特許 6698770 試料導入から結果出力までのプロセス化を提供する単一構造バイオチップおよび製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6698770

(24)【登録日】2020年5月1日

(45)【発行日】2020年5月27日

(54)【発明の名称】試料導入から結果出力までのプロセス化を提供する単一構造バイオチップおよび製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20200518BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20200518BHJP

   G01N 35/08 20060101ALI20200518BHJP

   G01N 35/00 20060101ALI20200518BHJP

   G01N 27/447 20060101ALN20200518BHJP

   G01N 21/64 20060101ALN20200518BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 A

   G01N37/00 101

   G01N35/08 F

   G01N35/00 C

   !G01N27/447 325A

   !G01N27/447 321Z

   !G01N27/447 315K

   !G01N27/447 311C

   !G01N27/447 301A

   !G01N21/64 F

【請求項の数】7

【外国語出願】

【全頁数】79

(21)【出願番号】特願2018-169730(P2018-169730)

(22)【出願日】2018年9月11日

(62)【分割の表示】特願2017-102502(P2017-102502)の分割

【原出願日】2011年3月9日

(65)【公開番号】特開2019-30302(P2019-30302A)

(43)【公開日】2019年2月28日

【審査請求日】2018年10月10日

(31)【優先権主張番号】61/339,743

(32)【優先日】2010年3月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507382050

【氏名又は名称】アンディ・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＡＮＤＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100132263

【弁理士】

【氏名又は名称】江間 晴彦

(72)【発明者】

【氏名】リチャード・エフ・セルデン

(72)【発明者】

【氏名】ユージーン・タン

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３１０６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０４９２６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５１２０７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１２４１０４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）界面に２０〜５００ｐｓｉｇの圧力を供給する空気圧サブシステムを備えた機器と、
（ｂ）前記機器に挿入されるバイオチップであって、上端と下端を有し、予め搭載された試薬貯蔵チャンバと、前記下端に結合した第１の箔シールと、前記上端に結合した第２の箔シールと、界面に配置され、前記機器から２０〜５００ｐｓｉｇの圧力を受けるとともに、該圧力を上端に供給するように構成された空気圧入口とを有し、前記第１の箔シールと前記第２の箔シールを破裂させ、前記の試薬貯蔵チャンバの内容物を放出させる、該バイオチップと、を含むシステム。

【請求項2】

前記の箔シールの一方または両方に切り込みを有する、請求項１記載のシステム。

【請求項3】

流体サブアセンブリーに接続されている、請求項２記載のシステム。

【請求項4】

破れる前に第１の箔の膨張に対応できるように大きさを設定されたスペーサープレートをさらに含み、該スペーサープレートは、前記チャンバと前記流体サブアセンブリーとの間に配置されている、請求項３記載のシステム。

【請求項5】

前記試薬貯蔵チャンバは、少なくとも１つの、封止され、予め搭載された試薬チューブを含む、請求項１記載のシステム。

【請求項6】

前記試薬貯蔵チャンバは、チューブインチューブ構造を有する、請求項１記載のシステム。

【請求項7】

前記試薬貯蔵チャンバは、単一チューブ構造を有する、請求項１記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

マイクロ流体工学の範囲は、通常１ｍＬより少ない微小な流体体積の操作に関わる分野として広く定義される。臨床検査においてマイクロ流体体積を利用するという考えは、１９６０年代後半から１９７０年前半に遡る従来の方法に比べて大きな進歩を意味するものであった。当該分野の従事者は、微小体積による分析により携帯測定装置が導入されると、広いラボスペースが不要となり、精密性と正確性が向上し、処理量が増加し、コストが低下し、および本当のオートメーションと両立できるものと考えていたが、当時開発されたシステムは、簡単なもので、期待されたマイクロ流体の利点を実感させるものではなかった。初期のシステムの１つは、小さな遠心ローターの中に移されて混合された、１〜１０μＬの試料と７０〜１１０μＬの試薬の分析に基づくものである（アンダーソン Ｎ．1969).”コンピュータに接続された高速分析装置”．Science 166:317-24； バーティス Ｃら（１９７２）.”小型の高速分析装置の開発”．Clinical Chemistry 18:753-61）。そのローターが、最初に報告されたマイクロ流体バイオチップであろう。

【背景技術】

【0002】

１９９０年代、「小型全化学分析システム」または「マイクロ−ＴＡＳ」の用語を創り出したマンツは、マイクロ流体工学の理論的基礎をさらに明らかにし、彼が考えているものが次世代のマイクロ流体デバイスであることを明確にした。マンツは、それらデバイスによりすべての必要な試料処理工程が実行されるべきであることを提案した。マンツが定めた目的は、マイクロ流体の現代における大きなゴールを確立するのに寄与した：オペレーターが介在することなく、試料の注入から結果生成までの複雑な一連の処理工程を実行できる、綜合、すなわち、完全に統合された分析システムを実現する。それは、複雑な一連の試料操作および処理工程を統合することを約束するものであり、それにより、「チップ上の実験室」（laboratory on a chip)というフレーズの使用が広まった。

【0003】

最初の初期の努力の後も遠心システムについての研究が継続され、マイクロ流体コンパクトディスクドライブを用いる、サンドイッチ式免疫アッセイ用の商用遠心システムが完成した。しかし、そのシステムは完全には統合されておらず、より正確には、ワークステーションというべきものであって、試薬がロボット的にコンパクトディスクへと移送、およびコンパクトディスクから移送される。また、免疫アッセイは非常に簡単であり、試料を捕捉カラムを通過させることにより行う。そのシステムは、試薬コストを低減させるためにマイクロ流体体積を用いたが、完全に統合されたシステムを提供するというマイクロ流体工学上の目的も、複雑な一連の試料操作および処理工程を統合するというマイクロ流体工学上の目的も実現できていない。

【0004】

同様に、他の研究者が、全血液から血漿を分別するために、ソフトエンボスを用いてポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）の中にスピニングバイオチップ（spinning biochip）を作製した。血液試料中の種々の対象被検質の測定のために、スピニングマイクロ流体バイオチップの適用がなされている。しかしながら、血液試料中の対象被検質の量を確認するといった簡単な分析試験のために、デバイスが開発された。試料は、複雑な一連の試料操作および処理工程に供されることはなく、２０年間の開発の後でも、確立された従来のアッセイに関しては大きな信頼性の問題が存在している。

【0005】

一般的に、ＣＤ系バイオチップは、大きな欠点と限界を抱えている。まず、それらは、複雑なプロセスに対応できない。これらのバイオチップは、特定の細胞の分離（従来の遠心装置を代替する）や高処理量免疫アッセイ（従来のアッセイの混合およびインキュベーションを代替する）等の比較的簡単なプロセスに限定されている。二番目に、流体移動の駆動力として遠心の利用には限界がある。例えば、バイオチップを回転させる必要があることは、試料を間接的に導入しなければならない場合（マニュアル操作または別の機器が必要である）または試料を直接的に導入しなければならない場合（例えば、採血用の管またはスワブも遠心処理に供する必要がある）のいずれの場合であっても、試料の取扱方法に対して明らかな限界をもたらす。また、スピニングバイオチップのプロセスフローは単一方向的であり、バイオチップの半径が、試料の処理を行うのに利用できる領域を制限する（プロセスの複雑性を制限する要因の１つ）。

【0006】

同時に、ＣＤ系バイオチップの代替物についても研究されてきた。多くのグループが、ＳＢＳ[生体分子スクリーニング協会（Society for Biomolecular Screening）、マイクロプレート標準開発委員会（Microplate Standards Development Committee)、ANSI/SBS1、ダンベリー、コネチカット州、２００４]基準を用いるマイクロリッター・プレートを利用したマイクロ流体バイオチップについて研究している。ＳＢＳは、マイクロタイタープレート用の一連の公表された標準を開発し、該マイクロタイタープレートは、フットプリント（１２７．７６×８５．４８ｍｍ、１０，９２０．９ｍｍ^２）、高さ、外側フランジの大きさを有する底部（bottom outside flange dimensions）およびウェル位置を有している。これらの標準は、用いる作製方法に関係なく、商用製造業者およびアカデミックグループによって用いられている。マイクロ流体マイクロタイタープレートは、ＤＮＡ精製およびタンパク質結晶化を含む多くのプロセスのために開発された。これらのバイオチップは、導入に先立って前処理が必要であり、ＤＮＡ精製処理の２工程のみで使用され、処理のＤＮＡ生成物の分析には使用されない。

【0007】

同様に、ナノリッター体積の試薬、生細胞の顕微鏡観察時の培地交換、および細胞と試薬の分配等の作業のために、他のグループはＳＢＳ標準に基づいて矩形のマイクロ流体プレートを用いている。さらに別の研究者は、ウェル内への試薬の分配を高処理量で行うロボットシステムに矩形のバイオチップを適用した。別のグループは、ウェルインウェル（well-in-a-well）のデバイスにおける生物学的信号増幅によるタンパク質検出のための矩形バイオチップを開発した。

【0008】

バイオチップ開発の進展とともに、ＳＢＳ形式におけるマイクロ流体特性の使用に基づいた多くの「統合流体回路」が商業化された。例えば、バイオチップは、４８ＳＮＰｓのそれぞれに対して４８個の試料を調べることのできるアレイを用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型判定を行う。その方法は、最初に、精製されたＤＮＡと反応混合物をマイクロ流体プレートの外側に準備し、該プレートをコントローラーの上に置き、該プレートを刺激し、試薬を加え該プレート上で４５分以上混合し、ＰＣＲのために該プレートを熱循環器の上に置き、および該プレートを蛍光検出装置に移動させる、ことにより行われる。これらのバイオチップは、導入に先立って前処理が必要で、チップ上での試料処理の間に複数のマニュアル操作が必要で、試薬を取り込まず、および処理で得られるＤＮＡ生成物の分析を行わない。

【0009】

同様の商業的アプローチは、ＳＢＳ標準ウェルプレートの中にミクロンスケールのフローセルデバイスを統合させるウェルプレートマイクロ流体工学を用いて、血小板の接着力を測定するものである。その方法には多くの前処理工程が必要で、その前処理工程には、マイクロ流体流路を覆うために対象タンパク質を手作業で導入すること、流路を灌流すること、洗浄、対象細胞試料を手作業で用意すること、マイクロ流体流路に細胞試料を添加すること、およびさらなる処理と分析のために該プレートをワークステーションの上に置くことが含まれる。同様のアプローチが、上皮細胞を種々の化合物に対して露出させることによる傷治療の研究に適用されている。これらのバイオチップは、導入に先立って、広範な試料前処理を必要とする。

【0010】

従来技術のマイクロ流体バイオチップの大多数は、バイオチップを作製するため、シリコンまたはガラス等の材料を使用することに基づいている。しかしながら、大量の商業用途のために作製するにはシリコンおよびガラスのバイオチップは法外に高価であり（１個のバイオチップが数千ドルもする）、使い捨て用途には実用的ではない。さらに、これらバイオチップを再利用しようというニーズには、限りなく汚染するという問題（人間の同一性や臨床診断の問題）や、もし機器内での再利用のためにバイオチップが作製される場合には機器の複雑化の問題があり、およびもし機器外での再利用のためにバイオチップが作製される場合には物流の問題がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

完全統合された状態の中で、１つまたは複数の試料に対して、並行して一連の複雑な処理工程を実行することが可能な、マイクロ流体工学、マイクロ流体バイオチップおよびマイクロ流体システムについての実現されていない可能性を実現するために、オペレータの操作の不要な試料導入から結果出力までのシステム（sample-in to results out system）が必要とされている。しかしながら、現在までに開発されたバイオチップは、分析に必要な工程の部分のみしか実施できず、１個のデバイスで分析結果を作成することができない。また、これらバイオチップおよびシステムは、大量生産に適さない材料および方法を用いている。

【課題を解決するための手段】

【0012】

概して、一態様において、本明細書に記載された技術は、オペレータを介在させることなく、試料挿入から結果生成までの複雑な処理のすべての工程が統合されたバイオチップに関する。一実施形態では、本技術に基づくバイオチップは、一連の処理工程の中で、機器のサブシステムにより実行されるマイクロ流体の特徴およびマクロ流体の特徴を含んでいる。

【0013】

別の態様では、前記の技術は高い特徴密度を持つ複雑なバイオチップの作製方法に関する。一実施形態では、該方法は、バイオチップを作製するためのプラスチック材料の射出成形を含む。

【0014】

別の態様では、前記の技術は、空気圧サブシステム、熱サブシステム、高電圧サブシステム、光学サブシステム、およびプロセスコントローラーを備えた電気泳動機器の中に挿入すると、少なくとも１つの試料から核酸の配列決定または選別の結果が生成する、バイオチップに関する。該バイオチップは、流体サブアセンブリーおよび空気圧サブアセンブリーに接続されたマクロ流体処理サブアセンブリーを含む。該マクロ流体処理サブアセンブリーは、試料を受けるために取り付けられた少なくとも１つのチャンバーを含む。前記流体サブアセンブリーは、流体プレート、および少なくとも１つの流体移動流路と前記熱サブシステムに接続するように取り付けられた増幅チャンバーを含む。前記空気圧サブアセンブリーは、前記の機器の含気サブシステムおよびバイオチップのサブアセンブリーに接続するように取り付けられている。前記空気圧サブアセンブリーは、空気圧プレートと、前記プロセスコントローラーからの指示に基づいて流体を空気圧で移動させるための１つまたは複数の駆動ラインを有している。バイオチップは、機器上の前記高電圧サブシステム、前記光学サブシステムおよびプロセスコントローラーに接続するように取り付けられた、分離および検出サブアセンブリーも有している。該分離および検出サブアセンブリーは、分離流路と、各該分離流路から前記の機器上の前記光学サブシステムへと信号を送るように配置された検出領域を有している。バイオチップは、プラスチック製で、固定型で、単一構造であり、流体プレートおよび／または空気圧プレートのフットプリントは、約８６ｍｍ×１２８ｍｍまたはそれより大きい（例えば、約１００×１５０ｍｍまたはそれより大きい、約１１５×２７５ｍｍまたはそれより大きい、約１１５×２７５ｍｍまたはそれより大きい、約１４０×２７５ｍｍまたはそれより大きい、１６５×２９５ｍｍまたはそれより大きい。）。

【0015】

別の態様では、前記の技術は、空気圧サブシステム、熱サブシステム、高電圧サブシステム、光学サブシステム、およびプロセスコントローラーを備えた電気泳動機器の中に挿入すると、少なくとも１つの試料から核酸の配列決定または選別の結果が生成する、バイオチップに関する。該バイオチップは、流体サブアセンブリーおよび空気圧サブアセンブリーに接続されたマクロ流体処理サブアセンブリーを含む。該マクロ流体処理サブアセンブリーは、試料を受けるために取り付けられた少なくとも１つのチャンバーを含む。前記流体サブアセンブリーは、流体プレート、および少なくとも１つの流体移動流路と前記熱サブシステムに接続するように取り付けられた増幅チャンバーを含む。前記空気圧サブアセンブリーは、前記の機器の空気圧サブシステムおよびバイオチップのサブアセンブリーに接続するように取り付けられている。前記空気圧サブアセンブリーは、空気圧プレートと、前記プロセスコントローラーからの指示に基づいて流体を空気圧で移動させるための１つまたは複数の駆動ラインを有している。バイオチップは、機器上の前記高電圧サブシステム、前記光学サブシステムおよびプロセスコントローラーに接続するように取り付けられた、分離および検出サブアセンブリーも有している。該分離および検出サブアセンブリーは、分離流路と、各該分離流路から前記の機器上の前記光学サブシステムへと信号を送るように配置された検出領域を有している。バイオチップは、プラスチック製で、固定型で、単一構造であり、流体プレートおよび／または空気圧プレートのフットプリントは、１０，９２０．０ｍｍ^２未満で、ＳＢＳ標準と一致しない。

【0016】

別の態様では、前記の技術は、空気圧サブシステム、熱サブシステム、高電圧サブシステム、光学サブシステム、およびプロセスコントローラーを備えた電気泳動機器の中に挿入すると、少なくとも１つの試料から核酸の配列決定または選別の結果が生成する、バイオチップに関する。該バイオチップは、流体サブアセンブリーおよび空気圧サブアセンブリーに接続されたマクロ流体処理サブアセンブリーを含む。該マクロ流体処理サブアセンブリーは、該マクロ流体処理サブアセンブリーの中または上に配置された少なくとも１つのマクロ流体特徴と、試料を受けることが可能なチャンバーを含む。前記流体サブアセンブリーは、流体プレート、および該流体プレートの中または上に配置された少なくとも１つの特徴を含む。前記流体サブアセンブリーは、少なくとも１つの流体移動流路と、前記熱サブシステムに接続するように取り付けられた増幅チャンバーをさらに含んでいる。前記空気圧サブアセンブリーは、前記の機器の空気圧サブシステムおよびバイオチップのサブアセンブリーに接続するように取り付けられている。前記空気圧サブアセンブリーは、空気圧プレートと、該空気圧プレートの中または上に配置された少なくとも１つの特徴と有している。前記空気圧サブアセンブリーは、前記プロセスコントローラーからの指示に基づいて流体を空気圧で移動させるための１つまたは複数の駆動ラインをさらに有している。バイオチップは、機器上の前記高電圧サブシステム、前記光学サブシステムおよびプロセスコントローラーに接続するように取り付けられた、分離および検出サブアセンブリーも有している。該分離および検出サブアセンブリーは、該分離および検出サブアセンブリーの中または上に配置された少なくとも１つの特徴を有している。該分離および検出サブアセンブリーは、分離流路と、各該分離流路から前記の機器上の前記光学サブシステムへと信号を送るように配置された検出領域をさらに有している。バイオチップは、プラスチック製で、固定型で、単一構造であり、流体サブアセンブリー、空気圧サブアセンブリー、および／または分離および検出サブアセンブリーの１つまたは複数の特徴の物理的状態が、２５またはそれを越える（例えば、５０またはそれを越える、１００またはそれを越える、２００またはそれを越える）設定された処理において変化するように取り付けられている。いくつかの実施形態では、バイオチップの中では、予定された処理工程が、２つまたはそれを越える処理工程となる。

【0017】

別の態様では、前記の技術は、空気圧サブシステム、熱サブシステム、高電圧サブシステム、光学サブシステム、およびプロセスコントローラーを備えた電気泳動機器の中に挿入すると、少なくとも１つの試料から核酸の配列決定または選別の結果が生成する、単一構造で、固定型のバイオチップに関する。該バイオチップは、流体サブアセンブリーおよび空気圧サブアセンブリーに接続されたマクロ流体処理サブアセンブリーを含む。該マクロ流体処理サブアセンブリーは、試料を受けるように取り付けられた少なくとも１つのチャンバーを有している。前記流体サブアセンブリーは、上面と底面を有し、該上面と底面の上にはパターンを付与された熱可塑性シートが結合されている流体プレートを有し、該プレートの各面の上に少なくとも１つの流体移動流路と、前記熱サブシステムに接続された増幅チャンバーとを形成する。前記空気圧サブアセンブリーは、前記の機器の空気圧サブシステムおよびバイオチップのサブセンブリーに接続するように取り付けられている。前記空気圧サブアセンブリーは、パターンを付与された熱可塑性シートが結合された上面を有する空気圧プレートと、前記プロセスコントローラーの指示に基づいて流体を空気圧で移動させる１つまたは複数の駆動ラインを有している。バイオチップは、流体サブアセンブリーと空気圧サブアセンブリーとの間に配置されそれらを接続するバルブサブアセンブリーと、前記の機器上の前記高電圧サブシステム、光学サブシステムおよびプロセスコントローラーに接続するように取り付けられた、分離および検出サブアセンブリーを有している。該分離および検出サブアセンブリーは、少なくとも１つの分離流路を有し、および該少なくとも１つの分離流路から前記の機器上の光学サブシステムへと信号を送るように配置された検出領域をさらに有している。

【0018】

前記の技術の本態様に係るいくつかの実施形態は、１つまたはそれより多い以下の特徴を含む。前記のマクロ流体サブシステム、空気圧サブシステム、流体サブシステム、分離サブシステムおよび検出サブシステムの１つまたは複数は、プラスチックから作製されている。いくつかの実施形態では、バルブサブアセンブリーは、少なくとも１つの弾性体バルブを有している。いくつかの実施形態では、バルブサブアセンブリーは、少なくとも１つの非弾性体バルブを有している。実施形態では、分離および検出サブアセンブリーの中での試料の電気泳動が、流体プレートを通過する試料の通常の流れと反対の方向で行われるように、分離および検出サブアセンブリーが配置されている。実施形態では、バイオチップは、該バイオチップ内の少なくとも１つの試料を処理するのに必要なすべての試薬を含んでいる。

【0019】

別の態様では、前記の技術は、生物学的試料の処理システムに関する。該システムは、バイオチップとプロセスコントローラーを含む。空気圧サブシステム、熱サブシステム、高電圧サブシステム、光学サブシステム、およびプロセスコントローラーを備えた電気泳動機器の中にバイオチップを挿入すると、少なくとも１つの試料から核酸の配列決定または選別の結果が生成する。該バイオチップは、流体サブアセンブリーおよび空気圧サブアセンブリーに接続されたマクロ流体処理サブアセンブリーを含む。該マクロ流体処理サブアセンブリーは、試料を受けるように取り付けられた少なくとも１つのチャンバーを有している。前記流体サブアセンブリーは、上面と底面を有し、該上面と底面の上にはパターンを付与された熱可塑性シートが結合されている流体プレートを有し、該プレートの各面の上には少なくとも１つの流体移動流路と、前記熱サブシステムに接続された増幅チャンバーが形成されている。前記空気圧サブアセンブリーは、前記の機器の空気圧サブシステムおよびバイオチップのサブセンブリーに接続するように取り付けられており、パターンを付与された熱可塑性シートが結合された上面を有する空気圧プレートと、前記プロセスコントローラーの指示に基づいて流体を空気圧で移動させる１つまたは複数の駆動ラインを有している。バイオチップは、流体サブアセンブリーと空気圧サブアセンブリーとの間に配置されそれらを接続するバルブサブアセンブリーと、前記の機器上の前記高電圧サブシステム、光学サブシステムおよびプロセスコントローラーに接続するように取り付けられた分離および検出サブアセンブリーを有している。該分離および検出サブアセンブリーは、少なくとも１つの分離流路を有し、および該少なくとも１つの分離流路から前記の機器上の光学サブシステムへと信号を送るように配置された検出領域をさらに有している。前記の機器のプロセスコントローラーは、２５またはそれより多い、自動化された設定処理工程を実行する指示を有している。

【0020】

別の態様では、前記の技術は、バイオチップの製造方法を特徴とする。該方法は、流体上面、流体底面、および該流体上面から該流体底面へと延在し、該流体上面と該流体底面とを接続する少なくとも１つのスルーホールを有する流体プレートを射出成形することを含む。該流体上面と該流体底面は、それぞれ複数のマイクロ流体特徴を有している。該方法は、空気圧上面、空気圧底面、および該空気圧上面から該空気圧底面へと延在し、該空気圧上面と該空気圧底面とを接続する少なくとも１つのスルーホールを有する空気圧プレートを射出成形することを含む。該空気圧上面と該空気圧底面は、それぞれ複数のマイクロ流体特徴を有している。該方法は、バイオチップを形成するように、流体プレートと空気圧プレートとを配列させることを含み、流体プレートおよび／または空気圧プレートのフットプリントが、８６ｍｍ×１２８ｍｍまたはそれより大きく、および流体プレートおよび／または空気圧プレートの複数のマイクロ流体特徴の少なくとも１つが２度未満の抜け勾配（draft angle）を有する。

【0021】

別の態様では、前記の技術は、流体サブアセンブリーおよび空気圧サブアセンブリーと流体連絡するマクロ流体処理サブアセンブリーを有する単一構造バイオチップの中で、少なくとも１つの未処理試料について、試料導入から結果出力まで自動化された電気泳動を行う方法を特徴とする。該方法は、以下の内容を含む：（ａ）マクロ流体処理サブアセンブリーの中のチャンバーの中に、少なくとも１つの未処理試料を挿入すること；（ｂ）空気圧サブシステム、熱サブシステム、高電圧サブシステム、光学システム、およびプロセスコントローラーを有する機器であって、該プロセスコントローラーが予め設定された処理スクリプト（script）を受け容れ、および該処理スクリプトを読み取るとともに、空気圧サブシステム、熱サブシステム、高電圧サブシステム、および光学システムを制御することにより該処理スクリプトを自動的に実行する該機器の中にバイオチップを挿入すること；（ｃ）該プロセスコントローラーを作動させて処理スクリプトを実行させる、ここで、該処理スクリプトは、以下に対する指示を含む：（i）空気圧サブシステムから空気圧サブアセンブリーのバルブラインへ圧力を加える、または空気圧サブアセンブリーと流体連絡させることにより、バイオチップを初期化すること；（ii）空気圧サブシステムからマクロ流体処理サブアセンブリーに圧力を加えて、該マクロ流体処理サブアセンブリーの中に貯蔵されていた試薬を放出させ、空気圧サブシステムから放出された試薬に圧力を加えて、未処理の試料から細胞溶解物を形成させ、空気圧サブシステムから圧力を加えて、流体サブアセンブリーの中の精製フィルターを通して溶解物を保管チャンバーの中へ取り出して、溶解物の中のＤＮＡをフィルターに結合させ、空気圧サブシステムから圧力を加えて、マクロ流体処理サブアセンブリーに貯蔵されている洗浄液を、精製フィルターを通して流し、結合しているＤＮＡから汚染物を除去することにより、未処理の試料からＤＮＡを精製する；圧力を加えて空気を精製フィルターに流して結合したＤＮＡを乾燥させ、空気圧サブシステムから圧力を加えて、マクロ流体処理サブアセンブリーの中に貯蔵されている溶出液を放出させて結合しているＤＮＡを精製フィルターから遊離させ、精製されたＤＮＡを含む溶出液を生成させること；（iii）空気圧サブシステムから空気圧サブアセンブリーへ圧力を加えて、凍結乾燥されたＰＣＲ反応混合物を含む再構成チャンバーへと溶出液を移動させること；（iv）再構成されたＰＣＲ反応混合物を、流体サブアセンブリーの中の熱サイクルチャンバーへと移動させること；（v）熱サイクルプロトコルを開始して熱サイクルチャンバーを加熱し、該ＰＣＲ混合物から標識されたアンプリコンを生成させること；（vi）空気圧サブシステムから空気圧サブアセンブリーに圧力を加えることにより、標識されたアンプリコンと、マクロ流体処理サブアセンブリーに貯蔵されているホルムアミド試薬とを結合チャンバーへと移動させ；標識されたアンプリコンとホルムアミド試薬とがホルムアミドＰＣＲ生成物の混合物を生成すること；（vii）空気圧サブシステムから空気圧サブアセンブリーに圧力を加えることにより、ホルムアミドＰＣＲ生成物の混合物を、ＩＬＳケーキと混合するために、ＩＬＳケーキチャンバーに流動させて移動させ、分離試料と検出試料を生成させること；（viii）空気圧サブシステムから空気圧サブアセンブリーに圧力を加えることにより、分離試料と検出試料を、流体サブアセンブリーの中のカソードチャンバーに移動させること；（ix）高電圧サブシステムから電圧を加えて、該カソードと該アノードにバイアスをかけることにより、分離と検出を分離するために、流体サブアセンブリーのカソードとアノードを用意すること；（x）空気圧サブシステムから空気圧サブアセンブリーに圧力を加えることにより、流体サブアセンブリーの中のゲル試薬貯蔵部から、流体サブアセンブリーのカソードチャンバーと廃棄チャンバーへとゲルを移動させること；（xi）注入し、高電圧サブシステムから電圧をカソードとアノードに印加することにより、分離流路の分離試料と検出試料を分離すること；および（xii）光学サブシステムのレーザーを作動させることにより、分離試料と検出試料の分離された成分の蛍光を発生させる。本発明は、分離された成分の蛍光信号を自動的に検出することも含み、それにより少なくとも１つの未処理試料から、分離および検出試料の結果を得ることができる。

【0022】

別の態様では、前記の技術は、少なくとも１つの生物学的試料に対して、少なくとも２つのタイプの、試料導入結果出力処理を提供するシステムに関する。該システムは、固定型バイオチップと、該バイオチップとインターフェイスで接続された、空気圧サブシステム、熱サブシステム、高電圧サブシステム、および光学サブシステムおよびプロセスコントローラーとを含む機器を有している。固定型のバイオチップは、流体サブアセンブリーおよび空気圧サブアセンブリーと接続されたマクロ流体処理サブアセンブリーを含んでいる。該マクロ流体処理サブアセンブリーは、試料を受けるように取り付けられた少なくとも１つのチャンバーを含む。該流体サブアセンブリーは、流体プレート、および少なくとも１つの流体移動流路並びに熱サブシステムに接続された増幅チャンバーを含む。前記の機器の空気圧サブシステムと、前記バイオチップのサブアセンブリーに接続するように取り付けられた空気圧サブアセンブリーは、空気圧プレートと、プロセスコントローラーからの指示に基づいて流体を空気圧で移動させる１つまたは複数の駆動ラインを有している。バイオチップは、前記の機器上の高電圧サブシステム、光学サブシステムおよびプロセスコントローラーに接続するように取り付けられた分離および検出サブアセンブリーを有している。該分離および検出サブアセンブリーは、分離流路と、各該流路から前記の機器上の光学サブシステムへと信号を送るように配置された検出領域とを有している。バイオチップは、試料処理のための少なくとも２つの異なる経路を有している。該２つの異なる経路のそれぞれは、異なる分析処理に使用される。前記の機器のプロセスコントローラーは、異なる分析処理において少なくとも１つの生物学的試料を処理する指示一式を有している。いくつかの実施形態では、前記の異なる分析処理はＳＴＲ分析と一塩基多型分析である。いくつかの実施形態では、前記の異なる分析処理は多重増幅とＤＮＡ配列決定である。いくつかの実施形態では、前記の異なる分析処理はＳＴＲ分析とミトコンドリアＤＮＡ配列決定である。いくつかの実施形態では、前記の異なる分析処理は逆転写ＰＣＲと従来のＰＣＲである。いくつかの実施形態では、前記の異なる分析処理はＤＮＡ配列決定と一塩基多型分析である。

【0023】

別の態様では、前記の技術は、マクロ流体ブロックおよびカバーを含む、バイオチップ用の試薬貯蔵容器に関する。該マクロ流体ブロックは、上端と下端を有する試薬貯蔵チャンバー；下端に結合した第１の箔シール；上端に結合した第２の箔シールを有している。試薬は箔シールされたチャンバーの中に貯蔵され、上端の箔と下端の箔が破れて、試薬貯蔵チャンバーの内容物が放出されるほどにカバーに空気圧を加えることにより放出させることができる。

【0024】

上記の態様についての実施形態は、以下の特徴を１つまたは複数含むことができる。いくつかの実施形態では、試薬貯蔵容器は流体サブアセンブリーに接続されている。いくつかの実施形態では、試薬貯蔵容器は、破れる前に第１の箔の膨張に対応できるように大きさを設定されたスペーサープレートを含み、該スペーサープレートは、該容器と流体サブアセンブリーとの間に配置されている。

【発明の効果】

【0025】

本技術は多くの利点を有しており、限定されるものではないが、少なくともオペレータの介在は不要で、作製コストを低減できる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

上述の本技術の利点、およびさらなる利点は、添付の図面とともに以下の記載を参照することにより十分に理解できるであろう。図面の縮尺は必ずしも正確ではないが、その代わり重点は、本技術の原則を示すことに置かれている。

【図1】図１は、単一の管状の試薬貯蔵および放出デバイスの一実施形態の側面図である。

【図2】図２は、試薬貯蔵放出破裂を用いた５個の試料バイオチップセットの実施形態に含まれているスペーサープレートの実施形態の写真である。

【図3】図３は、スペーサープレートの一部の模式断面図である。

【図4】図４は、様々の厚さを有するアルミ箔の直径と破裂圧力との関係を示すグラフである。

【図5】図５は、６個の試薬貯蔵チャンバーを含む試薬貯蔵放出ユニットの模式斜視図である。

【図6】図６は、図５の試薬貯蔵放出ユニットの上部斜視図であり、各チャンバーの上端に結合した上部箔を示している。

【図7】図７は、破裂後の試薬貯蔵放出ユニットの２つの箔を示す上面図である。

【図8】図８は、空気圧で駆動する弾性体バルブ構造体の一実施形態の模式上面図である。

【図9】図９は、図８の空気圧で駆動するバルブ構造体の模式断面図である。

【図10】図１０は、ＰＳＡテープを有する弾性体膜バルブの一実施形態の模式上面図である。

【図11】図１１は、請求項１０のバルブの模式断面図である。

【図12】図１２は、剛直なバルブ膜を有する空気圧駆動バルブの一実施形態の模式上面図である。

【図13】図１３は、図１２の剛直なバルブ膜を有する空気圧駆動バルブの断面図である。

【図14】図１４は、固定された弾性体膜バルブの一実施形態の模式上面図である。

【図15】図１５は、図１２の固定された弾性体膜バルブの断面図である。

【図16】図１６は、本技術に基づくバイオチップの一実施形態に使用された排出（vent）膜構造の模式断面図である。

【図17】図１７は、本技術に基づくバイオチップの別の実施形態に使用された排出膜構造の模式断面図である。

【図18】図１８は、本技術に基づくバイオチップの一実施形態であって、マニホールドと拡張された周辺領域を有する空気圧プレートの模式上面図である。

【図19】図１９は、本技術に基づくバイオチップの一実施形態であって、マニホールドと拡張された周辺領域を有する空気圧プレートの模式底面図である。

【図20】図２０は、本技術に基づくバイオチップの一実施形態であって、精製領域と拡張された周辺領域を有する流体プレートの模式透視図である。

【図21】図２１は、バイオチップの上に、制御された力を加えるのに使用される空気圧作動のシリンダーの写真である。

【図22】図２２は、図２１の空気圧作動のシリンダーによりバイオチップに印加される種々の圧力と、各ＳＴＲ位置における信号強度とを比較する棒グラフである。グラフでは、７５、１１２、１８７、２２４、２９９、および３３６ｐｓｉｇの圧力が印加され、各位置で、各圧力に対して信号強度が記録される（左から右に圧力は増加する）。

【図23】図２３は、本技術に基づく射出成形されたバイオチップの一実施形態の模式上面図である。

【図24】図２４は、本技術に基づくバイオチップの流体層２の一実施形態の模式上面図である。

【図25】図２５は、本技術に基づくバイオチップの流体層２の一実施形態の模式上面図である。

【図26】図２６は、本技術に基づくバイオチップの空気圧層１の一実施形態の模式上面図である。

【図27】図２７は、本技術に基づくバイオチップの空気圧層２の一実施形態の模式上面図である。

【図28】図２８は、図２５の第２の流体プレートに結合した図２４の第１の流体プレートを含む流体工学サブアセンブリーの一実施形態の模式上面透視図である。

【図29】図２９は、図２７の第２の空気圧プレートに結合した図２６の第１の空気圧プレートを含む空気圧サブアセンブリーの一実施形態の模式上面透視図である。

【図30】図３０は、図２８の流体工学サブアセンブリーに図２９の空気圧サブアセンブリーを取り付けて作製したバイオチップの模式上面透視図である。

【図31】図３１は、バイオチップに接続して使用する、空気圧機器および熱サイクル機器の一実施形態の写真である。

【図32】図３２は、本技術に基づくバイオチップ内部における、試料のＰＣＲ分析のためのＳＴＲプロファイルである。

【図33】図３３は、本技術に基づく流体アセンブリーの一実施形態に含まれる流体プレートの一実施形態の模式上面図である。

【図34】図３４は、図３３の流体プレートの模式底面図である。

【図35】図３５は、流体プレートの上面と底面の両方の特徴を示す該流体プレートの模式透視図である。

【図36】図３６は、流体プレートの上面に取り付ける、パターンを付与された薄膜の一実施形態の模式上面図である。

【図37】図３７は、流体プレートの底面に取り付ける、パターンを付与された薄膜の一実施形態の模式底面図である。

【図38】図３８は、ラインを有する流体プレートの一実施形態の模式上面図であり、単一の試料が流体プレートを通過する経路を示している。

【図39】図３９は、図３８の流体プレートの模式拡大上面図であり、精製領域を通過する経路の一部を示している。

【図40】図４０は、図３８の流体プレートの模式拡大上面図であり、増幅領域を通過する経路の一部を示している。

【図41】図４０は、図３８の流体プレートの模式拡大上面図であり、分離領域および検出領域を通過する経路の一部を示している。

【図42】図４２は、本技術に基づく空気圧アセンブリーの一実施形態に含まれる空気圧プレートの一実施形態の模式上面図である。

【図43】図４３は、図４２の空気圧プレートの模式底面図である。

【図44】図４４、図４２の空気圧プレートの透視図であり、空気圧プレートの上面と底面の両方の特徴を示している。

【図45】図４５は、空気圧プレートの上面に取り付ける、パターンを付与された薄膜の一実施形態の模式上面図である。

【図46】図４６は、空気圧プレートの底面に取り付ける、パターンを付与された薄膜の一実施形態の模式底面図である。

【図47】図４７は、マクロ流体処理サブアセンブリーの一実施形態に含まれるマクロ流体ブロックの一実施形態の模式透視図である。

【図48】図４８は、マクロ流体ブロックに対するカバーの上層の一実施形態の模式上面図である。

【図49】図４９は、カバーの上層の一実施形態の模式底面図である。

【図50】図５０は、カバーの上層の模式透視上面図である。

【図51】図５１は、マクロ流体ブロックに対するカバーの第２層の別の実施形態の模式上面図である。

【図52】図５２は、マクロ流体ブロックに対するカバーの第３層の別の実施形態の模式上面図である。

【図53】図５３は、図５２のカバーの第３層の一実施形態の模式底面図である。

【図54】図５４は、カバーの第３層の模式透視上面図である。

【図55】図５５は、加圧注入のための、分離および検出バイオチップの一実施形態の模式上面図である。

【図56】図５６は、電気泳動移送用の交差注入（cross injection）のための、分離および検出バイオチップの一実施形態の模式上面図である。

【図57】図５７は、本技術に基づくバイオチップの一実施形態の積層模式側面図である。

【図58】図５８は、本技術に基づくバイオチップアセンブリーの一実施形態の写真であり、矢印は処理フローの方向を示している。

【図59】図５９は、図５８のバイオチップアセンブリーの写真である。該バイオチップアセンブリーは、光学サブシステム、熱サブシステム、高電圧サブシステムおよび空気圧サブシステム、並びにプロセスコントロールシステムとインターフェイスで接続されている。

【図60】図６０は、本技術に基づくバイオチップの一実施形態の内部の対照ＩＬＳ試料（ＲＯＸで蛍光標識されたフラグメント）のために作成した比較電気泳動図である。

【図61】図６１は、以下の自動化されたスクリプトに基づき、頬のスワブ試料１種について生成させたＳＴＲフラグメントの大きさを示す電気泳動図である。ＰＣＲ反応混合物およびＩＬＳの中のＳＴＲプライマーを標識するのに使用された各蛍光色素は、各パネルに示されている。蛍光標識されたフラグメントは、上のパネルに示されており、ＪＯＥ標識されたフラグメントは上から第２のパネルに示され、ＴＡＭＲＡ標識されたフラグメントは、上から第３のパネルに示され、およびＲＯＸ標識されたＩＬＳフラグメントは下のパネルに示されている。

【図62】図６２は、本技術に基づく流体サブアセンブリーの流体プレートの一実施形態の模式上面図である。

【図63】図６３は、図６２の流体プレートの模式底面図である。

【図64】図６４は、流体プレートの模式透視図であり、図６２の上面の特徴と図６３の底面の特徴の両方を示している。

【図65】図６５は、射出成形流体プレートの一実施形態の写真である。

【図66】図６６は、図６５の流体プレートの上面に取り付ける、パターンを付与された上面用薄膜の一実施形態の模式上面図である。

【図67】図６７は、図６５の流体プレートの底面に取り付ける、パターンを付与された底面用薄膜の一実施形態の模式底面図である。

【図68】図６８は、ラインを有する流体プレートの一実施形態の模式上面図であり、該流体プレートを通過する単一の試料の通路を示している。

【図69】図６９は、図６８の流体プレートの模式拡大上面図であり、精製領域を通過する通路の一部を示している。

【図70】図７０は、図６８の流体プレートの模式拡大上面図であり、ＰＣＲセクションを通過する通路の一部を示している。

【図71】図７１は、図６８の流体プレートの模式拡大上面図であり、分離領域および検出領域を通過する通路の一部を示している。

【図72】図７２は、本技術に基づく空気圧アセンブリーの空気圧プレートの一実施形態の模式上面図である。

【図73】図７３は、図７２の空気圧プレートの模式底面図である。

【図74】図７４は、空気圧プレートの透視上面図であり、図７２および７３の空気圧プレートの上面および底面を示している。

【図75】図７５は、射出成形空気圧プレートの一実施形態の写真である。

【図76】図７６は、図７５の射出成形空気圧プレートの上面に取り付ける、パターンを付与された薄膜の一実施形態の模式上面図である。

【図77】図７７は、バイオチップ上での使用のための自動化された処理の一部について、規定の処理工程と結果の処理工程との関係を示す表である。

【図78】図７８は、試料分割と希釈マイクロ流体回路の一実施形態のフローチャートである。

【図79】図７９は、異なる厚さにおける複数の物質のバックグラウンド蛍光を示すグラフである。

【図80】図８０は、ノッチフィルターを付けた場合と付けない場合で取得した蛍光データの結果をまとめた表である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本明細書に記載されたバイオチップは、マイクロ流体工学の分野の基本的な目的を達成する：オペレータの介在なしに単一の機器で実施される、試料の挿入から結果生成までの複雑な処理のすべての工程の統合である。一つの態様では、我々は本明細書で新規なバイオチップを提供するものであり、該バイオチップは、完全に統合されており、および、法医学試料から縦列型反復配列（ＳＴＲ）を生成させる、細胞分解、精製、多重増幅、電気泳動による分離及び検出を含む複雑な、試料導入から結果出力までの分析を実行する；臨床試料からＤＮＡ配列を生成させる、細胞分解、ＤＮＡ精製、多重増幅、サンガ―配列決定、限外濾過、電気泳動による分離および検出；生物学的試料からＤＮＡ配列を生成させる、核酸精製、逆転写、多重増幅、サンガー配列決定、限外濾過、電気泳動による分離および検出；および、人間、バクテリア、ウィルスの臨床および研究試料からゲノムＤＮＡ配列を生成させる、核酸精製、ライブラリー構築、および単一分子配列決定。

【0028】

本発明のバイオチップで実施される試料操作には、核酸抽出；細胞分解；細胞分離； 細胞分解；差動濾過；全核酸精製；ＤＮＡ精製；ＲＮＡ精製；ｍＲＮＡ精製、タンパク質精製；プレ核酸増幅クリーンアップ；核酸増幅（例えば、単一および多重の両方のエンドポイントＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ（nested PCR）、レイトＰＣＲ（LATE PCR）、タッチダウンＰＣＲ（touch down PCR）、デジタルＰＣＲ、ローリングサークル増幅、ストランド置換増幅、多重置換増幅）；Ｙ−ＳＴＲ増幅；ミニＳＴＲ増幅；一塩基多型分析；ＶＮＴＲ分析；ＲＦＬＰ分析；ポスト核酸増幅クリーンアップ；プレ核酸配列決定クリーンアップ；核酸配列決定（例えば、サンガー配列決定、ピロシークエンシング（pyrosequencing）、単一分子配列決定）；ポスト核酸配列決定クリーンアップ；逆転写；ＳＮＰ分析；核酸ハイブリダイゼーション；電気泳動による分離および検出；免疫アッセイ；結合アッセイ；タンパク質分析；酵素アッセイ；質量分析；および核酸とタンパク質の定量化の組み合わせを含む。

【0029】

バイオチップの構造と機能を特徴付ける場合、少なくとも２段階の複雑性を検討することができる。試料数の複雑性は、バイオチップ上で処理される独立した試料の数を示す。処理の複雑性は、各試料がバイオチップ上で受ける連続する操作の数を示す。本発明のバイオチップは、試料数と処理の複雑性の両方が高いレベルにある。

【0030】

別の態様では、本発明の新規なバイオチップは、完全に統合された、試料導入から結果出力までのシステムを達成するために、多数の処理工程を統合する。発明者らは、これらのバイオチップの複雑さを示す２つのカテゴリーのバイオチップ処理工程を定義する。規定の処理工程は、バイオチップ内またはその上において特徴に直接作用するとともに、バイオチップとインターフェイス接続する機器の様々なサブシステムを含む、自動化されコンピュータ制御されたスクリプト（script）の結果として行なわれる作用である。その作用は、バイオチップの中の物理的状態（たとえば、バルブを閉じるために、バルブ膜を移動させる)、または試料またはバイオチップ内の空気（例えば、試料内の蛍光色素が励起され、空気が空気圧ドライブ２を通過する）。また、その作用は、バイオチップの特徴およびバイオチップ内の試料の物理的状態に同時に変化をもたらすことができる（例えば、熱チャンバーが加熱された場合、チャンバー内の試料も加熱される）。

【0031】

機器サブシステムは設定された作用を実施するとともに、空気圧サブシステムを含んでおり、該空気圧サブシステムは、圧力を加えて箔を破裂させ、バルブに対する圧力を増加および減少させ、および液体、気体、および固体を押す；高電圧サブシステムは、巨大分子を電気泳動にかけるために電流を流す；光学サブシステムは、電気泳動、定量、増幅、免疫アッセイおよび化学アッセイにおいて試料を励起し検出するために光を用いる;および熱サブシステムは、細胞分解、核酸変性、電気泳動の均一性、熱サイクルおよびサイクルシークエンスのために熱を加える。すなわち、すべての設定された処理工程は自動化されたスクリプトの特別な指示である。

【0032】

規定の処理工程は、機器のサブシステムとインターフェイスを介してバイオチップ内またはその上の特徴に生起する直接的な作用を規定する。バイオチップの特徴は、マイクロ流体、マクロ流体、またはその両方の組み合わせであってもよく、スクリプトは規定配列の中の規定位置のこれら特徴に作用する。例えば、たとえ機器に対する複数の変化が、その単一工程を達成するための必要条件であったとしても、バイオチップ上の所定のバルブの動作は単一の設定された処理工程であると考えられる（例えば、バルブを閉じるために、ポンプと駆動ラインを動作させる）。

【0033】

規定の処理工程の数を決める場合、ＰＣＲ増幅のように直接的反復工程（例えば、変性、アニーリング、および伸長の多くの直接的反復サイクル、それぞれ温度の変化で示される）は、１サイクルの中の工程の数と見なされる。すなわち、９３℃で２０秒間のホットスタート（１工程）、次に（９３℃で４秒間、５６℃で１５秒間、および７０℃で７秒間）（３工程）の３１サイクル、その次に７０℃で９０秒間の最終伸長（１工程）を含むＰＣＲ増幅反応は、合計で５つの規定の処理工程を表している。１つまたは複数の規定の処理工程の間に、１つの特徴に作用することができる。この場合、それぞれの独立した作用は、１工程と見なされる；例えば、所定のバルブを処理の間に７回作動させれば、これは７工程と見なされる。個々の試料の処理の間に並列的に複数の特徴に作用することができる。例えば、バイオチップのチャンバーが加熱されている間、３個のバルブを動かせば、これは４つの規定の処理工程と見なされる（換言すると、バイオチップ上またはバイオチップ内の特徴に対して４つの新たな作用が働く）。最後に、処理によって生データが一旦発生すると、データ処理（例えば色補正）またはデータ解析（例えば、対立遺伝子または塩基の読み出し）は規定の処理工程ではない。本発明のバイオチップは、２５，５０，７５，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２５０，３００，４００，５００，７５０，１０００、および１０００を越える規定の処理工程を行う。

【0034】

結果として得られる処理工程は、規定の処理工程の影響を受け、流路、チャンバー、フィルターおよび膜の特徴を含むバイオチップ全体における液体試料の移動を含んでいる；フィルターと膜の乾燥、反応混合物の熱サイクル；凍結乾燥された試薬の再懸濁、様々な液体の組み合わせ、液体の混合、液体の均質化、様々な母体を通しての試料巨大分子の電気泳動輸送、およびそれら巨大分子の励起。規定の処理工程の数は、結果として得られる処理工程より通常多い（結果として得られる処理工程より少なくなることはない）。例えば、流体充填物（fluid plug）を所定の流路から隣接チャンバーへ移動させるために（結果として得られる単一の処理工程）、複数のバルブを閉じ、複数の駆動ラインの空気圧力を変化させることが必要である（多重規定処理工程）。実施例６と図７７は、自動化された規定の工程の一部に対する、規定の処理と結果として得られる処理との間の関係を記載している。本発明のバイオチップは、２，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２５０、および２５０を越える処理工程を行う。

【0035】

全処理工程は、規定の処理工程と結果として得られる処理工程の合計である。全処理工程の数を多いほど、処理の複雑さも大きくなる。本発明のバイオチップは、２５，５０，７５，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２５０，３００，４００，５００，７５０，１０００，１５００，２０００、および２０００を越える全処理工程を行う。規定の処理工程、結果として得られる処理工程、および全処理工程は、単一の試料の処理を示す。所定のバイオチップ上で複数の試料が並行的に処理される場合、処理工程の総数は、慣例的に、１つの試料のみが処理される場合と同じになる。同様に、複数の試料が連続して同じように処理される場合（例えば、第１の試料がバイオチップを通過し、次に第２の試料のその後に続き、同じ処理を受ける）、処理工程の総数は、１つの試料のみが処理される場合と同じになる。これらの区別が重要なのは、本発明のバイオチップの複雑性が、比較的少ない数の処理工程を行うが、該処理工程を少数または多数の試料について繰り返して行うバイオチップとは対照的に、単一の試料に対して複雑な連続する操作を行うことに基づいていることにある。

【0036】

本発明のバイオチップは、上記の２つまたはそれより多い機能を統合することを可能とする。したがって、無限の数の組み合わせがバイオチップの中へ組み込まれ、複雑な操作の組み合わせがバイオチップ上で完成されることを可能としている。処理の複雑性は、上記のマイクロ流体要素に基づく多くの操作を含むことになる。例えば、本発明のバイオチップは、試料を受け容れ、溶解試薬を強く混合し、無秩序な泡により試料を溶解し、溶解物を濾過し、溶解物を計量し、溶解物をシリカ膜に結合させ、膜を洗浄し、核酸を膜から溶出させ、溶出液を均質化して精製されたＤＮＡを生成させ、ＤＮＡ溶液を計量し、凍結乾燥されたＰＣＲ反応混合物を再構成してＰＣＲ反応混合物を生成させ、該反応混合物を混合および均質化し、該反応混合物を計量し、迅速な多重増幅を実施し、終了したＰＣＲ反応混合物の一部を計量し、サイジング標準(sizing standard)を計量したＰＣＲ反応混合物で再構成して電気泳動用溶液を生成させ、該溶液を混合および均質化し、該溶液と電気泳動用試薬とを組み合わせ、材料を電気泳動流路に注入し、電気泳動分離を実施し、分離されたＤＮＡフラグメントを蛍光に基づき検出し、生蛍光データに基づいて電気泳動図を作成させ、生データを色補正し、処理データのＰＣＲピークを同定し、および読み出されたピークを解析する（例えば、人間の法医学的検証のためのＳＴＲプロファイルの作成、伝染病特定のための多重プロファイルの作成、または生物脅威病原体を同定するための多重プロファイルの作成）。当業者は、本発明のバイオチップが、実質的に無限の処理の複雑さを持つ多数の異なる種類の分析を実施できるように設計できることを理解するであろう。

【0037】

バイオチップ構造の概要
本発明のバイオチップは、単一的であり、単一の孤立構造を示す。これらの単一的バイオチップは、多くの構成部品から構成されているが、すべての部品は、マイクロ流体かマクロ流体かに関係なく、液体、固体または気体を移送する配管を使用することなく、バイオチップの一部から別の部分に直接的および永久的に取り付けられている。単一的バイオチップの利点は、オペレータ側の技術的手腕を必要とせずに、１単位として対応する機器の中に配置できることにある。また、接続配管が不要であるので、漏れを最小限にすることにより堅牢さを高めることができる。

【0038】

好ましくは、本発明の単一的バイオチップの構成材料はプラスチックである。ガラス、石英、およびシリコンウェーハは、それらから作製するには非常にコストが高いので、本発明のバイオチップにはそれらは使用せず、あるいはその使用は最小限である。すべての部品（試薬、フィルター、膜、金属箔、電極ピン、電極ストリップ等の挿入要素、並びにガスケット、感圧性接着剤（ＰＳＡ）およびテープ等のアセンブリー材料を除く）、はプラスチック製である。バイオチップの各試料経路は１回使用であることが好ましく、これは繰り返し使用による汚染を防ぎ、デザインを簡略化し、使いやすさを向上させる。したがって、一態様では、本発明では、１回の使用で、廃棄できるプラスチック製バイオチップを提供する。

【0039】

発明者らは、バイオチップの中に溶液を移送するのに用いる駆動機構に基づいた２つの広いクラスのマイクロ流体バイオチップを定義する。遠心型マイクロ流体バイオチップは円形フットプリントを有し、回転して、バイオチップ内の場所から場所へと流体を駆動する遠心力を提供する。固定型（または非遠心型）マイクロ流体バイオチップは、広い範囲のフットプリントを有し（矩形または実質的に矩形のフットプリントを含む）、バイオチップの回転によることなく駆動することが特徴である。

【0040】

本発明のバイオチップは固定型であり、それは、バイオチップ全体に流体を移動させるのに遠心力を発生させるための回転が不要であることを意味している（バイオチップは、一般的に移動可能であり、特に並進運動可能である）。その代わり、本発明のバイオチップは、空気圧的、機械的、磁気的、および流体的なものを含む駆動機構を有している。流体の移送と制御された液体フローには様々な方法を用いることができる。１つの方法は、体積式ポンピングであり、液体または介在ガスと接するプランジャーが、移動の間にプランジャーによって置換される体積に基づく正確な距離だけ液体を駆動する。その方法の例はシリンジポンプである。別の方法は、空気圧的、磁気的または別の方法で作動する統合弾性体膜の使用である。流体を駆動し、および流速を制御する好ましい方法は、空気圧駆動を用いることであり、液体の先端、後端、または両方のメニスカスにおける圧力を変化させることにより、液体自身に対して真空または圧力を直接加えることである。適切な圧力（典型的には、０．０５〜３００ｐｓｉｇの範囲および通常０．５〜３０ｐｓｉｇの範囲）が、所望の流動特性を達成するために加えられる。流れは、流体流路の大きさを適切に調整することにより制御することができ、これは、流速が、流速断面の差圧と水力直径の４乗に比例し、流路または液体充填物の長さおよび粘度に反比例するからである。また、流れは制御することができ、および流れの流路に沿って排出膜を組み入れることにより並列試料を配列させることができる。

【0041】

本発明のバイオチップは、単一の機器とともに作用して、複雑な化学分析を実施する。本明細書に記載された本発明のバイオチップは、機器から機器への試料の移動をなくし、オペレータの必要性を最小限または不要とすることにより使い易さを向上させ（適切なスクリプトとユーザーインターフェイスを用いて、単一の機械で可能である）、オペレータ操作の必要性をなくし、システムの耐久性を高める能力を向上させ（単一の機械の中にすべての耐久性向上サブシステムを組み入れることができる）、および試料処理に必要な実験チャンバーの基本的施設だけでなく必要な機器類のコストを低減することができる。実際、一実施形態において、単一の機器でバイオチップ機能を有するものは、実験チャンバー環境に対する要望を不要にするかもしれない。

【0042】

機器は、試料処理の完結に必要なすべてのサブシステムを提供する。これらのサブシステムは、高電圧および低電圧の電源サブシステム、熱サイクルサブシステム、空気圧サブシステム、磁気サブシステム、機械サブシステム、超音波サブシステム、光学サブシステム、耐久性強化サブシステム、プロセス制御サブシステムおよびコンピュータサブシステムを含んでいる。バイオチップインターフェイスに対する機器は、マイクロ流体ドライブと、バイオチップ内で実施すべき一連の処理に応じて、１つまたは複数のこれらサブシステムを用いてもよい。本明細書に記載した例では、バイオチップおよび機器のインターフェイスは、空気圧的、電気的、光学的、および機械的である。機器の大きさは、サブシステムの大きさ、バイオチップの大きさ、および処理量により決定される。機器の重量は、約１０ポンド、２５ポンド、５０ポンド、１００ポンド、１５０ポンド、２００ポンド、または２００ポンドより多い。同様に、機器の体積は、０．５立方フィート、または１，２，４，６，１０，１５，２０、または２０立方フィートより大きい。

【0043】

また、本発明のバイオチップおよび機器は、従来の実験チャンバー環境の外でも動作可能であるように設計されている。用途に応じて、移動や、温度、湿度、浮遊粒子状物質の極値に耐えうることができるように耐久性を向上させることができる。オフィス、屋外、戦場、空港、国境と港、および医療現場において、技術専門家以外のオペレータによる本発明の使用により、社会における遺伝子工学の幅広い応用が可能となる。未処理の試料の使用が、本発明の教示の広い応用を支援する。

【0044】

本明細書に述べられている本発明のマイクロ流体システム、機器およびバイオチップは、１回の使用または多数回の使用に用いることができる。１回使用の使い捨てのバイオチップの利点は、以下のものがふくまれる：
・相互汚染の最小化
多数回使用のデバイスでは、試料または試料の成分が、デバイスの中に存在し、洗浄を必要とする；残留物が次の分析を汚染する可能性がある。１回使用の使い捨てデバイスは、本質的に残留試料が存在しない。これは、新しい試料処理流路とそれらの製造方法により一部が達成され、そこでは、試料と試料との流路連絡はない。
・技術的要求の最小化
多数回使用のデバイスには、使用したデバイスを洗浄し、次の再使用に備えて準備するたまの装置が必要である。本発明の１回使用の使い捨てデバイスは、これらの要求に悩まされることがない。
・オペレータ要求の最小化
使用済みのデバイスを丁寧に洗浄し、次の再使用のために準備するのに必要な技術に加えて、デバイスまたは機器の中で挿入することにより、多数回使用デバイスの中に試薬を再装填する必要がある。１回使用の使い捨てマイクロ流体デバイスの中へすべての試薬を組み入れることにより、オペレータは操作の必要がなく、あるいは少しの試薬に曝されることがない。オペレータは、デバイスの中に試料を挿入し、スタートボタンを押すだけでよい。その結果、本明細書に記載された本発明のバイオチップは、未熟練または最小限のトレーニングを受けたオペレータにより操作することができ、典型的な実験チャンバー環境外であっても実施ができる。医療現場、戦場、軍事検問所、大使館、国家安全保障に重要なサイトおよび世界の開発途上地域で、これらの本発明のバイオチップを用いてすべての試料の分析が可能である。生物学的脅威の検出を含む用途に適用されるような試料の自主回収および分析も、オペレータ要求の最小化により利益を受ける。試料を取り扱う必要性が実質的にない方法について記載している研究は、分析の方法論のさらなる単純化と広範化を行うものであり、２０１０年２月３日に出願され、名称が「核酸精製」である米国特許出願番号No.12/699,564に記載されており、出典明示によりそのすべての内容が本明細書に組み入れられる。
・システム処理量の増加
技術的要求およびオペレータ要求の最小化は、単位時間当たりの試料数の増加を可能にする。特徴の高密度な充填は、多数の試料の並列処理を可能とし、大きなバイオチップの使用は処理量をさらに増加させる。また、処理フローの方向を逆転させることにより（例えば、電気泳動と、精製および増幅を向かい合わせにする）、より小さく、よりコンパクトなバイオチップと機器が可能となる。
・コストの最小化
必要労働力の最小化と一般費用の除去はコストを低減する。

【0045】

本明細書に記載された本発明のバイオチップは、ＳＢＳマイクロタイタープレートの大きさよりも大きい。バイオチップのフットプリントの大きさは、８６×１２８またはそれより大きい、１００×１５０ｍｍまたはそれより大きい、１１５×２７５ｍｍまたはそれより大きい、１４０×２７５ｍｍまたはそれより大きい、１６５×２９５ｍｍまたはそれより大きい。また、本発明のバイオチップは、ＳＢＳ基準に対応しない１０，９２０．０ｍｍ^２未満のフットプリントを包含している。本発明の教示は、先例がない程の試料数の複雑さと処理の複雑さとを有するバイオチップの設計および作製を可能にする。特定ユーザーの要求と所定の用途の要求に基づいてフットプリントを作製することができる。

【0046】

本発明のバイオチップの試料数と処理の複雑さが増加すると、バイオチップの特徴密度も増加する。この文脈では、マイクロ流体的な特徴は、ＣＮＣ加工により切断されるか、または射出成形により成形される、問題の層の面積として規定される。特徴密度は、問題の層の表面積に対するマイクロ流体特徴の数の比率である。例えば、実施例５と６のバイオチップは、以下の密度を有している：流体工学層の上面および底面は、マイクロ流体特徴により占有される表面積が、それぞれ約２０．２％と６．６％である。空気力学層の上面および底面は、マイクロ流体特徴により占有される表面積が、それぞれ約７．５％と８．８％である。同じバイオチップの１６試料用は、実質的に同じフットプリントを占有しているが、より高い密度を有している：流体工学の場合は１９％と１３．７％で、空気力学の場合は１８．３％と２５％である。層上の局所密度は、６０％またはそれより高い（実施例４，５および６のバイオチップの特定領域は、約３ｃｍ^２の領域において６４％を越える局所密度を有している）。本発明の空気力学バイオチップおよび流体工学バイオチップは、それらの表面積の５，１０，１５，２０，２５，３０，４０，５０，６０，７０，８０、および８０％を越える領域がマイクロ流体特徴により占有されている。マクロ流体特徴も密度に寄与している。

【0047】

本発明のバイオチップの特徴
本発明のバイオチップは、熱可塑性層を含み、該熱可塑性層は、１つまたは複数の流体移動流路（それらは、独立してもよく、接続してもよく、またはネットワーク化してもよい）、スルーホール、配列特徴、液体および凍結乾燥した試薬の貯蔵チャンバー、試薬放出チャンバー、ポンプ、計量チャンバー、凍結乾燥したケーキの再構成チャンバー、超音波チャンバー、結合チャンバーおよび混合チャンバー、混合要素、膜領域、濾過領域、排出要素、加熱要素、磁気要素、反応チャンバー、廃棄チャンバー、膜領域、伝熱領域、アノード、カソード、検出領域、ドライブ、バルブライン、バルブ構造、アセンブリー特徴、機器インターフェイス領域、光学窓、熱窓、および検出領域等のマイクロ流体特徴を含んでいる。バイオチップは、マクロ流体特徴、すなわち、上記のマイクロ流体特徴と同じタイプのより大きなものである特徴を含んでいる。例えば、バイオチップは、３０μＬの液体を含むマイクロ流体試薬貯蔵チャンバーと、５ｍＬの液体を含むマクロ流体試薬貯蔵チャンバーを含んでもよい。本発明のバイオチップにマイクロ流体特徴とマクロ流体特徴を組み入れることにより、所定のバイオチップがマクロ流体処理要求とマイクロ流体処理要求の両方を満たすことを可能にする。これは、比較的大体積を必要とする試料（法医学スワブまたは臨床血液試料等）をマイクロ流体スケールで処理する必要がある場合には利点となる。

【0048】

バイオチップに、パターンを付与された薄膜、スペーサー層、接着層、弾性層および非弾性層、並びに検出領域、を含む薄膜も組み入れてもよい。バイオチップは、特定の駆動機構（例えば、空気圧的、機械的、磁気的、および流体的な駆動のための作動ライン）に基づく層を組み入れてもよい。マイクロ流体バイオチップが、マクロ流体領域、特に法医学試料、臨床診断試料、および生物学的脅威試料のためのマクロ流体領域を含んでもよいことは留意されたい。

【0049】

本発明のバイオチップは、未処理の生物学的試料からの核酸および他の生物学的成分の精製、操作、および分析を可能とする。未処理の生物学的試料は、別々に集められ、中間の処理工程なしで、バイオチップの試料受容チャンバーに挿入される（しかし、試料採集機器は標識され、および／または処理に先立ち保存される）。オペレータは、単に試料を集めるか、あるいは単に試料を取得し、試料を器具に挿入し、該器具を機器の中に挿入し（該器具が予め機器の中に配置されている場合には必要ない）、およびスタートボタンを押すだけでよい。器具に挿入する前には、試料の処理、操作、または修飾は不要であり、オペレータは、スワブをカットしたり、血液管を開けたり、組織または生物学流体を集めたり、試料を別のホルダーに移したり、または試料を試薬または条件（例えば、熱、寒さ、振動）に曝す必要はない。したがって、オペレータは、生物科学または検査技術について広範囲なトレーニングを受ける必要はない。必要に応じて、本発明のバイオチップは処理された生物学的試料（例えば、後の精製に用いる細胞溶解物）を対象とすることもできるが、そのような用途は、技術教育を受けたオペレータを必要とするかもしれない。

【0050】

実際、生物学的試料は無数の採取器具を用いて集められ、それらは本発明のバイオチップに用いることができる。採取器具は一般的に商業的に入手可能であるが、所定の目的のために特別に設計しおよび製造することができる。臨床試料については、鼻、鼻咽頭、口、口液、大便、扁桃、膣、子宮、および傷のスワブを含む様々な商用スワブの種類が使用可能である。試料採取器具の大きさや材質は変化し、該器具は、直接破断を容易にする特別のハンドル、キャップ、切り込み線や、採取母体を含んでもよい。血液試料は、広い様々な範囲の商業的に入手可能な、様々な体積の管の中に集められ、それら管のいくつかは、添加剤（ヘパリン、クエン酸塩およびＥＤＴＡのような抗凝血剤を含む)、試料導入を容易にする真空、針挿入を容易にするストッパー、および試料に曝すことからオペレータを守るカバーを含んでいる。組織および体液(例えば痰、化膿性物質、吸引液)も管(血液管とは一般に異なる)に集められる。これらの臨床試料採取器具は、試験のために先端病院または民間臨床検査所に一般的に送られる（迅速連鎖状球菌検査用の喉／扁桃スワブの判定等の特定の検査は、臨床現場で行うことができるが）。環境試料は、フィルターまたはフィルターカートリッジ（例えば、吸気、エアゾールまたは水濾過器具から）、スワブ、粉末、または流体に存在してもよい。

【0051】

法医学の証拠用の共通の採取技術はスワブを用いて行なわれる。スワブは、ボード社（ロートン、バージニア州）、ピューリタン社（ギルフォード、メイン州）、フィッツコ社（スプリングパーク、ミネソタ州）、ボカ社（コーラルスプリング、フロリダ州）、コーパン社（マリエータ、カルフォリニア州）、およびスタープレックス社（エトビコーク、オンタリオ州、カナダ）から商業的に入手可能である。スワビングは、ゲージ状材料、使い捨てブラシ、または商業的に入手可能な生物学的試料キットを用いて行うこともできる。法医学試料は血液、精液、上皮細胞、尿、唾液、糞便、様々な組織および骨を含んでもよい。ヒトに存在する個体からの生物学的証拠は、頬側スワブを用いてしばしば採取される。広く用いられる商業的頬側スワブは、セクアスワブ（SecurSwab）（ボードテクノロジーグループ、ロートン、バージニア州）である。頬側試料は、被験者またはオペレータに指示して、口の内部の頬表面上にスワブを入れて、１回または複数回スワブを上下に移動させることにより採取される。

【0052】

本発明のバイオチップの別の大きな利点は、多数の試料に対して複雑な処理を並列的に実施できることである。バイオチップの可撓性により、同じ一連の操作を用いて多数の試料を処理すること、あるいは特別な一連の操作を用いて各試料（または試料の部分集合）を処理することが可能となる。さらに、複数の独立した分析を、所定の試料について行なうことができる。例えば、ＤＮＡを分離し、次にＳＴＲ分析、ＳＮＰ分析、および精製された材料に対してミトコンドリア配列決定を行うことにより、法医学的試料を分析できる。同様に、核酸とタンパク質を精製し、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、および免疫アッセイを行うことにより、臨床試料を分析でき、それにより（例えば）、単一のバイオチップ上で、多数の病原体や細胞プロセスを同時に調べることが可能となる。発明者らは、本明細書に、異なる統合問題に対する解決策だけでなく、異なる必要な機能に対する多くの解決策を記載している。これらは例示であって限定するものではなく、当業者であれば、様々な用途のための様々なバイオチップおよび手段にこれらの成分と統合の技術を適応させることができる。

【0053】

バイオチップの操作およびデータ解析のためには、一連のソフトウェアとファームウェアが必要である。機器のハードウェアは、成分関数を指令し、機器の自己診断テストを行なうソフトウェアおよびファームウェアによって制御される。自動化されたスクリプトは、すべての既定の処理工程の適用を含む、バイオチップを有する機器のすべての相互作用を制御する。解析ソフトウェアは、生データ(例えば電気泳動図の色補正)の処理およびアッセイ(例えばフラグメントサイジング、ＳＴＲ対立遺伝子呼び出し、ＤＮＡ配列解析)の結果の解析を行う。機器は、ユーザーに処理を開始させ、ユーザーに処理状況を知らせることができるグラフィカルユーザーインターフェイスを含んでもよい。最後に、システムは適切な解析コンパレーター(例えば興味のある個体からのＳＴＲプロファイルまたは病原体のＤＮＡ配列）を保存してもよく、あるいはシステムは、外部データベースとのマッチングおよびさらなる解析のために結果を移植してもよい。

【0054】

バイオチップ製造
本発明は、バイオチップの製造方法を提供するものであり、該バイオチップは、完全に統合され、試料の前処理調製が不要であり、ＳＢＳの寸法範囲に制限されず、かなり大きくでき、マイクロタイターフォーマットに制限されず、試料数の複雑さや処理の複雑さを取り込んでいる。

【0055】

バイオチップは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル(ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)、環式オレフィンポリマー(ＣＯＰ)および環式オレフィン共重合体(ＣＯＣ)を含む熱可塑性ポリマー、および本明細書で請求された新規な方法に基づく大量生産に適している他のポリマーから作製することができる。バイオチップは、大きなプレート(ＳＢＳ標準プレートより大きいものを含む)をＣＮＣ機械加工して作製することができ、ＣＮＣ機械加工のブランクプレートは射出成形で作製してもよい。バイオチップは、大きなプレート（ＳＢＳ標準プレートより大きいものを含む)を射出成形して作製することもできる。必要に応じ、特性を向上させるために、バイオチップに被膜を形成してもよい（組み立て前、組み立ての間の中間工程、または組み立て後）。広範囲の被膜と処理を適用することができる。例えば、流路を０．５％の牛血清アルブミンに曝すと、試料中に存在するタンパク質の流路壁への結合を減らすことができる。ＰＦＣ５０２Ａ（サイトニックス社、ベルトビル、メリーランド州）等の疎水性生成物は泡生成を最小限にするためにチャネル、チャンバーおよびバルブに適用することができる。同様に、空気圧的および機械的バルブ構造の弾性体膜または非弾性体膜は、最適なシーリング特性を得るために、被覆されるか、そうでなければ処理される。

【0056】

さらに、本発明の別の態様は、バイオチップおよびそれらの製造方法であり、同じバイオチップ上で多数の試料を処理すると同時に、複雑な一連の処理工程を実施するために大きなバイオチップを作製する、という問題を解決するものである。バイオチップがＣＮＣ機械加工により作製されるか射出成形により作製されるかに関係なく、バイオチップの特定の領域に、細かい特徴を高密度に一体的に充填し、アスペクト比を最大にしながら結合を可能とするようにそれらの間に空間を残しことにより、この複雑性が達成される。この射出成形されたバイオチップは、作製時および結合時にそれらが平らで、反りが最小限であり、限定された収縮特性を有するように、および処理工程の複雑性を可能とする特徴を支援するために適切な配列許容性を有するように、設計および作製されている。

【0057】

本発明のバイオチップは、流体サブアセンブリー、空気圧サブセンブリー、バルブサブアセンブリー、マクロ流体処理サブアセンブリー、分離および検出サブアセンブリーを含む複数のサブアセンブリーを含んでいる。すべてのサブアセンブリーが所定のバイオチップに必要であるという訳ではない。例えば、マクロ流体試料の体積とチップ上の試薬が不要であれば、マクロ流体サブアセンブリーは必要ではない。しかしながら、本発明のバイオチップは、少なくとも１つの、ＣＮＣ機械加工された、エンボス加工された、押し出された、または射出成形された層を一般的に有している。単一層は、流体をバイオチップの１つの領域から別の領域へと移動させる流体特徴と制御特徴の両方を含んでいる。多くの場合、流体層と制御層とが別々であることが好ましく、それは処理の複雑性を増加させることを可能にするからである。１層または複数層は、片面または両面に特徴を有している；両面特徴の利点は、処理の複雑性、特徴密度、および試料数を増加させるとともに、作製コストを低減し、および組み立てを容易にすることにある。多数の層を用いる場合、公知の多くの技術、例えば、熱結合、溶剤結合、接着結合および超音波溶接を用いて多数の層を結合してもよい（Tsao. C.-W(2009)、熱可塑性ポリマーマイクロ流体の結合、Microfluidics and Nanofluidics 6:1-16の解説）。マイクロ流体バイオチップの層の数を検討する場合、達成すべき両方の所望の複雑性を可能とする最も少ない数の層を用いることが望ましい。層数を最小にすることは、作製および組み立ての複雑性を減らし、および結果的にバイオチップの製造コストを低下させる。

【0058】

本発明のバイオチップの作製の別の態様は、様々なサブアセンブリーの上面と底面の上に配置された層に関する。「薄膜」と名付けられたこれら中間層の目的は、ＣＮＣ機械加工された層または射出成形された層を互いに結合させて、該ＣＮＣ機械加工された層または該射出成形された層を外部から保護すること、機器と層の中のチャンバーとの間を熱結合すること、機器内の要素による効率的な励起と検出を可能とするように適切な光学特性を与えること、層間に流路を設けること、膜、フィルター、および他の要素を保持すること、および直列バルブ用の材料に射出成形層を用いることである。非弾性体の薄膜材料は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、環式オレフィンポリマー、環式オレフィン共重合体、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタレート、アルミニウム、および三酢酸セルロースを含んでいる。弾性体薄膜材料は、Plastic: Materials and Processing 第３版（前掲）に記載されているような、広範囲のゴム(シリコーンを含む)と熱可塑性エラストマーを含んでいる。これらの膜は、厚さが１ミクロンから５００ミクロンである。

【0059】

ＣＮＣ機械加工された層または射出成形された層と薄膜は、互いに結合してバイオチップを形成するので、層の間および層を横切る流体連絡は、スルーホールにより提供される。スルーホールは、所定の層の上方から下方へと通過する層であり、ある層から別の層への流体の移動を可能にする層である。スルーホールは実質的にどのような形状でもとることができ、円筒状が多い。本発明のバイオチップは、多数のスルーホールを提供し、試料数の複雑性や処理の複雑性を可能とする。例えば、射出成形された実施例６の６試料のバイオチップと、１６試料の対応バイオチップは、以下のスルーホールを含んでいる。

【0060】

「Ｓ＆Ｄ」は、「分離および注入」（separation and injection）を指す。まとめると、６−試料バイオチップの部分（マクロ流体処理サブアセンブリーは除く）は９２９個のスルーホールを含み、１６−試料のアセンブリーは２７４７個のスルーホールを含む。本発明のバイオチップは、５０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，１５００，２０００，２５００、または２０００個を越えるスルーホールを含む。マイクロ流体特徴の合計（スルーホールを含む）について考えると、本発明のバイオチップは、１０００，２０００，３０００，４０００，５０００，７５００，１００００またはそれを越える特徴を有している。

【0061】

１層当たりの特徴の数が多い場合、本発明のバイオチップの層は、機器のインターフェイス接続の様々なサイトに対してだけでなく、すべての層に対して適切に配列されなくてはならない。配列の要因は結合時、特に熱結合時の部品の収縮に関係する；配列の問題は、部品間の収縮差により悪化する。本発明のバイオチップは、収縮差に対して責任を持つように設計および作製されている。組み立てを容易にするため、最大数の特徴と持った部分を収縮基準として用いる。すなわち、結合の後、その寸法が機器とインターフェイス接続するのに必要な寸法となるように設計される。他のすべての部品の寸法は、結合後に、それらが基準プレートに合わせて配列するように寸法合わせがなされる。

【0062】

機器のインターフェイス接続サイトにおける配列は、インターフェイス特徴を適切に寸法設定および配置することにより達成される。例えば、本発明の空気圧インターフェイスは、数ダースのポートから成る。バイオチップの空気圧層全体に広げる代わりに、それらは中心に集中している。空気圧層は全体として収縮するが、ずっと小さな空気圧インターフェイス領域はずっとわずかしか収縮しない。さらに、バイオチップはアセンブリーのための配列特徴を有しており、それは流体層および空気圧層の内部に組み入れられた配列穴を含んでいる。流体層を空気圧層に合わせて配列させるため、空気圧層と流体層の対応する配列穴の中に位置合わせピンが挿入される。機器内に確実に適切に配置するための配列特徴は、空気圧層（および流体層ではない）に登録する機器内のガイドを含み、そこには空気圧ポート特徴が配置されている。部品収縮は見積もることはできるが、実際の組み立て過程の後での収縮は慎重に測定する必要がある。例えば、実施例５の空気圧プレートと流体プレートは、それぞれ（Ｘ方向とＹ方向にそれぞれ−０．０６３％と０．１１６％）、（０．１５１％と０．４０１％）収縮し、およびこの収縮差を補償するために、空気圧プレートは、その大きさを（０．２１４％、０．２８５％）増加させた。

【0063】

層対層と機器対バイオチップの両方の配列は、配列すべき部品の数を最小限にすることにより管理される。例えば、ＣＮＣ機械加工されたまたは射出成形された、本発明のバイオチップの空気圧プレートおよび流体プレートは、その両面に存在する特徴を一般的に有している。これにより、組み立てに必要な部品の数を半分にできる。

【0064】

配列特徴と同時に、別の層の特徴と連絡する必要のある所定の層の特徴は、許容度をもって設計される。特に、バルブ特徴（実施例２に記載されている）は、流体チャンバーと弁座に合わせて空気圧特徴を配列させることを必要とする。さらに、空気圧層のスルーホールは、マクロ流体処理サブアセンブリーの中のチャンバーの出力を、流体層内の対応する入力ホールに接続する。２個のスルーホールを位置合わせする場合は、一般的に、２つのスルーホールの位置合わせの達成を確実に行うため、スルーホールの一方の直径を０．５ｍｍだけ大きくする。

【0065】

本発明のバイオチップは、閉鎖システムを表し、該閉鎖システムでは、バイオチップの中に試料が挿入されて密封され、バイオチップからは液が漏れない（すなわち、試料処理の最初にバイオチップ内に含まれている処理試薬は試料処理が終了するまでバイオチップの中に含まれている（そしてバイオチップが取り除かれる時、機器から除去される））。空気圧駆動ラインからの空気は、バイオチップに入り、空気は排出膜を通してバイオチップの外へ排気される。本発明の閉鎖システムバイオチップは、オペレータが試料または薬品および重要な安全特徴に曝されることがなく、および未使用の試薬または使用済みの試薬のいずれも機器内に貯蔵する必要がないという点で機器を簡単にできる。

【0066】

複雑な完全統合されたバイオチップの中に多数の細かい特徴が存在しなければならないので、マイクロ流体特徴の射出成形は、多くの挑戦を提供する。これらのマイクロ流体特徴は、マクロ流体特徴に沿った所定の部分に時折存在し、射出成形の挑戦をさらに増加させている。発明者らは、本明細書で、特別なタイプのバイオチップのためのデザイン検討事項に対する特別の解決策を提示しているが、当業者は、これらの特別な解決策を、特別の機能を持った数多くのタイプのバイオチップの作製に適用できるであろう。これらの例の中の設計検討事項の中には以下のものがある；精密射出成形における収縮および形状安定性、バイオチップの平坦性、バイオチップの反り、最小の特徴寸法、特徴密度および適切なアスペクト比等の幾何学的態様。本発明のバイオチップの射出成形部品のデザイン特徴は、射出成形プロセスの文脈で記載されるであろう。射出成形はプラスチック部品の作製プロセスであり、そこでは、金型は加圧されて締め付けられ、溶融プラスチックの注入と冷却が行われる。プラスチックの細粒（樹脂ペレット）は、射出成形機に供給され、次いで着色剤が供給される。樹脂は、注入バレルの中に落下し、そこで融点まで加熱されて、往復スクリューまたはラム装置のいずれかを通って金型に注入される。溶融プラスチックは金型の中に含まれ、金型の中のすべての空洞が充填されるまで、水圧または機械的圧力が加えられる。プラスチックは金型の中で冷却され、金型が開けられ、プラスチック部品が突出しピンで押し出される。全プロセスは、サイクル的であり、サイクル時間は、１０秒間から１００秒間の範囲であり、必要な冷却時間による。

【0067】

金型は２つの１次部品、射出金型と押出金型から成る。プラスチック樹脂は、湯口（sprue）を通って射出金型に入る；スプルーブッシュ（sprue bushing）は、注入バレルから金型キャビティに溶融樹脂が流れるように、該注入バレルのノズルに対して十分に密閉されている。スプルーブッシュは、プレートの面に機械加工された流路（またはランナー）を通して、溶融樹脂をキャビティ形（cavity images）に移動させる。溶融樹脂の流れは、１つまたは複数のゲートそしてキャビティ形状の中に入り、所望の部品を形成する。金型を開けた時に、完成部品が確実に金型の押し出し側に残るように、金型は通常設計されている。部品は、押し出された時に自由に落下する。金型は、ＣＮＣフライス加工や放電加工を含む機械加工方法の組み合わせを用いて製造することができる。

【0068】

本発明のバイオチップの射出成形用デザインに対する全体的なアプローチは以下のものを含む：
・層数の減少。
射出成形層の数を、層の両面に特徴を作製することにより、１つの流体層および１つの空気圧層に減らした。互いに横切る流路が層の別々の面上に至るように、流体ラインと空気圧ラインとを一部配置することにより、これが達成された。いくつかの場合、上がり下がりの変化も必要であった。垂直方向の変化は、大きな圧力低下と、流路伝達の減少をもたらすので、これらは最小限とした。排出膜とフィルター膜の超音波溶接を可能とする特徴も設計された。溶接特徴を組み入れることにより、射出成形層を減少させた。
・特徴密度の増加。
流路と特徴の充填密度の増加は、射出成形層の数と寸法を減少させて、収縮を減少させおよび配列性を向上させる。実施例５のバイオチップの空気圧層の図４４，６１の空気圧マニホールド領域では、例えば、流路のピッチは１．０ｍｍで、１０流路が１ｃｍ^２の領域の中に配置されている。流路間の狭い（０．５ｍｍ）壁にも拘わらず、流路を密閉した熱結合方法を開発したことにより、この密度が達成された。細かいピッチと狭い壁を持った特徴の熱結合は、平坦性を確保するために均一表面と低表面粗さとを有する結合用取付具を用いることにより達成された。さらに、２つの結合プレートが使用され、所定の射出成形アセンブリーまたは射出成形サブアセンブリーの全体の細かい特徴について信頼性のある結合を確保するために、０．０００５”の許容度に対応するように配置された。最後に、プレート全体の温度の均一性を０．２５℃の範囲内とすることにより、アセンブリーまたはサブアセンブリー全体に対して信頼性のある結合を確保している。
・抜け勾配の最小化。
部品を金型から離れ易くするために、すべての特徴の垂直面は、抜け勾配を持ってわずかに傾斜している。射出成形における抜け勾配は、典型的には２〜７°の範囲である。本発明の射出成形されたプレートは、０．５％のより小さな抜け勾配を用いた；抜け勾配が小さい程、射出成形特徴をより高密度に充填できる。これら小さな抜け勾配に合わせるため、成形プロセスで一般的なものよりも、マイクロ流体特徴により近付けて突出しピンを配置した。
・スルーホール。
射出成形のゲートを適切に配置することにより、ニットライン／ウェルドラインを減少させた。さらに、特徴の寸法と、大きな特徴の周囲の樹脂流れとを保持することが困難であるので、成形部品の大きな空いた特徴を最小化した。
・壁厚さ。
特徴床の１．０ｍｍの厚さと、特徴間の０．５ｍｍの壁の厚さがデザイン全体で維持された。
・平坦性と反り。
厚さを最小化するために、特徴間の適切な層厚さと変化が採用された。得られたプレートの平坦性が確認され、部品の内部応力を最小化するために、射出成形プロセスに対する調整が実施される。成形プレートの反った領域は、突出しピンの配置を変更することにより、調整される。さらに、平らでない領域を微細機械加工することにより平坦性が向上する。
・特徴アスペクト比。
高アスペクト比の特徴は最小化され、アスペクト比が２より小さく維持された。高アスペクト比の特徴は、金型から成形部品が効率的に押し出されるのを妨げる傾向がある。
・押し出し特徴。
突出しピンの場所を最小限とし、金型の半分の押し出し部分の上にだけ配置された。突出しピンは、部品の表面に局所的な変形を生成させ、それにより、結合が弱いか全く結合しない領域を生成させる。部品の突出しを繰り返すのに必要な動きを最小限にするように、金型内の突出しピンの動きが調整された。
・射出成形収縮。
樹脂用射出成形での収縮のすべては、収縮に適応することにある。さらに、金型温度と保持時間を調整することにより収縮はより細かく調整された。射出成形プレート内のすべての特徴が所定の許容範囲内で配列されるように、空気圧部品と流体部品の収縮は調整される。
・ブロック成形。
上記のアプローチは、両面が平らなプレート（例えば、流体プレート、空気圧プレート、およびマクロ流体処理カバープレート）の成形に適用可能である。マクロ流体処理ブロック等のより高体積のブロックを成形するために、これらのアプローチにおいて、アスペクト比が通常２より大きいというように変更された。ブロック成形の場合、１°未満の抜け勾配がデザインの中に組み入れられ、大きなチャンバーの体積を最大限にしながら成形部品から突出しピンを効率的に除去することを可能とした。

【0069】

本発明の完全に統合されたバイオチップは、オペレータの介在がない状態で、単一の機器で実施される、試料の挿入から結果生成までの一連の複雑な処理工程を実行できるバイオチップを提供することにより、マイクロ流体の可能性を実現する。さらに、これら本発明のバイオチップは使い捨て可能であり、コスト効率よく製造できる。

【実施例】

【0070】

実施例１．試薬保存および放出
本発明のバイオチップは、様々な処理を行うための試薬を必要とし、およびこれらの試薬は、それらが曝されるバイオチップ材料、操作条件および環境条件に対して適合しなければならない。

【0071】

本発明の試薬は、いくつかの方法でバイオチップの中で導入できる。
最初に、試薬は、通常使用直前にバイオチップに手作業で添加することができる。手作業による添加の利点は、バイオチップは試薬を長期間保持する必要がないので、バイオチップ上での長期安定性を最小限にすることができる。手作業による装填の欠点は、オペレータが技術教育を受けおよび専門知識を有することが必要であること、正確に配置されていない試薬は適切な処理を妨げること、および試薬を置くことが汚染源になる可能性があることである。配置の第２の方法は、機器の中または機器の近くの容器に試薬を貯蔵することである；配管または他の流路が、所望の処理時間で試薬をバイオチップに移送する。この方法の利点は、一度試薬容器を設けると、システムの複数の分析の実行を可能にすることである。欠点は、機器内に実質的な移送流路が必要であり、流路を通る妥協による流れは、例えば乾燥して流路上の残留物となり、また機器を開く必要があるので、損傷または汚染の可能性があり、複数の分析の実行のための試薬の貯蔵を可能とするためには、機器の大きさを相対的に増加させる必要があること、およびオペレータが技術教育を受けおよび専門知識を有することが必要であることである。

【0072】

好ましい方法は、バイオチップの中に試薬を配置することであり、予め搭載された試薬はバイオチップの必須部分であり、オペレータは実質的にさわることができない。この方法の利点は、オペレータが決して試薬に接する必要がないか、技術教育または専門知識を必要とせず、および、バイオチップが閉鎖システムの場合、汚染の可能性を最小限にできる。さらに、機器はバイオチップを受け容れるが、別の試薬管または試薬カートリッジを配置するために開く必要はない。チップ上の試薬が機器と接触しないようにする駆動システムと組み合わせる場合、バイオチップは閉鎖システムであり、汚染の可能性を最小限にしながらさらに使い易さを向上させることができる。

【0073】

チップ上に試薬を貯蔵するために、試薬は接触するすべてのバイオチップ材料に対して適合性を有する必要があり、および必要に応じ処理に対して利用可能でなければならない。発明者らは、これら要求に対する１つのアプローチを「試薬貯蔵および放出（ＲＳＲ）」と名付け、これは、試薬がバイオチップの中に貯蔵および隔離され、処理時には必要に応じて放出されることを示している。

【0074】

ＲＳＲへのアプローチは、ブリスターパック、チューブインチューブ（tube-in-tube）構造（試薬を含む管がバイオチップ試薬槽の中に挿入されている）、および単一チューブ構造（試薬がバイオチップ試薬槽の中に直接充填されている）。動作方法は、圧力を用いる方法（必要に応じ切れ目をいれた箔の使用を含んでもよい）、ピンを用いる方法（機械的または空気圧的に作動させたピンが箔シールを刺す）、および機械的方法（機器要素が貯蔵された試薬に圧力を加える）、を含む。

【0075】

ブリスターパック。
このアプローチでは、アルミ箔でシールされたブリスターパックまたはスティックパックを用いて試薬を貯蔵する。機械的力をパックに加えて中身を試薬槽に放出させる。

【0076】

チューブインチューブ構造。
このアプローチでは、試薬チューブは熱可塑性プラスチックで作製され、箔シールは試薬充填の前にチューブの底部に適用され、第２の箔シールは充填後にチューブの上部に適用される。封止された試薬チューブは、次にバイオチップの適切な試薬チャンバーの中に挿入される。積層されたアルミニウム製の封止用箔のいずれを選択しても、熱封止に使用できる。これらの箔の特徴は、アルミニウム薄膜に積層されたポリマー性熱封止表面にある。保護のためにアルミニウム箔上に用いられた被膜は、試薬自身、熱、およびかき傷に対して耐性のあるものが選択される。保護皮膜は、熱封止表面としても作用してよい。

【0077】

単一チューブ構造。
このアプローチでは、バイオチップ自身内部のチャンバーが貯蔵媒体である。このアプローチでは、利点は、バイオチップが比較的小さいこと（チューブインチューブはさらに壁を必要とする）、および作製し易いことである。図１は、単一チューブＲＳＲアプローチを示している。箔シール（１０１）は、各試薬貯蔵チャンバー（１０２）の上部と底部に結合されている（熱的に、超音波溶接により、または接着剤により）。底部の箔がまず結合され、液体試薬が充填され（１０２の陰影で示される）、そして上部箔が結合され、試薬貯蔵チャンバーが封止される。上部カバー（１０３）は、箔を破裂させるのに必要な圧力を付与する空気圧駆動ラインを含んでいる。凍結乾燥された試薬（１０４）は、箔の間に貯蔵することもできる。

【0078】

上部箔と底部箔を破裂させるのに必要な圧力が、試薬を試薬チャンバーから速やかに流出させる。試薬の流れを減少させるために、試薬チャンバーの底部に流量制御オリフィスが作製されている。オリフィスの直径は、適用される箔破裂圧力で所望の流れが得られるように寸法が調整されている。実施例２に記載されているように、流体の流れと並んだ液体を制御するために、バルブ膜と排出膜を用いることもできる。さらに、ＲＳＲチャンバーに空気圧駆動圧力が加えられる場合、箔は、破裂するに先立って膨張するのに十分な空間を持つ必要がある。この空間要求に対応するため（厚さ２５ミクロン、直径８ｍｍの箔に対して約１ｍｍ）、破裂用の膨張空間を付与するためにＲＳＲスペーサープレートが設計された。ＲＳＲスペーサープレートは、試薬チャンバーの大径（この場合８ｍｍ）の出口と、バイオチップの小径（０．５〜１ｍｍ）の入口穴とを結合する接続部を提供し、およびテーパーを有する２つの界面の間の試薬の流れの移行部を提供する。入口穴は、流体サブアセンブリーの特徴に届く、空気圧サブアセンブリーの中のスルーホールでもよく、あるいは流体サブアセンブリーまたは分離および検出サブアセンブリーに直接結合してもよい。図２は、５試料のバイオチップに使用されるスペーサープレート１０５の写真であり、ＲＳＲ破裂を必要とする液体試薬チャンバーと結合させるためのＲＳＲ移行部１０６を示している。従来の移行部１０７は、混合と保持に用いられる処理チャンバー（膨張空間を必要としないので試薬貯蔵に用いられるものではない）を、バイオチップの入口穴に結合させる。図３は、ＲＳＲチャンバー接続部１０８、円錐テーパー部１０９、およびバイオチップ接続部１１０を含むＲＳＲ移行部１０６の断面図である。また、示すように、従来の移行部１０７は、処理チャンバーと別のバイオチップサブアセンブリーとの間のスルーホール移行部である。スペーサープレートは、感圧性接着剤と機械的留め具により試薬チャンバーに取り付けられている。他の取り付け方法は、接着剤を用いる場合と用いない場合のガスケット、ねじ、熱かしめ、およびリベットの使用を含む。

【0079】

動作させるのに空気圧しか必要でないので、箔の空気圧破裂は好ましい方法である。バイオチップ内の空気圧駆動ラインを介してチューブの上部に供給される空気圧により箔シールは破裂する。この構造では、試薬チャンバーに適用される圧力は、箔上部に加えられ、それを破裂させる。破裂すると、チューブ内の試薬に直接圧力が加えられる。これにより、箔の底部が破裂し、処理用の溶液が放出される。空気圧破裂に用いる箔の選定にはいくつかの要素を検討する必要がある。空気圧破裂に適合するためには、破裂圧力が、バイオチップの構造に対して適切であり、バイオチップの許容範囲内である必要がある。本発明のバイオチップは、熱結合、溶剤結合、および接着剤結合により組み立てられており、望ましい破裂圧力は約２０〜５００ｐｓｉｇである。１０〜５００ミクロンの薄い箔フィルムがこの目的に適しており、好ましくは１０〜３０ミクロンである。

【0080】

図４は、直径２〜８ｍｍのチャンバーに結合した、１２ミクロン（実線）と１８ミクロン（破線）のアルミニウム箔に必要な空気圧破裂圧力を示している。破裂に必要な圧力は、箔の厚さの増加とともに増加し、チャンバー/箔の直径の増加とともに減少する。各点は、破裂に必要な平均圧力を示している（直径２ｍｍではｎ＝２、直径３ｍｍではｎ＝６、直径４ｍｍではｎ＝１０、直径５ｍｍではｎ＝９、直径６ｍｍではｎ＝１０、直径７ｍｍではｎ＝４、直径８ｍｍではｎ＝４）。破裂圧力は、箔材料の種類により影響を受ける。

【0081】

必要により、薄い箔への切り込みは破裂圧力を低下させる；箔上の様々な大きさおよび形状の切り込みを用いることができる。例えば、レーザーダイまたは機械ダイを用いた、様々な深さのライン、十字、円からなる切り込みを用いて、さらに破裂圧力を調整することができる。図５は、６チャンバーを備えたＲＳＲユニットを示している（各チャンバーは、直径が８ｍｍで、高さが５０ｍｍである）。２５ミクロンのアルミニウム箔にレーザー切り込みを入れ（４．５ｍｍの十字で、中心に深さ約１０ミクロンのラインを設けた)、熱かしめにより前期ユニットに熱結合された。底箔は最初に配置され、食品着色剤を有する液体試薬が各チャンバーに充填され、上部箔が結合された（図６）。

【0082】

試薬チャンバーの両面破裂は、図６のチャンバーの中に２ｍｌの試薬を充填し封止することにより実施された。該チャンバーの封止に使用された箔には切り込みが入れられ（４．５ｍｍの十字で、中心に深さ約１０ミクロンのラインを設けた)、３２ｐｓｉｇのわずかな破裂圧力であった。各チャンバーはＲＳＲスペーサープレートに取り付けられ、該プレートは次にマイクロ流体流路に取り付けられた。空気は破裂部からベント部へ移動するが、前記チャンバーから放出される流体は阻止されないように、マイクロ流体流路の出口は排出膜で封止された。カバーは、前記チャンバーの上部に固定された。該カバーは、６チャンバーの各チャンバーを空気圧駆動ラインに結合する。空気圧システムは、一度に１チャンバーだけに圧力を加えるように構成されている。液体がマイクロ流体流路の中へ流入するのが観察されるまで、空気圧駆動圧力を徐々に増加させ、この圧力を記録した。試験に用いた２４枚の箔すべて（４ＲＳＲユニット）が、３２ｐｓｉｇ±３ｐｓｉｇで破裂した。図７は、破裂後の箔を示している。破裂時に箔の破片がバラバラにならないようにして、潜在的に試薬の出口流路を塞ぐように、箔材料、切れ込み深さおよび構造、および破裂圧力が、協同して選択される。本明細書に示した切り込み箔は、箔の破片を発生させない。

【0083】

第２の実験では、試薬チャンバーは、切り込み箔を用いて上述のように充填されおよび封止された。該チャンバーは、マイクロ流体流路に取り付けられているＲＳＲスペーサープレートに取り付けられた各マイクロ流体流路の出口は排出膜で封止された。カバーは前記チャンバーの上部に固定され、すべての試薬チャンバーに対して４５ｐｓｉｇの圧力が１秒間加えられた。すべての箔は破裂し、試薬がマイクロ流体流路に流入し、排出膜で止まることが観察された。流路内の液体は、泡無の単一充填物から構成されていた。

【0084】

同時に、これらの実験は、ＲＳＲがチャンバーの中に封止する試薬を含むこと、封止箔の空気圧破裂、チャンバー直径と切れ込みによる破裂の制御、マイクロ流体チャンネへの試薬の移行、および排出膜を用いた試薬の待ち合わせ（queuing）を示している。

【0085】

ＲＳＲへの関連するアプローチは、箔を破裂させるのに、空気圧力よりむしろ機械的力を用いる。この方法は、箔封止された試薬チューブの上部と底部に、プラスチック製の鋭いピンを形成する（同じ目的のために金属ピンを挿入することもできる）。両方の箔は、ピンにより貫通され、必要な処理時間で試薬を放出する。

【0086】

実施例２．バイオチップにおける流れ制御
本発明のバイオチップは、細かい特徴を含み、解析結果の生成に必要な一連の処理工程を実行するためには、流れの制御が必要である。流れの制御要素の使用を必要とする流体の機能は以下のものを含む：
・バイオチップの中の流路を介して、流体の流れを１つの特徴から別の特徴へと向けること。
駆動ライン、バルブ、および排出膜の設定通りの使用は、バイオチップ内の特別な流路と特徴を通るように液体および気体を向ける。例えば、精製フィルター（図３９，１２）は、流体流路により試薬チャンバーおよび処理チャンバーに接続されている。流体の流れと、精製フィルターへの流入と流出を制御するバルブの順序は、実施例５のＤＮＡ結合工程、洗浄工程、乾燥工程、排出工程に記載されている。これらの工程では、流体の流れがこのチャンバーを通るように、いくつかの排出膜、バルブ（図３９、４６，４７，４３，４２および４４）、および空気圧駆動ラインが用いられている。
・チャンバーの封止。
熱サイクルや連続サイクル等の特定の反応は、高温を必要とする。かかる環境では完全な封止が重要であり、それは、反応が加熱されると、チャンバー内の流体の圧力が増加するからである。不十分な封止は、チャンバー外への流体の漏れをもたらし、反応内部のガスが抜け、泡を発生させる。チャンバーを封止することはこれらの問題を最小限にし、反応効率を向上させる。例えば、実施例５と６の熱サイクルチャンバーは、熱サイクル処理の間、バルブＶ１３とＶ１４（図４０，５２，５３）により封止されている。
・往復混合（reciprocal mixing）。
往復混合は、２液を空気バラストに対して押し付け、逆流を可能とするように圧力を放出することに基づく混合に対するアプローチである。加圧を繰り返し、およびその圧力を減少させることにより、溶液を前後に移動させて混合させることができる。このアプローチは、実施例６のバイオチップにおいて示されており、空気チャンバー（図７０、６１０）をバネとして用いており、該空気チャンバーは、流体に圧力が加えられた時は、流体の圧力により最初は圧縮され、圧力が解放された時は、流体を押し戻す。空気チャンバーは往復混合の間はバルブＶ１３（図６９、５２）により密閉され、そこでは圧力が０から１５ｐｓｉｇに直線的に増加し、次いで１５から０ｐｓｉｇが加えられる。混合後、Ｖ１３を開き、混合溶液をＰＣＲチャンバーの中へと流入させる。
・待ち合わせ排出膜―所定のバイオチップの中で並列処理される複数の試料の流速の変化は、試料の粘度（例えば、ＤＮＡ含有量）や流路の寸法（すなわち伝導性）を含む要因に起因する。待ち合わせ機能の使用は、バイオチップ内の並列流路を通る複数の試料の流体流れの変化に適応する。このアプローチでは、所定の工程の最大可能時間が、工程時間として用いられる。早く排出膜に到着した試料は、流速の遅い別の試料が待ち合わせポイントに到着する間、停止し待つことなる。このアプローチは、複数の試料を確実に同期させることにより、同時に該複数の試料を処理することを許容する。流体の待ち合わせは、実施例５および６の「熱サイクルチャンバーへの移送」で実行され、そこでは、複数試料用のＰＣＲ溶液を共通位置で停止させるために、排出膜（図４０と図６９、１００）とバルブ（Ｖ２９）（図４０と図６９、９９）を用いている。複数試料を同期させるための別法ではあるが、より複雑なアプローチは、各試料を別々に制御するとともに、所定の試料がバイオチップ上の所定のポイントに到着した時、スクリプトがフィードバックを受けることができるような検出特徴（例えば、光学的、熱的、化学的、機械的）を組み入れることである。
・チャンバーの計量―溶液は処理フローの中の複数の例において計量される。実施例５および６の計量例は、「溶出液計量」工程であり、計量チャンバー（図４０と７０、８）、バルブＶ１２（図４０と７０、５１）および排出膜ＶＭ（図４０と７０、１００）を用いる。
・間に空気充填物のある溶液の結合。
試料処理において、異なる入口からのものであり、かつ空気で分離されている２つの別々の流体充填物を結合する必要がある場合がある。この例は、「ＰＣＲ生成物とホルムアミドとの結合」工程である。この工程では、結合チャンバー（図４１および７１、７８）、排出膜、およびバルブ（図４１、要素１００、５６、８１）が用いられる。結合機能は、チャンバーの中へ各流体充填物を受け入れ、流体間の空気を除去し、結合した流体充填物を前進させるために上記の要素を用いる。この工程では、液体と空気の流れを停止させるためにバルブが用いられる。流体充填物間の空気を排出させるために排出膜が用いられる。
・廃棄チャンバーの充填。
バイオチップ内の廃棄チャンバーは、過剰の溶液、特に計量工程時の過剰の溶液を受け入れるように設計されている。廃棄物の取り扱い例は、「計量ホルムアミド」工程である。この工程では、廃棄チャンバー（図４１および７１、７７）は、上面全体とバルブＶ１５（図４１および７１、５４）を密閉する排出膜を有するチャンバーから成る。バルブと廃棄チャンバーのデザインは、体積が変化し、および空気泡を含む可能性のある（そのため流体充填物が不連続である試料）過剰流体に対応している。完全に放出された廃棄チャンバーの使用は、流体充填物の中に存在する空気を排出させることができ、バルブの使用は、廃棄物を廃棄チャンバー内に入れて密閉することができる。
・受動的試料分裂。
空気により分離されている２つの流体の流れを２つの経路に吐き出させるための、受動的伝導差特徴の使用には利点がある。このデザインでは、単一の流路が、排出されたチャンバーが終点となる２つの流路に分裂する。第１の流路の流れ伝導性（flow conductance）は、その流路に沿って受動的流れ制限を組み入れることにより顕著に減少させることができる。流れ制限は抵抗を発生させ、分岐点に流れる液体は、排出されたチャンバーが充填されるまで、あるいは排出膜が完全に湿るまで、伝導性のより高い流路を流れる。いずれかが起こった場合、この流れ流路の制限が高くなり、追加の液体は第２の流路に流入する（流れ制限要素があっても）。このデザインは、伝導性に基づく２つの経路の間の流体の流れの制御に受動的に用いられる。流路内の２つの液体が空気充填物により分離されている場合には特に有用である；第１の液体は第１の経路に流れ、第２の液体は第２の経路に向けられる。
・マクロ流体チャンバーの排出。
実施例５および６の「無秩序な泡生成」工程は、大量の溶液を強力に撹拌することにより行う。泡生成のために適切な空気流を生成させるために大量の空気を放出させる必要がある一方で、バイオチップから試薬が飛散し機器内に無くなることを防ぐために、無秩序な泡生成における分解溶液は、チャンバー内に含有されなくてはならない。これは、カバー内に排出膜を用いることにより達成され、該排出膜は、流体の流れに対しては障壁となるが、無秩序な泡生成からの空気が放出されることを可能とする。無秩序な泡生成を行うか、あるいは何らかの理由で実質的な空気流に曝す必要のあるチャンバーの排出を行うために、同様のデザインを用いることができる。
・駆動ラインの分離―バイオチップ内の流体から機器の駆動ラインを分離するため、カバーおよびバイオチップの他の部分の中にも排出膜を組み入れる。

【0087】

バルブ構造
上記の機能は、２つの流れ制御構造に依存している：バルブおよび排出膜。バイオチップは、バルブを流れ制御に用い、流路内の流体の流れを停止または可能にする。バルブは受動的でも能動的でもよく、受動的バルブはインライン重合ゲル、受動的充填物、および疎水性バルブを含んでもよい。能動的バルブ構造は、機械的バルブ（熱空気圧および形状記憶合金）、非機械的バルブ（ハイドロゲル、ゾルゲル、パラフィン、および氷）、および外部バルブ（組み込みモジュール、空気圧、および非空気圧）を含む。空気圧バルブ構造および機械的バルブ構造は、弾性体膜または非弾性体膜のいずれかを用いることもできる。いずれの場合も、最適な密閉性を付与できるように前記の膜を処理してもよい。

【0088】

多くのタイプのバルブ構造を本発明のバイオチップに用いることができ、およびいくつかのタイプを個々のバイオチップに組み入れてもよい。バルブ構造の選択は、機器へのアプローチと調整しながら、容易に作製できおよび組み立てられるかに、まず基づいている。例えば、バイオチップの特徴を作動させる線材により制御される機械的バルブは、高度な機械的な配列機構および制御機構を備えた機器には適しているであろう。同様に、ワックスの局所的な融解に基づくバルブは、制御された特別の加熱機構を備えた機器が必要である。実施例５および６では、機器は高度な空気圧制御が可能であり、組み入れられたバルブのタイプ（以下に示す）は、空気圧作動に基づいている。他の空気圧および非空気圧（例えば、機械的、液体、ワックス、電気的）作動機構および対応するバルブは、本発明のバイオチップに用いることができる。

【0089】

空気圧作動の弾性体バルブ構造の上面図を図８に示す。上面図は、感圧性接着剤（ＰＳＡ）テープと正常時開放バルブ用の弾性体膜を示している。流体および空気を制御するための空気圧作動バルブの断面図を図９に示す。バルブ構造の要素は、バルブ膜２０２、バルブシート２０３、空気圧チャンバー２０４、流体チャンバー２０５、両面ＰＳＡテープ２０６、流体スルーホール２０８、流体流路２０９、および空気圧流路２１０を含んでいる。このバルブは３つの要素を組み立てることにより作製できる。

【0090】

流体サブアセンブリー。
このサブアセンブリーは流体２０９（液体または空気）の流れの流路を含んでいる。流路は、貫通して表面に至る一連のスルーホール２０８により中断されている。表面では、これらのスルーホールは、バルブアセンブリーのためのバルブシート２０３を形成する。それは、熱可塑性シート（図３３）に、流路やスルーホールをＣＮＣ機械加工することにより作製され、両面を薄いプラスチック膜で覆っている。膜自身、ＣＮＣ機械加工によりパターンを付与され、流体サンドイッチ層に対する接続を提供するために、ＣＮＣ機械加工層上の対応する特徴に対して配列されているスルーホールを含む特徴を有している。同様に、流体層と空気圧層の中の同じ特徴も射出成形により作製できる。

【0091】

空気圧サブアセンブリー。
このサブアセンブリーは、機器の空気圧駆動装置を流体サブアセンブリーに結合し、流体サブアセンブリー内の流体を空気圧的に駆動させ、およびバイオチップ内のバルブを空気圧的に作動させる。空気圧流路２１０は、空気圧駆動装置をバルブチャンバーに接続する。このサブアセンブリーは、熱可塑性シート（図４４）の両面のそれぞれに流路とチャンバーをＣＮＣ機械加工することにより作製される。空気圧サンドイッチ層への接続を提供するために、薄いプラスチック膜の特徴は、ＣＮＣ機械加工層上の対応する特徴に対して配列するスルーホールを含んでいる。結合は、熱的に行うことができるが、超音波的に、溶媒を用いて、および接着剤を用いて行うこともできる。同様に、流体層および空気圧層内の同じ特徴も射出成形により作製できる。

【0092】

バルブサブアセンブリー―このサブアセンブリーは、空気圧サブアセンブリーと流体サブアセンブリーとの間に配置されている。この構造物においては、バルブアセンブリーは、厚さが０．００５“である弾性体膜２０２から成る。空気圧で作動させると、この層は反ることにより、流体層内の流体（空気を含む）の流れを制御する。上部の感圧性接着剤層２０６は、膜を上部空気圧層に結合するために用いられる。底部の感圧性接着剤は、膜層２０６を流体層に結合させるために用いる。感圧層は、レーザ切断によりパターン形成される。感圧性接着剤層も、型抜きまたは打ち抜きを含む方法によりパターン形成される。弾性体膜は、厚さが０．００５“〜０．０１５”であり、材料はシリコーン等のゴムを用いることができる。

【0093】

バルブは、３つのサブアセンブリーを一つに組み立てることにより製造された。流体アセンブリーおよび空気圧アセンブリーを熱結合で一体固定される。同様に、空気圧プレートおよび流体プレートは、ネジ、リベット、加熱かしめおよび超音波溶接を含む多数の機械的固定手段を用いることにより一体固定できる。

【0094】

これらのバルブは通常開いている。流体は、流体層の中の流路を通って、スルーホールを上がり、バルブ本体に入り、第２のスルーホールから出て、流体層内の流路に戻る。空気圧流路に圧力が加えられると、圧力はバルブ膜を反らし、バルブ膜およびバルブ流体チャンバーの床に対してこの膜を押し付ける。これによりスルーホール間の経路が密閉され、バルブを通る流れを止める。バルブ構造は膜要素とＰＳＡ要素を組み入れており、組立時に、結合させる２つの部品の平坦性の局所的なバラツキに対してそれらの圧縮が適応できるように、それらは高いコンプライアンスを有している。この適応性は、バルブ周辺の効果的な密閉を形成する能力を高める。

【0095】

バルブの密閉圧力を評価するために実験が行われた。バルブの空気圧流路が空気圧駆動装置ＶＤに接続された。所定体積の染色液体（水）が、バルブに接続する流体流路の一部の中に投入された。流体流路への入力は、別の空気圧駆動装置ＦＤに接続された。ＶＤの圧力は、実験を通して、一定に設定されかつ保持された。ＦＤの圧力は、流路内への流体の流れが観察されるまで徐々に増加させた。流体が流れ始める圧力は、所定のバルブ密閉圧力に対するバルブの破裂圧力である。バルブ密閉圧力５、１５および２２ｐｓｉｇに対するバルブの破裂圧力は、それぞれ３、１３．５および２０ｐｓｉｇである。このデータは、流体駆動圧力に比べて２ｐｓｉｇを超えて大きい空気圧密閉圧力が、密閉には好ましいことを示している。実施例５および６のバイオチップでは、ほとんどの処理工程では、共通の圧力（２２ｐｓｉｇ）に設定されている。複数のバルブを同時に制御し、および圧力１８ｐｓｉｇまで流れ流路を制御するには、これは有効である。バルブ駆動圧力を固定することはほとんどの機能に対して適切ではないが、バルブ膜を作動させた時の流体の撹拌を最小限にするために、様々なシステムはバルブ圧力を増加させたり（流体駆動圧力の要求が高い場合）、減少させたり（バルブを開く前）することを可能とする。

【0096】

真空処理工程でバルブが使用され、流体がバルブを通して流体が吸引される場合、バルブを開放状態に保持するために、流体ラインと空気圧ラインの両方にも真空を適用する必要がある。このバルブを閉じると、上述のように圧力が加えられる。

【0097】

実施例４，５，６のバイオチップのすべてのバルブは、通常は開放状態であるが、それらのバルブおよび本実施例のいくつかのタイプのバルブは、通常は閉鎖状態に設計することができる。例えば、図１０は、通常は閉鎖状態にあるＰＳＡテープと弾性体膜バルブの上面図である。図１１は、通常は閉鎖状態にあるＰＳＡテープと弾性体膜バルブの断面図である。このバルブの構造は、図８および９のバルブ構造とは、非作動状態では、バルブ膜層と密に接触するように、バルブシートが高くなっている点で相違している。作製のためバルブシートを備えたバルブ膜は、作製時および組立時において、伸長状態に置かれている。バルブを開くため、真空にしてバルブ膜をバルブシートから離れるように引っ張る。本実施例（図１０および１１の構造を除く）のすべてのバルブは、通常開放状態であることに注意する必要がある。いくつかの用途では、１回使用のバルブ、すなわち、アッセイプロセスの間、開放と閉鎖とを繰り返すようには設計されていないが、例えば、アッセイプロセスの間、開放状態でプロセスを開始させ、１回だけ閉じるバルブを組み入れることが好ましい。

【0098】

剛直なバルブ膜を備え通常は開放状態である空気圧作動バルブの上面を図１２に示す。液体および空気の制御のために、剛直なバルブ膜を備えた空気圧作動バルブの断面図を図１３に示す。バルブ構造の要素には、バルブ膜２０２、バルブシート２０３、空気圧チャンバー２０４、流体チャンバー２０５、流体スルーホール２０８、流体流路２０９、および空気圧流路２１０が含まれる。このバルブは、３個の要素を組み立てることで作製される。

【0099】

流体サブアセンブリー。
このサブアセンブリーは、流体（液体または空気）の流れのための流路を含んでいる。流路は、表面に至る一連のスルーホール２０８で中断される。これらのスルーホールはバルブアセンブリーのためのバルブシート２０３を形成する。あるいは、流路は流体プレートの上面に沿って伸び、バルブを通過する時に中断される。流路の末端はこのアセンブリーのバルブシートを形成する。このアセンブリーは、熱可塑性物に流路とスルーホールを射出成形することにより作製される。この場合、バルブ膜２０２は、結合される薄膜の熱可塑性膜である。この構造の流体チャンバー２０５は、密閉効果を発揮するために、最大に反った状態の剛直膜の形状に合わせて作製される。

【0100】

空気圧サブアセンブリー。
このサブアセンブリーは、流体サブアセンブリー内の流体を空気圧で駆動させ、およびバイオチップ内のバルブを空気圧で作動させるために、機器の空気圧駆動装置を流体サブアセンブリーに結合する。空気圧流路は、空気圧駆動装置をバルブチャンバーに結合する。このサブアセンブリーは、熱可塑性物に流路特徴とチャンバー特徴を射出成形することにより作製される（図７２および７３）。薄いプラスチック膜の特徴は、空気圧サブアセンブリーへの接続を提供する、射出成形された層上の対応する特徴に合わせて配列されるスルーホールを含んでいる。結合は熱的に行われるが、超音波的、溶媒を用いて、および接着剤を用いて行うこともできる。

【0101】

バルブサブアセンブリー。
このサブアセンブリーは、空気圧サブアセンブリーと流体サブアセンブリーとの間に配置された。この構造では、バルブアセンブリーは薄い熱可塑性膜から成る。膜の厚さは、１０〜２５０ミクロンの間である。実施例６では、厚さが４０ミクロン、５０ミクロン、および１００ミクロンの熱可塑性物の膜を用いた。空気圧で作動させると、流体層内の流体（空気を含む）の流れを制御するために、この層が反る。バルブは３つのサブアセンブリーを一体に組み立てることにより製造された。流体アセンブリーと空気圧アセンブリーは、熱的または溶媒により一体的に結合された。あるいは、上方と下方のサブアセンブリーを一体に結合するために、両面接着剤を用いることもできる。薄い熱可塑性の剛直なバルブ膜は流体層には不可欠であり、バイオチップの組立時には大きな利点をもたらす。

【0102】

これらのバルブは通常開いている。流体は、流体層内の流路を流れ、スルーホールを上がり、バルブ本体に入り、第２のスルーホールから出て、流体層内の流路に戻る。空気圧流路に圧力が加えられると、圧力は剛直なバルブ膜を反らせ、およびこの膜をバルブシートおよびバルブ流体チャンバーの床に押し付けて、スルーホール間の通路を密閉し、バルブを通る流れを止める。

【0103】

１００ミクロンの膜を備えたバルブを上述の方法を用いて作製することにより、バルブ密閉圧力を評価するために実験が行われた。バルブの空気圧流路が空気圧駆動装置ＶＤに接続された。所定体積の染色液体（水）が、バルブに結合した流体流路の一部に投入された。流体流路の入口は、別の空気圧駆動装置ＦＤに接続された。ＦＤの圧力は、実験を通して一定に設定および保持された。流路内の流体の流れが観察されるまで、ＶＤの圧力を高レベルの８０ｐｓｉｇから徐々に減少させた。ＦＤを１，２，３，４および５ｐｓｉｇに保持するのに必要なバルブ密閉圧力は、それぞれ１４，６、２８、５４、６５．５、および８１．５ｐｓｉｇであった。このバルブ構造に用いた剛直膜は、流体の流れを閉じるのに高い圧力を加えることを要した。バルブ膜の厚さを、１００ミクロンから５０ミクロンおよび４０ミクロンへ減少させると、流体の流れを閉じるのに必要な圧力に対する要求を実質的に減少させた。流体が流路を通して吸引される真空操作では、バルブを開放状態に保持するために、真空がバルブに適用される。

【0104】

図１４は、固定され、通常開放状態にある弾性体膜バルブの上面図を示している。流体および空気を制御するためのこの空気圧作動バルブの断面図を図１５に示す。バルブ構造の要素には、バルブ膜２０２、バルブシート２０３、空気圧チャンバー２０４、流体チャンバー２０５、流体スルーホール２０８、流体流路２０９、空気圧流路２１０、および圧縮リング２１２が含まれる。このバルブは３つのサブアセンブリーを組み立てることにより作製される。この構造の利点は、非常に簡単で、ＰＳＡテープを必要としないことである。

【0105】

流体サブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、流体２０９（液体または空気）の流れのための流路を含んでいる。流路は、表面に至る一連のスルーホール２０８により中断されている。表面ではこれらのスルーホールは、バルブアセンブリーのためのバルブシート２０３を形成する。熱可塑性シートにＣＮＣ機械加工により流路とスルーホールを形成し（図３３）、両面を薄いプラスチック膜で覆う（図３６および図３７）ことにより作製される。この場合、薄膜プラスチックは、結合される熱可塑性膜である。膜は、ＣＮＣ機械加工によりパターン形成され、流体サンドイッチ層への接続を提供する、ＣＮＣ機械加工された層上の対応する特徴に合わせて配列されるスルーホールを含んでいる。同様に、流体層と空気圧層の内部の同じ特徴も、射出成形により作製可能である。一連のバルブ膜圧縮リングは、流体チャンバー２１２の周囲に形成されている。

【0106】

空気圧サブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、流体サブアセンブリー内の流体を空気圧駆動させ、およびバイオチップ内のバルブを空気圧作動させるために、機器の空気圧駆動装置を流体サブアセンブリーに結合する。空気圧流路２１０は、空気圧駆動装置をバルブチャンバーに結合する。このサブアセンブリーは、熱可塑性シートの両面のそれぞれの上に流路とスルーホールをＣＮＣ機械加工することにより作製される（図１２）。薄いプラスチック膜の中の特徴は、ＣＮＣ機械加工された層上の対応する特徴に合わせて配列されるスルーホールを含み、該スルーホールは空気圧サンドイッチ層への接続を提供する。結合は、熱的に行われるが、超音波的、溶媒を用いて、および接着剤を用いて行うこともできる。同様に、流体層と空気圧層の内部の同じ特徴を、射出成形により作製することもできる。一連のバルブ膜圧縮リングは、空気圧チャンバー２１１の周囲に形成される。流体チャンバーおよび空気圧チャンバーの圧縮リングは、互いに一致し、互いに位置合わせして配列する。

【0107】

バルブサブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、空気圧サブアセンブリーと流体サブアセンブリーとの間に配置されている。この構造では、バルブアセンブリーは、厚さが０．００５”であるシリコーン膜から成る。空気圧で作動させると、この層は反ることにより、流体層内の流体（空気を含む）の流れを制御する。

【0108】

バルブは、３つのサブアセンブリーを一体的に組み立てることにより製造される。流体アセンブリーと空気圧アセンブリーは熱結合により一体的に固定される。同様に、空気圧プレートおよび流体プレートは、ネジ、リベット、加熱かしめ、および超音波溶接を含む多数の機械的固定方法を用いて一体的に固定される。空気圧層と流体層は、圧縮リング（２１２）間の膜層が圧縮されるように結合される。圧縮度は、５％〜６０％であり、バルブ膜の硬度計（durometer）と厚さの関数である。圧縮度は、空気圧駆動装置が空気圧チャンバー内に密閉され、流体が流体チャンバーから漏れなければ十分である。

【0109】

排出構造
装置のマイクロ流体要素は、空気を排出し、流体の流れに対する障壁として作用するために、排出膜を用いる。実施例５および６のバイオチップに使用された排出膜は、移送される液体の表面張力および表面自由エネルギーに基づいて選択された。その２つの間に大きな差が存在すると、固体表面と液体との間の接触角が大きく、液滴が膜に反発し膜を汚すことがない。別の検討は、膜を通過する空気流速である。空気が制限なく排出されるためには、その値は十分に高くなければならない。典型的には、所定の材料では、ポートの大きさが小さくなると、表面自由エネルギーと表面張力との差は大きくなるが、空気流速はポートの大きさに反比例する。例えば、水の表面張力は７３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ、イソプロピルアルコールは２２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ、およびオイルは３０ｄｙｎｅｓ／ｃｍである。

【0110】

バイオチップに使用される排出膜は、以下の材料から成るものを含む：ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、医療用の排出および気体濾過に広く使用されている材料。それは不活性な材料であり、優れた流れ特性と高い化学的抵抗性を提供する。この膜タイプの切断形状の寸法不安定性は、オーバーモールド操作時のロボットによるハンドリングに困難を生じさせる場合がある。ＰＴＦＥは、ガンマ線またはＥ線殺菌には不適当であり、それはイオン化放射線に晒されると、鎖が切断されて分解するからである；ポリビニリデンフロライド（ＰＶＤＦ）は、良好な流れ特性および広い耐薬品性を提供する丈夫な材料である。それは、そのままおよび超疎水形態の両方で利用可能である；超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）は、医療用の排出および気体濾過の市場により最近上市されたものである。それは、そのままで疎水的な材料であり、優れた流れ特性と広い耐薬品性を提供する；疎水化処理された変性アクリル膜は、排出用途に対しては経済的な選択である。それは、疎油性であり、疎水性であり、および化学的適合性がある。

【0111】

図１６は、実施例１５のバイオチップに使用された排出膜構造の断面図を示している。排出膜（図１６、２１３）は、該構造に組み入れられ、該膜は空気圧層と流体層との間に熱結合により配置されている。図１７は、実施例１６のバイオチップに使用された排出膜構造（図１７、２１３）の断面図を示している。この排出膜構造では、排出膜は流体層に溶接リッジを用いて溶接されている。

【0112】

実施例３．バイオチップインターフェイス
バイオチップは機器と相互作用する。機器は、試料の分析達成に必要なすべてのサブシステムを提供するものであり、図５８に示すように、高電圧および低電圧の電力サブシステム、熱サイクルシステム、空気圧サブシステム、磁気サブシステム、機械サブシステム、光学サブシステム、補強サブシステム、プロセス制御サブシステム、およびコンピュータサブシステムを含んでいる。バイオチップインターフェイスへの機器は、マイクロ流体駆動装置およびバイオチップ内で実行される一連の処理に応じて、これらのサブシステムの１種または複数種を含む。本明細書の実施例では、以下の通り、バイオチップと機器とのインターフェイスは、空気圧的、電気的、光学的、および機械的である：

【0113】

空気圧サブシステムインターフェイス
空気圧サブシステムは、空気圧マニホールドを介してバイオチップに結合する。図１８は、実施例５のバイオチップ用のものであり、空気圧プレートの上面上に配置された一連の空気圧ポートからなる空気圧マニホールド領域を示している。５つのタイプのポートが空気圧インターフェイスと一体化されている：
低流動駆動装置。低流動ポートは、バルブの作動のために空気を供給し、流体を駆動させてバイオチップに流すために使用される。
高流動駆動装置。高流動ポートは、泡による撹拌や精製膜の乾燥等の処理に必要な空気を供給するために使用され、１９ＳＬＰＭまでの流れを必要とする。圧力低下を最小限にするために、ポートの寸法は大きくされている。
高圧駆動装置。このポートは、マトリックス充填物をふるいにかけるために必要な、４００ｐｓｉｇまでの供給に使用される。
凝縮物ポート。機器内の機械的ポンプにより生成する凝縮物は、空気圧インターフェイスを介してバイオチップのチャンバーの中へ必要に応じて運ばれる。

【0114】

機器試験ポート。
試験ポートは、機器空気圧システムを試験するため、および機器の空気圧マニホールドの配列をバイオチップの配列に対して確認するために、空気圧マニホールドの中に組み入れることができる。

【0115】

空気圧ポートは、３４個の低流動ポートと７個の高流動ポートを有し、配列されている。この空気圧マニホールドの配置は、一部は以下の検討に基づき選択された。

【0116】

インターフェイスサイトの表面積の最小限化。空気圧インターフェイス領域をより圧縮すれば、射出成形時の局所的収縮や反りがインターフェイスの妨げとなることがより少なくなり、配列が向上する。

【0117】

すべての空気圧ポートを一つのインターフェイスサイトに集める。このアプローチは機器を単純化するもので、システムを頑丈にして実験室の外でも使用することができる利点がある。典型的には、単一のインターフェイスが、バイオチップのフットプリント内の中心に配置されるが、バイオチップの端部に配置されてもよい。代わりに、複数のインターフェイスをバイオチップ全体に分散させてもよい。実施例５および６のバイオチップでは、空気圧ポートは、１つの位置に集中させ、機器とバイオチップとの間の密な結合点を可能にしている。マニホールドのこの構成と配置は、中心にポートがない場合またはバイオチップの末端部にすべてのポートが配置されている場合のいずれと比較しても、バイオチップ内への空気圧ラインの通路決定を単純化する。これは、マニホールドと空気圧ポートとの間の配列の許容度を増加させるとともに、機器内の空気圧配管の通路決定を単純化する。

【0118】

特徴密度に基づくバイオチップ上のポートの配置―流体プレートと空気圧プレートの上には特徴密度が低い領域がある。可能であれば、これらの領域に空気圧マニホールドを配置することが最適である。一般に、バイオチップ上の空間の最適な使用（すなわち、すべてのマイクロ流体特徴およびマクロ流体特徴の理想的な詰め方）は、与えられた寸法のバイオチップの特徴密度と処理の複雑さを最大化するためには、重要である。実施例５および６のバイオチップでは、空気圧ポートは空気圧層の上面上に配置される。同様に、空気圧ポートは、流体層の底面上にも配置することができ、およびチップホルダーを介して機器に結合することもできる。ポートの絶対的は特徴密度、機能有用性、およびデザインの容易性により決定される。実施例５および６のバイオチップでは、熱サイクル領域は、流体サブアセンブリーの底面上に配置され、熱循環器との効率的な熱接触を確保するために、上からの固定圧力が必要である。したがって、単一の固定機構が、バイオチップと熱的および空気圧的に同時に相互作用するように機能するように、集中された空気圧ポートは空気圧サブアセンブリーの上面上に配置された。

【0119】

閉鎖システム−上述のように、本発明のバイオチップは、処理中および処理後にすべての液体がバイオチップ内に配置される、閉鎖システムである。排出膜（実施例２に記載されているように）は、バイオチップからの流体が不注意で機器の空気圧マニホールドの中へ流入するのを防ぐために使用される。

【0120】

空気圧流れと空気圧マニホールドの説明として、実施例５の「分解工程」用のマクロ流体処理サブシステム内に流体を動かすアプローチが提示される。この工程を実施するため、分解溶液を分解試薬チャンバー（図３９、２０）からスワブチャンバー（図３９、１９）へ移動させるために、分解駆動ラインＤＬ１（図３９、６８）を作動させた。プロセスコントローラーは、空気圧インターフェイス上の駆動ラインＤＬ１に所望の圧力を加える、機器のソレノイドリレーを作動させた（図３９、２０）。空気圧マニホールドのＤＬ１ポート（図１８、３０１）における空気圧インターフェイスを通り、空気圧プレートの空気圧流路（図１８、３０２）に沿って、空気圧プレート内のマイクロ流体インターフェイスポート（図１９、３０３）へと空気を移動させる。このインターフェイスポートは、空気圧駆動圧力を、マクロ流体処理ブロック（図４７、２６）内の空気圧流路を通って、マクロ流体処理サブアセンブリー（図４８、２７）のカバーの中へと届けた。次にカバーは、流路（図４８および５３、３０４）に沿って、分解試薬チャンバー（図４７、２０）の中へと空気圧駆動圧力を届けた。まとめると、結果としての工程は、分解試薬チャンバーから流体サブアセンブリーを通過し、最終的にスワブチャンバー（図２０、２０）に分解試薬を移送する工程である。

【0121】

同様に、チャンバー内の試薬が実施例１のように箔により密閉される場合、空気圧駆動装置は２段階動作し、第１段階では、箔を破裂させるパルスを発生させ、第２段階では、上述のように非ＲＳＲと同様である。

【0122】

高電圧サブシステムインターフェイス
高電圧サブシステムは、一連の電極ピンとワイヤハーネスを介してバイオチップと結合している。あるいは、エッチングした一連の薄い金属電極を作製することもできる。この構成では、取付具をバイオチップの中に押し込むことにより、電極ピンがアノードとカソードの中に挿入される。電極ピンは、空気圧サブアセンブリーの上部上に配置された電極片に接触し、かつ取付具を押し込むことにより挿入される。この電極片は、機器上の一連のバネ付き電極により機器に結合されている。電極片は、幅広い部品に使用されている高性能金属である、ベリリウム銅（ＢｅＣｕ）を用いて製造されている。その機械的および電気的特性により、その金属は、ＥＭＩ／ＲＦＩシールド製品用の理想的な材料である。電極片は、別の金属から製造することもできる。

【0123】

光学サブシステムインターフェイス
２００９／００２２９９８３として公開され、名称が「核酸およびタンパク質分析用の補強された装置」である出願Ｎｏ．１２／３９６，１１０、および２００９／００２０４２７として公開され、名称が「プラスチック製のマイクロ流体分離プラットホームおよび検出プラットホーム」である出願Ｎｏ．１２／０８０，７４５の特許出願に記載されているように、両方とも出典明示により本明細書に組み入れられるものであるが、チップホルダーの開口を介して、空気圧−バルブ−流体スタック（実施例５および６）の分離および検出窓と、レーザーが組み合わされている。レーンが分離および検出バイオチップ内のレーンを見つけ出せるように、一連のフォトダイオードが使用されている。

【0124】

熱サブシステムインターフェイス
２００９／００２３６０３として公開され、名称が「標的核酸の迅速多重増幅方法」であり、出典明示により本明細書に組み入れられる出願Ｎｏ．１２／０８０，７４６に記載されているように、熱サイクルチャンバーがＴＥＣ要素の中の中心に位置するように、熱循環器およびバイオチップが配置されている。温度サイクルプロファイルを正確に生成させるため、熱サイクルチャンバーとＴＥＣとの間に良好な接触を確保するには、固定力９０ｌｂｓが必要である。固定圧力は、固定アームとシリコーンパッドの圧縮により生成させる。固定アームはシリコーンパッド上に押し倒すのに必要な圧力を加える。

【0125】

効率的な熱移動に必要な固定力を評価するための実験が行われた。ＰＣＲバイオチップ（図２１、３０５）に対して制御された力を加えるために、空気圧作動シリンダー（図２１、３０５）が使用された。いろいろな力のレベルで、標準プロトコル[ギースら（２００９）、「慣用およびマイクロ流体ＳＴＲ分析のための迅速多重ＰＣＲ」、J.Forensic Sci,54(6):1287-96、出典明示により本明細書に組み入れられる]に基づきＰＣＲが実施され、およびＳＴＲプロファイルが解析された。データによれば、７５ｌｂｓより小さな力では、矛盾するＳＴＲプロファイルが得られた。７５ｌｂｓを越える力が加えられた場合、整合し効果的な増幅が認められた（図２２）。

【0126】

分離および検出サブシステムは、チップホルダー上のヒーターに結合されて温度を５０℃に維持する。均一な温度は重要であり、ヒータープレート上にバイオチップを固定することは、温度の均一性の確立および維持に寄与する。

【0127】

機械的配列
バイオチップを機器インターフェイスに合わせて配列するため、一連の機械的配列ガイドを含む機器のチップホルダー上にバイオチップが配置される。これらのガイドは、バイオチップのインターフェイス特徴を機器に対して±０．０２０”の範囲内で配列させる。ガイドは、原点と配向を決めるため、角の近くに、空気圧プレートの端に沿って３つの位置を決める。この配置において、ガイドは、空気圧層のみに対して配置される切り欠け部を有している（これは、流体層と空気圧プレート層との間のわずかな配列のずれによる影響を最小限にする）。

【0128】

実施例４．ＤＮＡとＰＣＲ試薬を受容および混合し、および同時に１６の試料に対して、１７分で１６重増幅反応を行うＣＮＣ機械加工バイオチップ
図２３のＰＣＲバイオチップ４０１がスライド形式に射出成形され、迅速多重ＰＣＲに対して旨く試験された。このバイオチップは、２５ｍｍ×７５ｍｍ×１．１ｍｍ（厚さ）である。システムは、ギースら（２００９）の「慣用およびマイクロ流体ＳＴＲ分析のための迅速多重ＰＣＲ」、J.Forensic Sci,54(6):1287-96、に記載されているように、ヒトＤＮＡ（ＤＮＡ６pg、実質的に単一コピーの検出限界）相当の単一ゲノムからのＳＴＲフラグメントの多重増幅を可能とする。

【0129】

その結果に基づき、バイオチップ（７６．２ｍｍ×１２７ｍｍのフットプリント）が設計され、およびＣＮＣ機械加工により製造された。流体層１（図２４、４０３）および流体層２（図２５、４０４）、空気圧層１（図２６、４０５）および空気圧層２（図２７、４０６）が、熱可塑性シートからＣＮＣ機械加工により製造された。流体サブアセンブリー（図２８、４０７）は、流体層１（図２４、４０３）、流体層２（図２５、４０４）およびパターン化されていない薄い熱可塑性膜を組み合わせて熱結合することにより製造された。空気圧サブアセンブリー（図２９、４０８）は、空気圧層１（図２６、４０５）と空気圧層２（図２７、４０６）を熱結合することにより製造された。バイオチップアセンブリー（図３０、４０９）は、流体サブアセンブリー（図２８、４０７）を空気圧サブアセンブリー（図３０、４０９）に結合し、弾性体の、実施例２に記載された通常開放状態のバルブアセンブリーを組み入れることにより製造された。

【0130】

バイオチップを試験するため、１６試料の増幅に十分な１６０μＬのＰＣＲ試薬のマスターミックスが調製され、ＣＮＣ機械加工されたバイオチップのマスターミックス試薬槽（図２８、４１０）の中に挿入された。９．３μＬのＤＮＡ（全テンプレート１ｎｇ）が各試料ウェル（図２８、４１１）の中に挿入された。バイオチップが空気圧／熱サイクル機器（図３１）に接続された。以下の工程を有する自動化されたスクリプトが実行された：
・開始
すべてのバルブが閉じられた。
・試料と試薬の待ち合わせ
駆動ラインＤＲ（図２８、４１９）に１ｐｓｉｇを加えることにより、バイオチップのＰＣＲ計量チャンバー（図２８、４１２）の中にＰＣＲ試薬を空気圧で移動させた。マスターミックスの体積９μＬが計量された。駆動ラインＤＳ（図２８、４１８）に各経路の試料は１ｐｓｉｇを加えることにより、各経路の試料を排出膜で待ち合わせさせた。
・過剰のＰＣＲ試薬の除去
バルブＷＶ（図２８、４１３）を開き、駆動ラインＤＲ（図２８、４１９）に１ｐｓｉｇを加え、試薬廃棄チャンバー（図２８、４１４）へ流入させることにより、過剰のＰＣＲマスターミックスを供給流路から除去した。試薬廃棄チャンバー（図２８、４１４）は、バルブＷＶ（図２８、４１３）を閉じることにより密閉され、駆動ラインＤＲ（図２８、４１９）を停止させた。
・結合チャンバーへの試薬の移動（ＪＣ）
バルブＲＶ（図２８、４１６）を開き、ＤＲ（図２８、４１８）に１ｐｓｉｇの空気圧駆動圧力を３０秒間加えることにより、ＰＣＲマスターミックスを結合チャンバー（図２８、４１５）の中へ空気圧で移動させた。試薬バルブＲＶ（図２８、４１６）を閉じ、ＤＲ（図２８、４１８）を停止させた。
・結合チャンバーへの試料の移動（ＪＣ）
バルブＳＶ（図２８、４１５）を開き、ＤＳ（図２８、４１９）に１ｐｓｉｇの空気圧駆動圧力を３０秒間加えることにより、結合チャンバー（図２８、４１５）の中へ試料を空気圧で移動させた。試料とＰＣＲマスターミックスは結合チャンバーの中で一体となりＰＣＲ溶液を形成した。バルブＳＶ（図２８、４１５）を閉じ、駆動ラインＤＳ（図２８、４１９）を停止させた。
・混合チャンバーへのＰＣＲ溶液の移動（ＭＣ）
バルブＪＶＣ（図２８、４２０）とＲＶ（図２８、４１６）を開き、ＤＲ（図２８、４１８）に１ｐｓｉｇの圧力を３０秒間加えることにより、混合チャンバー（図２８、４２１）の中へＰＣＲ溶液を導入した。
・試料と試薬の混合
バルブＲＶ（図２８、４１６、バルブＪＣＶはすでに開いている）を開き、０から１５ｐｓｉｇへは直線的に増加し、次いで１５から０ｐｓｉｇ（３０秒間）になる駆動圧力をＤＲ（図２８、４１８）に加えることにより、ＰＣＲ溶液を空気チャンバーＡＣ（図２８、４２２）に移動させることにより、往復混合が行われた。これは２回繰り返された。バルブＪＣＶ（図２８、４２０）とＲＶ（図２８、４１６）を閉じ、ＤＲ（図２８、４１８）を停止させた。
・ＰＣＲチャンバーへのＰＣＲ溶液の移動（ＰＣ）
バルブＰＶ１（図２８、４２４）、ＰＶ２（図２８、４２５）、ＪＶＣ（図２８、４２０）およびＲＶ（図２８、４１６）を開き、駆動ラインＤＲ（図２８、４１８）に０．５ｐｓｉｇの圧力を３０秒間加えることにより、ＰＣＲチャンバー（図２８、４２３）の中へＰＣＲ溶液を移動させた。バルブＰＶ１（図２８、４２４）、ＰＶ２（図２８、４２５）、ＪＣＶ（図２８、４２０）およびＲＶ（図２８、４１６）を閉じた。
・熱サイクル
バルブＰＶ１（図２８、４２４）とＰＶ２（図２８、４２５）を閉じ、１７分を要する２８サイクルプロトコルに従い熱サイクルを行った。
・ＰＣＲ生成物の回収
バルブＯＶ１（図２８、４２６）、ＰＶ１（図２８、４２４）、ＰＶ２（図２８、４２５）、ＪＣＶ（図２８、４２０）およびＲＶ（図２８、４１６）を開いた。ポートＯＰ（図２９、４２７）からＰＣＲ生成物を手作業で回収するために、ピペットチップを用いた。ＰＣＲ生成物が、１６バイオチップ試料から回収された。

【0131】

結果
スクリプトの実施に続いて、ＰＣＲ反応物を各流路から除去し、ジーンベンチ（Genebench）で分離と検出を行った。反応物の代表的なＳＴＲプロファイルを図３２に示す。

【0132】

実施例５．核酸を精製し、精製されたＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを電気泳動で分離し、および自動化されたスクリプトを用いてＳＴＲプロファイルを生成させる、ＣＮＣ機械加工された完全統合バイオチップ
５つの頬スワブを受け容れ、ＳＴＲプロファイルを生成させる、固定型で単一構造のプラスチックバイオチップは、以下の部分から成る：

【0133】

流体サブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、流体をバイオチップの中へ移送して処理し、空気圧サブアセンブリー、マクロ流体処理サブアセンブリー、バルブサブアセンブリー、並びに分離および検出サブアセンブリーと相互作用をする。ＣＯＰシートの「上面および底面の両面上に相互接続された流路とチャンバーをＣＮＣ機械加工することにより、流体サブアセンブリーの流体プレートが製造された。流体プレートの寸法は、２７６ｍｍ×１１７ｍｍ×２．５ｍｍである。図３３は、流体プレート１の上面を示し、図３４は流体プレート１の底面を示し、図３５は流体プレート１の透視図を示し、両面からの特徴を示している。ＣＮＣ機械加工された流体プレートは、厚さ２．５ｍｍの射出成形された素材を機械加工することにより製造された。プレートの上面および底面の両方は、パターンを付与された薄いプラスチック膜で覆われている。図３６は上部にパターンを付与された薄膜２を示し、図３７は底部にパターンを付与された薄膜３を示し；それらの薄膜の厚さは１００ミクロンである。流体プレートの上部と底部の両方に存在する特徴を持つことの利点は、組み立てのためには、１つの流体プレートだけでよいことである（そうでなければ２つのプレートが必要となる）。一般的に、アセンブリーに用いるプレートの数を最小限にすることには、大きな利点があり、すなわち、要素の配列をより真っ直ぐにするとともにより信頼性の高いものとし、ひずみ差や収縮差の影響を最小限にし、それにより、より少ないコストでより効果的な組み立てを可能とする。

【0134】

バイオチップの流路の特徴は以下の通りである：１）試料処理流路。分析される各頬スワブは、ＤＮＡ精製、ＰＣＲ増幅、分離および検出、並びにこれら核酸操作を行う、一連の独特な流路に対応する。各試料に対する該一連の独特な流路は、他の試料の一連の流路とは接続していない。すなわち、流路は、試料から試料へとは接続しておらず、およびチャンバー（アノードチャンバー以外）、フィルター領域、または他の試料に関係する膜領域を共有していないので、各試料の純度は保証され、および不注意による試料の混合または相互汚染を防ぐことができる。所定の空気圧駆動ラインは分かれて複数の試料を平行に移動させるが、移動は空気圧的に達成され、各試料の完全性は保証される。さらに、各試料に固有の一連の流路は閉鎖通路である；空気のみが空気圧駆動ラインからバイオチップに入り、および空気のみが排出膜を通過してバイオチップから出る−液体試薬はバイオチップにより用意され、液体はバイオチップから出ない。図３８は、流路４において単一の試料が流体プレートを通って流れることを示している。図３９は精製領域５を通るこの通路４の拡大図を示し、図４０は増幅領域６を通るこの通路４の拡大図を示し、および図４１は分離および検出領域７を通るこの通路４の拡大図を示している。電気泳動の方向が精製および増幅の方向と反対であることに留意することは重要である。直ぐ下の分離および検出層へ試料を回す流体層内のスルーホールによって、この方向の変化が促進される。２）ゲル処理流路。これらの流路は、分離および検出の準備において、分離および検出サブアセンブリーを篩い用マトリックスおよびバッファーで満たすのに使用される。すなわち、流路は、共通の試薬槽から充填される。精製後、増幅および予備電気泳動が終了すると、各流路は、試料に特定のカソードを介して１つの試料を受容する。各試料は、１つのカソードチャンバーと分離流路を有し、およびすべての試料は、単一のアノードチャンバーを共有しており、それを通して電気泳動試薬が装填される。

【0135】

流体プレートは、特定のフィルター領域、精製膜領域、および、いくつかのタイプのチャンバーを含んでおり、該チャンバーは、計量チャンバー、再構成チャンバー、混合チャンバー、結合チャンバー、廃棄チャンバー、並びにカソードチャンバーおよびアノードチャンバーを含んでいる。これらのチャンバーと領域は、流路に沿って位置し、要求される機能に応じて決定される形状および寸法を有している。例えば、試薬計量チャンバー（図４０、８）の特徴は、カソードチャンバー（図４１、９）または再構成チャンバー（図４０、１０）とは異なる寸法および体積にある。

【0136】

流路、チャンバー、フィルター領域および膜領域は、この場合、薄い熱可塑性膜を結合することにより覆われている（ＣＮＣ機械加工または射出成形されたプレートもカバーを形成する）。薄膜−流体層−薄膜のサンドイッチは、「流体サブアセンブリー」と呼ばれる。

【0137】

膜自身がＣＮＣ機械加工によりパターンを付与されており、本発明の薄膜も、型抜きまたは打ち抜きおよびレーザー切断を含む多くの処理法を用いてパターンを付与できる。これらの薄膜は、ＣＮＣ機械加工された流体層上の対応する特徴に合わせて配列され、流体層の特徴への接続を可能にするスルーホールを含む特徴を有している。例えば、試料は、流体層から、底面にパターンを付与された薄膜の中のスルーホールを通り、分離および検出サブアセンブリーに到達する。上部薄膜および下部薄膜をプレートに結合する前に、微粒子濾過（図３９、１１）、ＤＮＡ精製（図３９、１２）、および排出（図４１、１３）を含む機能のために追加の構成要素も組み入れられる。パターンを付与された薄膜の流体プレートへの結合は、熱的に達成されるが、超音波的に、溶媒を用いて、および接着剤を用いて行うこともできる。結合方法を容易にするためにプレート上および膜上の特徴を追加することができる；例えば、超音波溶接の場所にエネルギー指向リッジ（energy director ridges）を配置することができる。

【0138】

空気圧サブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、機器の空気圧駆動装置（実施例３に記載されているように）を、流体サブアセンブリー、マクロ流体処理サブアセンブリー、バルブサブアセンブリー、並びに分離および検出サブアセンブリーに結合して、流体を空気圧で移動させ、およびバイオチップ内のバルブを作動させる。ＣＯＰシートの両面のそれぞれに、相互接続された一連の空気圧駆動ラインをＣＮＣ機械加工することによりこのサブアセンブリーが製造される。駆動ラインのいくつかは試料に特有のものであり、他のものは、ゲル充填等の試料を選ばない機能に関係するものである。図４２は、空気圧プレート１４の上面を示し、図４３は空気圧プレート１４の底面を示し、図４４は空気圧プレート１４の透視図を示し、両面の特徴を示している。空気圧プレートの大きさは、２７６．７ｍｍ×１１７．３ｍｍ×２．５０ｍｍである。ＣＮＣ機械加工された空気圧プレートは、厚さ２．５ｍｍの射出成形素材を機械加工することにより製造された。空気圧プレートの上面は、パターンを付与された薄いプラスチック膜１５（図４５）で覆われている。空気圧プレートの底面は、完全な薄膜１６に覆われ、薄膜の特定の領域が、結合後に（図４６）バルブサブアセンブリーからのプレートに接続できるように切り抜かれている。パターンを付与された薄膜およびパターンを付与されていない薄膜の両方の厚さは１００ミクロンである。パターンは、結合の前（上部空気圧膜の場合のように）または結合の後で（底部空気圧膜の場合のように）に形成することができる。結合後のパターン付与工程が選択された理由は、大きな切り抜き領域は結合後簡単に除去できるからである。空気圧プレートへの薄膜の結合は、熱的に達成されたが、超音波的に、溶媒を用いて、および接着剤を用いて行うこともできる。結合方法を容易にするため、プレート上および膜上の特徴を追加することができる；例えば、エネルギー指向リッジを超音波溶接の場所に配置することができる。最後に、空気圧プレートは、流体特徴等も有することができる。これは有用であり、例えば、流体プレートが特徴で満たされ、空気圧プレートが利用可能な空間を有している。この場合の空気圧プレートは、バイオチップ全体におけるその位置およびその特徴の大部分が空気圧的であるという事実により、まだ空気圧プレートと呼ばれる。それらの位置に関係なく、空気圧ラインと空気圧流路は空気のみを含む。これに対し、流体特徴は、液体と空気を含んでもよい。

【0139】

薄いプラスチック膜における特徴は、ＣＮＣ機械加工された空気圧層上の対応する特徴に合わせて配列され、空気圧層への直接接続または空気圧層を介する流体層への間接接続を提供する、スルーホールを含む。例えば、マクロ流体処理サブアセンブリーのチャンバーの中の試薬は、流体サブアセンブリーへの途中で、空気圧サブアセンブリー（薄膜および空気圧プレート）のスルーホールを通る。パターンを付与された薄膜の空気圧プレートへの結合は、熱的に達成されたが、超音波的に、溶媒を用いて、および接着剤を用いて行うこともできる。

【0140】

バルブサブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、空気圧サブアセンブリーと流体サブアセンブリーとの間に配置されている。それは弾性体材料から成り、空気圧で作動させると、変形し、流体層内の流体（空気を含む）の流れを止める。このサブアセンブリーは、曲げることの可能な弾性体膜から成るが、実施例２に記載されたバルブアセンブリーはいずれも組み入れることができる。

【0141】

空気圧―バルブ―流体スタック ―このサブアセンブリーは、空気圧サブアセンブリー、バルブサブアセンブリー、および流体サブアセンブリーを組み合わせ、一体となるようにスタックを熱結合することにより製造される。排出膜（図４４、１７）は、流体サブアセンブリー（図３５、１３）の排出特徴および空気圧サブアセンブリーの対応する特徴の上にそれらを配置することにより、このサブアセンブリーの中に組み入れられる。排出膜は、単一片の形状であり、複数の試料の排出特徴を同時に覆うために使用される。１つの排出膜片が、多くの排出領域を覆うために用いられる。一般的に、手作業または自動化のいずれにおいても、構成要素数の減少は組み立てを容易にする。２つのサブアセンブリーの結合は、熱的に、超音波的に、溶媒を用いて、締め付け、および接着剤を用いても行うことができる。結合方法を容易にするために、プレート上および膜上の特徴を追加することができる；例えば、超音波溶接の場所にエネルギー指向リッジを配置することができ、または熱結合を容易にするために追加の結合層を用いることができる。

【0142】

マクロ流体処理サブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、２つの大きな要素から成る：マクロ流体ブロックとカバーである。このサブアセンブリーは、試料を受け容れ、試薬をバイオチップに用意し、およびマイクロ流体体積とマクロ流体体積との間のインターフェイスとして働き、プロセスは、名称が「核酸精製」であり、出典明示により本明細書に組み入れられる、出願番号１２／６９９，５６４に詳しく記載されている。図４７は、スワブ１９を備えたマクロ流体ブロック１８、分解溶液２０、エタノール２１、洗浄液２２、溶出液２３試薬チャンバー、溶解物保持用流体処理チャンバー２４、溶出液均質化２５、空気５８、ＴＴＥ５９、およびホルムアミド６０チャンバーを示している。ブロックの大きさは、１０２．８ｍｍ×５０．５ｍｍ×７４．７ｍｍである。マクロ流体ブロックは、０．１５〜３．０ｍＬの体積を使用し、空気圧サブアセンブリーおよびカバーと接続する。ブロックの側面は空気圧駆動ライン２６を含む；これらは空気圧サブアセンブリーの空気圧界面から始まり、それを通って該ブロックに至る。該ブロックから、駆動ラインはカバーに至る。実施例５に記載された実施形態を含み、いくつかの実施形態は、マクロ処理サブアセンブリーを含むが、本明細書に記載された技術に基づくすべてのバイオチップがマクロ処理サブアセンブリーを含むものではない。例えば、ＤＮＡまたは精製された細胞の試料は、バルブアセンブリーにより接続された空気圧サブアセンブリーと流体サブアセンブリーを含むバイオチップの中に、注入されることができる。

【0143】

図４８〜５４は、カバーを示している。カバーは３層から成る。図４８はカバー層１ ２７の上部を示し、図４９はカバー層１ ２７の底部を示し、および図５０はカバー層１ ２７の透視図を示す。図５１はカバー層２ ２８を示す。図５２はカバー層３ ２９の上部を示し、図５３はカバー層３ ２９の底部を示し、および図５４はカバー層３ ２９の透視図を示す。組み立てられたカバーの大きさは、５０．８ｍｍ×１１８．４×４．５ｍｍである。カバーの役目は、ブロックの側面からマクロ流体チャンバーの上部へと空気圧駆動ラインを持ってくることにあり、それにより、試薬の移送、バブリング、および流体処理を容易にする。カバーは、スワブチャンバー３０および溶出液保持チャンバー３１と連結する排出特徴を有している。排出膜は、チャンバーを分離することにより、圧力を正常にするために空気を逃がす一方で、流体が漏れるのを防ぐ。カバーはスワブを所定の場所に保持する働きも有する。必要に応じて、スワブのキャップまたはカバーに、試料を所定の場所に保持する固定機構を組み入れることもできる。

【0144】

マクロ流体ブロック部材およびカバー部材は、熱可塑性物をＣＮＣ機械加工することにより製造された。あるいは、これらの構成要素は、射出成形および圧縮射出成形および押し出しにより製造できる。マクロ流体処理ブロックを成形するため、２より大きいアスペクト比、および１°より小さい抜け勾配を設計に組み入れる。マクロ流体ブロックは、ガスケットやネジを用いて固定することにより、カバーに取り付けられた。ブロックは、両面ＰＳＡを用いて空気圧サブアセンブリーに取り付けられる。あるいは、ブロックの取り付けは、溶媒や熱結合でも行うことができる。

【0145】

マクロ流体処理に対する追加のアプローチは、係属中の名称が「核酸精製」である出願番号１２／６９９，５６４に詳しく記載されており、出典明示により本明細書に組み入れられる。マクロ流体処理アセンブリーは、バイオチップの適用に対して大きな柔軟性を提供する。液体試薬およびそれらの体積は、実行される試料操作のタイプに基づいて容易に変更可能である。スワブチャンバーは、異なるタイプのスワブ、血液試料、および環境試料を含む幅広い様々な試料を受け容れるように変更可能である。特定の環境では、空気圧−バルブ−流体スタックに対して影響を最小限にするようにこれらを変化させることができる；例えば、スタックの中の凍結乾燥されたケーキを単に変更することにより、異なる試料タイプにも全く異なる増幅アッセイを行うことを可能にする。

【0146】

分離および検出サブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、核酸の分離および検出に使用され、１６のマイクロ流路から成り、それぞれが注入ポートと分離ポートを備えている。プラスチック製バイオチップの分離および検出の詳細は、２００９／００２０４２７として公開され、名称が「プラスチック製のマイクロ流体分離および検出プラットホーム」である出願番号１２／０８０，７４５に詳しく記載されており、出典明示により本明細書に組み入れられる。試料注入に対して２つのアプローチ、圧力負荷と交差注入が用いられた。図５５は、圧力注入３２用の分離および検出バイオチップを示している。それは、界面導電注入用分離カラムの始点まで、分離および検出用の試料を空気圧で移動させる。分離流路（幅９０ミクロン、深さ４０ミクロン）の断面積と、アノードとカソードの間の長さ（２４ｃｍ）は、すべての流路で同じである。このサブアセンブリーは、薄い熱可塑性シート上にエンボス加工により製造された。あるいは、サブアセンブリーは、押し出し成形または射出成形により製造できる。スルーホールは、型押しされたシートの内部に形成され、マイクロ流体サブアセンブリーからの流路に対する接続を提供する。流路は、該流路の上に薄い熱可塑性シートを結合させることにより覆われた。

【0147】

図５６は、分離および検出用の試料を界面導電注入用分離カラム３３の始点まで界面導電移動させるための、交差注入用の分離および検出バイオチップを示している。バイオチップの大きさは、７７．７ｍｍ×２７６ｍｍ×３７６ミクロンである。分離流路（幅９０ミクロン、深さ４０ミクロン）の断面積と、アノードとカソードの間の長さ（２５ｃｍ）は、すべての流路で同じであった。このサブアセンブリーでは、１６流路の内の６個が作動していた。各流路の分離長さ（交差点と、励起／検出窓との間の距離）は、１６〜２０ｃｍの範囲である。カソードウェルと注入器との間の流路の断面積は、すべての電気抵抗、すなわちカソードと交差点との間の電場がバイアス下で実質的に同じになるように調整された。これにより、試料が投入される流路に関係なく、試料に加えられる電場が同じになることが確保される。すべての流路の交差電圧は実質的に同じであった。試料注入用の試料入口アームおよび試料廃棄アームは、両方とも長さが２．５ｍｍであった。両方の流路の間のオフセットは５００ミクロンであった。このサブアセンブリーは、薄い熱可塑性シートの上に型押しすることにより製造された。あるいは、サブアセンブリーは、押し出し成形または射出成形により製造してもよい。スルーホールは型押しされたシートの中に形成され、マイクロ流体サブアセンブリーからの流路への接続を提供する。別の薄い熱可塑性シートを溶剤結合することにより、流路は覆われた。あるいは、熱結合または熱補助型溶剤結合により取り付けることができる。

【0148】

分離および検出サブアセンブリー（圧力負荷または交差注入形式のいずれか）が、接着剤テープにより流体サブアセンブリーに取り付けられ、分離および検出バイオチップ内への核酸の流れが、ＮＡ精製および増幅とは反対の方向になるように、サブアセンブリーが配置された。すなわち、精製およびＰＣＲ増幅の時の流体の一般的な流れとは反対の方向に、分離および検出サブアセンブリーを通って核酸は移動する。サブアセンブリーの対向面を用いたこの方向の逆転により、複雑なバイオチップの長さを実質的に減少させることが可能となる。図５７は、いかにしてすべての層−マクロ流体カバー２７，２８および２９；マクロ流体ブロック１８、上部膜と底部膜を有する空気圧層１２，１５および１６；バルブサブアセンブリー層；上部膜と底部膜を有する流体層１，２および３；並びに分離および検出バイオチップ３２または３３が、積層一体化されてバイオチップを形成するかを示している。図５８は、バイオチップアセンブリー３４の写真であり、矢印は処理フローの方向を示している。

【0149】

図３９および４１を参照し、バイオチップを動かすために、試験の前にマクロ流体処理サブアセンブリーに以下の試薬が投入された：
・分解溶液（図３９、２０）、５５０μＬ−細胞溶解および試料からＤＮＡを放出させるためのカオトロピック塩系試薬。
・エタノール（図３９、２０）、５５０μＬ−溶解溶液、溶解細胞とともに用い、シリカ系精製フィルターに対するＤＮＡの結合を促進する。
・洗浄液（図３９、２２）、３ｍＬ−精製フィルターを洗浄して、タンパク質と他の生物学的材料を除去して純粋なＤＮＡを生成させるためも、洗浄用エタノール系試薬。
・溶出液（図３９、２３）、３００μｌ−精製フィルターから精製されたＤＮＡを放出させ、ＤＮＡを安定化させる、トリス−ＥＤＴＡ系試薬。
・ＴＴＥバッファー（図４１、５８）、１．６ｍＬ−電気泳動のためのトリス−タップス−ＥＤＴＡ系試薬。
・ホルムアミド（図４１、５９）、１５０μＬ−ＰＣＲ生成物を希釈して、分離および検出用の試料を調製するための変性溶液。試料とホルムアミドを約１：４（１：５０から１：１．５の範囲）の比率で混合する。変性を促進するために加熱または急冷は不要である。従来の加熱／冷却工程を省略することで機器を単純化できる。

【0150】

図４０および４１を参照し、試験の前に、バイオチップの流体サブアセンブリーの中に以下の凍結乾燥試薬が投入された：
・ＰＣＲケーキ（図４０、１０）−凍結乾燥ＰＣＲ反応混合物
・レーン（サイジング）内部標準（ＩＬＳ）ケーキ（図４１、３５）−蛍光標識された凍結乾燥ＤＮＡフラグメントであり、増幅されたフラグメントの電気泳動移動度を分子量と相関させることができる。
このアプローチの利点は、凍結乾燥された試薬を１つのサブアセンブリーの中に集めることができることである。凍結乾燥ケーキ（低水分および変化が少ない）を充填する条件は、液体を充填する条件とは全く異なり、かつ非常に厳しいので、このアプローチは、供給連鎖管理（supply chain management）を向上させることができる。したがって、液体試薬と凍結乾燥試薬は別々に、および並行して充填することができる。必要に応じて、対立遺伝子ラダーとＩＬＳフラグメントを含む凍結乾燥ケーキを、ＳＴＲ分析試験のための上部ケーキチャンバー３５の中に挿入できる。

【0151】

試験の前に、バイオチップの分離および検出部の中に以下の試薬が投入された：
・篩い用マトリックス（図５５、３６および図５６、３６）−ＤＮＡの電気泳動篩いのための高分子量線状ポリアクリルアミド溶液。

【0152】

以下のサブシステム（図５９）を含む単一構造の、完全統合された機器にバイオチップが挿入された。サブシステムについては、２００９／０２２９９８３として公開され、名称が「核酸およびタンパク質の分析用の補強された装置」である米国特許出願番号１２／３９６，１１０（パラグラフ６５〜７６参照）；２００９／００２３６０２として公開され、名称が「標的核酸の迅速多重増幅方法」である米国特許出願番号１２／０８０，７４６（パラグラフ５４、および５６〜６７参照）；２００９／００５９２２２として公開され、名称が「統合核酸分析」である米国特許出願番号１２／０８０，７５１（パラグラフ１３９〜１４４参照）；２００９／００２０４２７として公開され、名称が「プラスチック製のマイクロ流路分離および検出プラットホーム」である米国特許出願番号１２／０８０，７４５、に記載されており、すべての内容は出典明示により本明細書に組み入れられる。該サブシステムは、以下のものをふくむ：

【0153】

空気圧サブシステム−空気圧および真空ポンプが、一連のタンクおよびソレノイドバルブを通して、空気圧マニホールド（実施例４では、図４４、６１として記載されている）に接続されている。次にこのマニホールドは、空気圧インターフェイスを介してバイオチップの空気圧ポートに接続されている。ソレノイドバルブは、プロセスコントローラーにより制御されている。

【0154】

熱サブシステム−ペルチエ系熱サイクルシステムが、バイオチップの熱サイクルチャンバー（図３５、６２）に接続され、反応物をこれらの流路の中に迅速に循環させる。実施例４に記載されているように、クランプが増幅領域に圧力を加えているので、熱循環器による十分な熱移動が行われる。反応温度および保持時間はプロセスコントローラーにより制御される。

【0155】

高電圧サブシステム−高電圧源は、分離バイオチップのアノード部（図５５、６３）とカソード部（図５５、６４）に接続されている。アノード電極がアノード部の空気圧プレートと流体プレート（図４４、６５および図３５、６５）を通過し、およびカソード電極が流体プレートと空気圧プレートの中のカソード部の中に組み入れられ（図４４、６６および図３５、６６）、分離および検出バイオチップとの接続が確保されていることに留意されたい。高電圧を印加すると、流路に沿って電界が発生し、予備電気泳動、試料注入、並びに分離および検出が行われる。高電圧サブシステムはプロセスコントローラーにより制御される。

【0156】

光学サブシステム−バイオチップ内にある、分離および検出バイオチップの励起および検出窓（図５５、６７および図５６、６７）に、光学システムが接続されている。空気圧プレートと流体プレート上の開放窓（図４４、３８および図３５、３７）を光が通過することに留意されたい。光学システムは、分離流路内の標識ＤＮＡフラグメントからの蛍光を誘起するのに使用されるレーザーから成る。一連のダイクロイックミラーは蛍光の波長成分を分離するのに使用される。光電子増倍管は、蛍光信号を検出するために使用される。一連の光学要素は、光（励起レーザーおよび発光蛍光）を、レーザーと分離および検出バイオチップとの間、並びに分離および検出バイオチップと検出器との間に移動させるのに使用される。光学サブシステムはプロセスコントローラーにより制御される。

【0157】

プロセスコントローラー ―予め設定された処理スクリプトを受け容れ、該スクリプトを読み取り、それに従いサブシステムを制御することにより該スクリプトを自動的に実行するコンピュータを用いたコントローラー。コンピュータは、必要に応じてデータ処理およびデータ解析を行うことに留意されたい。

【0158】

試料投入から結果出力へのプロセスは以下のように実行された。ドナーから５つのスワブが収集された。メーカーの指示に従い、ボーデセキュアスワブのスワブの先端を頬内側に押しつけることによりスワブは回収された。５つのスワブのそれぞれが、バイオチップのスワブチャンバーの１つの中に挿入され、バイオチップは機器の中に配置され、自動処理スクリプトが開始され、スワブ投入から結果出力までの分析が実行された。以下の工程を含む自動化スクリプトが実行された：
・初期化
バルブラインに圧力を加えることによりバイオチップ上のすべてのバルブが閉じられた。実施例５のバルブは２０ｐｓｉｇの圧力で作動して閉じられ、開くことにより大気に排出させた。例外はバルブＶ１３（図３９、４１）であり、〜１１ｐｓｉｇの圧力を加えることにより開放位置を維持させた。簡単のため、バルブ番号は、空気圧プレートに対するそれらの位置に基づいて示される（たとえバルブがバルブアセンブリーの中に実際に配置されていても）。
・分解
バルブＶ１（図３９、３９）を開き、駆動ラインＤＬ１（図３９、６８）に対して３ｐｓｉｇの圧力を３０秒間、次いで５．５ｐｓｉｇの圧力を６０秒間加えることにより、５５０μＬの分解溶液が、分解試薬チャンバー（図３９、２０）からスワブチャンバー（図３９、１９）の中へ、空気圧で投入された。バルブＶ１（図３９、３９）を閉じ、駆動ライン１（図３９、６８）を停止させた。バルブＶ２（図３９、４０）を開き、駆動ライン２（図３９、６９）に５．５ｐｓｉｇの駆動圧力を３０秒間加えることにより、エタノール試薬チャンバー（図３９、２１）から５５０μＬのエタノールがスワブチャンバー（図３９、１９）の中に空気圧で投入された。
・無秩序バブリング
バルブＶ２（図３９、４０）を開き、駆動ライン２（図３９、６９）に５．５ｐｓｉｇの空気圧力を３０秒間加えることにより、スワブチャンバー（図３９、１９）の中に空気圧により空気が導入された。バルブ２（図３９、４０）を閉じ、駆動ライン２（図３９、６９）を停止させた。スワブチャンバーの中に導入された空気は分解溶液の中に泡を生成させ、分解試薬とスワブ先端の両方を無秩序に攪拌した。これにより細胞が分解され、ＤＮＡが放出された。
・待ち合わせ
溶解物を移動させるため、駆動ライン３（図３９、７０）を〜７ｐｓｉｇで３０秒間の真空としながら、バルブＶ３（図３９、４１）を開放位置に保持することにより、粒子状フィルター（図３９、１１）を通してスワブチャンバー（図３９、１９）から溶解物を取り出して、保持チャンバー（図３９、２４）の中に移動させた。バルブ３（図３９、４１）を閉じ、駆動ライン３（図３９、７０）を停止させた。
・ＤＮＡ結合
バルブＶ４８（図３９、４２）および一連のバルブＶ５（図３９、４３）を開き、駆動ラインＤＬ３（図３９、７０）に５ｐｓｉｇの圧力を６０秒間加えることにより、保持チャンバー（図３９、２４）からの溶解物を精製フィルター（図３９、１２）を通して、スワブチャンバー（図３９、１９）の中へ移動させた。バルブＶ４（図３９、４２）およびＶ５（図３９、４３）を閉じ、ＤＬ３（図３９、７０）を停止させた。溶解物内のＤＮＡは精製フィルター（図３９、１２）に結合した。スワブチャンバーが、溶解物の生成および処理の後の廃棄チャンバーとしての使えることに留意されたい；この二重使用は、マクロ流体ブロック上の別の大体積のチャンバーへの要求を不要にする。もし溶解物の保留が必要な場合、各試料から別の廃棄チャンバーを必要に応じて含めることができる。
・洗浄
バルブＶ５（図３９、４３）およびＶ６（図３９、４６）を開き、駆動ラインＤＬ４（図３９、７１）に１３ｐｓｉｇの圧力を９０秒間加えることにより、洗浄試薬チャンバー（図３９、２２）からの洗浄液を、精製フィルター（図３９、１２）を通して、スワブチャンバー（図３９、１９）の中に空気圧で移動させた。バルブＶ５（図３９、４３）およびＶ６（図３９、４６）を閉じ、ＤＬ４（図３９、７１）を停止させた。汚染物および結合したＤＮＡの破片を除去するために３ｍＬの洗浄液を精製フィルターに流した。２回の追加洗浄で隣接する流路の洗浄が可能であった。
・乾燥
バルブＶ５（図３９、４３）およびＶ６（図３９、４６）を開き、駆動ラインＤＬ４（図３９、４６）に１３ｐｓｉｇの圧力を１８５秒間加えることにより、精製フィルター（図３９、１２）を通して、スワブチャンバー（図３９、１９）の中に空気圧で空気を移動させた。バルブＶ５およびＶ６を閉じ、ＤＬ４（図３９、７１）を停止させた。空気は部分的に精製フィルターを完全に乾燥させる。
・溶出
バルブＶ６（図３９、４６）、Ｖ７（図３９、４５）およびＶ８（図３９、４７）を開き、駆動ラインＤＬ５（図３９、７２）に５ｐｓｉｇの圧力を１２０秒間加えることにより、溶出試薬チャンバー（図３９、２３）からの溶出バッファーを、精製フィルター（図３９、１２）を通して、溶出液保留チャンバー（図３９、２５）の中に空気圧で移動させた。バルブＶ６（図３９、４６）、Ｖ７（図３９、４５）およびＶ８（図３９、４７）を閉じ、ＤＬ５（図３９、７２）を停止させた。精製フィルターに結合している精製ＤＮＡを放出させるために、精製フィルター（図３９、７２）に３００μＬの溶出バッファーを流した。
・均質化
バルブＶ６（図３９、４６）、およびＶ８（図３９、４７）を開き、駆動ラインＤＬ４（図３９、７１）に５ｐｓｉｇの圧力を６０秒間加えることにより、溶出液保留チャンバーの中へ空気圧で空気を移動させた。バルブＶ６（図３９、４６）、およびＶ８（図３９、４７）を閉じ、ＤＬ４（図３９、７１）を停止させた。溶出液保留チャンバーの中へ移動させた空気は、溶出液の中で泡を生成させ、溶出液の中のＤＮＡを攪拌し均質化した。精製ＤＮＡの保留試料が必要な場合、必要に応じて、溶出液の一部を貯蔵チャンバーまたは貯蔵フィルター上へ移送することができる。
・溶出液計量
バルブＶ１０（図３９、４８）を開き、ＤＬ６（図３９、７３）に１ｐｓｉｇの圧力を４０秒間加えることにより、溶出液保留チャンバー（図３９、２５）からの溶出液を、溶出液計量チャンバー（図４０、８）の中に空気圧で移動させた。バルブＶ１０（図３９、４８）を閉じ、ＤＬ６（図３９、７３）を停止させた。各溶出液は計量チャンバーを充填し、排出膜で止まった。バルブＶ１０（図３９、４８）およびＶ１１（図４０、５０）を開き、駆動ラインＤＬ７（図４０、４９）に２ｐｓｉｇの圧力を２５秒間加えることにより、過剰の溶出液を溶出液保留チャンバーの中へ空気圧で戻した。バルブＶ１０（図３９、４８）およびＶ１１（図４０、５０）を閉じ、ＤＬ７（図４０、４９）を停止させた。
・再構成ＰＣＲケーキ
バルブＶ１１（図４０、５０）およびＶ１２（図４０、５１）を開き、駆動ラインＤＬ７（図４１、４９）に、０．２ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．４ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．６ｐｓｉｇで６０秒間の連続駆動を適用することにより、溶出液計量チャンバー（図４０、８）からＰＣＲケーキチャンバー（図４０、１０）へと溶出液を空気圧で移動させた。バルブＶ１１（図４０、５０）とＶ１２（図４０、５１）を閉じ、ＤＬ７（図４１、４９）を停止させた。凍結乾燥ＰＣＲ反応混合物を含むケーキを再構成して増幅用のＰＣＲ混合物を生成させるために、２０．５μＬの計量された溶出液を移動させた。
・熱サイクルチャンバーへの移動
バルブＶ１１（図４０、５０）、Ｖ１２（図４０、５１）、Ｖ１３（図４０、５２）、およびＶ１４（図４０、５３）を開き、駆動ラインＤＬ７（図４１、４９）に、０．２ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．４ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．６ｐｓｉｇで３０秒間へと連続的に増加させる連続駆動を適用することにより、ケーキチャンバー（図４０、１０）から熱サイクルチャンバー（図４０、６２）へとＰＣＲ反応混合物を空気圧で移動させた。バルブＶ１１（図４０、５０）、Ｖ１２（図４０、５１）、Ｖ１３（図４０、５２）、およびＶ１４（図４０、５３）を閉じ、ＤＬ７（図４０、４９）を停止させた。ＰＣＲ反応混合物を熱サイクルチャンバーの中で移動させ、待ち合わせ排出膜の位置で停止する。
・熱サイクル
熱サイクルチャンバー（図４０、６２）内で反応を繰り返すために、３１サイクルプロトコルを適用して、標識アンプリコンを生成させた（ギース．Ｈら（２００９）、「従来のおよびマイクロ流体ＳＴＲ分析のための迅速多重ＰＣＲ」、J.Forensic Sic.,54(6),1287-96、および２００９／００２３６０３として公開され、名称が「標的核酸の迅速多重増幅方法」である出願番号が１２／０８０，７４６、いずれも出典明示により本明細書に組み入れられる。）。サイクル条件は以下の通りである：ホットスタートで９３℃×２０秒間、次に（９３℃×４秒間、５６℃×１５秒間、および７０℃×７秒間）を３１サイクル、次いで、７０℃×９０秒間の最終延長。
・ＰＣＲ生成物の計量
バルブＶ１１（図４０、５０）、Ｖ１２（図４０、５１）、Ｖ１３（図４０、５２）、Ｖ１４（図４０、５３）、およびＶ３０（図４１、１１１）を開き、駆動ラインＤＬ７（図４０、４９）に、０．２ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．４ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．６ｐｓｉｇで４５秒間へと連続的に増加させる連続駆動を適用することにより、熱サイクルチャンバー（図４０、６２）からＰＣＲ計量チャンバー（図４１、７４）へとＰＣＲ反応混合物を空気圧で移動させた。バルブＶ１１８図４０、５０）、Ｖ１２（図４０、５１）、Ｖ１３（図４０、５２）、Ｖ１４（図４０、４９）およびＶ３０（図４１、１１１）を閉じ、ＤＬ７（図４０、４９）を停止させた。ＰＣＲ生成物は計量チャンバーに流入し、排出膜の位置で止まる。
・ホルムアミド計量
駆動ラインＤＬ８（図４１、７５）に１ｐｓｉｇで５０秒間の圧力を加えることにより、ホルムアミド試薬チャンバー（図４１、６０）からホルムアミド計量チャンバー（図４１、７６）の中へ空気圧でホルムアミドを移動させた。駆動ラインＤＬ８（図４１、７５）を停止させた。ケーキを再構成して対照試料を生成させるために、ホルムアミドの６番目の体積（図４１、７７）を計量した。ホルムアミドは計量チャンバーに流入し、排出膜の位置で止まる。バルブＶ１５（図４１、５４）を開き、駆動ラインＤＬ８（図４１、７５）に３ｐｓｉｇで１８０秒間圧力を加えることにより、ホルムアミドチャンバーから廃棄チャンバーの中へ過剰のホルムアミドを空気圧で移動させた。バルブＶ１５（図４１、５４）を閉じ、ＤＬ８（図４１、７５）を停止させた。試薬チャンバーと駆動ラインの過剰のホルムアミドはすべて廃棄チャンバーに移動させた。
・ＰＣＲ生成物とホルムアミドとの結合
バルブＶ１８（図４１、５７）、Ｖ１７（図４１、８０）およびＶ２０（図４１、８１）を開き、駆動ラインＤＬ９（図４１、７９）に、０．２、０．３、０．４、および０．５ｐｓｉｇを、それぞれ３０秒間という段階的駆動プロファイルで圧力を加えることにより、ＰＣＲ計量チャンバー（図４１、７４）から結合チャンバー（図４１、７８）の中へ、計量されたＰＣＲ生成物を空気圧で移動させた。バルブＶ１８（図４１、５７）、Ｖ１７（図４１、８１）、およびＶ２０（図４１、８１）を閉じ、ＤＬ９（図４１、７９）を停止させた。バルブＶ１６（図４１、５５）およびＶ２０（図４１、８１）を開き、ＤＬ８（図４１、７５）に、０．２、０．４、および０．６ｐｓｉｇが、それぞれ３０秒間、３０秒間および６０秒間と増加する圧力を加えることにより、ホルムアミド計量チャンバー（図４１、７６）から結合チャンバー（図４１、７８）の中へホルムアミドを空気圧で移動させた。バルブＶ１６（図４１、５５）およびＶ２０（図４１、８１）を閉じ、ＤＬ８（図４１、７５）を停止させた。結合チャンバーは、２つの別々の流れに由来する計量されたＰＣＲと計量されたホルムアミドとを結合して、分離および検出用の試料を調製する。
・ＩＬＳケーキの再構成
バルブＶ１６（図４１、５５）およびＶ１９（図４１、５６）を開き、駆動ラインＤＬ８（図４１、７５）に、０．２、０．４、および０．６ｐｓｉｇが、それぞれ３０秒間、３０秒間および６０秒間の増加する圧力を加えることにより、ＩＬＳケーキチャンバー（図４１、３５）の中へ、分離および検出用の試料を空気圧で移動させた。Ｖ１６（図４１、５５）およびＶ１９（図４１、５６）を閉じ、ＤＬ８（図４１、７５）を停止させた。４．１μＬのＰＣＲ生成物と１６．４μＬのホルムアミドを含む分離および検出用の試料は、チャンバー内のＩＬＳケーキを再構成して、分離および検出用の試料を生成させた。
・対照＋ＩＬＳケーキの再構成
バルブＶ１６およびＶ２０を開き、駆動ラインＤＬ９に、０．２、０．４、および０．６ｐｓｉｇが、それぞれ３０秒間、３０秒間および６０秒間の増加する圧力を加えることにより、対照＋ＩＬＳケーキチャンバー（図４１、８３）の中へ６番目の計量されたホルムアミド体積を空気圧で移動させた。Ｖ１６およびＶ２０を閉じ、ＤＬ９を停止させた。２０．５μＬのホルムアミドがチャンバー内のケーキを再構成して、分離および検出用の試料を生成させた。
・分離流路への試料の注入
バルブＶ２１（図４１、８６）およびＶ２２（図４１、８７）を開き、駆動ラインＤＬ８（図４１、７４）に、０．４、０．６、１．０、１．５および２．０ｐｓｉｇが、それぞれ３０秒間、３０秒間、３０秒間、３０秒間、および３０秒間の連続する段階的なプロファイルの圧力を加えることにより、ケーキチャンバー（図４１、３５および８２）から脱泡チャンバー（図４１、８３）を通って、カソードチャンバー（図４１、８４）および試料廃棄チャンバー（図４１、８５）を充填するように、６つの分離および検出用の試料を空気圧で移動させた。Ｖ２１（図４１、８６）およびＶ２２（図４１、８７）を閉じ、ＤＬ８（図４１、７４）を停止させた。カソード（図５５および５６、６３）とアノード（図５５および５６、６４）に４４００Ｖの電圧を３５秒印加することにより、試料内のＤＮＡをカソードチャンバー（図４１、８４）からバイオチップの分離部（図５６および図５５、８８）に注入させた。
・ＤＮＡの分離および検出
バルブＶ２５（図４１、９１）、Ｖ２４（図４１、９０）、Ｖ２６（図４１、９５）、Ｖ２７（図４１、９６）、およびＶ２８（図４１、９７）を開き、駆動ラインＤＬ１０（図４１、９８）に２ｐｓｉｇの圧力を２４０秒間加えることにより、ＴＴＥ試薬槽（図４１、５９）からＴＴＥを空気圧で移動させ、カソード（図４１、８４）を充填させ、およびＴＴＥ廃棄チャンバー（図４１、９２、９３、および１３）を充填させた。バルブＶ２５（図４１、９１）、Ｖ２４（図４１、９０）、Ｖ２６（図４１、９５）、Ｖ２７（図４１、９６）、およびＶ２８（図４１、９７）を閉じ、ＤＬ１０（図４１、９８）を停止させた。カソードを通過するＴＴＥの流れは、カソード内の試料を置換した。カソード（図５５および５６、６３）とアノード（図５５および５６、６４）に６４００Ｖの電圧を３０分印加すると、Ｓ＆Ｄバイオチップ（図５５）の分離部に注入されたＤＮＡは、バイオチップの分離部（図５６、８８）を下方に移動する。光学システムも作動させて、励起および検出窓において、レーザー誘導蛍光励起および検出を行った。レーザーは２００ｍＷであり、データ収集速度は５Ｈｚで行った。蛍光信号は、検出経路を通って光電子増倍管に到達する。そこで、蛍光は信号に変換され、該信号はシステムソフトウェアにより記録される。

【0159】

上述の設定された処理工程に基づいて電気泳動図（図６０および６１）が作成された。対照電気泳動図（図６０）は、対照ＩＬＳ試料（ＲＯＸで蛍光標識されたフラグメント）について作成された。Ｘ軸はデータ収集カウントを示し、各カウントは、標識フラグメントが検出領域に到着した時間を示している。いうつかの標準サイズを矢印で示しており、低分子量のフラグメントは高分子量のフラグメントよりも速く移動し、早く検出される（すなわち、グラフの左側）。Ｙ軸は、各ピークに対する相対蛍光単位（ｒｆｕ）を示している。図６１は、１つの頬スワブ試料の生成したＳＴＲフラグメントの大きさを示している。ＰＣＲ反応混合物中のＳＴＲプライマーとＩＬＳを標識するのに用いた各蛍光色素を各パネルに示す。蛍光標識フラグメントは一番上のパネルに示し、ＪＯＥ標識フラグメントは上から２番目のパネルに示し、ＴＡＭＲＡ標識フラグメントは上から３番目のパネルに示し、およびＲＯＸ標識ＩＬＳフラグメントは一番下のパネルに示す。Ｘ軸およびＹ軸は、図６０で説明したのと同じである。試料挿入から電気泳動図作成までの全プロセスに要した時間は約９０分であり、および約２１５の設定処理工程であった。多くの処理工程が短縮可能であり、必要であれば、プロセスは４５分未満で実行できる。

【0160】

実施例６．自動化スクリプトを使用して、核酸を精製し、精製ＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを電気泳動分離し、およびＳＴＲプロファイルを生成させる、完全に統合されたバイオチップの射出成形
このバイオチップは実施例５のものと似ており、射出成形により製造された流体プレートおよび空気圧プレートを有している。５つの頬スワブを受け容れ、ＳＴＲプロファイルを生成させる、固体型で単一構造のプラスチック製バイオチップは、以下の構成要素からなる：

【0161】

流体サブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、バイオチップ内の流体を移動させおよび処理し、空気圧サブアセンブリー、マクロ流体処理サブアセンブリー、バルブサブアセンブリー、並びに分離および検出サブアセンブリーと相互作用する。該サブアセンブリーは、相互接続された一連の流路、チャンバー、並びに、熱可塑性シートの上面と底面の両方の上の膜およびフィルター特徴を備えたＣＯＰを射出成形することにより製造された。図６２は、流体プレート６０１の上面を示し、図６３は流体プレート６０１の底面を示し、および図６４は流体プレート６０１の透視図を示し、両面の特徴を示している。図６５は、射出成形された流体プレート６０１ｂの写真を示す。射出成形された流体プレートの大きさは、２７６ｍｍ×１１７ｍｍ×２．５ｍｍである。プレートの上面および底面の両方は、パターンを付与された薄いプラスチック膜で覆われている。図６６は、上部にパターンが付与された薄膜６０２を示し、図６７は底部にパターンが付与された薄膜６０３を示す。

【0162】

射出成形された流体プレート内の単一の試料のための流路を図６８に示す。試料流路４は、精製部（図６８、５）、ＰＣＲ部（図６８、６）並びに分離および検出部（図６８、７）を通る。分離部、ＰＣＲ部並びに分離および検出部の拡大図を、それぞれ図６９、７０および７１に示す。射出成形された流体プレートは、粒子状フィルター領域（図６９、１１）、精製膜領域（図６９、１２）、並びに計量チャンバー（図６９、８）、再構成チャンバー（図６９、１０）、結合チャンバー（図７０、７８）、廃棄チャンバー（図７０、９２、９３および９４）、およびカソード（図７１、８４）とアノード（図６４、６５）を含むいくつかのタイプのチャンバーを有している。

【0163】

流体プレートの上面と底面は、パターンを付与された薄いプラスチック膜で覆われ、および溶剤結合により取り付けられている。流体プレートへのパターンを付与された薄膜の結合は、超音波的に、熱的に、および接着剤を用いて行うこともできる。結合方法を容易にするために、プレートおよび膜の上の特徴を追加することができる；例えば、超音波溶接の場所にエネルギー指向リッジを配置することができる。薄膜の厚さは１００ミクロンであり、ＣＮＣ機械加工により製造され、必要により、型抜き、またはレーザー切断により製造することができる。薄いプラスチック膜の中の特徴は、スルーホールを含み、流体サンドイッチ層に接続できるように、射出成形された層上の対応する特徴に合わせて配列されている。精製膜（図６９、１２）、粒子状フィルター（図６９、１１）および排出膜は、薄膜を結合する前に、熱溶接によりこのサブアセンブリーに取り付けられている。同様に、これらの膜およびフィルターは、超音波溶接および熱かしめにより取り付けられている。

【0164】

空気圧サブアセンブリー ―このサブアセンブリーは、機器の空気圧駆動装置を流体サブアセンブリーに結合し（実施例４に記載されているように）、流体サブアセンブリーの中の流体を空気圧で移動させ、およびバイオチップ内のバルブを空気圧で作動させる。このサブアセンブリーは、熱可塑性シートの上面と底面の両方の上の、相互接続された一連の空気圧駆動ライン、チャンバー、並びに膜およびフィルター特徴を有するＣＯＰを射出成形することにより製造された。図７２は、空気圧プレートの上面を示し、図７３は空気圧プレートの底面を示し、および図７４は空気圧プレートの透視図を示し、両面の特徴を示している。図７５は、射出成形された空気圧プレートの写真を示す。射出成形された空気圧プレートの大きさは、２７７．６ｍｍ×１１７．７ｍｍ×２．５０ｍｍである。結合後、すべての空気圧サブアセンブリー特徴は、流体サブアセンブリー特徴に合わせて配列する。プレートの上面はプレートへの接続を可能とするスルーホール、を備えたパターンを付与された薄いプラスチック膜で覆われている。図７６は、上部にパターンを付与された薄膜を示している。パターンを付与され、バルブサブアセンブリーを示す薄膜が溶剤結合により取り付けられた時、プレートの底面は覆われる；薄膜はＣＮＣ機械加工によりパターンを付与される。薄膜の厚さは１００ミクロンである。パターンは、結合の前または結合の後で形成することができる。上部薄膜および底部薄膜を空気圧プレートに結合する前に、排出膜を組み入れる（図６８、１７）。空気圧プレートへの薄膜の結合は溶媒を用いて達成できるが、超音波的、熱的、および接着剤を用いて行うこともできる。

【0165】

マクロ流体処理サブアセンブリー並びに分離および検出サブアセンブリーは実施例５に記載されているものと同じである。本バイオチップでは、バルブアセンブリーは、厚さが４０ミクロン、５０ミクロン、または１００ミクロンである薄い熱可塑性膜である。空気圧で作動させる剛直バルブ層（実施例２に記載されている）は、空気圧サブアセンブリーと流体サブアセンブリーを分離する。空気圧で作動すると、この層は反り、流体層内の流体（空気を含む）の流れを制御する。

【0166】

空気圧―バルブ―流体のスタックサブアセンブリーは、空気圧アセンブリーを流体アセンブリーに溶剤結合することにより製造された。空気圧プレートの底面上のチャンバーおよび流路は、流体層に溶剤結合される時に封止される。マクロ流体ブロックは、ガスケットまたはネジを用いて固定することによりカバーに取り付けられる。ブロックは両面ＰＳＡテープを用いて空気圧サブアセンブリーに取り付けられた。あるいは、ブロック取り付けは、溶剤結合または熱結合により行うことができる。最後に、分離および検出サブアセンブリーはＰＳＡテープを用いて流体サブアセンブリーに取り付けられ、および分離および検出バイオチップ内の核酸の流れがＮＡ精製および増幅とは反対の方向になるように、サブアセンブリーが配置された。

【0167】

バイオチップを試験するために、液体試薬および凍結乾燥試薬が実施例５に記載されているように投入され、実施例５の完全に統合された機器の中にバイオチップが挿入される。ドナーから５つのスワブが収集され、該５つのスワブのそれぞれがバイオチップのスワブチャンバーの１つに挿入された。以下の工程を含む自動化スクリプトが実行された：
・初期化
すべてのバルブラインに７５ｐｓｉｇの圧力を加えることによりバイオチップ上のすべてのバルブが閉じられた。例外はバルブＶ３であり、〜１１ｐｓｉｇの圧力を加えることにより開放位置を維持させた。簡単のため、バルブ番号は、空気圧プレートに対するそれらの位置に基づいて示される（たとえバルブがバルブアセンブリーの中に実際に配置されていても）。
・分解
バルブＶ１（図６９、３９）を開き、駆動ラインＤＬ１（図３９、６８）に対して３ｐｓｉｇの圧力を３０秒間、次いで５．５ｐｓｉｇの圧力を６０秒間加えることにより、５５０μＬの分解溶液が、分解試薬チャンバー（図６９、２０）からスワブチャンバー（図６９、１９）の中へ、空気圧で投入された。バルブＶ１（図６９、３９）を閉じ、駆動ライン１（図６９、６８）を停止させた。バルブＶ２（図６９、４０）を開き、駆動ライン２（図６９、６９）に５．５ｐｓｉｇの駆動圧力を３０秒間加えることにより、エタノール試薬チャンバー（図６９、２１）から５５０μＬのエタノールがスワブチャンバー（図６９、１９）の中に空気圧で投入された。
・無秩序バブリング
バルブＶ２（図６９、４０）を開き、駆動ライン２（図６９、６９）に５．５ｐｓｉｇの空気圧力を３０秒間加えることにより、スワブチャンバー（図６９、１９）の中に空気圧により空気が導入された。バルブ２（図６９、４０）を閉じ、駆動ライン２（図６９、６９）を停止させた。スワブチャンバーの中に導入された空気は分解溶液の中に泡を生成させ、分解試薬とスワブ先端の両方を無秩序に攪拌した。これにより細胞が分解され、ＤＮＡが放出された。
・待ち合わせ
溶解物を移動させるため、駆動ライン３（図６９、７０）を〜７ｐｓｉｇで３０秒間の真空としながら、バルブＶ３（図６９、４１）を開放位置に保持することにより、粒子状フィルター（図６９、１１）を通してスワブチャンバー（図６９、１９）から溶解物を取り出して、保持チャンバー（図６９、２４）の中に移動させた。バルブ３（図６９、４１）を閉じ、駆動ライン３（図６９、７０）を停止させた。
・ＤＮＡ結合
バルブＶ４（図６９、４２）および一連のバルブＶ５（図６９、４３）を開き、駆動ラインＤＬ３（図６９、７０）に５ｐｓｉｇの圧力を６０秒間加えることにより、保持チャンバー（図６９、２４）からの溶解物を精製フィルター（図６９、１２）を通して、スワブチャンバー（図６９、１９）の中へ移動させた。バルブＶ４（図６９、４２）およびＶ５（図６９、４３）を閉じ、ＤＬ３（図６９、７０）を停止させた。溶解物内のＤＮＡは精製フィルター（図３９、１２）に結合した。スワブチャンバーが、溶解物の生成および処理の後の廃棄チャンバーとしての使えることに留意されたい；この二重使用は、マクロ流体ブロック上の別の大体積のチャンバーへの要求を不要にする。もし溶解物の保留が必要な場合、各試料から別の廃棄チャンバーを必要に応じて含めることができる。
・洗浄
バルブＶ５（図６９、４３）およびＶ６（図６９、４６）を開き、駆動ラインＤＬ４（図６９、７１）に１３ｐｓｉｇの圧力を９０秒間加えることにより、洗浄試薬チャンバー（図６９、２２）からの洗浄液を、精製フィルター（図６９、１２）を通して、スワブチャンバー（図６９、１９）の中に空気圧で移動させた。バルブＶ５（図６９、４３）およびＶ６（図６９、４６）を閉じ、ＤＬ４（図６９、７１）を停止させた。汚染物および結合したＤＮＡの破片を除去するために３ｍＬの洗浄液を精製フィルターに流した。２回の追加洗浄で隣接する流路の洗浄が可能であった。
・乾燥
バルブＶ５（図６９、４３）およびＶ６（図６９、４６）を開き、駆動ラインＤＬ４（図６９、４６）に１３ｐｓｉｇの圧力を１８５秒間加えることにより、精製フィルター（図６９、１２）を通して、スワブチャンバー（図６９、１９）の中に空気圧で空気を移動させた。バルブＶ５およびＶ６を閉じ、ＤＬ４（図６９、７１）を停止させた。空気は部分的に精製フィルターを完全に乾燥させる。
・溶出
バルブＶ６（図６９、４６）、Ｖ７（図６９、４５）およびＶ８（図６９、４７）を開き、駆動ラインＤＬ５（図６９、７２）に５ｐｓｉｇの圧力を１２０秒間加えることにより、溶出試薬チャンバー（図６９、２３）からの溶出バッファーを、精製フィルター（図６９、１２）を通して、溶出液保留チャンバー（図６９、２５）の中に空気圧で移動させた。バルブＶ６（図６９、４６）、Ｖ７（図６９、４５）およびＶ８（図６９、４７）を閉じ、ＤＬ５（図６９、７２）を停止させた。精製フィルターに結合している精製ＤＮＡを放出させるために、精製フィルター（図６９、７２）に３００μＬの溶出バッファーを流した。精製ＤＮＡの保留試料が必要な場合、必要に応じて、溶出液の一部を貯蔵チャンバーまたは貯蔵フィルター上へ移送することができる。
・均質化
バルブＶ６（図６９、４６）、およびＶ８（図６９、４７）を開き、駆動ラインＤＬ４（図６９、７１）に５ｐｓｉｇの圧力を６０秒間加えることにより、溶出液保留チャンバーの中へ空気圧で空気を移動させた。バルブＶ６（図６９、４６）、およびＶ８（図６９、４７）を閉じ、ＤＬ４（図６９、７１）を停止させた。溶出液保留チャンバーの中へ移動させた空気は、溶出液の中で泡を生成させ、溶出液の中のＤＮＡを攪拌し均質化した。
・溶出液計量
バルブＶ１０（図６９、４８）を開き、ＤＬ６（図６９、７３）に１ｐｓｉｇの圧力を４０秒間加えることにより、溶出液保留チャンバー（図６９、２５）からの溶出液を、溶出液計量チャンバー（図７０、８）の中に空気圧で移動させた。バルブＶ１０（図６９、４８）を閉じ、ＤＬ６（図６９、７３）を停止させた。各溶出液は計量チャンバーを充填し、排出膜で止まった。バルブＶ１０（図６９、４８）およびＶ１１（図７０、５０）を開き、駆動ラインＤＬ７（図７０、４９）に２ｐｓｉｇの圧力を２５秒間加えることにより、過剰の溶出液を溶出液保留チャンバーの中へ空気圧で戻した。バルブＶ１０（図６９、４８）およびＶ１１（図７０、５０）を閉じ、ＤＬ７（図７０、４９）を停止させた。
・ＰＣＲケーキの再構成
バルブＶ１１（図７０、５０）を開き、駆動ラインＤＬ７（図７１、４９）の駆動圧力を１５秒間で０〜１５ｐｓｉｇまで直線的に増加させることにより、溶出液計量チャンバー（図７０、８）からＰＣＲケーキの再構成および往復（reciprocation）チャンバー（図７０、６１０）へと溶出液を空気圧で移動させた。（図７０、６１０）の該チャンバーは、凍結乾燥ＰＣＲケーキを保持し、ＰＣＲケーキの再構成、およびＰＣＲ反応の往復混合を行うように設計されている。該チャンバーの体積は、溶出液計量チャンバー（図７０、８）で規定される溶出液の体積の約２．２バイである。ＰＣＲケーキは、該チャンバーの入口側に置かれおよび配置される。該チャンバーの出口はバルブで密閉されている。溶出液とバルブＶ１３（図７１、５２）との間の空気は、圧縮され、それにより溶出液が該チャンバーの中へ移動し、凍結乾燥ＰＣＲケーキと接触することが可能となる。ＤＬ７の圧力を１５ｐｓｉｇで６０秒間保持することにより、ケーキを再構成される。凍結乾燥ＰＣＲ反応混合物を含むケーキを再構成するために、１１．５μＬの計量された溶出液を移動させ、増幅用のＰＣＲ混合物を生成させる。
・ＰＣＲ溶液の往復混合―駆動ラインＤＬ７の圧力を１５秒間で１５から０ｐｓｉｇへと直線的に減少させることにより、ＰＣＲの再構成および往復チャンバー（図７０、１０）から溶出液計量チャンバー（図７０、８）へとＰＣＲ溶液（すなわち、溶出液で再構成されるＰＣＲケーキ）を戻す。溶出液とバルブＶ１３（図７１、５２）との間の空気は圧縮され、ＰＣＲ混合物を計量チャンバー（図７１、８）の方向に押し出し空気バネとして働く。駆動ラインＤＬ７の圧力を１５秒間で０から１５ｐｓｉｇまで直線的に増加させ、次いで１５秒間で１５から０ｐｓｉｇへと直線的に減少させることにより、ＰＣＲ混合物は往復混合される。バルブＶ１２（図７０、４９）を閉じ、駆動ラインＤＬ７（図７０、４９）を停止させた。
・熱サイクルチャンバーへの移動
バルブＶ１１（図７０、５０）、Ｖ１３（図７０、５２）、およびＶ１４（図７０、５３）を開き、駆動ラインＤＬ７（図７０、４９）に、０．２ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．４ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．６ｐｓｉｇで３０秒間へと駆動圧力を連続的に増加させることにより、溶出液計量チャンバー（図７０、８）から熱サイクルチャンバー（図７０、６２）へとＰＣＲ反応混合物を空気圧で移動させた。バルブＶ１２（図７０、５１）およびＶ１４（図７０、５３）を閉じ、ＤＬ７（図７０、４９）を停止させた。ＰＣＲ反応混合物を熱サイクルチャンバーの中で移動させ、待ち合わせ排出膜の位置で停止する。
・熱サイクル
熱サイクルチャンバー（図７０、６２）内で反応を繰り返すために、３１サイクルプロトコルを適用して、標識アンプリコンを生成させた。サイクル条件は以下の通りである：ホットスタートで９３℃×２０秒間、次に（９３℃×４秒間、５６℃×１５秒間、および７０℃×７秒間）を３１サイクル、次いで、７０℃×９０秒間の最終延長。
・ＰＣＲ生成物の計量
バルブＶ１１（図７０、５０）、Ｖ１３（図７０、５２）、Ｖ１４（図７０、５３）、およびＶ３０（図７１、１１１）を開き、駆動ラインＤＬ７（図７０、４９）に、０．２ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．４ｐｓｉｇで３０秒間、次いで０．６ｐｓｉｇで４５秒間へと連続的に増加させる連続駆動を適用することにより、熱サイクルチャンバー（図７０、６２）からＰＣＲ計量チャンバー（図７１、７４）へとＰＣＲ反応混合物を空気圧で移動させた。バルブＶ１１（図７０、５０）、Ｖ１３（図７０、５２）、Ｖ１４（図７０、５３）およびＶ３０（図７１、１１１）を閉じ、ＤＬ７（図７０、４９）を停止させた。ＰＣＲ生成物は計量チャンバーに流入し、排出膜の位置で止まる。
・ホルムアミド計量
駆動ラインＤＬ８（図７１、７５）に１ｐｓｉｇで５０秒間の圧力を加えることにより、ホルムアミド試薬チャンバー（図７１、６０）からホルムアミド計量チャンバー（図７１、７６）の中へ空気圧でホルムアミドを移動させた。駆動ラインＤＬ８（図７１、７５）を停止させた。この工程では、ケーキを再構成して対照試料を生成させるために、ホルムアミドの６番目の体積（図７１、７７）を計量した。ホルムアミドは計量チャンバーに流入し、排出膜の位置で止まる。バルブＶ１５（図７１、５４）を開き、駆動ラインＤＬ８（図７１、７５）に３ｐｓｉｇで１８０秒間圧力を加えることにより、ホルムアミドチャンバーから廃棄チャンバーの中へ過剰のホルムアミドを空気圧で移動させた。バルブＶ１５（図７１、５４）を閉じ、ＤＬ８（図７１、７５）を停止させた。試薬チャンバーと駆動ラインの過剰のホルムアミドはすべて廃棄チャンバーに移動させた。
・ＰＣＲ生成物とホルムアミドとの結合
バルブＶ１８（図７１、５７）、Ｖ１７（図７１、８０）およびＶ２０（図７１、８１）を開き、駆動ラインＤＬ９（図７１、７９）に、０．２、０．３、０．４、および０．５ｐｓｉｇを、それぞれ３０秒間という４段階的駆動プロファイルで圧力を加えることにより、ＰＣＲ計量チャンバー（図７１、７４）から結合チャンバー（図７１、７８）の中へ、計量されたＰＣＲ生成物を空気圧で移動させた。バルブＶ１８（図７１、５７）、Ｖ１７（図７１、８１）、およびＶ２０（図７１、８１）を閉じ、ＤＬ９（図７１、７９）を停止させた。ＤＬ８（図７１、７５）に、０．２、０．４、および０．６ｐｓｉｇが、それぞれ３０秒間、３０秒間および６０秒間と増加する圧力を加えることにより、ホルムアミド計量チャンバー（図７１、７６）から結合チャンバー（図７１、７８）の中へ計量されたホルムアミドを空気圧で移動させた。バルブＶ２０（図７１、８１）を閉じ、ＤＬ８（図７１、７５）を停止させた。結合チャンバーは、２つの別々の流れに由来する計量されたＰＣＲと計量されたホルムアミドとを結合して、分離および検出用の試料を調製する。
・ＩＬＳケーキの再構成
バルブＶ２０（図７１、８１）を開き、駆動ラインＤＬ８（図７１、７５）に、１５秒間をかけて０〜１５ｐｓｉｇまで直線的に駆動圧力を増加させることにより、結合チャンバー（図７１、７８）からＩＬＳケーキチャンバー（図７１、６３５）の中へ、分離および検出用の試料を空気圧で移動させた。試料とバルブＶ１２（図７１、８６）との間の空気は圧縮され、それにより、試料はチャンバーの中に移動し、凍結乾燥ＩＬＳケーキと接触する。ＤＬ８（図７１、７５）の圧力を１５ｐｓｉｇで６０秒間保持することにより、ケーキを再構成される。凍結乾燥内部レーン標準を含むケーキを再構成して分離および検出用の試料を生成させるために、１１．５μＬの計量された試料を移動させた。
・分離および検出用溶液の往復混合―駆動ラインＤＬ８（図７１、７５）の圧力を１５秒間で１５から０ｐｓｉｇへと直線的に減少させることにより、ＩＬＳの再構成および往復チャンバー（図７１、６３５）から結合チャンバー（図７１、７８）へとＰＣＲ溶液（すなわち、計量されたホルムアミドと計量されたＰＣＲ生成物で再構成されるＩＬＳケーキ）を戻す。溶出液とバルブＶ１３（図７１、５２）との間の空気は圧縮され、ＰＣＲ混合物をホルムアミド計量チャンバー（図７１、７６）の方向に押し出し空気バネとして働く。駆動ラインＤＬ８（図７１、７５）の圧力を１５秒間で０から１５ｐｓｉｇまで直線的に増加させ、次いで１５秒間で１５から０ｐｓｉｇへと直線的に減少させることにより、分離および検出用試料は往復混合される。バルブＶ１２（図７０、４９）を閉じ、駆動ラインＤＬ８（図７１、７５）を停止させた。
・分離流路への試料の注入
バルブＶ２１（図７１、８６）およびＶ２２（図７１、８７）を開き、駆動ラインＤＬ９（図７１、７９）に、０．４、０．６、１．０、１．５および２．０ｐｓｉｇが、それぞれ３０秒間、３０秒間、３０秒間、３０秒間、および３０秒間の連続する段階的なプロファイルの圧力を加えることにより、今は脱泡チャンバーとして機能するＩＬＳケーキチャンバー（図７１、６３５および６８２）を通って、カソードチャンバー（図７１、８４）および試料廃棄チャンバー（図７１、８５）を充填するように、結合チャンバー（図７１、７８）から５つの分離および検出用の試料を、およびホルムアミド計量チャンバー（図７１、７６）から対照試料を空気圧で移動させる。バルブＶ２１（図７１、８６）およびＶ２２（図７１、８７）を閉じ、ＤＬ８（図７１、７４）を停止させた。カソード（図５５および５６、６３）とアノード（図５５および５６、６４）に４４００Ｖの電圧を３５秒印加することにより、試料内のＤＮＡをカソードチャンバー（図７１、８４）からバイオチップの分離部（図５５および図５６、８８）に注入させた。
・ＤＮＡの分離および検出
バルブＶ２５（図７１、９１）、Ｖ２４（図７１、９０）、Ｖ２６（図７１、９５）、Ｖ２７（図７１、９６）、およびＶ２８（図７１、９７）を開き、駆動ラインＤＬ１０（図７１、９８）に２ｐｓｉｇの圧力を２４０秒間加えることにより、ＴＴＥ試薬槽（図７１、５９）からＴＴＥを空気圧で移動させ、カソード（図７１、８４）を充填させ、およびＴＴＥ廃棄チャンバー（図７１、９２、９３、および１３）を充填させた。バルブＶ２５（図７１、９１）、Ｖ２４（図７１、９０）、Ｖ２６（図７１、９５）、Ｖ２７（図７１、９６）、およびＶ２８（図７１、９７）を閉じ、ＤＬ１０（図７１、９８）を停止させた。カソードを通過するＴＴＥの流れは、カソード内の試料を置換した。カソード（図５５および５６、６３）とアノード（図５５および５６、６４）に６４００Ｖの電圧を３０分印加すると、Ｓ＆Ｄバイオチップ（図５５）の分離部に注入されたＤＮＡは、バイオチップの分離部を下方に移動する。光学システムも作動させて、励起および検出窓において、レーザー誘導蛍光励起および検出を行った。レーザーは２００ｍＷであり、データ収集速度は５Ｈｚで行った。蛍光信号は、検出経路を通って光電子増倍管に到達する。そこで、蛍光は信号に変換され、該信号はシステムソフトウェアにより記録される。

【0168】

上述の設定された処理工程に基づいて試料および対照の電気泳動図が作成される。試料挿入から電気泳動図作成までの全プロセスに要した時間は約９０分であり、および約２１５の設定処理工程であった。多くの処理工程が短縮可能であり、必要であれば、プロセスは４５分未満で実行できる。図７７は、プロセスの一部について、設定された処理工程と結果の処理工程の関係を占めいている。溶出液を、溶出液保留チャンバー（図３９、２５）から空気圧で移動させ、結果として、図７７の１０工程スクリプトにより、計量された体積を溶出液計量チャンバー（図３９、８）の中へ移動させた。５つのバルブおよび駆動ライン状態から成るスクリプトの工程は、保留チャンバーから計量チャンバーへ溶出液を移動させるために変化する。次の５つのスクリプト工程は、過剰の溶出液を除去し、この過剰の体積を保留チャンバーの中へ押し込む。したがって、１０の設定された処理工程（バルブと駆動ラインへの圧力を増加させるまたは減少させる）は、２つの結果の処理工程（溶出液保留チャンバーから溶出液計量チャンバーへの移動および過剰の試料を溶出液保留チャンバーに戻す移動）に対応する。

【0169】

実施例７．核酸定量に対する要求をなくすための試料分割
所定試料中の核酸の量は、法医学的試料、臨床試料、またはバイオ脅威試料であれ、非常に幅広い。特定の核酸操作では、有効であるために、反応条件は特定の範囲の投入核酸が必要とする。実験チャンバーでは、所定の操作の前に核酸定量を行うことでこの問題をよく解決している。核酸定量は、名称が「法医学的ＤＮＡ定量の改良方法」である特許出願番号１２／８１６，３７０に記載されているように、マイクロ流体用途に対して開発されており、出典明示によりその内容は本明細書に組み入れられる。

【0170】

本発明は、マイクロ流体バイオチップにおいて特定範囲の核酸を得るという問題に対する別の解決策を提案する。このアプローチは定量化を含むものではなく、その代わり、好ましくは並行して、所定試料を１倍または複数倍に希釈して、分析用に２つまたはそれより多数の核酸濃度を提供することに基づくものである。本発明の例示として、接触試料（touch sample）がある。接触試料は、人体への接触により表面に残された細胞（主として上皮）から成る法医学的試料である。それらは、指紋、衣服（例えばシャツの襟）に検出される皮膚細胞、およびソーダ缶の開放部または飲用コップの縁に検出される口の上皮細胞を含む。接触ＤＮＡ試料から回収されるＤＮＡの量は、非常に幅広い。接触試料は、１００ｎｇまでのＤＮＡを含み、ほとんどの接触試料は０．５〜１０ｎｇのＤＮＡを含む。したがって、接触試料システムは、０．５〜１００ｎｇのＤＮＡを含むスワブを処理するであろう。

【0171】

ほとんどの接触試料は、１０ｎｇ未満のＤＮＡを含むであろうから、最大で２００倍の範囲のＤＮＡが正確に処理されなくてはならないということを予想して、未知接触試料が処理されなくてはならない。手作業による増幅システムでは、０．５ｎｇを増幅することは適切であるが、１００ｎｇを増幅することは適切ではない。したがって、手作業のシステムでは、接触試料から精製されたＤＮＡは、増幅前に一般的に定量される。本発明のマイクロ流体バイオチップは、流体サブアセンブリー内の２つのアリコートの中に精製されたＤＮＡを分割することにより、定量することなく接触試料ＤＮＡの処理がなされる。溶出ＤＮＡの１つのアリコートはそのまま増幅され（増幅混合物中に１０ｎｇ未満のＤＮＡが存在すると仮定して）、別のアリコートは２０倍に希釈される（反応混合物中に５〜１００ｎｇのＤＮＡが存在すると仮定して）。そのままのアリコートと希釈されたアリコートの両方は、別々に増幅され、分離され、および検出されるが、それらは並行して行われる。そのままの試料は精製ＤＮＡの少なくとも０．０５〜１０ｎｇの範囲で効率的に増幅され、希釈された試料は精製ＤＮＡの少なくとも１〜２００ｎｇの範囲で効率的に増幅される；効果的に分析されるＤＮＡ含量の全範囲は、少なくとも４０，０００倍にまで拡大する。

【0172】

試料分割マイクロ流体工学は、実施例５および６のバイオチップの中に、以下の方法で組み入れられる。同じＤＮＡ精製プロトコルを用いてＤＮＡは、体積２０μＬに希釈される。この体積で、溶出液保留チャンバーはマクロ流体処理サブシステムから除去され、２０μＬ溶出液保留チャンバーは流体サブアセンブリーの流体プレートの上に置かれる。そのプレート上で、２０μＬの精製ＤＮＡは、並行経路に送られる：
・そのままの経路では、計量チャンバーで１２μＬのＤＮＡが計量され、ＰＣＲケーキ再構成チャンバーに送られ、そして増幅のためにＰＣＲチャンバーに送られる。約１０μＬの再構成反応混合物を受け入れるため、チャンバーは少しだけ拡張される。
・希釈経路では、約２μＬのＤＮＡが計量され、３８μＬの計量された溶出液と結合される。その希釈された溶液は、次にケーキ再構成チャンバーに送られ、そして増幅のためにＰＣＲチャンバーに送られる。
・増幅後、２つの溶液は並行して分離および検出のため処理される。

【0173】

試料の分割と希釈のマイクロ流体回路のフローチャートを図７８に示す。必要に応じて、以降の処理のために精製ＤＮＡ試料を２つより多いアリコートに分割することもでき、および希釈された試料をさらに希釈して、処理のための追加のアリコートを得ることができる。接触試料の場合、その希釈は必要ではないが、特定の法医学的、臨床的、診断、および生物脅威の試料はより多くのＤＮＡを含んでもよく、３またはそれより多いアリコートの処理によりそれらの分析が容易になる。

【0174】

実施例８．プラスチックのバックグラウンド蛍光
分離および検出バイオチップは、熱可塑性物質で製造される。熱可塑性ポリマーはレーザー励起に曝されると、自己蛍光を発生させ、それはバックグラウンドノイズとなり、検出システムにより検出されおよび処理される。この自己蛍光は本当の信号ピークのＳＮ比を低下させて、システムの検出限界を高くする。分離および検出用の従来のＳ＆Ｄバイオチップは、ガラス基材または石英基材で製造され、それらはプラスチック基材と比較して単位厚さ当たりの自己蛍光が少ない。プラスチック基材を用いてレーザー誘導蛍光検出を実施する場合についていくつかの検討がなされる必要がある：
（１）低い自己蛍光を示すプラスチック材料の選択
環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）および環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）の熱可塑性材料が、実施例５および６で使用される分離および検出バイオチップを製造するために使用される。これらの熱可塑性物質は、他のポリマーに比べ、可視波長域において、自己蛍光が本質的に低い。
（２）レーザーにより励起あされるプラスチック基材の厚さを薄くする。
使用される材料の厚さは、３５０ｐｓｉｇを超えるゲル充填圧力に耐えうる構造物の能力により制限される。実施例５および６で使用されたバイオチップは、厚さ１８８ミクロンの熱可塑性シートに流路特徴を型押しし、次いで流路を覆うように別の厚さ１８８ミクロンの熱可塑性シートを結合させて製造される。いくつかの基材（プラスチック１８８ｍｍ、プラスチック３７６ｍｍ、ホウケイ酸ガラス０．７ｍｍ、およびホウケイ酸ガラス１．４ｍｍ）をジーンベンチ光学検出機器の分離および検出窓の上に配置することにより、ガラス基材とプラスチック基材のバックグラウンド蛍光を測定する実験が実施された（２００９/００２０４２７として公開され、名称が「プラスチック製マイクロ流体分離および検出プラットホーム」である出願番号１２/０８０，７４５を一般的には参照）。２００ｍＷのレーザー励起を基材に照射し、振動を収集した。図７９は、低蛍光プラスチック（厚さ１８８ミクロンおよび３７６ミクロン）およびホウケイ酸ガラス（厚さ０．７ｍｍおよび１．４ｍｍ）のバックグラウンド蛍光を示す。データは、プラスチック薄膜のバックグラウンド蛍光が、厚さ０．７ｍｍおよび１．４ｍｍのホウケイ酸ガラスのそれよりも４〜７倍も低いことを示している。
（３）バックグラウンド発光低減のためにフィルターを組み入れる。
バックグラウンド蛍光は一般的に低いが、プラスチックは、約５６９ｎｍに高い自己蛍光を示す。この発光ピークは、プラスチックが４８８ｎｍレーザーで励起される時に生成するラマン蛍光によるものである。そのピークのスペクトルは、約５６９ｎｍを中心にして全幅が５ｎｍである。中心波長が約５７０ｎｍで、約５〜１０ｎｍの間の阻止バンドを有するノッチフィルタ−を用いることによりラマン蛍光を除去できる。ラマンプラスチック蛍光除去のためのノッチフィルターを用いたＳＮ比向上を評価する実験を行った。分離および検出を３回行う一連の実験をノッチフィルターなしで行い、ＰＭＴボックスへの入口に取り付けたノッチフィルターを用いた別の一連の実験を行った。図８０は、データ結果を示している。データは、フィルターが、黄色チャンネルのピーク間ノイズを６７から３９相対蛍光単位（ｒｆｕ）へと減少させたことを示している。フィルターは、絶対信号強度も１５２０から１２３６ｒｆｕへと減少させ、ＳＮ比も全体として２３から３２２に向上させた。検出限界が特に重要であるような状況においては（例えば、法医学的接触試料の分析、および病原菌数が少ない所定の病気の初期における感染物質の診断）、統合または未統合の機器の両方の光学システムにおいて、ノッチフィルターは有効である。

【0175】

実施例９．自動化スクリプトを用いて、臨床全血試料から核酸を精製し、精製ＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡをサンガー配列し、配列ＤＮＡを限外濾過し、限外濾過されたＤＮＡを分離し、および多重ＤＮＡ配列を精製させる、完全に統合されたバイオチップの設計
ぶどう状球菌、連鎖球菌およびエルシニアエンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）のような病原菌は血液の細胞外成分の中に存在する場合がある。２つの血液試料を受け入れ、所定の病原菌の８個の遺伝子座（loci）からＤＮＡ配列を生成させる、固定型で単一構造のプラスチック製バイオチップは、空気圧―バルブ―流体のスタック、マクロ流体処理サブアセンブリー、並びに分離および検出サブアセンブリーから成る。バイオチップは実施例６の射出成形バイオチップに似ており、以下に記載されたように改良され、自動化スクリプトに基づき、以下のように処理が実施される：

【0176】

マクロ流体サブアセンブリーは、前投入された試薬を保持し、またはＤＮＡ精製処理の間、保留チャンバー/反応チャンバーとして働く、１２チャンバーから構成されている。１チャンバーは血液収集チューブを受け入れるために使用され；６チャンバーは、３ｍＬの洗浄液、１００μＬの細胞懸濁溶液、４５０μＬの分解溶液、５５０μＬの無水エタノール、２μＬの洗浄バッファー、２０００μＬの脱イオン水、および４００μＬの溶出バッファーを予め充填されている。

【0177】

バイオチップセットは、標準３ｃｃ バキュテナー（vacutainer）チューブ（分離実験のため、適切な抗凝固剤を含むチューブの中に血液は収集される）を受け入れる。血液収集チューブは、ゴム製の栓をした端部を下にしてバイオチップの中に挿入される。ユーザーが機器のスタートボタンを押すと精製処理が開始される。機器の中では、血液収集チューブは、血液収集チューブ用の窪みの基部に配置された２つの中空ピンの上に押し付けられる。中空ピンはゴム栓を突き抜け、血液収集チューブには空気圧で５ｐｓｉｇまでの圧力が加えられ、血液収集チューブから血液が、平均ポアサイズが８ミクロンのフィルター（例えばロイコソルブビーメディア（Leukosorb B media）、パールコーポレイション、ポートワシントン、ニューヨーク）を通って移動し、血液から白血球が除去される。貫流（Flowthrough）は、０．２ミクロンのポリカーボネートのトラックエッチ（track-etch）膜（SPI-Pore登録商標、トラックエッチ膜、ストラクチャープローブ社、ウエストチェスター、ＰＡ）の単一層を通過し、膜上で捕獲してバクテリアを濃縮し、そしてこの貫流は廃棄チャンバーに送られる。

【0178】

再懸濁液（１００μＬ）をトラックエッチ膜の表面に適用し、トラックエッチ膜上に保持された病原菌を再懸濁し、濃縮病原菌懸濁液（残留白血球も含む）を生成させる。この懸濁液を分解チャンバーに空気圧で移動させる。ＤＮＡ精製は、実施例５および６に記載したように行い、すべての体積は比例して少ない。無秩序分解試薬が分解チャンバーの中に送られ、そして空気圧で空気が分解／廃棄チャンバーの中に送りこまれ、溶解物の無秩序バブリングが行われる。エタノール槽からのエタノールは、分解／廃棄チャンバーに送られ、無秩序バブリングにより混合される。溶解物／エタノール混合物は、保留チャンバーへ空気圧で送られ、精製膜を通過して分解／廃棄チャンバーに送られる。膜には一連の３回の洗浄が行われ、未結合材料および残留分解溶液が除去される。フィルターは次いで空気乾燥される。溶出溶液２０．５μＬが、溶出液槽から、精製膜を通過して、溶出液保留槽に空気圧で送られる。これは小体積であるので、確実に、単離された核酸の大部分が、次の増幅反応で増幅される。

【0179】

溶出液は、溶出液保留チャンバーから溶出液計量チャンバーに空気圧で送られ、過剰の溶出液は溶出液保留チャンバーの中へ空気圧で戻される。溶出液は、溶出液計量チャンバーからＰＣＲケーキチャンバーの中へ空気圧で送られる。２０．５μＬの計量された溶出液が、凍結ＰＣＲ反応混合物を含むケーキを再構成するために送られ、増幅用のＰＣＲ混合物を生成させる。ケーキは、ヒトＳＴＲプライマー対（各対の１つは蛍光標識されている）が一連の８０プライマー対（各対のいずれも標識されていない）で置換される以外は、図５および６と同じ成分を含む。その８０プライマー対は、ぶどう状球菌、連鎖球菌およびエルシニアエンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）を含む１０個の病原菌のそれぞれの８個の特定の遺伝子座を表す（必要に応じてさらに大きな遺伝子座も可能である）。再構成されたＰＣＲ反応混合物は、ケーキチャンバーから熱サイクルチャンバーの中に空気圧で送られ、待ち合わせ排出膜の位置で停止する。熱サイクルチャンバー内での反応を繰り返すために、３１サイクル増幅プロトコルが適用される。すべての設定および処理工程は、実施例５および６に記載されているのと同様の方法で実質的に実施される。

【0180】

ＰＣＲ生成物は、熱サイクルチャンバーからＰＣＲ計量チャンバーへ空気圧で送られ、排出膜で停止する。結合チャンバーの中で、６μＬのＰＣＲ生成物が９４μＬの脱イオン水と混合される。結合チャンバーでは、計量されたＰＣＲと計量された水（２つの別々の流れに由来する）が結合され、凍結乾燥された配列ケーキの再構成用試料を形成する。希釈されたＰＣＲ生成物は、結合チャンバーから送られて８個の計量チャンバーに分割され、各チャンバーは１１μＬを収容し、排出膜により待たされる。８個の試料のそれぞれは、配列ケーキ再構成チャンバーに送られる。８個のケーキは、サンガー反応混合物とはわずかに異なる種類であり（各伸長生成物が、配列のその位置における塩基に対応する単一の蛍光標識を有するように、色素標識ターミネーターの使用に基づき）、各ケーキは固有の一連の１０個の配列プライマー ―対象とする１０個の病原菌のそれぞれの遺伝子座の一つである― を含んでいる。所定の病原菌では、特定の遺伝子座の１つのプライマー対は、ケーキ１の中にあり、第２の対はケーキ２の中にある等；この配置により、単一のＤＮＡ配列が各ケーキから所定の病原菌を確実に生成させる。再構成された配列の反応混合物は、ケーキチャンバーから連続サイクル用サイクリングチャンバー（第２の熱循環器のすぐ上に位置する）の中へ空気圧で送られ、待ち合わせ用排出膜の位置で停止する；各サイクルチャンバーは１０μＬを収容する。連続サイクルは、以下のように実施される：９５℃で１５秒間、次に（９５℃で５秒間、５０℃で１０秒間、および６０℃で２５秒間）を３０サイクル。８個の連続反応（２つの血液試料では全体で１６個）のそれぞれにおいて、限外濾過の調製時に結合チャンバーの中で、１０μＬの連続反応生成物を１００μＬの脱イオン水と混合する。

【0181】

配列生成物を精製して、分離を妨害する、配列決定（および前のＰＣＲ反応）に必要なイオンを除去することで、電気泳動分離の特性を大きく向上させることができる。限外濾過を含む様々な方法を用いることができ、該限外濾過では、小さなイオン／プライマー／取り込まれなかった標識色素は、フィルターへ送られ、必要な生成物はフィルターに残され、次いで該必要な生成物は溶出され、すぐに分離および検出に供される。限外濾過媒体は、トラック―エッチ膜だけでなく、ポリエーテルスルホンおよび再生セルロース“織物”フィルターを含み、それらにおいては、非常に薄い（１〜１０μｍ）膜の中に非常に均一な大きさのポアが形成されている。後者は、表面よりはいくらか深い所で生成物を捕獲するというよりは、フィルターの表面のポアの大きさよりも大きい生成物を収集できるという利点を有する。

【0182】

したがって、希釈された配列生成物は、限外濾過フィルターを通過して送られた。フィルターはサンガー配列生成物は捕獲するが、イオンおよび希釈された配列バッファーは通過させる。フィルター上の材料は、２００μＬの脱イオン水を空気圧でフィルターに送ることによりイオンとバッファーを除去することにより洗浄された。最後に、１０μＬの脱イオン水をフィルターチャンバーに空気圧で送り込むことにより、洗浄されたサンガー配列生成物を溶出させ、サンガー配列生成物を再懸濁させた。次いで溶出液を結合チャンバーに空気圧で送り込む。ホルムアミド試薬チャンバーからホルムアミド計量チャンバーの中にホルムアミドを空気圧で送り込む。ホルムアミドは計量チャンバーに流れ込み、排出膜で停止する。過剰のホルムアミドは、ホルムアミドチャンバーから廃棄チャンバーに空気圧で送られる。１０μＬの計量された限外濾過生成物は、計量チャンバーから結合チャンバーの中に空気圧で送られる。計量されたホルムアミドは、ホルムアミド計量チャンバーから結合チャンバーに空気圧で送り込まれる。計量チャンバーでは、計量された限外濾過生成物と計量されたホルムアミド（それらは別々の流れに由来する）を結合させて、分離および検出用の試料を調製する。バイオチップを６０℃に加熱する以外は、実施例５および６に記載した同様に電気泳動は実施される。注入電圧および時間、分離電圧および時間は、実施例５および６のものと同じである。２つの血液試料は、それらが分離および検出用の１６個の生成物流路を生成するように処理される。一般に、試料当たりの分離流路の数は、評価を行う病原菌の１つに対してデータが取得される、遺伝子座およびプライマー対の最大数と同じである。

【0183】

光学システムを作動させて、レーザー誘起蛍光励起および検出を行う。レーザーは２００ｍＷに設定され、データ収集速度は５Ｈｚで行われる。色補正の後で、自動化されたベースコール（basecaller）は、レーンから配列を生成させるが、該レーンは、増幅と配列プライマー（sequencing primer）が、それぞれ増幅ケーキおよび配列ケーキに組み入れられた、１０個の病原菌の１つを含む。約５００ｂｐの配列物が、レーン当たり生成する。

【0184】

臨床試料のタイプや同定されるべき病原菌に応じて、バイオチップを多くの方法で変更できる。例えば、野兎病（Francisella tularenis）やクラミジアトラコマチス（Chlamydia trachomastis）等の特定のバクテリアはかれらのライフサイクルの大部分を哺乳類の細胞で過ごす。いくつかは真正細胞内生物であり他は細胞内であってもよい。血液中のそのような細胞内バクテリアのためのＤＮＡ精製処理は、大きな点を除いて上記と同じである。全血液を細胞分離フィルターの上に載せ、フィルターを通すと、フィルターに捕獲された白血球は対象とするＤＮＡを含んでいる。フィルターを洗浄し、１００μＬに再懸濁させ、実施例１に記載されたグアニジン系精製を行い、対応還元は試薬体積で行う。

【0185】

必要に応じて、白血球の溶解を最初に行うように（例えば浸透圧的に）、装置を設計することもでき、それにより、バクテリアに比較して哺乳類の細胞の溶解を比較的簡単にできるという利点がある。この設定では、完全な細胞内バクテリアが放出され、細胞抽出物は、バクテリア捕獲フィルターを通過し、洗浄される。バクテリアのＤＮＡは、次いで上記のように精製される。同様に、全血液を細胞分離なしで溶解させることができるので、細胞外バクテリアまたは細胞内バクテリアまたはウィルス性ＤＮＡを精製できる。

【0186】

本発明のいくつかの実施形態について記載したが、図示および記載されたそれらの詳細については、本発明の範囲から逸脱しない範囲内で様々な変更が可能であることは当業者には明らかであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図78】

【図79】

【図80】