特許 6699013 ＷＴ１由来ペプチド認識抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6699013

(24)【登録日】2020年5月7日

(45)【発行日】2020年5月27日

(54)【発明の名称】ＷＴ１由来ペプチド認識抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20200518BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200518BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20200518BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20200518BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20200518BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200518BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20200518BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200518BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200518BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200518BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200518BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/30ZNA

   C12N5/10

   C12N15/13

   C12P21/08

   C07K16/28

   A61K39/395 T

   A61K35/12

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   A61P35/00

【請求項の数】16

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-250957(P2015-250957)

(22)【出願日】2015年12月24日

(65)【公開番号】特開2016-204358(P2016-204358A)

(43)【公開日】2016年12月8日

【審査請求日】2018年12月13日

(31)【優先権主張番号】特願2014-261852(P2014-261852)

(32)【優先日】2014年12月25日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2015-108966(P2015-108966)

(32)【優先日】2015年5月28日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年６月３０日発行の第１８回日本がん免疫学会総会プログラムで発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年７月３１日に愛媛県松山市で開催された第１８回日本がん免疫学会総会で発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年７月１４日に発行された第２０回日本遺伝子治療学会学術集会プログラム抄録集で発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年８月８日に東京で開催された第２０回日本遺伝子治療学会学術集会で発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年９月１９日に発行された第７３回日本癌学会学術総会抄録集で発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年９月２５日に横浜で開催された第７３回日本癌学会学術総会で発表

(73)【特許権者】

【識別番号】304026696

【氏名又は名称】国立大学法人三重大学

(73)【特許権者】

【識別番号】302019245

【氏名又は名称】タカラバイオ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】珠玖 洋

(72)【発明者】

【氏名】赤堀 泰

(72)【発明者】

【氏名】米山 元裕

(72)【発明者】

【氏名】天石 泰典

(72)【発明者】

【氏名】岡本 幸子

(72)【発明者】

【氏名】峰野 純一

【審査官】 鈴木 優志

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５１２８１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０６３９０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／０４５０２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 岡ら，日本臨床免疫学会会誌，２００８年，Vol.31, No.5，p.375-382

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／１３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖からなる抗ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体抗体又はその抗原結合性フラグメント。

【請求項2】

配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含む重鎖及び配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖からなる、請求項１記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。

【請求項3】

ＷＴ１ペプチドが配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１又は２記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。

【請求項4】

抗体の抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメント。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸。

【請求項6】

配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列及び配列番号７に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む請求項５記載の核酸。

【請求項7】

請求項５又は６記載の核酸を含むベクター。

【請求項8】

請求項５又は６記載の核酸又は請求項７のベクターを発現させる工程を含む、抗ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体抗体又はその抗原結合性フラグメントの製造方法。

【請求項9】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む組成物。

【請求項10】

請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントとシグナル伝達タンパク質の細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体。

【請求項11】

シグナル伝達タンパク質がＣＤ３ζ鎖である請求項１０記載のキメラ抗原受容体。

【請求項12】

さらにＣＤ２８の細胞内ドメインを含む請求項１１記載のキメラ抗原受容体。

【請求項13】

請求項１０〜１２のいずれか１項記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。

【請求項14】

請求項１３に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクター。

【請求項15】

請求項１０〜１２のいずれか１項記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。

【請求項16】

請求項１５記載の細胞を有効成分として含有する医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を特異的に認識する抗体又はその抗原結合性フラグメント、抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする核酸、この核酸を含むベクター、抗体又はその抗原結合性フラグメントの製造方法、抗体又はその抗原結合性フラグメントを含むキメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体をコードする核酸、この核酸を含むベクター、キメラ抗原受容体を発現する細胞及びこれらを含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ＷＴ１遺伝子は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍の原因遺伝子の１つとして単離された遺伝子（非特許文献１）に由来し、成長因子遺伝子（ＰＤＧＦα鎖、ＣＳＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ）、成長因子レセプター遺伝子（ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ）や、その他の遺伝子（ＲＡＲ−α、Ｃ−ｍｙｂ、Ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｌ−２、オルニチン脱炭酸酵素、Ｎ−ｍｙｃ）の転写を抑制する。一方、ＷＴ１遺伝子は、ＲｂＡｐ４６、Ｄａｘ−１、ｂｃｌ−２遺伝子の転写を促進することが知られている。ＷＴ１遺伝子は、白血病や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現していると言われている（特許文献１）。これらの疾患においては腫瘍発生に関与し、固形癌や造血器腫瘍の発症や進展に重要な役割を果たしているとされている。

【0003】

造血器腫瘍等を有する患者において、ＷＴ１由来のタンパク質に対する液性免疫反応及びＣＤ８陽性Ｔ細胞による細胞性免疫反応が自然に誘導されることが知られている。また、ＷＴ１からＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する複数の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープペプチドが同定されている。例えば、ヒト白血球型抗原ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性の１２６−１３４ペプチド、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性の２３５−２４３ペプチドなどが報告されている。これらペプチドを認識するＣＴＬは、ＷＴ１抗原を発現する腫瘍細胞をＨＬＡ拘束性に傷害することが報告されている。ＷＴ１遺伝子は正常造血幹細胞を除く正常細胞での発現は極めて低レベルであるが、正常造血幹細胞には腫瘍細胞と同等の発現があるとされている。しかし、ＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬを用いたヒトｉｎ ｖｉｔｒｏコロニー形成能阻害実験や、マウスにおけるＷＴ１ペプチドワクチンによるｉｎ ｖｉｖｏ実験においては、正常造血幹細胞への傷害性はみられていない（非特許文献２）。

【0004】

現在、様々な腫瘍細胞の表面に発現している腫瘍抗原が多数見出され、それぞれの腫瘍細胞や正常組織での発現強度が報告されている。これらの腫瘍抗原を標的とする細胞性免疫又は液性免疫に基づく治療が研究されているが、腫瘍と腫瘍抗原は多種多様であり、それぞれの腫瘍の治療に適切な腫瘍抗原の選択と選択した腫瘍抗原に基づく治療戦略を見出すべく試行錯誤が続けられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許第７６９６１８０号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】モレキュラー セル バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１１巻、第１７０７頁（１９９１）

【非特許文献2】ジャパニーズ ジャーナル オブ クリニカル オンコロジー（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．）、第４０巻、第３７７−３８７頁（２０１０）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を特異的に認識する抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を特異的に認識する抗体又はその抗原結合性フラグメントを見出し、本発明を完成させた。

【0009】

すなわち本発明を概説すれば、
［１］配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖からなる抗ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体抗体又はその抗原結合性フラグメント、
［２］配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含む重鎖及び配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖からなる、［１］記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント、
［３］ＷＴ１ペプチドが配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、［１］又は［２］記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント、
［４］抗体の抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメント、
［５］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸、
［６］配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列及び配列番号７に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む［５］記載の核酸、
［７］［５］又は［６］記載の核酸を含むベクター、
［８］［５］又は［６］記載の核酸又は［７］のベクターを発現させる工程を含む、抗ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体抗体又はその抗原結合性フラグメントの製造方法、
［９］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む組成物、
［１０］［１］〜［４］のいずれか１項記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントとシグナル伝達タンパク質の細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体、
［１１］シグナル伝達タンパク質がＣＤ３ζ鎖である［１０］記載のキメラ抗原受容体、
［１２］さらにＣＤ２８の細胞内ドメインを含む［１１］記載のキメラ抗原受容体、
［１３］［１０］〜［１２］のいずれか１項記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸、
［１４］［１３］に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクター、
［１５］［１０］〜［１２］のいずれか１項記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞、
［１６］［１５］記載の細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
に関する。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を特異的に認識する抗体又はその抗原結合性フラグメント、抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする核酸、この核酸を含むベクター、抗体又はその抗原結合性フラグメントの製造方法、抗体又はその抗原結合性フラグメントを含むキメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体をコードする核酸、この核酸を含むベクター、キメラ抗原受容体を発現する細胞及びこれらを含む組成物が提供される。ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を特異的に認識する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、細胞医療、遺伝子治療の分野で使用することができ、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を発現する腫瘍細胞の検出、治療及びそのための研究、試験に極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の抗体フラグメントの特異性を示す図である。

【図2】本発明の抗体フラグメントの結合特性を示す図である。

【図3】本発明の抗体フラグメントの結合特性の解析結果示す図である。

【図4】ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を提示する細胞と本発明の抗体フラグメントとの結合を示す図である。

【図5】ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を提示する細胞と本発明の抗体フラグメントとの結合を示す図である。

【図6】ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を提示する細胞と本発明の抗体フラグメントとの結合を示す図である。

【図7】本発明のキメラ抗原受容体の細胞表面発現を示す図である。

【図8】本発明のキメラ抗原受容体により産生されるサイトカインを示す図である。

【図9】本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞の細胞傷害活性を示す図である。

【図10】本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞の生体での効果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本明細書において「ＷＴ１」とは、前記の通りＷｉｌｍｓ腫瘍の原因遺伝子の１つとして単離された遺伝子がコードするタンパク質である。アミノ酸配列はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００３６９．３に、塩基配列はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿０００３７８．４に記載される。細胞におけるＷＴ１の発現は、例えば特許文献１に記載される方法で定量することができる。

【0013】

本明細書において「抗体」は、免疫系の抗原結合性タンパク質を指す。抗原結合性領域を有する完全長の天然に存在する抗体は、ジスルフィド結合により相互に連結された２つの重鎖（Ｈ鎖）及び２つの軽鎖（Ｌ鎖）を含む糖タンパク質である。各重鎖には、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）が含まれる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖には、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）が含まれる。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインから構成される。ＶＨ及びＶＬの領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）という超可変性を有する領域及びフレームワーク領域（ＦＲ）というある程度保存されている領域に細分することができる。ＶＨ及びＶＬではアミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲが、それぞれ配列されている。抗原との結合はＣＤＲ３が重要であることが知られている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。

【0014】

本明細書において「ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ：ヒト白血球型抗原）」とは、ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を意味し、免疫細胞への抗原提示に必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を指す。ＨＬＡはクラスＩおよびクラスＩＩに分類することができる。クラスＩ ＨＬＡは、α鎖とβ２−ミクログロブリンから構成される。クラスＩ ＨＬＡは、ほとんどすべての有核細胞により発現され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞への抗原提示において機能することが示されている。クラスＩ ＨＬＡは、さらにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃに分類することができる。

【0015】

本明細書において「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、抗原に結合する細胞外ドメイン、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質をいう。「キメラ受容体」、「Ｔ−ｂｏｄｙ」、「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることがある。「抗原に結合する細胞外ドメイン」は、ある抗原に結合することができる任意のオリゴ又はポリペプチドを示し、「細胞内ドメイン」は細胞内で生物学的プロセスの活性化又は阻害をもたらすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。

【0016】

本明細書において「抗原結合性フラグメント」は、抗原に結合し、抗原に対する特異性を抗体に付与する抗体の一部の領域、部分又はタンパク質の断片である。

【0017】

以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメント及びこれらをコードする核酸
本発明の抗ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体抗体は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性であるＷＴ１の２３５−２４３ペプチド（ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ：配列番号１；以下、ＷＴ１ペプチドと記載する）と、ＨＬＡ−Ａ２４からなる複合体を特異的に認識し結合する抗体である。ここで、ＨＬＡ−Ａ２４は、ＨＬＡ−Ａ２４α鎖（配列番号２）及びβ２−ミクログロブリン（配列番号３）から構成される。本発明の抗体は、単独で存在するＷＴ１ペプチド又はＨＬＡ−Ａ２４に比べて、これらの複合体をより特異的に認識する。さらに、本発明の抗体は、ＷＴ１ペプチド以外のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４の複合体及びＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４以外のＨＬＡの複合体と結合しない、又は結合活性が低い。従って、本発明の抗体は、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を特異的に検出又は標的化することができる。

【0018】

本発明の抗体は、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖からなる。

【0019】

本発明の一態様として、本発明の抗体は配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含む重鎖及び配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖からなる。ＶＨのアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号４に示され、ＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号５に示される。さらに、前記の重鎖可変領域ならびに軽鎖可変領域のアミノ酸配列のうちの相補性決定領域以外の配列が他のアミノ酸配列、例えばヒト又は他の動物に由来する抗体のフレームワークのアミノ酸配列に置換された抗体も本発明に包含される。

【0020】

本発明の一態様として、本発明は抗ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体抗体の抗原結合性フラグメントを含む。抗体には、抗原に特異的に結合する１又はそれ以上のフラグメントが含まれる。抗体の抗原結合領域を含む抗体のフラグメントは完全長抗体と同様に抗原を特異的に認識することが示されている。本発明の抗原結合性フラグメントに含まれる抗体の断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ＦａｂはＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価の抗体フラグメントである。Ｆａｂ’はＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ部から構成される一価の抗体フラグメントである。Ｆ（ａｂ’）_２はヒンジ部のジスルフィド結合により結合した二つのＦａｂ断片を含む二価の抗体フラグメントである。Ｆｖは抗体の単腕のＶＬ及びＶＨから構成される一価の抗体フラグメントである。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされており、遺伝子組換技術によりこれらのドメインをリンカーで連結して１分子のタンパク質であるｓｃＦｖを作製することができる。ｓｃＦｖはＶＨ及びＶＬの間にリンカーを追加的に含む。前記リンカーはＶＨ及びＶＬを人為的に連結し、ｓｃＦｖ抗体の抗原結合能を安定化するために当業界で通常利用されるペプチドである（参照文献：例えば、ＧＳリンカーは Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２０３：４６−８８（１９９１）、ＥＫリンカーは Ｗｈｉｔｌｏｗ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， ６：９８９（１９９３））。前記リンカーは一般にグリシン及びセリンを含み、その長さは１５〜１８アミノ酸である。

【0021】

本発明の一態様として、本発明は抗原結合性フラグメントの組合せを含む。このような分子は、Ｆａｂ_３、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ、ｉｎｔａｃｔ−ＩｇＧが例示され、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、第９号、ｐ．１１２６−３６（２００５）に詳述される。

【0022】

本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、その特性に実質的な影響を及ぼさない限り、１つの、数個の又は１〜９個のアミノ酸が改変され得る。例えば、定常領域やＦＲ領域において、アミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入され得る。このような改変は、例えば、部位特異的変異導入法（点突然変異導入及びカセット式変異導入等）、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の核酸の改変方法を組み合わせて、容易に実施することが可能である。

【0023】

本発明は、さらに、前記の本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントをコードする核酸を含む。本発明の一態様として、本発明の核酸は配列表の配列番号４に示される塩基配列及び配列番号５に示される塩基配列を含む。本発明の核酸は、コードするアミノ酸配列を変更させずに、宿主細胞に適したコドン（至適コドン）を使用するように改変することができる。このように至適コドンに改変することによって、宿主細胞内におけるポリペプチドの発現効率が向上する。

【0024】

本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法又は化学合成等の各種手段を用いて製造することができる。遺伝子工学的手法としては、例えば、本発明の核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクターを作製し、当業者に公知の適当な方法でこのベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を培養して核酸を発現させ、得られたポリペプチドを回収し、精製することによって製造することができる。本発明の核酸が複数の核酸分子からなる場合は、それぞれの核酸分子を含む複数のベクターの組合せ（セット）を宿主細胞に導入するか、又は複数の核酸を含む１つのベクターを宿主細胞に導入してもよい。なお、ポリペプチドを製造する際に、目的のポリペプチドにペプチドタグを連結させ、ペプチドタグを使用して精製することができる。

【0025】

本発明に使用可能なベクターは、適切な宿主中で本発明の核酸を発現するように、適切な制御配列と機能的に連結している。制御配列としては、本発明の核酸を転写させるためのプロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、リボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、ポリアデニル化配列、及び転写や翻訳の終了を制御する配列等が含まれる。さらにベクターには、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて使用しても良い。これらの各種配列又は部位は、発現させるポリペプチドの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することができる。

【0026】

本発明に使用可能なベクターは、宿主のゲノムに組み込まれるベクター、組み込まれないベクター、細胞質に存在して自律的に複製するエピソーマルベクターのいずれもが使用できる。例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクターなどのウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中でウイルスが自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、リポソーム及び陽イオン脂質などの縮合剤との併用により、非ウイルスベクターも使用することができる。更に、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントにより細胞に本発明の核酸を導入することができる。

【0027】

本発明の核酸を導入する宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞を挙げることができる。

【0028】

宿主細胞で発現された本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、宿主細胞の培養培地、宿主細胞の抽出物及び／又は溶解物から精製することができる。精製方法は当業者に公知の任意の方法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、遠心分離、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及びアフィニティクロマトグラフィーによって好適に精製される。アフィニティクロマトグラフィーは、ポリペプチドが有するペプチドタグとの親和力を利用した効率が高い好ましい精製技術の一つである。

【0029】

（２）本発明の組成物
本発明は、前記（１）記載の本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントを含む組成物、ならびに本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントをコードする核酸を含む組成物を提供する。

【0030】

本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体に対するプローブとして使用することができる。特に、ＷＴ１はがん細胞表面でＨＬＡに提示されることが明らかとなっており、Ｔ細胞はその抗原認識に基づいてがん細胞を攻撃している。従って、本発明の本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、腫瘍（がん）細胞に対するプローブ、つまり検出用組成物又は診断用組成物として使用することが可能である。

【0031】

検出方法としては、慣用の一般的な検出方法、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体アッセイ、放射性免疫アッセイ、放射性免疫沈降法、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイなどが挙げられるが、これらに制限されない。

【0032】

診断や検出の対象とするサンプルは、生物学的サンプル、例えば、疾患部位の組織又は細胞、血液、血清、血漿、リンパ液、尿などの体液、などである。これらのサンプル、もしくは必要に応じて予備精製、均質化、遠心分離、又は希釈を行ったサンプルに、適切な緩衝液中で、本発明の抗体を接触させ、抗原と抗体との複合体を上記の検出方法により検出する。この場合、本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントを標識してもよく、標識二次抗体を使用してもよい。標識は、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、放射性同位元素（例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉなど）、蛍光性物質（例えばローダミン、フルオレサミン、ダンシルクロリド、それらの誘導体など）、タグペプチドなどである。

【0033】

本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、医薬を標的に送達するために使用することができる。医薬と連結させた本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体を特異的に認識し、医薬を標的に送達する。連結可能な医薬として、サイトカイン（ＩＬ２、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γなど）及びそれらの受容体などのタンパク質、細胞毒（リシン、ジフテリア、ゲロニンなど）、放射性核種（^９０Ｙ、^１３１Ｉ、^２２５Ａｃ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、及び^２２７Ｔｈなど）、細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）又は低分子化合物（カリケアミシン、ドキソルビシンなど）が挙げられる。

【0034】

本発明の医薬組成物の有効成分の有効量は、例えば治療目的、腫瘍の種類、部位及び大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、及び投与経路等によって当業者が適宜決めることができる。典型的な１回の投与量又は日用量は、上記の条件に応じ、可能ならば、例えば当分野で既知の腫瘍細胞の生存又は成長についての検定法を使用して、まずインビトロで、そして次に、人間の患者のための用量範囲を外挿し得る適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することができる。

【0035】

本発明の組成物を医薬組成物として使用する際には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することができる。本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、及び、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、及びマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。

【0036】

投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、又は病変内経路による注入又は注射、及び持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。本発明の医薬組成物は、輸液により連続的に、または大量注射により投与されることができる。

【0037】

本発明の組成物は、例えば慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの造血器腫瘍や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、中皮腫等の固形癌の治療、診断、検出のために使用される。特にＷＴ１陽性、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の腫瘍、癌の治療、診断、検出に有用である。

【0038】

（３）本発明のキメラ抗原受容体
本発明は、前記（１）記載の本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントとシグナル伝達タンパク質の細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。本発明のＣＡＲは、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体に特異的に結合して、ＣＡＲを発現する細胞にシグナルを伝達することができる。本発明のＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインには本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントが含まれる。細胞外ドメインと前記複合体が特異的に結合すると、ＣＡＲの細胞内ドメインを介して細胞内にシグナルが伝達され、ＣＡＲを発現している細胞を刺激する。刺激を受けた細胞はサイトカイン等を産生し、前記複合体を発現している標的細胞に対し細胞傷害性を発揮し、又は他の免疫細胞の細胞傷害性を誘導することができる。

【0039】

ＣＡＲの細胞内ドメインとして、同一分子内に存在する細胞外ドメインがＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体と結合（相互作用）した際に、細胞内にシグナルを伝達することが可能な分子であるシグナル伝達タンパク質の細胞内ドメインが使用できる。本発明のＣＡＲに使用可能なシグナル伝達タンパク質としては、膜タンパク質、シグナル受容体、サイトカイン受容体から選択されるタンパク質が例示される。ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来する一次細胞質シグナル伝達配列を含む細胞内ドメインが例示される。また、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ及びＣＤ１５４に由来する二次細胞質シグナル（共刺激シグナル）伝達配列を含む細胞内ドメインが例示される。さらに、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−２１受容体に由来する三次細胞質シグナル伝達配列を含む細胞内ドメインが例示される。

【0040】

ＣＡＲの膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲの膜貫通ドメインを使用することができる。また、人為的に設計した配列でもよい。

【0041】

本発明は、本発明のＣＡＲをコードする核酸を含む。ＣＡＲをコードする核酸は、適当なプロモーターの制御下に発現されるように別の核酸と連結することができる。プロモーターとしては構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｘｉｓｔプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター等の哺乳類由来プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、各種レトロウイルスのＬＴＲプロモーター等のウイルス由来プロモーターを使用することができる。また、核酸の効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含む核酸を連結してもよい。また、更に核酸の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。

【0042】

本発明のＣＡＲをコードする核酸は、前記（１）で記載した本発明に使用可能なベクターにより細胞に導入することができる。さらに、ＣＡＲをコードする核酸は医薬用組成物の有効成分として使用することができる。ＣＡＲをコードする核酸を含む医薬用組成物は前記（２）の記載のとおり、製造及び使用することができる。

【0043】

本発明の別の態様において、本発明には本発明のＣＡＲを発現する細胞が含まれる。当該細胞は、本発明のＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入する工程により調製することができる。ＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲを介してＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体と結合することにより細胞内にシグナルが伝達され活性化される。細胞の活性化は、宿主細胞の種類や細胞内ドメインにより異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。例えば、活性化された細胞からの細胞傷害性のサイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシンなど）の放出は、前記複合体を発現する腫瘍細胞の破壊をもたらす。また、サイトカイン放出や細胞表面分子の変化により、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等を刺激する。従って、本発明のＣＡＲ発現細胞は養子免疫療法、特にＷＴ１陽性、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の腫瘍又は癌に対する養子免疫療法において有用である。

【0044】

ＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入する工程は、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）又は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で実施される。核酸を導入する細胞は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の細胞が使用できる。また、細胞の種類としては、例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官より採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。ＰＢＭＣ、免疫細胞［樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球又はＮＫ細胞、血球系細胞（好中球、好塩基球、単球）］、造血幹細胞、臍帯血単核球、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、血球細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、多能性幹細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。本発明においては、特にＴ細胞、Ｔ細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）、多能性幹細胞又はこれらを含有する細胞集団の使用が好ましい。Ｔ細胞には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、又はＣＤ４陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。Ｔ細胞及びＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、ＰＢＭＣが含まれる。本発明で使用する細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののどちらでもよい。核酸を導入した細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞に核酸を導入することが好ましい。

【0045】

本発明のＣＡＲを発現する細胞は、対象に投与する前に適切な培地及び／又は刺激分子を使用して培養及び／又は刺激を行ってもよい。刺激分子にはサイトカイン類、適当なタンパク質、その他の成分が含まれる。サイトカイン類としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ等が例示され、好適には、ＩＬ−２を含有する培地が使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０^５Ｕ／ｍＬ、より好適には１〜１×１０^４Ｕ／ｍＬである。また、適当なタンパク質としては、例えばＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、抗ＩＬ−４抗体が例示される。また、この他、レクチン等のリンパ球刺激因子を添加することもできる。更に、培地中に血清や血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０超〜２０容量％が例示され、また培養段階に応じて使用する血清や血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用される。

【0046】

細胞の培養に使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ_２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の細胞集団を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られる細胞集団の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。

【0047】

本発明には、ＣＡＲを発現する細胞を有効成分として含有する医薬組成物が含まれる。本発明の医薬用組成物は、非経口的に対象に投与して用いる。非経口的な投与方法としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、及び皮下投与などの方法が包含される。抗腫瘍作用を高めるため、髄膜腫又は近傍の組織、例えば皮下に投与することもできる。また、投与量は、対象の状態、体重、年齢等応じて適宜選択されるが、通常、細胞数として、体重６０ｋｇの対象に対し、１回当り、１０^７〜１０^９細胞程度、好ましくは、５×１０^７〜５×１０^８細胞程度投与される。本発明の医薬組成物は、１回又は複数回にわたって投与することができる。本発明の医薬組成物は、非経口投与に適した公知の形態、例えば、注射又は注入剤とすることができる。本発明の医薬組成物は、適宜、薬理学的に許容できる賦形剤を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、また、細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含んでもよい。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。

【実施例】

【0048】

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
実施例１ ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体特異的ｓｃＦｖのスクリーニング
（１） ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体の調製
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＷＴ１ペプチドを合成した（北海道バイオシステムズ社）。また、Ｃ末端にビオチン化サイトを有するＨＬＡ−Ａ２４重鎖の細胞外フラグメント（配列番号２）及び配列番号３に示すアミノ酸配列を有するβ２−ミクログロブリン（β２Ｍ）を大腸菌で発現させ精製した。１０ｍｇのＷＴ１ペプチド、１３．２ｍｇのβ２Ｍ、１８．６ｍｇのＨＬＡ−Ａ２４重鎖の細胞外フラグメントを２００ｍＬの溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４００ｍＭ Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ＨＣｌ、２ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、５ｍＭ ｒｅｄ． ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、０．５Ｍ ｏｘｉｄ．ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２ｍｇ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、０．２ｍｇ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）中で混合したのち、蒸留水による透析、Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦシステム（ミリポア社製）及びアミコンウルトラ１０ｋ（ミリポア社製）による濃縮を行った。濃縮物をＡＫＴＡ（ＧＥ社製）による分画に供してＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を取得した。ＷＴ１ペプチドと同様に、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、ＳＡＧＥ（肉種抗原）、Ｈｅｒ２（ヒト表皮成長因子受容体２型）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＥＢＮＡ（エプステインバーウイルス核内抗原）由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４の複合体を調製した。次いでＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体をビオチンリガーゼ（ＡＶＩＤＩＴＹ社製）によりビオチン化した。ビオチン化物についてＡＫＴＡにて再度の精製を行い、これをＡ２４−ＷＴ１とした。

【0049】

（２） ｓｃＦｖのスクリーニング
実施例１−（１）で調製したＡ２４−ＷＴ１ ２０μｇを、ストレプトアビジンを結合させた磁気ビーズ２００ｍｇと混ぜ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ溶液中、４℃で通夜反応させたのち、これに３μＬの２ｍＭ ビオチン／ＰＢＳを入れて１時間反応させた。これを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ溶液にて２回洗浄したのち、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ溶液４００μＬに懸濁し、これを抗原ビーズ液とした。
反応液として、ヒトＢリンパ細胞に由来する抗体のファージライブラリ溶液１×１０^１３ｃｆｕ相当、１００μｇのストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）、実施例１−（１）で調製した５０μｇのＡ２４−ＣＭＶ、５０μｇのＡ２４−Ｈｅｒ２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳを作製し、これを室温で１時間回転混和したのち、抗原ビーズ液１００μＬを混ぜて１時間回転混和した。

【0050】

その後、マグネットトラッパー（東洋紡社製）にてトラップした磁性ビーズを１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳにて５回洗浄したのちＰＢＳにて１回洗浄した。洗浄後に回収した磁性ビーズを培養した大腸菌ＤＨ１２Ｓに加え、３７℃にて１時間感染させた。それを２００μｇ／ｍＬ アンピシリン、１％ ｇｌｕｃｏｓｅを含む２×ＹＴ培地（２×ＹＴＡＧ）５００ｍＬにて３０℃通夜培養した。

【0051】

１ｍＬの培養液に２００ｍＭ アンピシリンを含む２×ＹＴ培地（２×ＹＴＡ）５ｍＬ及びヘルパーファージＭ１３ＫＯ７ ５０μＬを入れ、３７℃にて１時間培養したのち、５０μＭ カナマイシン、２００μＭ アンピシリンを含む２×ＹＴ（２×ＹＴＡＫ）５００ｍＬを入れ、３０℃通夜培養した。これを遠心して得られた上清に１００ｍＬの２０％ ＰＥＧ＃６００、２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を入れて混和し、遠心して沈殿を回収した。これを１０ｍＬ ＰＢＳにて懸濁したのち、フィルター滅菌した。抗原ビーズ液とのインキュベーションからフィルター滅菌までの操作を４回繰り返し、４回目終了後、回収された大腸菌をＬＢＧＡ ｐｌａｔｅ（２００μｇ／ｍＬ アンピシリン、０．１％ ｇｌｕｃｏｓｅの入った普通寒天培地（日水社製））に蒔いた。３０℃にて培養し、得られたコロニーを２×ＹＴＡＧ培地にて３０℃通夜培養し、培養液の一部を使用してｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にてＤＮＡを調整し、配列決定を行った。この段階で１９個のクローンが陽性、すなわちＡ２４−ＷＴ１との結合能を有すると判断した。また、培養液５０μＬを１．５ｍｌの２×ＹＴＡＩ（０．５ｍＭのＩＰＴＧを入れた２×ＹＴＡ培地）と混ぜ、３０℃通夜培養したのち、遠心して上清のファージ液をとった。このファージ液をＥＬＩＳＡ法に使用した。

【0052】

（３） ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体特異的クローンの取得
Ｍａｘｉｓｏｐ ｌｏｏｓｅ（ＮＵＮＣ社製）にＰＢＳ ５０μＬに懸濁された５００ｎｇ ｎｅｕｔｒａａｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を入れて４℃にて通夜振盪しプレートにｎｅｕｔｒａａｖｉｄｉｎを固定化した。終了後、液を捨て、２００μＬの２％ ＢＳＡ／ＰＢＳを入れ、通夜静置した。このプレートに、実施例１−（１）で調製したＡ２４−ＷＴ１を３００ｎｇ／５０μＬ ＰＢＳとなるように入れ、４℃にて通夜振盪した。終了後、ＰＢＳにて洗浄し抗原ｐｌａｔｅとした。コントロールとして、実施例１−（１）で調製したＡ２４−ｈＴＥＲＴ、Ａ２４−ＳＡＧＥ、Ａ２４−Ｈｅｒ２、Ａ２４−ＣＭＶ、Ａ２４−ＥＢＮＡのＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチドを使用し、実施例１−（１）と同様にビオチン化したＨＬＡ−Ａ２４複合体を調製して抗原固定化プレートを調製した。
それぞれの抗原固定化プレートに実施例１−（２）で調製したファージ液１００μＬを入れ、室温にて１時間振盪したのち、プレートをＰＢＳにて洗浄し、次いで０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳにて２０００倍希釈した抗ｃｐ３ウサギ抗体１００μＬを入れて室温にて１時間振盪した。プレートをＰＢＳにて洗浄したのち、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳにて４０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ＭＢＬ社製）１００μＬを入れて室温にて１時間振盪した。プレートをＰＢＳにて洗浄したのち、０．０１％ Ｈ_２Ｏ_２、０．１Ｍ Ｎａ_２ＰＯ_４、０．１Ｍ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ（ｐＨ５．１）にて懸濁させたＯＰＤ（ＷＡＫＯ社製）を反応させ、発色を確認したら２Ｎ 硫酸にて停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２（モレキュラーデバイス社製）にて４９０ｎｍの波長にて吸光度を測定した。

【0053】

実施例１−（２）で取得したファージクローン１９個の中から、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体と特異的に結合するＷＴ＃２１３クローンを取得した。さらに、ＷＴ＃２１３クローンの濃度を変化させてＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体とのアフィニティーを確認した。その結果を図１及び図２に示す。なお、図２の縦軸は吸光度、横軸はＷＴ＃２１３クローンの希釈度を示す。図１及び図２から、ＷＴ＃２１３クローンが提示しているｓｃＦｖは、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体との結合特異性が非常に高く、アフィニティーが高いことを確認した。

【0054】

（４） ＷＴ＃２１３クローンの評価
ＷＴ＃２１３クローンのｓｃＦｖとＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体の解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用した。ＷＴ＃２１３クローンを固定化し、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体をアナライトとして測定した。ランニングバッファーとしてＨＢＳバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ） Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を用いた。データの解析には、分析ソフトウェアを用いて、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及びアフィニティー（ＫＤ）を算出した。その結果は、ｋａ値は３．０１ｅ^４、ｋｄ値は０．１１７、ＫＤ値は３．８９μＭであった。解析グラフを図３に示す。図３から、ＷＴ＃２１３クローンのｓｃＦｖはＫＤ値が高く、ｋｄの曲線もなだらかであることから、このｓｃＦｖは抗原との結合力が強く、かつ離れにくいことが確認された。

【0055】

実施例２ ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖの評価
（１） ＷＴ１ｓｃＦｖテトラマーの調製
ＷＴ＃２１３クローンのｓｃＦｖのＶＨの塩基配列を配列番号４に、ＶＬの塩基配列を配列番号５に示す。また、ＶＨのアミノ酸配列を配列番号６に、ＶＬのアミノ酸配列を配列番号７に示す。なお、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号８、９、１０に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１、１２、１３にそれぞれ示す。
さらに、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントを、ＷＴ＃２１３クローンから抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより調製した。プライマーは、Ｆプライマー（配列番号１４）及びＲプライマー（配列番号１５）を使用した。米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ）、２００３年、第１００巻、第１３号、第７４８０−７４８５頁を参考に、増幅したＤＮＡフラグメントをｐＨｉｓＡｖｉの制限酵素サイトＳａｌＩ−ＡｓｃＩに挿入し、得られたプラスミドをｐＷＴ＃２１３ｓｃＦｖＨｉｓＡｖｉとした。ｐＷＴ＃２１３ｓｃＦｖＨｉｓＡｖｉは、ＰｅｌＢリーダー、Ｈｉｓタグ、ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖ及びＡｖｉタグを有する融合タンパク質、並びにＰｅｌＢリーダー及びビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）を有する融合タンパク質を発現する。ｐＷＴ＃２１３ｓｃＦｖＨｉｓＡｖｉで形質転換した大腸菌ＤＨ５α株を、０．５ｍｇ／ｍＬ ＩＰＴＧ及び２μＭ ビオチンを含む２×ＹＴＡ培地（２×ＹＴＡＩＢ培地）５００ｍＬで、３０℃通夜培養した。培養液を遠心（８０００ｒｐｍ、４℃で１０分）して得られた上清に硫安１４５．５ｇを入れて５０％飽和とし、完全に溶解させた。これを遠心（８０００ｒｐｍ、４℃で１０分）して回収した沈殿をｃｏｍｐｌｅｔｅ（ロシュ社製）を入れたＰＢＳにて懸濁した。懸濁液を遠心（１００，０００ｒｐｍ、４℃で３０分）したのち、回収した上清を０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）にてろ過し、次いでろ液をＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムにアプライし、さらにカラムを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、及びＰＢＳにて洗浄した。カラムに結合したタンパク質を５０ｍＭ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ２．５）にて溶出したのち、３Ｍ Ｔｒｉｓにて中和した。次いで、ＰＢＳによる透析を行い、アミコンウルトラ（ミリポア社製）による濃縮を行った。

【0056】

以上の操作で得られたタンパク質１３μｇをＰＥ標識Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）４μｇと混ぜ、全体容量を４００ｍＬになるよう、０．０５％ ＮａＮ_３／ＰＢＳを加え、遮光して４℃にてゆっくりと通夜回転混和し、ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖテトラマーを調製した。

【0057】

（２） ＷＴ１ペプチドパルスＬＣＬとＷＴ＃２１３ｓｃＦｖとの反応性
ＲＰＭＩ培地中で、ＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞であるリンパ芽球様細胞株（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、以下ＬＣＬ）を実施例１−（１）で調製したＷＴ１ペプチドで２４時間パルスした。パルスしたＬＣＬをＰＢＳで洗浄し、実施例２−（１）で調製したＷＴ＃２１３ｓｃＦｖテトラマーを添加し、４℃で１時間静置した。ＬＣＬをＰＢＳで洗浄し、１％ パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定化して、フローサイトメトリーを実施した。コントロールとしてペプチドをパルスしないＬＣＬを同様に調製した。結果を図４に示す。図４から、ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖはＷＴ１ペプチドをパルスしたＬＣＬに反応性を示すことが確認された。

【0058】

（３） ＷＴ１ペプチドパルスＴ２Ａ２４とＷＴ＃２１３ｓｃＦｖとの反応性
ＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞であるＴ２Ａ２４を使用し、実施例２−（２）と同様にＷＴ１ペプチドをパルスし、ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖの反応性を確認した。コントロールとして、ＣＭＶペプチドをパルスした細胞を調製した。結果を図５に示す。図５から、ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖはＷＴ１ペプチドに特異的に反応することが確認された。

【0059】

（４） ＷＴ１発現腫瘍細胞とＷＴ＃２１３ｓｃＦｖとの反応性
ＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞で内因性にＷＴ１を発現しているヒト巨核芽球白血病細胞株であるＭＥＧ−０１を使用して、ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖとの反応性を実施例２−（２）と同様に確認した。コントロールとして、ＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞であるがＷＴ１を発現しないヒト口腔扁平上皮がん細胞株であるＨＳＣ−２を使用した。結果を図６に示す。また、コントロールとして、ＨＬＡ−Ａ２及びＷＴ１を発現するＫ５６２−Ａ２細胞も使用し、ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖに反応性が見られないことを確認した。以上より、ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖはＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４拘束性に反応することが確認された。

【0060】

実施例３ キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
（１） ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖを有するＣＡＲを発現するレトロウイルスプラスミドの調製
国際公開第２０１３／０５１７１８号パンフレットに記載されるｐＭＳ３−ＥＧＦＲ−ＬＣ−ｚＧ−ＣＡＲプラスミドベクターの、ＥＧＦＲに対するｓｃＦｖ及びヒトＩｇＧ−ＣＬ（軽鎖定常領域）ドメインコードするＤＮＡを、実施例２−（１）で調製したＷＴ＃２１３ｓｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントに置換してｐＭＳ３−ＷＴ＃２１３−ｚＧ−ＣＡＲプラスミドベクターを調製した。このベクターは、Ｎ末端から順に、リーダー配列、ＷＴ＃２１３ｓｃＦｖ、ＣＤ２８膜貫通領域（ＴＭ）、ＣＤ３ζ鎖細胞内ドメイン、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体）細胞内ドメインを有するＣＡＲを発現する。このＣＡＲをＷＴ＃２１３ＣＡＲとする。

【0061】

（２） レトロウイルス溶液の作製
実施例３−（１）で作製したプラスミドベクターにより大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体を得た。これら形質転換体の保持するプラスミドＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（マッハライナーゲル社製）を用いてそれぞれ精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして以下の操作に供した。
調製したトランスフェクション用ＤＮＡのそれぞれとＲｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）に含有されるｐＧＰベクター、ｐＥｅｃｏベクターを２９３Ｔ細胞にそれぞれトランスフェクトした。この操作は前記キットの製品プロトコールに従って行った。得られた形質導入細胞のそれぞれよりエコトロピックウイルスを含有する上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過した。この上清を用いて、ポリブレンを使用する方法によりＰＧ１３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０６８６）にエコトロピックウイルスを感染させた。得られた細胞の培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターによりろ過し、ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現用レトロウイルス溶液とした。

【0062】

（３） ＷＴ＃２１３ＣＡＲの発現
インフォームドコンセントを得て採取されたヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、実施例３−（２）で作製したＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現用レトロウイルス溶液を、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）を用いた標準的な方法で２回感染させ、ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現ＰＢＭＣを作製した。
ウイルス感染から１４日後の細胞（ＧＭＣ）及びコントロールとしてベクターを導入しなかったＰＢＭＣ（ＮＧＭＣ）を、抗ヒトＩｇＧ Ｌａｍｂｄａ抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識 抗Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体により染色した。また別に、ＰＥ（フィコエリスリン：ベクトンディッキンソン社製）標識ＷＴ１−Ａ２４テトラマーを添加した。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、蛍光標識陽性である細胞の割合、すなわちＣＡＲが陽性である細胞及びＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体に結合するＣＡＲが陽性である細胞の割合を測定した。その結果を図７に示す。図７に示すように、高いＣＡＲ陽性率が確認され、細胞表面にＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体に結合するＣＡＲが発現していることが分かった。

【0063】

（４） ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現細胞の機能評価（サイトカイン産生、マーカーの発現）
実施例３−（３）で調製したウイルス感染１４日後のＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現細胞を回収し、９６−ｗｅｌｌプレートにて細胞内サイトカインの染色を以下の通り行った。細胞内輸送阻害剤ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（シグマ社製）を含む培地で上記ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現細胞（ＧＭＣ）及びコントロールとしてベクターを導入しなかったＰＢＭＣ（ＮＧＭＣ）を１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した懸濁液を、前記プレートの１ウェルあたり１００μＬ添加した。さらに、Ｔ２Ａ２４細胞株にＷＴ１ペプチドをパルスした細胞の１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ懸濁液を１００μＬ添加し、５時間共培養させた。コントロールとして、ＷＴ１ペプチドをパルスしないＴ２Ａ２４細胞株及びＣＭＶペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４細胞株を使用し、同様の操作を行った。それぞれ共培養させた細胞を抗Ｈｕｍａｎ ＣＤ８抗体及び抗Ｈｕｍａｎ ＣＤ４抗体により染色した後、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ（ベックマンコールター社製）処理を行い、抗Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ抗体、抗Ｈｕｍａｎ ＣＤ１０７ａ抗体及び抗Ｈｕｍａｎ Ｍｉｐ１ｂ抗体により染色を行った。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、ＣＤ８陽性細胞中又はＣＤ４陽性細胞中の各サイトカイン産生細胞の割合を測定した。図８に結果を示す。図８に示す通り、ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現細胞（ＧＭＣ）は、ＷＴ１ペプチドを認識して各種サイトカイン、マーカーを産生することが確認された。

【0064】

（５） ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現細胞の機能評価（細胞傷害活性）
実施例３−（３）で調製したウイルス感染１４日後のＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現細胞（ＧＭＣ）を回収し、９６−ｗｅｌｌプレートにてＣａｌｓｅｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙによって細胞傷害活性を測定した。Ｃａｌｓｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学社製）を取り込ませたＴ２Ａ２４細胞株、Ｋ５６２−Ａ２細胞株及びＭＥＧ−０１細胞株を１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。Ｔ２Ａ２４細胞株については、ＷＴ１ペプチドをパルスした細胞、ＣＭＶペプチドをパルスした細胞及びパルスしない細胞を準備した。各細胞１ウェルあたり１００μＬ添加し、上記ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現細胞及びコントロールとしてベクターを導入しなかったＰＢＭＣ（ＮＧＭＣ）を懸濁し、ＥＴ比が２０、１０、５、２．５となるように１００μＬ添加した。ＰＢＭＣの代わりに、Ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌとして培地を、Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌとして０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１００μＬ添加するウェルを用意した。細胞及びコントロールを調製した後、９６−ｗｅｌｌプレートを５．０％ ＣＯ_２ガスで平衡化した３７℃ ＣＯ_２インキュベーター中で４時間保温した。次いで、上清１００μＬについてλ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５１５ｎｍにて蛍光強度を測定し、放出Ｃａｌｓｅｉｎ量を測定した。細胞傷害活性（Ｌｙｓｉｓ）を下式によって算出した結果を図９に示す。

【0065】

細胞傷害活性（％）＝１００×（各ウェルの測定値−Ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌの測定値）／（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌの測定値−Ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌの測定値）

【0066】

図９に示すように、ＷＴ１ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４細胞株においてＷＴ＃２１３ＣＡＲを導入したＰＢＭＣによる高い細胞傷害活性が見られた。ＣＭＶペプチドをパルスした細胞株及びペプチドをパルスしていない細胞株に対して反応性を示さないことから、ＷＴ＃２１３ＣＡＲは高い特異性を有していることが確認された。また、共にＷＴ１を内因性に発現しているＫ５６２−Ａ２細胞株及びＭＥＧ−０１細胞株について、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＭＥＧ−０１細胞株に対する細胞傷害活性が確認された。また、ＨＬＡ−Ａ２４陰性のＫ５６２−Ａ２細胞株特異的な細胞傷害活性は確認されなかっこのことは、ＷＴ＃２１３ＣＡＲはＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４拘束性に反応することを示している。

【0067】

実施例４ 担癌動物を用いた評価
（１） ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現Ｔ細胞群の調製
インフォームドコンセントを得て採取されたヒト末梢血より分離したＰＢＭＣ５．３×１０^５ｃｅｌｌｓを、０．２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、６００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、０．６％の血漿を含むＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）中に懸濁し、５μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及び２５μｇ／ｍＬのレトロネクチン（タカラバイオ社製）を固層化したプレートに播種し、５．０％ＣＯ_２ガスで平衡化した３７℃ ＣＯ_２インキュベーター中で４日間培養しＴ細胞の拡大培養を行った。このＴ細胞に、実施例３−（２）で作製したＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現用レトロウイルス溶液を、標準的な方法で２回感染させた。感染させたＴ細胞を、０．２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、６００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、０．６％の血漿を含むＧＴ−Ｔ５０３培地でさらに４日間培養し、ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現Ｔ細胞群を調製した。培養開始後８日目のＴ細胞群のＣＡＲの発現を実施例３−（３）と同様の方法で測定した。その結果、Ｔ細胞群に含まれるリンパ球のうち８７．７％がＣＤ８陽性細胞で、そのうち９４％の細胞がＣＡＲを発現していることを確認した。また、Ｔ細胞群に含まれるリンパ球のうち７．８％がＣＤ４陽性細胞で、そのうち９８％の細胞がＣＡＲを発現しており、ＷＴ＃２１３ＣＡＲの高い発現率を確認した。

【0068】

（２） 担癌マウスにおけるＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現Ｔ細胞の効果
８〜１０週令のＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ、ＩＬ−２γ ＫＯ）（（財）実験動物中央研究所）に２．５Ｇｙの放射線照射を行った。翌日、各マウスの左背部に、ＷＴ1陽性、ＨＬＡ−Ａ２４陰性のＫ５６２細胞株２．５×１０^６ｃｅｌｌｓを皮下注射し、右背部にＷＴ1陽性、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＫ５６２−Ａ２４細胞株２．５×１０^６ｃｅｌｌｓを皮下注射した。同時に、実施例４−（１）で調製したＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現Ｔ細胞１．０×１０^７ｃｅｌｌｓを静脈注射した。また、コントロールとして、ウイルス液を感染させていないＴ細胞を注射したマウス及びＴ細胞の代わりにＰＢＳを注射したマウスを用意した。マウスは各群５匹を使用した。注射後２〜３日毎に腫瘍径及び体重を測定した。腫瘍径は、腫瘍の最大直径と最小直径を測定してその数値を乗じることにより算出した。

【0069】

腫瘍径（ｍｍ^２）＝最大直径（ｍｍ）×最小直径（ｍｍ）

【0070】

図１０にそれぞれのマウスにおけるＫ５６２細胞株及びＫ５６２−Ａ２４細胞株の腫瘍径と体重の経時変化を示す。図中、ＧＭＣはＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現Ｔ細胞を静脈注射したマウス、ＮＧＭＣはウイルス液を感染させていないＴ細胞を注射したコントロールのマウス、ＰＢＳはＴ細胞の代わりにＰＢＳを注射したコントロールのマウスをそれぞれ示す。横軸は日数、縦軸は腫瘍径の積を示す。ＷＴ＃２１３ＣＡＲ発現Ｔ細胞を輸注したマウスでのみ、Ｋ５６２−Ａ２４細胞株の腫瘍の増殖抑制が確認された。このことは、ＷＴ＃２１３ＣＡＲはＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４拘束性に腫瘍増殖を抑制することを示している。また、各マウスの体重に差が見られず、ＷＴ＃２１３ＣＡＲの高い安全性を確認した。

【産業上の利用可能性】

【0071】

本発明により、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を特異的に認識する抗体又はその抗原結合性フラグメント、抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする核酸、この核酸を含むベクター、抗体又はその抗原結合性フラグメントの製造方法、抗体又はその抗原結合性フラグメントを含むキメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体をコードする核酸、この核酸を含むベクター、キメラ抗原受容体を発現する細胞及びこれらを含む組成物が提供される。ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を特異的に認識する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、細胞医療、遺伝子治療の分野で使用することができ、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４複合体を発現する腫瘍細胞の検出、治療及びそのための研究、試験に極めて有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0072】

SEQ ID NO:1: WT1 peptide sequence
SEQ ID NO:2: Extracellular domain of HLA-A24 heavy chain amino acid sequence
SEQ ID NO:3: beta 2M amino acid sequence
SEQ ID NO:4: VH nucleic acid sequence
SEQ ID NO:5: VL nucleic acid sequence
SEQ ID NO:6: VH amino acid sequence
SEQ ID NO:7: VL amino acid sequence
SEQ ID NO:8: VH-CDR1 amino acid sequence
SEQ ID NO:9: VH-CDR2 amino acid sequence
SEQ ID NO:10: VH-CDR3 amino acid sequence
SEQ ID NO:11: VL-CDR1 amino acid sequence
SEQ ID NO:12: VL-CDR2 amino acid sequence
SEQ ID NO:13: VL-CDR3 amino acid sequence
SEQ ID NO:14: F primer sequence
SEQ ID NO:15: R primer sequence

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]