特許 6702725 改良されたポックスウイルスワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6702725

(24)【登録日】2020年5月11日

(45)【発行日】2020年6月3日

(54)【発明の名称】改良されたポックスウイルスワクチン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20200525BHJP

   C12N 15/30 20060101ALI20200525BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20200525BHJP

   C12N 15/863 20060101ALI20200525BHJP

   C07K 14/005 20060101ALI20200525BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20200525BHJP

   C07K 14/37 20060101ALI20200525BHJP

   C07K 14/44 20060101ALI20200525BHJP

   C07K 14/82 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 39/002 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20200525BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20200525BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/12ZNA

   C12N15/30

   C12N15/31

   C12N15/863 Z

   C07K14/005

   C07K14/195

   C07K14/37

   C07K14/44

   C07K14/82

   A61K39/002

   A61K39/02

   A61K39/12

   A61K39/00 G

   A61K39/00 H

   A61P31/00

   A61P31/12

   A61P33/00

   A61P35/00

   A61P31/04

   A61P31/10

   A61K39/00 K

   A61K31/7088

   A61K48/00

   A61K39/39

   A61K35/761

   A61K35/76

【請求項の数】20

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2015-562528(P2015-562528)

(86)(22)【出願日】2014年3月14日

(65)【公表番号】特表2016-510989(P2016-510989A)

(43)【公表日】2016年4月14日

(86)【国際出願番号】IB2014059802

(87)【国際公開番号】WO2014141176

(87)【国際公開日】20140918

【審査請求日】2017年3月7日

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2013/055409

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】305060279

【氏名又は名称】グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム

(74)【代理人】

【識別番号】100091982

【弁理士】

【氏名又は名称】永井 浩之

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100082991

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 泰和

(74)【代理人】

【識別番号】100105153

【弁理士】

【氏名又は名称】朝倉 悟

(74)【代理人】

【識別番号】100117787

【弁理士】

【氏名又は名称】勝沼 宏仁

(74)【代理人】

【識別番号】100143971

【弁理士】

【氏名又は名称】藤井 宏行

(72)【発明者】

【氏名】ステファノ、コロカ

(72)【発明者】

【氏名】リッカルド、コルテーゼ

(72)【発明者】

【氏名】アントネラ、フォルゴリ

(72)【発明者】

【氏名】アルフレード、ニコシア

【審査官】 星 功介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０６２６５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５０９０７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Drillien, R., et al.，Modified vaccinia virus Ankara induces moderate activation of human dendritic cells，Journal of General Virology，２００４年，85，2167-2175

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １４／００−１４／８２５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸構築物を含んでなる改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターであって、該核酸構築物が、
（ｉ）少なくとも一つの抗原タンパク質またはその抗原フラグメントをコードする核酸配列、ここで該核酸配列が下記（ｉｉ）と作動可能に連結され、および
（ｉｉ）少なくとも一つのバリアント鎖をコードする核酸、ここで該少なくとも一つのバリアント鎖が下記である：
（ａ）天然インバリアント鎖、または
（ｂ）天然インバリアント鎖と少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含んでなる、ベクター。

【請求項2】

少なくとも一つのコードされるインバリアント鎖が哺乳動物起源のものである、請求項１に記載のＭＶＡベクター。

【請求項3】

コードされる少なくとも一つのインバリアント鎖が、配列番号１もしくは配列番号３であるか、または配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載のＭＶＡベクター。

【請求項4】

少なくとも一つの抗原タンパク質が、病原生物のタンパク質、癌特異的タンパク質、または異常な生理応答反応に関連するタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＭＶＡベクター。

【請求項5】

病原生物がウイルス、細菌、原生生物または多細胞寄生生物である、請求項４に記載のＭＶＡベクター。

【請求項6】

医薬としての使用のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＭＶＡベクター。

【請求項7】

免疫応答のプライミングまたはブースティングにおいて使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＶＡベクター。

【請求項8】

免疫応答のプライミングが同種プライム−ブーストワクチン接種レジメンの一部である、請求項７に記載のＭＶＡベクター。

【請求項9】

免疫応答のプライミングが異種プライム−ブーストワクチン接種レジメンの一部である、請求項７に記載のＭＶＡベクター。

【請求項10】

ＭＶＡベクターが、鼻腔内、筋肉内、皮下、皮内、胃内、経口、または局所経路を介して投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＭＶＡベクター。

【請求項11】

（ａ）（ｉ）少なくとも一つの第１の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントをコードする核酸配列、ここで該核酸配列が下記（ｉｉ）と作動可能に連結され、および
（ｉｉ）少なくとも一つのバリアント鎖をコードする核酸、ここで該少なくとも一つのバリアント鎖が下記である：
１．天然インバリアント鎖、または
２．天然インバリアント鎖と少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含んでなる核酸構築物を含んでなるＭＶＡベクター、ならびに
（ｂ）少なくとも一つの第２の抗原タンパク質もしくはその抗原フラグメント、または
一つの第２の抗原タンパク質またはその抗原フラグメント、または
ウイルス様粒子
をコードする核酸配列を含んでなる第２のベクター
を含んでなり、
ここで、該第１の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントの少なくとも一つのエピトープが該第２の抗原タンパク質またはそのフラグメントと免疫学的に同一である、ワクチンの組合せ。

【請求項12】

第２のベクターがアデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、アレナウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、裸のＤＮＡおよびウイルス様粒子から選択される、請求項１１に記載のワクチンの組合せ。

【請求項13】

アデノウイルスベクターが非ヒト大型類人猿由来アデノウイルスベクターである、請求項１２に記載のワクチンの組合せ。

【請求項14】

アデノウイルスベクターがチンパンジーまたはボノボアデノウイルスベクターである、請求項１３に記載のワクチンの組合せ。

【請求項15】

プライム−ブーストワクチン接種レジメンにおいて使用するための、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のワクチンの組合せ。

【請求項16】

ＭＶＡベクター（ａ）が免疫応答のプライミングに使用され、（ｂ）のベクターまたは抗原タンパク質が免疫応答のブースティングに使用される、請求項１５に記載のワクチンの組合せ。

【請求項17】

（ａ）のベクターまたは抗原タンパク質が免疫応答のプライミングに使用され、ＭＶＡベクター（ｂ）が免疫応答のブースティングに使用される、請求項１５に記載のワクチンの組合せ。

【請求項18】

免疫応答が鼻腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、胃内投与、経口投与および局所投与からなる群から選択される投与経路によってプライミングされ、免疫応答が鼻腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、胃内投与、経口投与および局所投与からなる群から選択される投与経路によってブースティングされる、請求項１６または１７に記載のワクチンの組合せ。

【請求項19】

対象における免疫応答の刺激において使用するための、請求項１または２に記載のＭＶＡベクターを含んでなる組成物。

【請求項20】

核酸構築物を含んでなるＭＶＡベクターを含む組成物であって、該核酸構築物が、
（ｉ）少なくとも一つの抗原タンパク質またはその抗原フラグメントをコードする核酸配列、ここで該核酸配列が下記（ｉｉ）と作動可能に連結され、および
（ｉｉ）少なくとも一つのバリアント鎖をコードする核酸、ここで該少なくとも一つのバリアント鎖が下記である：
１．天然インバリアント鎖、または
２．天然インバリアント鎖と少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントを含んでなる、
組成物。

【発明の詳細な説明】

【発明の背景】

【0001】

技術分野
本出願は、抗原タンパク質とインバリアント鎖をコードする核酸構築物を含んでなる改良されたポックスウイルスワクチン、およびこのようなポックスウイルスベクターの新規な投与レジメンに関する。特に、免疫応答のプライミングまたはブースティングのための前記ポックスウイルスベクターの使用が開示される。

【0002】

背景技術
感染性疾患は、なお人間にとって大きな脅威である。感染性疾患を予防または治療する一つの方法は、抗原物質を個体に投与し、個々の抗原に対する適応免疫応答を生じさせるというワクチン接種による免疫応答の人工的誘導である。抗原物質は、構造的には完全であるが不活化されている（すなわち、非感染性）は、もしくは弱毒された（すなわち、感染性が低減された）病原体（例えば、微生物またはウイルス）、または免疫原生が高いことが分かっている病原体の精製された成分であり得る。病原体に対する免疫応答を誘導するためのもう一つのアプローチは、病原体の免疫原性タンパク質またはペプチドをコードする１以上のベクターを含んでなる発現系の提供である。このようなベクターは裸のプラスミドＤＮＡの形態であってもよく、または免疫原性タンパク質もしくはペプチドは、例えば、改変ワクシニアウイルス（例えば、改変ワクシニアアンカラ、ＭＶＡ）もしくはアデノウイルスベクターに基づくウイルスベクターを使用することにより送達することもできる。このような発現系は、環境条件に対する感受性が低い、十分に特徴付けられた成分を含んでなるという利点を有する。

【0003】

ベクターに基づく発現系を開発する場合、これらの発現系の患者への適用が、個々の病原体による感染に対して防御性のある免疫応答を惹起するということが特定の目的となる。しかしながら、発現系によっては、病原体に対して免疫原性応答を誘導するものの、その病原体による感染から完全に防御するに十分強い免疫応答を惹起することができない場合がある。よって、病原体に対して防御免疫応答を誘導できる改良された発現系、ならびに増強された免疫応答を惹起する既知の発現系の新規な投与レジメン（regimen）の必要がなお存在する。

【0004】

抗原は、ＭＨＣ分子により抗原提示細胞の表面に提示されるペプチドフラグメントである。抗原は、外来（すなわち、病原性）起源のもの、またはその生物体自体に由来するものであり得、後者は自己抗原と呼ばれる。ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）とＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）の２つのクラスが存在する。ＭＨＣ−Ｉ分子は、各細胞内で合成されたペプチドのフラグメントを提示する。ＭＨＣ−ＩＩ分子は、貪食作用により取り込まれ、次いでエンドソーム内で消化されたペプチドのフラグメントを提示する。一般に、ＭＨＣ−ＩＩ分子は、マクロファージまたは樹状細胞などの「専門の」抗原提示細胞によってのみ発現される。ＭＨＣ−ＩＩ分子に結合した抗原は、ヘルパーＴ細胞によって認識される。ＭＨＣ−ＩＩ分子によって提示された抗原に対する、ヘルパーＴ細胞のＴ細胞受容体の結合は、抗原提示細胞によって分泌されたサイトカインとともに、ＴＨ_０の表現型の未熟なヘルパーＴ細胞の、様々なタイプのエフェクター細胞への成熟を誘導する。

【0005】

ＭＨＣ−ＩＩ分子は、小胞体で合成され、小胞体を離れてＭＨＣクラスＩＩコンパートメントに入る膜結合型受容体である。内在性のペプチド、すなわち、自己抗原が、ＭＨＣ−ＩＩ分子と結合しないようにするために、新生ＭＨＣ−ＩＩ分子は別のタンパク質であるインバリアント鎖と結合し、このインバリアント鎖がＭＨＣ−ＩＩ分子のペプチド結合溝を遮断している。ＭＨＣクラスＩＩコンパートメントが、貪食作用と消化を受けたタンパク質を含有する後期エンドソームと融合すると、インバリアント鎖が切断されて、ＭＨＣ−ＩＩ分子と結合したＣＬＩＰ領域のみが残る。第２段階で、ＣＬＩＰはＨＬＡ−ＤＭ分子によって除去され、外来抗原のフラグメントが自由に結合することができるＭＨＣ−ＩＩ分子が残る。前記フラグメントは、このＭＨＣクラスＩＩコンパートメントが原形質膜とひと度融合すると抗原提示細胞の表面に提示され、このようにして他の細胞、主としてヘルパーＴ細胞に外来抗原を提示する。

【0006】

アデノウイルスを用いて投与した場合、インバリアント鎖と、ワクチン接種に使用される発現系により含まれる抗原との融合は、前記抗原に対する免疫応答を増強するということが、これまでに見出されている（ＵＳ２０１１／０２９３７０４として公開され、インバリアント鎖配列を開示する目的で引用することにより本明細書の開示の一部とされるＷＯ２００７／０６２６５６）。さらに、前記アデノウイルス構築物は、プライム−ブースティングワクチン接種レジメンに関して免疫応答をプライミングするために有用であることを実証した（ＵＳ２０１０／０２７８９０４として公開され、インバリアント鎖配列をコードするアデノウイルスベクターを開示する目的で引用することにより本明細書の開示の一部とされるＷＯ２０１０／０５７５０１）。本発明者らは、驚くことに、インバリアント鎖抗原融合物の送達のためにアデノウイルスの代わりにポックスウイルスを用いると、所与の抗原に対する免疫応答が同等に増強され得ることを見出した。この方法で、免疫応答を生じさせることが可能である。ポックスウイルスベクターは、免疫応答のプライミングに使用した場合にもこの効果を惹起したことは特に驚くべきことである。

【発明の概要】

【0007】

第１の側面において、本発明は、免疫応答のプライミングまたはブースティングにおいて使用するための核酸構築物を含んでなるポックスウイルスベクターであって、前記核酸構築物が、
（ｉ）作動可能に連結された、少なくとも一つの抗原タンパク質またはその抗原フラグメントをコードする核酸配列と、
（ｉｉ）少なくとも一つのインバリアント鎖をコードする核酸
を含んでなるベクターに関する。

【0008】

別の側面において、本発明は、
（ａ）（ｉ）作動可能に連結された、少なくとも一つの第１の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントをコードする核酸配列と、
（ｉｉ）少なくとも一つのインバリアント鎖をコードする核酸
を含んでなる核酸構築物を含んでなるポックスウイルスベクター、ならびに
（ｂ）少なくとも一つの第２の抗原タンパク質もしくはその抗原フラグメント、または
一つの第２の抗原タンパク質またはその抗原フラグメント、または
をコードする核酸配列を含んでなるウイルスベクター
を含んでなり、
ここで、前記第１の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントの少なくとも一つのエピトープが前記第２の抗原タンパク質またはそのフラグメントと免疫学的に同一であるワクチンの組合せに関する。

【0009】

さらに別の側面において、本発明は、プライム−ブーストワクチン接種レジメンにおいて使用するための上記のワクチンの組合せに関する。このようなポックスウイルスベクターおよびの組合せを使用する方法も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】インバリアント鎖（ｌｉ）−ＮＳ抗原をコードするＭＶＡは、マウスにおいてより強いＴ細胞応答を誘導する。２群のマウスを２×１０＾５プラーク形成単位（ｐｆｕ）の、ＮＳ抗原を含んでなるＭＶＡ（左のパネル）およびインバリアント鎖に連結されたＮＳを含んでなるＭＶＡ（右のパネル）で免疫した。ＮＳ抗原に対する全Ｔ細胞応答をＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔにより測定し、ｙ軸の数字はスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１００万脾細胞を表す。

【図2】インバリアント鎖（ｌｉ）−ＮＳ抗原をコードするＭＶＡは、マウスにおいて対応するアデノよりも強いＴ細胞応答を誘導する。２群のマウスを、ＮＳをコードするＭＶＡ（ＭＶＡ ｗｔ）またはヒトインバリアント鎖に連結されたＮＳをコードするＭＶＡ（ＭＶＡｌｉ）で免疫した。さらに２群のマウスを同等用量の、ＮＳをコードするＣｈＡｄ３（ＣｈＡｄ３ ｗｔ）またはヒトインバリアント鎖に連結されたＮＳをコードするＣｈＡｄ３（ＣｈＡｄ３ｌｉ）で免疫した。ＮＳ抗原に対する全Ｔ細胞応答をＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔにより測定し、ｙ軸の数字はスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１００万脾細胞を表す。

【図3】インバリアント鎖に連結されたＮＳを含んでなるＭＶＡでのブースティングはマカクザルにおいてＨＣＶ−ＮＳ特異的Ｔ細胞の生成を増大させる。４個体のマカクザル２群をＣｈＡｄ３ＩｉＮＳでプライミングし、５０週間後にＭＶＡ−ＮＳ（灰色のバー）またはＭＶＡ−ＩｉＮＳ（黒いバー）でブースティングした。パネルＡは、ブースト１週間後（ピークブースト）または３か月後（記憶）のＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔによる応答を示す。ｙ軸の数字はスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１００万ＰＢＭＣを表す。パネルＢは、ＭＶＡＩｉＮＳでのブースト１週間後のＩＦＮγ ＩＣＳによるより高いＣＤ８頻度を示す（黒いバー）。ｙ軸の数字は抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞産生ＩＦＮγの％を表す。

【図4】ヒトインバリアント鎖の４つのアイソフォーム（ｐ３３、ｐ３５、ｐ４１、ｐ４３、アイソフォームｃ）とネズミインバリアント鎖の２つのアイソフォーム（ｐ３１、ｐ４１）を示す概略図。ヒトｐ３５およびｐ４３では、付加的な１６残基が翻訳の選択的開始のためにＮ末端に存在する。ヒトｐ４１およびｐ４３アイソフォームおよびネズミｐ４１アイソフォームでは、付加的ドメインが選択的スプライシングのために存在する。ヒトｃアイソフォームはヒトｐ３３およびｐ３５に比べて２つのエキソン（ヒトｐ４１およびｐ４３に比べて３つのエキソン）を欠き、フレームシフトを引き起こす。

【発明の具体的説明】

【0011】

そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。

【0012】

例えば、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland) に記載の通りに定義される。

【0013】

本明細書および以下に続く特許請求の範囲を通して、文脈がそうではないことを要求しない限り、「含んでなる(comprise)」という用語および「含んでなる(comprises)」および「含んでなる(comprising)」などの変形は、示された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を包含するが、任意の他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を排除しないことを意味すると理解される。

【0014】

本明細書の文面にはいくつかの文献が引用されている。本明細書に引用される各文献（全ての特許、特許出願、化学刊行物、製造者の仕様書、説明書などを含む）は、前掲も後掲も、引用することによりその全内容が本明細書の開示の一部とされる。本明細書において、本発明は先行発明のためにこのような開示に先行する権利がないことを認めたものと解釈されるべきでない。本発明のある側面に関して本明細書に提供された定義は全て、本発明の他の側面にも当てはまる。

【0015】

本発明の基礎にある問題は、特許請求の範囲および以下の基性で特徴付けられる実施形態によって解決される。

【0016】

第１の側面において、本発明は、免疫応答のプライミングまたはブースティングにおいて使用するための核酸構築物を含んでなるポックスウイルスベクターであって、前記核酸構築物が、
（ｉ）作動可能に連結された少なくとも一つの抗原タンパク質またはその抗原フラグメントをコードする核酸配列と、
（ｉｉ）少なくとも一つのインバリアント鎖をコードする核酸
を含んでなるベクターに関する。

【0017】

本発明において使用する場合、用語「ポックスウイルスベクター」は、ポックスウイルス科(Poxviridae)の天然に存在するメンバー、または核酸構築物を個体の細胞に導入することができるそれに由来するウイルスベクターを意味する。本発明の文脈において、導入される核酸構築物によりコードされている抗原およびインバリアント鎖が、ポックスウイルスベクターにより導入された際に前記細胞内で発現されることが企図される。

【0018】

ポックスウイルス科は、二本鎖ＤＮＡからなるゲノムを特徴とする。好適には、ポックスウイルスベクターは、チョルドポックスウイルス(chordopoxvirinae)亜科、より好ましくは、オルソポックス、パラポックス、ヤタポックス、アビポックス（好ましくは、カナリア痘（ＡＬＶＡＣ）または鶏痘（ＦＰＶ））およびモルシポックスからなる群から選択される前記亜科の属に属する。いっそうより好ましくは、ポックスウイルスベクターはオルソポックスに属し、ワクシニアウイルス、ＮＹＶＡＣ（ワクシニアのコペンハーゲン株由来）、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ウシポックスウイルスおよびサル痘ウイルスからなる群から選択される。最も好ましくは、ポックスウイルスベクターはＭＶＡである。

【0019】

ＭＶＡの記載は、Mayr A, Stickl H, Muller HK, Danner K, Singer H. “The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behavior in organisms with a debilitated defense mechanism. “Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA.” Zentralbl Bakteriol B. 1978 Dec、 167(5-6):375-90およびMayr, A., Hochstein-Mintzel, V. & Stickl, H. (1975). Infection 3, 6-14に見出すことができる。

【0020】

ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞で５７０回を超える継代培養中に複数の完全に特徴付けられた欠失を受けたワクシニアウイルスの高弱毒株である。これらは、宿主域遺伝子およびサイトカイン受容体をコードする遺伝子を含んでいた。包含されるウイルスは、ヒトおよびほとんどの他の哺乳動物細胞で効率的に複製できないが、複製欠陥はビリオン集合の後期に起こるので、ウイルス遺伝子および組換え遺伝子の発現は損なわれず、これにより、ＭＶＡは哺乳動物において感染を引き起こすことができない効率的な１回発現ベクターとなる。

【0021】

一実施形態では、ＭＶＡは、ＣＥＦ細胞でのワクシニアウイルスの５７１回目の継代培養から得られたウイルスシードバッチ４６０ＭＧに由来する。別の実施形態では、ＭＶＡは、ウイルスシードバッチＭＶＡ ４７６ ＭＧ／１４／７８に由来する。さらなる実施形態では、ＭＶＡは、１９７８年１２月３１日以前に由来または作出され、プリオン汚染フリーである。

【0022】

本発明の使用のためのさらなるポックスウイルスベクターは、ＭＶＡと類似の特性を有する。特に、それらは感染性であるが、ヒトにおいて複製不能である。この形質のために、複製のためにはタンパク質をトランスで発現させる必要があり得る。一般に、これらのタンパク質はウイルス生産細胞株で安定的にまたは一時的に発現され、それにより、ウイルスの複製を可能とする。

【0023】

用語「核酸」は、ヌクレオチドモノマーから構成されるポリマー高分子を意味する。ヌクレオチドモノマーは、核酸塩基、五炭糖（例えば、限定されるものではないが、リボースまたは２’−デオキシリボース）、および１〜３個のリン酸基から構成される。一般に、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合を介して形成される。本発明の文脈において、核酸分子には、限定されるものではないが、リボ核酸（ＲＮＡ）とデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれる。さらに、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡまたはＲＮＡの人工類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）も含まれる。

【0024】

用語「核酸構築物」は、少なくとも一つの抗原タンパク質と少なくとも一つのインバリアント鎖をコードする核酸を意味する。好適には、前記核酸は、核酸構築物によりコードされているポリペプチドの転写および翻訳を指示するエレメントをさらに含んでなる。このようなエレメントには、無細胞系または細胞系、例えば、細胞系においてｍＲＮＡの転写を指示するためのプロモーターおよびエンハンサーエレメントが含まれる。好適には、このようなプロモーターおよび／またはエンハンサーは、ポックスウイルスベクターの内在性プロモーターおよび／またはエンハンサーである。この酸性構築物が翻訳可能なＲＮＡとして提供される場合には、核酸構築物は、少なくとも一つの免疫原性ポリペプチドをコードするＲＮＡの翻訳および／または安定化に必要なエレメント、例えば、ポリＡテール、ＩＲＥＳ、キャップ構造などを含んでなることが想定される。

【0025】

用語「実質的に同じ」とは、核酸配列またはアミノ酸配列に関して使用される場合、個々に示される参照ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９８％を超える、または９９％を超える配列同一性の程度を意味する。

【0026】

２以上のポリペプチドにおける残基は、残基または残基群がポリペプチド構造において類似の位置を占める場合に、互いに「対応する」と言われる。当技術分野で周知のように、２以上のポリペプチドにおける類似の位置は、アミノ酸配列または構造的類似性に基づいてそれらのポリペプチド配列をアラインすることによって決定することができる。このようなアラインメントツールは当業者には周知であり、例えばthe World Wide Web、例えば、ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw)またはAlign (www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)で得られるものであり得る（標準設定を使用、例えば、Alignの場合には、EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5）。当業者ならば、満足なアラインメントを得るためには、いずれかの配列にギャップを導入する必要のある場合があることを理解するであろう。残基が最良の配列アラインメントでアラインされた場合に、それらの残基は「対応する」と言われる。２つのポリペプチド間の「最良の配列アラインメント」は、アラインされた同一の残基が最大数となるようなアラインメントと定義される。「最良の配列アラインメントの領域」は、アラインされた二配列間の配列類似性または同一性が１０、２０または３０アミノ酸長にわたって３０％未満、２０％未満、または１０％未満に低下した場合に終わり、よって、類似性スコアの決定のために比較配列の長さの境界および限界を規定する。

【0027】

上記で概略を示したように、本発明のベクターはポックスウイルスベクターであることが企図される。従って、前記ポックスウイルスベクターが複製コンピテントである場合、核酸構築物は、ウイルスベクターの複製に必要とされる核酸配列および／または核酸構築物によりコードされているポリペプチドの発現を指示する調節エレメントをさらに含む、より大きな核酸分子により含まれる。

【0028】

本発明の一実施形態では、抗原タンパク質またはその抗原フラグメントとインバリアント鎖が単一のオープンリーディングフレームによって含まれ、従って、前記オープンリーディングフレームの転写および翻訳の結果、抗原タンパク質またはその抗原フラグメントとインバリアント鎖を含んでなる融合タンパク質が生じる。

【0029】

用語「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、アミノ酸に翻訳され得るヌクレオチド配列を意味する。一般に、このようなＯＲＦは、開始コドン、通常３ヌクレオチドの倍数の長さを持つ、それに続く領域を含むが、所与のリーディングフレーム内には終止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ、ＵＡＧ、ＵＡＡ，またはＵＧＡ）を含まない。一般に、ＯＲＦは天然に存在するか、または人工的に、すなわち、遺伝子技術の手段によって構築される。ＯＲＦはタンパク質をコードし、それに翻訳され得るアミノ酸がペプチド結合した鎖を形成する。

【0030】

用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、長さ、共翻訳時修飾または翻訳後修飾とは無関係に、いずれのペプチド結合したアミノ酸鎖も意味する。

【0031】

本明細書で使用する用語「翻訳後」は、ヌクレオチドトリプレットのアミノ酸への翻訳および配列中の前のアミノ酸へのペプチド結合の形成の後に起こるイベントを意味する。このような翻訳後イベントは、全ポリペプチドが形成された後に、またはすでに翻訳プロセス中にすでに翻訳されたポリペプチドの部分で起こり得る。翻訳後イベントは一般に、結果として得られるポリペプチドの化学的または構造的特性を変更または修飾する。翻訳後イベントの例としては、限定されるものではないが、アミノ酸のグリコシル化もしくはリン酸化、または例えばエンドペプチダーゼによるペプチド鎖の切断が含まれる。

【0032】

本明細書で使用する用語「共翻訳」は、ヌクレオチドトリプレットのアミノ酸鎖への翻訳プロセス中に起こるイベントを意味する。これらのイベントは一般に、結果として得られるアミノ酸の化学的または構造的特性を変更または修飾する。共翻訳時イベントの例としては、限定されるものではないが、翻訳プロセスを完全に停止させ得るか、またはペプチド結合形成の妨害により２つの離散した翻訳産物を形成させ得るイベントが含まれる。

【0033】

本発明において使用可能なタンパク質（タンパク質誘導体、タンパク質変異体、タンパク質フラグメント、タンパク質セグメント、タンパク質エピトープおよびタンパク質ドメインを含む）は、化学修飾によってさらに修飾することができる。ゆえに、このような化学修飾ポリペプチドは、２０種の天然アミノ酸中に見られる残基以外の化学基を含んでなってもよい。このような他の化学基の例としては、限定されるものではないが、グリコシル化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸が含まれる。ポリペプチドの化学修飾は、例えば、安定性の増大、生体半減期の延長、または水溶解度の増大の一つ以上など、親ポリペプチドに比べて有利な特性を提供し得る。本発明において使用可能な変異体に適用可能な化学修飾としては、限定されるものではないが、ペグ化、非グリコシル化親ポリペプチドのグリコシル化、または親ポリペプチドに存在するグリコシル化パターンの改変が含まれる。本発明において使用可能な変異体に適用可能なこのような化学修飾は、共翻訳時または翻訳後に起こり得る。

【0034】

本出願において言及される「抗原タンパク質」は、少なくとも一つのエピトープを含有する上記で定義されるようなポリペプチドである。抗原タンパク質の「抗原フラグメント」は、少なくとも一つのエピトープを含んでなる前記抗原タンパク質の部分配列である。免疫誘導目的では、免疫応答を惹起するタンパク質の部分だけが関連する。従って、核酸構築物は、病原体または癌細胞に見られるような全長抗原タンパク質をコードする必要はない。このようなタンパク質の短縮フラグメントは、そのアミノ酸配列が免疫系による抗原タンパク質の認識を負う１または複数のエピトープを含んでなる十分な長さである。

【0035】

抗原決定基としても知られる用語「エピトープ」は、本発明の文脈において使用される場合、免疫系により認識されるポリペプチドの部分である。好適には、この認識は、問題のエピトープへの抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞の結合により媒介される。抗体またはＢ細胞により結合されるエピトープは「Ｂ細胞エピトープ」と呼ばれ、Ｔ細胞により結合されるエピトープは「Ｔ細胞エピトープ」と呼ばれる。これに関して、用語「結合」は、特異的結合を意味し、これは、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と各エピトープの間の会合定数が１×１０^５Ｍ^−１以上、または１×１０^６Ｍ^−１、１×１０^７Ｍ^−１、１×１０^８Ｍ^−１以上である結合と定義される。当業ならば、どのようにして会合定数を決定すればよいかを十分に認知している（例えば、Caoili, S.E. (2012) Advances in Bioinformatics Vol. 2012参照）。好適には、エピトープへの抗体の特異的結合は、抗体のＦａｂ(fragment, antigen binding)領域により媒介され、Ｂ細胞の特異的結合は、Ｂ細胞受容体により含まれる抗体のＦａｂ領域により媒介され、Ｔ細胞の特異的結合は、Ｔ細胞受容体の可変（Ｖ）領域により媒介される。Ｔ細胞エピトープは抗原提示細胞の表面に提示され、そこでそれらは腫瘍組織適合（ＭＨＣ）分子と結合している。それぞれＭＨＣクラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ分子と呼ばれる少なくとも３つの異なるクラスのＭＨＣ分子が存在する。ＭＨＣ−Ｉ経路を介して提示されるエピトープは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８^＋細胞）による応答を惹起し、一方、ＭＨＣ−ＩＩ経路を介して提示されるエピトープは、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋細胞）による応答を惹起する。ＭＨＣクラスＩ分子により提示されるＴ細胞エピトープは一般に８〜１１アミノ酸長の間のペプチドであり、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されるＴ細胞エピトープは一般に１３〜１７アミノ酸長の間のペプチドである。ＭＨＣクラスＩＩＩ分子はまた、糖脂質としての非ペプチドエピトープも提示する。よって、用語「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかにより提示され得る８〜１１または１３〜１７アミノ酸長のペプチドを意味する。

【0036】

エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群からなり、通常、特異的な三次元構造特徴、ならびに特異的な電荷特徴を有する。用語「エピトープ」は、コンフォメーションエピトープならびに非コンフォメーションエピトープを意味する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は失われるが、後者に対する結合は失われないことで識別される。Ｔ細胞エピトープは非コンフォメーションであり、すなわち、それらは直鎖であり、一方、Ｂ細胞エピトープはコンフォメーションまたは非コンフォメーションであり得る。直鎖Ｂ細胞エピトープは一般に５〜２０アミノ酸長の間で様々である。

【0037】

本発明による抗原タンパク質は、ウイルス、細菌、原虫および多細胞寄生生物からなる群から選択される病原体に由来する。本発明の別の実施形態では、抗原タンパク質は、癌細胞により発現されるポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントである。

【0038】

抗原タンパク質またはその抗原フラグメントは、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答またはＢ細胞応答とＴ細胞応答を誘導する。よって、抗原タンパク質または抗原フラグメントは、少なくとも一つのＴ細胞エピトープおよび／または少なくとも一つのＢ細胞エピトープを含んでなる。

【0039】

本発明の特定の例示的実施形態では、ベクターによりコードされている抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来する。ＨＣＶゲノムは、約３０００アミノ酸の前駆体ポリタンパク質をコードしている約９．５ｋｂ長の１本鎖ＲＮＡからなる(Choo et al. (1989) Science 244, 362-364、 Choo et al. (1989) Science 244, 359-362、 Takamizawa et al. (1991) J. Virol. 65, 1105-1113)。ＨＣＶポリタンパク質は、Ｃ−Ｅｌ−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの順序でウイルスタンパク質を含有する。個々のウイルスタンパク質はＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解によって産生される。宿主細胞プロテアーゼは推定構造タンパク質Ｃ、Ｅｌ、Ｅ２、およびｐ７を放出し、８１０番のアミノ酸にＮＳ２のＮ末端を作出する(Mizushima et al. (1994) J. Virol. 65, 2731-2734、 Hijikata et al. (1993) P.N.A.S. USA 90, 10773-10777)。非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂはおそらくウイルス複製機構を形成し、ポリタンパク質から放出される。ＮＳ２およびＮＳ３のＮ末端と会合している亜鉛依存性プロテアーゼは、ＮＳ２とＮＳ３の間の切断を担う(Grakoui et al. (1993) J. Virol. 67, 1385-1395, Hijikata et al. (1993) P.N.A.S. USA 90, 10773-10777)。
ＮＳ３のＮ末端ドメインに位置する別のセリンプロテアーゼは、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ａ７ＮＳ５Ｂ接合部でのタンパクを担う(Bartenschlager et al. (1993) J. Virol. 67, 3835-3844、 Grakoui et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10583-10587, Tomei et al. (1993) Virol. 67, 4017-4026)。ＮＳ４Ａは、ＮＳ３活性の補因子を提供する(Failla et al. (1994) J. Virol. 68, 3753-3760、 De Francesco et al, 米国特許第５，７３９，００２号)。ＮＳ５Ａは、インターフェロン耐性を付与する高リン酸化タンパク質である(De Francesco et al., (2000) Semin. Liver Dis., 20(1), 69-83、 Pawlotsky (1999) Viral Hepat. Suppl. 1, 47-48)。ＮＳ５Ｂは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する(De Francesco et al, 国際公開第ＷＯ９６／３７６１９号, Behrens et al, EMBO 15, 12-22, 1996, Lohmann et al., Virology 249, 108-118, 1998)。

【0040】

一つの限定されない例示的実施形態では、抗原タンパク質は、不活性なＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ領域を含有するＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドである。例えば、前記抗原タンパク質は、配列番号１１で定義される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有し、それ自体をプロセシングして、配列番号１１中に存在するＮＳ５Ｂ領域と実質的に同じ少なくとも一つのポリペプチドを産生するのに十分なプロテアーゼ活性を有する。この抗原タンパク質の配列はＷＯ２００３／０３１５８８に公開されており、これはＵＳ２００４／０２４７６１５として公開され、ＨＣＶポリペプチドを開示する目的で引用することにより本明細書の開示の一部とされる。産生されたＮＳ５Ｂに相当するポリペプチドは酵素的に不活性である。さらなる実施形態では、ＨＣＶポリペプチドは、配列番号１１中に存在するＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ領域と実質的に同じポリペプチドを産生するのに十分なプロテアーゼ活性を有する。

【0041】

一実施形態では、配列番号１１の配列との配列同一性の程度は、配列番号１１で定義される配列の８０％を超えるか、８５％を超えるか、９０％を超えるか、９５％を超えるか、または９８％を超える。しかしながら、いくつかの実施形態では、抗原タンパク質の配列は、配列番号１１で定義される配列と９９％を超える配列同一性を有するか、またはそれと同一である。

【0042】

「ｌｉ」または「ＣＤ７４」としても知られる用語「インバリアント鎖」は、非多形性ＩＩ型内在性膜タンパク質を意味する。このタンパク質は、リンパ球成熟および適応免疫応答に複数の機能を有し、特に、ｌｉは、新たに合成されたＭＣＨ ＩＩのエンドサイトーシス経路への標的化を保証し、そこでこの複合体は抗原ペプチドと遭遇し得る(Pieters J. (1997) Curr. Opin. Immunol., 9: 8996)。さらに、ｌｉは、ＭＨＣクラスＩシャペロンとして機能すること (Morris et al. (2004) Immunol. Res., 30: 171-179)、およびそのエンドソーム標的化配列により、共有結合された抗原に向けられたＣＤ４^＋の刺激を促進すること（ＣＤ８^＋Ｔはそうではない）(Diebold et al. (2001) Gene Ther. 8: 487-493)が示されている。

【0043】

ヒトインバリアント鎖では、４つの異なるアイソフォームが知られ、一般にｐ３３、ｐ３５、ｐ４１およびｐ４３と呼ばれている(Strubin et al., 1986, EMBO Journal, 5: 3483- 3488)。配列番号１および配列番号２は、ヒトインバリアント鎖ｐ３５アイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に相当する。ヒトｐ３３およびｐ４１に関しては、ヒトｐ３５およびｐ４３アイソフォームは、翻訳の選択的開始のためにＮ末端に付加的な１６個の残基を含む。ヒトｐ３３およびｐ３５に比べ、ヒトｐ４１およびｐ４３アイソフォームは、インバリアント鎖のＣ末端領域にインフレームで挿入された付加的ドメイン（エキソン６ｂの選択的スプライシング）を含んでなる。配列番号５および配列番号６は、ヒトインバリアント鎖ｐ４３アイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に相当する。ヒトｐ３３およびｐ３５に比べて２つのエキソンを欠く、さらなるヒトアイソフォームｃの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ（受託番号ＢＣ０２４２７２）で入手可能である。配列番号９および配列番号１０は、ヒトインバリアント鎖ｃアイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に相当する。

【0044】

【表1】

【0045】

ネズミインバリアント鎖では、ヒトインバリアント鎖アイソフォームｐ３３およびｐ４１に相当する２つのアイソフォーム（ｐ３１およびｐ４１）のみが知られている。配列番号３および配列番号４は、ネズミインバリアント鎖ｐ３１アイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に相当する。配列番号７および配列番号８は、ネズミインバリアント鎖ｐ４１アイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に相当する。種々のアイソフォームの模式的概要を図４に示す。

【0046】

一実施形態では、本発明において使用されるインバリアント鎖は、配列番号１または３のインバリアント鎖と実質的に同じである。

【0047】

インバリアント鎖は、いくつかのドメイン、すなわち、ヒトインバリアント鎖ｐ３５およびｐ４３変異体のＥＲ保留シグナル（ヒトインバリアント鎖配列番号１の１番〜１６番）により先行される選別（標的化）ペプチド（リソソーム標的化配列としても知られる）（ヒトインバリアント鎖配列番号１の１７番〜４６番、ネズミインバリアント鎖配列番号３の１番〜２９番）を含むサイトゾルドメイン、膜貫通ドメイン（シグナルアンカー、ヒトインバリアント鎖配列番号１の４７番〜７２番、ネズミインバリアント鎖配列番号３の３０番〜５５番）、およびそれ自体にＫＥＹ領域（ヒトインバリアント鎖配列番号１の９３番〜９６番、ネズミインバリアント鎖配列番号３の７６番〜７９番）、隣接するＣＬＩＰ領域（ヒトインバリアント鎖配列番号１の９７番〜１２０番、ネズミインバリアント鎖配列番号３の８０番〜１０３番）を含んでなる管腔ドメインを含んでなる。ＣＬＩＰ領域は、コアＣＬＩＰペプチド（ヒトインバリアント鎖配列番号１の１０３番〜１１７番、ネズミインバリアント鎖配列番号３の８６番〜１００番）および三量体形成ドメイン（ヒトインバリアント鎖配列番号１の１３４番〜２０８番、ネズミインバリアント鎖配列番号３の１１７番〜１９１番、Mittendorf et al., (2009) Expert Opin. Biol. Ther., 9:71-78、 Strumptner-Cuvelette and Benaroch, 2002, Biochem. Biophys. Acta, 1542: 1-13）を含んでなる。管腔ドメインの残りの部分は、膜貫通領域とＫＥＹ領域の間に位置する２つの柔軟性の高い領域（ヒトインバリアント鎖配列番号１の７３番〜９２番、ネズミインバリアント鎖配列番号３の５６番〜７５番）または三量体形成ドメインの下流（ヒトインバリアント鎖配列番号の２０９番〜２３２番、ネズミインバリアント鎖配列番号３の１９２番〜２１５番）を含んでなる。インバリアント鎖は、ニワトリ、ウシ、イヌ、マウス、ラットおよびヒトなどの数種の生物において同定されている。

【0048】

一実施形態では、インバリアント鎖は脊椎動物起源、鳥類もしくは哺乳動物起源であるか、またはさらには、それはニワトリ、ウシ、イヌ、マウス、ラット、非ヒト霊長類およびヒト由来のインバリアント鎖からなる群から選択される。さらなる実施形態では、それはヒトまたはネズミ起源であり、例えば、ヒトインバリアント鎖は、配列番号１により定義されるアミノ酸配列を有する。前記ポリペプチドは、一実施形態では、配列番号２で示される核酸配列によりコードされている。別の実施形態では、ネズミインバリアント鎖は、配列番号３により定義されるアミノ酸配列を有する。前記ポリペプチドは、一実施形態では、配列番号４で示される核酸配列によりコードされている。

【0049】

用語「インバリアント鎖」はまた、天然インバリアント鎖もしくは天然インバリアント鎖と実質的に同じインバリアント鎖のアミノ酸配列の一部の欠失、またはそれらの他の配列での置換を特徴とする、上記のポリペプチドの変異体も含んでなる。例示的変異体を以下に示す。

【0050】

インバリアント鎖の一つの特定の変異体では、ＬＲＭＫアミノ酸残基からなる内在性ＫＥＹ領域が欠失しているか、または異なるアミノ酸配列により置換されている。例えば、ＬＲＭＫアミノ酸残基または相当する残基が欠失している。ＬＲＭＫアミノ酸残基の欠失は、完全であってもよく（ＬＲＭＫアミノ酸残基の全てが関与）または部分的であってもよい（ＬＲＭＫアミノ酸残基の少なくとも一つが関与）。ＬＲＭＫアミノ酸残基の全ての完全欠失が想定される。さらに、ＬＲＭＫアミノ酸残基の少なくとも一つのまたは全てが、異なるアミノ酸残基により置換されている。

【0051】

さらに別の例示的変異体では、配列番号１のヒトインバリアント鎖の１０７番および１１５番のメチオニン、または配列番号３のネズミインバリアント鎖の９０番および９８番のメチオニン、または他のインバリアント鎖におけるこれらの位置に相当するメチオニンが他のアミノ酸により置換されている。メチオニンは置換されていることが好適である。

【0052】

さらに別の例示的変異体では、インバリアント鎖は、例えば膜貫通領域までのＮ末端が除去されるような程度の、Ｎ末端切断型である。従って、さらなる実施形態では、配列番号１のインバリアント鎖のＮ末端の４６未満のアミノ酸が切断されるか、４１未満のアミノ酸が切断されるか、または３６未満のアミノ酸が切断される。従って、また、配列番号３のインバリアント鎖に関しては、Ｎ末端の３０未満のアミノ酸が切断されるか、２５未満のアミノ酸が切断されるか、または２０未満のアミノ酸が切断されることも企図される。配列番号１のインバリアント鎖の一実施形態では、ヒトインバリアント鎖の最初の１６個のアミノ酸残基が欠失している。また、最初の１６個のアミノ酸残基の少なくとも一つ、しかしながら全てではない欠失も可能である。さらに、ヒトインバリアント鎖（配列番号１）の最初の１６個のアミノ酸残基の少なくとも一つ、または全ての、他のアミノ酸残基による置換も可能である。

【0053】

さらに別の変異体では、小胞体の内腔での発現のための少なくとも一つのシグナルペプチドがインバリアント鎖のＮ末端に、例えば、Ｎ末端切断のために膜貫通領域を欠いたＮ末端切断型のインバリアント鎖に付加される。

【0054】

インバリアント鎖のさらに別の変異体では、少なくとも一つのＣＬＩＰ領域が個々のインバリアント鎖の内在性ＣＬＩＰ領域に付加されるか、またはそれに取って代わる。配列番号１のヒトインバリアント鎖では、ＣＬＩＰ領域は９７番〜１２０番にわたり、配列番号３のネズミインバリアント鎖では、それは８０番〜１０３番にわたる。よって、当業者ならば、配列番号１および３のインバリアント鎖においてＣＬＩＰ領域に相当するアミノ酸残基を容易に決定することができる。さらなる実施形態では、完全な内在性ＣＬＩＰ領域が欠失または置換される。しかしながら、内在性ＣＬＩＰ領域に属する少なくとも一つのアミノ酸残基の欠失または置換も企図される。

【0055】

用語「インバリアント鎖」はまた、上記のインバリアント鎖およびそれらの変異体、例えば、配列番号１もしくは３のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２もしくは４の核酸配列によりコードされているインバリアント鎖のフラグメントも意味する。遺伝コードの縮重特性のために、一つのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされる場合があることが理解されるべきである。例えば、アミノ酸イソロイシンは、コドンＡＵＵ、ＡＵＣまたはＡＵＡによりコードされ得る。従って、本発明はまた、特定の核酸配列に関わらず、配列番号１または３により定義されるアミノ酸配列をコードする上述の核酸配列の全ての変異体を包含する。生物が異なれば、異なるコドンを異なる効率で利用するので、ヌクレオチド配列のコドン使用頻度を意図する宿主生物に適合させることが有利であり得る。一実施形態では、フラグメントは、野生型インバリアント鎖または上記で定義されるその変異体の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１０、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００または２１０のアミノ酸残基のフラグメントである。

【0056】

さらに、用語「インバリアント鎖」は上記の野生型インバリアント鎖、その変異体またはフラグメントのいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を有するポリペプチドを意味する。２つの異なるポリペプチド間の配列同一性を決定するための方法は当技術分野で周知である。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の類似性、すなわち、配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントによって決定することができる。このようなアラインメントは、いくつかの技術分野で公知のアルゴリズム、例えば、Karlin and Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)の数学的アルゴリズム、ｈｍｍａｌｉｇｎ(HMMER package, hmmer.wustl.edu/)または例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/もしくはwww.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlもしくはnpsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlで利用可能なＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム(Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)を用いて行うことができる。配列同一性（配列一致）の程度は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴまたはＢＬＡＳＴＺ（またはＢＬＡＳＴＸ）を用いて計算することができる。類似のアルゴリズムが、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムにも組み込まれている。

【0057】

比較のためにギャップを有するアラインメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載のようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを使用する。配列一致分析は、Ｓｈｕｆｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ(Brudno M., Bioin formatics 2003b, 19 Suppl 1: I54-I62)またはマルコフ確率場のような確立されたホモロジーマッピング技術によって補足することができる。本出願において配列同一性のパーセンテージが言及される場合、これらのパーセンテージは、特に断りのない限り、より長い配列の全長に関して計算される。

【0058】

用語「免疫応答をプライミングする」とは、免疫系の、少なくとも一つの抗原タンパク質またはその抗原との最初の遭遇と、その後の定義された時間内での抗原特異的免疫応答の誘導を意味する。前記期間は、プライミング前の、例えば、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも５年または少なくとも１０年である。一実施形態では、抗原特異的免疫応答を誘導しない、個体または対象の免疫系の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントとの遭遇は、本発明による「免疫応答をプライミングする」とは見なされない。例えば、持続的免疫を誘導しない、個体の免疫系の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントとの遭遇は、本発明による「免疫応答をプライミングする」とは見なされない。さらなる実施形態では、持続的免疫の誘導は、メモリーＢ細胞および／またはメモリーＴ細胞の生成によって媒介される。例えば、癌の場合、免疫応答を惹起することなく、特異的抗原が癌細胞によって発現され得る。単にこの抗原が存在するだけでは、本出願により理解されるような前記抗原に対する「免疫応答のプライミング」ではない。一実施形態では、それ以前の一定の期間に疾患を治療または予防する目的で、個体または対象は抗原タンパク質もしくはその抗原フラグメント、またはこのようなタンパク質もしくはフラグメントをコードする核酸を含んでなるベクターで故意に免疫誘導されていない。

【0059】

しかしながら、用語「免疫応答をプライミングする」とは、個体の前記抗原タンパク質またはその抗原フラグメントを天然に含んでなる病原体との過去のいずれの接触も、その接触が医療目的で人為的に誘導されなかったならば、意味する。特に、本出願によれば、その感染が医療目的で人為的に誘導されなかったならば、個体が前述の病原体にすでに感染していてもよいことが想定される。免疫応答のプライミングが起こった際には、その個体の感染はなお存在していてもよいし、またはすでに排除されていてもよい。同様に、癌の場合には、本発明のポックスウイルスベクターで免疫される個体または対象は本発明の核酸構築物により含まれる抗原タンパク質またはその抗原フラグメントを発現する癌にすでに罹患していることが想定される。

【0060】

本発明によるポックスウイルスベクターで免疫される患者または対象は、例えば、哺乳動物または鳥類、より具体的には、霊長類、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、ガチョウ、ニワトリ、アヒルまたはシチメンチョウ、最も具体的には、ヒトである。

【0061】

上記で定義される核酸構築物を含んでなるポックスウイルスベクターは、例えば、プライム−ブーストワクチン接種レジメンで使用される。

【0062】

多くの場合、ワクチンの単回投与では、問題の病原体の将来の感染の場合の効果的な防御のため、腫瘍疾患を含む疾患に対する防御のため、または腫瘍疾患などの疾患の治療的処置のために必要とされる数の長期持続免疫細胞を生成するのに十分でない。従って、前記病原体もしくは疾患に対する持続的かつ防御性免疫を確立するため、または所与の疾患を治癒させるためには、特定の病原体または疾患に特異的な生物学的調製物で繰り返し抗原投与することが必要とされる。同じ病原体または疾患に対するワクチンの繰り返し投与を含んでなる投与レジメンは、本出願では、「プライム−ブーストワクチン接種レジメン」と呼ばれる。一実施形態では、プライム−ブーストワクチン接種レジメンは、特定の病原体、病原体群または疾患に対するワクチンまたはワクチン組成物の少なくとも２回の投与を含む。１回目のワクチン投与は「プライミング」と呼ばれ、同じワクチンまたは１回目のワクチンと同じ病原体に対するワクチンのその後のいずれの投与も「ブースティング」と呼ばれる。よって、本発明のさらなる実施形態では、プライム−ブースティングワクチン接種レジメンは、免疫応答をプライミングするための１回のワクチン投与と、免疫応答をブースティングするためのその後の少なくとも１回の投与を含む。免疫応答をブースティングするために２回、３回、４回またはさらには５回の投与も本発明により企図されると理解されるべきである。

【0063】

プライムとブーストの間の期間は、場合により、１週間、２週間、４週間、６週間または８週間である。より詳しくは、その期間は４週間または８週間である。２回以上のブーストが行われる場合には、後のブーストは前のブーストの１週間、２週間、４週間、６週間または８週間後に投与される。例えば、任意の２回のブースト間の間隔は４週間または８週間である。

【0064】

プライム−ブーストワクチン接種レジメンは、同種または異種であり得る。同種プライム−ブーストレジメンでは、プライミングおよび少なくとも１回のブースティングは両方とも抗原タンパク質またはその抗原フラグメントの同じ投与手段を用いて行われ、すなわち、プライミングおよびブースティングはポリペプチドを用いて行われるか、またはプライミングおよびブースティングは、同じベクターにより含まれる核酸構築物を用いて行われる。本発明の文脈において、同種プライム−ブーストワクチン接種レジメンは、免疫応答のプライミングならびにブースティングの両方に本発明のポックスウイルスベクターを使用することを含んでなると考えられる。異種プライム−ブースティングレジメンは、免疫応答のプライミングおよびブースティングに異なる手段に異なる手段の使用を含む。本発明の文脈において、異種プライム−ブースティングレジメンは、免疫応答のプライミングのための上記のようなポックスウイルスベクターと、免疫応答のブースティングのための異なるベクターまたはペプチドワクチンを含んでなると考えられる。

【0065】

あるいは、異種プライム−ブースティングレジメンは、免疫応答のプライミングのための異なるベクターまたはペプチドワクチンと、免疫応答のブースティングのための上記のようなポックスウイルスベクターを含んでなると考えられる。

【0066】

本発明の一実施形態では、プライム−ブースティングワクチン接種レジメンは同種である。

【0067】

本発明の別の実施形態では、プライム−ブースティングワクチン接種レジメンは異種である。

【0068】

一つの異種プライムブースティングレジメンでは、上記のようなポックスウイルスベクターが免疫応答のブースティングに使用され、異なるベクターまたはペプチドワクチンが免疫応答のプライミングに使用される。別の実施形態としての異種プライムブースティングレジメンでは、上記のようなポックスウイルスベクターが免疫応答のプライミングに使用され、異なるベクターまたはペプチドワクチンが免疫応答のブースティングに使用される。

【0069】

別の実施形態では、異種プライム−ブースティングレジメンは、免疫応答のプライミングのためのアデノウイルスベクターと、免疫応答のブースティングのための上記のようなポックスウイルスベクターを含んでなると考えられる。

【0070】

さらに別の実施形態では、異種プライムブースティングレジメンは、免疫応答のプライミングのための上記のようなポックスウイルスベクターと、免疫応答のブースティングのためのアデノウイルスベクターを含んでなると考えられる。

【0071】

総てのプライム−ブースティングワクチン接種レジメンに関して、免疫応答のブースティングに使用される抗原タンパク質または抗原ペプチドは、免疫応答のプライミングに使用される抗原タンパク質またはその抗原フラグメントと免疫学的に同一であることが想定される。抗原タンパク質またはその抗原フラグメントはポリペプチド（「ペプチドワクチン」）として投与してもよく、または対象とする個体に投与される核酸分子によってコードされていてもよいことが理解されるべきである。後者の場合、所望の免疫応答を惹起する抗原タンパク質または抗原ポリペプチドは、免疫された個体の細胞で発現される。

【0072】

２つ以上の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントは、それらが同じ抗体、Ｔ細胞またはＢ細胞によって認識されるならば、「免疫学的に同一」である。同じ抗体、Ｔ細胞またはＢ細胞による２つ以上の免疫原性ポリペプチドの認識は、前記抗体、Ｔ細胞またはＢ細胞の「交差反応性」としても知られる。一実施形態では、同じ抗体、Ｔ細胞またはＢ細胞による２つ以上の免疫学的に同一のポリペプチドの認識は、総てのポリペプチドにおける同一または類似のエピトープの存在によるものである。類似のエピトープは、同じ抗体またはＢ細胞受容体のＦａｂ領域または同じＴ細胞受容体のＶ領域によって結合されるに十分な構造および／または電荷の特徴を共通に有する。抗体、Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体の結合の特徴は、例えば、問題のエピトープへの受容体の結合親和性によって定義される。本出願によって理解されるように、親和性定数が高いポリペプチドの親和性定数が、親和性定数が高いポリペプチドの親和性定数の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％であれば、２つの免疫原性ポリペプチドは「免疫学的に同一」である。受容体に対するポリペプチドの結合親和性を決定するための方法は、平衡透析法または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など、当技術分野で周知である。

【0073】

一実施形態では、２つ以上の「免疫学的に同一」のポリペプチドは、少なくとも一つの同一のエピトープを含んでなる。最も強いワクチン接種効果は通常、免疫原性ポリペプチドが同一のエピトープを含んでなる場合、または免疫原性ポリペプチドが同一のアミノ酸配列を有する場合に得ることができる。

【0074】

一実施形態では、免疫応答のプライミングのための上記のようなポックスウイルスベクターの使用は、病原体もしくは疾患に対する防御免疫を確立するか、または疾患の根絶をもたらすであろう。

【0075】

一実施形態では、ポックスウイルスベクターは、鼻腔内、筋肉内、皮下、皮内、胃内、経口および局所経路によって投与される。

【0076】

「鼻腔内投与」は、肺を含む全気道の粘膜への本発明のベクターの投与である。より詳しくは、組成物が鼻粘膜に投与される。一実施形態では、鼻腔内投与は、点滴、スプレーまたはエアゾールの手段によって達成される。さらなる実施形態では、前記投与は、針などの機械的手段による粘膜の穿孔を含まない。

【0077】

用語「筋肉内投与」は、個体の任意の筋肉へのベクターの注射を意味する。例示的筋肉内注射は、三角筋、外側広筋または腹側臀部(ventrogluteal)および背側臀部(dorsogluteal)領域に投与される。

【0078】

用語「皮下投与」は、真皮下へのベクターの注射を意味する。

【0079】

用語「皮内投与」は、真皮の皮膚層間へのベクターの注射を意味する。

【0080】

用語「経口投与」は、口腔を介した胃系へのベクターの投与を意味する。

【0081】

「局所投与」は、針または類似のデバイスで皮膚を貫通しない、皮膚の任意の部分へのベクターの投与である。ベクターまた、口腔、鼻、生殖器領域および直腸の粘膜へ局所投与してもよい。

【0082】

別の側面において、本発明は、
（ａ）（ｉ）作動可能に連結された、少なくとも一つの第１の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントをコードする核酸配列と、
（ｉｉ）少なくとも一つのインバリアント鎖をコードする核酸
を含んでなる核酸構築物を含んでなるポックスウイルスベクター、ならびに
（ｂ）少なくとも一つの第２の抗原タンパク質もしくはその抗原フラグメント、または
一つの第２の抗原タンパク質またはその抗原フラグメント、または
ウイルス様粒子
をコードする核酸配列を含んでなるベクター
を含んでなり、
前記第１の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントの少なくとも一つのエピトープが前記少なくとも一つの第２の抗原タンパク質またはそのフラグメントと免疫学的に同一であるワクチンの組合せに関する。

【0083】

用語「ワクチン」は、特定の疾患に対する免疫を誘導または改善する生物学的調製物を意味する。前記調製物は、死滅した病原体または弱毒化した生きた病原体を含んでなり得る。前記調製物はまた、免疫応答を惹起するのに好適な病原体由来の１以上の化合物も含んでなり得る。一実施形態では、前記化合物は、前記病原体のポリペプチドと実質的に同一または免疫学的に同一のポリペプチドである。別の実施形態では、本ワクチンは、前記病原体のポリペプチドと実質的に同一または免疫学的に同一の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸構築物を含んでなる。後者の場合、ワクチンで処置した個体において前記ポリペプチドを発現させることも企図される。ワクチン接種の基礎にある原理は、免疫「記憶」の生成である。個体の免疫系をワクチンで刺激すると、そのワクチンにより含まれる化合物を特異的に認識する免疫細胞の生成および／または増殖が誘導される。前記免疫細胞の少なくとも一部は、ワクチン接種後１０年、２０年または３０年に及び得る期間、活性を留める。その個体の免疫系が上述の期間内に免疫応答を惹起し得る化合物が由来した病原体に遭遇すれば、ワクチン接種によって生成された免疫細胞が再活性化され、ワクチンで刺激されずに初めてその病原体の免疫原性化合物に遭遇する個体の免疫応答に比べてその病原体に対する免疫応答を増強する。

【0084】

本発明において使用する場合、用語「ベクター」は、少なくとも一つのポリヌクレオチド、または少なくとも一つのポリヌクレオチドとその中に含まれるポリヌクレオチドを細胞に導入することができる少なくとも一つのタンパク質との混合物を意味する。さらに、用語「ベクター」はまた、例えば、Geall et al., 2012, PNAS, 109:14604-14609により記載されているような、少なくとも一つのポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることができるリポソームまたは脂質ナノ粒子の調製物とともに処方された少なくとも一つのポリヌクレオチドも意味する。

【0085】

ベクターにより含まれる少なくとも一つのポリヌクレオチドは、少なくとも一つの免疫原性タンパク質をコードする少なくとも一つの核酸構築物からなるか、またはそれを含んでなる。本発明の核酸構築物からなる、またはそれを含んでなるポリヌクレオチドに加え、付加的ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドも細胞に導入されてよい。付加的ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの付加はまた、前記付加的ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドが本発明の核酸構築物を細胞に導入するために必要とされる場合、または付加的ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの導入が本発明の核酸構築物によってコードされる免疫原性ポリペプチドの発現を増強する場合にも企図される。

【0086】

本発明の文脈において、１または複数のベクターの導入時に、導入された核酸構築物によってコードされている抗原タンパク質またはその抗原フラグメントがその細胞内で発現されることが想定される。好適なベクターの例としては、限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスベクター、脂質ナノ粒子または人工染色体が含まれる。

【0087】

本発明の一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ５型および２型）、アルファウイルスベクター（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、およびＶＥＥ−ＳＩＮキメラ）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、アカゲザルサイトメガロウイルス（ＲｈＣＭＶ）などのサイトメガロウイルス由来のベクター）、アレナウイルスベクター（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）ベクター）、麻疹ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、バキュロウイルスベクター(baculovirus vectot)、水疱性口内炎ウイルスベクター、レトロウイルス、レンチウイルス、ウイルス様粒子、および細菌胞子からなる群から選択される。

【0088】

さらなる実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、特に、ヒトまたは非ヒト大型類人猿由来のアデノウイルスベクターである。アデノウイルスが由来する例示的大型類人猿は、チンパンジー（Ｐａｎ）、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ）およびオランウータン（Ｐｏｎｇｏ）、例えば、ボノボ（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）および一般的なチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）である。一般に、天然の非ヒト大型類人猿アデノウイルスが個々の大型類人猿の糞便サンプルから単離される。具体的には、ベクターは、ｈＡｄ５、ｈＡｄ１１、ｈＡｄ２６、ｈＡｄ３５、ｈＡｄ４９、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８２、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、およびＰａｎＡｄ３ベクターまたは複製コンピテントＡｄ４およびＡｄ７ベクターに基づく非複製アデノウイルスベクターである。ヒトアデノウイルスｈＡｄ４、ｈＡｄ５、ｈＡｄ７、ｈＡｄ１１、ｈＡｄ２６、ｈＡｄ３５およびｈＡｄ４９は当技術分野で周知である。天然型ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３およびＣｈＡｄ８２に基づくベクターはＷＯ２００５／０７１０９３に詳細に記載され、これはＵＳ２０１１０２１７３３２として公開され、本明細書に記載のアデノウイルスベクターに関して参照することにより本明細書の開示の一部とされる。天然型ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２、ＰａｎＡｄ３、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、およびＣｈＡｄ１４７に基づくベクターはＷＯ２０１０／０８６１８９に詳細に記載され、これはＵＳ２０１２００２７７８８として公開され、本明細書に記載のアデノウイルスベクターに関して参照することにより本明細書の開示の一部とされる。

【0089】

別の実施形態では、第２の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントは、ポックスウイルスベクターにより含まれる核酸構築物によってコードされている抗原タンパク質またはその抗原フラグメントと免疫学的に同一である。

【0090】

本発明の別の実施形態では、ベクターは裸のＤＮＡとして存在する。用語「裸のＤＮＡ」は、ウイルスベクターのタンパク質をコードしないが、少なくとも一つの抗原タンパク質またはそのフラグメントをコードするいずれの核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡも意味する。裸のＤＮＡはいずれのポリペプチドとも会合されず、特に、ウイルス起源のポリペプチドと会合されないことが企図される。例えば、裸のＤＮＡは、プラスミド、コスミドまたは人工染色体として存在する。さらなる実施形態では、裸のＤＮＡは、ポックスウイルスベクターにより含まれる核酸構築物によってコードされている抗原タンパク質またはその抗原フラグメントと免疫学的に同一のポリペプチドをコードする。

【0091】

用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、ウイルスタンパク質を含んでなるが核酸は含まない集合を意味する。ＶＬＰは、好適な生産細胞株においてウイルス表面タンパク質を発現させることによって生産することができる。核酸の欠如、従って遺伝情報の欠如はＶＬＰを非感染性とするので、安全なワクチンが作製される。例えば、ＶＬＰは、ポックスウイルスベクターにより含まれる核酸構築物によってコードされている抗原タンパク質またはその抗原フラグメントと免疫学的に同一のポリペプチドを含んでなる。

【0092】

本発明のある特定の実施形態では、上記ワクチンの組合せは、プライム−ブーストワクチン接種レジメンで使用される。このプライム−ブーストワクチン接種レジメンの第１の実施形態では、ポックスウイルスベクターが免疫応答のプライミングに使用され、ウイルスベクターまたは抗原タンパク質もしくはその抗原フラグメントが免疫応答のブースティングに使用される。プライム−ブーストワクチン接種レジメンの別の実施形態では、ウイルスベクターまたは抗原タンパク質もしくはその抗原フラグメントが免疫応答のプライミングに使用され、ポックスウイルスベクターが免疫応答のブースティングに使用される。

【0093】

本発明の一実施形態では、免疫応答が鼻腔内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の筋肉内投与によりブースティングされる、
免疫応答が鼻腔内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮下投与によりブースティングされる、
免疫応答が鼻腔内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮内投与によりブースティングされる、
免疫応答が鼻腔内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の胃内投与によりブースティングされる、
免疫応答が鼻腔内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の経口投与によりブースティングされる、
免疫応答が鼻腔内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の局所投与によりブースティングされる、
免疫応答が鼻腔内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の鼻腔内投与によりブースティングされる、
免疫応答が筋肉内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の筋肉内投与によりブースティングされる、
免疫応答が筋肉内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮下投与によりブースティングされる、
免疫応答が筋肉内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮内投与によりブースティングされる、
免疫応答が筋肉内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の胃内投与によりブースティングされる、
免疫応答が筋肉内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の経口投与によりブースティングされる、
免疫応答が筋肉内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の局所投与によりブースティングされる、
免疫応答が筋肉内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の鼻腔内投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮下投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の筋肉内投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮下投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮下投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮下投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮内投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮下投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の胃内投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮下投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の経口投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮下投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の局所投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮下投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の鼻腔内投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の筋肉内投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮下投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮内投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の胃内投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の経口投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の局所投与によりブースティングされる、
免疫応答が皮内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の鼻腔内投与によりブースティングされる、
免疫応答が胃内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の筋肉内投与によりブースティングされる、
免疫応答が胃内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮下投与によりブースティングされる、
免疫応答が胃内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮内投与によりブースティングされる、
免疫応答が胃内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の胃内投与によりブースティングされる、
免疫応答が胃内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の経口投与によりブースティングされる、
免疫応答が胃内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の局所投与によりブースティングされる、
免疫応答が胃内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の鼻腔内投与によりブースティングされる、
免疫応答が経口投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の筋肉内投与によりブースティングされる、
免疫応答が経口投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮下投与によりブースティングされる、
免疫応答が経口投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮内投与によりブースティングされる、
免疫応答が経口投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の胃内投与によりブースティングされる、
免疫応答が経口投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の経口投与によりブースティングされる、
免疫応答が経口投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の局所投与によりブースティングされる、
免疫応答が経口投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の鼻腔内投与によりブースティングされる、
免疫応答が局所投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の筋肉内投与によりブースティングされる、
免疫応答が局所投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮下投与によりブースティングされる、
免疫応答が局所投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の皮内投与によりブースティングされる、
免疫応答が局所投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の胃内投与によりブースティングされる、
免疫応答が局所投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の経口投与によりブースティングされる、
免疫応答が局所投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の局所投与によりブースティングされる、
免疫応答が局所投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の鼻腔内投与によりブースティングされる。

【0094】

一実施形態では、免疫応答が鼻腔内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の筋肉内投与によりブースティングされる。

【0095】

さらに別の実施形態では、免疫応答が鼻腔内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の鼻腔内投与によりブースティングされる。

【0096】

さらに別の実施形態では、免疫応答が筋肉内投与によりプライミングされ、免疫応答が少なくとも１回の筋肉内投与によりブースティングされる。

【0097】

さらなる側面において、本発明は、上記に定義される免疫応答をプライミングするためのポックスウイルスベクターを含んでなるワクチン組成物、またはポックスウイルスベクターと、（ｉ）少なくとも一つの第２の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントをコードする核酸配列を含んでなるベクター、（ｉｉ）第２の抗原タンパク質またはその抗原フラグメントおよび（ｉｉｉ）ウイルス様粒子からなる群から選択される薬剤とを含んでなるワクチンの組合せに関する。

【0098】

用語「組成物」は、抗原タンパク質もしくはそのフラグメントまたはウイルス様粒子を含んでなるの組合せ、または核酸構築物と、薬学上許容可能な担体、製薬賦形剤およびアジュバントからなる群から選択される少なくとも一つのさらなる化合物とを含んでなるベクターを意味する。

【0099】

「薬学上許容可能な」とは、動物、より詳しくはヒトにおける使用に関して、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方または他の一般に認知されている薬局方に挙げられていることを意味する。

【0100】

用語「担体」は、本発明において使用する場合、治療的有効成分が一緒に投与される、限定されるものではないが、希釈剤、賦形剤、またはビヒクルなどの薬理学的に不活性な物質を意味する。このような医薬担体は液体であっても固体であってもよい。液体担体には、限定されるものではないが、水および油（落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、石油、動物、植物または合成起源のものを含む）中の無菌液体、例えば、生理食塩水が含まれる。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射溶液に使用可能である。生理食塩水は、医薬組成物が静脈内にまたはネブライザーによって鼻腔内に投与される場合に、一つの好ましい担体である。

【0101】

好適な製薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。

【0102】

好適な医薬担体の例は、E. W. Martinにより"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。

【0103】

用語「アジュバント」は、細胞性または体液性レベルのいずれかで、その組成物の有効成分に対する免疫応答を増強、刺激、活性化、強化または調節する薬剤を意味し、例えば、免疫アジュバントは、実際の抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、免疫効果自体は持たない。このようなアジュバントの例としては、限定されるものではないが、無機アジュバント（例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどの無機金属塩）、有機アジュバント（例えば、サポニンまたはスクアレン）、オイルベースのアジュバント（例えば、フロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバント）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＦＳ、およびＩＮＦ−γ）、粒状アジュバント（例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、リポソーム、または生分解性ミクロスフェア）、ビロソーム、細菌アジュバント（例えば、モノホスホリル脂質Ａ、またはムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、または合成脂質Ａ）、または合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えば、ポリアルギニンまたはポリリジン）が含まれる。

【実施例】

【0104】

実施例１：インバリアント鎖に連結されたＮＳを含んでなるＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈｌｉ ＮＳ）によるプライミングは、マウスにおいてＨＣＶ−ＮＳ特異的Ｔ細胞の生成を増大させる。
２群のＢａｌｂ／ｃマウスを２×１０＾５ｐｆｕ（プラーク形成単位）の、ＮＳをコードするＭＶＡで、または同じ用量の、ヒトインバリアント鎖に連結されたＮＳを含んでなるＭＶＡで筋肉内免疫した。ＮＳ領域は、ＨＣＶゲノムの約３分の２を包含し、５つの異なるタンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ）をコードし、これらはコードされているＮＳ３プロテアーゼによるＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解切断から生じる。免疫誘導１０日後に脾細胞を回収し、ＨＣＶ−ＮＳ特異的Ｔ細胞応答を、ＮＳにわたるペプチドのプールを用いてＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔにより評価した。応答は、６つの各ペプチドプールに対する反応性を合計し、およびｓｕｂｔｒアクチンｇ バックグラウンド（ペプチドを含まない対照ウェルで計数されたスポット）を差し引くことによって評価した。ＮＳを標的とする特異的Ｔ細胞のレベルは、ｌｉに基づくＭＶＡワクチンでプライミングしたマウスで高かった（図１）。

【0105】

実施例２：インバリアント鎖に連結されたＮＳを含んでなるＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈｌｉ ＮＳ）によるプライミングは、マウスにおいて、対応するアデノウイルスベクターよりも強いＴ細胞応答を誘導する。
２群のＢａｌｂ／ｃマウスを、２×１０＾５ｐｆｕの、ＮＳをコードするＭＶＡで、または同じ用量の、ヒトインバリアント鎖に連結されたＮＳを含んでなるＭＶＡで筋肉内免疫した。さらなる２群のマウスを、２×１０＾５ｉｕ（感染単位）の、ＮＳをコードするＣｈＡｄ３で、または同じ用量の、ヒトインバリアント鎖に連結されたＮＳを含んでなるＣｈＡｄ３で免疫したピーク免疫応答は、それぞれＭＶＡおよびＣｈＡｄ３ベクターワクチンでの免疫誘導１０日後および２１日後に回収した脾細胞において評価した。Ｔ細胞応答は、ＮＳにわたるペプチドのプールを用いて、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔにより評価した。結果（図２）は、ｌｉに基づくＭＶＡワクチンは、対応するｌｉに基づくＣｈＡｄ３ワクチンよりも高い応答を誘導することを示す。

【0106】

実施例３：インバリアント鎖に連結されたＮＳを含んでなるＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈｌｉ ＮＳ）によるブースティングは、マカクザルにおいて、ＨＣＶ−ＮＳ特異的Ｔ細胞の生成を増大させる。
４個体のマカクザル２群をＣｈＡｄ３ＩｉＮＳでプライミングし、５０週間後にＭＶＡ−ＮＳ（灰色のバー）またはＭＶＡ−ＩｉＮＳ（黒いバー）でブースティングした。注射用量は、アデノウイルスベクターでは１×１０^１０ｖｐ、ＭＶＡベクターでは２×１０^８ｐｆｕであった。免疫応答は、ＮＳにわたるペプチドのプールを用い、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔおよびＩＦＮγ細胞内染色（ＩＣＳ）により、プライミング１週間後（ピーク応答）および３か月後（記憶応答）に回収したＰＢＭＣにおいて評価した。図３に示されるように、両時点とも、ＭＶＡＩｉＮＳを受容した群でより高いＥＬＩＳｐｏｔ応答が誘導された（黒いバー）。パネルＡは、ブースト１週間後または３か月後のＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔによる応答を示す。パネルＢは、ＭＶＡＩｉＮＳによるブースト１週間後の、ＩＣＳによる、ＩＦＮγを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のより高い頻度を示す（黒いバー）。

【0107】

材料および方法
アデノウイルスおよびＭＶＡベクター
遺伝子型１ｂ、ｂｋ株由来の全ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＮＳ）領域を発現するＣｈＡｄ３ベクターは従前に記載されている(Colloca et al. Sci Transl Med 4(115), 115ra112, 2012)。同じカセットを発現するＭＶＡベクターを、従前に記載されているように誘導および調製した(Cottingham, M.G. et al PLoS ONE 3, e1638, 2008、 Di Lullo, G. et al. Virol. Methods 156, 37-43, 2009)。ヒトＩｉ（ｐ３５、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００４３５５）挿入配列をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ペーズリー、ＵＫ）により合成し、次に、ＮＳ導入遺伝子のＮ末端のＨＣＭＶおよびＢＧＨｐＡ制御下にクローニングした。

【0108】

動物およびワクチン接種
総ての試験手順は国家および国際法および政策（ＥＥＣ理事会指令８６／６０９、イタリア政令１１６／９２）に従って行った。イタリア保健省の倫理委員会はこの研究を承認した。動物の取り扱い手順は麻酔下で行い、苦痛を最小限にし、動物数を低減するためにあらゆる努力を行った。雌６週齢Ｂａｌｂ／ｃまたはＣ５７Ｂｌ／６マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（コモ、イタリア）から購入し、マウス各５個体の試験群を設定した。ＣｈＡｄ３およびＭＶＡベクターは、一部位当たり５０μｌの用量（最終用量１００μｌ）を送達することにより、四頭筋に筋肉内投与した。

【0109】

細胞生物学・神経学研究所（イタリア学術研究会議、ローマ）で飼育された目的繁殖コロニーからのナイーブ雌１１〜１９週齢（体重範囲３．２〜６．５Ｋｇ）カニクイザル(macaca fascicularis)を各５個体の試験群に割り付けた。免疫は総て、安定化バッファーに希釈した０．５ｍｌのウイルスを注射する三角筋における筋肉内経路によって送達した。注射用量は、アデノウイルスベクターでは１×１０^１０ｖｐ、ＭＶＡベクターでは２×１０^８ｐｆｕとした。取扱中、動物は１０ｍｇ／ｋｇ塩酸ケタミンのｉ．ｍ．注射により麻酔した。

【0110】

ペプチド
ＨＣＶ遺伝子型１ｂ ＢＫ株のＮＳ３−ＮＳ５Ｂ（１９８５ａ．ａ．）由来のオープンリーディングフレームにわたる、１５アミノ酸長、１１アミノ酸重複の４９４ペプチドのセットをＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（マナサス、ＶＡ）から入手した。

【0111】

マウスおよびマカクザルサンプルを用いたｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ
ＭＳＩＰ Ｓ４５１０プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、１０μｇ／ｍｌの抗マウスまたは抗サルＩＦＮγ抗体（両方ともＵ−ＣｙＴｅｃｈ Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダから）で４℃にて一晩コーティングした。洗浄およびブロッキング後、マウス脾細胞またはマカクザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２種類の異なる密度（２×１０^５および４×１０^５細胞／ウェル）の二反復で播種し、重複する１５マーペプチドプールを用い、各単一ペプチドの終濃度を４μｇ／ｍｌとして一晩刺激した。ペプチド希釈剤ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラン、イタリア）およびＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラン、イタリア）をそれぞれ陰性対照および陽性対照として用いた。続いてビオチン化抗マウスまたは抗サルＩＦＮγ抗体（両方ともＵ−ＣｙＴｅｃｈ Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダから）、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）、および最後にＢＣＩＰ／ＮＢＴ １−Ｓｔｅｐ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォードＩＬ）でインキュベートすることにより、プレートを現像した。プレートをＡ．ＥＬ．ＶＩＳ自動プレートリーダーにより取得および分析した。ＥＬＩＳｐｏｔ応答は以下の条件の総てを満たした場合に陽性と見なした：Ｃｏｎ−Ａ刺激ウェルに存在するＩＦＮγ生産、少なくとも一つのペプチドプールに対して脾細胞またはＰＢＭＣ１００万個当たり少なくとも５０個の特異的スポット、陽性ウェルに見られるスポットの数がｍｏｃｋ対照ウェル（ＤＭＳＯ）で検出される数の３倍、および応答が細胞希釈とともに低下。ＥＬＩＳｐｏｔデータは、脾細胞またはＰＢＭＣ１００万個当たりのＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表した。

【0112】

マカクザルサンプルを用いた細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）およびＦＡＣＳ分析
簡単に述べれば、２×１０^６サルＰＢＭＣを、３７℃、５％ＣＯ_２中、１５〜２０時間、抗ヒトＣＤ２８／ＣＤ４９ｄ共刺激抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）およびブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラン、イタリア）の存在下、抗原としてのペプチドプールを各２μｇ／ｍｌのペプチド終濃度で用いて刺激した。ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラン、イタリア）を陰性対照として用い、ブドウ球菌内毒素Ｂ（ＳＥＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラン、イタリア）を陽性対照として用いた。一晩刺激した後、ＰＢＭＣを以下の表面抗体で染色した(PBMCs where stained with the following surface antibodies)：ＡＰＣ抗サルＣＤ３、クローンＳＰ３４−２、ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５抗サルＣＤ４、クローンＬ２００、ＰＥ抗ヒトＣＤ８、クローンＲＰＡ−Ｔ８（総てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪから）。細胞内染色は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで処理した後、Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）の存在下で、ＦＩＴＣ抗ヒトＩＦＮγクローンＭＤ−１（Ｕ−ＣｙＴｅｃｈ Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダ）を用いて行った。染色細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏフローサイトメーターで取得し、ＤＩＶＡソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）を用いて分析した。各サンプルにつき、少なくとも３０，０００のＣＤ８＋、ＣＤ３＋ゲートイベントを取得した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]