特許 6703947 がん転移の阻害

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6703947

(24)【登録日】2020年5月13日

(45)【発行日】2020年6月3日

(54)【発明の名称】がん転移の阻害

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20200525BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20200525BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20200525BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20200525BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20200525BHJP

【ＦＩ】

   A61K45/00

   A61K39/395 V

   A61K31/7088

   A61K48/00

   A61P35/04

   C12N15/113 110

   C12Q1/68ZNA

   G01N33/574 A

【請求項の数】12

【全頁数】63

(21)【出願番号】特願2016-543993(P2016-543993)

(86)(22)【出願日】2014年9月18日

(65)【公表番号】特表2016-533388(P2016-533388A)

(43)【公表日】2016年10月27日

(86)【国際出願番号】US2014056379

(87)【国際公開番号】WO2015042303

(87)【国際公開日】20150326

【審査請求日】2017年9月19日

(31)【優先権主張番号】61/879,514

(32)【優先日】2013年9月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500213834

【氏名又は名称】メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】マッサーグ， ジョアン

(72)【発明者】

【氏名】バリエンテ， マニュエル

【審査官】 渡邉 潤也

(56)【参考文献】

【文献】 Cancer Res.，２０１３年 ２月，73(3 Supplement)，Abstract A29，DOI:10.1158/1538-7445.TIM2013-A29

【文献】 Genome Biology，２００６年 ５月３０日，7，216，doi:10.1186/gb-2006-7-5-216

【文献】 Clin Cancer Res.，２０１２年 ４月 １日，18(7)，p.1914-1924

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ３１／７１０５

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ｃ１２Ｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における脳または骨へのがんの転移拡散を阻害するための組成物であって、該組成物は、免疫グロブリンまたは干渉ＲＮＡからなる群より選択される治療量のＬ１ＣＡＭ阻害剤を含み、該対象における該がんの細胞がセルピンを過剰発現していると決定されていることを特徴とし、該セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２であり、該Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が、血管のＬ１ＣＡＭ媒介性利用、Ｌ１ＣＡＭと内皮細胞の相互作用、Ｌ１ＣＡＭ媒介性腫瘍成長、Ｌ１ＣＡＭ二量体化、および、ＥＲＫ、ＭＡＰＫ、ＡＫＴもしくはＦＡＫのＬ１ＣＡＭ媒介性リン酸化を阻害する組成物。

【請求項2】

前記がんが乳がんである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記がんが肺がんである、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

セルピンの発現を、がんに罹患している対象の処置のための指標とする方法であって、該セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２であり、該がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するステップを含み、該セルピンの過剰発現は、該対象の、該がんの転移拡散のリスクがより高いことを示し、該セルピンの過剰発現は、転移の成長または発生を阻害し、それにより、該がんの転移拡散の該リスクを低下させる、免疫グロブリンまたは干渉ＲＮＡからなる群より選択される治療量のＬ１ＣＡＭ阻害剤が実施または推奨されることを示すことを特徴とし、該リスクが対象の脳または骨への転移拡散のリスクであり、該Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が、血管のＬ１ＣＡＭ媒介性利用、Ｌ１ＣＡＭと内皮細胞の相互作用、Ｌ１ＣＡＭ媒介性腫瘍成長、Ｌ１ＣＡＭ二量体化、および、ＥＲＫ、ＭＡＰＫ、ＡＫＴもしくはＦＡＫのＬ１ＣＡＭ媒介性リン酸化を阻害する方法。

【請求項5】

前記がんが乳がんである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記がんが肺がんである、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

セルピンの発現を、対象のがんの転移拡散のリスクが高いかどうかの指標とする方法であって、該セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２であり、該がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するステップを含み、該セルピンの過剰発現が、該対象の、該がんの転移拡散のリスクが高いこと、そして、免疫グロブリンまたは干渉ＲＮＡからなる群より選択されるＬ１ＣＡＭ阻害剤が該がんの転移拡散を阻害する可能性が高いことを示し、該対象または医療従事者に決定の結果および関連するリスクが通知されることを特徴とし、該リスクが対象の脳または骨への転移拡散のリスクであり、該Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が、血管のＬ１ＣＡＭ媒介性利用、Ｌ１ＣＡＭと内皮細胞の相互作用、Ｌ１ＣＡＭ媒介性腫瘍成長、Ｌ１ＣＡＭ二量体化、および、ＥＲＫ、ＭＡＰＫ、ＡＫＴもしくはＦＡＫのＬ１ＣＡＭ媒介性リン酸化を阻害する方法。

【請求項8】

前記がんが乳がんである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記がんが肺がんである、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

がんを有する対象において、脳または骨への該がんの転移拡散を阻害するための組成物であって、該組成物は、免疫グロブリンまたは干渉ＲＮＡからなる群より選択される治療量のＬ１ＣＡＭ阻害剤を含み、該対象における該がんの細胞が、（ｉ）セルピンを過剰発現しており、該セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２であり、（ｉｉ）Ｌ１ＣＡＭを発現していると決定されていることを特徴とし、該Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が、血管のＬ１ＣＡＭ媒介性利用、Ｌ１ＣＡＭと内皮細胞の相互作用、Ｌ１ＣＡＭ媒介性腫瘍成長、Ｌ１ＣＡＭ二量体化、および、ＥＲＫ、ＭＡＰＫ、ＡＫＴもしくはＦＡＫのＬ１ＣＡＭ媒介性リン酸化を阻害する組成物。

【請求項11】

前記がんが乳がんである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記がんが肺がんである、請求項１０に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権主張
本出願は、その内容の全体が明細書に参考として援用される２０１３年９月１８日に出願された米国仮出願第６１／８７９５１４号に対する優先権を主張する。

【0002】

助成金情報
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により認定された助成金番号ＣＡ１６３１６７−０２およびＣＡ１２９２４３−０７の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0003】

１．序論
本発明は、対象におけるがんの転移拡散を阻害するための方法および組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、がん患者の、がんの転移拡散が発生するリスクが高いかどうかを決定するため、および、その場合に、患者を、転移拡散のリスクが低下するように治療するための方法および材料を提供する。

【背景技術】

【0004】

２．発明の背景
転移はがんによる死亡の主要な原因であるが、生物学的には、転移はどちらかというと非効率的なプロセスである。固形腫瘍を離れた大多数のがん細胞は消滅し、この減少の大半は、循環がん細胞が遠隔器官に浸潤すると起こる（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、２００２年；Ｆｉｄｌｅｒ、２００３年；Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ａ；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、２０１１年；ＶａｌａｓｔｙａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０１１年）。転移開始活性を実験的に富化させた細胞株でさえ、それらが浸潤した器官において大きな減少にさらされる。宿主実質における生存シグナルの欠如、がん幹細胞を支持する間質の欠乏、および自然免疫への過剰曝露が、播種性がん細胞の排除の原因であると仮定される。最近の研究により、腫瘍細胞の分散の初期のステップの機構およびマクロ転移増大の後期の機構が明らかになったが（ＶａｌａｓｔｙａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０１１年；ＶａｎｈａｒａｎｔａおよびＭａｓｓａｇｕｅ、２０１３年）、生命維持に必要な器官における播種性がん細胞の生存および適応を決定する因子が何であるかは依然として不明である。

【0005】

これらの因子を同定することは、脳転移の場合に特に重要である。脳での再発は最も大きな被害を及ぼすがんの合併症であり、典型的な特質として、急性神経性窮迫および高い死亡率を伴う（ＧａｖｒｉｌｏｖｉｃおよびＰｏｓｎｅｒ、２００５年；Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈら、２００２年）。脳転移の発生率は全ての原発性脳腫瘍を合わせた発生率の１０倍であり、今も上昇している（Ｍａｈｅｒら、２００９年）。肺がんおよび乳がんは脳転移の上位の出所であり、合わせると症例のほぼ３分の２を占める。黒色腫、結腸直腸がんおよび腎細胞癌が残りの大部分を占める（Ｂａｒｎｈｏｌｔｚ−Ｓｌｏａｎら、２００４年；Ｓｃｈｏｕｔｅｎら、２００２年）。しかし、実験モデルにおいて示された通り、浸潤性がん細胞の減少速度が特に高いのは脳内である（Ｈｅｙｎら、２００６年；Ｋｉｅｎａｓｔら、２０１０年；Ｐｅｒｅｒａら、２０１２年；Ｓｔｅｅｇら、２０１１年）。

【0006】

この現象と一致して、脳転移は、診療所におけるがんの後期合併症になる傾向があり（Ｆｅｌｄら、１９８４年；Ｋａｒｒｉｓｏｎら、１９９９年；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋｉｔｔｌｅｒら、２００３年）、他の器官に容易に転移する遺伝子操作された腫瘍を有するマウスにおいては稀である（Ｆｒａｎｃｉａら、２０１１年；Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎら、２００３年；Ｍｏｏｄｙら、２００２年；Ｒｅｇａｌｅｓら、２００９年；Ｓｉｅｇｅｌら、２００３年；Ｗｉｎｓｌｏｗら、２０１１年）。脳転移が最終的に出現した場合、病変は高度に侵攻性であり、療法に対して抵抗性である。この点はＨＥＲ２＋乳がんの脳転移の発生率が現在上昇していることにより劇的に例示され、該疾患は、ＨＥＲ２腫瘍タンパク質を標的とする抗体が頭蓋外疾患の制御には有効であるが脳転移に対しては有効でないものである（Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ、２００９年；ＬｉｎおよびＷｉｎｅｒ、２００７年；Ｐａｌｍｉｅｒｉら、２００７年；Ｓｌｅｄｇｅ、２０１１年；Ｓｔｅｍｍｌｅｒら、２００６年）。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

脳における転移細胞の大きな減少および診療所における脳転移の後期の出現により、循環がん細胞がこの器官におけるコロニー形成において主要なハードルに面することが立証される。１つの障害は、脳毛細血管壁の緊密性、血液脳関門（ＢＢＢ）である。がん細胞はＢＢＢを渡るために特別な機構を必要とし、このプロセスの分子メディエーターが最近同定された（Ｂｏｓら、２００９年；Ｌｉら、２０１３年）。しかし、細胞増殖を支持する間質シグナルおよび細胞自律活性が存在するにもかかわらず（Ｋｉｍら、２０１１年；Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ａ；Ｑｉａｎら、２０１１年；Ｓｅｉｋｅら、２０１１年）、ＢＢＢを通過する大多数のがん細胞は死滅する（Ｈｅｙｎら、２００６年；Ｋｉｅｎａｓｔら、２０１０年；Ｐｅｒｅｒａら、２０１２年；Ｓｔｅｅｇら、２０１１年）。興味深いことに、脳への浸潤に成功したがん細胞は、脳毛細血管の表面に接着し、血管周囲に溝として成長する顕著な特徴を示す。このように脈管構造を利用することができないがん細胞はまた、よく育つことができない（Ｋｉｅｎａｓｔら、２０１０年）。ＢＢＢを通過する大多数のがん細胞を死滅させるものは何か、および生存する少数の細胞が脈管構造を利用することを可能にするものは何かが生物学的および臨床的関心に関する問題である。

【0008】

３．発明の概要
本発明は、がん患者の、がんの転移拡散が発生するリスクが高いかどうかを決定するため、および、患者のリスクが高い場合に、患者を、転移のリスクが低下するように治療するための方法および組成物に関する。本発明は、少なくとも一部において、がん細胞によるセルピンの過剰発現およびセルピン分泌ならびにＬ１ＣＡＭ媒介性血管利用（ｃｏｏｐｔｉｏｎ）が肺がんおよび乳がんの脳への転移を促進するという発見、およびセルピンまたはＬ１ＣＡＭの拮抗作用が転移を減少させるという発見に基づく。

【0009】

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、がんを有する対象の、がんの転移を有するまたはそれが発生するリスクが高いかどうかを決定するための方法および組成物であって、がんの細胞がセルピンを過剰発現し、かつ／または分泌するかどうかを決定するステップを含む方法および組成物を提供し、ここで、がん細胞がセルピンを過剰発現し、かつ／または分泌している場合、対象の、がんの転移を有するまたはそれが発生するリスクが高い。ある特定の非限定的な実施形態では、前記対象は、脳への転移を有するまたはそれが発生するリスクが高い。

【0010】

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、セルピンを過剰発現し、かつ／または分泌するがんを有する対象を処置するための方法および組成物を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、血管利用に関連する細胞接着分子の活性が阻害される。例えば、Ｌ１ＣＡＭの活性が阻害される。他の非限定的な実施形態では、セルピン自体が阻害される。

【0011】

ある特定の非限定的な実施形態として、以下が挙げられる。
がんを有する対象において、がんの転移拡散を阻害する方法であって、がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するステップと、細胞がセルピンを過剰発現している場合に、対象を治療量のＬ１ＣＡＭ阻害剤を用いて処置するステップとを含む方法。

【0012】

−セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、上記の方法。

【0013】

−がんが乳がんである、上記の方法。

【0014】

−がんが肺がんである、上記の方法。

【0015】

−Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が免疫グロブリンである、上記の方法。

【0016】

−Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が干渉ＲＮＡである、上記の方法。

【0017】

−阻害される転移が脳への転移である、上記の方法。

【0018】

−阻害される転移が肺への転移である、上記の方法。

【0019】

−阻害される転移が肝臓への転移である、上記の方法。

【0020】

−阻害される転移が骨への転移である、上記の方法。

【0021】

がんに罹患している対象を処置する方法であって、（ｉ）対象の、がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定するステップであって、がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定することを含み、セルピンの過剰発現が、対象の、がんの転移拡散のリスクがより高いことを示すステップと、（ｉｉ）対象の転移拡散のリスクが高い場合に、転移の成長または発生を阻害し、それにより、がんの転移拡散のリスクを低下させる治療モダリティを実施または推奨するステップとを含む方法。

【0022】

−セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、上記の方法。

【0023】

−がんが乳がんである、上記の方法。

【0024】

−がんが肺がんである、上記の方法。

【0025】

−リスクが脳への転移のリスクである、上記の方法。

【0026】

−リスクが肺への転移のリスクである、上記の方法。

【0027】

−リスクが肝臓への転移のリスクである、上記の方法。

【0028】

−リスクが骨への転移のリスクである、上記の方法。

【0029】

対象の、がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定する方法であって、がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するステップであって、セルピンの過剰発現が、対象の、がんの転移拡散のリスクがより高いことを示すステップと、対象または医療従事者に決定の結果および関連するリスクを通知するステップとを含む方法。

【0030】

−セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、上記の方法。

【0031】

−がんが乳がんである、上記の方法。

【0032】

−がんが肺がんである、上記の方法。

【0033】

−リスクが脳への転移のリスクである、上記の方法。

【0034】

−リスクが肺への転移のリスクである、上記の方法。

【0035】

−リスクが肝臓への転移のリスクである、上記の方法。

【0036】

−リスクが骨への転移のリスクである、上記の方法。

【0037】

がんを有する対象の、がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定するためのキットであって、がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための手段と、セルピンの過剰発現が、対象の、がんの転移拡散のリスクがより高いことを示すことを示す使用説明書とを含むキット。

【0038】

−セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、上記のキット。

【0039】

−細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための手段が、免疫グロブリンまたはその断片を含む、上記のキット。

【0040】

−細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための手段が、ＰＣＲプライマーの対を含む、上記のキット。

【0041】

がんを有する対象において、がんの転移拡散を阻害する方法であって、がんの細胞が、（ｉ）セルピンを過剰発現しているかどうか、および（ｉｉ）Ｌ１ＣＡＭを発現しているかどうかを決定するステップと、細胞がセルピンを過剰発現しており、かつＬ１ＣＡＭを発現している場合に、対象を治療量のＬ１ＣＡＭ阻害剤を用いて処置するステップとを含む方法。

【0042】

−セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、上記の方法。

【0043】

−がんが乳がんである、上記の方法。

【0044】

−がんが肺がんである、上記の方法。

【0045】

−Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が免疫グロブリンである、上記の方法。

【0046】

−Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が干渉ＲＮＡである、上記の方法。

【0047】

−阻害される転移が脳への転移である、上記の方法。

【0048】

−阻害される転移が肺への転移である、上記の方法。

【0049】

−阻害される転移が肝臓への転移である、上記の方法。

【0050】

−阻害される転移が骨への転移である、上記の方法。

【0051】

がんを有する対象の、がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定するためのキットであって、がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための手段と、セルピンの過剰発現が、対象の、がんの転移拡散のリスクがより高いことを示すことを示す使用説明書とを含むキット。

【0052】

−セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、上記のキット。

【0053】

−細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための手段が、免疫グロブリンまたはその断片を含む、上記のキット。

【0054】

−細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための手段が、ＰＣＲプライマーの対を含む、上記のキット。

【0055】

−使用説明書が、対象のがん細胞がセルピンを過剰発現している場合にはＬ１ＣＡＭ阻害剤を用いて対象を処置するべきであるという推奨を含む、上記のキット。

【0056】

がんを有する対象の、がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定するためのキットであって、がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうか、およびＬ１ＣＡＭを発現しているかどうかを決定するための手段と、セルピンの過剰発現が、対象の、がんの転移拡散のリスクがより高いことを示し、Ｌ１ＣＡＭの発現が、リスクがより高い対象にＬ１ＣＡＭ阻害剤療法から利益を受け得ることを示すことを示す使用説明書とを含むキット。

【0057】

−セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、上記のキット。

【0058】

−細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための手段が、免疫グロブリンまたはその断片を含む、上記のキット。

【0059】

−細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための手段が、ＰＣＲプライマーの対を含む、上記のキット。

【0060】

−細胞がＬ１ＣＡＭを発現しているかどうかを決定するための手段が、免疫グロブリンまたはその断片を含む、上記のキット。

【0061】

−細胞がＬ１ＣＡＭを発現しているかどうかを決定するための手段が、ＰＣＲプライマーの対を含む、上記のキット。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
対象におけるがんの転移拡散を阻害する方法であって、該がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するステップと、該細胞が該セルピンを過剰発現している場合に、該対象を治療量のＬ１ＣＡＭ阻害剤を用いて処置するステップとを含む方法。
（項目２）
前記セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記がんが乳がんである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記がんが肺がんである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が免疫グロブリンである、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が干渉ＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目７）
阻害される前記転移が脳への転移である、項目１に記載の方法。
（項目８）
阻害される前記転移が肺への転移である、項目１に記載の方法。
（項目９）
阻害される前記転移が肝臓への転移である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
阻害される前記転移が骨への転移である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
がんに罹患している対象を処置する方法であって、（ｉ）該対象の、該がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定するステップであって、該がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定することを含み、該セルピンの過剰発現が、該対象の、該がんの転移拡散のリスクがより高いことを示すステップと、（ｉｉ）該対象の転移拡散のリスクが高い場合に、転移の成長または発生を阻害し、それにより、該がんの転移拡散の該リスクを低下させる治療モダリティを実施または推奨するステップとを含む方法。
（項目１２）
前記セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記がんが乳がんである、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記がんが肺がんである、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記リスクが、脳への転移のリスクである、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記リスクが、肺への転移のリスクである、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記リスクが、肝臓への転移のリスクである、項目１１に記載の方法。
（項目１８）
前記リスクが、骨への転移のリスクである、項目１１に記載の方法。
（項目１９）
対象の、がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定する方法であって、該がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するステップであって、該セルピンの過剰発現が、該対象の、該がんの転移拡散のリスクが高いことを示すステップと、該対象または医療従事者に決定の結果および関連するリスクを通知するステップとを含む方法。
（項目２０）
前記セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記がんが乳がんである、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記がんが肺がんである、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記リスクが、脳への転移のリスクである、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記リスクが、肺への転移のリスクである、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記リスクが、肝臓への転移のリスクである、項目１９に記載の方法。
（項目２６）
前記リスクが、骨への転移のリスクである、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
がんを有する対象において、該がんの転移拡散を阻害する方法であって、該がんの細胞が、（ｉ）セルピンを過剰発現しているかどうか、および（ｉｉ）Ｌ１ＣＡＭを発現しているかどうかを決定するステップと、該細胞が該セルピンを過剰発現しており、かつＬ１ＣＡＭを発現している場合に、該対象を治療量のＬ１ＣＡＭ阻害剤を用いて処置するステップとを含む方法。
（項目２８）
前記セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記がんが乳がんである、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記がんが肺がんである、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が免疫グロブリンである、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
前記Ｌ１ＣＡＭ阻害剤が干渉ＲＮＡである、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
阻害される前記転移が脳への転移である、項目２７に記載の方法。
（項目３４）
阻害される前記転移が肺への転移である、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
阻害される前記転移が肝臓への転移である、項目２７に記載の方法。
（項目３６）
阻害される前記転移が骨への転移である、項目２７に記載の方法。
（項目３７）
がんを有する対象の、該がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定するためのキットであって、該がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための手段と、該セルピンの過剰発現が、該対象の、該がんの転移拡散のリスクがより高いことを示すことを示す使用説明書とを含むキット。
（項目３８）
前記セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、項目３７に記載のキット。
（項目３９）
細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための前記手段が、免疫グロブリンまたはその断片を含む、項目３７に記載のキット。
（項目４０）
細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための前記手段が、ＰＣＲプライマーの対を含む、項目３７に記載のキット。
（項目４１）
前記使用説明書が、前記対象の前記がん細胞がセルピンを過剰発現している場合にはＬ１ＣＡＭ阻害剤を用いて該対象を処置するべきであるという推奨を含む、項目３７に記載のキット。
（項目４２）
がんを有する対象の、該がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定するためのキットであって、該がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうか、およびＬ１ＣＡＭを発現しているかどうかを決定するための手段と、該セルピンの過剰発現が、該対象の、該がんの転移拡散のリスクがより高いことを示し、Ｌ１ＣＡＭの発現が、リスクがより高い対象がＬ１ＣＡＭ阻害剤療法から利益を受け得ることを示すことを示す使用説明書とを含むキット。
（項目４３）
前記セルピンがニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＤ１またはセルピンＥ２である、項目４２に記載のキット。
（項目４４）
細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための前記手段が、免疫グロブリンまたはその断片を含む、項目４２に記載のキット。
（項目４５）
細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定するための前記手段が、ＰＣＲプライマーの対を含む、項目４２に記載のキット。
（項目４６）
細胞がＬ１ＣＡＭを発現しているかどうかを決定するための前記手段が、免疫グロブリンまたはその断片を含む、項目４２に記載のキット。
（項目４７）
細胞がＬ１ＣＡＭを発現しているかどうかを決定するための前記手段が、ＰＣＲプライマーの対を含む、項目４２に記載のキット。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1A】図１Ａ〜Ｉは、ＰＡ阻害性セルピンと脳転移表現型の関連性を示す図である。（Ａ）脳転移性ではない対応物におけるレベルと比較した脳転移細胞株におけるセルピンｍＲＮＡレベルを示す。ｑＲＴ−ＰＣＲ値は、少なくとも３つの独立した反応の平均である。転移細胞の供給源が示されている。ＴＮ、トリプルネガティブ乳がん；ＥＲ−、エストロゲン受容体陰性、ＰＲ−、プロゲステロン受容体陰性。（Ｂ）親ＭＤＡ２３１細胞株および骨、肺、または脳への転移性トロピズムを有する誘導体における、示されているセルピンのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。各グラフ内の棒は、左から右に、親、骨転移、肺転移、および脳転移である。エラーバー、９５％信頼区間。（Ｃ）異なるＫｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^−／−マウス肺がん細胞株を接種した免疫適格性マウス由来の脳の代表的なｅｘ ｖｉｖｏ生物発光（ＢＬＩ）画像を示す。脳転移が発生しているマウスの百分率および平均ＢＬＩ光子束シグナルが示されている。ｎ＝１０。（Ｄ）ｑＲＴＰＣＲ分析に基づいた、Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^−／−誘導体におけるセルピンｍＲＮＡ発現のヒートマップを示す。（Ｅ）セルピン−ＰＡ−プラスミンカスケードの要約を示す。（Ｆ）示されている細胞株の細胞培養上清によるプラスミノーゲンのプラスミンへの変換の阻害を示す。プラスミン活性を発色アッセイによって決定した。データは、３連の実験からの平均±ＳＥＭである。（Ｇ）原発腫瘍におけるＳＥＲＰＩＮＢ２ ｍＲＮＡレベルおよびＳＥＲＰＩＮＩ１ ｍＲＮＡレベルに基づいて分類された肺腺癌１０６症例における無脳転移生存期間のカプラン・マイヤー解析を示す。Ｐ値はコックス比例ハザードモデルから算出し、ＳＥＲＰＩＮＢ２およびＳＥＲＰＩＮＩ１発現を連続変数として扱った。（Ｈ）ニューロセルピンまたはセルピンＢ２に対する抗体で染色した肺がんおよび乳がん由来の代表的なヒト脳転移試料を示す。（Ｉ）非小細胞肺癌３３症例および乳癌１２３症例における、ニューロセルピン免疫染色（赤色）またはセルピンＢ２免疫染色（オレンジ色）について陽性とスコアリングされた転移試料の割合を示す。乳がんセットの小さな図は、当該情報が入手可能であったセルピン陽性試料の原発腫瘍サブタイプ（ＴＮ、トリプルネガティブ；ＨＥＲ２、ＨＥＲ２＋；ＥＲ／ＰＲ、ホルモン受容体陽性；ＴＰ、トリプルポジティブ）を表す。両方のセルピンに対して陽性とスコアリングされた脳転移は、肺がんおよび乳がん症例のそれぞれ４２％および３４％を構成する。陽性とスコアリングされた試料は＞８０％の、陽性反応性を示す新生細胞を有した。スケールバー：１００μｍ。

【図1BCD】同上

【図1EFG】同上

【図1HI】同上

【0063】

【図2ABCD】図２Ａ〜Ｏは、血管利用、増大、および間質プラスミン作用の回避を示す図である。（Ａ）転移細胞の脳毛細血管との相互作用を示す。ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞（緑色）は、血管外遊出完了後に脳毛細血管（赤色）に結合したままである。（Ｂ）血管外遊出ステップの共焦点分析を示し、脳毛細血管において血管内に留まっているＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞、毛細血管壁を通過する細胞、および反管腔側毛細血管表面にわたって拡散している、血管外遊出した細胞が示されている。（Ｃ）脳毛細血管周囲に溝を形成する血管外遊出したＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞のクラスターを示す。血管外遊出した細胞は全て、最初にこのように成長した。赤色またはマゼンタ色、脈管構造内のＩＶ型コラーゲン。緑色、ＧＦＰ。青色、ビス−ベンズアミドを用いた核染色。（Ｄ）脳の転移コロニー形成の間の最初のステップおよび相互作用を表す模式図である。（Ｅ）がん細胞を循環中に接種した後の異なる時点での、脳実質における転移性Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞のＧＦＡＰ＋反応性アストロサイト（矢じり）への曝露を示す。３日目：赤色、ＩＶ型コラーゲン；白色、ＧＦＡＰ；緑色、ＧＦＰ＋がん細胞。７日目以降：赤色、ＧＦＡＰ；緑色、ＧＦＰ；青色、核染色。（Ｆ、Ｇ）ＧＦＰ＋Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞（緑色）を有するマウス脳におけるＧＦＡＰ＋アストロサイト（青色）に関連するｔＰＡおよびｕＰＡ免疫蛍光染色（赤色、矢じり）を示す。（Ｈ）プラスミノーゲン免疫蛍光染色（白色、矢じり）は、マウス脳におけるＧＦＰ＋転移細胞のクラスター（緑色）の近くのＮｅｕＮ＋ニューロン体（赤色）に関連する。青色、核染色。（Ｉ）脳切片器官型培養の模式図である。切片の表面上に置いたがん細胞は組織内に遊走し、微小毛細血管（ｍｉｃｒｏｃａｐｉｌｌａｒｙ）を探す。（Ｊ）まだ脳毛細血管を巡回している浸潤したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞（白抜きの矢じり）またはすでに脳毛細血管を越えて拡散した浸潤したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞（黒塗りの矢じり）を有する脳切片の代表的な画像である。（Ｋ）示されているがん細胞が浸潤した脳切片組織の代表的な共焦点像を示す。α２−抗プラスミンを示されている培養物に添加した。ＢｒＭ３細胞またはα２−抗プラスミンを用いた親細胞の伸びた形態と比較して親細胞の密度が低く、様相が乱れていることに注意されたい。（Ｌ）パネルＫの実験におけるＧＦＰ＋がん細胞の数量化を示す。視野（ＦＯＶ）当たりの細胞の数は、平均±ＳＥＭである。ｎ＝６〜１０の脳切片、少なくとも２回の独立した実験において切片当たり少なくとも２視野をスコアリング。（Ｍ）示されている細胞および添加物を有する脳切片における切断カスパーゼ−３免疫蛍光染色を示す。（Ｎ）パネルＭの実験における切断カスパーゼ−３陽性がん細胞の数量化を示す。値は、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３に対して標準化したものであり、平均±ＳＥＭである。ｎ＝６〜１０の脳切片、少なくとも２回の独立した実験から切片当たり少なくとも２視野をスコアリング。（Ｏ）それぞれプラスミノーゲンおよびＰＡの供給源としてのニューロンおよびアストロサイト、ならびに生じたプラスミンの浸潤性がん細胞に対する致死効果を示す概略図である。Ｐ値は全てスチューデントのｔ検定によるものである。スケールバー：２５μｍ（Ａ）、５μｍ（Ｂ〜Ｃ）、５μｍ（３日目）、１５μｍ（７日目）、２５μｍ（１４日目）、７０μｍ（微小転移）、１００μｍ（マクロ転移）（Ｄ）、１０μｍ（Ｆ〜Ｈ）、１００μｍ（Ｋ）、５μｍ（Ｍ）。

【図2E】同上

【図2FGHIJ】同上

【図2KLM】同上

【図2NO】同上

【0064】

【図3ABC】図３Ａ〜Ｎは、ニューロセルピンが脳転移を媒介することを示す図である。（Ａ）実験計画の模式図である。マウスにおいて、がん細胞を動脈循環中に接種した後、脳転移が発生する。脳病変を、がん細胞におけるホタルルシフェラーゼの発現に基づく生物発光イメージング（ＢＬＩ）、およびＧＦＰの発現に基づく免疫蛍光法（ＩＦ）によって分析する。（Ｂ）対照ｓｈＲＮＡまたはニューロセルピンｓｈＲＮＡ（ｓｈＮＳ）を用いて形質導入したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞を接種した５週間後の、全身ＢＬＩおよび脳ｅｘ ｖｉｖｏ ＢＬＩの代表的な画像である。（Ｃ）パネルＢの実験における無脳転移生存期間のカプラン・マイヤープロットを示す。対照（ｎ＝２０）および２つの異なるｓｈＮＳ［ｓｈＮＳ（１）、ｎ＝１１；ｓｈＮＳ（２）、ｎ＝１３］を解析した。ログランクマンテル・コックス検定を用いてＰ値を得た。（Ｄ）パネルＢからの脳におけるｅｘ ｖｉｖｏ ＢＬＩの数量化を示す。（Ｅ）Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞をマウスに接種した２１日後または３５日後にＧＦＰ ＩＦについて分析した冠状脳切片の代表的な画像を示す。病変の輪郭が顕著である。（Ｆ）パネルＥにおける２１日目の時点でのサイズに応じた脳病変の数量化を示す。対照ｎ＝５の脳、ｓｈＮＳ ｎ＝６の脳。Ｐ値はサイズ分布を指す。病変の総数について、ｐ＜０．０５。（Ｇ）パネルＥの実験における脳腫瘍量の数量化を示す。対照ｎ＝５、ｓｈＮＳ ｎ＝６。（Ｈ）脳切片アッセイにおける対照およびニューロセルピン枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞の代表的な画像を示す。挿入図は切断カスパーゼ−３免疫蛍光を示す。（Ｉ）パネルＨの実験におけるＧＦＰ＋細胞の数量化を示す。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝６〜１０の切片、少なくとも２回の独立した実験において切片当たり少なくとも２視野をスコアリング。（Ｊ）パネルＨの実験において切断カスパーゼ−３について陽性であった細胞の数量化を示す。値を対照群に対して標準化した。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝６〜１０の切片、少なくとも２回の独立した実験から切片当たり少なくとも２視野をスコアリング。（Ｋ、Ｌ）親およびＢｒＭ細胞株と比較した、切断カスパーゼ−３について陽性であった細胞の数量化、およびニューロセルピン野生型または変異体型の過剰発現の効果では親細胞株Ｈ２０３０（Ｋ）およびＭＤＡ２３１（Ｌ）においてＰＡ（ＮＳ^{Δｌｏｏｐ}）を標的とすることができないことを示す。値を対応するＢｒＭ細胞株に対して標準化した。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝６〜１０の切片、少なくとも２回の独立した実験から切片当たり少なくとも２視野をスコアリング。（Ｍ）ＰＣ９−ＢｒＭ３を接種した２１日後のマウスの脳および後肢の代表的なｅｘ ｖｉｖｏ ＢＬＩ画像である。細胞に、空ベクター（ｎ＝５）または野生型ニューロセルピンをコードするベクター（ｎ＝７）または£Ｇｌｏｏｐニューロセルピン変異体をコードするベクター（ｎ＝８）を用いて形質導入した。（Ｎ）パネルＭの実験における、脳における光子束と骨における光子束の比を示す。ｅｘ ｖｉｖｏにおける脳平均ＢＬＩ値も示されている。Ｐ値は、パネルＣ以外は全てスチューデントのｔ検定によって算出した。スケールバー：２５０μｍ（Ｅ）、１００μｍ、５μｍ（挿入図）（Ｈ）。

【図3DEFGH】同上

【図3IJKL】同上

【図3MN】同上

【0065】

【図4ABC】図４Ａ〜Ｈは、抗ＰＡセルピンが乳がん細胞の脳転移を媒介することを示す図である。（Ａ、Ｂ）対照ベクター、ニューロセルピン、ＳＥＲＰＩＮＢ２およびＳＥＲＰＩＮＤ１を標的とするｓｈＲＮＡベクター（三重Ｋ／Ｄ）、ＳＥＲＰＩＮＢ２ ｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＢ２）、またはｓｈＳＢ２＋ニューロセルピン発現ベクターを用いて形質導入したＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞を免疫不全マウスの動脈循環に接種した。脳転移量をｅｘ ｖｉｖｏ脳ＢＬＩによって可視化し（Ａ）、定量化した（Ｂ）。対照ｎ＝２２；三重Ｋ／Ｄ ｎ＝９、ｓｈＳＢ２ ｎ＝１４；ｓｈＳＢ２およびニューロセルピンｎ＝８。（Ｃ）ＭＤＡ２１３−ＢｒＭ２集団から単離した１０のクローン細胞株の中で、示されているセルピンの１つ、２つまたは３つを過剰発現しているクローン（単一細胞後代_ｉＶＳＣＰ−）の分布を示す。（Ｄ）注射した異なるＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２ ＳＣＰからのｅｘ ｖｉｖｏ脳ＢＬＩ数量化を示す。赤色ドットのＳＣＰ（全てのセルピンが高レベル）、ｎ＝８；淡緑色ドットのＳＣＰ（セルピンＢ２が低レベル）、ｎ＝１１；青色ドットのＳＣＰ（セルピンＢ２およびＤ１が低レベル）、ｎ＝８；濃緑色ドットのＳＣＰ（セルピンＢ２およびニューロセルピンが低レベル）、ｎ＝５。Ｐ値はスチューデントのｔ検定によって決定した。（Ｅ）ニューロセルピンおよびセルピンＤ１が高レベルであるＳＣＰをニューロセルピンノックダウンに供し、脳転移活性について試験した。２１日後に転移量をｅｘ ｖｉｖｏ脳ＢＬＩによって定量化した。（Ｆ）コンジェニック親ＥｒｂＢ２−Ｐ細胞を接種した免疫適格性マウス（ｎ＝９）または脳転移性誘導体であるＥｒｂＢ２−ＢｒＭ１を接種した免疫適格性マウス（ｎ＝７）およびＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２を接種した免疫適格性マウス（ｎ＝５）における無脳転移生存期間についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。ログランクマンテル・コックス検定を使用して生存曲線を比較した。ＥｒｂＢ２−Ｐ対ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ１、Ｐ＝０．００４５、およびＥｒｂＢ２−Ｐ対ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２、Ｐ＝０．００５３。（Ｇ）ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２またはセルピンＢ２ ｓｈＲＮＡを発現するこれらの細胞によって形成された転移病変の代表的な全身ＢＬＩ画像を示す。（Ｈ）パネルＧの実験における脳ＢＬＩ光子束の数量化を示す。対照ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２細胞（ｎ＝１０）、および２つの異なるセルピンＢ２ ｓｈＲＮＡ、ｓｈＳＢ２（１）、ｎ＝１０；ｓｈＳＢ２（２）、ｎ＝６を発現するＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２細胞を分析した。データは平均±ＳＥＭである。Ｐ値は、パネルＧ以外は全てスチューデントのｔ検定によって決定した。

【図4DEFGH】同上

【0066】

【図5ABCDE】図５Ａ〜Ｏは、ニューロセルピンが、がん細胞をＦａｓＬ死滅シグナルから遮蔽することを示す図である。（Ａ）ＦａｓＬ、およびＦａｓＬの、Ｆａｓ−ＦＡＤＤシグナル伝達を通じたアポトーシスの拡散性トリガーであるｓＦａｓＬへのプラスミンによる変換の模式図である。ＴＭＤ、膜貫通ドメイン；ＳＡ、三量体自己組織化ドメイン；ＴＨＤ、腫瘍壊死因子−相同性ドメイン。赤い十字記号、アポトーシス細胞。ａ、アストロサイト。ｃ、がん細胞。（Ｂ）Ｈ２０３０−ＢｒＭ３を動脈に接種した２１日後の、転移細胞を有するマウス脳における、ＧＦＰに対する抗体（がん細胞、緑色）、ＧＦＡＰに対する抗体（反応性アストロサイト、青色）およびＦａｓＬに対する抗体（マゼンタ色）を用いた免疫蛍光法を示す。（Ｃ）外因性プラスミノーゲン（１μＭ）と一緒に、または添加を伴わずにインキュベートしたアストロサイト培養物の画像である。ＦａｓＬの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）または細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に対する抗体を用いて免疫蛍光染色を実施した。（Ｄ）抗ＦａｓＬ ＥＣＤ抗体を使用した、パネルＣに示されている培養物の上清のウエスタン免疫ブロッティングを示す。チューブリンをローディング対照として使用した。（Ｅ）マウス脳切片を、α２−抗プラスミンと一緒に、ニューロセルピンおよびセルピンＢ２と一緒に、または添加を伴わずにインキュベートした。組織溶解物中のｓＦａｓＬを、抗ＦａｓＬ ＥＣＤ抗体を用いたウエスタン免疫ブロッティング分析によって検出した。（Ｆ）ＧＦＰ＋Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞（緑色）を、ｓＦａｓＬを添加した培地または添加を伴わない培地中の脳切片に浸潤させた。ｓＦａｓＬを伴うと、がん細胞はアポトーシスマーカーである切断カスパーゼ−３について陽性にスコアリングされた（挿入図の赤色）。（Ｇ、Ｈ）パネルＦの実験（オレンジ色の棒）およびパネルＩの実験（緑色の棒）における、ＧＦＰ＋細胞の総数（Ｇ）およびアポトーシスＧＦＰ＋細胞（Ｈ）の数量化を示す。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝６〜１０の切片、少なくとも２回の独立した実験から切片当たり少なくとも２視野をスコアリング。（Ｉ）ＧＦＰ＋Ｈ２０３０細胞（緑色）を、抗ＦａｓＬ遮断抗体を含有する培地または添加を伴わない培地中の脳切片に浸潤させた。抗ＦａｓＬは、内在性シグナルがカスパーゼ−３活性化を誘発するのを妨げた（挿入図の赤色）。（Ｊ）がん細胞におけるアポトーシス促進性Ｆａｓシグナル伝達を抑制するためのＦＡＤＤ−ＤＤ過剰発現（黄色の形）の描写である。（Ｋ）示されている通り、ＦＡＤＤ−ＤＤベクター、ニューロセルピンｓｈＲＮＡベクター、または空ベクターを用いて形質導入したＨ２０３０−ＢｒＭ３におけるＦＡＤＤ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。（Ｌ）示されているベクターを用いて形質導入したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞にｓＦａｓＬを添加した後のアポトーシス細胞の数量化を示す。（Ｍ、Ｎ）示されているＧＦＰ＋Ｈ２０３０−ＢｒＭ３トランスフェクタントおよび／または添加物を有する脳切片における、総ＧＦＰ＋細胞（Ｍ）およびアポトーシスＧＦＰ＋細胞（Ｎ）の数量化を示す。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝５〜８の切片、少なくとも２回の独立した実験から切片当たり少なくとも２視野をスコアリング。（Ｏ）示されているベクターを用いて形質導入し、マウスの動脈循環中に接種したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞の脳転移活性を示す。対照ｓｈＲＮＡ（ｎ＝１１）、ＦＡＤＤ−ＤＤ（ｎ＝４）、ニューロセルピンｓｈＲＮＡ（ｎ＝１４）、またはこのｓｈＲＮＡおよびＦＡＤＤ−ＤＤ（ｎ＝１２）を用いて形質導入した細胞においてＢＬＩ光子束を定量化した。Ｐ値は全てスチューデントのｔ検定によって決定した。スケールバー：２５μｍ（Ｂ）、２００μｍ（Ｃ）、１００μｍ（Ｆ、Ｉ）、５μｍ（Ｆ、Ｉの挿入図）。

【図5FGH】同上

【図5IJKL】同上

【図5MNO】同上

【0067】

【図6ABCD】図６Ａ〜Ｎは、プラスミンが、Ｌ１ＣＡＭにより媒介される脳転移細胞による血管利用を標的とすることを示す図である。（Ａ）同種親和性細胞接着相互作用のメディエーターおよび異種親和性細胞接着相互作用のメディエーター（例えば、インテグリン）としてのＬ１ＣＡＭ、ならびに、Ｌ１ＣＡＭの接着欠損断片へのプラスミンによる変換の模式図である。免疫グロブリン様（Ｉｇ）およびフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）ドメインリピート、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、およびインテグリン結合性ＲＧＤ配列が示されている。（Ｂ）ＧＦＰ＋Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞の浮遊液をヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）の単層の上部に置き、２０分後に、ＨＢＭＥＣと結合したがん細胞を、ＧＦＰ、Ｌ１ＣＡＭ免疫染色、およびビス−ベンズアミドを用いた核染色についてイメージングした。Ｌ１ＣＡＭはがん細胞において高度に発現し、ＨＢＭＥＣではより低いレベルで発現する。（Ｃ、Ｄ）ＨＢＭＥＣ単層（Ｃ）またはＨ２０３０−ＢｒＭ３単層（Ｄ）へのＨ２０３０−ＢｒＭ３の結合の分析、およびＬ１ＣＡＭノックダウンの影響を示す。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝５、カバーガラス当たり少なくとも１０視野をスコアリング。（Ｅ）無処理対照と比較した、示されている、Ｌ１ＣＡＭ ｓｈＲＮＡを発現している脳細胞またはプラスミンと一緒にインキュベートした脳細胞における細胞表面Ｌ１ＣＡＭのフローサイトメトリー分析を示す。（Ｆ）プラスミンと一緒に、またはプラスミンを伴わずにインキュベートした後の細胞および培養上清の抗Ｌ１ＣＡＭウエスタン免疫ブロッティング分析を示す。（Ｇ、Ｈ）がん細胞をプラスミンで処理し、ＨＢＭＥＣ接着アッセイに供した。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝３、カバーガラス当たり少なくとも５視野をスコアリング。（Ｉ）脳組織切片への浸潤後の対照またはＬ１ＣＡＭ枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞を示す。２日後にＧＦＰ＋がん細胞（緑色）および脈管構造（ＩＶ型コラーゲン免疫染色、赤色）を可視化した。条件ごとに２つの代表的な画像が示されている。下のパネル、高拡大率。（Ｊ、Ｋ）パネルＩの実験における、毛細血管上に拡散した細胞（Ｊ）およびＫｉ６７＋細胞上に拡散した細胞（Ｋ）の数量化を示す。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝６の切片、２回の独立した実験から、切片当たり少なくとも３視野をスコアリング。（Ｌ）ニューロセルピン過剰発現およびＬ１ＣＡＭ枯渇の、ＰＣ９−ＢｒＭ３細胞と脳切片内の毛細血管の相互作用に対する影響を示す。（Ｍ、Ｎ）パネルＬの実験において、毛細血管上に拡散した細胞（Ｍ）およびＫｉ６７＋細胞上に拡散した細胞（Ｎ）の数量化を示す。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝６の切片、２回の独立した実験から切片当たり少なくとも３視野をスコアリング。Ｐ値は全てスチューデントのｔ検定によるものである。スケールバー：１０μｍ（Ｂ）、５０μｍ（Ｉ、Ｌ）。

【図6EFGH】同上

【図6IJK】同上

【図6LMN】同上

【0068】

【図7ABCDE】図７Ａ〜Ｉは、Ｌ１ＣＡＭが脳における転移増大を媒介することを示す図である。（Ａ）Ｈ２０３０−ＢｒＭ３によって形成された初発脳コロニーの、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を用いた免疫組織化学的染色およびＨ＆Ｅ対比染色を示す。がん細胞（ｃｃ、淡青色の核）は互いに接近したままで、内皮細胞（ｅ、濃青色の核）と相互作用する。挿入図は、細胞間接触領域について拡大率を上げたものである。（Ｂ）示されているＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞を動脈に接種したマウスの代表的な脳のｅｘ ｖｉｖｏ ＢＬＩを示す。（Ｃ）パネルＢの実験における、ｅｘ ｖｉｖｏにおける脳光子束の数量化を示す。対照ｓｈＲＮＡ、ｎ＝９；ｓｈＬ１ＣＡＭ、ｎ＝６。（Ｄ）示されているＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞を動脈に接種したマウスの脳のｅｘ ｖｉｖｏ ＢＬＩの数量化を示す。対照ｓｈＲＮＡ、ｎ＝９；ｓｈＬ１ＣＡＭ、ｎ＝１０。（Ｅ）心臓内注射の７日後に脳に浸潤しているＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞、およびＬ１ＣＡＭ枯渇の影響を示す。（Ｆ）パネルＣの脳からのＧＦＰ＋転移病変の代表的な画像である。（Ｇ）パネルＣに示されている脳における、微小転移に対するマクロ転移の相対的な存在量（図３Ｆにおいて定義されている）を示す。病変の数：対照＝２８３．２±８４．８、ｓｈＬ１ＣＡＭ＝６９．８±１１．５。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝３の脳。（Ｈ）示されているＰＣ９−ＢｒＭ３細胞を動脈に接種したマウスの脳のｅｘ ｖｉｖｏ ＢＬＩ光子束の数量化を示す（ｎ＝５〜７）。Ｐ値は全てスチューデントのｔ検定によって決定した。スケールバー：２５μｍ（Ａ）、３０μｍ（Ｅ）、２００μｍ（Ｆ）。（Ｉ）脳に浸潤するがん細胞に対する間質ＰＡ−プラスミン系の作用のモデル、および間質ＰＡ−プラスミンからの脳転移細胞の保護における抗ＰＡセルピンの役割を示す。反応性アストロサイトは血管外遊出したがん細胞の存在下でＰＡを産生する。ＰＡがニューロン由来プラスミノーゲンからプラスミンを生成し、プラスミンがアストロサイトからＦａｓＬを動員してがん細胞を死滅させると、転移は失敗する（左側）。さらに、プラスミンは、がん細胞が血管利用のために発現する細胞接着分子であるＬ１ＣＡＭを切断し、不活化する。脳転移細胞が、プラスミンの生成ならびにがん細胞の生存および血管への付着に対するプラスミンの有害作用を妨げる抗ＰＡセルピンを発現すると、転移が進行する（右側）。

【図7FGHI】同上

【0069】

【図8ABC】図８Ａ〜Ｊは、脳転移モデルおよび臨床的な試料において高度に発現する遺伝子を示す図である（図１Ａ〜Ｉに関連する）。（Ａ）以前に２つの肺腺癌脳転移モデル（Ｈ２０３０−ＢｒＭ３およびＰＣ９−ＢｒＭ３；Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年）において、または２つの乳がん脳転移モデル（ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２およびＣＮ３４−ＢｒＭ２；Ｂｏｓら、２００９年）において脳転移活性と関連付けられ、これらのモデルの中で共有されることが見いだされた遺伝子を示す。値は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ転写データセット（Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年、Ｂｏｓら、２００９年）内の非脳転移対応物と比較した、ＢｒＭ細胞におけるこれらの遺伝子の発現の増加倍率を示す。（Ｂ）遺伝子操作されたＫｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^−／−マウス肺腫瘍に由来する細胞株（３７３Ｎ１、３９３Ｎ１、４８２Ｎ１、２６９１Ｎ１）を、同系のマウスの動脈循環からの全体的な転移活性について試験した。無転移生存期間のカプラン・マイヤープロット、細胞株当たりｎ＝１０のマウス。以前に記載されている通り、全ての細胞株は多器官転移活性を示したが（Ｗｉｎｓｌｏｗら、２０１１年）、脳転移活性は異なった。（Ｃ）ＥＬＩＳＡによって決定した、低血清細胞培養上清におけるニューロセルピン（ＮＳ）タンパク質レベルを示す。（Ｄ）ウエスタン免疫ブロッティングによって決定した、細胞溶解物におけるセルピンＢ２（ＳＢ２）タンパク質レベルを示す。（Ｅ）示されている細胞株からの細胞培養上清により、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換が異なる程度に阻害されたことを示す。プラスミン活性を発色アッセイによって決定した。Ｐ値はスチューデントのｔ検定によって決定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｆ、Ｇ）原発腫瘍におけるＳＥＲＰＩＮＢ２ ｍＲＮＡレベルおよびＳＥＲＰＩＮＩ１ ｍＲＮＡレベルに基づいて分類された肺腺癌１０６症例における無骨転移生存期間および対側無肺転移生存期間のカプラン・マイヤー解析を示す。Ｐ値はコックス比例ハザードモデルによって算出し、ＳＥＲＰＩＮＢ２およびＳＥＲＰＩＮＩ１発現を連続変数として扱った。（Ｈ）原発腫瘍におけるＳＥＲＰＩＮＢ２ ｍＲＮＡレベルおよびＳＥＲＰＩＮＩ１ ｍＲＮＡレベルに基づいて分類された乳腺癌６１５症例（ＥＭＣ−ＭＳＫデータセット）における無脳転移生存期間のカプラン・マイヤー解析を示す。Ｐ値はコックス比例ハザードモデルから算出し、ＳＥＲＰＩＮＢ２およびＳＥＲＰＩＮＩ１発現を連続変数として扱った。（Ｉ）示されている細胞株を心臓内に接種したマウスの脳におけるＮＳおよびＳＢ２に対する免疫組織化学的検査を示す。（Ｊ）ニューロセルピンまたはセルピンＢ２抗体を用いて染色した代表的な脳転移組織マイクロアレイコアを示す。スケールバー：１００μｍ。

【図8DEF】同上

【図8GHIJ】同上

【0070】

【図9AB】転移細胞と脳実質の相互作用を示す図である（図２Ａ〜Ｏに関連する）。（Ａ）循環がん細胞によって形成された脳転移コロニーの分析についての実験計画を示す。（Ｂ）マウスの動脈循環中に接種した後の、示されている時点での脳における親ＭＤＡ２３１（Ｐ）およびＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２（ＢｒＭ）細胞の数量化を示す。データは、２つの脳における多数の視野の平均±ＳＥＭである。Ｐ値は、７日目前後の親集団および脳転移集団における血管外遊出した細胞を比較して、スチューデントのｔ検定によって決定した。（Ｃ、Ｄ）接種の７日後に脳毛細血管（ＩＶ型コラーゲン陽性）の内腔に留まった細胞（ビメンチン＋、緑色）が切断カスパーゼ−３免疫蛍光について陽性にスコアリングされたことを示す（赤色、Ｄの矢じり）。（Ｅ、Ｆ）関与しない領域に位置する非反応性アストロサイト（Ｅ）、および転移細胞を含有する領域内の反応性アストロサイト（Ｆ）を、毛細血管との相互作用の改変、ならびに肥厚および細胞プロセスの数の低下を含めた劇的な形態学的変化に基づいて区別することができることを示す。（Ｇ〜Ｊ）Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞と、顕性転移による血管外遊出に由来する反応性小膠細胞（Ｉｂａ１＋）およびニューロン（ＮｅｕＮ＋）を含めた脳微小環境の異なる成分の相互作用を示す。（Ｋ）Ｄ−ＶＬＫ発色プラスミン基質アッセイを使用して、マウス小膠細胞またはアストロサイトの培養上清に関連するプラスミン活性を比較した。（Ｌ）プラスミノーゲンを添加したグリア細胞との共培養物における切断カスパーゼ−３陽性がん細胞の数量化を示す。値は、プラスミノーゲンを伴わないＨ２０３０−ＢｒＭ３に対して標準化したものであり、平均±ＳＥＭである。条件ごとにｎ＝６〜９の共培養物、３回の独立した実験からの、共培養物当たり多数の視野をスコアリング。（Ｍ）脳切片アッセイにおける切断カスパーゼ−３陽性がん細胞の数量化を示す。値は、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２に対して標準化したものであり、平均±ＳＥＭである。ｎ＝６〜１０の脳切片、２回の独立した実験から。（Ｎ）脳切片におけるプラスミン活性を分析するための実験計画の模式図である。（Ｏ）脳切片におけるプラスミンのα２−抗プラスミン阻害を示す。（Ｐ）単層培養物中のＨ２０３０細胞へのプラスミン添加では細胞死が誘導されないことを示す。Ｐ値は全てスチューデントのｔ検定によって決定した。スケールバー：１０μｍ（Ｃ）、５０μｍ（Ｅ、Ｆ）、２０μｍ（Ｇ、Ｉ）、５００μｍ（Ｈ、Ｊ）。

【図9CDEFGHIJ】同上

【図9KLMNOP】同上

【0071】

【図10ABCD】図１０Ａ〜Ｍは、ニューロセルピンが肺がん細胞の脳転移を媒介することを示す図である。図３Ａ〜Ｎに関連する。（Ａ）ＧＦＰ＋Ｈ２０３０−ＢｒＭ３転移（緑色）を有する脳におけるニューロセルピンＩＦ（赤色）を示す。挿入図はニューロセルピンとＧＦＰ＋がん細胞の共局在（黄色）を示す。（Ｂ）ニューロセルピンｓｈＲＮＡを用いて形質導入したＨ２０３０−ＢｒＭ３および誘導体におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって決定されたニューロセルピンｍＲＮＡレベルを示す。（Ｃ）示されているＨ２０３０誘導体の培養上清に対してニューロセルピンＥＬＩＳＡを実施した。（Ｄ）対照またはＮＳ ｓｈＲＮＡを用いて形質導入したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞のＭＴＴ細胞増殖アッセイを示す。（Ｅ）図３Ｄの動物の脳における転移病変の追跡およびサイズ分布を示す。全ての実験条件についての各サイズ群の相対的な存在量が示されている。（Ｆ）ニューロセルピン枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞によって形成されたわずかなマクロ転移はニューロセルピンＩＦについて陽性にスコアリングされたが（左側のパネル）、微小転移はニューロセルピンについて陰性にスコアリングされた（右側のパネル）。（Ｇ）Ｈ２０３０−ＢｒＭ３におけるニューロセルピンノックダウンによって接種の７日後の血管外遊出した細胞の数は変化しなかった。データは３つの脳からの平均±ＳＥＭである。（Ｈ）実験的な血液脳関門（ＢＢＢ）を通るがん細胞遊出についてのアッセイの模式図を示す（Ｂｏｓら、２００９年）。ＨＵＶＥＣ、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞。（Ｉ）Ｈ２０３０−ＢｒＭ３対照細胞に対して標準化した、この実験的ＢＢＢを通って遊走した細胞の数量化を示す。脳血管外遊出メディエーターＳＴ６ＧａｌＮａＣ５を標的とするｓｈＲＮＡ（Ｂｏｓら、２００９年）は陽性対照としての機能を果たした（ｓｈＮＳ対ｓｈＳＴ６ＧａｌＮａＣ５、Ｐ＜０．００１）。各条件について少なくとも５回の独立した遊走アッセイを実施した。（Ｊ）示されているｆｌａｇエピトープタグを付けたニューロセルピン構築物をトランスフェクトしたＰＣ９−ＢｒＭ３細胞におけるニューロセルピンｍＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＰＣＲプライマーセット＃１は野生型ニューロセルピンｍＲＮＡのみを認識し、セット＃２は野生型とΔｌｏｏｐ変異体型の両方を認識する。（Ｋ）ＰＣ９−ＢｒＭ３またはニューロセルピンｃＤＮＡを発現するこの細胞株の培養上清に対してニューロセルピンＥＬＩＳＡを実施した。（Ｌ）示されているニューロセルピン構築物を発現するＰＣ９−ＢｒＭ３細胞からの培養上清の抗ｆｌａｇウエスタン免疫ブロッティングを示す。チューブリン免疫ブロッティングをローディング対照として使用した。（Ｍ）対照およびニューロセルピン過剰発現ＰＣ９−ＢｒＭ３細胞の増殖アッセイを示す。Ｐ値は全てスチューデントのｔ検定によるものである。スケールバー：２００μｍ（Ａ、Ｆ）、１００μｍ（Ａ、挿入図）、２５０μｍ（Ｅ）。

【図10EF】同上

【図10GHIJKLM】同上

【0072】

【図11ABCDEF】図１１Ａ〜Ｊは、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞において多重同時発現させたセルピンの分析を示す図である。図４Ａ〜Ｈに関連する。（Ａ）３種の示されているセルピンを標的とするｓｈＲＮＡを発現するＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２のｑＲＴ−ＰＣＲを示す。（Ｂ）示されている細胞株からの低血清培養上清におけるニューロセルピンＥＬＩＳＡを示す。（Ｃ）示されている細胞株からの溶解物の抗セルピンＢ２（ＳＢ２）ウエスタン免疫ブロッティングを示す。（Ｄ）ｓｈＳＢ２ ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２形質導入細胞株の増殖アッセイを示す。（Ｅ）示されている細胞株からの溶解物の抗セルピンＢ２ウエスタン免疫ブロッティングを示す。ＢｒＭ２−ＳＣＰ^ＨＩＧＨおよびＢｒＭ２−ＳＣＰ^ＬＯＷは、図４Ｄに示されているＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２由来のクローン株に対応する。（Ｆ）示されている細胞株からの培養上清のニューロセルピンＥＬＩＳＡを示す。（Ｇ）ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２対照（ｎ＝５）とｓｈＮＳ（１）（ｎ＝９）を比較した、無脳転移生存期間のカプラン・マイヤープロットを示す。Ｐ値はログランクマンテル・コックス検定によるものである。（Ｈ）ＣＮ３４−ＢｒＭ２対照（ｎ＝１２）とｓｈＳＥＲＰＩＮＥ２（１）（ｎ＝５）を比較した、無脳転移生存期間のカプラン・マイヤープロットを解析した。Ｐ値はログランクマンテル・コックス検定によるものである。（Ｉ）ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞株から単離した単一細胞後代（ＳＣＰ）におけるセルピン発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。黒色、クローン株；青色、親集団；オレンジ色、ＢｒＭ集団。（Ｊ）図４Ｄにおいて数量化した、示されているセルピンを発現するＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２ ＳＣＰの転移アッセイからの代表的な脳のｅｘ ｖｉｖｏ ＢＬＩ画像を示す。

【図11GH】同上

【図11IJ】同上

【0073】

【図12ABCDEF】図１２Ａ〜Ｌは、ｓＦａｓＬが脳転移細胞のアポトーシスを誘発することを示す図である。図５Ａ〜Ｏに関連する。（Ａ）Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞によって形成された脳病変における、抗ＧＦＡＰおよび抗ＦａｓＬ抗体を用いて染色したアストロサイトの拡大率を上げたものである。（Ｂ）マウスアストロサイトおよび小膠細胞の初代培養物におけるＦａｓＬ ｍＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。データは３連の平均±ＳＥＭである。（Ｃ）使用した種々の抗ＦａｓＬ抗体を示す模式図である。（Ｄ、Ｅ）図５ＣにおけるＦａｓＬ ＥＣＤおよびＩＣＤ免疫蛍光シグナルの数量化を示す。（Ｆ）示されている細胞溶解物の抗Ｆａｓウエスタン免疫ブロッティングを示す。チューブリン免疫ブロッティングをローディング対照として使用した。（Ｇ）ｓＦａｓＬ（５００ｎｇ／ｍｌ）と一緒に、または添加を伴わずにインキュベートした、乳房（ＣＮ３４−ＢｒＭ２）および肺（Ｈ２０３０−ＢｒＭ３）脳転移細胞単層における切断カスパーゼ−３ ＩＦ（赤色）を示す。青色、核染色。（Ｈ）示されているｓＦａｓＬの濃度での、パネルＧに示されている実験の数量化を示す。データは３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。対照との差異は全て、スチューデントのｔ検定によって決定してＰ＜０．０１であった。（Ｉ）ｓＦａｓＬ（５００ｎｇ／ｍｌ）の添加を伴うまたは伴わない、示されている細胞株の細胞増殖アッセイを示す。データは３連の平均±ＳＥＭである。Ｐ値は６日目における差異についてスチューデントのｔ検定によって決定した。（Ｊ）添加したα２−抗プラスミン、α２−抗プラスミンおよびｓＦａｓＬを用いて処理した、または添加を伴わない、脳切片における切断カスパーゼ−３陽性Ｈ２０３０がん細胞の数量化を示す。値は、Ｈ２０３０＋α２−抗プラスミンに対して標準化したものであり、平均±ＳＥＭである。ｎ＝５〜８の脳切片、少なくとも２回の独立した実験から切片当たり少なくとも２視野をスコアリング。（Ｋ）示されているＦＡＤＤ−ＤＤおよびニューロセルピンｓｈＲＮＡベクターを用いて形質導入したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞におけるニューロセルピンｍＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。（Ｌ）脳切片における切断カスパーゼ−３陽性ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２がん細胞の数量化を示す。ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞に、対照ベクター、セルピンＢ２（ＳＢ２）ｓｈＲＮＡ、またはこのｓｈＲＮＡ＋ＦＡＤＤ−ＤＤ発現ベクターを用いて形質導入した。値は、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２対照に対して標準化したものであり、平均±ＳＥＭである。ｎ＝６〜１０の脳切片、少なくとも２回の独立した実験から切片当たり少なくとも２視野をスコアリング。Ｐ値は全てスチューデントのｔ検定によるものである。スケールバー：１μｍ（Ａ）、１００μｍ（Ｇ）。

【図12GH】同上

【図12I】同上

【図12JKL】同上

【0074】

【図13ABCD】図１３Ａ〜Ｉは、プラスミンの標的および脳転移のメディエーターとしてのＬ１ＣＡＭを示す図である。図６Ａ〜Ｎに関連する。（Ａ）示されている細胞株によって形成された病変を有する脳からの代表的なＧＦＰ ＩＦ画像である。スケールバー：１００μｍ、２５μｍ（挿入図）。（Ｂ、Ｃ）示されているヒト肺がん細胞株または乳がん細胞株（Ｂ）およびマウス肺がん細胞株または乳がん細胞株（Ｃ）についての細胞溶解物の抗Ｌ１ＣＡＭウエスタン免疫ブロッティングを示す。（Ｄ）対照およびＬ１ＣＡＭ枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞のＭＴＴ増殖アッセイを示す。（Ｅ）図６Ｉの実験において、脳毛細血管と接触していたが、必ずしも拡散していなかったＧＦＰ＋がん細胞の数量化を示す。条件ごとに１０視野（＞１８０個の個々の細胞）をスコアリングした。データは平均±ＳＥＭである。（Ｆ）脳切片アッセイにおけるアポトーシス性野生型またはＬ１ＣＡＭ枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞の数量化を示す。データは平均±ＳＥＭである。２回の独立した実験から、ｎ＝５〜８の切片、切片当たり少なくとも２視野をスコアリングした。（Ｇ）毛細血管上に拡散したＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２対照またはｓｈＬ１ＣＡＭ形質導入細胞の数量化を示す。データは平均±ＳＥＭである。２回の独立した実験から、ｎ＝６の切片、切片当たり少なくとも３視野をスコアリング。（Ｈ、Ｉ）示されているニューロセルピン発現ベクターおよび／またはＬ１ＣＡＭ ｓｈＲＮＡベクターを用いて形質導入したＰＣ９−ＢｒＭ３細胞におけるＬ１ＣＡＭ ｍＲＮＡレベル（Ｈ）およびニューロセルピンｍＲＮＡレベル（Ｉ）のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。

【図13EFGHI】同上

【0075】

【図14】図１４Ａ〜Ｃは、（Ａ）脳（がん細胞は肺腺癌のものである）、（Ｂ）骨および（Ｃ）肺（どちらの場合も、がん細胞は低クローディントリプルネガティブ乳腺癌のものである）における、ＧＦＰを有する腫瘍細胞によって開始される転移における血管利用を示す図である。

【0076】

【図15AB】図１５Ａ〜Ｆは、ＲＮＡｉ媒介性Ｌ１ＣＡＭ枯渇により、胸腺欠損マウスにおいて心臓内注射後にＭＤＡ２３１乳がん細胞からの（Ａ）骨転移および（Ｂ）肺転移の形成；（Ｃ）Ｈ２０３０肺がん細胞の同所性肺注射の部位における腫瘍の成長または（Ｄ）対側肺への転移；（Ｅ）ＭＤＡ２３１細胞の乳房脂肪パッド注射の部位における腫瘍の成長または（Ｆ）肺もしくは肝臓への転移が阻害されることを示す図である。

【図15CD】同上

【図15EF】同上

【0077】

【図16】図１６Ａ〜Ｂは、Ｌ１ＣＡＭ枯渇により、定義済みの無接着条件で成長させた（左）肺がん細胞または（右）乳がん細胞に由来する細胞間相互作用富化腫瘍球（ｏｎｃｏｓｐｈｅｒｅ）凝集体の成長が阻害されることを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0078】

５．発明を実施するための形態
説明を明瞭にするために、また、限定するものではなく、発明を実施するための形態を以下の小節に分ける：
（ｉ）転移関連セルピン；
（ｉｉ）リスクを評価するための方法およびキット；ならびに
（ｉｉｉ）
（ａ）Ｌ１ＣＡＭの阻害；および
（ｂ）セルピンの阻害
を含めた治療方法。

【0079】

５．１転移関連セルピン
本発明に従って使用することができるセルピンとしては、ヒトまたは非ヒト対象、例えば、これらに限定されないが、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはクジラ目の動物に由来するセルピンが挙げられる。

【0080】

ある特定の非限定的な実施形態では、転移のリスクの上昇に関連するヒトセルピンは、ニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＥ１、セルピンＥ２、またはセルピンＤ１であってよい。特定の非限定的な例では、ニューロセルピンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＧ０１０８９に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２４８２４４、ＡＦ２４８２４５および／またはＡＦ２４８２４６に記載されている配列を有する核酸によってコードされるヒトニューロセルピンであってよい。特定の非限定的な例では、セルピンＢ２は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１１３７２９０に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／またはＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１１４３８１８に記載されている配列を有する核酸によってコードされるヒトセルピンＢ２であってよい。特定の非限定的な例では、セルピンＥ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０５１２１に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４０８３に記載されている配列を有する核酸によってコードされるヒトセルピンＥ１であってよい。特定の非限定的な例では、セルピンＥ２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０７０９３に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６２１６；ＮＭ＿００１１３６５２８．１、またはＮＭ＿００１１３６５３０．１に記載されている配列を有する核酸によってコードされるヒトセルピンＥ２であってよい。特定の非限定的な例では、セルピンＤ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０５５４６もしくはＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００１８５に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１２８４９およびＭ１９２４１および／もしくはＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００１８５に記載されている配列を有する核酸によってコードされるヒトセルピンＤ１であってよい。非ヒト種由来のこれらのセルピンの変型が公知であり、それらのアミノ酸および核酸配列は公的に入手可能である。

【0081】

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明に従って使用することができるセルピンは、プラスミノーゲン活性化因子を選択的に阻害するセルピンである。上に列挙されているものに追加して、本発明に従って使用することができるセルピンは、プラスミノーゲン活性化因子を阻害するそれらの能力に基づいて同定することができる。
５．２リスクを評価するための方法およびキット

【0082】

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、がんを有する対象の、がんの転移を有するまたはそれが発生するリスクが高いかどうかを決定するための方法および組成物であって、がんの細胞が上の節に記載されているセルピンを過剰発現し、かつ／または分泌するかどうかを決定するステップを含む方法および組成物を提供し、ここで、がん細胞がセルピンを過剰発現し、かつ／または分泌している場合、対象の、がんの転移、例えば、脳への転移を有するまたはそれが発生するリスクが高い。リスクの上昇に関して転移の部位になり得る他の器官の非限定的な例としては、肺、肝臓、および骨が挙げられる。

【0083】

転移とは、がんの元の場所と物理的に連続していない場所にあるがん細胞の集団である。

【0084】

対象は、ヒトまたは非ヒト対象、例えば、これらに限定されないが、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはクジラ目の動物であり得る。

【0085】

リスクの上昇とは、プラスミノーゲン活性化因子阻害性セルピンを過剰発現および／または分泌しないがんを有する対象のリスクよりもリスクが大きいことである。

【0086】

過剰発現とは、原発組織の非悪性細胞において起こるものよりも発現が有意に多いこと、例えば、乳管腺癌における発現が非悪性乳管細胞と比較してより多いことを意味する。非限定的な例では、過剰発現は、同等の正常細胞における発現よりも少なくとも２０パーセント多い、または少なくとも５０パーセント多いものであり得る。

【0087】

発現は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。非限定的な例では、セルピンタンパク質の発現は、免疫グロブリン媒介性技法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学的検査、免疫蛍光法、および／または免疫ブロッティング（例えば、下記の実施例を参照されたい）を使用して、プラスミノーゲン活性化因子阻害活性を測定することによって、または当技術分野で公知の他の技法を使用して測定することができる。他の非限定的な例では、セルピンの発現は、例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ドットブロットなどの技法、または当技術分野で公知の他の技法を使用して、ｍＲＮＡ発現によって測定することができる。

【0088】

当該方法は、対象または医療従事者に決定の結果および関連するリスクを通知するステップをさらに含み得る。

【0089】

当該方法は、リスクの上昇が示されている場合に、追加的な診断手順、例えば、対象が検出可能な転移性疾患を有するかどうかを決定するためのイメージング研究を推奨または実施するステップをさらに含み得る。イメージングモダリティの非限定的な例としては、磁気共鳴画像法、コンピュータ化された断層撮影法および陽電子放出断層撮影法が挙げられる。

【0090】

ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する対象の、がんの転移を有するまたはそれが発生するリスクが高いかどうかを決定するためのキットを提供する。

【0091】

キットの型の非限定的な例としては、これらに限定されないが、１種または複数種のセルピンを検出するための１種または複数種のプライマー、プローブ、抗体、または他の検出試薬を含有し得るアレイ／マイクロアレイ、セルピン特異的抗体およびビーズが挙げられる。

【0092】

非限定的な実施形態では、本発明は、がんを有する対象の、がんの転移、例えば、これに限定されないが、脳転移を有するまたはそれが発生するリスクが高いかどうかを決定するためのキットであって、セルピン、例えば、ニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＥ１、セルピンＥ２および／またはセルピンＤ１のタンパク質レベルを検出するための手段を含むキットを提供する。

【0093】

非限定的な実施形態では、キットは、同定しようとするセルピン（複数可）を免疫検出するための少なくとも１種の抗体を含んでよい。セルピンに特異的な抗体可変領域またはその小領域を含む分子を含めた、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体は、当業者には公知の従来の免疫技法を使用して調製することができる。キットの免疫検出試薬は、所与の抗体または抗原自体に付随する、または連結した検出可能な標識を含んでよい。そのような検出可能な標識としては、例えば、化学発光または蛍光分子（ローダミン、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＲＯＸ）、放射標識（３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ、１３１Ｉ）または酵素（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）が挙げられる。あるいは、検出可能部分は、第１の抗体または抗体断片（前記第１の抗体または抗体断片はセルピンを特異的に認識する）に選択的に結合する二次抗体または抗体断片に含めることもできる。

【0094】

さらなる非限定的な実施形態では、セルピン特異的抗体は、カラムマトリックス、アレイ、またはマイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体に結合させてもたらすことができる。あるいは、支持体は、キットの別々の要素としてもたらすこともできる。

【0095】

ある特定の実施形態では、キットの型としては、これに限定されないが、包装されたプローブおよびプライマーセット（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ／プライマーセット）が挙げられ、これは、１種または複数種のセルピン、例えば、ニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＥ１、セルピンＥ２またはセルピンＤ１を検出するための１種または複数種のプローブ、プライマー、または他の検出試薬をさらに含有してよい。

【0096】

特定の非限定的な実施形態では、キットは、同定しようとするセルピン（複数可）を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸配列決定に適したオリゴヌクレオチドプライマーの対を含んでよい。プライマー対は、上記のセルピンと相補的なヌクレオチド配列を含んでよく、前記セルピンと選択的にハイブリダイズするために十分な長さであってよい。複数のセルピンを同時にアッセイするために多数のセルピン特異的プライマーをキットに含めることができる。キットは、１つまたは複数のポリメラーゼ、逆転写酵素、およびヌクレオチド塩基も含んでよく、ヌクレオチド塩基はさらに検出可能に標識されていてもよい。

【0097】

非限定的な実施形態では、プライマーは、少なくとも約１０ヌクレオチドもしくは少なくとも約１５ヌクレオチドもしくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さおよび／または最大で約２００ヌクレオチドもしくは最大で約１５０ヌクレオチドもしくは最大で約１００ヌクレオチドもしくは最大で約７５ヌクレオチドもしくは最大で約５０ヌクレオチドの長さであってよい。

【0098】

さらなる非限定的な実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーを、固体表面または支持体上、例えば、核酸マイクロアレイ上に固定化することができ、場合によって、固体表面または支持体に結合させた各オリゴヌクレオチドプライマーの位置は既知であり、同定可能である。

【0099】

特定の非限定的な実施形態では、キットは、同定しようとするセルピンを検出するためのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適した少なくとも１種の核酸プローブを含んでよい。

【0100】

特定の非限定的な一実施形態では、キットは、１種または複数種のセルピン、例えば、ニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＥ１、セルピンＥ２および／またはセルピンＤ１を検出するために適したプローブ、プライマー、マイクロアレイ、抗体または抗体断片のうちの１つまたは複数を含んでよい。

【0101】

ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、バイオマーカーの発現レベルを決定するためのアッセイまたは反応を行うために必要な１種または複数種の検出試薬および他の成分（例えば、緩衝液、アルカリホスファターゼなどの酵素、抗体など）を含んでよい。

【0102】

ある特定の実施形態では、キットは、プラスミノーゲン活性化因子の阻害を検出および／または測定するための手段を含んでよい。そのようなキットは、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン、および場合によってプラスミノーゲンのプラスミンへの切断を検出するための手段を含んでよい。

【0103】

ある特定の実施形態では、キットは、上記のセルピン発現を検出および／または測定するための手段に加えて、Ｌ１ＣＡＭの発現を検出および／または測定するための手段をさらに含んでよく、したがって、Ｌ１ＣＡＭ発現を検出するために適したプローブ、プライマー、マイクロアレイ、抗体または抗体断片を含んでよい。そのような決定は、Ｌ１ＣＡＭの拮抗作用を用いる療法が意図される場合に有用であり得る。

【0104】

キットは、キットを使用するための指示書をさらに含んでよい。前記指示書は、がん細胞がセルピン（例えば、ニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＥ１、セルピンＥ２またはセルピンＤ１）を過剰発現し、かつ／または分泌している場合には、対象の、がんの転移、例えば、これに限定されないが、脳への転移を有するまたはそれが発生するリスクが高いという開示を含んでよい。Ｌ１ＣＡＭ検出用要素が含まれる場合には、前記指示書は、セルピンならびにＬ１ＣＡＭを発現するがん細胞がＬ１ＣＡＭ拮抗作用から利益を受け得るという開示をさらに含んでよい。ある特定の実施形態では、指示書により、対象のがん細胞においてセルピンの過剰発現が検出された場合、特にがん細胞がＬ１ＣＡＭも発現しているまたはその正常な対応物と比較してＬ１ＣＡＭを過剰発現している場合に、対象がＬ１ＣＡＭの阻害から利益を受け得ることが推奨され得る。
５．３治療方法

【0105】

ある特定の実施形態では、本発明は、がんに罹患している対象を処置する方法であって、（ｉ）対象の、がんの転移拡散のリスクが高いかどうかを決定するステップであって、がんの細胞がセルピンを過剰発現しているかどうかを決定することを含み、セルピンの過剰発現が、対象の、がんの転移拡散のリスクがより高いことを示すステップと、（ｉｉ）対象の転移拡散のリスクが高い場合に、転移の成長または発生を阻害する治療モダリティを実施または推奨するステップとを含む方法を提供する。

【0106】

治療モダリティは、標準の化学療法または放射線療法および／または下の節に記載されている本発明による療法を含んでよい。
５．３．１Ｌ１ＣＡＭの阻害

【0107】

ある特定の非限定的な実施形態では、転移の成長または発生を阻害するための治療モダリティは、血管のＬ１ＣＡＭ媒介性利用を、例えば、上記のリスクがあると同定された対象にＬ１ＣＡＭ阻害剤を投与することによって阻害するための手段を含む。Ｌ１ＣＡＭ阻害剤は、Ｌ１ＣＡＭの血管を利用する能力を低下させ、かつ／またはＬ１ＣＡＭの腫瘍の成長を促進する能力を低下させる薬剤である。Ｌ１ＣＡＭ阻害剤は、例として、また限定するものではなく、がん細胞におけるＬ１ＣＡＭの発現を低下させること、またはＬ１ＣＡＭをがん細胞表面から除去すること、またはＬ１ＣＡＭに結合し、したがって内皮細胞に結合するＬ１ＣＡＭの能力を低下させることによって、例えば内皮細胞との結合に利用可能なＬ１ＣＡＭの量を減少させることによって、または物理的な阻害によって、作用し得る。

【0108】

ある特定の非限定的な実施形態では、そのような治療を、がんの細胞がセルピンとＬ１ＣＡＭの両方を発現しているがんを有する対象に施す。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、がんを有する対象において、がんの転移拡散を阻害する方法であって、がんの細胞が、（ｉ）セルピンを過剰発現しているかどうか、および（ｉｉ）Ｌ１ＣＡＭを発現しているかどうかを決定するステップと、細胞がセルピンを過剰発現しており、かつＬ１ＣＡＭを発現している場合に、対象を治療量のＬ１ＣＡＭ阻害剤を用いて処置するステップとを含む方法を提供する。

【0109】

対象がヒトである非限定的な実施形態では、阻害されるＬ１ＣＡＭは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ３２００４および／またはＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００４２５バージョンＮＭ＿０００４２５．４および／またはＮＭ＿００１２７８１１６バージョンＮＭ＿００１２７８１１６．１に記載されているアミノ酸配列を有するヒトＬ１ＣＡＭである。

【0110】

非限定的な実施形態では、Ｌ１ＣＡＭ阻害剤は、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する抗体または抗体断片または単鎖抗体であってよい。そのような抗体の非限定的な例は、米国特許第８，１３８，３１３号、国際特許出願公開第ＷＯ２００７１１４５５０号、および国際特許出願公開第ＷＯ２００８１５１８１９号に開示されており、ならびにこれらの引用に記載されている抗体とＬ１ＣＡＭとの結合について競合する抗体である。ある特定の非限定的な実施形態では、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体または抗体断片を使用して、本発明に従って使用するための、Ｌ１ＣＡＭに対して特異的であるヒト、ヒト化、または他のキメラ抗体を調製することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｌ１ＣＡＭ抗体、抗体断片、または単鎖抗体は、生理的条件下、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｌ１ＣＡＭの内皮細胞または毛細血管への結合を阻害し得る。

【0111】

非限定的な実施形態では、Ｌ１ＣＡＭ阻害剤は、Ｌ１ＣＡＭ ｍＲＮＡと相同な領域を含む核酸、例えば、低分子ヘアピン型、干渉、アンチセンス、またはリボザイム核酸であってよい。例えば、そのような核酸は、約１５から約５０の間または約１５から３０の間または約２０から３０ヌクレオチドの間の長さであり、生理的条件下でＬ１ＣＡＭ ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるものであってよい。Ｌ１ＣＡＭを阻害する低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡの非限定的な例は、下記の実施例に記載されている。非限定的な実施形態では、核酸であるＬ１ＣＡＭ阻害剤は、前記がん細胞に選択的にターゲティングすることができ、かつ／または、腫瘍細胞において選択的に活性であるプロモーターもしくは特定の非限定的な実施形態ではセルピンプロモーターによってＬ１ＣＡＭ阻害核酸の発現を導くことができるベクター、例えば、レンチウイルスを介してＬ１ＣＡＭ発現がん細胞にもたらすことができる。Ｌ１ＣＡＭ ｍＲＮＡの核酸配列の非限定的な例としては、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００４２５バージョンＮＭ＿０００４２５．４および／またはＮＭ＿００１２７８１１６バージョンＮＭ＿００１２７８１１６．１に記載されている配列が挙げられる。特定の非限定的な一実施形態では、Ｌ１ＣＡＭ阻害剤は、ヘアピン配列５’−ＣＣＧＧＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号１）
および標的配列ＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴ（配列番号２）；
またはヘアピン配列５’−ＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号３）
および標的配列ＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号４）；
またはヘアピン配列５’−ＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＧＴＡＧＡＴＧＴＡＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号５）
および標的配列ＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＴ（配列番号６）を有するＲＮＡｉＴＲＣＮ０００００６３９１６（Ｔｈｅ ＲＮＡｉ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｐｕｂｌｉｃ ＴＲＣ Ｐｏｒｔａｌ）である
５．３．２セルピンの阻害

【0112】

ある特定の非限定的な実施形態では、転移の成長または発生を阻害するための治療モダリティは、セルピン、例えば、限定するものではないが、ニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＥ１、セルピンＥ２もしくはセルピンＤ１、またはより詳細にはヒトニューロセルピン、ヒトセルピンＢ２、ヒトセルピンＥ１、ヒトセルピンＥ２もしくはヒトセルピンＤ１を阻害するための手段を含む。セルピン阻害剤は、プラスミノーゲン活性化因子を阻害するセルピンの能力を低下させる薬剤である。セルピン阻害剤は、例として、また限定するものではなく、がん細胞におけるセルピンの発現を低下させる、またはセルピンに結合し、したがってプラスミノーゲン活性化因子を阻害するセルピンの能力を低下させることによって作用し得る。

【0113】

ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、対象におけるがんの転移を阻害する方法であって、対象に、有効量のセルピン阻害剤、例えば、プラスミノーゲン活性化因子を阻害するセルピン、例えば、これらに限定されないが、ニューロセルピン、セルピンＢ２、セルピンＥ１、セルピンＥ２、および／またはセルピンＤ１の阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。

【0114】

非限定的な実施形態では、セルピン阻害剤は、セルピンに特異的に結合する抗体または抗体断片または単鎖抗体であってよい。そのような抗体の非限定的な例は、Ｉｒｖｉｎｇ， Ｊ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０１１年；５０１巻；４２１〜４６６頁；Ｂｏｎｃｅｌａ、Ｊ．ら、Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． ２０１１年；２８６巻；４３１６４〜４３１７１頁；およびＶａｎ Ｄｅ Ｃｒａｅｎ， Ｂ．ら、Ｔｈｒｏｍ． Ｒｅｓ．２０１２年；１２９巻（４号）：ｅ１２６〜１３３頁に開示されている。ある特定の非限定的な実施形態では、抗セルピン抗体または抗体断片を使用して、本発明に従って使用するための、セルピンに対して特異的であるヒト、ヒト化、または他のキメラ抗体を調製することができる。

【0115】

非限定的な実施形態では、セルピン阻害剤は、セルピンｍＲＮＡと相同な領域を含む核酸、例えば、低分子ヘアピン型、干渉、アンチセンス、またはリボザイム核酸であってよい。例えば、そのような核酸は、約１５から５０の間または約１５から３０の間または約２０から３０ヌクレオチドの間の長さであり、生理的条件下でセルピンｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるものであってよい。セルピンを阻害する低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡの非限定的な例は、下記の実施例に記載されている。非限定的な実施形態では、核酸であるセルピン阻害剤は、前記がん細胞に選択的にターゲティングすることができ、かつ／または腫瘍細胞において選択的に活性であるプロモーターによってセルピン阻害核酸の発現を導くことができるベクター、例えば、レンチウイルスを介してセルピン発現がん細胞にもたらすことができる。

【実施例】

【0116】

６．実施例
６．１材料および方法
脳転移細胞の単離および培養。ヒト脳転移細胞株は以前に記載されている（Ｂｏｓら、２００９年；Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）。ＥｒｂＢ２−Ｐ細胞株を、マウスにおけるＭＭＴＶ駆動ＮｅｕＮＴトランスジェニック乳房腫瘍から樹立した（Ｍｕｌｌｅｒら、１９８８年）。ＥｒｂＢ２−Ｐ細胞を心臓内に注射して脳転移性誘導体を得た。簡単に述べると、体積１００μｌ中、ＴＫＧＦＰ−ルシフェラーゼ（ＴＧＬ）構築物を発現するＥｒｂＢ２−Ｐ細胞１０^５個を含有する細胞浮遊液を、麻酔した４〜６週齢ＦＶＢ／ＮＣｒマウスの左心室に注射した。以前に記載されている通り、ＸｅｎｏｇｅｎのＩＶＩＳ−２００イメージングシステムを使用した週に１回の生物発光イメージングによって腫瘍の発生をモニターした。ｅｘ ｖｉｖｏ生物発光イメージングによって脳病変の場所を特定し、滅菌条件下で切除した。組織を細かく刻み、０．１２５％コラゲナーゼＩＩＩおよび０．１％ヒアルロニダーゼを補充した、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２の１：１混合物を含有する培養培地に入れた。試料を室温で４〜５時間、穏やかに揺らしながらインキュベートした。コラゲナーゼ処理後、細胞を短時間遠心分離し、０．２５％トリプシンに再浮遊させ、３７℃のウォーターバス中でさらに１５分インキュベートした。細胞を培養培地に再浮遊させ、１０ｃｍの皿上で集密になるまで成長させた。ＧＦＰ＋細胞を培養物中での繁殖またはマウスへの接種のために選別した。

【0117】

ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２、ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２、３７３Ｎ１、３９３Ｎ１、４８２Ｎ１、２６９１Ｎ１を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１£ｇｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを補充したＤＭＥ培地で培養した。ＣＮ３４−ＢｒＭ２を、２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＭ１９９培地で培養した。Ｈ２０３０−ＢｒＭ３およびＰＣ９−ＢｒＭ３を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。レトロウイルスおよびレンチウイルス産生のために、それぞれＧＰＧ２９および２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを補充したＤＭＥ培地で培養した。さらに、ＧＰＧ２９培地は、０．３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、２０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンおよび２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有した。ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２ ＳＣＰを以前に示されている通り段階希釈によって調製し（Ｋａｎｇら、２００３年）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを補充したＤＭＥ培地で培養した。マウス小膠細胞はＡＴＣＣで取得した（ＣＲＬ−２４６７）。マウスアストロサイトは、２日齢の仔から得た（Ｓｃｈｉｌｄｇｅら、２０１３年）。簡単に述べると、脳を機械的に分離し、１００μｍのフィルターを通して濾過し、細胞浮遊液を、ペトリ皿中、通常条件下でその後の１０日間培養した。１０日目に、皿を３７℃で一晩、穏やかに振とうしながらインキュベートした。次の日に培地を交換し、アストロサイトの富化を、細胞の９０％超がＧＦＡＰについて陽性に染色されたことで確認した。

【0118】

動物研究。動物を使用する実験は全て、ＭＳＫＣＣ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により認可されたプロトコールに従って行った。４〜６週齢の胸腺欠損ＮＣＲ ｎｕ／ｎｕ（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）、Ｃｒ：ＮＩＨ ｂｇ−ｎｕ−ｘｉｄ（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）、ＦＶＢ／ＮＣｒ（ＮＣＩＦｒｅｄｅｒｉｃｋ）、およびＢ６１２９ＳＦ１／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）雌マウスを動物実験のために使用した。脳コロニー形成アッセイを以前に記載されている通り実施した（Ｂｏｓら、２００９年；Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）。簡単に述べると、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２ａ、ＣＮ３４ＢｒＭ−２ｃ、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３、ＰＣ９−ＢｒＭ３を５０，０００個（長期実験用）または５００，０００個（短期実験用）、および同系の細胞株３７３Ｎ１、３９３Ｎ１、４８２Ｎ１、２６９１Ｎ１、ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２細胞については１００，０００個を１００μｌのＰＢＳに再浮遊させ、左心室に注射した。脳コロニー形成をｉｎ−ｖｉｖｏおよびｅｘ−ｖｉｖｏにおいて生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって分析した。麻酔したマウス（１００ｍｇ／ｋｇのケタミン／１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン）をＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）と一緒に後眼窩に注射し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｘｅｎｏｇｅｎ ｍａｃｈｉｎｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてイメージングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５０を使用して生物発光分析を実施した。

【0119】

遺伝子発現解析。ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを細胞から単離した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してｃＤＮＡを生成するために１０００ｎｇのＲＮＡを使用した。Ｔａｑｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して遺伝子発現を解析した。アッセイをヒト遺伝子：ＦＡＤＤ（Ｈｓ０４１８７４９９＿ｍ１）、ＦＡＳＬ（Ｈｓ００１８１２２５＿ｍ１）、Ｌ１ＣＡＭ（Ｈｓ０１１０９７４８＿ｍ１）、ＳＥＲＰＩＮＢ２（Ｈｓ００２３４０３２＿ｍ１）、ＳＥＲＰＩＮＤ１（Ｈｓ００１６４８２１＿ｍ１）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（Ｈｓ０１１２６６０４＿ｍ１）、ＳＥＲＰＩＮＥ２（Ｈｓ００３８５７３０＿ｍ１）、ＳＥＲＰＩＮＩ１プローブ＃１（Ｈｓ０１１１５３９７＿ｍ１）、ＳＥＲＰＩＮＩ１プローブ＃２（Ｈｓ０１１１５４００＿ｍ１）に対して使用した。アッセイをマウス遺伝子：ｆａｓＬ（Ｍｍ００４３８８６４＿ｍ１）、セルピンｂ２（Ｍｍ００４４０９０５＿ｍ１）、セルピンｄ１（Ｍｍ００４３３９３９＿ｍ１）、セルピンｅ２（Ｍｍ００４３６７５３＿ｍ１）、セルピンＩ１（Ｍｍ００４３６７４０＿ｍ１）に対して使用した。相対的な遺伝子発現を、「ハウスキーピング」遺伝子、すなわちβ２Ｍ（Ｈｓ９９９９９９０７＿ｍ１）およびβ２ｍ（Ｍｍ００４３７７６２＿ｍ１）に対して標準化した。ＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍで定量的ＰＣＲ反応を実施し、ｓｏｆｔｗａｒｅ ＳＤＳ２．２．２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。

【0120】

臨床的な試料および免疫組織化学的検査。肺がん脳転移および乳がん脳転移からそれぞれ３３および１２３症例を、ＭＳＫＣＣのＢｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｎｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙから得た。乳がんおよび肺がんから得た脳転移由来のパラフィン包埋組織マイクロアレイを、ＭＳＫＣＣ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙから、ＭＳＫＣＣ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって認可されたプロトコールに従って得た。Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１６１７１−１００、ロット番号１５８３５８、１：２５０）およびＳｅｒｐｉｎＢ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２５７４５、ロット番号Ｌ１４０６、５μｇ／ｍｌ）は、ＭＳＫＣＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにより、標準化した自動プロトコールを使用して実施された。免疫反応性染色を臨床病理医が盲検式で評価し、スコアリングした。４２の乳がん由来脳転移試料を原発腫瘍型に対してアノテートし、これは、ニューロセルピンについて陽性が２７症例、およびセルピンＢ２について陽性が１２症例に対応する。ＳＥＲＰＩＮＢ２およびＳＥＲＰＩＮＩ１の発現の解析を、ＭＳＫＣＣデータセット＃１（Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）を使用することによって実施し、このデータセットは１０７の試料を含み、そのうちの１０６について臨床情報が入手可能であった。ＳＥＲＰＩＮＩ１およびＳＥＲＰＩＮＢ２の平均値のハザード比を、Ｒにおいて「ｃｏｘｐｈ」コマンドによって実行されるコックス比例ハザードモデルに基づいて計算した。

【0121】

脳切片アッセイ。成体マウス脳由来の器官型切片培養物を、以前に記載された方法（ＰｏｌｌｅｕｘおよびＧｈｏｓｈ、２００２年）を適合させて調製した。脳（４〜６週齢の胸腺欠損ＮＣＲ ｎｕ／ｎｕマウス）を、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（２．５ｍＭ）、Ｄ−グルコース（３０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、ＭｇＳＯ_４（１ｍＭ）、ＮａＨＣＯ_３（４ｍＭ）を補充したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で解剖し、４２℃で予め加熱した低融点アガロース（Ｌｏｎｚａ）に包埋した。包埋した脳を、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して２５０μｍの切片に切断した。脳切片（ｂｒｅｇｍａ−１ｍｍ〜＋３ｍｍ）を、平らなへらを用いて、切片培養培地（ＨＢＳＳ、ＦＢＳ５％、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中の０．８μｍのポア膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上部に置いた。脳切片を３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートし、次いで、培養培地２μＬに浮遊させたがん細胞３×１０^４個を切片の表面上に置き、４８〜７２時間インキュベートした。脳切片は、これらの条件下で５日間まで、組織構造の明らかな変更を伴わずに維持することができた。α２−抗プラスミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、２．５μｇ／ｍｌ）、ニューロセルピンおよびセルピンＢ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、各０．５μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。ｓＦａｓＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、５００ｎｇ／ｍｌ）またはＦａｓＬ遮断抗体（ＢＤ、１２．５μｇ／ｍｌ）を培地に添加し、切片を２４時間プレインキュベートした後にがん細胞を添加した。脳切片を４％ＰＦＡ中、一晩にわたって固定し、次いで、ＧＦＰ（Ａｖｅｓ ｌａｂ、ｒｅｆ．ＧＦＰ−１０２０、１：１０００）、切断カスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｒｅｆ．９６６１、１：５００）、ＩＶ型コラーゲン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｒｅｆ．ＡＢ７５６Ｐ、１：５００）について浮動性免疫蛍光を実施した。核をビス−ベンズアミド（ＳＩＧＭＡ、１£ｇｇ／ｍｌ）で染色した。切片にＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉ ｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を乗せた。

【0122】

プラスミド、組換えタンパク質およびｉｎ ｖｉｔｒｏ実験。ヒトニューロセルピンｃＤＮＡ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏレトロウイルス発現ベクターにサブクローニングした。部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を実施して、以前に特徴付けられたΔｌｏｏｐ変異体を生成した（Ｔａｋｅｈａｒａら、２００９年）。この研究において使用するｓｈＲＮＡのＴＲＣ番号は、ニューロセルピン（ＴＲＣＮ０００００５２３５６およびＴＲＣＮ０００００５２３５５）、ＳＥＲＰＩＮＢ２（ＴＲＣＮ０００００５２２７８）、ＳＥＲＰＩＮＥ２（ＴＲＣＮ０００００５２３１７）、Ｌ１ＣＡＭ（ＴＲＣＮ０００００６３９１６）である。ｓｈＲＮＡは全て、ヒト遺伝子に特異的であり、ピューロマイシン、ハイグロマイシンまたはネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子を有するｐＬＫＯ．１−ｓｈＲＮＡベクター（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において発現するものであった。ＳＴ６ＧａｌＮａＣ５ ｓｈＲＮＡは以前に記載されている（Ｂｏｓら、２００９年）。ＦＡＤＤ−ＤＤ構築物（Ａｎｄｒｅｗ Ｍ．Ｔｈｏｒｎｂｕｒｎ）をｐＬＶＸ−ｈｙｇｒｏレンチウイルス発現ベクターにサブクローニングした。ニューロセルピンＥＬＩＳＡを製造者の指示書に従って実施した（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）。ＤＶＬ−Ｋ発色アッセイを、２４ウェルプレートに細胞５×１０^４個をプレーティングし、ＤＭＥＭ ＦＢＳ０．２５％中、一晩にわたって飢餓状態にすることによって実施した。プラスミノーゲン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、０．１２５μＭ）を、ＤＶＬ−Ｋ発色アッセイの前に２４時間インキュベートしたがん細胞に添加した。Ｄ−ＶＬＫ発色基質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）を製造者の指示書に従って調製した。ＤＶＬＫを細胞に添加し、４０５ｎｍにおける吸収の変化をモニターした。（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）細胞増殖アッセイ用に細胞５×１０^２個を９６ウェルプレートにプレーティングし、切断カスパーゼ−３用に細胞２５×１０^３個を２４ウェルプレートにプレーティングし、ｓＦａｓＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００〜５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で０．２５％ＦＢＳを用いて一晩にわたって飢餓状態にし、示されている期間にわたってインキュベートした。細胞のプラスミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）処理を１．６Ｕ／ｍｌで４時間にわたって行った。

【0123】

免疫蛍光法。免疫蛍光用の組織を、ＰＦＡ４％を用いて４℃で一晩固定した後に得た。ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）または滑走式ミクロトーム（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用することによって脳の切片作製を行った。両方の型の脳切片（それぞれ２５０μｍおよび８０μｍ）をＰＢＳ中１０％ＮＧＳ、２％ＢＳＡ、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ中、室温（ＲＴ）で２時間にわたってブロッキングした。一次抗体をブロッキング溶液中、４℃で一晩インキュベートし、翌日にＲＴで３０分インキュベートした。０．２５％ＰＢＳＴｒｉｔｏｎ中で広範に洗浄した後、二次抗体をブロッキング溶液に添加し、２時間インキュベートした。０．２５％ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ中で広範に洗浄した後、ビス−ベンズアミドを用い、ＲＴで７分にわたって核を染色した。一次抗体：ＧＦＰ（Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ、ｒｅｆ．ＧＦＰ−１０２０、１：１０００）、プラスミノーゲン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｒｅｆ．ｓｃ−２５５４６、１：１００）、ｔＰＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、ｒｅｆ．ＡＳＭＴＰＡ−ＧＦ、１：５０）、ｕＰＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、ｒｅｆ．ＡＳＭＵＰＡ−ＧＦ、１：５０）、ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ、ｒｅｆ．Ｚ０３３４、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｒｅｆ．ＭＡＢ３６０、両方とも１：１０００）、ＩｂａＩ（Ｗａｋｏ、ｒｅｆ．０１９−１９７４１、１：５００）、Ｃｏｌ．ＩＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｒｅｆ．ＡＢ７５６Ｐ、１：５００）、ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｒｅｆ．ＭＡＢ３７７、１：５００）、ニューロセルピン（Ａｂｃａｍ、ｒｅｆ．ａｂ１６１７１、１：２５０）、ＦａｓＬ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｒｅｆ．ｓｃ−８３４およびｓｃ−６２３７、１：１００）、Ｌ１ＣＡＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｒｅｆ．ＣＢＬ２７５、１：２００およびＣｏｖａｎｃｅ、ｒｅｆ．ＳＩＧ−３９１１、１£ｇｇ／ｍｌ）。二次抗体：Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ抗ニワトリ４８８、抗ウサギ５５５、抗マウス５５５、抗マウス６３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

【0124】

免疫ブロッティング。細胞ペレットをＲＩＰＡ緩衝液を用いて溶解させ、タンパク質の濃度をＢＳＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレンまたはＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを、ＦＡＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｒｅｆ．ｓｃ−７１５、１：１００）、ＦａｓＬ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｒｅｆ．ｓｃ−８３４およびｓｃ−６２３７ １：１００）、Ｌ１ＣＡＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｒｅｆ．ＣＢＬ２７５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｒｅｆ．１４−１７１９、およびＡｂｃａｍ、ｒｅｆ．ａｂ２４３４５、１：２００〜１０００）、ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ、１：２０００）、セルピンＢ２（Ａｂｃａｍ、ｒｅｆ．４７７４２、１：５００）、チューブリン（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：２０００）に対する抗体を用いて免疫ブロットした。

【0125】

共焦点顕微鏡法および画像解析。Ｌｅｉｃａ ＳＰ５縦型共焦点顕微鏡１０×、２０×、４０×および６３×対物レンズを用いて画像を取得し、ＩｍａｇｅＪ、ＩｍａｒｉｓおよびＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを用いて画像を解析した。脳切片アッセイにおいて、表面上に残っている細胞クラスターを避けるために、切片の表面から４０μｍ超の場所にあるＧＦＰ＋細胞体を解析の考慮に入れた。ＩｍａｇｅＪを使用して、共焦点像を使用して閾値０．４５でラウンドフィルターを適用することによって拡散細胞指数を決定した。

【0126】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ血液脳関門アッセイ。このアッセイを以前に記載されている通り実施した（Ｂｏｓら、２００９年）。簡単に述べると、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）をポリリシン処理し、ゼラチンでコーティングした組織培養トランスウェルインサートの反対側でヒト初代アストロサイト（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）と３日間共培養した。簡単に述べると、３μｍ孔のＰＥＴ組織培養インサート（Ｆｉｓｈｅｒ）を、ポリリシン（１μｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて一晩処理し、４回洗浄し、０．２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて最低３０分にわたってコーティングした。インサートを１５ｃｍのプレートに上下逆にして置き、初代ヒトアストロサイト１０^５個をメンブレン表面にプレーティングした。アストロサイトを１５分ごとに５時間にわたり供給し、次いで、インサートを反転させ、２４ウェルプレートに入れた。内皮細胞５×１０^５個をインサートの上のチャンバーにプレーティングし、培養物をさらに動かすことなくインキュベーターに入れた。ＢＢＢ遊出アッセイのために、細胞５×１０^５個を上のチャンバーに播種し、１４〜１８時間インキュベートした。インサートをＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡを用いて２０分にわたって固定した。メンブレンをプラスチックインサートから取り出し、ＧＦＰに対する免疫蛍光法を実施し、顕微鏡スライドに乗せた。実験当たり５〜８個のインサートからの多数の視野の像を取得し、遊出した細胞の数を計数した。

【0127】

フローサイトメトリー。１ｍＭのＥＤＴＡを使用して接着細胞の単層を剥離し、単一細胞浮遊液に再浮遊させ、蛍光色素とコンジュゲートしたヒトＬ１ＣＡＭのモノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｒｅｆ．１２−１７１９−４２）と一緒にインキュベートした。Ｌ１ＣＡＭの細胞表面での発現をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって解析した。

【0128】

細胞接着アッセイ。ＨＢＭＥＣまたは腫瘍細胞を、２ウェル培養スライド（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）にプレーティングし、９０％超の集密になるまで成長させた。腫瘍細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ．Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。予め標識した腫瘍細胞７．２×１０^４個をがん細胞の単層に２０分にわたって接着させた。非接着細胞を洗い流した後、スライドを、１％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を伴う封入剤を用いて封入した。接着細胞（緑色）および総細胞の核（青色）を蛍光顕微鏡法によってスコアリングした。各ウェルの底部を覆うＨＢＭＥＣまたはがん細胞に接着したＧＦＰ＋がん細胞の数を算出した。
６．２結果

【0129】

ＰＡ阻害性セルピンと脳転移表現型の関連性。共有される脳転移のメディエーターを同定するために、リンパ節由来ヒト肺腺癌細胞株Ｈ２０３０およびＰＣ９（Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）から単離した脳転移性亜集団（ＢｒＭ）、ならびに胸水由来乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（略してＭＤＡ２３１）およびＣＮ３４（Ｂｏｓら、２００９年）から単離した脳転移性亜集団（ＢｒＭ）のトランスクリプトームサインを解析した（図１Ａ）。４つのモデルのうち少なくとも３つにおいて、７種の遺伝子が脳転移細胞において供給源である親系統と比較して上方制御された（図８Ａ）。これらの遺伝子の中で、ＬＥＦ１は以前に肺腺癌細胞の脳転移におけるＷＮＴシグナル伝達メディエーターとして定義されている（Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）。ＳＥＲＰＩＮＩ１（以下を参照されたい）はヒト原発腫瘍における脳での再発に関連したが、他の遺伝子はいずれも関連しなかった。ニューロセルピン（ＮＳ）をコードするＳＥＲＰＩＮＩ１はまた、その発現が通常はニューロンに制限され、そこでＰＡ関連細胞傷害性から保護されるので、興味深いものであった（ＦａｂｂｒｏおよびＳｅｅｄｓ、２００９年；Ｙｅｐｅｓら、２０００年）。

【0130】

ヒトにおけるセルピンファミリーは、集合的に１８種のプロテアーゼを標的とする３６種のメンバーを含む（Ｉｒｖｉｎｇら、２０００年）。これらのセルピンのうちの４種−ニューロセルピン、ならびにセルピンＢ２、Ｅ１、およびＥ２は、ＰＡを選択的に阻害する（Ｌａｗら、２００６年）。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した遺伝子発現解析により、抗ＰＡセルピンのうちの３種が脳転移細胞においてｍＲＮＡレベルで３倍超に上方制御されることが示された（図１Ａ）。他の唯一のセルピン、ＳＥＲＰＩＮＤ１も上方制御された（図１Ａ）。セルピンＤ１は、大脳傷害においてプラスミノーゲンと協同するトロンビンを阻害する（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、２００８年）。骨転移性誘導体（ＭＤＡ２３１−ＢｏＭ）（Ｋａｎｇら、２００３年）および肺転移性誘導体（ＭＤＡ２３１−ＬＭ２）（Ｍｉｎｎら、２００５年）はＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２との比較のために利用可能であり、それらは、セルピンのわずかな上方制御を示すか（ＢｏＭ）またはセルピンの上方制御を示さなかった（ＬＭ２）（図１Ｂ）。

【0131】

免疫適格性モデル、および乳がんの異なるサブタイプを調査するために、変異体ＥｒｂＢ２導入遺伝子（Ｍｕｌｌｅｒら、１９８８年）によって駆動されるマウス乳房腫瘍から細胞株ＥｒｂＢ２−Ｐを樹立し、次いで、コンジェニックマウスにおけるＥｒｂＢ２−Ｐのｉｎ ｖｉｖｏ選択によって脳転移性誘導体（ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２）を単離した。ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２細胞は親系統と比較してセルピンＢ２およびＤ１の強力な上方制御を示した（図１Ａ）。遺伝子操作されたＫｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^−／−マウス肺腺癌のリンパ節転移に由来する４つの細胞株もスクリーニングした（Ｗｉｎｓｌｏｗら、２０１１年）。４つの株の全てが内臓に高度に転移したが、脳転移活性が広範であった（図１Ｃ、Ｓ１Ｂ）；脳転移は、セルピンＩ１、Ｂ２、Ｅ２および／またはＤ１の高発現と関連した（図１Ｃ、Ｄ）。

【0132】

脳転移細胞におけるニューロセルピンおよびセルピンＢ２の上方制御がタンパク質レベルで確認された（図８Ｃ、Ｄ）。さらに、脳転移細胞株からの馴化培地では、発色プラスミン活性アッセイを使用して決定された通り、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換が阻害された（Ｂａｉら、２０１１年）（図１Ｅ、Ｆおよび８Ｅ）。唯一の例外がＰＣ９−ＢｒＭ３であり、この細胞株はＨ２０３０−ＢｒＭ３と比較して脳転移における侵攻性が低く（Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）、抗ＰＡセルピンが上方制御されなかった（図１Ａ、８Ｃ、Ｄ）。

【0133】

ヒト脳転移組織におけるニューロセルピンおよびセルピンＢ２。これらのモデルにおいて最も頻繁に上方制御された２種の抗ＰＡセルピン、ニューロセルピンおよびセルピンＢ２に焦点を当てて、１０^６の、再発アノテーションを伴う原発肺腺癌からの遺伝子発現データを照会した（Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）。腫瘍におけるＳＥＲＰＩＮＩ１およびＳＥＲＰＩＮＢ２の発現レベルは、個々の遺伝子として（データは示していない）および組み合わせての両方で脳での再発と関連した（ｐ＝０．０１８、ハザード比＝２．３３＋／−０．３；図１Ｇ）。２種の遺伝子の発現は、骨または肺への転移とは有意には関連しなかった（ｐ＝０．８９、ハザード比＝０．９１＋／−０．３３；ｐ＝０．３６、ハザード比＝０．７６＋／−０．２７；図８Ｆ、Ｇ）。原発性乳腺腫瘍におけるＳＥＲＰＩＮＩ１およびＳＥＲＰＩＮＢ２発現は脳転移の予測因子ではないが（ｐ＝０．２１、ハザード比＝０．９６＋／−０．１６；図８Ｈ）、これらの場合の大部分で脳での再発が後期事象であった。

【0134】

ヒト脳転移組織におけるニューロセルピンおよびセルピンＢ２の免疫組織化学的分析を、参照脳としてマウスにおいてセルピン発現ヒトがん細胞によって形成された病変を使用して実施した（図８Ｉ）。３３の、非小細胞肺癌の脳転移のうち、４５％がニューロセルピンについて陽性にスコアリングされ、９４％がセルピンＢ２について陽性にスコアリングされた。種々のサブタイプの乳がんからの１２３の中では、７７％がニューロセルピンについて陽性にスコアリングされ、３４％がセルピンＢ２について陽性にスコアリングされた（図１Ｈ、Ｉおよび８Ｉ、Ｊ）。免疫反応性は癌腫細胞の細胞質内に拡散的に分布し、最低限のみがわずかな細胞外間質に分布した。腫瘍周囲の炎症性浸潤ではニューロセルピンおよびセルピンＢ２についての陽性が限定された。

【0135】

プラスミンは、脳実質に浸潤するがん細胞に対して致死的なものである。ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２またはＨ２０３０−ＢｒＭ３モデルは、同所性腫瘍からも動脈循環からも脳に転移する（Ｂｏｓら、２００９年；Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）。これらの細胞を免疫不全マウスの動脈循環に、左心室から接種し、組織を固定して、脳毛細血管ネットワーク内に留まったがん細胞を異なる時点で計数した（図２Ａ〜Ｃ、９Ａ）。接種の１日後、単離した、脳毛細血管内に捕捉されたがん細胞を観察した（図２Ｂ、およびＨ２０３０−ＢｒＭ３）。接種の２日後から７日後の間に、ＢＢＢを通過する細胞が観察された（図２Ｂ、９Ｂ）。７日目に毛細血管内に残っていた全ての細胞はアポトーシスマーカーである切断カスパーゼ−３について陽性に染色され（図９Ｃ、Ｄ）、その後消失した。親ＭＤＡ２３１では、血管外遊出した細胞の数は５日目以降に急激に減少し、めったに回復しなかった（図９Ｂ）。以前の報告と一致して（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、２００９年；Ｃｈａｍｂｅｒｓ、２０００年；Ｋｉｅｎａｓｔら、２０１０年；ＬｏｒｇｅｒおよびＦｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ、２０１０年）、脳に侵入したがん細胞の９０％超が数日以内に消失した。ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２では、血管外遊出した細胞の数は７日目まで増加し、１０日目までに急激に減少したが、１６日目までに回復した。生存細胞は、脳毛細血管の反管腔側の表面に結合し、その上に広がった（図２Ａ、Ｂ）。増大は利用された血管上で主に起こった（図２Ｃ、図２Ｄに要約されている）。

【0136】

脳では、転移細胞はアストロサイト（図２Ｅ、９Ｅ、Ｆ）、小膠細胞およびニューロン（図９Ｇ〜Ｊ）の極めて近傍にあった。ＧＦＡＰ過剰発現および星状の形態によって同定される反応性アストロサイトは血管外遊出の直後（３日目）からそれ以降、がん細胞と関連した（図２Ｅ、９Ｅ、Ｆ）。反応性アストロサイトは脳傷害におけるＰＡの主要な供給源であるので（Ａｄｈａｍｉら、２００８年；ＦａｂｂｒｏおよびＳｅｅｄｓ、２００９年；ＧａｎｅｓｈおよびＣｈｉｎｔａｌａ、２０１１年）、これらの細胞が脳転移におけるＰＡの供給源であるかどうかを調査した。転移細胞を有するマウス脳切片はアストロサイトに関連するｔＰＡおよびｕＰＡ免疫反応性を示した（図２Ｆ、Ｇ）。培養物中のマウスアストロサイトは、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換において小膠細胞よりも優れていた（図９Ｋ）。ニューロンは、神経突起およびシナプス形成のためにプラスミノーゲンを産生することが公知である（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００９年；Ｈｏｏｖｅｒ−Ｐｌｏｗら、２００１年）。マウス脳におけるプラスミノーゲン免疫反応性とＮｅｕＮ＋ニューロン周囲の転移細胞の関連性を確認した（図２Ｈ）。したがって、脳転移微小環境は、プラスミン産生に必要な成分を含有する。

【0137】

脳実質内のプラスミンが転移細胞に対して有害であるかどうかを決定するために、培養物中のマウス脳切片を使用した（図２Ｉ）。脳切片の上部に置くと、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞は組織内に遊走し、毛細血管を標的とし、血管の表面上に拡散した（図２Ｊ）。Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞はこれらの条件下で生き残り、増殖したが（図２Ｋ、Ｌ）、親Ｈ２０３０は増殖せず（図２Ｋ、Ｌ）、アポトーシスを受けた（図２Ｍ、Ｎ）。ＭＤＡ２３１細胞を用いて同様の結果が得られた（図９Ｍ）。がん細胞とアストロサイトおよび小膠細胞の共培養物では、プラスミノーゲンの添加により、親Ｈ２０３０ではアポトーシスが誘発されたが、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３ではアポトーシスは誘発されなかった（図９Ｌ）。脳組織切片は内在性プラスミン活性を含有し、プラスミン阻害剤であるα２−抗プラスミン（Ｂａｊｏｕら、２００８年）の添加により、この活性が阻害された（図９Ｎ、Ｏ）。α２−抗プラスミンの添加により、脳切片における親Ｈ２０３０細胞の生存が増加した（図２Ｋ〜Ｎ）。留意点として、がん細胞単層培養物へのプラスミンの添加によりアポトーシスは誘発されなかった（図９Ｐ）。これらの結果により、脳微小環境において未知の基質を通じて作用するプラスミンにより、浸潤性がん細胞が死滅するが、高転移性の細胞はこの脅威から遮蔽されることが示唆された（図２Ｏ）。

【0138】

ニューロセルピンは、転移細胞をプラスミン媒介性減少から保護する。脳転移におけるニューロセルピンの役割を調査するために、まず、このセルピンのみが上方制御されるＨ２０３０−ＢｒＭ３モデルを使用した（図１Ａ参照）。マウスにおいてＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞によって形成された脳病変は強力なニューロセルピン免疫反応性を示した（図１０Ａ）。ニューロセルピンの発現および分泌を８５％超減少させた２種のｓｈＲＮＡ（図１０Ｂ、Ｃ）は、培養物中のＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞の成長に影響を及ぼさなかった（図１０Ｄ）が、マーカーであるルシフェラーゼの生物発光イメージング（ＢＬＩ）ｉｎ−ｖｉｖｏ（図３Ａ〜Ｄ）、ＢＬＩ ｅｘ−ｖｉｖｏ（図３Ｂ）、および脳切片における、マーカーである緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現（図３Ｅ）によって示される通り、これらの細胞の転移活性を阻害した。Ｈ２０３０−ＢｒＭ３におけるニューロセルピン枯渇により、脳病変の数およびサイズの有意な減少が引き起こされ（図３Ｆ、１０Ｅ）、脳腫瘍量の全体的な減少は９０％超であった（図３Ｇ）。発生したわずかな肉眼で見える病変ではニューロセルピンが豊富であり（図１０Ｆ）、これにより、これらの病変がノックダウンを免れた細胞から成長したものであることが示される。

【0139】

ニューロセルピンノックダウンにより、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞の脳実質内への血管外遊出は阻害されなかった（図１０Ｇ）。ニューロセルピンノックダウンはまた、これらの細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて内皮／アストロサイトＢＢＢ様関門を渡る能力にも影響を及ぼさなかったが、ＢＢＢ血管外遊出のメディエーターであるＳＴ６ＧａｌＮａＣ５（Ｂｏｓら、２００９年）のノックダウンは当該能力に影響を及ぼした（図１０Ｈ、Ｉ）。脳切片アッセイにおいて、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞におけるニューロセルピンノックダウンにより、浸潤細胞の数が減少し（図３Ｈ、Ｉ）、アポトーシスが増加したが（図３Ｈ、Ｊ）、親Ｈ２０３０およびＭＤＡ２３１細胞におけるニューロセルピンの過剰発現は逆の影響を及ぼした（図３Ｋ、Ｌ）。要するに、がん細胞におけるニューロセルピン発現により、それらのがん細胞の脳実質における生存および増大が支持された。

【0140】

ニューロセルピンのＰＡ阻害機能によって媒介される脳転移。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてニューロセルピンにより肺がん細胞の脳転移活性が増大し得るかどうかを決定するために、ＰＣ９−ＢｒＭ３モデルを使用した。ＰＣ９−ＢｒＭ３細胞は、脳に浸潤することができるが、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３よりも侵攻性が低く（Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）、抗ＰＡセルピンの上方制御を示さない（図１Ａ、８Ｃ、Ｄ参照）。ＰＣ９−ＢｒＭ３細胞に、野生型ニューロセルピンまたはＰＡ阻害機能を欠く変異体（ニューロセルピンΔｌｏｏｐ）をコードするベクターを用いて安定に形質導入した（Ｔａｋｅｈａｒａら、２００９年）（図１０Ｊ〜Ｌ）。野生型ニューロセルピンによりＰＣ９−ＢｒＭ３細胞の脳転移活性が有意に増大したが、変異体ニューロセルピンでは当該活性が増大せず（図３Ｍ、Ｎ）、培養物中のこれらの細胞の増殖の増加は伴わなかった（図１０Ｍ）。ＰＣ９−ＢｒＭ３細胞はまた、骨への転移性を有するが（Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）、ニューロセルピン過剰発現はこの活性に著しい影響を及ぼさなかった（図３Ｍ、Ｎ）。ニューロセルピンΔｌｏｏｐは親Ｈ２０３０およびＭＤＡ２３１細胞の脳組織におけるアポトーシスからの保護にも効力がなかった（図３Ｋ、Ｌ）。これらの結果により、ニューロセルピンが、ＰＡを阻害することによって、がん細胞における脳転移活性を媒介することが示唆される。

【0141】

脳転移性乳がん細胞における抗ＰＡセルピンの役割。Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞とは異なり、他の大多数の脳転移モデルおよびヒト脳転移組織の大部分は、１種ではなく多数の抗ＰＡセルピンを過剰発現した（図１Ａ、Ｉ参照）。ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２では、３種の過剰発現セルピン−セルピンＢ２、Ｄ１およびニューロセルピンの三重ノックダウン（図１１Ａ〜Ｃ）により、個々のセルピンのいずれかのノックダウンによるものよりも大きく、細胞の脳転移活性が阻害された（図４Ａ、Ｂ、１１Ｇ、Ｈ）。セルピンＢ２のノックダウン（図１１Ｄ、Ｅ）により、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２の脳転移活性が部分的に阻害され、失われた活性は、ニューロセルピンを強制的に過剰発現させることによってレスキューすることができた（図４Ａ、Ｂ、１１Ｆ）。ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２集団から１０クローン細胞株を単離し、各細胞株におけるニューロセルピン、セルピンＢ２およびセルピンＤ１の発現レベルを決定した。セルピン発現のクローンによる不均一性が明らかであり、個々のクローンが１種、２種、または３種全てのセルピンを過剰発現した。親ＭＤＡ２３１集団と比較して、ニューロセルピンはクローンの９／１０において上方制御され、セルピンＢ２はクローンの５／１０において上方制御され、セルピンＤ１はクローンの８／１０において上方制御された（図４Ｃ、１１Ｉ）。傾向として、３種のセルピンを過剰発現するクローンは、より少ないセルピンを過剰発現するクローンよりも脳への転移性が高かった（図４Ｄ、１１Ｊ）。ニューロセルピンおよびセルピンＤ１を過剰発現したクローンでは、ニューロセルピンｓｈＲＮＡを用いて形質導入すると脳転移活性が失われた（図４Ｅ）。ＥｒｂＢ２−ＢｒＭ２モデルでは、セルピンＢ２は、唯一上方制御された抗ＰＡセルピンであった（図１Ａ参照）。これらの細胞におけるセルピンＢ２ノックダウンにより、免疫適格性マウスにおけるそれらの脳転移活性が強力に低下した（図４Ｆ〜Ｈ）。要するに、証拠により、１種または複数種の抗ＰＡセルピンの発現により、肺がんおよび乳がん細胞に脳転移の形成における重大な利点がもたらされることが示された。
転移細胞は脳においてＦａｓＬに面する。プラスミンによる切断が脳転移と関連する可能性があるタンパク質について、プラスミン基質データベース（ＭＥＲＯＰＳ、ＣｕｔＤＢ）を検索した。線維素溶解カスケードにおけるフィブリンの切断に加えて、プラスミンは、ある特定のサイトカイン、膜タンパク質、および細胞外マトリックスの成分を切断することができる（Ｂａｊｏｕら、２００８年；ＣｈｅｎおよびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ、１９９７年；Ｎａｙｅｅｍら、１９９９年；Ｐａｎｇら、２００４年）。プラスミンによる切断が脳内の転移細胞に対して有害である可能性のあるタンパク質として、まずＦａｓＬに焦点を当てた。ＦａｓＬは、受容体Ｆａｓに結合する膜アンカー型ホモ三量体タンパク質であり、アダプタータンパク質ＦＡＤＤを通じてアポトーシス促進性カスパーゼを活性化する（ＡｓｈｋｅｎａｚｉおよびＤｉｘｉｔ、１９９８年）。

【0142】

ＦａｓＬは、虚血、脳外傷、アルツハイマー病、脳脊髄炎および多発性硬化症において、反応性アストロサイトに高度に発現する（ＣｈｏｉおよびＢｅｎｖｅｎｉｓｔｅ、２００４年；Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、２００３年）。アストロサイトは、実験的な脳脊髄炎における侵入性Ｔ細胞へのＦａｓＬの主要な供給源である（Ｗａｎｇら、２０１３年）。プラスミンは膜アンカー型ＦａｓＬをＡｒｇ１４４において切断し、それにより、可溶性アポトーシス促進性断片（ｓＦａｓＬ）が放出される（Ｂａｊｏｕら、２００８年；Ｆａｎｇら、２０１２年）。したがって、抗ＰＡセルピンは、プラスミンに動員されるｓＦａｓＬの致死作用からがん細胞を遮蔽するという仮説を試験した（図５Ａ）。

【0143】

Ｈ２０３０−ＢｒＭ３病変を有する脳切片の免疫蛍光染色により、ＦａｓＬが病変内の反応性アストロサイト上に主に発現することが確認された（図５Ｂ、１２Ａ）。ヒトおよびマウスアストロサイトも培養物中でＦａｓＬを発現した（図５Ｃ、１２Ｂ）。これらの培養物にプラスミノーゲンを添加することにより、ＦａｓＬの細胞外ドメインに対する抗体を用いた免疫染色およびウエスタンブロッティングによって決定された通り、上清中の切断産物を増加させる細胞関連ＦａｓＬのレベルが低下した（図５Ｃ、Ｄ、１２Ｃ〜Ｅ）。活性なプラスミンを含有するマウス脳切片（図２Ｋ、９Ｏ参照）もｓＦａｓＬを含有した。抗ＰＡセルピンまたは抗プラスミンの添加により、これらの組織におけるｓＦａｓＬのレベルが低下した（図５Ｅ）。これらの結果により、ＰＡ−プラスミン系の、脳において間質ＦａｓＬを動員する能力が示唆された。

【0144】

次に、脳に浸潤するがん細胞がＦａｓＬ媒介性死滅を受けやすいかどうかを調査した。Ｈ２０３０、ＰＣ９、ＭＤＡ２３１およびＣＮ３４は、それらのＢｒＭ誘導体と同様にＦａｓを発現した（図１２Ｆ）。ｓＦａｓＬをＢｒＭ細胞単層に添加することにより、アポトーシスが引き起こされた（図１２Ｇ〜Ｉ）。Ｈ２０３０−ＢｒＭ３を有する脳切片へのｓＦａｓＬの添加（図５Ｆ〜Ｈ）、α２−抗プラスミン（図２Ｎ参照）が培養物中に存在する場合でさえ（図Ｓ５Ｊ）。逆に、抗ＦａｓＬ遮断抗体を添加することにより、親Ｈ２０３０細胞がアポトーシスから保護された（図５Ｇ〜Ｉ）。したがって、脳転移細胞は、脳実質においてＦａｓＬに曝露すると、アポトーシスを非常に受けやすい。

【0145】

ニューロセルピンは、脳転移細胞をＦａｓ媒介性死滅から遮蔽する。Ｆａｓシグナル伝達により、脳に浸潤したがん細胞の死滅が引き起こされるかどうかを決定するために、デスエフェクタードメインを欠き（ＦＡＤＤ−ＤＤ構築物）、Ｆａｓシグナル伝達のドミナントネガティブ阻害剤として作用するＦＡＤＤ切断変異体を使用した（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、１９９６年）（図５Ｊ）。ＦＡＤＤ−ＤＤをＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞株に形質導入することにより（図５Ｋ）、ｓＦａｓＬによるカスパーゼ３の活性化が妨げられた（図５Ｌ）。抗ＰＡセルピン枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３またはＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞が脳組織において受けるアポトーシス（図３Ｈ〜Ｊ、１２Ｌ参照）は、抗ＦａｓＬ遮断抗体を組織培養物に添加すること、ならびに細胞においてＦＡＤＤ−ＤＤの発現を強制することによって妨げることができた（図５Ｍ、Ｎ、１２Ｌ）。さらに、ＦＡＤＤ−ＤＤにより、ニューロセルピン枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞の脳内に転移する能力が部分的にレスキューされた（図５Ｏ）。集合的に、これらの結果により、脳に浸潤するがん細胞はＦａｓシグナル伝達により死滅し、抗ＰＡセルピン活性により転移細胞がＦａｓＬ攻撃から遮蔽され得ることが示された。

【0146】

プラスミンは、Ｌ１ＣＡＭにより媒介されるがん細胞の脳内皮細胞への拡散を標的とする。ＦＡＤＤ−ＤＤを用いたＦａｓシグナル伝達の阻害により、ニューロセルピン枯渇がん細胞が脳における死滅から明白に保護されたが、これらの細胞の転移活性は野生型Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞の転移活性と比較して、完全には回復しなかった（図５Ｏ）。ニューロセルピン枯渇ＦＡＤＤ−ＤＤ発現Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞は、脳内の毛細血管の横に十分に組織化されていないより小さな病変を形成した（図１３Ａ）。したがって、抗ＰＡセルピンは、単にＦａｓＬ作用を妨げる以上のことを行うことによって脳転移を促進すると仮定した。

【0147】

いくつかの糸口に導かれ、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）をセルピン−ＰＡ−プラスミン系の下流の追加的な脳転移のメディエーターとして検討した。Ｌ１ＣＡＭは、神経組織および腫瘍において主に発現する（ＳｃｈａｆｅｒおよびＡｌｔｅｖｏｇｔ、２０１０年）。Ｌ１ＣＡＭは、６つの免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン、５つのフィブロネクチン様（ＦＮ）ドメイン、膜貫通領域、および細胞内ドメインからなる（図６Ａ）。Ｌ１ＣＡＭ Ｉｇ様リピートは、脳の発生中の軸索誘導のための同種親和性相互作用および異種親和性相互作用を媒介する（ＭａｎｅｓｓおよびＳｃｈａｃｈｎｅｒ、２００７年）。Ｌ１ＣＡＭは、それ自体にも、βインテグリン（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、１９９７年）および他のタンパク質（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら、２００２年；Ｄｏｎｉｅｒら、２０１２年；Ｋｕｌａｈｉｎら、２００８年）にも結合し、シグナル伝達および細胞骨格リモデリングを誘発する（Ｈｅｒｒｏｎら、２００９年）。遺伝性Ｌ１ＣＡＭ変異によりＬ１神経症候群が引き起こされるが（Ｄｅｍｙａｎｅｎｋｏら、１９９９年；ＭａｎｅｓｓおよびＳｃｈａｃｈｎｅｒ、２００７年；ＶｏｓおよびＨｏｆｓｔｒａ、２０１０年）、腫瘍におけるＬ１ＣＡＭ発現は、予後不良を伴う（Ｂｏｏら、２００７年；Ｆｏｇｅｌら、２００３年；Ｈａｉら、２０１２年；Ｔｈｉｅｓら、２００２年；Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、２０１１年；Ｚｈｕら、２０１０年）。Ｌ１ＣＡＭは細胞浸潤に関係付けられているが（Ｖｏｕｒａら、２００１年）、がんにおけるその役割に関してはほとんど分かっていない。プラスミンによりＬ１ＣＡＭが二塩基モチーフ（Ｌｙｓ８６０／Ｌｙｓ８６３）において切断され、細胞間接着の能力が妨害される（Ｎａｙｅｅｍら、１９９９年；Ｓｉｌｌｅｔｔｉら、２０００年）（図６Ａ）。

【0148】

Ｌ１ＣＡＭは、種または起源の腫瘍型にかかわらず、調査したほとんどの親系統および全ての脳転移性誘導体で発現した（図１３Ｂ、Ｃ）。Ｌ１ＣＡＭの、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞とヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）の単層の間の異型相互作用およびＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞の単層間の同型相互作用のメディエーターとしての役割を調査した。Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞は、ＨＢＭＥＣ単層に容易に接着した（図６Ｂ）。特に、Ｌ１ＣＡＭのＲＮＡｉ媒介性ノックダウン（図１３Ｂ）により、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３細胞のＨＢＭＥＣ（図６Ｃ）またはＨ２０３０−ＢｒＭ３単層（図６Ｄ）に結合する能力が阻害された。

【0149】

Ｈ２０３０−ＢｒＭ３、ＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２およびＰＣ９−ＢｒＭ３の単層にプラスミンを添加することにより、抗Ｌ１ＣＡＭフローサイトメトリー（図６Ｅ）および上清中の１５０ｋＤａのＬ１ＣＡＭ断片の蓄積（図６Ｆ）によって示される通り、細胞に付随する２２０ｋＤａのＬ１ＣＡＭレベルの低下が引き起こされた（Ｍｅｃｈｔｅｒｓｈｅｉｍｅｒら、２００１年）。さらに、プラスミン処理したＨ２０３０−ＢｒＭ３細胞はＨＢＭＥＣ単層に結合する能力を失った（図６Ｇ、Ｈ）。

【0150】

Ｌ１ＣＡＭは血管利用および転移増大を媒介する。がん細胞による血管利用に関する分子基盤は依然として不明である。Ｌ１ＣＡＭの、脳転移細胞のＨＢＭＥＣへの接着を媒介する能力を考慮して、がん細胞Ｌ１ＣＡＭが脳における血管利用に関与するかどうかを調査した。野生型およびＬ１ＣＡＭ枯渇Ｈ２０３０−ＢｒＭ３は培養物中で同様の増殖速度（図１３Ｄ）、および、同様の、脳組織に浸潤し、脳毛細血管を探す能力（図６Ｉ、１３Ｅ）を示した。しかし、Ｌ１ＣＡＭ枯渇により、Ｈ２０３０−ＢｒＭ３およびＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２細胞の脳毛細血管の反管腔側の表面上に拡散する能力が有意に低下した（図６Ｉ、Ｊ、１３Ｇ）。特に、Ｌ１ＣＡＭ枯渇には、血管に付随するがん細胞（図６Ｋ）における増殖マーカーであるＫｉ６７の顕著な減少が伴ったが、アポトーシスマーカーは変化しなかった（図１３Ｆ）。

【0151】

ＰＣ９−ＢｒＭ３細胞は内在性抗ＰＡセルピンを過剰発現しない。興味深いことに、脳切片アッセイにおいて、ほんの小さな割合のＰＣ９−ＢｒＭ３細胞のみが毛細血管上に拡散する（図６Ｌ、Ｍ）。これらの細胞の転移活性を強化するニューロセルピンをＰＣ９−ＢｒＭ３細胞において強制的に発現させることにより（図３Ｎ参照）、脳毛細血管へのそれらの拡散（図６Ｌ、Ｍ）および利用された血管でのそれらの増殖（図６Ｎ）が有意に増加した。重要なことに、ニューロセルピン過剰発現ＰＣ９−ＢｒＭ３細胞におけるＬ１ＣＡＭ枯渇（図１３Ｈ、Ｉ）により、血管利用および細胞増殖のニューロセルピン依存性の増加が抑止された（図６Ｌ〜Ｎ）。これらの結果により、Ｌ１ＣＡＭが脳内の転移細胞の血管利用および増大を媒介することが示された。

【0152】

Ｌ１ＣＡＭは、ニューロセルピンの下流の転移開始を支持する。Ｌ１ＣＡＭのｉｎ ｖｉｖｏでの脳転移における役割を調査した。Ｈ２０３０−ＢｒＭ３微小転移のＬ１ＣＡＭの免疫組織化学的分析により、この分子が内皮細胞との境界面（小さな、平らな形態の核および強いＨ−Ｅ染色により同定される）および隣接するがん細胞との境界面に局在化することが示された（図７Ａ）。Ｈ２０３０−ＢｒＭ３およびＭＤＡ２３１−ＢｒＭ２におけるＬ１ＣＡＭノックダウンにより、マウスにおけるこれらの細胞の転移活性が著しく低下した（図７Ｂ〜Ｄ）。７日目の組織学的分析により、Ｌ１ＣＡＭ枯渇した細胞は脳内に血管外遊出した後、毛細血管ネットワーク上に拡散しないことが示された（図７Ｅ）。２１日後、これらのコロニーは微小転移性段階で失速した（図３Ｆにおいて定義されている通り）（図７Ｆ、Ｇ）。野生型細胞は毛細血管ネットワークにわたって容易に拡大増殖し、大きなコロニーを形成したが、Ｌ１ＣＡＭ枯渇した細胞は大部分が毛細血管に不十分に結合した単一細胞または小さなクラスターのままであった（図７Ｆ、Ｇ）。さらに、ＰＣ９−ＢｒＭ３における、ニューロセルピンを強制的に過剰発現させることによって与えられる転移活性の獲得は、これらの細胞におけるＬ１ＣＡＭノックダウンによって抑止された（図７Ｈ）。これらの結果により、転移細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現が、ニューロセルピンの下流で脳毛細血管の利用および転移増大を媒介するように作用することが立証された。
６．３考察

【0153】

脳転移の発生率が増していることにより、この条件の基礎をなす分子機構のよりよい理解が保証される。我々の知見は、脳の転移コロニー形成に関する２つの重大な要件、すなわち、浸潤性がん細胞が反応性間質からの致死的シグナルによる死滅を免れること、および、生存がん細胞の、転移性拡大増殖の間に脳毛細血管を利用する著しい能力を解明するものである。我々は、間質ＰＡ−プラスミン経路および癌腫由来抗ＰＡセルピンによるその阻害により、肺がんからの脳転移および乳がんからの脳転移の両方におけるこれらのプロセスが制御されることを示し、これにより、脳の転移コロニー形成のための統合された機構が示唆される。

【0154】

脳転移の共通のメディエーターとしての抗ＰＡセルピン。脳転移には、がん細胞と脳毛細血管および反応性アストロサイトの密接かつ持続的な相互作用が必要とされる。以前の研究（Ｋｉｅｎａｓｔら、２０１０年；ＬｏｒｇｅｒおよびＦｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ、２０１０年）および我々自身のデータにより、脳毛細血管内の循環がん細胞が、血管外遊出の間だけでなく、その後も同様に、利用された血管に沿った溝として転移増大するために反管腔側の表面に付着することによってＢＢＢ内皮と相互作用することが示される。がん細胞はまた、血管周囲の空間に存在し、内皮と接触してＢＢＢを形成するアストロサイトにすぐに曝露される（Ａｂｂｏｔｔら、２００６年）。我々は、アストロサイトが、侵入細胞を寄せつけないための有害なシグナルの供給源として作用することを示す。アストロサイトは、最終的に、増殖因子（Ｓｅｉｋｅら、２０１１年）およびＧＡＰ結合（Ｌｉｎ、２０１０年）をもたらすことによって脳転移の成長を支持し得る。しかし、これらの栄養インプットから利益を受けるためには、がん細胞はまず反応性間質の有害作用を妨げなければならない。

【0155】

がん細胞における抗ＰＡセルピンの発現により、そのような遮蔽がもたらされる。我々は、ヒトまたはマウス起源の脳転移性肺がん細胞および脳転移性乳がん細胞が、脳への転移性が低い対応物と比較して高レベルの抗ＰＡセルピンを発現することを示す。公知の抗ＰＡセルピン４種のうちの３種、およびセルピンＤ１は、我々が調査した６つの実験モデルにおいて発現する。これらのモデルにおける最も顕著な抗ＰＡセルピンであるニューロセルピンおよびセルピンＢ２は、我々が調査した肺がんおよび乳がん患者由来のヒト脳転移試料の大多数においても発現する。機能アッセイでは、これらのセルピンおよびそれらのＰＡ阻害活性は脳の転移コロニー形成を限定するものである。

【0156】

ＰＡ−プラスミン系は、血餅溶解におけるその役割と関連してよく特徴付けられている。しかし、がんでは、ＰＡ−プラスミン系は、腫瘍抑制と腫瘍の進行の両方に逆説的に関係する。プラスミンは、がん細胞の増殖および浸潤を、増殖因子前駆体および細胞外マトリックスの成分を切断することによって促進すると考えられている（ＭｃＭａｈｏｎおよびＫｗａａｎ、２００８年）。しかし、腫瘍中および血液中の抗ＰＡセルピンＥ１は、肺がん、乳がん、および胃腸がんの臨床転帰不良に関連する（Ａｌｌｇａｙｅｒら、１９９７年；Ｂｅｒｇｅｒ、２００２年；Ｆｏｅｋｅｎｓら、１９９５年；Ｈａｒｂｅｃｋら、１９９９年）。肺がん中のセルピンＢ２についても同じことが当てはまる（Ｍｏｒｉｔａら、１９９８年）。したがって、腫瘍の進行におけるＰＡおよびプラスミンの役割は不明瞭なままである。本明細書において、我々は、抗ＰＡセルピンが転移細胞を脳におけるＰＡ−プラスミンから遮蔽し、明らかな転移促進利点を伴うことを示す。

【0157】

脳におけるＦａｓ死滅シグナルからのがん細胞の遮蔽。我々の結果により、ＦａｓＬを通じて作用するＰＡ−プラスミン系により、脳における浸潤性がん細胞に非常に適さない環境が創出されることが示唆される。ＦａｓＬは免疫恒常性において重要な役割を果たし（Ｋｒａｍｍｅｒ、２０００年）、腫瘍内に存在するが（Ｂａｌｄｉｎｉら、２００９年）、その発現は反応性アストロサイトにおいて特に急性のものである（Ｂｅｅｒら、２０００年）。アストロサイトは、浸潤性白血球に応答したＦａｓＬ、および脳傷害に応答したＰＡの主要な供給源である（Ａｄｈａｍｉら、２００８年；Ｂｅｃｈｍａｎｎら、２００２年；ＧａｎｅｓｈおよびＣｈｉｎｔａｌａ、２０１１年；Ｔｅｅｓａｌｕら、２００１年）。アストロサイト由来ＦａｓＬは、脳に侵入してくる自己免疫性Ｔ細胞を寄せつけないことにおいて中心的な役割を果たす（Ｗａｎｇら、２０１３年）。我々は、転移関連アストロサイトがＰＡとＦａｓＬの両方を発現すること、プラスミンが膜に結合したＦａｓＬをアストロサイトから放出させること、および脳組織におけるｓＦａｓＬレベルがプラスミンに依存することを認めた。抗ＰＡセルピン、抗プラスミンセルピン、またはＦａｓＬ−遮断抗体を脳組織に添加することにより、浸潤性がん細胞が保護される。さらに、肺がんまたは乳がん由来の脳転移細胞はｓＦａｓＬに誘導されるアポトーシスに対する感受性が高く、抗ＰＡセルピンを発現しなければ、脳におけるＦａｓ依存性死滅を受ける。我々は、脳における浸潤性がん細胞の減少がＦａｓシグナル伝達によって媒介され、抗ＰＡセルピンによって妨害されると結論づける。したがって、抗ＰＡセルピンを発現するがん細胞は、ＰＡが豊富な脳の微小環境において強力な利点を有する。

【0158】

転移増大のためのＬ１ＣＡＭ媒介性血管利用。ＦａｓＬ媒介性死滅の回避は抗ＰＡセルピンによってもたらされる唯一の転移促進利益ではない。我々は、ニューロセルピンがさらに血管利用−脈管構造上へのがん細胞の拡散を促進することを示す。この効果は、がん細胞におけるプラスミン不安定分子Ｌ１ＣＡＭの発現に依存する。Ｌ１ＣＡＭ発現は通常ニューロンに制限され、そこで成長円錐と周囲の成分の相互作用を通じて軸索誘導を媒介する（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら、２００２年；Ｗｉｅｎｃｋｅｎ−Ｂａｒｇｅｒら、２００４年）。我々は、がん細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現により、培養物中の脳内皮細胞および脳内の毛細血管へのがん細胞の接着および拡散が媒介されることを示す。Ｌ１ＣＡＭはさらにがん細胞間の相互作用を媒介する。プラスミンはＬ１ＣＡＭを切断し、これらの結合活性を不活化する。Ｌ１ＣＡＭを枯渇させると、脳転移細胞は脳毛細血管を利用できず、転移増大が失速する。この証拠により、ニューロセルピンにより脳転移細胞におけるＬ１ＣＡＭのプラスミン媒介性破壊が妨げられ、これらの細胞による血管利用が促進され、転移がさらに増強されることが示唆される。

【0159】

Ｌ１ＣＡＭが毛細血管上へのがん細胞拡散のメディエーターであるという知見により、がんにおける血管利用に関する分子基盤に関する予想外の洞察がもたらされる。脳転移の著しい特徴は、転移細胞の、血管外遊出後に毛細血管ネットワークに密接に付着し続ける能力である（Ｋｉｅｎａｓｔら、２０１０年；ＬｏｒｇｅｒおよびＦｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ、２０１０年）。血管利用は、脳転移のために（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、２００９年）、および、がん細胞が療法に誘導される低酸素状態から免れるために（Ｌｅｅｎｄｅｒｓら、２００４年）重要であると考えられている。がんにおける血管利用が重要である可能性にもかかわらず、このプロセスの分子基盤は分かっていない。Ｌ１ＣＡＭが転移性血管利用のメディエーターであることのこの同定により、このプロセスの機構的および機能的解明のきっかけがもたらされる。

【0160】

脳転移以上の意味。本明細書で同定される分子機構は、転移細胞を脳において特に急性である選択圧力から保護するものであるが、他の状況にも関連する可能性がある。遠隔器官に浸潤するがん細胞の高死滅率が一般に転移の特性であり（ＧｕｐｔａおよびＭａｓｓａｇｕｅ、２００６年；ＶａｌａｓｔｙａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０１１年）、他の器官への転移における、および他の型のがんによる血管利用が観察されている（Ｂｌｏｕｗら、２００３年；Ｌｅｅｎｄｅｒｓら、２００２年；Ｌｅｅｎｄｅｒｓら、２００４年）。脳微小環境はがん細胞における、脳特異的転移性形質を確実に選択することができるものである（Ｂｏｓら、２００９年；Ｎｇｕｙｅｎら、２００９年ｂ）。しかし、死滅シグナルから逃れ、脈管構造と相互作用することが、脳だけではなく全ての器官において転移細胞にとって基本的に必要である。我々は、我々の脳転移モデルにおいて過剰発現するセルピンは、たとえ低いレベルであっても、他の器官に転移する対応物においても発現することに注目する（図１Ｂ参照）。さらに、原発腫瘍におけるＬ１ＣＡＭ発現は、種々の型のがんにおける予後不良に関連する（Ｂｏｏら、２００７年；Ｄｏｂｅｒｓｔｅｉｎら、２０１１年；Ｆｏｇｅｌら、２００３年；Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、２００９年；Ｔｈｉｅｓら、２００２年；Ｔｉｓｃｈｌｅｒら、２０１１年；Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、２０１１年）。ＰＡ、プラスミン、およびＦａｓＬも他のがんにおける疾患の進行に関係付けられている（ＭｃＭａｈｏｎおよびＫｗａａｎ、２００８年；Ｔｉｍｍｅｒら、２００２年）。反応性脳間質、ならびにＰＡ−プラスミンおよびＦａｓＬを生成するその高い能力は、他の器官の間質よりも浸潤性がん細胞に対して攻撃的であり得る。結果として、脳は、他では一般的な転移性形質の顕著なバージョンを選択することができる。抗ＰＡセルピン、プラスミン、ＦａｓＬおよびＬ１ＣＡＭは以前には統合機構に結びつけられず、転移細胞の生存および血管利用にも関連付けられていないが、それらの予後不良との反復的な臨床的関連性は、転移におけるより広い役割を反映し得る。
７．実施例：転移開始における血管利用

【0161】

脳、骨および肺への転移の開始において血管利用が観察された。図１４Ａ〜Ｃは、ＧＦＰ発現がん細胞の血管利用を示し、血管が赤色ＣｏｌＩＶ染色で示されている。一番左のパネルでは、がん細胞は肺腺癌、ＫＲＡＳ変異体（細胞株Ｈ２０３０−ＢｒＭ３）である。中央のパネルでは、がん細胞は乳腺癌、サブタイプ低クローディントリプルネガティブ、細胞株ＭＤＡ２３１−ＳＣＰ６である。一番右のパネルでは、がん細胞は乳腺癌、サブタイプ低クローディントリプルネガティブ、細胞株ＭＤＡ２３１−ＬＭ２である。
８．実施例：Ｌ１ＣＡＭの関与は、がん細胞の成長および散在に必要な一般的な機構である

【0162】

異常なＬ１ＣＡＭ発現は、原発腫瘍の前縁において実証されており、また、肺癌、乳癌および結腸癌を含めた多くのヒトがんにおける浸潤、転移および予後不良に関連付けられている（Ｖｏｕｒａら、２００１年；Ｂｅｎら、２０１０年；Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、２０１１年；Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、２００９年；Ｔｉｓｃｈｌｅｒら、２０１１年；Ｂｏｏら、２００７年；Ｃｈｅｎら、２０１３年；Ｆｏｇｅｌら、２００３年ａ；Ｄｏｂｅｒｓｔｅｉｎら、２０１１年；Ｆｏｇｅｌら、２００３年ｂ；Ｋｉｍら、２００９年；Ｍａｎｅｓｓら、２００７年）。これにより、Ｌ１ＣＡＭ発現から得られる選択的利点は脳に制限されないことが示唆された。したがって、中枢神経系の外側への転移におけるＬ１ＣＡＭの役割を評価するために実験を実施した。

【0163】

がん細胞におけるＬ１ＣＡＭ発現を、がん細胞にｐＬＫＯ．１−ｓｈＲＮＡベクターによって導入した、ヘアピン配列５’ＣＧＧＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号１）および標的配列ＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴ（配列番号２）を有するＲＮＡｉを含めたＲＮＡｉ（（ＴＲＣＮ０００００６３９１６；Ｔｈｅ ＲＮＡｉ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｐｕｂｌｉｃ ＴＲＣ Ｐｏｒｔａｌ）を使用して阻害した。ヒトＭＤＡ２３１乳がん細胞およびＨ２０３０ヒト肺がん細胞を、このようにＬ１ＣＡＭを枯渇させた（図において「ｓｈＬ１ＣＡＭ」と示されている）。

【0164】

ｓｈＬ１ＣＡＭ ＭＤＡ２３１−ＢｏＭ２（骨転移）もしくはＭＤＡ２３１−ＬＭ２（肺転移）細胞、または対照ＭＤＡ２３１−ＢｏＭ２もしくはＭＤＡ２３１−ＬＭ２（肺転移）細胞１００，０００個を、胸腺欠損マウスに心臓内注射（骨転移）または尾静脈注射（肺転移）によって導入し、２１日後に生物発光イメージングを使用して骨および肺転移の量を決定した。図１５ＡおよびＢに示されている通り、それぞれ骨および肺における転移性疾患の程度は、Ｌ１ＣＡＭ枯渇がん細胞を受けたマウスにおいて劇的に低下した。対照（非枯渇）またはｓｈＬ１ＣＡＭ Ｈ２０３０ヒト肺がん細胞５０００個をマウス肺に注射したところ、同様の結果が観察された。図１５Ｃは、４週間後の同所性肺注射の部位における腫瘍の成長を示す。図１５Ｄは、４週間後の対側肺への転移を示す。図１５Ｅは、対照またはｓｈＬ１ＣＡＭ ＭＤＡ２３１−ＬＭ２がん細胞５０，０００個の乳房脂肪パッド注射部位における腫瘍体積を示し、図１５Ｆは、９週間後のこれらの細胞の肺または肝臓への転移の程度を示す。これらの実験の全てにおいて、Ｌ１ＣＡＭ枯渇（Ｌ１ＣＡＭ阻害）により転移性疾患の進行が有意に低下した。

【0165】

さらに、図１６Ａ〜Ｂに示されている通り、Ｌ１ＣＡＭ枯渇により、定義済みの無接着条件で成長させた（Ａ）肺がん細胞（Ｈ２０３０−ＢｒＭ３）または（Ｂ）乳がん細胞（Ｈｃｃ１９５４−ＢｒＭ１ｂ）に由来する細胞間相互作用富化腫瘍球凝集体の成長が阻害されることが観察された。

【0166】

これらの実験結果により、内皮細胞に由来するものか腫瘍内細胞間接触に由来するものかにかかわらず、Ｌ１ＣＡＭの関与によってがん細胞に成長および生存の利点が付与されることが示される。

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【0167】

種々の刊行物が本明細書において引用されており、その内容全体がこれによって参照により組み込まれる。

【図1A】

【図1BCD】

【図1EFG】

【図1HI】

【図2ABCD】

【図2E】

【図2FGHIJ】

【図2KLM】

【図2NO】

【図3ABC】

【図3DEFGH】

【図3IJKL】

【図3MN】

【図4ABC】

【図4DEFGH】

【図5ABCDE】

【図5FGH】

【図5IJKL】

【図5MNO】

【図6ABCD】

【図6EFGH】

【図6IJK】

【図6LMN】

【図7ABCDE】

【図7FGHI】

【図8ABC】

【図8DEF】

【図8GHIJ】

【図9AB】

【図9CDEFGHIJ】

【図9KLMNOP】

【図10ABCD】

【図10EF】

【図10GHIJKLM】

【図11ABCDEF】

【図11GH】

【図11IJ】

【図12ABCDEF】

【図12GH】

【図12I】

【図12JKL】

【図13ABCD】

【図13EFGHI】

【図14】

【図15AB】

【図15CD】

【図15EF】

【図16】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]