特許 6703973 β２ｍタンパク質の治療的使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6703973

(24)【登録日】2020年5月13日

(45)【発行日】2020年6月3日

(54)【発明の名称】β２ｍタンパク質の治療的使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20200525BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200525BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/16

   A61P37/02

   A61P29/00 101

   A61P19/02

   A61P17/00

   A61P21/00

   A61P5/14

   A61P3/10

   A61P1/04

   A61P25/00

   A61P43/00 111

【請求項の数】14

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2017-250624(P2017-250624)

(22)【出願日】2017年12月27日

(62)【分割の表示】特願2016-20393(P2016-20393)の分割

【原出願日】2011年4月6日

(65)【公開番号】特開2018-76356(P2018-76356A)

(43)【公開日】2018年5月17日

【審査請求日】2018年1月25日

(31)【優先権主張番号】61/346,617

(32)【優先日】2010年5月20日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】10290188.1

(32)【優先日】2010年4月8日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】512259248

【氏名又は名称】ベータ・イノブ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マルセル・メルセル

(72)【発明者】

【氏名】クロビス・ラコトアリブロ

【審査官】 岩下 直人

(56)【参考文献】

【文献】 臨床免疫・アレルギー科，２００７年，Vol.47, No.2, ，p.170-173

【文献】 Biochimica et Biophysica Acta, 2007, vol.1772, p.1258-1269

【文献】 FEBS Letters, 2004, vol.575, p.1-8

【文献】 Clinica Chimica Acta, 1995, vol.233, p.101-104

【文献】 Clinical rheumatology, 1997, vol.16, No.2, p.149-153

【文献】 Arthritis & Rheumatism, [online], 2010.11,，[2016年11月22日]，ＵＲＬ，http://www.blackwellpublishing.com/acrmeeting/abstract.asp?MeetingID=774&id=90095

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／１６

Ａ６１Ｐ １／０４

Ａ６１Ｐ ３／１０

Ａ６１Ｐ ５／１４

Ａ６１Ｐ １７／００

Ａ６１Ｐ １９／０２

Ａ６１Ｐ ２１／００

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３７／０２

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

β２−ミクログロブリンまたはヒトβ２−ミクログロブリンタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を示す該タンパク質の機能変異体を活性成分として含む、自己免疫疾患の治療のための医薬品であって、
該活性成分は食塩水形態で調製し、投与前に、治療しようとする患者の血液または血清と前もってエキソビボで接触させてインキュベートする、医薬品。

【請求項2】

活性成分はヒトβ２−ミクログロブリンタンパク質である請求項１に記載の医薬品。

【請求項3】

治療を受ける自己免疫疾患はリウマチ性多発性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、線維筋痛、筋炎、強直性脊椎炎、Ｉ型インスリン依存性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、クローン病、セリアック病、多発性硬化症または筋萎縮性側索硬化症である請求項１または２に記載の医薬品。

【請求項4】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のための請求項１または２に記載の医薬品。

【請求項5】

多発性硬化症の治療のための請求項１または２に記載の医薬品。

【請求項6】

クローン病の治療のための請求項１または２に記載の医薬品。

【請求項7】

リウマチ性多発性関節炎の治療のための請求項１または２に記載の医薬品。

【請求項8】

Ｉ型インスリン依存性糖尿病の治療のための請求項１または２に記載の医薬品。

【請求項9】

自己免疫疾患を患っている患者における血液β２−ミクログロブリンの比を２．５〜１２ｍｇ／ｌの間の濃度に上昇させるための請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬品。

【請求項10】

自己免疫疾患を患っている患者における膜ＭＨＣ−Ｉ複合体内の正常なＨＣ／β２−ミクログロブリンモル比を戻すための請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬品。

【請求項11】

自己免疫疾患を患っている患者においてＭＨＣ−Ｉ複合体中のβ２−ミクログロブリン欠乏が生ずるのを予防するための請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬品。

【請求項12】

自己免疫疾患を罹患している患者において、血液β２−ミクログロブリン比を、３ｍｇ／ｌ〜８ｍｇ／ｌの間の濃度に上昇させるための、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬品。

【請求項13】

自己免疫疾患を罹患している患者において、血液β２−ミクログロブリン比を、３ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌの間の濃度に上昇させるための、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬品。

【請求項14】

請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬品を含む、自己免疫疾患の治療のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本特許出願は医学分野、特に自己免疫疾患の治療の医学分野に関する。

【0002】

本発明は、より詳しくはβ２−ミクログロブリンタンパク質（β２ｍ）の特に自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症またはクローン病）の治療のために意図される医薬組成物中の活性成分としての使用に関する。

【背景技術】

【0003】

β２ｍタンパク質は、通常９９アミノ酸から形成される約１１．６ｋＤａの平均分子量を有し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ ＩまたはＨＬＡ Ｉ）を構成する［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｂ．Ａ．ら，Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂｅｔａ−２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（１９７３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２：４８１１−４８２１］。

【0004】

ＭＨＣ Ｉ組織適合遺伝子複合体が免疫系による「自己」及び「非自己」の認識において重要な役割を発揮することを思い出されたい。これらの複合体は、赤血球を除く多くのヒト細胞の表面上に存在している。その表面上には多数の抗原が存在しており、その抗原に基づいてＴリンパ球（ＣＤ８）は個人の細胞を異物である、病的であるまたは腫瘍変換プロセスを受けている細胞から区別することができる。

【0005】

ＭＨＣ Ｉ複合体は、約４４ｋＤａのグリコシル化重鎖（ＨＣ）及び重鎖の細胞外ドメインと非共有的に会合している軽鎖のβ２ｍから構成される。ＭＨＣ Ｉのα鎖は、図１Ａに示すように３つの細胞外ドメイン（α１、α２及びα３）及び膜貫通セグメントから構成されている。β２ｍは、ＨＣ中のα１ドメインの末端及びα３ドメインの始めが近接しているゾーン中に位置するアミノ酸配列に会合する［Ｇｕｓｓｏｖ，Ｄ．ら（１９８７），Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ：ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｕｎｉｔ（１９８７），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３９：３１３２−３１３８］。ＭＨＣ Ｉ分子をコードする遺伝子はその発見順に番号が付与され、群（Ａ、Ｂ及びＣ）及び複合体（Ｄ、Ｈ及びＧ）に分類されている。

【0006】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、免疫系のＴ細胞（ＣＤ８）に対する抗原プレゼンターとしてＭＨＣ Ｉタイプの複合体を使用する。ＭＨＣ Ｉにより提示される抗原は、通常内因性タンパク質のプロテアソームによる開裂により生ずる８〜１０アミノ酸を有する各種ポリペプチドにより構成されている。これらの抗原は、小胞体内で形成されている間ＭＨＣ Ｉ複合体のサブユニット（ＨＣ及びβ２ｍ）の表面上に存在するペプチド腔に負荷される。抗原が負荷されると、ＭＨＣ複合体は細胞の表面に運ばれる。次いで、α３ドメインに位置する重鎖の膜貫通ドメインにより、ＭＨＣ Ｉ複合体は血漿膜に固定される。

【0007】

β２ｍタンパク質により形成されるサブユニットは、配列が事実上不変であり、そのポリペプチド鎖がグリコシル化されていない点で重鎖と区別される。

【0008】

その生理学的役割はまだ十分に解明されていなくとも、β２ｍタンパク質は、抗原結合部位のコンホメーションが維持できるように［Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，Ｈ−Ｇ．（１９９０），Ｅｍｐｔｙ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｍｅ ｏｕｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６，４７６−４８０］、β２ｍタンパク質がＴＡＰ−１タンパク質に特異的に結合している［Ｃｏｒｒら，１９９２，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｈ−２Ｌｄｓ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＪＥＭ，１７６（６）：１９８１−９２］ＭＨＣ Ｉ／抗原複合体の構築時に［Ａｎｄｒｏｌｅｗｉｃｚ ＭＪ．ら（１９９４），ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ ＴＡＰ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｂｅｆｏｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８６４−８６７］、他方ではＭＨＣ Ｉ／抗原複合体が細胞表面に運ばれるときに、ＭＨＣ Ｉ複合体を形成する他のタンパク質に対して重要な役割を発揮する。β２ｍは重鎖のフォールディングに関与し、抗原のＴ細胞（ＣＤ８）への提示に関与していることも知見されている。β２ｍはＭＨＣ−Ｉ／抗原複合体の安定性にも寄与する［Ｎｅｅｆｊｅｓ，Ｆ．Ｆ．ら（１９９３），Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ＭＨＣ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１（５１２２）：７６９−７７１］。

【0009】

β２ｍを欠くトランスジェニック動物は生存可能であるが、弱化した免疫応答を呈し、ウイルスや寄生虫感染に対してより感受性となる。これらの動物における免疫応答の低下は、細胞がＭＨＣ Ｉ複合体に対して非常に少数の抗原しか提示せず、そのＴリンパ球の大部分は機能的でないという事実と相関しているようである［Ｐｅｒｅｉｒａ Ｐ．ら（１９９２），Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｇａｍｍａ ｄｅｌｔａ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｂｅｔａ ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１１：２５−３１］。

【0010】

β２ｍタンパク質はゴルジ装置における重鎖のグリコシル化に関与するとも記載されている［Ｓｅｇｅら（１９８１），Ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ＨＬＡ ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（１６），ｐ．４５２３−４５３０］。

【0011】

β２ｍタンパク質は他の現象、例えば細胞内シグナリングの調節及び細胞中の鉄の流れを調節するＨＦＥ（ヒトヘモクロマトーシスタンパク質）のような主要タンパク質の正しいフォールディングにも関与している。

【0012】

１９８０年代の終わりから、β２ｍが抗原応答を有利に改善し得、Ｔリンパ球（ＣＤ８）にリンクしている免疫応答を刺激するためのワクチンアジュバントとして使用され得ることも立証されている。

【0013】

多数の文献が、β２ｍを免疫反応を誘導させる仕事を有する分子（例えば、特定ウイルスまたは腫瘍抗原）と組み合わせてワクチン組成物中に配合し得ることを示している。

【0014】

前記ワクチン組成物において、β２ｍは精製または組換体の各種形態で存在し得る。インビボで特定免疫反応を引き出すべく融合タンパク質を発現させる目的でβ２ｍをコードする遺伝子を免疫原性ペプチドをコードする遺伝配列に融合させている遺伝的構築が記載されている［ＷＯ ９９／６４９５７］。

【0015】

β２ｍタンパク質はグリコシル化されていないのでそれ自体の免疫原性は非常に弱い。このために、β２ｍは上記ワクチン組成物中で活性成分としてではなく、常にアジュバントとして使用されている。

【0016】

このことは、今まで医薬組成物中の使用を正当化できるβ２ｍの治療効果が観察されていなかったという事実のために確かである。

【0017】

ワクチン接種とは別に、いくつかの従来技術文献は治療用組成物中の不活化または修飾形態のβ２ｍタンパク質を示している。

【0018】

国際出願ＷＯ ０２／１０２８４０は、もはやＣＤ８ Ｔリンパ球を活性化し得ない不活性ＭＨＣ Ｉ複合体を形成すべくβ２ｍを非機能性とすることを記載している。こうして形成されたＭＨＣ複合体は免疫抑制効果を得ることを目的として免疫系に対する「ルアー」として使用される。

【0019】

別の国際出願ＷＯ ０２／２４９２９は、β２ｍが薬物（組成物の活性成分）を細胞内コンパートメントにデリバリーするためのベクターとしてＨＦＥタンパク質にコンジュゲートされている治療用組成物を記載している。

【0020】

これらの種類の出願では、β２ｍタンパク質を活性成分としての野生型機能形態ではなく、ＭＨＣに対してではない活性成分の存在下で医薬支持体またはベクターとして使用されていることに注目すべきである。

【0021】

更に、治療用途とは対照的に、β２ｍタンパク質はしばしば各種病理に対するマーカーとして、特に診断手段として使用されている。

【0022】

例えば、ＨＩＶに感染してから何年か後にＡＩＤＳ病の免疫不全症候群が明らかになる前に、血液中のβ２ｍ濃度が急に上昇する。

【0023】

いくつかの刊行物［Ｗｕ Ｃ．Ｈ．ら（２００１），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０：７００６−２０］は、β２ｍ濃度の上昇はいくつかの癌、特に骨癌及び前立腺癌の発症と相関しており、多分関与している［Ｇｒｏｓｓ Ｍ．ら（２００７），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１３：１９７９−１９８６］ことを強調している。結腸癌のような他の癌の場合には、β２ｍ血清濃度の低下が観察される［Ｋａｋｌａｍａｎｉｓ Ｌ．ら（１９９２），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７：３７９−３８５］。

【0024】

β２ｍの血液（より具体的には、血液血清）、脳脊髄液または唾液中の量がある感染性または寄生虫疾患の診断において頻繁に使用されているだけでなく、腎臓またはリンパ系の特定疾患、リウマチ、炎症性疾患及び神経系疾患（例えば、アルツハイマー型及び前頭側頭型認知症）の診断のために主に使用されている［Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ Ｐ．ら（２００２），Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１３：６１１−６１５；Ｈａｎｓｓｏｎ Ｓ．Ｆ．ら（２００４），Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｅｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２：１−１１］。

【0025】

健康であると見なされている人の場合、β２ｍの血液中の平均濃度は比較的一定のままであり、２ｍｇ／ｌ以下であり、濃度が４．０ｍｇ／ｌくらい高い値に達し得る上記疾患の場合にはそうではない。

【0026】

いくつかの病理の場合、血清β２ｍの上昇はβ２ｍの高い「シェディング」（細胞表面タンパク質の放出）により引き起こされ得る［Ｂｅｌｌｏｔｔｉ Ｖ．ら（１９９９），Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５５−９７７−９９１］。

【0027】

血液中を循環している血漿β２ｍは通常腎臓において糸球体により濾過され、その後細管において再吸収され、異化される。

【0028】

研究で、毎日再生される血漿β２ｍ（遊離形態のβ２ｍ）の半分はより特にＭＨＣ−Ｉ複合体の再循環に由来することが判明している。この再生はそれ自体平均サイズの人の場合約１５０ｍｇ／２４時間という血清β２ｍの高い産生に寄与するようである。しかしながら、「代謝回転」は血清濃度を２ｍｇ／ｌで安定化させるようである。

【0029】

β２ｍが腎臓により排泄されない透析中の患者の場合、β２ｍが体液中を循環すると有害な結果をもたらす。特に、ある結合組織（神経及び関節）中にアミロイドプラークを形成することにより関節症及び神経症を誘発させる［Ｏｈｓｈｉ Ｋ．ら，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ（２００１），Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．，５１：１−１０］。

【0030】

変形性関節症（関節症）では、β２ｍは軟骨細胞の増殖に対して抑制作用を有し、その結果軟骨の破壊を助長すると記載されている［ＷＯ ２００４／０２０５８６］。

【0031】

いくつかの自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ））の場合、炎症エピソードの発症を予測するため患者におけるβ２ｍ濃度の変化をモニターすることが一般的である［Ｂａｇｎａｔｏ，Ｆ．（２００３），ｂｅｔａ−２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ ａｓ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，２４：５１３０１−５１３０４］。この場合、血液中のβ２ｍ濃度は非常に変わりやすいと見られているので脳脊髄液中のβ２ｍ濃度を測定することが好ましい［Ｃａｕｄｉｅ Ｃ．ら（２００５），Ｖａｌｅｕｒｓ ｕｓｕｅｌｌｅｓ ｅｔ ｕｔｉｌｉｔｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｑｕｅ ｄｅ ｌａ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ ｄａｎｓ ｌｅ ｌｉｑｕｉｄｅ ｃｅｐｈａｌｏｒａｃｈｉｄｉｅｎ，Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．，６３（６）：６３１−６３７；Ｒｙｕ Ｏ．Ｈ．ら（２００６），Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，４５：１０７７−１０８６］。

【0032】

自己免疫疾患におけるβ２ｍの関与は不確かなままであり、更なる研究に値する。

【0033】

自己免疫疾患は、自己抗体が存在しても存在しなくてもその症状が体内に通常存在する物質または組織に対する免疫系の機能亢進に起因し得る多くの疾患を形成している。

【0034】

自己免疫疾患における「自己」に対する免疫応答はＭＨＣ系を介するＴリンパ球の活性化により生じ、幾つかのメカニズムがこれを引き起こし得ることは確かであるる
・免疫系では：
−自己抗体により公知の抗原を提示することによりＴ細胞を用いて自己抗体を誘導することによる。これは全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、橋本甲状腺炎、多発性硬化症（ＭＳ）、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）等の症例である。
・細胞では：
−ウイルス抗原に対して特異的なＴ細胞を活性化することによる自己免疫応答の誘導；
−ＡＰＣ−ＭＨＣ−Ｉ／ＴｃＲ（Ｔ細胞受容体）認識及び活性化Ｔリンパ球のシグナリングカスケードに対する改変；
−ＡＰＣにおけるＭＨＣ−Ｉ系の成分の不適切な構築；
−調節細胞の操作における欠陥。
・分子レベルでは：
−分子模倣または寛容；
−自己抗原としてのＭＨＣ Ｉ。

【0035】

自己免疫疾患は通常、身体がそれ自身の抗原に対する免疫反応を発現している間遺伝的素質及び感染性エピソードに関連して生ずると考えられている。しかしながら、これらの疾患の正確な原因は正確に同定されていない。

【0036】

最も一般的な自己免疫疾患はリウマチ性多発性関節炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、アジソン病、全身性エリテマトーデス、強皮症、線維筋痛、筋炎、強直性脊椎炎、Ｉ型インスリン依存性糖尿病、クローン病、セリアック病及び多発性硬化症（ＭＳ）である。

【0037】

「オーファン」疾患と称されている疾患の中には、自己免疫疾患であるとも疑われている多数の他の疾患がある。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）はこうした疾患の１つであり、このため有効な治療は現在ない。

【0038】

２つのタイプの自己免疫疾患、すなわち特異性自己免疫疾患及び非特異性自己免疫疾患は区別されなければならない。

【0039】

非特異性疾患の場合、異なる臓器が冒され、これにより関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群及び強皮症のような全身性疾患が生ずる。

【0040】

特異的疾患は特にいくつかの臓器に限定される。最も一般的な疾患はインスリン依存性糖尿病、甲状腺疾患、アジソン病、腎臓、肺、消化器の少数の疾患、及び特に多発性硬化症である。

【0041】

現在の治療法は、抗炎症療法から代謝拮抗物質及び抗癌剤を用いる免疫抑制療法までの広範囲のアプローチを含む。例として、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、代謝拮抗薬（メトトレキサート、アザチオプリン）、シクロホスファミド、スルファサラジン、金塩、シクロスポリンＡ、ミコフェノレート及びレフルノミドが使用されている。

【0042】

最近では、インターフェロンβがＭＳに対して推奨されており、（マラリアに対して使用されている）クロロキンの誘導体がエリテマトーデス及びリウマチ性多発性関節炎の治療のために推奨されている。

【0043】

他の疾患を治療するために使用されている上記治療はうまく適応されておらず、特に長期間使用したときに多数の望ましくない副作用を有している。更に、上記治療は疾患の症状を少なくとも部分的に弱め得るが、疾患の寛解を得ることはできない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0044】

【特許文献1】国際公開第９９／６４９５７号

【特許文献2】国際公開第２００２／１０２８４０号

【特許文献3】国際公開第２００２／２４９２９号

【特許文献4】国際公開第２００４／０２０５８６号

【非特許文献】

【0045】

【非特許文献1】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｂ．Ａ．ら，Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂｅｔａ−２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（１９７３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２：４８１１−４８２１

【非特許文献2】Ｇｕｓｓｏｖ，Ｄ．ら（１９８７），Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ：ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｕｎｉｔ（１９８７），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３９：３１３２−３１３８

【非特許文献3】Ａｎｄｒｏｌｅｗｉｃｚ ＭＪ．ら（１９９４），ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ ＴＡＰ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｂｅｆｏｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８６４−８６７

【非特許文献4】Ｃｏｒｒら，１９９２，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｈ−２Ｌｄｓ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＪＥＭ，１７６（６）：１９８１−９２

【非特許文献5】Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，Ｈ−Ｇ．（１９９０），Ｅｍｐｔｙ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｍｅ ｏｕｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６，４７６−４８０

【非特許文献6】Ｎｅｅｆｊｅｓ，Ｆ．Ｆ．ら（１９９３），Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ＭＨＣ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１（５１２２）：７６９−７７１

【非特許文献7】Ｐｅｒｅｉｒａ Ｐ．ら（１９９２），Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｇａｍｍａ ｄｅｌｔａ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｂｅｔａ ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１１：２５−３１

【非特許文献8】Ｓｅｇｅら（１９８１），Ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ＨＬＡ ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（１６），ｐ．４５２３−４５３０

【非特許文献9】Ｗｕ Ｃ．Ｈ．ら（２００１），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０：７００６−２０

【非特許文献10】Ｇｒｏｓｓ Ｍ．ら（２００７），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１３：１９７９−１９８６

【非特許文献11】Ｋａｋｌａｍａｎｉｓ Ｌ．ら（１９９２），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７：３７９−３８５

【非特許文献12】Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ Ｐ．ら（２００２），Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１３：６１１−６１５

【非特許文献13】Ｈａｎｓｓｏｎ Ｓ．Ｆ．ら（２００４），Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｅｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２：１−１１

【非特許文献14】Ｂｅｌｌｏｔｔｉ Ｖ．ら（１９９９），Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５５−９７７−９９１

【非特許文献15】Ｏｈｓｈｉ Ｋ．ら，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ（２００１），Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．，５１：１−１０

【非特許文献16】Ｂａｇｎａｔｏ，Ｆ．（２００３），ｂｅｔａ−２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ ａｓ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，２４：５１３０１−５１３０４

【非特許文献17】Ｃａｕｄｉｅ Ｃ．ら（２００５），Ｖａｌｅｕｒｓ ｕｓｕｅｌｌｅｓ ｅｔ ｕｔｉｌｉｔｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｑｕｅ ｄｅ ｌａ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ ｄａｎｓ ｌｅ ｌｉｑｕｉｄｅ ｃｅｐｈａｌｏｒａｃｈｉｄｉｅｎ，Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．，６３（６）：６３１−６３７

【非特許文献18】Ｒｙｕ Ｏ．Ｈ．ら（２００６），Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，４５：１０７７−１０８６

【発明の概要】

【0046】

本出願の発明者らは、明らかに異なる自己免疫疾患を患っている４人の患者の状況に特に興味を持った：
−非特異的自己免疫疾患を患っている、すなわち特定の臓器が冒されていないが、橋本甲状腺炎及び原発性シェーグレン症候群を患っている第１の患者（Ｐ１）；
−元々ＭＳであり、その後十二指腸リンパ球浸潤を伴っている第２の患者（Ｐ２）；
−セリアック病を患っている第３の患者（Ｐ３）；
−橋本甲状腺炎及びセリアック病を患っている第４の患者（Ｐ４）。

【0047】

これらの患者について、患者の血液から単離したリンパ球に由来する量ＨＣ（ＭＨＣ−ＡＢＣ）／β２ｍの比を以下に示す一般的方法を用いて算定しようと試みた。

【0048】

驚くことに、血清β２ｍ濃度は平均でＰ１の場合約１．９ｍｇ／ｌ、Ｐ２の場合１．８ｍｇ／ｌ、Ｐ３の場合１．１ｍｇ／ｌ、Ｐ４の場合１．１ｍｇ／ｌであるのに対して、ＨＣ／β２ｍ比が４人の患者では対照ドナーのＨＣ／β２ｍ比に比べて上昇していることが明らかとなった（表１を参照されたい）。

【0049】

【表1】

ＨＣ：ＭＨＣ Ｉの重鎖
（ａ）β２ｍの濃度（ｍｇ／ｌ）；
（ｂ）全リンパ球タンパク質から計算したＨＣ／β２ｍ；
（ｃ）精製したリンパ球分画から単離した血漿膜について計算したＨＣ／β２ｍ。

【0050】

上表１の結果はＨＣ／β２ｍ比のアンバランスを示している。これらの結果は、血液中の遊離β２ｍの濃度は上昇していないが、４人の患者中に存在するＭＨＣ−Ｉ膜複合体では明らかにＨＣ濃度に比べてβ２ｍが有意に欠乏しているという予期せぬ状況を明らかにした。

【0051】

これらの所見は、１に近いＨＣ／β２ｍ比を示す健康な対照と比較される。対照的に、β２ｍは自己免疫疾患に冒されている患者の細胞内コンパートメント中では隔離されているようである。

【0052】

これらの結果は本発明者らを驚かし、本発明者らは４人の自己免疫疾患を患っている患者では共通原因として膜ＭＨＣ−Ｉ複合体中のβ２ｍが欠乏しているという仮説をまとめた。より一般的には、ＭＨＣ複合体中のＨＣ／β２ｍアンバランスは多数の自己免疫疾患で経験する障害の発現の原因となっているようである。

【0053】

以下に記述するこの仮説によれば、４人の患者が患っている自己免疫反応は病変の関係で明らかに血液中の遊離β２ｍの一般的な上昇の結果ではなく、逆にＴ細胞（ＣＤ８）に対する抗原提示が変化しがちである膜ＭＨＣ−Ｉ複合体中の局所的β２ｍ欠乏に起因する。

【0054】

この仮説は、従来技術に記載されていたようなＴリンパ球の活性化及び炎症プロセスにおけるβ２ｍの関与を決して排除していないことを留意すべきである。

【0055】

これらの第１の所見を考えて、本発明者らはＭＳまたはクローン病を患っている他の患者中に存在する全リンパ球タンパク質中のＨＣ／β２ｍの分析を実施し、これらの患者のリンパ球に由来するＨＣ／β２ｍ比も対照患者のＨＣ／β２ｍ比よりも高いことを知見し得た。

【0056】

これらの結果に基づいて、本発明者らは、主な活性成分が機能形態のβ２ｍタンパク質である医薬組成物を開発した。

【0057】

これらの組成物の目的は、自己免疫疾患に冒されている患者における膜ＭＨＣ−Ｉ複合体中のβ２ｍの欠乏を軽減することである。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】Ｉ型のＭＨＣ複合体の平面（Ａ）及び空間（Ｂ）での略図。重鎖（ＨＣ）は３つの細胞外ドメイン（α１、α２及びα３）及び１つの膜貫通ドメインにより構成されている。細胞外である軽鎖（β２ｍ）は膜と重鎖のα１及びα３が近接している位置との間に入っている。図Ｂは重鎖により提示されるペプチド（抗原）の位置を示している。

【図2】本発明に従うリポソームと接触して配置されているリンパ球の写真（×６３０）。リポソームは実施例２に記載されている透析方法に従って作成した。リポソーム（明るいスポット）はリンパ球（ＨＬＡ−ＡＢＣ）の膜に吸着されている。細胞核はもとのままである（灰色）。

【図3】本発明に従うアルブミンを含有しているリポソームと接触して配置されているリンパ球の写真（×６３０）。タンパク質（アルブミン）をＤＡＰＩで蛍光性とする。免疫蛍光法により検出されるより暗いスポットを形成し、このスポットにはより明るいリンパ球（ＨＬＡ−ＡＢＣ陽性）が貫通している。

【図4】抽出方法（緑色）を用いて作成し、蛍光β２ｍ（ＴＲＩＴＣ）を含有しているリポソームの写真（×６３０）。Ａ：リポソーム中に含有されている蛍光脂質ＮＢＤ−ＰＣ−オレイルより放出される蛍光。Ｂ：β２ｍにカップリングさせた蛍光団（ローダミンＢイソチオシアネート）より放出される蛍光。Ｃ：２つの蛍光Ａ及びＢの重置。

【図5】患者（Ｐ１）から精製し、抽出方法に従って作成し且つ蛍光β２ｍ（ＴＲＩＴＣ）を含有しているリポソームとインキュベートしたリンパ球の写真（×６３０）。Ａ：リンパ球の核を青色に着色するＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２マーカーより放出される蛍光。Ｂ：β２ｍにカップリングさせた蛍光団（ローダミンＢイソチオシアネート）より放出される蛍光。このマーキングは色が赤になることでβ２ｍのリンパ球への取り込みを示す。Ｃ：リポソーム中に含有されている緑色蛍光脂質ＮＢＤ−ＰＣ−オレイルより放出される蛍光。このマーキングはリポソームのリンパ球との会合を示す。Ｄ：Ｂ及びＣマーキングの重置（黄色）。スケールバー：１０μｍ。

【図6】２つの異なる温度（２５℃及び３７℃）で３０日間保存後のアルブミン（ＴＲＩＴＣ）を含有しているリポソームの蛍光による顕微鏡検査。観察により、作成及び保存の異なるタイプ間の大きな差異を区別できない。Ａ及びＢ：バッチ３０（３０ｍｇ タンパク質／１５０ｍｌ）。Ｃ及びＤ：バッチ６０（６０ｍｇ タンパク質／１５０ｍｌ）。下部：リポソーム中に含有されている蛍光脂質ＮＢＤ−ＰＣ−オレイルより放出される蛍光。上部：アルブミンにカップリングさせた蛍光団（ローダミンＢイソチオシアネート）より放出される蛍光。スケールバー：２００ｎｍ。倍率：×６３０。

【図7】アルブミンを含有しているリポソーム（＜５０ｎｍ，５０〜１００ｎｍ，＞１００ｎｍ）の時間（２、３０及び６０日間）及び保存温度（２５℃及び３７℃）に応じたサイズ分布（％）。Ａ及びＢ：バッチ３０（３０ｍｇ タンパク質／１５０ｍｌ）。Ｃ及びＤ：バッチ６０（３０ｍｇ タンパク質／１５０ｍｌ）。

【図8】高濃度のβ２ｍ（バッチ８０ｍｇ タンパク質／１５０ｍｌ）を含有しているリポソーム（＜５０ｎｍ，５０〜１００ｎｍ，＞１００ｎｍ）の２５℃での６及び４０時間の保存に応じたサイズ分布（％）。

【図9】患者または健康なドナーの血清による純粋またはリポソーム被覆β２ｍについての経時的分解プロフィール。Ａ及びＢ：β２ｍの純粋／リポソーム調製物（血清患者１：橋本病を患っている５１才の女性）。Ｃ及びＤ：β２ｍの純粋／リポソーム調製物（血清患者２：リウマチ性多発性関節炎を患っている７３才の女性）。Ｅ及びＦ：対照患者，健康な６２才の男性。

【図10】β２ｍ（リポソーム調製物）と患者から精製したリンパ球の細胞表面上のＭＨＣ−Ｉの重鎖間の会合を示すタンパク質の電気泳動ゲル。Ａ：グルタルアルデヒドの存在下で、ＨＬＡ−β２ｍ複合体は５５ｋＤａで見られ、遊離β２ｍは１２ｋＤａで見られる。グルタルアルデヒドなしのトラックの１２ｋＤａでのバンドは細胞β２ｍ（レーン３）に相当する。Ｂ：β２ｍの膜発現の定量化。この対照により、ＨＬＡ−β２ｍ複合体を作成するためのグルタルアルデヒドの使用を実証することができる。Ｃ：多発性硬化症を患っている患者（３９才の女性）及び健康なドナー（６７才の男性）からのリンパ球のβ２ｍのリポソーム調製物と９０分間インキューベートした後の比較。リポソーム中に含有されているβ２ｍは（グルタルアルデヒドの存在下で）対照中よりも患者由来のリンパ球上により多く結合する。

【図11】ヒト肝臓及び腎臓細胞に対する遊離またはリポソーム形態のβ２ｍの「インビトロ」毒性アッセイ。Ａ、Ｃ及びＥ：２４、４８及び７２時間暴露後のＨＨ肝臓細胞に対するアッセイ。Ｂ、Ｄ及びＦ：２４、４８及び７２時間暴露後のＨＲＥｐｉｃ腎臓細胞。１．対照；２．対照及び非負荷リポソーム；３．３μｇの遊離β２ｍ；４．３μｇのリポソーム形態のβ２ｍ（バッチ６６μｇ／１５０ｍｌ）；５．６μｇの遊離β２ｍ；６．６μｇのリポソーム形態のβ２ｍ（バッチ１３２μｇ／１５０ｍｌ）。全タンパク質含量はＢＣＡ方法により推定した。

【図12】ヒト肝臓及び腎臓細胞に対する遊離またはリポソーム形態のβ２ｍの「インビトロ」毒性アッセイ。ラベルは図１１と同じ。生存度についてはＭＴＴアッセイの結果。

【発明を実施するための形態】

【0059】

よって、本発明は、β２ｍタンパク質の特に薬剤を製造するための活性成分としての使用に関する。

【0060】

β２ｍタンパク質は、好ましくは精製または組換体のタンパク質のヒト形態であり、その参照ポリペプチド配列及び遺伝子決定基はＧＥＮＥＢＡＮＫデーターベースに寄託番号ＣＡＧ３３３４７で記載されている。

【0061】

精製されているならば、β２ｍは健康なドナーの血清から得ることができる。

【0062】

タンパク質は非グリコシル化形態で使用され得るので、化学合成に頼ることも予想され得る。

【0063】

本発明のβ２ｍの治療的使用は、野生型タンパク質と同一の機能性を有する、すなわち本明細書に記載されているのと同じ治療効果を有するが、効果が野生型タンパク質に比してその強度が低いまたは高いことがあり得る該タンパク質の機能変異体、すなわちそのイソフォーム、該タンパク質の変異コピーまたは断片に及ぶ。

【0064】

機能変異体は、より詳しくは細胞の表面上に存在するＭＨＣ複合体と会合し得るポリペプチドを意味し、そのポリペプチド配列はヒトβ２ｍタンパク質のポリペプチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％同一である（配列の比較は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアアプリケーションを用いてなされる）。

【0065】

β２ｍの機能変異体は、好ましくは同じ治療効果または同じ生理活性を示すβ２ｍタンパク質の断片から構成される。

【0066】

このような機能変異体は、発現ベクターまたは遺伝子治療ベクターにクローン化したヌクレオチド配列を発現させることによっても生じ得る。

【0067】

複数の刊行物が、例えば齧歯類［Ｇｏｄｉｎｇ Ｊ．Ｗ． ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ Ｉ．Ｄ．，Ａｌｌｅｌｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ（１９８０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：７３９５−７３９９］及びヒト［Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ Ｐ．ら，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ（２００２），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１３：６１１−６１５；Ｈａｎｓｓｏｎ Ｓ．Ｆ．ら，Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｅｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ（２００４），Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２：１−１１］におけるβ２ｍのイソフォームの存在を記載している。等電点（ｐＩ）が異なることにより特に区別されるこれらのイソフォームはβ２ｍの機能変異体と見なされる。

【0068】

上記機能変異体は、精製ヒトタンパク質に対する生成物またはその処方物の有効性（溶解度、より高い安定性、少ないタンパク質分解）の点である利点を有し得る。

【0069】

本発明は、β２ｍまたはβ２ｍの機能変異体の１つを活性成分として含む医薬組成物に関する。

【0070】

好ましくは、β２ｍまたはその機能変異体は前記組成物の単一活性成分を形成する。

【0071】

本発明の意味の範囲内で、活性成分は薬剤の組成物に含まれ、その薬力学的または治療特性に関与し得る物質である。本発明の意味の範囲内で、アジュバントは活性成分と見なされない。

【0072】

より好ましくは、本発明は、医薬的に許容され得る担体またはビヒクル中に含まれているβ２ｍまたはβ２ｍの機能変異体から構成される医薬組成物に関し、前記した医薬的に許容され得る担体またはビヒトルは好ましくはリポソームである。

【0073】

本発明の好ましい態様によれば、β２ｍは規制推奨及び要件に従って医薬的に許容され得る担体または生理学的溶液と共に投与される。

【0074】

本発明によれば、β２ｍは患者における膜ＭＨＣ−Ｉ複合体内のＨＣ／β２ｍ比を正常に戻す能力を有しているためにより特に使用される。

【0075】

ＨＣ／β２ｍ比は、好ましくはリンパ球、特にＢ細胞に関して論じられる。ＨＣ／β２ｍ比は精製ＭＨＣ Ｉ複合体中のＨＣ及びβ２ｍサブユニットのモル比に相当する。

【0076】

好ましくは、この比は病気を患っていない患者のレベルに匹敵するレベルに戻される。より好ましくは、β２ｍは１に近いモル比を達成するために患者におけるＨＣ／β２ｍ比を低下させる目的で使用される。

【0077】

本発明は、より特に自己免疫疾患を患っている患者におけるＭＨＣ−Ｉ複合体中のβ２ｍの欠乏が生ずるのを防止することに関する。

【0078】

よって、本発明に従うβ２ｍの使用は自己免疫疾患の治療のためにより特に意図されている。

【0079】

本発明者らは、自己免疫疾患を患っているいくつかの患者では細胞内または膜β２ｍの欠乏によりＨＣ／β２ｍ比は１以上、または２以上にもなることを確認することができた。よって、本発明は、ＨＣ／β２ｍ比を生理学的値に近い値、すなわち好ましくは２未満、より好ましくは１．５未満、更により好ましくは１．２未満に戻すことに関する。

【0080】

勿論、本発明は自己免疫疾患以外のＭＨＣ Ｉ複合体中のＨＣ／β２ｍ比のアンバランスにリンクしている疾患に適用される。

【0081】

本発明の意味の範囲内で、臓器移植片または移植片拒絶にリンクする病変は自己免疫疾患とも、免疫系による「非自己」の認識の欠陥に起因する疾患とも見なされない。正確に言うと、ここでは移植片拒絶は免疫系による「非自己」の認識により生じると見なされ、「自己」の認識の欠陥とは見なされない。

【0082】

本発明者らがいろいろな患者において実施した分析は、全リンパ球タンパク質に基づいて計算して１．２超のＨＣ／β２ｍ比が少なくとも以下の疾患、すなわちリウマチ性多発性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、線維筋痛、筋炎、強直性脊椎炎、Ｉ型インスリン依存性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、クローン病、セリアック病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び多発性硬化症（ＭＳ）で観察され得ることを示している。科学界でなお論争中の問題であるが、ＡＬＳは得られた結果にてらして自己免疫疾患に似ている。

【0083】

本発明は、より特に膜ＭＨＣ−Ｉ複合体のＨＣ／β２ｍ欠乏を軽減するために血液β２ｍの比を２．５〜１２ｍｇ／ｌの間、好ましくは３〜８ｍｇ／ｌの間、より好ましくは３〜５ｍｇ／ｌの間の濃度に上昇させるための薬剤の開発に関する。

【0084】

下記するように、本明細書の実験部分では、本発明の薬剤はβ２ｍまたはその機能変異体を含むリポソーム調製物から構成され得る。リポソームは、本明細書の実施例の欄に例示されているような当業者に公知の各種技術を用いて製造され得る。リポソームを構成する各種脂質を使用し得る［Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（１９８６），Ｋｕｎｉｏ Ｙａｇｉ編，Ｊａｐａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｋａｒｇｅｒ］。

【0085】

この点で、本発明の好ましい薬剤はβ２ｍを負荷したリポソームから構成される。

【0086】

好ましくは、β２ｍまたは該タンパク質の機能変異体が上記リポソーム調製物中に含有される唯一の活性成分を構成する。

【0087】

β２ｍを起こり得るタンパク質分解攻撃から保護でき、また特に細胞膜を構成するリン脂質とリポソームの融合によりＭＨＣ−Ｉ複合体を標的とするようにβ２ｍをデリバリーできるので、本発明に従うリポソームは薬剤として使用することが有利である。

【0088】

本発明の別の態様によれば、β２ｍまたはその機能変異体の１つをコードする遺伝子治療ベクターはインビボで、好ましくはＭＨＣ複合体の環境でタンパク質を合成するために使用される。このような遺伝子治療ベクターはリポソーム中に含有され得る。

【0089】

よって、本発明は、β２ｍまたはその機能変異体を活性成分としてインビボまたはエキソビボで発現させるステップを含む遺伝子治療方法にも関する。この目的のためにβ２ｍタンパク質を発現させるべく文献に記載されている各種タイプのウイルスまたは非ウイルスベクターが改変され得る［Ｕｒｎｏｖら（２００５），Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：５７７−５７９］。好ましくは、本発明に従う遺伝子治療ベクターにより、他の活性成分、好ましくは他のポリペプチドを除くβ２ｍタンパク質（またはその機能変異体）をヒト体内で発現させることができる。

【0090】

本発明の態様によれば、患者はβ２ｍまたは該タンパク質を発現するベクターを含有するリポソームの溶液を潅流させることにより、または前もってβ２ｍと接触させた患者のリンパ球を輸注することにより治療され得る。この接触配置は同一患者から予め採取した血液のサンプルから抽出したリンパ球をエキソビでインキュベートすることにより実施され得る。

【0091】

本発明の好ましい態様によれば、β２ｍを含む薬剤は食塩水形態で調製される。薬剤を製造するための好ましい方法は、食塩水形態のβ２ｍを薬物治療しようとする患者の血清と接触させてエキソビボでインキュベートすることからなる。

【0092】

本発明に従う上記した医薬組成物は、経口投与、注射、輸注または吸入のために当業者に公知の適切な形態をとり得る。

【0093】

本発明の別の態様は、ＭＨＣ Ｉ複合体のＨＣ／β２ｍ比をインビボまたはインビトロで測定することによる自己免疫疾患の診断、より特に上に挙げた疾患の診断に関する。

【0094】

本発明に従う診断方法は、好ましくは
ｉ）自己免疫疾患をスクリーニングしようとする患者から細胞、好ましくはリンパ球を採取する；
ｉｉ）これらの細胞からＭＨＣ Ｉ複合体を抽出する；及び所要により
ｉｉｉ）複合体中に含有されているＨＣ及びβ２ｍのそれぞれの量を測定する；
ｉｖ）ＨＣ／β２ｍモル比を算定する；及び
ｖ）得られたＨＣ／β２ｍ比を予め他の患者から得た結果と比較する；
から構成されるステップの１つ以上を含む。

【0095】

ＨＣ／β２ｍ比は、細胞の全体（ＨＣ／β２ｍ細胞比）、または好ましくは膜（膜ＭＨＣ Ｉ複合体のＨＣ／β２ｍ比）について算定され得る。好ましくは、本発明に従う診断方法は、ＨＣ／β２ｍ比を対照のものと比較する、または患者のモニターに関連しては他の前もって求めた比と比較するステップを含む。

【0096】

ＨＣ及びβ２ｍのタンパク質のそれぞれの量は当業者に公知の方法に従って、例えば定量的免疫検出（例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノブロット、「ウェスタンブロット」、自己抗原マイクロアレー等）により標準方式で測定され得る。ＭＨＣ−Ｉ複合体の抽出は細胞及び膜タンパク質を抽出する公知プロトコルに従って実施する。

【0097】

本発明に従う診断方法は、各種自己免疫疾患を患っている患者の治療モニタリングに関連して実行され得る。

【0098】

下記実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明の説明を補足するために意図されている。

【実施例】

【0099】

１−自己免疫疾患を患っている患者におけるリンパ球のＨＬＡ−Ｉ膜複合体の成分の分析
理論に束縛されないが、本発明者らはＨＣ／β２ｍ比が上昇すると自己免疫タイプの反応が生じる恐れがあるという作業仮説を展開した。特に、本発明者らはＭＨＣ−Ｉ複合体のレベルでのＨＣの過剰及び／またはβ２ｍの低下によりＴｃＲに対する「自己」の露出過度の現象が生じ得ると考えた。β２ｍはＨＣのある領域を保護し、ＣＤ ８ Ｔ−細胞に対する「非自己」の提示を特異的に決定することに注目されたい［Ｈｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．ら（２００３），Ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ β２−ｍｉｃｒｏｇｏｂｕｌｉｎ ｂｌｏｃｋｓ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＪＢＣ，２７８：５６３０−５６３８］。

【0100】

この仮説を確かめるために、４人の患者のリンパ球から抽出したＭＨＣ Ｉ複合体中のＨＣ及びβ２ｍのモル量を測定する第１の分析を行った。これらの分析の結果を表１に示し、注釈を加えた。

【0101】

リンパ球を健康なドナー及び患者の血液からＨｏｆｍａｎ Ｆ．Ｍ．ら［Ａｎｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９８２），７７：７１０−７１６］が改変したＬｉｇｈｔｂｏｄｙ Ｊ．［Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｓｅ ＮＲ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｈ．編集者，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ＤＣ），１９７６，ｐ．８５１−８５７］の方法に従って単離した。ＭＨＣ−Ｉ複合体を全リンパ球または少し改変したＷａｒｌｅｙ Ａ．ら［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ａｃｔａ（１９７３），３２３：５５−６６］の方法に従って作成した血漿膜上で検出する。ＭＨＣ−Ｉのタンパク質成分の検出はＬａｅｍｍｌｉ Ｕ．Ｋ．［Ｎａｔｕｒｅ（１９７０），２２７：６８０−６８５］に従って電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ系）することにより、次いでＴｏｗｂｉｎ Ｈ．ら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９），７６：４３５０−４３５４］の方法に従ってＰＶＤＦの膜に電気伝達し、イムノブロッティングすることにより実施した。暴露はＮＢＴ−ＤＣＩＰ混合物を用いてアルカリホスファターゼにカップリングした二次抗体により実施した。

【0102】

血漿膜を単離し、後記するグルタルアルデヒドへの結合方法を使用することにより多くの重鎖が実際膜起源であることを確認した。

【0103】

先に示したように、ＭＳの４つの他の症例及びクローン病の２つの症例はＨＣ／β２ｍ＞１の細胞比を示す。これらの所見は、出願人に特にリポソームを使用することによりＨＣ／β２ｍ（ＭＨＣ−Ｉ）のバランスを戻すことができる実験的アプローチを開発することを刺激した。

【0104】

２−β２ｍを負荷したリポソームの作成
２．１ 患者にデリバリーしようとするβ２ｍの量の評価
リンパ球の表面上のβ２ｍを過剰とするためには、増殖の可能性を有する細胞上のシグナリングチャネルをトリガーしないように血液中のその濃度を「合理的」限界の範囲内で上昇させなければならない。

【0105】

β２ｍが膜から脱離して、血液及び腎臓系中を循環する能力を考えると、血液β２ｍ濃度を３ｍｇ／ｌ〜８ｍｇ／ｌ（正常濃度は約２ｍｇ／ｌ−血液で変わる）の範囲内としなければならない。このように上昇させると、β２ｍは細胞の表面に吸着する。

【0106】

Ｉ型の主要組織適合遺伝子複合体はモル／モルの重鎖（ＭＷ≒４３ｋＤａ）及びβ２ｍ（ＭＷ≒１２ｋＤａ）から構成されていることに注目されたい。よって、複合体（ＭＷ≒５５ｋＤａ）は重量基準で７９％の重鎖及び２１％の軽鎖から構成される。

【0107】

リンパ球の平均タンパク質含量は６５０×１０^−１２ｇであり、その血漿膜のタンパク質含量はその全含量の１％のみ、すなわち６．５×１０^−１２ｇに相当する。ＭＨＣ−Ｉのみは静止期リンパ球の膜タンパク質の全含量の多くとも１％に相当し、よってβ２ｍ含量は約１．４×１０^−１４ｇ／リンパ球であると考えられる。

【0108】

平均生理学的パラメーター２×１０^６リンパ球／ｍｌ−血液及び５リッターの血液／個人を採用することにより、全ＭＨＣ−Ｉ／個人（リンパ球に関して）の「重量」範囲は１．４×１０^−６ｇ〜１．８×１０^−６ｇのリンパ球β２ｍである。これらの数字は、我々の最初の推定が優先的に患者において平均で０．２×１０^−９〜５００×１０^−９ｇの範囲の値を示している最大数てある。血液中の平均量は１０ｍｇのβ２ｍ／個人、すなわちリンパ球の表面上に存在するより非常に実質的に多い量であるので、正常な状態では実質的に１未満の比が既に膜β２ｍと血清β２ｍ間で存在すると思われる。よって、β２ｍの膜欠乏を補うために血液循環中のβ２ｍの比を上昇させる（そのコロイド浸透分圧を高める）ことは合理的である。

【0109】

β２ｍの投与は２つの方法で実施し得る：
（１）β２ｍを負荷したリポソームの投与。このタイプの医薬担体はペプチド、抗体、遺伝物質等の投与のために流通している。リポソーム（「人工」または合成膜）を使用すると、細胞表面と活性成分間の接触が促進される；
（２）食塩水形態の活性成分を投与前に患者の血清とインキュベートする。このインキュベーションの目的は、血清のリポタンパク質をりポソームのようにベクターとして働かせることである。

【0110】

方法１または２による投与のためのβ２ｍのリンパ球への取り込みの程度を対照の投与と比較し得る。後者の場合、β２ｍ食塩水潅注を０．１０ｍｇ／ｍｌ（全容量１５０ｍｌ）で投与し、これにより３ｍｇのβ２ｍ／Ｌ−血液（“バッチ１５”と称される１５ｍｇのβ２ｍ／１５０ｍｌのリポソーム溶液のバッチ）が与えられる。

【0111】

２．２ リポソームの製剤化
リポソーム（１ｍｌの場合）を製造するために、成分を含有するジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）を窒素下で蒸発乾固させた後、場合によりコレステロールを添加して、場合によりスフィンゴミエリンを添加して、またはコレステロール及びスフィンゴミエリンを添加して、ホスファチジルコリンを含有するフィルムを形成する。３つの化合物（ホスファチジルコリン、コレステロール及びスフィンゴミエリン）について、割合はそれぞれ１０Ｍ、２Ｍ及び１Ｍ、すなわち最終溶液１ｍｌにつき７．６０ｍｇ、０．７６ｍｇ及び０．３８ｍｇである。このフィルムに対して２ｍｇのβ２ｍを含有する食塩水溶液（ＰＢＳ １０ｍＭ，ｐＨ＝７．４；ハンクス，トリス／グリシンまたはＤＭＥＭ）を１ｍｌ添加する。リポソームをホスファチジルコリン（１０Ｍ）、ホスファチジルコリン（１０Ｍ）及びコレステロール（２Ｍ）、ホスファチジルコリン（１０Ｍ）及びスフィンゴミエリン（１Ｍ）から作成したならば、各化合物に対するモル濃度は同一のままである。しかしながら、脂質成分に対して他のモル濃度を使用してもよい。タンパク質の量は異なっていてもよく、ｐＨはケースに応じて７．４超でもよい。脂質フィルムの分散は２０〜３７℃の間の温度で最長３時間撹拌することにより実施する。

【0112】

リポソームを所謂「洗浄剤／透析」方法により、または所謂「抽出」方法により形成する。後者の場合、溶液（Ｌｉｐｏｆａｓｔ（登録商標），Ｓｏｄｅｘｉｍ Ｓ．Ａ．，５１１４０ ミュイゾン，フランス国）を６９バールの圧力下でポリカーボネート中に１００ｎｍのフィルター膜を介して４１回通す。得られたリポソームは均質なサイズを有している。この場合、リポソームを４℃で２日間保持し、リンパ球懸濁液（直径＜１００ｎｍ；図４）に添加する。より大規模では、溶液（３ｌ／時；ｓｏｄｅｘｉｍ ２７７０；ｅｍｕｌｓｉｆｆｌｅｘ ｃ３；ｓｏｄｅｘｉｍ ｓ．ａ．）を４５０バールの圧力下で４回通して、ＳＵＶ（単ラメラ小胞）を得る。

【0113】

「プレパイロット」アッセイでは、β２ｍのリポソームへの取り込み、リポソームの細胞表面への吸着及びタンパク質のリポソームから細胞の内部への移動を示すために、我々は蛍光リポソームを作成した。アッセイに従って、５２０ｎｍまたは５７２ｎｍで蛍光を発するリポソームを作成した。このために、脂質混合物に０．５ＭのＮＢＤ−ＰＣ（１−オレイル−２−（−６−（（（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾル−４−イル）アミノ）ヘキサノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（４９０ｎｍで励起、５２０ｎｍで放出）または０．５Ｍ Ｌｉｓｓ Ｒｈｏｄ ＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）（５４１ｎｍで励起、５７２ｎｍで放出）を添加した後、蒸発させ、脂質フイルムを得た（上記を参照されたい）。

【0114】

プレパイロット規模で、リポソームを洗浄剤／透析方法により作成した。この技術によっても、よく検定された安定なＳＵＶが得られた。

【0115】

簡単に説明すると、２０〜３７℃の間の温度で最長３時間撹拌した後、ミセル懸濁液を微小透析装置においてβ２ｍ及び４μΜ（０．８ｍｇ／ｍｌ）のｎ−ヘキシル−βＤ−グルコピラノシドを含有する食塩水溶液に対して４℃で１２時間透析する。透析膜は３．５ｋＤａのカットオフを有し、ｎ−ヘキシル−βＤ−グルコピラノシド（洗浄剤）を最終溶液中最小１ｐｐｍまで希釈する。

【0116】

得られたリポソームは直径約２００ｎｍのサイズを有している。これらは周囲温度で少なくとも３ヶ月にわたり安定であり、少なくとも０．１ｍｇのβ２ｍ／ｍｌ−初期溶液を含有している。

【0117】

２．３ 被験リポソームのエキソビボで培養維持したリンパ球に対する適用
リンパ球のＭＨＣ複合体を標的化する目的でβ２ｍタンパク質をリポソーム懸濁液の形態で製剤化する適切さを示すために、リンパ球を比較的簡単な技術を用いて蛍光により検出することができるタンパク質であるアルブミンを負荷したリポソームとインキュベートした。

【0118】

ホスファチジルコリンに基づいて上記したプロトコルに従って作成したリポソームへのタンパク質の取り込み及びリポソームの適用をＬｉｓｓ Ｒｈｏｄ ＰＥを用いてエキソビボで試験した。

【0119】

ＤＡＰＩ（ジアミノフェニルインドール；３７２ｎｍで励起、４５６ｎｍで放出）の蛍光に匹敵する蛍光を示す化合物であるフルオレスカミンでマーキングすることによりタンパク質を蛍光性とした。ウシ血清から結晶化したアルブミンを、Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．ら［Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ ＢＤ． ａｎｄ Ｒｉｃｋｗｏｏｄ Ｄ．編，Ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，第２版，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｔｏｋｙｏ，ｐ．６７］に記載されている方法を用いてタンパク質のＮ末端上にフルオレスカミンを共有結合により結合させることにより蛍光性とした。ただし、マーキングは洗浄剤（ＳＤＳ）を含有していないトリス−ＨＣｌ（２５ｍＭ）／グリシン（１９２ｍＭ）（ｐＨ＝８．３）緩衝液を用いて実施した。先に記載したように、形成されたリポソームは２ｍｇの蛍光アルブミン／ｍｌ−リポソーム溶液を含有している。

【0120】

次いで、０．２ｍｌの２５００００個のリンパ球を含有するリンパ球の懸濁液（ハンクス／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ＝７．４）を０．２ｍｌのアルブミン（緩衝液２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ／１９２ｍＭ グリシン，ｐＨ＝８．３）を含有する形成されたリポソームとＣＯ_２（５％）を飽和させた湿潤雰囲気中で３７℃で１時間インキュベートした。

【0121】

最後に、対照リポソーム（２００μｌ）、対照リンパ球（２００μｌ）、及びタンパク質を負荷したリポソームで処理したリンパ球（２００μｌ）をＲａｋｏｔｏａｒｉｖｅｌｏ Ｃ．ら［Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ａｒｏｍａｔａｓｅ ａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｙ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｅｍｂｒｙｏ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ（２００４），Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，８０：２８４−２９７］に記載されている方法を用いて処理し、ポリリシン及びラミニンで被覆したカバーガラス上に載せた。

【0122】

調製物を落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ；Ｚｅｉｓｓ，ドイツ国）により直接観察するか、または水中４％（ｐｌｖ）パラホルムアルデヒドの溶液で３０分間固定し、カバーガラスをＰＢＳ（１６０ｍＭ，ｐＨ＝７．２）で３回濯いだ。調製物をＰＢＳ中で調製した０．１％ トリトンＸ−１００（ｖ／ｖ）を用いて５分間で優しく透過性とした。

【0123】

細胞を一次抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体によりマーキングした。ある例では、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ（蛍光 ４５０ｎｍ 青色放射，ＤＡＰＩ）でマーキングした。家兎で産生させた一次抗体は「ウェスタンブロット」のために使用したものと同一である。一次抗体を１／５０に希釈し、ヤギにおいて産生させたＦＩＴＣ（緑色蛍光）に結合させた二次抗体を１／１６０に希釈する。抗体のインキュベーションは２％ ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で実施した。×６３レンズの場合、カバーガラスにＦｌｕｏｒｓａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，米国）を載せた。

【0124】

図２及び３の写真は、リポソームがリンパ球の表面上に吸着されており、リポソーム中に含有されているマーキングしたタンパク質がリンパ球の膜表面上に沈着していることを示している。

【0125】

結果は、我々がＨＣ／β２ｍ膜平衡を戻すことを提案する実験アプローチの実現可能性を明らかに立証している。

【0126】

尿から精製したヒトβ２ｍ（Ｓｉｇｍａ，米国）を０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で含有している緑色蛍光を有する他のリポソームを抽出方法に従っても作成した。β２ｍを赤色蛍光（励起：５４０ｎｍ；蛍光：６２５ｎｍ）を有するローダミンＢイソチオシアネートでマーキングした。β２ｍ−ローダミンＢ結合をＲｉｇｇｓら［（１９５８），Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，３４：１０８１−１０９７］に記載されている方法を用いて形成した。結合後、タンパク質をセファデックスカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スウェーデン国，Ｇ−１０：床容量９ｍｌ；カラムの内径０．７ｍｍ）を用いて精製した。カラムをＰＢＳ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，１０ｍＭ ホスフェート，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ＝８．３）中で水和した。タンパク質をｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ_２Ｏで１：１希釈したＰＢＳ中に溶離した（４．５〜７．０ｍｌ）。形成されたリポソーム（図４）を類似カラムを用いて精製し（２．５〜６．５ｍｌ）、回転蒸発器（Ｂｕｃｈｉ，スイス国）を用いて２回濃縮した。患者Ｐ１の血液から単離したリンパ球を先に記載したように９０分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。結果はβ２ｍのリンパ球の８９％への取り込みを示している（図５）。

【0127】

２．４ リポソームの安定性（図６〜８）
上で得たアルブミンを含有する「被験」リポソームを各種条件下で試験して、その経時的安定性を評価した。

【0128】

安定性は、バッチ３０（１５０ｍｌのリポソームにつき３０ｍｇのアルブミンに相当）及び６０（１５０ｍｌのリポソームにつき６０ｍｇのアルブミンに相当）について時間及びインキュベーション温度に対して試験した。

【0129】

リポソームを構成する脂質は６３６ｎｍｏｌのＰＣ及び３１．８ｎｍｏｌのＮＢＤ−ＰＣ−オレイルから構成した。窒素流下で蒸発乾固した後、脂質の混合物を１ｍｌの２００または４００μｇのアルブミン（Ｓｉｇｍａ，米国）を含有するＰＢＳ（ｐＨを７．２に調節した）（それぞれ、バッチ３０及び６０）を１滴ずつ用いて強く撹拌しながら可溶化する。次いで、リポソファスト−塩基系（Ｓｏｄｅｘｉｍ，フランス国）を用いて機械的に抽出することによりリポソームを得た。次いで、各バッチをセファデックスＧ１０カラムで精製した。設定した時間に、５０μｌの各バッチをポリ−Ｄ−リシン／ラミニンを被覆したカバーガラス上に載せ、３７℃で１２時間インキュベートした。次いで、生物材料を４℃でグルタルアルデヒドを３０間用いることにより結合させた。画像（１ヶ月保存時の安定性，図６）をＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００（Ｚｅｉｓｓ）落射蛍光顕微鏡を用いて撮影し、Ａｘｉｏｎ ｖｉｓｉｏｎソフトウェアアプリケーションを用いて記録した。統計研究（図７）に関して、リポソームの直径はＳｅｒｆソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｇ／ｓｅｒｆ）を用いて測定した。各バッチの研究毎に、リポソーム集団を３つのクラス：直径＜５０、５０〜１００ｎｍ及び＞１００ｎｍに分けた。バチャートの高さは各サイズの亜群を表す。３７℃で保持したバッチ６０は、６０日間の保存で最高の安定性を示す：リポソームの９５％が＜１００ｎｍの直径を有しており、これは細胞表面へのタンパク質の移動のための理想的直径である。

【0130】

バッチ８０（８０ｍｇのβ２ｍ；図８）に関して、バッチ８０を汚染及び蒸発を最小限とするために２５℃で６及び４０日間の保存について試験した。作成方法はバッチ３０及び６０（アルブミン）に関して上記した方法と同じであり、ただし非蛍光β２ｍ（５３３μｇ／ｍｌ−ＰＢＳ）を使用し、精製は透析カセット（２０ｋＤａカットオフの膜，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）により実施した。図８のバーチャートは、この段階の保存でβ２ｍのリンパ球への移動のためにリポソームの９８％が理想的サイズ（すなわち、直径＜１００ｎｍ）を維持し、これは最長４０日間維持されることを示している。

【0131】

２．５ リポソームにより付与される外因性β２ｍのヒト血清によるタンパク質分解に対する保護（図９）
血清を健康なドナー及び自己免疫疾患（橋本甲状腺炎、リウマチ性多発性関節炎）を患っているドナーから採取した。これらの血清（９０μｌ）を２μｇの純粋なβ２ｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）またはリポソーム形態のβ２ｍ（１５０ｍｌのリポソームにつき３０ｍｇのβ２ｍに相当するバッチ３０リポソーム）の存在下２５℃で１５日間インキュベートした。全反応容量は１３０μｌであり、所要によりＰＢＳ（リン酸ナトリウム１０ｍＭ，塩化ナトリウム１５０ｍＭ，ｐＨ＝７．２）を補充した。６Ｍ 尿素を含有する変性緩衝液（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，レムリ）で３０μｌとした反応培地から１０μｌ（１５０ｎｇに相当する）を０、１、２、３、６、１０及び１５日目に順次取り出した。サンプルを分析まで−２０℃で保持した。

【0132】

すべてのサンプルを収集した後、これらを５０℃で１時間インキュベートした。次いで、タンパク質を４Ｍ 尿素を含有する１２％ アクリルアミドゲル（％Ｔ＝１２，％Ｃ＝２．６）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。

【0133】

ポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜を用いて電気泳動溶出させた後、β２ｍの存在をイムノブロッティングにより検出し、対応するバンドの強度をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，米国）を用いて定量した。標準曲線を用いることにより、得られたピクセルの数をβ２ｍのピコモル（１０^−１２モル）に変換した。図９Ａ〜Ｆに示すグラフは得られた結果の例を表し、β２ｍの量（単位ピコモル）を経時的に表す。自己免疫疾患を患っている人では血清に添加した遊離β２ｍが経時的に分解し、対照ではそうではないことが注目され得る。

【0134】

結論として、遊離β２ｍが自己免疫患者の血清により段階的に大きく分解するが、対照では見られない。他方、この分解はβ２ｍをリポソーム中にカプセル化したときには観察されない。正確に言うと、量の有意な減少が観察されなかったので、リポソームはβ２ｍを血清による分解から保護すると見られる。

【0135】

結論として、リポソームはβ２ｍを血清による分解から保護する。

【0136】

２．６ リポソーム中に含有されているβ２ｍの膜表面上に位置するＨＬＡ Ｉ重鎖との会合（図１０）
健康な人及び生理学的状態では、リンパ球表面上で発現させたβ２ｍの分子は１：１の比でＨＬＡ重鎖に対して非共有的に結合している。

【0137】

これらのタンパク質会合を観察し、定量するために、我々は上記タンパク質の中でＨＬＡ−β２ｍダイマーを一緒に共有的に連結できる技術を開発した。

【0138】

この技術の開発は、正確な膜ＨＣ／β２ｍ比を計算し、リポソーム形態のβ２ｍの添加がＨＬＡ−Ｉの重鎖に特異的に会合することを示すために必要であった。

【0139】

このために、ジアルデヒドであるグルタルアルデヒドの２個のアルデヒド基によりタンパク質のアミノ基を結合させる能力を利用した。これらのアルデヒド基は、グルタルアルデヒドを２つの相互作用するタンパク質に由来する２個のアミノ基と統計的に架橋させ得る３つのメチレンの可変鎖により一緒に連結される（Ｓｕｎ、Ｔ．Ｔ．ら（１９７４），Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ３０Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１６ ｔｏ ５０Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｏｒ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８７（３）：５０９−２２）。

【0140】

この手順に従って、ＭＳＬにより精製した５００万個のリンパ球を可能性ある痕跡量の遊離アミンを除去するためにＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）で１回洗浄した後、１００００ｇで１０分間遠心することによりペレット化し、上清液体は除去した。次いで、細胞を０．２５％ グルタルアルデヒドを含有するＰＢＳ（１ｍｌ）中周囲温度で５分間インキュベートした。このインキュベーション中、管を数回ひっくり返した。

【0141】

トリス １Ｍ（ｐＨ＝７．２）（１００μｌ）を添加することにより反応を停止し、過剰アミン基はグルタルアルデヒドを中和トリス緩衝液より与えられた。１００００ｇで１０分間遠心することによりリンパ球を回収した後、痕跡量のグルタルアルデヒドを除去するためにＰＢＳ（１ｍｌ）で洗浄した。遠心後、ペレットを４Ｍ 尿素を含有し、アンチプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍＢＨ，ドイツ国）及び５％ β−メルカプトエタノールを含むレムリ緩衝液（４００μｌ）中に回収し、分析するまで−２０℃で保持した。

【0142】

細胞を溶解させるために、サンプルに３回の凍結−融解サイクルを施し、強く回転させた。次いで、サンプルを９５℃で５分間インキュベートし、不溶性残渣を除去するために４０００ｇで１０分間遠心した。タンパク質（１２５０００個のリンパ球に相当する１０μｌのホモジネート）を定電圧（１２０Ｖ）下で４Ｍ 尿素を含有する１０％（％Ｔ＝１０，％Ｃ＝２．６）のアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。こうして分離したタンパク質をトリス−グリシン緩衝液の存在下、１３Ｖで前もってメタノールで活性化したＰＶＤＦ膜上に半乾燥で４０分間かけて移した。

【0143】

１／６００に希釈した一次抗β２ｍ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，デンマーク国）と周囲温度で１時間、次いでアルカリホスファターゼにカップリングさせ、１／２００００に希釈した二次抗家兔抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）と再び１時間インキュベートすることによりβ２ｍを検出した。得られたバンドの強度の定量はＩｍａｇｅＪソフトウェアアプリケーション（ＮＩＨ，米国）を用いて実施した。

【0144】

図１０Ａは得られたゲルの写真を示す。グルタルアルデヒドの存在下で、１２ｋＤａの通常のバンドに加えて５５ｋＤａにバンドが見られる。この５５ｋＤａのバンドは、分子量がβ２ｍ分子及び重鎖の分子量の付加：１２＋４３ｋＤａ＝５５ｋＤａに相当するＨＬＡ−β２ｍ複合体に相当する。同一レーン上の１２ｋＤａのバンドは遊離非複合化β２ｍに相当する。各バンドの強度を定量した後、１２及び５５ｋＤのこれらの２つのバンドの累積強度が「グルタルアルデヒドなしの」レーン中の１２ｋＤａのバンドの強度に相当し、全β２ｍに相当する。グルタルアルデヒドあり及びなしのいずれのレーンでも、同一数のリンパ球に相当する全タンパク質の同一量が沈着した。

【0145】

５５ｋＤａのバンドの定量が実際リンパ球表面上に存在するＨＬＡ−β２ｍ複合体の量を与えるという証拠を得るために、平行してリンパ球から血漿膜を精製するための技術を使用した。この技術により、我々は明確にリンパ球血漿膜のタンパク質を研究できた。膜β２ｍの存在を調べ、定量した（図１０Ｂを参照されたい）。得られた結果は５５ｋＤａのバンドの定量に匹敵し、このバンドが実際膜ＨＬＡ−β２ｍ複合体に相当することを確認する。更に、全β２ｍに対する膜β２ｍの割合（図１０Ｂ）は５５ｋＤａバンド／全β２ｍ １２ｋＤａバンドの強度の比に等しい（図１０Ａ）。

【0146】

こうして確認されたグルタルアルデヒド技術を使用して、ヒト血液から単離したリンパ球へのリポソームにより運ばれるβ２ｍの取り込みの程度を調べ、定量した。

【0147】

対照として使用される一人の健康なドナー及び多発性硬化症を患っている他のドナーの２人のドナーを選択した。第２のドナーはＨＬＡ−Ｉの重鎖に比して膜β２ｍが欠乏しているために選択された。この患者は１．７に等しい膜ＨＣ／β２ｍ比を有し、これはリンパ球膜がβ２ｍよりも重鎖を６９％より多く含有していることを意味する。

【0148】

２人のドナー（２５ｍｌの血液）からのリンパ球を各４ｍｌの２つのバッチに分離した。１５０ｍｌにつき４０ｍｇの濃度でβ２ｍを含有している２ｍｌのリポソーム（バッチ４０）を４ｍｌのリンパ球に添加した。Ｔ_０リンパ球を直ちに集め、ＰＢＳで洗浄した。Ｔ_９０でサンプリングしたリンパ球をリポソームと３７℃で９０分間インキュベートした後、収集し、未反応の過剰のリポソームを除去するためにＰＢＳで洗浄した。

【0149】

２つの条件の各々の下で、我々はグルタルアルデヒドで処理したまたは処理しなかったリンパ球の２つの集団を分析した（上述のプロトコルを参照されたい）。

【0150】

各条件下で、全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットにより明らかにした。得られた結果を図１０Ｃに示し、我々は定量後、対照とは対照的にグルタルアルデヒドの存在下で（ＨＬＡ−β２ｍ複合体を表す）５５ｋＤａバンドの強度がＴ_０に比してＴ_９０で５５％増加することを知見した。

【0151】

この増加は、患者におけるリンパ球表面上に遊離ＨＬＡ−１鎖を存在させるβ２ｍの欠乏と一致する。すなわち、重鎖は実際リポソームにより与えられる外因性β２ｍと会合している。

【0152】

実行した実験アプローチにより、本発明の治療概念を提供することを証明できた。すなわち、
・リンパ球表面にリポソーム形態の外因性β２ｍを付加することによりＨＬＡ−β２ｍバランスを再構築することができる。
・β２ｍが欠乏している患者はβ２ｍの取り込みを必要としない対照よりもより多くのβ２ｍを取り込むことができる。
・取り込まれたβ２ｍは実際遊離ＨＬＡ分子と会合してＨＬＡ−β２ｍダイマーを形成する。

【0153】

要するに、得られた実験データから、β２ｍのリポソーム調製物を使用すると生理学的正常に近い、すなわち１に近似のＨＣ／β２ｍ比を再構築する目的で遊離重鎖（ＨＣ／β２ｍ＞１）を提示するリンパ球を標的することができることが確認される。

【0154】

３−β２ｍのリポソーム組成物の毒性分析
リポソーム形態のβ２ｍを、ヒト起源の肝臓、腎臓、骨格筋及び心臓細胞の培養物に対するその可能性ある毒性についてインビトロで試験した。

【0155】

３．１ 被験細胞の型
被験細胞及び培地はＳｃｉｅｎｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（６０７６ Ｃｏｒｔｅ Ｄｅｌ Ｃｅｄｒｏ，カリフォルニア州カールズバッド）から購入した。

【0156】

ａ．ＨＣＦ：初代ヒト心臓線維芽細胞，バッチＮｏ．２１３６
培地：ＦＭ（線維芽細胞培地），バッチＮｏ．５６７３＋線維芽細胞増殖溶液，バッチＮｏ．５８６３＋ＦＢＳ １０％＋ペニシリン溶液（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ），バッチＮｏ．５９１７
ｂ．ＨＲＥｐｉＣ：初代ヒト腎臓上皮細胞，バッチＮｏ．０５４６
培地：上皮細胞培地，バッチＮｏ．５９６７＋上皮細胞増殖溶液，バッチＮｏ．５８５５＋ＦＢＳ １０％＋ＰＳ
ｃ．ＨＨ：初代ヒト肝細胞，バッチＮｏ．４６０７
培地：ＨＭ（肝細胞培地），バッチＮｏ．５９３３＋肝細胞増殖溶液，バッチＮｏ．５７２２＋ＦＢＳ １０％＋ＰＳ
ｄ．ＨＳｋＭＣ：初代ヒト骨格筋細胞，バッチＮｏ．５６０６
培地：骨格筋細胞培地＋ＳｋＭＧＳ＋ＦＢＳ １０％＋ＰＳ
培養フラスコまたは皿を３７℃、５％ ＣＯ_２及び飽和湿度のインキュベーター（Ｓａｎｙｏ）中に置いた（バッチは０．２２μｍ，Ｎａｎｏｐｕｒｅ，Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒで濾過した超純水を含有している）。

【0157】

初代ヒト細胞のための培養基質は、インキュベーターにおいて２μｇ／ｃｍ^２のポリ−Ｌ−リシン（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，バッチＮｏ．５８２６，溶液：１０ｍｇ／ｍｌ）と一晩インキュベートし、接種前に滅菌超純水で２回濯いだ細胞培養処理プラスチック（ＴＰＰ，スイス国）である。

【0158】

３．２ 細胞層の脱離及び解離
作成した培地を培養フラスコから取り出し、層を滅菌ＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ，バッチＮｏ．０８８Ｋ２３５６）で濯ぎ、次いで０．０５％ トリプシン（ＳＩＧＭＡ トリプシンＲｅｆ Ｔ−１４２６，バッチＮｏ．０２０Ｍ７３５４）、ＥＤＴＡ ０．２ｇ、ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．４ｇ、ＮａＨＣＯ_３ ０．５８ｇ、グルコース １ｇ（ＳＩＧＭＡ）、１リッターまで超純水の溶液で処理することにより、細胞層の脱離を実施した。溶液は０．２２μ孔径の膜濾過（ＰＥＳ），ＣＭＬ バッチＮｏ．６６８９１９）により滅菌し、トリプシン溶液の容量をフラスコの種類に調節し（例えば、２５ｃｍ^２のフラスコの場合１ｍｌ）、培養フラスコは３７℃（Ｓａｎｙｏインキュベータ）で３〜４分間放置した。

【0159】

細胞をその基質から脱離させたら、脱離を培地の存在下で血清（トリプシンの酵素作用の阻害）をピペット（細胞型応じて５〜１０ｍｌ）に出し入れしながら実施した。

【0160】

３．３ 毒性試験
細胞を光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）の下Ｔｈｏｍａ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてカウントし、９６ウェルの細胞培養処理プラスチック（ＮＵＮＣ，バッチＮｏ．１１４７５４）の平底培養皿を用いて２００μｌのそれぞれの培地中に５０００細胞／ウェルの量で接種し、作成後皿をインキュベーター中に２４時間置いた。被験物質の各種希釈物を１００μｌの抗生物質なしの培地において３回濃縮し、抗生物質は処理のため２００μｌの各ウェルに添加した（全容量：３００μｌ）。２４時間、４８時間及び７２時間目に、処理ウェル及び対照ウェルを細胞毒性を評価するためにプロトコルに従ってＭＴＴ（ブルーテトラゾリウム臭化チアゾリル）［Ｌｉｕ Ｙ．ら（１９９７），Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＭＴＴ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６９：５８１−５９３］及びタンパク質の量（Ｒｅｆ ２３２２７、ＢＣＡタンパク質アッセイキット；Ｐｉｅｒｃｅ）について調べた。
・最終濃度２５μｇ／ｍＬのためにＭＴＴ溶液の添加、
・３７℃で１時間のインキュベーション
・培地の吸引、
・１００μＬ（飽和ＤＯならば２００μＬ）のＤＭＳＯの添加、
・皿（Ｂｉｏｒａｄ）の４９０ｎｍでの測定、
・Ｅｘｃｅｌを用いるコンピューター処理、
・空ウェル（ブランク）を用いるバックグラウンドノイズの引き算、
・ＤＯ Ｘウェル／ＤＯ対照ウェルの比を決定する、
・前記比の薬物濃度に対する曲線をトレースする。

【0161】

毒性を治療の２４時間及び４８時間目、すなわちｔ_ｏ＋４８ｈ及びｔ_０＋７２ｈに調べた。

【0162】

図１１及び１２は、たとえ高量（バッチ１３２）でもリポソーム被覆β２ｍは、β２ｍに対して感受性である肝細胞及び腎細胞の生存率に悪影響を与えないことを明らかに示している。同じことが心臓起源の細胞及び骨格筋細胞（結果示さず）にも当てはまる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】