特許 6704420 フォンヴィレブランド因子の半減期を改善するための化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6704420

(24)【登録日】2020年5月14日

(45)【発行日】2020年6月3日

(54)【発明の名称】フォンヴィレブランド因子の半減期を改善するための化合物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20200525BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 38/37 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20200525BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 N

   C07K16/28ZNA

   A61K39/395 D

   A61P43/00 121

   A61K38/37

   A61P7/04

【請求項の数】15

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2017-564947(P2017-564947)

(86)(22)【出願日】2016年3月4日

(65)【公表番号】特表2018-510213(P2018-510213A)

(43)【公表日】2018年4月12日

(86)【国際出願番号】EP2016054650

(87)【国際公開番号】WO2016142289

(87)【国際公開日】20160915

【審査請求日】2019年2月20日

(31)【優先権主張番号】15158088.3

(32)【優先日】2015年3月6日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】518315254

【氏名又は名称】ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ミヒャエル・モーゼス

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン・シュルテ

(72)【発明者】

【氏名】ゲーアハルト・ディックナイテ

(72)【発明者】

【氏名】ウーヴェ・カリーナ

(72)【発明者】

【氏名】ザビーネ・ペステル

【審査官】 吉田 知美

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１６７３０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Biochemistry，２００７年，Vol.141, No.1，pp.127-136

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液凝固障害の治療に使用するための、ヒト受容体タンパク質ＣＬＥＣ１０Ａに結合する能力を有する抗体を含む医薬組成物であって、前記抗体がフォンビレブランド因子のＣＬＥＣ１０Ａへの結合を阻害する能力を有する、前記医薬組成物。

【請求項2】

前記抗体がＣＬＥＣ１０Ａに特異的に結合する、請求項１に記載した医薬組成物。

【請求項3】

前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載した医薬組成物。

【請求項4】

前記ＣＬＥＣ１０Ａが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜３の何れか１項に記載した医薬組成物。

【請求項5】

フォンビレブランド因子の半減期を治療により増加させる、請求項１〜４の何れか１項に記載した医薬組成物。

【請求項6】

第ＶＩＩＩ因子の半減期を、治療により増加させる、請求項１〜５の何れか１項に記載した医薬組成物。

【請求項7】

前記治療が、第ＶＩＩＩ因子、フォンビレブランド因子およびそれらの組合せからなる群より選択されたポリペプチドを投与することを更に含む、請求項１〜６の何れか１項に記載した医薬組成物。

【請求項8】

前記医薬組成物および前記ポリペプチドを別個に投与する、請求項７に記載した医薬組成物。

【請求項9】

前記血液凝固障害が、血友病Ａまたはフォンビレブランド病である、請求項１〜８の何れか１項に記載した医薬組成物。

【請求項10】

（ｉ）請求項１〜４の何れか１項に記載した医薬組成物と、（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子、
フォンビレブランド因子およびそれらの組合せからなる群より選択されたポリペプチドとを含む医薬キット。

【請求項11】

前記医薬組成物および前記ポリペプチドが、別個の組成物中に含まれる、請求項１０に記載の医薬キット。

【請求項12】

（ｉ）請求項１〜４の何れか１項に記載した医薬組成物と（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子、フォンビレブランド因子及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリペプチドとを含み、血液凝固障害の治療において、同時に、別々に、又は順番に使用するための医薬キット。

【請求項13】

フォンビレブランド因子の、半減期を増加させるか、またはクリアランスを減少させるための、請求項１〜４の何れか１項に記載した医薬組成物。

【請求項14】

第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加させるための、請求項１〜４の何れか１項に記載した医薬組成物。

【請求項15】

治療的処置におけるフォンビレブランド因子の半減期の延長に使用するための、請求項１〜４の何れか１項に記載した医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液凝固障害の治療を改善するための製品及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

血液凝固因子の欠失に起因する様々な出血性障害がある。最も一般的な障害は、血友病Ａ及びＢであり、夫々血液凝固因子、第ＶＩＩＩ（ＶＩＩＩ）及びＩＸ、の欠失がもたらす。もう一種の既知の出血性障害はフォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）である。

【0003】

ＦＶＩＩＩは、血漿中に、ほとんどフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）との非共有結合複合体として存在し、その凝固機能は、因子ＸからＸａへの転換に依存する因子ＩＸａを促進することである。

【0004】

古典的血友病又は、血友病Ａは、遺伝性出血性疾患である。これは、血液凝固因子ＦＶＩＩＩの染色体Ｘ−結合欠失がもたらす結果であり、ほぼ独占的に男性に影響を及ぼし、発症率は１０，０００人あたり１〜２人である。Ｘ染色体欠損は、女性キャリアによって伝達されるが、彼女達自身は血友病患者ではない。血友病Ａの臨床症状は出血傾向が大きいことである。

【0005】

予防的にＦＶＩＩＩ治療により療養している重症の血友病Ａの患者は、ＦＶＩＩＩの血漿半減期が約１２〜１４時間と短いために、週に約３回静脈内（ｉ．ｖ．）投与をしなければならない。毎回のｉ．ｖ．投与は煩わしく、痛みを伴い、かつ、感染の危険性を伴う、というのは、これは特に患者自身で、又は、血友病Ａと診断された子供の両親により、家庭で行われるからである。

【0006】

従って、ＦＶＩＩＩの半減期を増加し、投与しなければならない頻度を低減したＦＶＩＩＩを含有する医薬組成物が強く望まれている。

【0007】

活性化していないＦＶＩＩＩの半減期を延長するための、数種の試みとしては、細胞受容体とのその相互作用を低減することにより（特許文献１、２）、ポリマーをＦＶＩＩＩに共有結合させることにより（特許文献３、４及び５）、ＦＶＩＩＩをカプセル化することにより（特許文献６）により、新規な金属結合部位を導入することにより（特許文献７）により、Ａ２領域をＡ３領域に、ペプチド結合（特許文献８及び９）で、又は、ジスルフィド結合（特許文献１０）の何れかで共有結合させることにより、又は、Ａ１領域をＡ２領域に共有結合させることにより（特許文献１１）なされている。

【0008】

ＦＶＩＩＩ又は、ＶＷＦの機能的半減期を増強するための別のアプローチは、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化（特許文献１２、１３、１４）又は、ＶＷＦのＰＥＧ化（特許文献１５）、であり、増加した半減期を有することにより、ＰＥＧ化したＶＷＦが血漿中に存在するＦＶＩＩＩの半減期をも間接的に増強する。又、ＦＶＩＩＩの融合タンパク質も記載されている（特許文献１６、１７及び１８）。

【0009】

フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）の異なる形態中において、欠損しているか、機能的な欠陥を有するか、又は、減少した量でのみ得られる、ＶＷＦは、複数の生理学的機能を有し、哺乳動物の血漿中に存在する多量体接着性糖タンパク質である。一次止血の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特異的受容体と、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの成分との間の介在物質として作用する。更に、ＶＷＦは、凝血原ＦＶＩＩＩのための担体及び安定化タンパク質としての役割を有する。ＶＷＦは２８１３アミノ酸前駆体分子として内皮細胞及び巨核球内で合成される。野生型ＶＷＦのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列は、非特許文献１に開示されている。前駆体ポリペプチドである、プレプロＶＷＦは、成熟血漿ＶＷＦ中に見出される２２残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロペプチド及び２０５０残基のポリペプチドからなる（非特許文献２）。小胞体におけるシグナルペプチドの切断後、ＶＷＦの２つの単量体の間でＣ末端ジスルフィド架橋が形成される。分泌経路を更に輸送する間に、Ｎ結合型及びＯ結合型炭水化物側鎖が付加される。より重要なことは、ＶＷＦ二量体は、Ｎ末端ジスルフィド架橋を介して多量体化され、７４１アミノ酸長のプロペプチドは、後期ゴルジ体内の酵素ＰＡＣＥ／フューリンによって切断されることである。プロペプチド並びにＶＷＦの高分子量多量体（ＶＷＦ−ＨＭＷＭ）は、内皮細胞のバイベル−パラード（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）小体又は、血小板のα−顆粒に貯蔵される。

【0010】

一旦、血漿中に分泌されたプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦのＡ１領域内でＶＷＦを切断する。従って、血漿ＶＷＦは、５００ｋＤａの単一の二量体から１０，０００ｋＤａを超える分子量を有する二量体２０以上からなる多量体までの全範囲の多量体からなる。ＶＷＦ−高分子量多量体（ＨＭＷＭ）は最強の止血活性を有し、これはリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）中で測定しても良い。ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ抗原の比率が高いほど、高分子量多量体の相対量が高くなる。

【0011】

ＶＷＦの欠損が、フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）の原因であり、多かれ少なかれ明白な出血性表現型を特徴とする。ＶＷＤ３型は、最も重篤な形態であり、ＶＷＦが完全に欠損しており、ＶＷＤ１型は、ＶＷＦの定量的な損失に関連し、その表現型は非常に軽度となり得る。ＶＷＤ２型は、ＶＷＦの定性的欠損に関連し、ＶＷＤ３型と同等に重篤となり得る。ＶＷＤ２型は、多くの副次的形態を有し、その内、いくつかは高分子量多量体の損失又は、減少と関連している。Ｖｏｎ ＶＷＤ２ａ型は、中間型多量体と大型多量体の両方の損失が特徴的である。ＶＷＤ２Ｂ型は、最高分子量の多量体の損失が特徴的である。

【0012】

ＶＷＤは、ヒトにおいて最も頻出する遺伝性の出血性疾患であり、血漿又は、組換え由来のＶＷＦを含有する濃縮物を用いる補充療法によって治療しても良い。

【0013】

血漿中で、ＦＶＩＩＩは高い親和性でＶＷＦに結合し、成熟前の異化作用から保護し、従って一次止血における役割の他に、ＦＶＩＩＩの血漿レベルを調節する重要な役割を果たし、結果として二次止血を制御する中心的因子でもある。ＶＷＦに結合した活性化していないＦＶＩＩＩの半減期は、血漿中で約１２〜１４時間である。 ＶＷＦがほとんど又は全く存在しないフォンヴィレブランド病３型では、ＦＶＩＩＩの半減期は僅か約６時間であり、ＦＶＩＩＩの濃度低下のため、そのような患者が、軽度から中等度の血友病Ａの症状に至るのである。ＦＶＩＩＩに及ぼすＶＷＦの安定化効果は、又、ＣＨＯ細胞におけるＦＶＩＩＩの組換え発現を補助するためにも使用されている（非特許文献３）。

【0014】

ＶＷＦ、ＦＶＩＩＩ又は、両因子の半減期を増加させるための製品及び方法についての必要性がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0015】

【特許文献1】国際特許公開第０３／０９３３１３号

【特許文献2】国際特許公開第０２／０６０９５１号

【特許文献3】国際特許公開第９４／１５６２５号

【特許文献4】国際特許公開第９７／１１９５７号

【特許文献5】米国特許第４９７０３００号

【特許文献6】国際特許公開第９９／５５３０６号

【特許文献7】国際特許公開第９７／０３１９３号

【特許文献8】国際特許公開第９７／４０１４５号

【特許文献9】国際特許公開第０３／０８７３５５号

【特許文献10】国際特許公開第０２／１０３０２４号

【特許文献11】ＷＯ２００６／１０８５９０

【特許文献12】国際特許公開第２００７／１２６８０８号

【特許文献13】国際特許公開第２００６／０５３２９９号

【特許文献14】国際特許公開第２００４／０７５９２３号

【特許文献15】国際特許公開第２００６／０７１８０１号

【特許文献16】国際特許公開第２００４／１０１７４０号

【特許文献17】国際特許公開第２００８／０７７６１６号、

【特許文献18】国際特許公開第２００９／１５６１３７号

【非特許文献】

【0016】

【非特許文献1】Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，４３９３−４３９７

【非特許文献2】Ｆｉｓｃｈｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ。３５１：３４５−３４８，１９９４

【非特許文献3】Ｋａｕｆｍａｎら、１９８９、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

本出願の発明者らは、ＶＷＦ単量体が、マクロファージ上に存在する受容体タンパク質であるカルシウム型レクチン領域ファミリー１０メンバーＡ（ＣＬＥＣ１０Ａ）に強く結合することを見出した。特に、ＣＬＥＣ１０Ａのマウスオルソログに結合し得る抗体が、マウスにおけるＶＷＦのクリアランスに対し阻害効果を及ぼすことを見出した。従って、ＶＷＦのクリアランスを減少させることにより、ＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る阻害性抗体が、血漿中のＶＷＦの半減期を延長するのである。このような阻害性抗体を投与することにより、ＦＶＩＩＩの半減期を延長することもできる。

【課題を解決するための手段】

【0018】

従って、本発明は、項目［１］〜［１８］に定義した内容に関する。
［１］ 血液凝固障害の治療に用いるための、ヒト受容体タンパク質ＣＬＥＣ１０Ａ又は、そのオルソログに結合し得る化合物。
［２］ フォンヴィレブランド因子のＣＬＥＣ１０Ａへの結合を阻害し得る、［１］項に記載の使用のための化合物。
［３］ 前記化合物がＣＬＥＣ１０Ａに特異的に結合する、［１］項又は、［２］項に記載の使用のための化合物。
［４］ 前記化合物が抗体又は、その断片である、［１］〜［３］項の何れか１項に記載の使用のための化合物。
［５］ 前記抗体がモノクローナル抗体である［４］項に記載の使用のための化合物。
［６］ 前記ＣＬＥＣ１０Ａが、配列番号１又は、２に示されるアミノ酸配列を有する、［１］〜［５］項の何れか１項に記載の使用のための化合物。
［７］ フォンヴィレブランド因子の半減期が治療により増加する、［１］〜［６］項の何れか１項に記載の使用のための化合物。
［８］ 第ＶＩＩＩ因子の半減期が治療により増加する、［１］〜［７］項の何れか１項に記載の使用のための化合物。
［９］ 前記治療が、第ＶＩＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子及びそれらの組合わせからなる群から選択されたポリペプチドを投与することを更に含む、［１］〜［８］項の何れか１項に記載の使用のための化合物。
［１０］ 前記化合物と前記ポリペプチドとを別々に投与する、［９］項に記載の使用のための化合物。
［１１］ 前記血液凝固障害が、血友病Ａ又は、フォンヴィレブランド病である、［１］〜［１０］項の何れか１項に記載の使用のための化合物。
〔１２〕（ｉ）［１］〜［６］項の何れか１項に定義した第１の化合物と、
（ｉｉ）第ＦＶＩＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子及びそれらの組合わせからなる群から選択されたポリペプチドとを含む医薬キット。
［１３］ 前記化合物と前記ポリペプチドとは別々の組成物に含まれる［１２］項に記載の医薬キット。
［１４］ フォンヴィレブランド因子の半減期を増加するか、又はクリアランスを低減するための、［１］〜［６］項の何れか１項に定義した化合物の使用。
［１５］ 第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加するための、［１］〜［６］項の何れか１項に定義した化合物の使用。
［１６］ 治療的処置におけるフォンヴィレブランド因子の半減期を延長するために使用する［１］〜［６］項の何れか１項に定義した化合物。
［１７］ ［１］〜［６］項の何れか１項に定義した化合物の有効量を被験者に投与することを含む、インビボでのフォンヴィレブランド因子の半減期を増加するか、又はクリアランスを低減する方法。
［１８］ ［１］〜［６］項の何れか１項に定義した化合物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血液凝固障害の治療方法。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ヒトＶＷＦ単量体と組換えヒトＣＬＥＣ１０Ａとの相互作用（実施例１参照）。

【図2】ヒトＶＷＦ単量体と組換えヒトＣＬＥＣ１０Ａ及びＣＬＥＣ１０Ａオルソログマウスタンパク質（ＭＧＬ１及びＭＧＬ２）両方との相互作用（実施例２参照）。

【図3】ヒトＶＷＦ単量体と組換えヒトＣＬＥＣ１０Ａ及びＣＬＥＣ１０Ａオルソログマウスタンパク質（ＭＧＬ１及びＭＧＬ２）両方との相互作用（実施例２参照）。

【図4A】中和抗ＭＧＬ１／２抗体の存在下でのＭＧＬ２へのＶＷＦ結合の阻害（実施例３参照）。

【図4B】中和抗ＭＧＬ１／２抗体の存在下でのＭＧＬ２へのＶＷＦ結合の阻害（実施例３参照）。

【図4C】中和抗ＭＧＬ１／２抗体の存在下でのＭＧＬ２へのＶＷＦ結合の阻害（実施例３参照）。

【図5】インビボで夫々の受容体機能を中和する抗ＭＧＬ１／２抗体の存在下のヒトＶＷＦのＰＫ（実施例４参照）。ＶＷＦ欠損マウスに、ポリクローナルヤギ抗ＭＧＬ１／２抗体を体重１ｋｇ当たり８ｍｇ投与した。非特異的なヤギ抗体を対照治療として使用した。続いて、ヒトＶＷＦ（２００ＩＵ／ｋｇ体重）を注射し、注射した後の指示された時間に血漿中に回収したＶＷＦ：Ａｇを、注射したＶＷＦ用量のパーセンテージとして提示した。阻害性抗ＭＧＬ１／２抗体の投与により、対照抗体を投与した群と比較した場合、ＶＷＦクリアランスの減少がもたらされていた。

【発明を実施するための形態】

【0020】

第１の態様において、本発明は、血液凝固障害の治療に使用するための、ヒト受容体タンパク質ＣＬＥＣ１０Ａ又はそのオルソログに結合し得る抗体に関する。

【0021】

他の態様では、本発明は、血液凝固障害の治療に使用するためのヒトＣＬＥＣ１０Ａ又は、そのオルソログに結合し得る化合物に関し、ここで前記化合物は、
（ｉ）抗体であり、
（ｉｉ）ヒトＣＬＥＣ１０Ａ又はそのオルソログに特異的に結合し得て、
（ｉｉｉ）ＡＢＯ（Ｈ）血液型抗原の一部、又はそれに由来する利用可能な糖残基を含まず、
（ｉｖ）前記化合物の一部であり得る炭水化物構造を介して受容体タンパク質ＣＬＥＣ１０Ａ又は、そのオルソログに結合せず、
（ｖ）ヒトＡＳＧＰ受容体に結合せず、
（ｖｉ）ヒト受容体ＣＬＥＣ４Ｍに結合せず、
（ｖｉｉ）ヒト受容体ＳＣＡＲＡ５に結合せず、
（ｖｉｉｉ）ヒト受容体ＭＭＲに結合せず、
（ｉｘ）ヒト受容体ＣＬＥＣ４Ｆに結合せず、及び／又は、
（ｘ）ヒト受容体ＣＯＬＥＣ１２に結合しない。

【0022】

ＣＬＥＣ１０Ａ
ＣＬＥＣ１０Ａは、マクロファージＧａｌ型レクチンとしても知られ、ＣＬＥＣファミリーのヒトＩＩ型膜貫通受容体タンパク質である。さらなる同義語としては、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー１４、マクロファージレクチン２及びＣＤ３０１である。ＣＬＥＣ１０Ａは、肝臓ＡＳＧＰＲタンパク質と密接な関係があるが、中間単球、マクロファージ及び樹状細胞によって発現する。それにもかかわらず、ＣＬＥＣ１０Ａ及びＡＳＧＰＲは、明確に異なる細胞局在及び炭水化物特異性を有する異種タンパク質である。ＣＬＥＣ１０Ａは、樹状細胞による病原体の認識に関与し、しかも、癌発生において腫瘍関連糖タンパク質を選択的に認識することが報告されている（ｖａｎ Ｖｌｉｅｔら（２００５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７：６６１−６６９； Ｎａｐｏｌｅｔａｎｏら（２０１２） Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４２：９３６−９４５）。この受容体は、末端α−及びβ−結合ＧａｌＮＡｃ残基を含む糖タンパク質への結合を媒介するとして記載されている。Ｔｎ−抗原（セリン／スレオニンにα結合したＧａｌＮＡｃ）及びシアリル−Ｔｎ−抗原構造のようなＯ−結合型炭水化物構造は、ＣＬＥＣ１０Ａの好ましい相互作用パートナーとして同定されている（ｖａｎ Ｖｌｉｅｔら（２００５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７：６６１−６６９； Ｓａｅｌａｎｄら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、５６：１２２５−１２３６； ｖａｎ Ｖｌｉｅｔら（２００８）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２９：８３−９０； Ｄｅｎｄａ−Ｎａｇａｉら（２０１０ ）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８５：１９１９３−１９２０４； Ｍｏｒｔｅｚａｉら（２０１３）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２３：８４４−８５２）。多くの腫瘍細胞は、グリコシルトランスフェラーゼの、変化した発現レベル及び活性に起因する異常なグリコシル化を示し、これはＴｎ抗原などのグリカンの異常な発現をもたらす（ｖａｎ Ｖｌｉｅｔら（２００８）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２９：８３−９０。

【0023】

本明細書中で使用する用語「ＣＬＥＣ１０Ａ」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は、その天然由来の変異体を有する、又は、それからなるヒトタンパク質を意味する。ＣＬＥＣ１０Ａは、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース中で識別子Ｑ８ＩＵＮ９−１、Ｑ８ＩＵＮ９−２、及びＱ８ＩＵＮ９−３で示されるようなアミノ酸配列を有する、又は、それからなるタンパク質を含むが、これに限定する訳ではない。最も好ましくは、ＣＬＥＣ１０Ａは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか又は、それからなる。

【0024】

ＣＬＥＣ１０Ａのオルソログは、マウス、ラット及びゼブラフィッシュを含む数種において同定されている。ヒトはＣＬＥＣ１０Ａの単一遺伝子を保有し、一方マウスは２つの密接に関連するＭＧＬ１及びＭＧＬ２遺伝子を有する。マウス受容体タンパク質も又、マクロファージ上及び未成熟樹状細胞上で発現する。ヒトＣＬＥＣ１０Ａ及びマウス受容体タンパク質は、アミノ酸レベルで高度の相同性を示す。炭水化物認識領域内で、ヒトＣＬＥＣ１０Ａは、マウスＭＧＬ１及びマウスＭＧＬ２の両方と約６０％のアミノ酸配列同一性を共有する（Ｓｕｚｕｋｉら（１９９６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５６：１２８−１３５）。同様のリガンド好適性がヒトＣＬＥＣ１０Ａ、マウスＭＧＬ１及びマウスＭＧＬ２によって示され、以前に報告された結合性の研究では、３種の受容体タンパク質の全てがＧａｌ及びＧａｌＮＡｃ関連を認識することを実証している（Ｓｕｚｕｋｉら（１９９６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５６：１２８−１３５；Ｏｏ−ｐｕｔｈｉｎａｎら（２００８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１７８０：８９−１００）。ＭＧＬ１及びＭＧＬ２は、そのアミノ酸配列（アミノ酸同一性が約９０％）内において互いに高度に相同であり、しかも炭水化物認識領域において高度の同一性を共有する（Ｔｓｕｉｊｉら（２００２）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７７： ２８８９２−２８９０１；Ｏｏ−ｐｕｔｈｉｎａｎら（２００８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１７８０：８９−１００）。

【0025】

本発明による好ましいオルソログには、
・ マウス由来のオルソログ（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ４９３００、Ｆ８ＷＨＢ７及びＱ８ＪＺＮ１の内の１種により、定義されるアミノ酸配列を有するか又は、それからなるポリペプチド；
・ ラット（ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のオルソログ、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ４９３０１により、定義されるアミノ酸配列を有するか又は、それからなるポリペプチド。
・ ウサギ（ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）由来のオルソログ、
・ モルモット（ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）由来のオルソログ、
・ カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のオルソログ及び
・ アカゲザル（ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）由来のオルソログなどが挙げられる。

【0026】

ＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物
ＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物（以下、「化合物」という）の種類や分類は特に限定されない。 然しながら、好ましくは、化合物はペプチド又は、ポリペプチドであり、最も好ましくは化合物は抗体又は、その断片である。

【0027】

本明細書で使用する用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子を意味し、特定の抗原と結合、又は、免疫学的に反応性を示し、かつポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子操作抗体及びその他の修飾した形態の抗体を含み、抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ）、単一領域抗体（ナノボディ）及び抗体の抗原結合断片、例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びｓｃＦｖなど、を含むが、これに限定する訳ではない。更に、特に示さない限り、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、無処置の分子、ならびにタンパク質に結合し得る抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片）の両方を含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、無処置の抗体のＦｃ断片を欠損しており、動物又は、植物の循環からより迅速に除去され、無処置の抗体よりも非特異的組織結合が少ない可能性がある（Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ Ｎｕｃｌ。Ｍｅｄ。２４：３１６）。

【0028】

本発明の抗体は、ＣＬＥＣ１０Ａの少なくとも１種の変異体に結合し得る。好ましい実施形態において、抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に結合し得る。最も好ましい実施形態では、抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に結合し得る。

【0029】

他の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａの細胞外領域、例えば、配列番号２のアミノ酸６１−３１６内のエピトープに結合し得る。

【0030】

好ましくは、本発明の抗体は、ＣＬＥＣ１０Ａのレクチン結合部位に結合する。

【0031】

好ましくは、本発明の抗体は、可変領域のアミノ酸残基を介してＣＬＥＣ１０Ａに結合する。より好ましくは、本発明の抗体は、ＡＢＯ（Ｈ）血液型抗原に由来する利用可能な糖残基を含まず、抗体は利用可能な糖残基、即ちガラクトース、フコース又は、Ｎ−アセチルガラクトサミンを含まない。更により好ましくは、抗体はＦｃ領域にグリコシル化部位を含まず、例えば、抗体は、Ｋａｂａｔの番号に従うと残基Ｎ２９７の変異を有するＩｇＧである。最も好ましくは、グリコシル化されていない抗体である。

【0032】

又、抗体がＣＬＥＣ１０Ａに特異的に結合することも好ましい。一実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、以下の受容体、ＡＳＧＰＲ１、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＬＥＣ４Ｆ、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＳＣＡＲＡ５及びＭＭＲの２種又はそれ以上に、好ましくは全てに結合し得ない。

【0033】

別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＡＳＧＰＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｐ０７３０６）には結合し得ない。

【0034】

別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＣＯＬＥＣ１２（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｑ５ＫＵ２６）には結合し得ない。

【0035】

別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＣＬＥＣ４Ｆ（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｑ８Ｎ１Ｎ０）には結合し得ない。

【0036】

別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＣＬＥＣ４Ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｑ９Ｈ２Ｘ３）には結合し得ない。

【0037】

別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＳＣＡＲＡ５（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｑ６ＺＭＪ２）には結合し得ない。

【0038】

別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＭＭＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｐ２２８９７）には結合し得ない。

【0039】

更に別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、以下の受容体、ＡＳＧＰＲ１、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＬＥＣ４Ｆ、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＳＣＡＲＡ５及びＭＭＲ、の何れの１種にも結合し得ない。

【0040】

別の実施形態では、抗体は、ＣＬＥＣ１０Ａの少なくとも１種のマウスオルソログに結合し得る。 その実施形態において、抗体は、ＭＧＬ１、ＭＧＬ２、又は、ＭＧＬ１及びＭＧＬ２の両方に結合し得る。 抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子番号Ｐ４９３００に定義されるアミノ酸配列を有するか又は、それからなるタンパク質に結合し得る。 この抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔ 識別子番号 Ｆ８ＷＨＢ７に定義されるアミノ酸配列を有するか又は、それからなるタンパク質に結合し得る。抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子番号 Ｑ８ＪＺＮ１に定義されるアミノ酸配列を有するか又は、それからなるタンパク質に結合し得る。

【0041】

別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａのラットオルソログに結合し得る。別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａのウサギオルソログに結合し得る。別の実施形態では、抗体は、ＣＬＥＣ１０Ａのカニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）オルソログ、及び／又はアカゲザル（ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）オルソログに結合し得る。

【0042】

ＣＬＥＣ１０Ａに対する抗体の結合は、以下の実施例１に記載するように決定することができる。

【0043】

ＣＬＥＣ１０Ａ及び抗体によって形成される複合体の解離定数Ｋ_Dは、好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、最も好ましくは５ｎＭ未満である。通常、Ｋ_Dは、約１０ｐＭ〜約１００ｎＭ、又は、約１００ｐＭ〜約１０ｎＭ、又は、約５００ｐＭ〜約５ｎＭの範囲である。

【0044】

好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物又は、ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を意味し、それが産生される方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又は、それらを組合わせる使用を含む、当該分野で公知の多種多様な技術を用いて調製しても良い。（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８８、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。

【0045】

ヒトにおける抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体のインビボでの使用を含む他の実施形態では、キメラ、霊長類化された、ヒト化された、又は、ヒト抗体を使用しても良い。好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体又は、ヒト化抗体であり、より好ましくはモノクローナルヒト抗体又は、モノクローナルヒト化抗体である。

【0046】

本明細書で使用される用語「キメラ」抗体とは、例えば、ラット又は、マウス抗体等等の非ヒト免疫グロブリン、及び、通常、ヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域、から誘導される可変配列を有する抗体を意味する。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２−７を参照のこと。Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２、米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、及び第４，８１６，３９７号に記載され、これらは、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。

【0047】

非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又は、その断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は、他の標的結合サブ配列など）であり、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全て、少なくとも１種、及び、通常は２種の可変ドメインを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、かつＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常は選択されたヒト免疫グロブリン鋳型のものを含んでも良い。ヒト化は、キメラ抗体を作製するための技術であり、１種又は、それ以上のアミノ酸、又はヒト可変領域の一部分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。ヒト化抗体は、非ヒト種で産生した抗体分子であり、非ヒト種由来の１種又は、それ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する所望の抗原と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク（ＦＲ）領域とを結合する。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換され、抗原結合を改変し、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えばＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングし、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、及び配列比較して、特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−７及びＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号（その各々は、その全体が参照により組込まれる）を参照のこと。抗体は、ヒト化しても良く、当該分野で周知の種々の技術としては、例えばＣＤＲ移植（欧州特許第２３９４００号、国際特許公開第９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又は、再表面化（欧州特許第５９２１０６号、欧州特許第５１９５９６号、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２８：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３）、及びチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）等を使用し、これらはすべて、参照によりその全体を本明細書に組込む。

【0048】

いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号に記載されているように調製する（その各々は、その全体を参照により組込む）。

【0049】

いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体はヒト抗体である。完全な「ヒト」抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、ヒト患者の治療的処置に望ましいものとなり得る。本明細書中で使用する「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、かつ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、又は、１種又はそれ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニック動物から得られた抗体を含み、しかも、内因性免疫グロブリンを発現しない。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて上記のファージディスプレイ法を含む、当該分野で公知の種々の方法により作製出来る。米国特許第４，４４４，８８７号、及び第４，７１６，１１１号、及び国際特許公開第９８／４６６４５号、国際特許公開第９８／５０４３３号、国際特許公開第９８／２４８９３号、国際特許公開第９８／１６６５４号；国際特許公開第９６／３４０９６号、国際特許公開第９６／３３７３５号、及び国際特許公開第９１／１０７４１号、を参照のこと、これらは、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒト抗体はまた、遺伝子導入マウスを用いて作製出来、これらは機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができる。例えば、国際特許公開第９８／２４８９３号、国際特許公開第９２／０１０４７号、国際特許公開第９６／３４０９６号、国際特許公開第９６／３３７３５号、米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、第５，８８５，７９３号、第５，９１６，７７１号、及び第５，９３９，５９８号を参照のこと、これらは、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称する技術を用いて産生することが出来る。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、完全ヒト抗体の選択を誘導し、同じエピトープを認識する（Ｊｅｓｐｅｒｓら、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。

【0050】

いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は霊長類化抗体である。用語「霊長類化抗体」とは、サルの可変領域とヒト定常領域とを含む抗体を意味する。霊長類化した抗体を産生する方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６８１，７２２号及び第５，６９３，７８０号を参照のこと、これらは、各々その全体が参照により本明細書に組込まれる。

【0051】

いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、モノクローナル、好ましくはヒト又は、ヒト化抗体であり、少なくとも２種の異なる抗原に対し結合特異性を有する。本発明の方法で有用な二重特異性抗体において、結合特異性は、ＣＬＥＣ１０Ａ上の異なる２種の特異的エピトープに直接向かうことが出来、それによりＶＷＦの結合を単一特異性抗体よりも更に効果的に遮断することが出来る。

【0052】

いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は誘導体化された抗体である。例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンド又は、他のタンパク質への結合（抗体コンジュゲートの考察については以下を参照のこと）などにより修飾された誘導体化抗体が挙げられるが、これに限定する訳ではない。多数の化学修飾の何れも、既知の技術、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等により、実施することが出来るがこれに限定する訳ではない。更に、その誘導体は、１種又はそれ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。

【0053】

いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体又は、その断片は、その配列が対応する野生型配列と関連する少なくとも１種の定常領域媒介生物学的エフェクター機能を低下させるように修飾された抗体又は、抗体断片であり得る。抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体を、Ｆｃ受容体への結合の減少を示すように、修飾すると、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントはＦｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に必要な特定の領域で変異させることが出来る（例えばＣａｎｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；及びＬｕｎｄら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２参照のこと）。抗体のＦｃＲ結合能力の低下はまた、オプソニン作用及び貪食性及び抗原依存性細胞傷害作用のようなＦｃＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能を低下させ得る。

【0054】

更に別の態様では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体又は、その断片は、胎児性Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対するそれらの結合親和性を増加又は、減少させるように修飾した抗体又は、抗体断片でも良い。ＦｃＲｎへの結合親和性を変更するために、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントは、ＦｃＲｎとの相互作用に必要な特定の領域を突然変異させても良い（例えば、国際特許公開第２００５／１２３７８０号参照）。ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加すると、抗体の血清半減期が増加する筈であり、ＦｃＲｎに対する結合親和性が低減すると、逆に抗体の血清半減期が減少する筈である。特定の実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４及び４２８の少なくとも１種が未修飾抗体に存在するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換されたＩｇＧクラスである。ＩｇＧクラスの抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の抗体が含まれる。置換は単独の位置２５０、３１４、または４２８で、又はそれらの組合わせの何れかで、例えば、位置２５０と４２８とで、又は位置２５０と３１４とで、又は位置３１４と４２８とで、または位置２５０と３１４並びに４２８とを、好ましい組み合わせとして位置２５０および４２８とで行なう。各位置において、置換アミノ酸は、非修飾抗体のその位置に存在するものとは異なるどのようなアミノ酸残基でも良い。位置２５０について、置換アミノ酸残基は、スレオニン以外のどのようなアミノ酸残基でも良く、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、又は、チロシン等を含むが、これらに限定する訳ではない。位置３１４については、置換アミノ酸残基は、ロイシン以外のどのようなアミノ酸残基でも良く、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、又は、チロシン等を含むが、これらに限定する訳ではない。位置４２８では、置換アミノ酸残基は、メチオニン以外のどのようなアミノ酸残基でも良く、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、又は、チロシン等を含むが、これらに限定する訳ではない。適切なアミノ酸置換の特定の組み合わせは、国際特許公開第２００５／１２３７８０号の表１と同一であり、この表は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。Ｈｉｎｔｏｎら、米国特許第７，２１７，７９７号、第７，３６１，７４０号、第７，３６５，１６８号、及び第７，２１７，７９８号も参照のこと、これらも参照によりその全体が本明細書に組込まれる。

【0055】

更に他の態様では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、その超可変領域の１種又はそれ以上に挿入された１種又はそれ以上のアミノ酸を有し、これは例えば米国特許公開第２００７／０２８０９３１号に記載されている。

【0056】

抗体コンジュゲート
いくつかの実施形態において、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、抗体コンジュゲートであり、これは例えば、任意のタイプの分子を抗体へ共有結合することにより修飾し、ＣＬＥＣ１０Ａへの結合を共有結合が妨害しないようにしたものである。エフェクター部分を抗体に結合させる技術は、当該分野において周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒａｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、６２３−５３頁（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ｅｄｓ．，１９８７）、 Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３）。

【0057】

１つの実施例において、抗体又はその断片は、共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して、場合によりＮ末端又はＣ末端で、別のタンパク質（又は、その一部、好ましくはそのタンパク質の 少なくとも１０、２０又は５０個のアミノ酸部分）のアミノ酸配列と融合している。好ましくは、抗体又は、その断片は、抗体の定常領域のＮ末端で他のタンパク質に連結される。組換えＤＮＡ手順を使用して、例えば、国際特許公開第８６／０１５３３号、及び欧州特許第０３９２７４５号に記載されているように、そのような融合物を作製しても良い。別の実施例において、エフェクター分子はインビボで半減期を増加させ得る。この型の適切なエフェクター分子としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又は、国際特許公開第２００５／１１７９８４号、に記載されているようなアルブミン結合化合物が挙げられる。

【0058】

いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体をポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合させても良い。例えば、抗体が抗体断片である場合、ＰＥＧ部分は、抗体断片内に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は、末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又は、カルボキシル基を介して結合させても良い。このようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在するものでもよく、又は、組換えＤＮＡ法を用いて断片中に操作したものでも良い。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照のこと。複数の部位を用いて、２種またはそれ以上のＰＥＧ分子を結合させても良い。好ましくは、ＰＥＧ部分は、抗体断片内に位置する少なくとも１種のシステイン残基のチオール基を介して共有結合的に連結される。チオール基を結合箇所として使用する場合、適切に活性化されたエフェクター部分、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体のようなチオール選択性誘導体を使用しても良い。

【0059】

別の例において、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体コンジュゲートは、例えば欧州特許第０９４８５４４号に開示された方法に従ってＰＥＧ化された、すなわちそれにＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を共有結合させた修飾Ｆａｂ’断片である。Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ．）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）ポリ（エチレングリコール）化学及び生物学的応用、（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．１９９７）及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍ．Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ．Ｄｅｎｔ、編、Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８）。及びＣｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：５３１−５４５。も参照のこと。

【0060】

凝固障害の治療
本明細書に記載の抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、限定する訳ではないが、血友病及びフォンヴィレブランド病を含む凝固障害の治療に有用である。好ましくは、該疾患は、血友病Ａ又は、フォンヴィレブランド病である。

【0061】

用語「血友病Ａ」とは、機能性凝固ＦＶＩＩＩの欠損を意味し、通常遺伝性である。

【0062】

用語「フォンヴィレブランド病」（ＶＷＤ）とは、ＶＷＦの定性的又は、定量的欠損に関連する凝固異常を意味する。

【0063】

疾患の治療は、いずれかの臨床段階又は、症状において既に疾患の任意の形態を有すると診断された患者の治療を包含し、発症又は進展又は悪化、症状の憎悪又は疾患の徴候の遅延、及び／又は、疾患の重篤度を予防及び／又は、低減することを含む。

【0064】

抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体を投与する「被験者」又は、「患者」は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は、霊長類（例えば、サル又は、ヒト）等の哺乳類でも良い。好ましくは、患者はヒトである。特定の態様において、ヒトは小児患者である。他の態様において、ヒトは成人患者である。

【0065】

抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体、及び、場合により１種又は、それ以上の追加治療薬、例えば、以下に記載の第２の治療薬、を含む組成物を本明細書に記載する。組成物は、通常は、薬学的に許容される担体を含む無菌の医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）適切であれば任意の形態でも良い。

【0066】

抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、局所的又は、局部的等種々の経路により、患者に投与しても良い。与えられる如何なる場合でも投与のために最も適切な経路は、特定の抗体、被験者、及び疾患の性質及び重症度ならびに被験者の体調に依存する。通常は、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体を静脈内投与する。

【0067】

通常の実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、静脈内投与を可能にするのに十分な濃度０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇで医薬組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法における使用に適した抗体の濃度としては、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、又は、前記の何れかの値の間の範囲の濃度、例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、又は、１０ｍｇ／ｋｇ〜１８ｍｇ／ｋｇ．を含むが、これに限定する訳ではない。

【0068】

抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体の有効用量は、単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与又は、連続投与当たり約０．００１〜約７５０ｍｇ／ｋｇの範囲で良く、又は、（例えば、ボーラス）投与、複数回の投与又は、連続投与で、血清濃度０．０１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を達成することができ、又は、投与する対象の症状、投与経路及び対象の年齢、体重、及び状態に依存するがその中の任意の有効な範囲又は、値で良い。特定の実施形態では、各用量は、体重１キログラム当たり約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇ又は、体重キログラムあたり約３ｍｇ〜約３０ｍｇの範囲で良い。抗体は、水溶液として製剤化しても良い。

【0069】

医薬組成物は、用量当たり所定量の抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体を含有する単位用量形態で簡便に提供することができる。 その単位は、０．５ｍｇ〜５ｇであり、例えば、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１０００ｍｇ、又は、前記値の何れか２つの間の任意の範囲、例えば１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、２０ｍｇ〜５０ｍｇ、又は、３０ｍｇ〜３００ｍｇであるが、これに限定する訳ではない。薬学的に許容される担体は、例えば、治療される状態又は、投与経路に応じて多種多様な形態を採り得る。

【0070】

抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体を用いる有効投薬量、総用量数及び治療期間の決定は、当業者の能力の範囲内に十分納まり、標準的な用量増量試験を用いて決定しても良い。

【0071】

本明細書に記載した方法に適した抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体の治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は、水溶液として保存するために調製しても良く、所望の程度の純度を有する抗体を、当該分野で通常使用される任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は、安定剤（これら全てを本明細書で担体と称す）即ち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤、及びその他の種々の添加剤と混合する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（Ｏｓｏｌ、編．１９８０）を参照のこと。このような添加剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒でなければならない。

【0072】

緩衝剤は、生理学的条件を近似する範囲のｐＨを維持するのに役立つ。それらは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で提供し得る。適切な緩衝剤としては有機及び無機酸の両方、及びその塩であり、クエン酸塩緩衝液（例、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸塩緩衝液（例、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸塩緩衝剤（例、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物、フマル酸塩緩衝液（例、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物等）、グルコン酸塩緩衝液（例、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物等）、シュウ酸塩緩衝液（例、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物、等）、乳酸塩緩衝液（例、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物等）及び酢酸塩緩衝液（例、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物等）等を含む。更に、リン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液及びトリスなどのトリメチルアミン塩を使用しても良い。

【0073】

保存剤を、微生物の増殖を遅らせるために添加しても良く、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量を添加しても良い。適切な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハライド（例、塩化物、臭化物及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及び、メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールを挙げられる。時々は、「安定化剤」として知られる等張化剤を添加し、液体組成物の等張性を確実にしても良く、例えば、多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの３価又はそれ以上の糖アルコールを含んでも良い。安定剤は、広範囲のカテゴリーの賦形剤を意味し、機能的に、バルキング剤から治療剤を可溶化するか、又は、変質若しくは、容器壁への付着を防止するのに役立つ添加剤までの範囲を有し得る。通常の安定化剤としては、多価糖アルコール（上記に列挙）、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなどであり、イノシトールなどのシクリトールを含む、有機糖又は糖アルコーを挙げられ、ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー、硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム、低分子量ポリペプチド（例、１０又はそれ以下の残基を有するペプチド）、タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は、免疫グロブリンなど、親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなど、二糖類、例えばラクトース、マルトース、スクロース及び三糖類、例ラフィノースなど、；及び多糖類 例デキストランなどを挙げられる。安定化剤は、活性タンパク質１重量部当たり０．１〜１０，０００重量の範囲で存在することができる。

【0074】

非イオン性表面活性剤又は、界面活性剤（「湿潤剤」としても知られている）を添加して、治療剤の可溶化を補助するとともに、撹拌により誘発される凝集から治療用タンパク質を保護し、又、製剤がタンパク質の変質を引き起こすことなく、せん断面応力に曝されるのを可能にする。適切な非イオン性表面活性剤は、ポリソルベート（２０，８０等）、ポリオキサマー（１８４，１８８等）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０等）を含む。 非イオン性表面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲で、又は、約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。

【0075】

更に他の種々の賦形剤としては、バルキング剤（例えばデンプン）、キレート化剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒が挙げられる。

【0076】

本明細書の製剤は又、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体の他に第２の治療剤を含有しても良い。第２の治療薬として適切な例を以下に示す。

【0077】

投与スケジュールは、月に１度から毎日と、変動し得るが、疾患の型、疾患の重症度、及び抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体に対する患者の感受性を含む臨床的因子の数に依拠する。特定の実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体を、毎日、週に２回、週に３回、５日毎に、１０日毎に、２週間毎に、３週間毎に、４週間毎に、又は１ヶ月に１回、又は 前述の値のうちの任意の２つの値の間の任意の範囲、例えば、４週間から一月毎、１０日から２週間毎、又は、１週間に２〜３回などに投与する。

【0078】

投与される抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体の投与量は、特定の抗体、被験体、及び疾患の性質及び重症度、被験者の体調、治療計画（例えば、第２の治療剤を使用するかどうか）、及び選択された投与経路に従って変動し、適切な投薬量は、当業者により、直ちに決定され得る。

【0079】

抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体の個々の投薬量の最適な量及び間隔は、治療される状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、及び治療を受ける特定の被験者の年齢及び状態により決定され、しかも使用する適切な投薬量を最終的に医師が決定するものであることは当業者には認識されるであろう。この投薬量は、適切な回数繰り返しても良い。もし、副作用が発現する場合、投薬の量及び／又は頻度は、標準的臨床基準に従って、変更や低減しても良い。

【0080】

併用療法
好ましくは、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体を用いる治療を受けている患者は、又、従来の凝固障害の療法の治療も受ける。例えば、血友病に罹患している患者は、通常、血液凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子、ＶＷＦ又は、それらの組合わせを用いる治療も受けている。

【0081】

本明細書で使用する用語「フォンヴィレブランド因子」（ＶＷＦ）とは、天然に存在するＶＷＦを含むが、その変異体をも含み、例えば、断片、融合タンパク質又は、コンジュゲート、又は１種若しくはそれ以上の残基を挿入、欠失又は、置換した配列変異体であり、生物学的活性を保持している天然のＶＷＦである。 もし、ＶＷＦ変異体が野生型の少なくとも１種の生物学的活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％を保持しているならば、本発明の意味において生物学的活性が保持されていることになる。野生型ＶＷＦ及びその変異体の生物学的活性は、リストセチン補因子活性に関する方法（Ｆｅｄｅｒｉｃｉ ＡＢ ら、２００４．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８９：７７−８５）、血小板糖タンパク質複合体Ｉｂ−Ｖ−ＩＸのＧＰＩｂαへのＶＷＦの結合（Ｓｕｃｋｅｒ ら．２００６．Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．１２：３０５−３１０）、コラーゲン結合アッセイ（Ｋａｌｌａｓ ＆ Ｔａｌｐｓｅｐ．２００１．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ８０：４６６−４７１）、または第ＶＩＩＩ因子への結合を使用して、当業者により、決定することができる。

【0082】

用語「第ＶＩＩＩ因子」と「ＦＶＩＩＩ」とは、本明細書において同義語として使用する。「ＦＶＩＩＩ」は、ある個体から別の個体に存在して発生し得るＦＶＩＩＩの天然の対立遺伝子変異を含む。ＦＶＩＩＩは、周知の産生及び精製方法を用いて、血漿由来で又は、組換え的に産生しても良い。グリコシル化、チロシン硫酸化及び他の翻訳後修飾の程度及び位置は、選択された宿主細胞及びその増殖条件に依存して変化し得る。

【0083】

用語ＦＶＩＩＩには、ＦＶＩＩＩ類似体が含まれる。本明細書で使用する用語「ＦＶＩＩＩ類似体」とは、ＦＶＩＩＩの野生型アミノ酸配列（即ち、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ００４５１によって定義される配列）と比較して１種又はそれ以上のアミノ酸が置換又は、欠失しているＦＶＩＩＩ分子（完全長又は、Ｂ−領域切断／欠失、又は、単鎖ＦＶＩＩＩ）を、又は、Ｂ領域切断／欠失ＦＶＩＩＩ分子については、そのアミノ酸配列に対応する部分を意味する。ＦＶＩＩＩ類似体は天然では存在しないが、ヒトの操作によって得られる。

【0084】

本発明に従って使用する第ＶＩＩＩ因子分子は又、Ｂ領域切断／欠失ＦＶＩＩＩ分子であっても良く、ここで残された領域は、ＦＶＩＩＩ野生型アミノ酸配列のアミノ酸番号１−７４０及び１６４９−２３３２に示されるような配列に対応する。Ｂ−領域欠失ＦＶＩＩＩ分子の他の形態は、ａ３領域に部分的欠失を更に有し、単鎖ＦＶＩＩＩ分子をもたらす。

【0085】

これらのＦＶＩＩＩ分子は、形質転換された、好ましくは哺乳動物由来の宿主細胞内で組換えた分子であることになる。然しながら、Ｂ領域欠失ＦＶＩＩＩ（すなわち、３つのＡ領域、２つのＣ領域、及びａ１、ａ２及びａ３領域）内の残りの領域は、僅かに、例えば各々の野生型アミノ酸配列（アミノ酸１−７４０及び１６４９−２３３２）から約１％、２％、３％、４％又は、５％、異なり得る。

【0086】

本発明に従って使用されるＦＶＩＩＩ分子は、二本鎖ＦＶＩＩＩ分子又は、一本鎖ＦＶＩＩＩ分子であっても良い。本発明の組成物に含まれるＦＶＩＩＩ分子は又、生物学的に活性なＦＶＩＩＩの断片であっても良く、即ち、Ｂ領域以外の領域が欠失若しくは切断されてはいるが、欠失／切断された形態内でＦＶＩＩＩ分子は、血餅の形成を補助するその能力を保持している。ＦＶＩＩＩ活性は、当該分野で周知の技術を用いてインビトロで評価することが出来る。本発明によるＦＶＩＩＩ活性を決定するための好ましい試験は、発色基質アッセイ又は、１段階アッセイ（下記参照）である。アミノ酸の修飾（置換、欠失等）を残りの領域等の中に導入して、例えば、フォンヴィレブランド因子 （ｖＷＦ）、低密度リポタンパク質受容体の関連タンパク質（ＬＰＲ）、種々の受容体、他の凝固因子、細胞表面など種々の他の成分で、第ＶＩＩＩ因子の結合能力を修飾しても良く、又は、グリコシル化部位などを導入及び／又は、廃止しても良い。本発明の組成物における使用のためにＦＶＩＩＩ活性を消失させない他の変異体もまた、ＦＶＩＩＩ分子／類似体中で適応し得る。

【0087】

ＦＶＩＩＩ類似体は又、親ポリペプチドの１種若しくはそれ以上のアミノ酸残基が欠失し、又は、他のアミノ酸残基で置換したＦＶＩＩＩ分子を含み、及び／又は、追加的にアミノ酸残基が親ＦＶＩＩＩポリペプチドに付加されている。

【0088】

更に、第ＶＩＩＩ因子分子／類似体は、例えば、切断されたＢ−領域内に、及び／又は、分子（「ＦＶＩＩＩ誘導体」）の１種若しくはそれ以上の他の領域内に、他の修飾を含み得る。これらの他の修飾は、第ＶＩＩＩ因子分子にコンジュゲートした種々の分子の形態、例えば、高分子化合物、ペプチド化合物、脂肪酸由来化合物等でも良い。

【0089】

用語ＦＶＩＩＩは、グリコＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを含む。 本明細書の文脈上、用語「グリコＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ」とは、第ＶＩＩＩ因子分子（全長ＦＶＩＩＩ及びＢ領域切断／欠失ＦＶＩＩＩを含む）を指定することを意図しており、ここで、１種若しくはそれ以上のＰＥＧ基がポリペプチドの多糖類側鎖（グリカン）を介してＦＶＩＩＩポリペプチドに結合している。

【0090】

用語ＦＶＩＩＩは、保護基又は、半減期延長部位を有するＦＶＩＩＩ分子を含む。用語「保護基」／「半減期延長部部位」とは、本明細書では、１種若しくはそれ以上のアミノ酸サイト鎖官能基に結合した１種若しくはそれ以上の−ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨ２などの化学基、又は、１種若しくはそれ以上のＮ−及び／又は、Ｏ−グリカン構造を意味し、しかも、これらのタンパク質／ペプチドにコンジュゲートした場合、多数の治療タンパク質／ペプチドのインビボ循環半減期を延長し得るものを意味すると理解する。保護基／半減期延長部位の例としては、生体適合性脂肪酸及びその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、例えばヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリ（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）ｎ（ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ））、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサンポリマー（ＨＥＰ）、ホスホリルコリン系ポリマー（ＰＣポリマー）、Ｆｌｅｘｉｍｅｒ（登録商標）ポリマー（Ｍｅｒｓａｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製，ＭＡ，ＵＳＡ）、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、ＸＴＥＮ（登録商標）ポリマー（Ａｍｕｎｉｘ社製、ＣＡ、ＵＳＡ）、アルブミン結合ペプチド、フォンヴィレブランド 因子断片（ｖＷＦ断片）、カルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰペプチド、Ｐｒｏｌｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ＩＬ）、及びそれらの任意の組合わせ（例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、ＣＬ、ＡＢ Ｌｏｗｅ及びＮ．Ａｙｒｅｓ、Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ｉｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００２、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）。誘導体化の手法には重大な意味はなく、上記から解明することができる。

【0091】

本発明に従って使用し得るＦＶＩＩＩ分子としては、異種アミノ酸配列に融合したＦＶＩＩＩアミノ酸配列、好ましくは半減期延長アミノ酸配列を含む融合タンパク質が挙げられる。好ましい融合タンパク質としては、Ｆｃ融合タンパク質及びアルブミン融合タンパク質である。本明細書において、用語「Ｆｃ融合タンパク質」とは、任意の抗体アイソタイプに由来し得るＦｃ領域に融合したＦＶＩＩＩを包含した意味を有する。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ抗体の循環半減期が比較的長いため、好ましいことが多い。Ｆｃ領域を、更に修飾し、例えば結合を補完し及び／又は、特定のＦｃ受容体へ結合する等の、特定のエフェクター機能、を調節しても良い。ＦｃＲｎ受容体に結合する能力を有するＦｃ領域とＦＶＩＩＩとの融合は、一般に、野生型ＦＶＩＩＩ（ｗｔ ＦＶＩＩＩ）の半減期と比較して、融合タンパク質の循環半減期を延長させるであろう。本発明における使用のためのＦＶＩＩＩ分子は、ＦＶＩＩＩ類似体の誘導体、例えば、ＦＶＩＩＩ類似体の融合タンパク質、ＰＥＧ化又は、グリコＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ類似体又は、又は、ヘパロザンポリマーとコンジュゲートしたＦＶＩＩＩ類似体等でも良い。本明細書において、「アルブミン融合タンパク質」という用語は、アルブミンアミノ酸配列又は、その断片に、若しくはその誘導体に融合したＦＶＩＩＩを包含した意味を有する。異種アミノ酸配列を、ＦＶＩＩＩのＮ末端やＣ末端に融合しても良く、又、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列内部に挿入しても良い。異種アミノ酸配列は、国際特許公開第２００８／０７７６１６号に記載されている「半減期延長ポリペプチド」の何れでもよく、その開示は参照により本明細書に組込まれる。

【0092】

本発明の組成物で使用するためのＦＶＩＩＩ分子の例としては、例えば、国際特許公開第２０１０／０４５５６８号、国際特許公開第２００９／０６２１００号、国際特許公開第２０１０／０１４７０８号、国際特許公開第２００８／０８２６６９号、国際特許公開第２００７／１２６８０８、米国特許公開第２０１０／０１７３８３１号、米国特許公開第２０１０／０１７３８３０号、米国特許公開第２０１０／０１６８３９１号、米国特許公開第２０１０／０１１３３６５号、米国特許公開第２０１０／０１１３３６４号、国際特許公開第２００３／０３１４６４号、国際特許公開第２００９／１０８８０６号、国際特許公開第２０１０／１０２８８６号、国際特許公開第２０１０／１１５８６６号、国際特許公開第２０１１／１０１２４２号、国際特許公開第２０１１／１０１２８４号、国際特許公開第２０１１／１０１２７７号、国際特許公開第２０１１／１３１５１０号、国際特許公開第２０１２／００７３２４号、国際特許公開第２０１１／１０１２６７号、国際特許公開第２０１３／０８３８５８、及び国際特許公開第２００４／０６７５６６に記載されたＦＶＩＩＩ分子を含む。

【0093】

本発明の組成物に使用し得るＦＶＩＩＩ分子の例としては、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、Ｈｅｌｉｘａｔｅ（登録商標）、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）、Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）の活性成分ならびに国際特許公開第２００８／１３５５０１号、国際特許公開第２００９／００７４５１号に記載されたＦＶＩＩＩ分子、及び国際特許公開第２００４／０６７５６６号の「ｄＢＮ（６４−５３）」と命名した構築物を含む。

【0094】

本発明に従って使用される組成物中の第ＶＩＩＩ因子の濃度は、通常、１０〜１０，０００ＩＵ／ｍＬの範囲である。異なる実施形態において、本発明の組成物中のＦＶＩＩＩ分子の濃度は、１０〜８，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、１０〜５，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、２０〜３，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、５０〜１５００ＩＵ／ｍＬ、又は３，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、２，５００ＩＵ／ｍＬ、又は、２，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、１，５００ＩＵ／ｍＬ又は、１，２００ＩＵ／ｍＬ、又は、１，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、８００ＩＵ／ｍＬ、又は、６００ＩＵ／ｍＬ、又は、５００ＩＵ／ｍＬ、又は、４００ＩＵ／ｍＬ、又は、３００ＩＵ／ｍＬ、又は、２５０ＩＵ／ｍＬ、又は、２００ＩＵ／ｍＬ、又は、１５０ＩＵ／ｍＬ、又は、１００ＩＵ／ｍＬである。

【0095】

「国際単位」又は、「ＩＵ」は、ＦＶＩＩＩ活性アッセイ、例えば、一次段階凝固アッセイ又は、発色基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイ等により測定されるＦＶＩＩＩの血液凝固活性（効力）の測定単位であり、「ＩＵ」で較正した国際標準製剤に対する標準の較正を用いる。Ｎ Ｌｅｅ、Ｍａｒｔｉｎ Ｌら、Ａｎ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｎ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙｓ ｏｆ ＦＶＩＩＩ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ 社）３０，５１１，５１９（１９８３年）に記載されているような、一段階凝固アッセイ法が当該技術分野に知られている。一段階アッセイの原理。この試験は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイの改良版として実施される。血漿とリン脂質及び表面活性化剤とのインキュベーションにより、内因性凝固系の因子が活性化する。カルシウムイオンの添加が、凝固カスケードのトリガーとなる。測定可能なフィブリン血餅の形成までの時間を測定する。アッセイは、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の存在下で実施される。その欠損血漿の凝固能力は、試験される試料に含まれる凝固因子ＶＩＩＩによって回復される。凝固時間の短縮は、試料中に存在する第ＶＩＩＩ因子の量に比例する。凝固第ＶＩＩＩ因子の活性は、活性既知の標準的な第ＶＩＩＩ因子の製剤の国際単位と直接比較することによって定量化される。

【0096】

別の標準的なアッセイは、発色基質アッセイである。発色基質アッセイは、ｃｏａｍａｔｉｃ ＦＶＩＩＩ試験キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｐＡ Ｖ．ｌｅ Ｍｏｎｚａ ３３８−２０１２８ Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）などの市販品を購入しても良い。発色アッセイの原理。カルシウム及びリン脂質の存在下で、第ＩＸａ因子により、第Ｘ因子が第Ｘａ因子に活性化される。この反応は補因子としての第ＶＩＩＩａ因子によって刺激される。ＦＶＩＩＩａは、測定すべき試料中のＦＶＩＩＩ由来の反応混合物中の少量のトロンビンにより形成される。最適濃度のＣａ²⁺、リン脂質及び第ＩＸａ因子及び過剰量の第Ｘ因子を使用する場合、第Ｘ因子の活性化は第ＶＩＩＩ因子の効力に比例する。活性化した第Ｘ因子は発色基質Ｓ−２７６５から発色団ｐＮＡを放出する。従って、４０５ｎｍで測定するｐＮＡの放出は、形成したＦＸａの量に比例し、従って、サンプルの第ＶＩＩＩ因子活性にも比例する。

【0097】

一実施形態では、治療は、本発明の抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体と第ＶＩＩＩ因子とを、血友病、好ましくは血友病Ａに罹患している患者に投与することを含む。

【0098】

他の実施形態では、治療は、本発明の抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体とＶＷＦとを、血友病、好ましくは血友病Ａに罹患している患者に投与することを含む。

【0099】

別の実施形態において、治療は、本発明の抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体と第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとを、血友病、好ましくは血友病Ａに罹患している患者に投与することを含む。

【0100】

別の実施形態において、治療は、本発明の抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体とＶＷＦとをフォンヴィレブランド病に罹患している患者に投与することを含む。

【0101】

特定の実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体と血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、ＶＷＦ又は、それらの組合わせ）とを同時に投与する。別の実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体と血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、ＶＷＦ又は、それらの組合わせ）とを別々に投与する。抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体と血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、ＶＷＦ又は、それらの組合わせ）との投与の間の時間は、特に制限はない。血液凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子、ＶＷＦ又は、それらの組合わせ）を抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体の前に投与することが好ましい。

【0102】

本発明の別の態様は、（ｉ）上記で定義した第１の化合物（好ましくは抗体）と（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子及びそれらの組合わせからなる群から選択されたポリペプチドとを含む医薬キットである。好ましくは、化合物（好ましくは抗体）及びポリペプチドは別々の組成物中に含まれる。

【0103】

本発明の別の態様は、（ｉ）本明細書中上記で定義した第１の化合物（好ましくは抗体）及び（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子、フォンヴィレブランド因子及びそれらの組合せからなる群から選択されたポリペプチドを含み、血液凝固障害の治療において、同時に、別々に、又は、逐次に使用するための医薬キットである。

【0104】

本発明の別の態様は、フォンヴィレブランド因子の半減期を増加させるか又は、クリアランスを減少させるための、上記に定義した化合物（好ましくは抗体）の使用である。

【0105】

用語「半減期」とは、インビボでの血行からタンパク質の半分を除去するのに要する時間を意味する。曲線下面積（ＡＵＣ）を決定して、クリアランス効果を評価できる。クリアランスを低減すると、ＡＵＣ値がより高くなり、かつ半減期の延長をもたらす。

【0106】

本発明の更に別の態様は、第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加するための、上記に定義した化合物（好ましくは抗体）の使用である。

【0107】

本発明の更に別の態様は、治療処置におけるフォンヴィレブランド因子の半減期を延長するために使用する上記で定義した化合物（好ましくは抗体）である。

【0108】

本発明は更に、本明細書中、上記で定義した化合物（好ましくは抗体）の有効量を被験者に投与することを含む、インビボでのフォンヴィレブランド因子の半減期を増加するか又は、クリアランスを低減する方法に関する。

【0109】

本発明のさらなる態様は、本明細書中、上記で定義した化合物（好ましくは抗体）の有効量をそれを必要とする患者に、投与することを含む血液凝固障害を治療する方法である。

【0110】

更なる態様は、血友病Ａの治療におけるＦＶＩＩＩの投与の頻度を低減するための、上記で定義した化合物（好ましくは抗体）の使用である。ＦＶＩＩＩの静脈内又は、皮下投与の頻度は、週に２回に低減し得る。或いは、ＦＶＩＩＩの静脈内又は、皮下投与の頻度を１週間に１回に低減し得る。

【0111】

更なる態様は、ＶＷＤの治療におけるＶＷＦの投与の頻度を低減するための、上記で定義した化合物（好ましくは抗体）の使用である。ＶＷＦの静脈内又は、皮下投与の頻度は、週に２回に低減し得る。或いは、ＶＷＦの静脈内又は、皮下投与の頻度は、週に１回に低減し得る。

【0112】

別の態様は、血友病Ａの治療において投与されるＦＶＩＩＩの用量を低減するための、上記で定義した化合物（好ましくは抗体）の使用である。

【0113】

別の態様は、ＶＷＤの治療において投与されるＶＷＦの用量を低減するための、上記で定義した化合物（好ましくは抗体）の使用である。

【0114】

本明細書で使用する用語「ＡＢＯ（Ｈ）血液型抗原」とは、抗Ａ抗体又は、抗Ｂ抗体により、一般に認識される、赤血球上に存在する炭水化物抗原を意味する。ＡＢＯ（Ｈ）血液型システム（ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ｓｙｓｔｅｍ）は、ヒトの輸血における最も重要な血液型システム（ｂｌｏｏｄ ｔｙｐｅ ｓｙｓｔｅｍ）である。 Ｈ抗原は、ＡＢＯ（Ｈ）血液型抗原の必須前駆体であり、主にタンパク質に結合した炭水化物構造であり、セラミドに結合した少量画分を有する。これは、β−Ｄ−ガラクトース、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、β−Ｄ−ガラクトース及び２結合型α−Ｌ−フコースの鎖からなる。Ａ抗原は、Ｈ抗原の末端のＤ−ガラクトース残基に結合したα−Ｎ−アセチルガラクトサミンを含み、Ｂ抗原はＨ抗原のＤ−ガラクトースに結合したα−Ｄ−ガラクトース残基を有する。従って、ＡＢＯ（Ｈ）血液型システムの末端糖残基はガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びフコースである。

【実施例】

【0115】

実施例１ ヒトＶＷＦ単量体と組換えヒトＣＬＥＣ１０Ａとの相互作用
材料と方法
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を適用して、精製したヒトＶＷＦ単量体（検体）とＣＬＥＣ１０Ａ（リガンド）等の受容体タンパク質とのリアルタイム生体分子相互作用のメカニズムを評価した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００のようなＳＰＲベースの機器は、光学的方法を使用して、リガンドが固定されている金属センサ表面の裏面に近い屈折率の変化をモニターする。分析物は、移動相内にあり、固定されたリガンド上を連続的に通過する。リガンドが分析物を捕捉するという事象により、表面上に分析物が蓄積することになり、その結果、屈折率が増加し、これを、反射光の強度の変化を検出することによるＳＰＲ応答として、リアルタイムで測定した。ＳＰＲ信号はＲＵで表現し、経時的な信号の変化をセンサーグラムとして表示した。基準フローセルからのバックグラウンド応答値は、実験応答値から差し引いた。ＳＰＲシグナルの変化の大きさは、固定化又は、捕捉された質量に正比例し、しかも、結合定数のアッセイ及び結合現象の動力学的解析をリアルタイムで、及び標識を付けない環境で可能である（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２００８； Ｓｃｈａｓｆｏｏｒｔ＆ Ｔｕｄｏｓ、２００８； Ｂｉａｃｏｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２０１２）。

【0116】

相互作用の試験をＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＣａＣｌ₂ ５ｍＭ及びＴｗｅｅｎ−２０．０５％（ｗ／ｖ）を含むランニング緩衝液、これは試料希釈緩衝液としても使用、をｐＨ７．４で適用することにより、フローセル温度＋ ２５℃で実施した。使用したタンパク質は、適用前にＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によってランニング緩衝液に移動した。試薬及び緩衝ストック溶液は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入し、使用前に緩衝溶液を滅菌濾過した（０．２２μｍＳｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニット、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）。ＣＬＥＣ１０Ａの細胞外領域は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。更に、ヒトアルブミン（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ社、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を対照タンパク質として使用した。 ＣＬＥＣ１０Ａを、製造者の指示書に従って前処理（カルボキシメチル化して平坦に）したＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｃ１で捕捉した。ＣＬＥＣ１０Ａの調査は、予濃縮工程より開始し、所望レベルの固定化を得るために、並びに、固定化のための最適なｐＨ値を決定するために、必要なタンパク質の量を推定した。固定化を効率的にするために、固定化緩衝液のｐＨ値をリガンドの等電点より低くしなければならない。従って、ｐＨ探査のために、ＣＬＥＣ１０Ａを先ず注射用水（ＷＦＩ）中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、更にｐＨ４．０、４．５、５．０及び５．５の酢酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭで各々１：５０に希釈した。この方法は、接触時間１８０秒、及び流速５μＬ／分を適用することにより、Ｂｉａｃｏｒｅ機器制御ソフトウェア内の固定化ｐＨ探査ウィザードに従って実施した。分析後、共有結合による固定化を開始する前に表面をＮａＯＨ５０ｍＭで再生した。

【0117】

固定化の目的のために、溶解したＣＬＥＣ１０Ａを最適ｐＨ値（ｐＨ５．０）の酢酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭで濃度２０μｇ／ｍＬに希釈した。製造業者の実験計画書に従ってアミンカップリングキットを適用することによって、リガンドを遊離アミン基を介してカルボキシメチル化デキストランマトリックスに、共有結合的に固定した。ＥＤＣ０．０５ＭとＮＨＳ０．２Ｍとの１：１混合物が活性化した後、チップ表面上に存在するリガンドの第一級アミン基と遊離カルボン酸基との間で７分間結合させる。固定化は流速１０μＬ／分、２５℃で実施した。最終的表面密度は範囲７００〜１，５００ＲＵを目標とした。更に、タンパク質を固定化していないブランクフローセルを、バルク移動及び非特異的結合の変化のためのチップ上の参照表面として含めた。リガンドを固定化した後、両チップ表面を１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で７分間遮断し、次いで、固定化プロセスの間に潜在的に形成される非共有結合、非特異的相互作用を１０ｍＭ ＮａＯＨで１０秒間、３回、流速２５μＬ／分で洗浄することにより除去した。ＳＰＲベースラインは、それぞれの場合にランニング緩衝液を用いる始動サイクルを５回実施することによって調整した。

【0118】

濃度が増加するＶＷＦ単量体を、ランニング緩衝液中で連続２倍希釈系列として調製し、チップ表面に２５μＬ／分で逐次注入し、タンパク質−リガンド相互作用の特性を調べた。ＶＷＦ単量体の濃度は４，０００〜３１．２５ｎＭの範囲であり、ＶＷＦ単量体の分子量（ＭＷ）を基に計算した。緩衝液組成の変化に対してＳＰＲシステムは高い感度を有するため、全ての試料は類似した緩衝液組成物を含むように設計した。比較的高い流速を選択し、物質移動の制限に起因する再結合の可能性を避けた。相互作用解析サイクルは、５分間の試料注入段階からなるようにした。この会合段階において、ＶＷＦがＣＬＥＣ１０Ａに結合し、表面上に固定化し、表面質量が増加した。この段階の後、ランニング緩衝液中での１７分間の解離段階となる。解離段階においては、試料はランニング緩衝液で置換され、解離したＶＷＦが表面から除去され、結果的に表面質量が減少する。試験では、全ての試料を繰返し測定した。チップ表面と対照表面の両方は、表面上に固定されたＣＬＥＣ１０Ａから、結合したＶＷＦを除去するために、ＮａＯＨ１０ｍＭの１０秒パルスで再生するが、これは、それぞれの実行の間に、即ち、最後の２分間洗浄ステップをランニング緩衝液で開始する前に、３回繰り返す一つのステップと次の実行との間に実施する。動的データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアＶｅｒ．１．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて分析したが、データセットは情報目的にのみ使用した。

【0119】

ＳＰＲは主に質量検出器として使用した。ＶＷＦとＣＬＥＣ１０Ａとの相互作用は、蓄積した質量の増加により検出し、特異的結合は、対照表面から記録された結合応答を差し引き、続いてブランクとして注入した緩衝液の平均を差し引くことによって同定した。試料注入の終了後２０秒に時点を置き、着目する安定なタンパク質−リガンド相互作用の代表として評価した。従って、この点を、ＶＷＦとＣＬＥＣ１０Ａとの間の生体分子相互作用の評価及び計算に使用した。更に、試験は少なくとも二重に実施し、応答を各々の場合の基準値に対して相対的に計算した。ＶＷＦ−ＣＬＥＣ１０Ａ相互作用の一般的評価の外に、ＣＬＥＣ１０Ａの５０％を占める全ＶＷＦ濃度の応答を表す親和定数（Ｒ５０％）を決定した。親和定数は、定義された報告点を適用することにより結合親和性の推定に使用し、ソフトウェアによって予め設定された定常状態親和性適合を用いて球状の非線形曲線適合から誘導する。更に、解離速度定数（解離速度）は、解離相のみを適合させることにより計算した。適切な解離モデルは確立されており（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅｓ、２００８）、以前に定義した報告ポイントを計算に使用した。

【0120】

結果
ＳＰＲにより特性が明らかにされたＣＬＥＣ１０Ａについて、図１に示すように、ＶＷＦは用量に依存する強い結合を示した。

【0121】

実施例２ ヒトＶＷＦ単量体と組換えヒトＣＬＥＣ１０Ａ及びＣＬＥＣ１０Ａオルソログマウスタンパク質（ＭＧＬ１及びＭＧＬ２）の両者との相互作用
材料と方法
ＣＬＥＣ１０Ａ、ＭＧＬ１及びＭＧＬ２を、実施例１に各々記載したように、シリーズＳセンサーチップＣＭ３上（固定化のためのｐＨ値：ＣＬＥＣ１０Ａ及びＭＧＬ１の両方についてｐＨ５．０、ＭＧＬ２についてｐＨ５．５）に固定化した。受容体タンパク質の固定化はアミンカップリングにより、実施したが、表面密度は６，０００（±５００）ＲＵを目標とした。試験は実施例１に記載したように実施した。

【0122】

結果
結合相互作用をＳＰＲ分析により調査した。表１並びに図２及び３の結果では、精製したヒトＶＷＦ単量体が、ヒトＣＬＥＣ１０Ａ及びマウス受容体の両方のタンパク質にインビトロで用量依存的に結合することを明確に実証した。一般に、３種の受容体タンパク質全てついて類似した結合特性が観察された。

【0123】

ＶＷＦの受容体結合についての親和定数（Ｒ５０％）を推定した。更に、解離速度定数（解離速度）は、解離相のみを適合させることにより計算した。安定なタンパク質−リガンド相互作用を代表する結合応答（サンプル注入の終了後２０秒）を計算に使用した。マウス受容体タンパク質ＭＧＬ１及びＭＧＬ２に対するヒトＶＷＦ単量体は、ヒトＣＬＥＣ１０Ａに対するＶＷＦ結合と比較して、親和性がより低いことが推定された。

【0124】

【表1】

【0125】

実施例３ 中和抗ＭＧＬ１／２抗体の存在下でのＭＧＬ２へのＶＷＦ結合の阻害
材料と方法
ＶＷＦ結合に及ぼすポリクローナルヤギ抗ＭＧＬ１／２抗体（Ｐｒｏｄ．Ｎｏ．ＡＦ４２９７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の阻害効果をＳＰＲ分析により調査した。凍結乾燥した抗体をランニング緩衝液中に２００μｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ｍＧＬ１及びＭＧＬ２を、各々シリーズＳ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ３上に固定した。受容体タンパク質の固定化は、前述のようにアミンカップリングにより実施した。表面密度６，０００（±５００）ＲＵを目標とした。ランニング緩衝液及び抗ＭＧＬ１／２抗体を各々１２分間注入し、続いて５分間、ＶＷＦ単量体（２μＭ）を重複して注入し、８分間の最終解離相を注入した。ＳＰＲ分析は＋ ２５℃で２０μＬ／分の流速で行った。

【0126】

結果
例えば（図４参照）、中和抗ＭＧＬ１／２は、固定化されたＭＧＬ２（図４Ａ及び４Ｂ参照）との強い結合を示し、その結果質量が増加した。分析物として使用したＶＷＦが、固定化した受容体タンパク質に結合しなかったのは、中和抗体が受容体の各々の結合領域を遮断するためである。 その結果、ＶＷＦ結合を検出出来なかった。 対照的に、ＶＷＦは、ランニング緩衝液（図４Ａ及び４Ｃを参照）を用いた対照試料によって実証するように、中和抗体の非存在下で固定化ＭＧＬ２に強く結合した。

【0127】

結論として、ポリクローナル抗体の受容体遮断効果は、ＳＰＲ分析により、明確に確認された。結果として、ＳＰＲによる分析は、抗体が、固定化されたＭＧＬ１及びＭＧＬ２の各々とＶＷＦとの相互作用を完全に遮断することを示した。結果として、両方の抗体が、ＭＧＬ１及びＭＧＬ２を特異的にブロックするために適用可能であることを定性的に評価した。

【0128】

実施例４ 阻害抗体を使用し、インビボでのヒトＣＬＥＣ１０Ａのマウスオルソログ受容体タンパク質を特異的に遮断し、マウスにおけるインビボでのＶＷＦのクリアランスを低減した。
２種のＣＬＥＣ１０Ａオルソログ受容体タンパク質ＭＧＬ１及びＭＧＬ２はマウス中に存在する。 ポリクローナルヤギ抗ＭＧＬ１／２抗体（Ｐｒｏｄ。Ｎｏ．ＡＦ４２９７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をインビボでの受容体遮断に適用した。更に、プールした正常ヤギ血清から精製した非特異的抗体（Ｐｒｏｄ。Ｎｏ．Ｉ５２５６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を対照治療として使用した。

【0129】

ＶＷＦ欠損マウスに、体重１ｋｇあたり８ｍｇの特異的阻害抗体を静脈内に投与し、インビボでのＶＷＦクリアランスに及ぼすＭＧＬ１及びＭＧＬ２受容体の効果を研究した。前もって、凍結乾燥した抗体を等張性ＮａＣｌ溶液（適用量５ｍＬ／ｋｇｂ．ｗ．）に溶解した。 非特異的抗体を対照治療として使用した。１０分後、マウスに単回の静脈内注射（適用量５ｍＬ／ｋｇｂ．ｗ．）としてヒトｐｄＶＷＦ（２００ＩＵ／ｇｂ．ｗ．）を投与した。試験計画は各２匹のマウスからなる２つの群を含む。ＶＷＦの投与後に血液試料を採取した（１群、５分及び１２０分に採取。２群、６０分及び２４０分に採取）、試料を血漿試料に処理し、次いでＶＷＦ：Ａｇ ＥＬＩＳＡで分析した。得られたデータを図５に示す。統計的分析の概要を表２に示した。

【0130】

ＰＫデータの分析により、ＶＷＦ欠損マウスの抗ＭＧＬ１／２抗体治療は、対照抗体を投与した群と比較した場合、ヒトＶＷＦのクリアランスに阻害効果を及ぼすことを示した。阻害性抗ＭＧＬ１／２抗体の存在下では、ＡＵＣは対照治療と比較して約１．７倍高く、かつＶＷＦの血漿クリアランス速度は約１．７倍低かった。結論として、ＭＧＬ１及びＭＧＬ２は、インビボでのＶＷＦクリアランスにおいて重要な効果を果たし、しかもＶＷＦの取り込みの必須介在物である可能性があることを見出した。

【0131】

要約すると、ＶＷＦクリアランスにおける各々の受容体タンパク質の関与を更に評価するため、阻害抗体を使用して、インビボにおけるヒトＣＬＥＣ１０Ａのマウスオルソログ受容体タンパク質の炭水化物認識領域を特異的に遮断した。ＰＫデータの分析により、ＶＷＦ欠損マウスの抗ＭＧＬ１／２抗体治療は、非特異的対照抗体を投与した群と比較した場合、ヒトＶＷＦのクリアランスに阻害効果を及ぼすことを示した。ＭＧＬ１／ＭＧＬ２に向けられた抗体は、ヒトＶＷＦの分解を顕著な程度で阻害し、ＭＧＬ１／ＭＧＬ２がＶＷＦの結合に寄与し、しかもその特異的受容体遮断がｉｎ ｖｉｖｏでのＶＷＦの取込みを妨害することを示した。これらのデータは、ＶＷＦが受容体媒介機構を介して細胞内に取り込まれたの英語細胞内に取り込まれ、ＶＷＦの取込みにおけるヒトＣＬＥＣ１０Ａの関与を確証することを示唆している。

【0132】

【表2】

【0133】

実施例５ ヒトＣＬＥＣ１０Ａに対する遮断抗体の産生
当業者にとって、ヒト組換え又は膜関連ＣＬＥＣ１０Ａに対する遮断抗体の発見に使用し得る抗体生成方法は数多く存在する。この実施例では、抗体産生と予備的機能性スクリーニングのために、組換えＣＬＥＣ１０Ａを用いる抗体ファージディスプレイ技術を使用した。抗体遮断活性の確認は、細胞ベースの内部移行アッセイ又は、適切なモデルにおけるインビボでの薬物動態学的研究を用いて行った。

【0134】

以前に記載した方法（国際特許公開第２０１３／０１４０９２号）を用いて、ビオチン化ヒトＣＬＥＣ１０Ａに対してスクリーニングするために、ヒトＦａｂベースのファージディスプレイライブラリー（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用した。３回のパニングの後、各回のパニングから複数の個々のファージクローンを選択し、Ｆａｂ−ファージＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＬＥＣ１０Ａへの特異的結合をスクリーニングする。任意のＣＬＥＣ１０Ａ特異的ファージクローンについて、Ｆａｂ領域をＰＣＲを用いて増幅し、可変領域配列（重鎖及び軽鎖）をヌクレオチド配列決定により決定する。更に機能的評価のために、ＣＬＥＣ１０Ａ特異的Ｆａｂ抗体を無処置のヒトＩｇＧ４抗体に再設計し、以前に記載されているように（国際特許公開第２０１３／０１４０９２号）哺乳動物発現系を用いて発現させる。ＣＬＥＣ１０Ａに対するこれらＩｇＧ抗体の特異的結合は、ＥＬＩＳＡによって確認した。ヒトＣＬＥＣ１０Ａに対する結合特異性を有する独特なＩｇＧ抗体のパネルを同定した。

【0135】

機能遮断活性のためのＣＬＥＣ１０Ａ特異的抗体のスクリーニング
ＣＬＥＣ１０Ａ特異的ＩｇＧ抗体の機能遮断活性を、ビオチン化βＧａｌＮＡｃＰＡＡ又は、ｖＷＦのＣＬＥＣ１０Ａへの結合を阻害する能力により、ＥＬＩＳＡで評価した。次いで、このアッセイで遮断活性を示す抗体を、フローサイトメトリーを用いて活性化マクロファージによるフルオロフォアでコンジュゲートしたＶＷＦの内在化を調節する能力についてさらに特徴付けする。この実施例から同定された機能遮断抗体は何れも本質的に完全この実施例から同定された機能遮断抗体は何れも本質的に完全なヒトであるので、それらはヒトにおける治療への使用に容易に受け入れられる。この実施例から同定された機能遮断抗体は何れも本質的に完全なヒトであるので、それらはヒトにおける治療への使用に容易に受け入れられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]