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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6704617
(24)【登録日】2020年5月15日
(45)【発行日】2020年6月3日
(54)【発明の名称】小型肝細胞の継代培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20200525BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
【請求項の数】4
【全頁数】13
(21)【出願番号】特願2016-16210(P2016-16210)
(22)【出願日】2016年1月29日
(65)【公開番号】特開2017-131194(P2017-131194A)
(43)【公開日】2017年8月3日
【審査請求日】2019年1月25日
(73)【特許権者】
【識別番号】307014555
【氏名又は名称】北海道公立大学法人 札幌医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002480
【氏名又は名称】特許業務法人ＩＰアシスト特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100113332
【弁理士】
【氏名又は名称】一入 章夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160037
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 真紀
(72)【発明者】
【氏名】三高 俊広
(72)【発明者】
【氏名】石井 雅之
(72)【発明者】
【氏名】市戸 義久
(72)【発明者】
【氏名】谷水 直樹
(72)【発明者】
【氏名】水口 徹
(72)【発明者】
【氏名】平田 公一
【審査官】
飯室 里美
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第０２／０８８３３２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開平０９−３１３１７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平０８−１１２０９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平１０−１７９１４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１４／１６８１５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００９−５２０４７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００６／００１４７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００４−５１０４３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００６／００１４７３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＥＨＳゲル、ラミニン１１１、ラミニン３３２及び／又はニドゲンをその表面に有する担体上で小型肝細胞を培養する培養工程を含む、小型肝細胞の継代培養方法。
【請求項2】
前記培養工程の前に、小型肝細胞を含む細胞集団からＣＤ４４陽性細胞又はＩＣＡＭ−１陽性細胞を分離し収集することで小型肝細胞を取得する細胞分離工程をさらに含む、請求項１に記載の培養方法。
【請求項3】
前記細胞分離工程の前に、ヒアルロン酸をその表面に有する担体上で小型肝細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の培養方法。
【請求項4】
継代が１〜８回行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、小型肝細胞の継代培養方法に関する。
【背景技術】
【0002】
肝臓は糖やアミノ酸等の代謝、血清タンパク質産生、薬物代謝、胆汁産生など、生体内で様々な役割を果たしており、これらの多くは肝細胞の機能に依存している。したがって、肝細胞をその生体内での機能を維持した状態で学術研究や創薬における薬理試験等の試験研究目的で使用することが強く望まれている。
【0003】
このため、肝臓から成熟肝細胞を分離培養し、その機能を維持したまま増殖させる試みがなされている。しかし、機能を維持した成熟肝細胞を長期にわたって安定的に増殖させる方法は未だ確立していない。近年、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から肝細胞へと分化誘導させる方法も新たに提唱されているが、多くの研究者が日夜努力しているにも拘わらず、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導された肝細胞の利用は未だ実用化されていない。
【0004】
また、正常な肝臓は高い組織再生能を有しており、その一部が切除されても比較的速やかに復元する性質を有している。しかし、肝炎、肝硬変、肝癌などが進行して肝機能不全状態になると、正常な肝臓に復元することはもはや困難となる。
【0005】
かかる肝機能不全患者に対する治療法の選択肢として、肝臓移植が挙げられる。しかし、肝臓移植は、移植を必要とする患者に対するドナー数が常に不足していること、また成熟肝細胞は凍結解凍することでその機能が低下してしまうためにドナーから提供された肝臓を凍結保存することができないこと、などの問題を有する。そのため、他者からの臓器提供に頼らない、新たな臓器移植方法が模索されている。その最も基本的な試みは、肝細胞を培養増殖させて肝組織を再生させ、患者に移植するというものであるが、やはり機能を維持した肝細胞を増殖させることの困難性が研究開発の障壁となっている。
【0006】
本発明者らは、肝臓組織内に、アルブミン、トランスフェリン、サイトケラチン（ＣＫ）８、ＣＫ１８などのマーカーについて成熟肝細胞とほぼ同様の表現型を示し、超微構造的にも肝細胞としての特徴を有するが、増殖能を有する小型肝細胞（Ｓｍａｌｌ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）が存在することを示した（非特許文献１、非特許文献２）。小型肝細胞はＣＤ４４陽性、増殖能、及び成熟肝細胞では困難であった凍結保存が可能であることなどの特徴を有している。特に凍結保存が可能という特徴は、必要なときに凍結保存した小型肝細胞を融解し、コロニーを形成するまで培養してから成熟化させて使用することを可能とする、という利点をもたらす。
【0007】
本発明者らは、小型肝細胞を肝組織から調製、培養する方法（特許文献１）、小型肝細胞のコロニーから肝組織を誘導する方法（特許文献２）、効率的な小型肝細胞の分離方法及び培養方法（特許文献３）などを提供し、小型肝細胞の利用の促進を試みてきた。しかし、小型肝細胞は、増殖能は有するものの、その機能を維持したまま継代培養することが困難であるという問題を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第０１／０９２４８１号パンフレット
【特許文献2】国際公開第０２／０８８３３２号パンフレット
【特許文献3】国際公開第２００６／００１４７３号パンフレット
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｍｉｔａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１６，４４０−４４７（１９９２）
【非特許文献2】Ｍｉｔａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２９，１１１−１３５（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、機能を保持したまま小型肝細胞の継代を可能にする培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウスサルコーマ細胞が産生するＥＨＳゲルを表面に付着させた担体上で小型肝細胞を培養することで、小型肝細胞の継代培養が可能となることを見いだし、下記の各発明を完成させた。
【0012】
（１）ＥＨＳゲル、ラミニン１１１、ラミニン３３２及び／又はニドゲンをその表面に有する担体上で小型肝細胞を培養する培養工程を含む、小型肝細胞の継代培養方法。（２）前記培養工程の前に、小型肝細胞を含む細胞集団からＣＤ４４陽性細胞又はＩＣＡＭ−１陽性細胞を分離し収集することで小型肝細胞を取得する細胞分離工程をさらに含む、（１）に記載の培養方法。
（３）前記細胞分離工程の前に、ヒアルロン酸をその表面に有する担体上で小型肝細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含む、（１）又は（２）に記載の培養方法。
（４）継代が１〜８回行われる、（１）〜（３）のいずれかに記載の培養方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、小型肝細胞を、その機能を維持したまま継代培養することができ、小型肝細胞の細胞数を多く確保することができる。本発明によれば、肝細胞の生化学的研究、肝細胞を利用した薬物の開発等に対して有益な小型肝細胞を安定的かつ多量に提供することが可能となる。また、小型肝細胞は肝機能不全患者に対する治療法の選択肢である肝臓移植用の臓器の作製に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】培養７〜３５日目における２代目の同一小型肝細胞コロニーの位相差顕微鏡写真である。
【図2】培養２８日目における２〜５代目の小型肝細胞コロニーの位相差顕微鏡写真である。
【図3】２〜５代目の小型肝細胞のコロニーあたりの細胞数を示すグラフである。横軸は世代毎の培養日数、縦軸は観察されたコロニーを構成する細胞数／コロニー（ｎ＝３）を表す。グラフ中の各プロットは個々のコロニーの細胞数を示す。
【図4】２〜５代目の小型肝細胞の細胞分裂回数を示すグラフである。横軸は培養日数、縦軸は細胞分裂回数を表す。
【図5】２〜５代目の小型肝細胞の培養１日目における生着率（左）及び各世代の培養２８日目における細胞増殖率（右）を示すグラフである。
【図6】３代目及び４代目の小型肝細胞における各種マーカーのタンパク質発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図7】２〜５代目の小型肝細胞におけるＣＤ４４、Ａｌｂ、ＣＫ１９、Ｃ／ＥＢＰα及びＨＮＦ４αの遺伝子発現量を示すグラフである。縦軸はＧＡＰＤＨに対する相対的発現量を表す。
【図8】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）重層による３代目の小型肝細胞の成熟化を示す位相差顕微鏡写真である。左からＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）重層後０、２、４、６、１０日目のコロニーの位相差顕微鏡写真、一番右はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤ）添加後の蛍光顕微鏡写真である。
【図9】２代目の小型肝細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン１１１、ニドゲン、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン３３２又はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）を付着させた担体上で培養したときの、各担体への細胞の生着率を示すグラフである。
【図10】２代目の小型肝細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン１１１、ニドゲン、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン３３２又はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）を付着させた担体上で７日間培養したときのコロニー形成の有無を示す位相差顕微鏡写真である。
【図11】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン１１１又はラミニン５１１に接着した小型肝細胞における各種マーカーの遺伝子発現量を示すグラフである。縦軸はＧＡＰＤＨに対する相対的発現量を表す。
【図12】マウス由来の小型肝細胞の増殖を示すグラフである。横軸は培養時間（週）、縦軸は細胞数を表す。
【図13】マウス由来の小型肝細胞のＩＣＡＭ−１（Ａ）及びＣＤ４４（Ｂ）の発現を示すフローサイトメトリーのヒストグラムである。横軸はシグナル強度、縦軸はカウント数を表す。図中、濃色のピークはＩＣＡＭ−１又はＣＤ４４陽性細胞を、淡色のピークはＩｇＧ陽性細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明は、ＥＨＳゲル、ラミニン１１１、ラミニン３３２及び／又はニドゲンをその表面に有する担体上で小型肝細胞を培養する培養工程を含む、小型肝細胞の継代培養方法に関する。
【0016】
本発明における小型肝細胞とは、単に肝臓に由来する小型の細胞を意味するものではなく、前述の非特許文献１、２及び特許文献１〜３などにおいて報告されている、肝臓から単離可能な細胞であって、アルブミン、トランスフェリン、ＣＫ８、ＣＫ１８などのマーカーについて成熟肝細胞とほぼ同様の表現型を示し、超微構造的にも肝細胞としての特徴を有するが、高い増殖能を有する、肝臓由来の特別な種類の小型の細胞を意味する。
【0017】
小型肝細胞は、成熟肝細胞（肝実質細胞）と比較して比重が軽く、肝臓組織のコラゲナーゼ処理等により得られる肝臓由来細胞集団を含む懸濁液を低い重力加速度で遠心分離した場合、成熟肝細胞は主として沈殿に移行するが、小型肝細胞は主として上清に移行する性質を持つ。小型肝細胞と成熟肝細胞とを効率的に分離させるため、かかる遠心分離は、好ましくは、５０×ｇで１分以下の時間、行われる。
【0018】
また、小型肝細胞はＣＤ４４を発現しているが、成熟肝細胞及び肝非実質細胞は発現していない。このような特徴により、小型肝細胞は成熟肝細胞及び肝非実質細胞とは異なる細胞として理解されている。
【0019】
本発明における小型肝細胞は、単離された状態であっても細胞集団に含まれる状態であってもよい。すなわち本発明の培養方法は、肝臓組織から単離又は調製された小型肝細胞又は小型肝細胞に富む細胞集団をその対象とすることができる。特に、表面抗原としてＣＤ４４を発現している小型肝細胞（ＣＤ４４陽性小型肝細胞）又はこれに富む細胞集団が、本発明において好ましい培養対象である。小型肝細胞は、前記非特許文献１、２又は特許文献１〜３に記載された方法に従って、ヒトを含む霊長類やげっ歯類等の哺乳動物の肝臓から単離又は調製することができる。ＣＤ４４陽性小型肝細胞は、小型肝細胞若しくはこれを含む細胞集団（典型的には、肝臓組織から非選択的に回収される、様々な肝臓由来細胞を含む集団）に対してＣＤ４４特異的抗体を利用したセルソーティングを行うことにより、及び／又はその表面にヒアルロン酸を有する担体上でかかる細胞集団を培養することにより、効率的に取得することができる（詳細は特許文献３を参照されたい）。本発明の好ましい態様は、かかる細胞分離工程及び／又はヒアルロン酸担体上での培養工程をさらに含む。
【0020】
なお後述の実施例に示すように、本発明者らは、マウス由来の小型肝細胞ではＣＤ４４に加えてＩＣＡＭ−１が選択的に発現することを見出している。したがって、ＩＣＡＭ−１は小型肝細胞を含む細胞集団から小型肝細胞を検出又は分離するためのマーカーとして有用であり、小型肝細胞マーカーとしてのＩＣＡＭ−１、及びＩＣＡＭ−１特異的抗体を用いた小型肝細胞の検出・分離方法もまた、本発明の一部に包含される。
【0021】
また、本発明の継代培養方法において、ＣＤ４４陽性小型肝細胞又はこれに富む細胞集団を培養対象とするだけでなく、ＩＣＡＭ−１陽性小型肝細胞又はこれに富む細胞集団を培養対象とすることも可能である。かかる細胞又は細胞集団を得るためにＩＣＡＭ−１特異的抗体を利用したセルソーティングを行うこともまた好ましい。
【0022】
ＥＨＳゲルは、細胞外マトリクスタンパク質を豊富に含むＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出した再構成基底膜調製品であり、Ｃｏｒｎｉｎｇ社からＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）として市販されている。ＥＨＳゲルは、細胞外マトリクスの成分としてラミニン、コラーゲンＩＶ及びニドゲン等を含み、主成分はラミニンでアイソフォームとしてラミニン１１１のみを含む。
【0023】
ラミニンは、細胞外マトリクスの基底膜に含まれる、細胞接着に関与する糖タンパク質であり、α鎖、β鎖、γ鎖と呼ばれる３本のサブユニットが十字架様に会合した構造を有する。ラミニンのα鎖はα１〜α５の５種類、β鎖はβ１〜β３の３種類、γ鎖はγ１〜γ３の３種類がこれまでに同定されており、これらの組み合わせが異なる１９種類のアイソフォームが存在することが確認されている。本発明において使用されるラミニンは、アイソフォームの一種であるラミニン１１１（α１β１γ１）及びラミニン３３２（α３β３γ２）である。
【0024】
ラミニン１１１及びラミニン３３２は、それぞれＢｉｏＬａｍｉｎａ社及びＯｒｉｅｎｔａｌ社から入手することができる。また、ラミニン１１１は、ＥＨＳゲルとして、又はＥＨＳゲルから部分的に精製したものを用いてもよい。
【0025】
ニドゲンは、エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）とも呼ばれ、ラミニンと同様に細胞外マトリクスの基底膜に含まれる糖タンパク質の一種である。２種類のアイソフォーム（ニドゲン−１、−２）が知られており、いずれもラミニンγ１鎖に結合し、ラミニンをＩＶ型コラーゲンに結びつけることで基底膜の形成と維持に関与している。本発明においては、ニドゲン−１、−２いずれのアイソフォームも利用することができる。ニドゲンは、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭ社から入手することができる。また、ニドゲンは、ＥＨＳゲルとして、又はＥＨＳゲルから部分的に精製したものを用いてもよい。
【0026】
ＥＨＳゲル、ラミニン１１１、ラミニン３３２及び／又はニドゲン（以下、これらをまとめて言及するときは継代培養用接着基質と表す）をその表面に有する担体の典型的な態様は、特異的又は非特異的であるかを問わず、また共有的又は非共有的などの結合の態様を問わず、継代培養用接着基質がその表面（培養が行われる面）に付着した、すなわち細胞培養中に容易に遊離しない程度に結合した担体をいう。かかる付着は、典型的には、適当量の継代培養用接着基質を含む溶液と担体表面とを接触させて、継代培養用接着基質を担体の表面に非特異的に吸着させることによって行うことができる。例えば、ＥＨＳゲルを溶解した溶液をディッシュに加えることで、ＥＨＳゲル、そこに含まれるラミニン１１１及び／又はニドゲンが表面に付着したディッシュを作製することができる。担体に付着させた培養用接着基質は、乾燥状態、湿潤状態を問わない。
【0027】
本発明における担体は、細胞培養に利用可能な担体であればどのようなものでもよいが、好ましくは、多孔質、ガラス、セファロース、プラスチック、金属及びセルロースよりなる群から選択される材料によって成形される培養基材又は培養容器である。そのような例としては、プラスチック製又はガラス製のディッシュ、培養フラスコ、培養ボトル、培養チューブ、培養ビーズ、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、セファロースビーズ、磁気ビーズ、スポンジ、セルロース多孔質などを挙げることができる。
【0028】
継代培養用接着基質の担体表面への付着量は、担体表面積１ｃｍ２あたりおおよそ１０〜３０μｇであることが好ましい。かかる付着量は、担体の材質、継代培養用接着基質を含む溶液の濃度、液量、インキュベーション温度などを適宜設定することで、調節することができる。
【0029】
例えば、０．１５〜１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬの継代培養用接着基質を含む溶液、例えば一般的な細胞培養培地又はハンクス液、生理食塩水若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を、担体表面積１ｃｍ２あたり、０．０５〜０．２０ｍＬ、より好ましくは０．１０〜０．１５ｍＬとなるように担体に加えてインキュベートすることで、継代培養用接着基質を担体の表面に付着させることができる。担体としてポリスチレン製のディッシュを、継代培養用接着基質としてＥＨＳゲルを選択したときは、０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＥＨＳゲルを含むハンクスＢＳＳの適当量をポリスチレン製ディッシュに加え、４℃〜４０℃程度の温度でインキュベートすることによって、付着を行うことができる。
【0030】
なお、活発に増殖している小型肝細胞にＥＨＳゲルを共存させると、小型肝細胞の成熟化が誘導されることが知られている。継代培養のための小型肝細胞は未成熟な状態を維持していることが好ましいため、継代培養用接着基質としてＥＨＳゲルを用いる場合、コロニーを形成していない状態の小型肝細胞を用いて継代培養を開始することが望ましい。
【0031】
継代培養用接着基質をその表面に有する担体上での小型肝細胞の培養は、前述の非特許文献１又は特許文献１〜３に記載されている培養条件、例えば培地組成、温度、培養時間等を設定して行うことができる。好ましくは、培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であり、温度は３５〜３８℃、培養時間は７〜３０日の範囲内で適宜設定することができる。
【0032】
本発明における継代培養の操作自体は格別の工夫を必要とはせず、先に説明した担体上で培養した小型肝細胞に対して、洗浄処理、トリプシン処理等の一般的な操作によって細胞を回収し、再び本発明にかかる担体上に回収した細胞と適当な培地とを加えて培養するという操作を繰り返せばよい。かかる継代培養を１又は２回行うことで、機能を維持した状態の小型肝細胞をより大量に取得することができる。また、小型肝細胞の機能の一部は失われるものの、２回より多い継代培養、好ましくは８回まで、より好ましくは４回までの継代培養が可能である。継代回数は、取得する小型肝細胞の用途に応じて適宜選択することができる。
【0033】
本発明の方法で培養した後の細胞が小型肝細胞としての所望の機能を保持しているかどうかは、種々のマーカーを用いて確認することができる。そのようなマーカーとしては、培地中に分泌されるアルブミンの他、トランスフェリン、尿素の産生、グリコーゲン量、アミノ酸代謝酵素、チトクロームＰ４５０等が利用できる。これらは、培地又は細胞抽出液のＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング解析、ＲＴ−ＰＣＲ等によって、あるいは直接細胞を免疫染色することによって確認することができる。また、小型肝細胞は、成熟肝細胞のマーカーであるアルブミン、ＣＫ８、ＣＫ１８、グリコーゲン等のマーカーを有しており、これらもマーカーとして利用可能である。
【0034】
さらに、ＥＤ１／２（クッパー細胞のマーカー）、ＳＥ−１（類洞内皮細胞マーカー）、デスミン（ｄｅｓｍｉｎ、星細胞のマーカー）、又はビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ、肝上皮様細胞マーカー）などが陰性であることで、小型肝細胞であることを補足的に確認することも可能である。
【0035】
以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【0036】
＜実施例１＞１）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を表面に有する担体の作製
氷上に置いた１００ｍｍ径のプラスチック製ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を２００μｇ／ｍＬの濃度で含むハンクスＢＳＳ５〜１０ｍＬを加え、１時間インキュベートした後、溶液をディッシュから除去した。ディッシュをクリーンベンチ内で一晩風乾させて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）が表面に付着したディッシュを作製した。
【0037】
２）小型肝細胞の分離特許文献１に記載された方法によって成体Ｆ３４４ラット肝臓小葉内から分離した小型肝細胞を含む細胞集団を、特許文献３に記載された方法に従ってヒアルロン酸でコーティングしたディッシュ上で９日間無血清培養した。培地を除去した後の細胞をＰＢＳで洗浄後、１％ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液を加えて３７℃、５分間インキュベートした。上清をビーカーに移し、７ｍＬのコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ溶液（５０ｍｌ Ｈａｎｋｓ ＢＳＳ、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ）、１７５００Ｕ／５０μＬヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ））を加えて３７℃で５分間インキュベートした。穏やかにピペッティングした後、溶液を別のビーカーに移して３７℃で３０分間撹拌した。その後、この溶液から、０．５μｇ／ｍＬの抗ラットＣＤ４４抗体（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した磁気ビーズを用いたＭＡＣＳ法によりＣＤ４４陽性細胞を回収した（初代）。
【0038】
３）継代培養１）で作製したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を表面に有するディッシュに１０ｍＭニコチンアミド、１ｍＭアスコルビン酸２リン酸、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、ＩＴＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｔｅ）、１０−７Ｍデキサメタゾン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びゲンタマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を分注し、２）で回収したＣＤ４４陽性小型肝細胞（１×１０６個）を加えて、３７℃で２８日間、培地を一日おきに交換しながら培養した後、ＰＢＳによる洗浄及びトリプシン処理を行って小型肝細胞を回収した（２代目）。１×１０６個の回収小型肝細胞／ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と新しい培地とを再び新しい１）のディッシュに加え、３７℃で２８日間、培地を培養開始の翌日及びその後は一日おきに交換しながら培養し、上記と同様の操作で小型肝細胞を回収した（３代目）。この操作を繰り返して５代目まで培養した。
【0039】
４）コロニー形成能２代目の小型肝細胞を培養開始から７日毎に位相差顕微鏡を用いて観察したところ、小型肝細胞は増殖しコロニーは増大していることが認められた（図１）。また、２〜５代目のコロニーを培養２８日目に観察したところ、コロニーは比較的円形の形態を伴って増殖していた（図２）。さらに、２〜５代目の小型肝細胞について、細胞数＞１０であるコロニーの１コロニーあたりの細胞数をカウントし、増殖能を比較した（図３）。世代を経る毎に平均細胞数は減少し、増殖能の低下した小型肝細胞が増えるものの、２〜５代目の小型肝細胞はいずれもコロニー形成能を有していた。
【0040】
５）世代毎の細胞分裂回数１つの小型肝細胞が分裂してコロニーを形成したと仮定し、培養７、１４、２１日目のコロニーあたりの平均細胞数から培養２８日目の細胞数を算出することで、各継代培養における小型肝細胞の細胞分裂回数を推定した。その結果、初代では６回／９日、２代目では１３．５回／２８日、３代目では１２．７回／２８日、４代目では１１回／２８日、５代目では９回／２８日と算出され（図４）、その合計は５２回であった。劇症肝炎マウスモデルに移植した肝細胞の推定分裂回数は最大７０回程度とされており（Ｏｖｅｒｔｕｒｆ Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１２７３−１２８０（１９９７））、本発明によって継代培養した小型肝細胞はこれに近い回数の細胞分裂を行い得ると推測された。
【0041】
６）世代毎の生着率及び増殖率２〜５代目の小型肝細胞の生着率（培養１日目の接着細胞数／添加した細胞数）と、増殖率（培養２８日目に回収された細胞数／接着細胞数）を算出した。生着率は、継代を通じて１３〜１６％の範囲でほぼ一定であった（図５左）。また、増殖率は世代を経る毎に減少するものの、５代目でも増殖能を保持していた（図５右）。
【0042】
上記の接着率及び増殖率の結果から、３代目の培養終了時に回収された細胞数は、ディッシュ１枚あたり、１×１０６個×０．１６×１２倍×０．１４×１１倍＝２．９６×１０６個と算出された。すなわち、分離された小型肝細胞を本発明の方法によって３代目まで培養することで、約２ヵ月で絶対総数として細胞数を３倍に増加させることが可能であることが確認された。
【0043】
＜試験例１＞実施例１において得られた小型肝細胞の性質を評価するため、以下の試験を行った。なお、特に指定がないかぎり、各世代の培養２８日目の小型肝細胞を試験に用いた。
【0044】
１）培地成分の影響実施例１の３代目細胞を、実施例１の培地からニコチンアミド、ＥＧＦ、ＩＴＳ、デキサメタゾン又はアスコルビン酸２リン酸をそれぞれ除いた培地を用いて７日間継代培養を行い、コロニー数、コロニーあたりの細胞数をカウントした。また、細胞をＢｒｄＵ（Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）で２４時間処理した後に固定し、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて免疫染色後、総細胞数に対するＢｒｄＵ陽性細胞の割合（Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｄｅｘ）を算出した。ニコチンアミド又はＥＧＦを含まない培地で継代培養した３代目細胞では、コロニー数、細胞数、Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｄｅｘのいずれについても減少が認められたことから（表１）、３代目の小型肝細胞は、ニコチンアミド及びＥＧＦに依存して増殖することが示された。
【表1】
【0045】
２）ＤＮＡ合成、倍数性及び多核性実施例１の３代目細胞について上記１）と同様の操作でＬａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｄｅｘを算出したところ、培養１４日目で２１．３±８．４％、培養２８日目では１７．７±７．９％であった。またフローサイトメトリーによりＧ０期の細胞（Ｋｉ６７陰性細胞）のＤＮＡ含量から倍数性を評価したところ、コロニーを形成する細胞のほとんどは２倍体であった。さらに、３代目細胞における１核細胞及び２核細胞の割合は、１核細胞が９３．２±３．６％、２核細胞が６．５±３．６％と、ほぼすべて１核細胞であった。
【0046】
３）マーカー発現実施例１の３代目及び４代目細胞のコロニーを免疫染色し、ＣＤ４４、Ａｌｂ、ＨＮＦ４α、ＣＫ１９、Ｓｏｘ９及びＴｈｙ１のタンパク質発現を調べた結果、いずれのマーカーも発現が観察された（図６）。また、２〜５代目細胞におけるＣＤ４４、Ａｌｂ、Ｃ／ＥＢＰα、ＨＮＦ４α及びＣＫ１９の遺伝子発現量をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。世代を経ることで発現量は減少するものの、ＣＤ４４、Ａｌｂ、ＣＫ１９及びＨＮＦ４αの発現は５代目まで維持され、Ｃ／ＥＢＰαの発現は３代目まで維持された（図７）。
【0047】
実施例１で得られた小型肝細胞におけるその他のマーカー遺伝子及びタンパク質の発現についても同様に評価した。結果を表２にまとめる。【表2】
【0048】
４）分化能３代目の培養１８日目の小型肝細胞に対してＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を重層し、さらに１０日間培養を続けたところ、細胞の大型化及び毛細胆管様構造の形成が観察された。また、ＦＤを培養液に加えたところ、ＦＤの代謝物である蛍光物質ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの毛細胆管様構造内への蓄積が認められた（図８）。
【0049】
さらに、分泌／代謝マーカーであるＴｒｙｐｔｏｐｈａｎ ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ（Ｔｄｏ２）、有機アニオン輸送体であるＯａｔｐ２、薬物代謝マーカーであるＣｙｐ１Ａ２及びＣｙｐ２Ｂ１の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の添加前と比較して、Ｔｄｏ２は１３倍に、Ｏａｔｐ２は１２倍に、Ｃｙｐ１Ａ２は１５０倍に、Ｃｙｐ２Ｂ１は５７倍にそれぞれ発現量が上昇した。４）で示したように、３代目の小型肝細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の添加によって毛細胆管を形成し、胆汁分泌能も獲得することから、成熟肝細胞への分化能を保持していることが確認された。
【0050】
５）凍結保存３代目の培養２８日目の小型肝細胞を回収し、特許文献１に記載の方法に従って、−８０℃で約２ヵ月凍結保存した後、解凍して培地に播種し、培養した。培養１日目の細胞のディッシュへの生着率は５０％以上であった。さらに培養を継続すると、凍結保存した細胞は、凍結保存を行なっていない４代目と同様に増殖してコロニーを形成することが確認された。
【0051】
以上の試験結果から、実施例１で得られた小型肝細胞は、継代培養を行わない従来の小型肝細胞と同様の性質及び機能を有することが示された。
【0052】
＜実施例２＞１）担体の作製
実施例１の１）におけるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）をラミニン１１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、ニドゲン（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭ社）、ラミニン５１１（Ｎｉｐｐｉ社）、ラミニン５２１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ラミニン３３２（Ｏｒｉｅｎｔａｌ社）又はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に置き換えて同様の操作を行い、各物質を表面に有するディッシュを作製した。
【0053】
２）接着能及びコロニー形成能実施例１の２代目の小型肝細胞を培養２８日目に回収し、培地を分注した上記１）の各ディッシュに加えて３代目の継代培養を開始し、各ディッシュへの細胞の接着能を実施例１の６）と同様に調べた。その結果、３代目の細胞は、ラミニン５１１及びラミニン５２１に対して４０％以上の接着率を示し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン１１１、ニドゲン及びラミニン３３２に対して約１５〜２０％の接着率を示し、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）に対して約３０％程度の接着率を示した（図９）。
【0054】
また、３代目の継代培養を１４日間行ったところ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン１１１、ニドゲン又はラミニン３３２を付着させたディッシュ上にはコロニーが観察されたが、ラミニン５１１又はラミニン５２１を付着させたディッシュ上では小型肝細胞コロニーは観察されなかった（図１０）。また、ラミニン５１１又はラミニン５２１に接着した細胞は、コロニーを形成しないまま増殖するものの、培養を継続するにつれて細胞が次第に大型化し、増殖能を失った。
【0055】
＜試験例２＞実施例１の培養２１日目の２代目細胞を回収し、ラミニン１１１を付着させたディッシュに播種した。３時間後にディッシュから培地を回収してラミニン１１１に接着しなかった細胞を集め、ラミニン５１１を付着させたディッシュに播種したところ、細胞は良好に接着した。
【0056】
次に、上記のラミニン１１１又はラミニン５１１に接着した細胞、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に接着した細胞、初代のＣＤ４４陽性小型肝細胞及び成熟肝細胞のそれぞれからＲＮＡを抽出し、肝細胞マーカーであるＡｌｂ、ＨＮＦ４α及びＣ／ＥＢＰα、胆管細胞マーカーであるＣＫ１９、Ｓｏｘ９、ＥｐＣＡＭ及びＧｒｈｉ２の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ラミニン１１１に接着した細胞は、実施例１の表２に示されるものと同傾向のマーカー発現を示していた（図１１）。
【0057】
＜実施例３＞抗ＣＤ４４抗体の代わりに抗ＩＣＡＭ−１抗体を用いた点以外は実施例１と同様に、マウス肝臓から小型肝細胞を調製し、ラミニン１１１を付着させたディッシュに２×１０４個の細胞濃度で播種した。培養開始から７日後、細胞をトリプシン処理によりディッシュから遊離させ、細胞数をカウントした。この操作を繰り返すことで継代培養を行ったところ、８回の継代を繰り返しても細胞は良好に増殖することが確認された（図１２）。
【0058】
＜試験例３＞実施例３で得られた８代目のマウス小型肝細胞を、ＰＥ−抗ＩＣＡＭ−１抗体及びＰＥ−ラットＩｇＧ、又はＰＥ−抗ＣＤ４４抗体及びＰＥ−ラットＩｇＧで染色した後にフローサイトメトリーに供し、ＩＣＡＭ−１及びＣＤ４４の発現を評価した。全ての細胞でＩＣＡＭ−１及びＣＤ４４が発現していることが確認された（図１３）。
【産業上の利用可能性】
【0059】
本発明は、肝細胞の生化学的研究、肝細胞を利用した薬物の開発等に対して有益な小型肝細胞を、研究材料等として提供することについての産業上の利用可能性を有する。