特許 6704848 広範囲に自己再生するヒト赤芽球（ＥＳＲＥ）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6704848

(24)【登録日】2020年5月15日

(45)【発行日】2020年6月3日

(54)【発明の名称】広範囲に自己再生するヒト赤芽球（ＥＳＲＥ）

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/078 20100101AFI20200525BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20200525BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20200525BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20200525BHJP

   C12N 5/02 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20200525BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200525BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/078

   C12N5/0735

   C12N5/074

   C12N5/077

   C12N5/02

   A61K35/15

   A61P7/00

   A61P7/04

   A61K48/00

【請求項の数】20

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2016-514069(P2016-514069)

(86)(22)【出願日】2014年5月15日

(65)【公表番号】特表2016-525882(P2016-525882A)

(43)【公表日】2016年9月1日

(86)【国際出願番号】US2014038075

(87)【国際公開番号】WO2014186508

(87)【国際公開日】20141120

【審査請求日】2017年4月28日

(31)【優先権主張番号】61/823,677

(32)【優先日】2013年5月15日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500549847

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ ロチェスター

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】パリス，ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】イングランド，サマンサ

(72)【発明者】

【氏名】キム，アー・ラム

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０６３６１９９８（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 特表平０９−５０２３５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 ENGLAND，BLOOD，２０１０年１２月 ２日，V117 N9，P2708-2717

【文献】 IWAMA，IMMUNITY，２００４年１２月 １日，V21 N6，P843-851

【文献】 CHANG，NATURE BIOTECHNOLOGY，２００６年 ７月１６日，V24 N8，P1017-1021

【文献】 DIAS, Jessica et al.，Generation of Red Blood Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells，STEM CELLS AND DEVELOPMENT，２０１１年，Vol. 20, No. 9，p. 1639-1646

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

Ａ６１Ｐ ７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

培地中で増殖し、最終的に成熟する能力を維持する、広範囲に自己再生するヒト赤芽球（ＥＳＲＥ）の単離された集団であり、ここで、前記ＥＳＲＥは、不死化されていない、少なくとも３０回の細胞分裂を受けることができる、完全赤血球前駆細胞の集団から誘導され、更に、ここで前記ＥＳＲＥの集団が、限定的な自己再生を受けた赤芽球、及び初期前赤芽球と比較して、Ｂｍｉ−１のより高い発現レベルを示す、前記単離された集団。

【請求項2】

１つ若しくはそれ以上の治療タンパク質を発現するように、前記ＥＳＲＥが遺伝的に改変される、請求項１に記載の前記ＥＳＲＥの単離された集団。

【請求項3】

前記ＥＳＲＥが、因子ＩＸ、因子ＶＩＩＩｃ、フォンウィルブランド因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、アンチトロンビンＩＩＩ、及び、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される因子を発現するように、遺伝的に改変される、請求項１に記載の前記ＥＳＲＥの単離された集団。

【請求項4】

ヒトＥＳＲＥの単離された集団を含み、並びに、ＥＰＯ、ＳＣＦ、デキサメタゾン及び脂質混合物を含有する増殖培地を含む組成物。

【請求項5】

前記増殖培地が、更に、Ｂｍｉ−１タンパク質、Ｂｍｉ−１ペプチド、及びＢｍｉ−１調節剤のうちの１つ若しくはそれ以上を含む、請求項４に記載の前記組成物。

【請求項6】

広範囲に自己再生した赤芽球（ＥＳＲＥ）の集団由来のヒトＲＢＣの単離された集団。

【請求項7】

ヒト細胞から広範囲に自己再生する赤芽球（ＥＳＲＥ）の実質的に純粋な集団を生成する方法であって：
ａ）完全赤血球前駆体細胞集団の生成を促進する条件下で、ヒト幹細胞及びヒト前駆体細胞からなる群より選択されるヒト細胞を培養し；
ｂ）ＥＰＯ、ＳＣＦ、デキサメタゾン、及び、脂質混合物を含む増殖培地中で前記完全赤血球前駆体細胞の集団を増殖し、Ｂｍｉ−１タンパク質、Ｂｍｉ−１ペプチド、及びＢｍｉ−１調節剤のうちの１つ若しくはそれ以上を赤血球の自己再生を調節するために十分な量で完全赤血球前駆体細胞集団に提供し、それにより、少なくとも約４５日間連続して自己再生する細胞分裂を受けて、最終的に成熟する能力を維持する、実質的に純粋なＥＳＲＥ集団を生成することを含む、前記方法。

【請求項8】

前記ヒト細胞が、胚性幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、成体幹細胞、臍帯細胞、骨髄細胞、及び、それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の前記方法。

【請求項9】

段階ａ）の前記完全赤血球前駆体細胞の集団が、胚様体（ＥＢ）由来である、請求項７に記載の前記方法。

【請求項10】

前記細胞が、少なくとも約２０日間、ａ）段階で培養される、請求項７に記載の前記方法。

【請求項11】

前記Ｂｍｉ−１調節剤がヘッジホッグリガンドである、請求項７に記載の前記方法。

【請求項12】

前記増殖培地が、約２Ｕ／ｍＬのＥＰＯ、約１００ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＳＣＦ、約１０^−６Ｍのデキサメタゾン、約４０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン様成長因子−１、及び、約０．４％の脂質混合物で補充された動物成分無しの培地である、請求項７に記載の前記方法。

【請求項13】

哺乳動物に遺伝子を送達するための試薬の調製における遺伝子送達ビヒクルの使用であって、ここで、前記ビヒクルは、請求項２に記載の前記遺伝子改変ＥＳＲＥを含む、使用。

【請求項14】

ヒト赤血細胞（ＲＢＣ）を生成する方法であって、ＥＰＯ及びインスリンを含む分化培地において、請求項１に記載される広範囲に自己再生する赤芽球（ＥＳＲＥ）を培養することを含む、前記方法。

【請求項15】

ＲＢＣ輸血の必要性を有する対象を治療するための試薬の調製における請求項６に記載のＲＢＣの単離された集団の使用。

【請求項16】

前記ＲＢＣが、前記対象から得られた細胞から生成される、請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

前記対象から得られた前記細胞が、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、及び、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

血液疾患を有する対象を治療するための試薬の調製における請求項１に記載されるＥＳＲＥの治療上有効量の使用。

【請求項19】

前記ＥＳＲＥが、血液障害を有する対象を治療するために、一つ若しくはそれ以上の因子を発現するように遺伝的に改変される、請求項１８に記載の使用。

【請求項20】

前記因子が、第ＶＩＩＩ因子、または第ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ因子、第Ｖａ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォンウィルブランド因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、アンチトロンビンＩＩＩ、及び、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦政府支援の研究開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与されたＵ０１ ＨＬ０９９６５６の政府支援でなされた。政府は、本発明においてある権利を有する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月１５日出願の米国特許仮出願第６１／８２３,６７７号に対する優先権を主張し、その内容全体を参照することにより、本明細書に組み入れたものとする。

【背景技術】

【0003】

１６００万ユニット以上の赤血細胞（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ、ＲＢＣ）が、外傷、手術、または癌化学療法後の重症患者の臨床的必要性を満たすために、米国で、毎年、輸血されている。現在、輸血用赤血球の供給は、ドナーのみに依存し、それは、感染リスク、スクリーニングの高コスト、特に、珍しい血液型のためには供給のボトルネックに関連している。今後数十年にわたり、赤血球輸血の必要性は、米国人口の高齢化と共に増加する。従って、代わりの輸血源が必要となる。

【0004】

胚性幹（ＥＳ）細胞ベースのアプローチを用いた赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）の生成は、赤血球前駆細胞を生成するためのスケーラビリティ及び限定された方法により制限される。以前の技術には、骨髄由来の、及び、臍帯血由来の造血幹細胞が用いられているが、赤血球前駆細胞の実用可能な生成が達成されていない。逆に、赤血球前駆細胞の最終的分化及び除核のための技術が存在するが、しかし、「出発細胞」の十分な量の生成が成功していない（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ， ２０１１）。本発明は、当該分野で未達成の必要性に対応する。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、培養中で増殖し、最終的に成熟する能力を維持する、ヒトが広範囲に自己再生する赤芽球（ＥＳＲＥ）の単離された集団を提供し、ここで、ＥＳＲＥは不死化されていない。

【0006】

一実施形態において、ＥＳＲＥ集団は、少なくとも３０回の細胞分裂を受けることが可能である。

【0007】

一実施形態において、ＥＳＲＥの集団は、更に、完全赤血球前駆細胞の集団由来であり、ここで、ＥＳＲＥの集団は、限定的な自己再生を受けた赤芽球、及び初期前赤芽球と比較して、Ｂｍｉ−１のより高い発現レベルを示す。

【0008】

一実施形態において、ＥＳＲＥは、１つ若しくはそれ以上の治療タンパク質を発現するように遺伝的に改変される。

【0009】

一実施形態において、ＥＳＲＥは、因子ＩＸ、因子ＶＩＩＩｃ、フォンウィルブランド因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、アンチトロンビンＩＩＩ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される因子を発現するように遺伝的に改変される。

【0010】

本発明は、また、ヒトＥＳＲＥの単離された集団、並びに、ＥＰＯ、ＳＣＦ、デキサメタゾンを含む増殖培地、及び、脂質混合物を含む組成物を提供する。

【0011】

一実施形態において、増殖培地は、更に、Ｂｍｉ−１タンパク質、Ｂｍｉ−１ペプチド、及びＢｍｉ−１調節剤のうちの１つ若しくはそれ以上を含む。

【0012】

本発明は、また、ＥＳＲＥの集団由来のヒトＲＢＣの単離された集団を提供する。

【0013】

本発明は、また、ヒト細胞からＥＳＲＥの実質的に純粋な集団を生成する方法を提供する。一実施形態において、方法は、ａ）分化した細胞集団の生成を促進する条件下でヒト細胞を培養し、ｂ）ＥＰＯ、ＳＣＦ、デキサメタゾン、及び脂質混合物を含む増殖培地中で分化した細胞集団を増殖し、それにより、ＥＳＲＥの実質的に純粋な集団を生成させることを含む。

【0014】

一実施形態において、ヒト細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、成体幹細胞、臍帯細胞、骨髄細胞、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。

【0015】

一実施形態において、段階ａ）の分化した細胞の集団は、胚様体（ＥＢ）由来である。

【0016】

一実施形態において、段階ａ）で、細胞は、完全赤血球前駆細胞の集団を生成するために培養される。

【0017】

一実施形態において、段階ａ）で、細胞は、少なくとも２０日間培養される。

【0018】

一実施形態において、段階ｂ）で、ＥＳＲＥの集団は、少なくとも約４５日間連続して自己再生する細胞分裂を受ける。

【0019】

一実施形態において、段階ｂ）で、Ｂｍｉ−１タンパク質、Ｂｍｉ−１ペプチド、及びＢｍｉ−１調節剤のうちの１つ若しくはそれ以上は、赤血球の自己再生を調節するために十分な量で分化した細胞集団に提供される。

【0020】

一実施形態において、Ｂｍｉ−１調節剤は、ヘッジホッグリガンドである。

【0021】

一実施形態において、増殖培地は、約２Ｕ／ｍＬのＥＰＯ、約１００ｎｇ／ｍＬのヒト組み換えＳＣＦ、約１０^−６Ｍのデキサメタゾン、約４０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン様成長因子−１、及び、約０．４％の脂質混合物で補充された動物成分無しの培地である。

【0022】

本発明は、また、哺乳動物に遺伝子を送達する方法を提供する。一実施形態において、方法は、哺乳動物への遺伝子送達ビヒクルを投与することを含み、ここで、ビヒクルは、遺伝的に改変されたＥＳＲＥを含む。

【0023】

本発明は、また、ヒト赤血細胞（ＲＢＣ）を生成する方法を提供する。一実施形態において、方法は、ＥＰＯ及びインスリンを含む分化培地でＥＳＲＥを培養することを含む。

【0024】

本発明は、また、ＲＢＣ輸血の必要性を有する対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象へのＥＳＲＥ集団由来のヒトＲＢＣの単離された集団を投与することを含む。

【0025】

一実施形態において、ＲＢＣは、対象から得られた細胞から生成する。

【0026】

一実施形態において、対象から得られた細胞は、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0027】

本発明は、また、血液疾患を有する対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象にＥＳＲＥの治療上有効量を導入することを含む。

【0028】

一実施形態において、ＥＳＲＥは、血液疾患を有する対象を治療するために、一つ若しくはそれ以上の因子を発現するように、遺伝的に改変されている。

【0029】

一実施形態において、血液疾患は血友病である。

【0030】

一実施形態において、因子は、第ＶＩＩＩ因子、または第ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ因子、第Ｖａ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォンウィルブランド因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、アンチトロンビンＩＩＩ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0031】

本発明は、また、ＥＳＲＥ遺伝子発現を調節する試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態において、方法は、ＥＳＲＥを試験化合物と接触させ、及び、試験化合物の存在下での遺伝子の発現レベルが、試験化合物の非存在下での遺伝子の発現レベルと異なるとき、ＥＳＲＥ遺伝子発現の調節剤としての化合物を同定することを含む。

【0032】

一実施形態において、ＥＳＲＥは、グロビン遺伝子プロモーターに操作可能に連結した、検出可能なポリペプチドをコードする核酸配列を含むように遺伝的に改変される。

【0033】

一実施形態において、グロビン遺伝子プロモーターは、ヒトγ−グロビン遺伝子プロモーター及びヒトβ−グロビン遺伝子プロモーターからなる群から選択される。

【0034】

一実施形態において、検出可能なポリペプチドは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、キナーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される。

【0035】

一実施形態において、方法は、試験化合物の存在下、及び、非存在下で検出可能なポリペプチドレベルを測定することを含み、ここで、試験化合物の非存在下で検出可能なポリペプチドのレベルと比較して、試験化合物の存在下で検出可能なポリペプチドのレベルの上昇は、グロビン遺伝子プロモーターを活性化する化合物として試験化合物を同定する。

【0036】

一実施形態において、方法は、試験化合物の存在下、及び、非存在下で検出可能なポリペプチドレベルを測定することを含み、ここで、試験化合物の非存在下で検出可能なポリペプチドのレベルと比較して、試験化合物の存在下で検出可能なポリペプチドレベルの減少は、グロビン遺伝子の発現を阻害する化合物として試験化合物を同定する。

【0037】

一実施形態において、試験化合物は、小分子、核酸分子、ポリペプチド、合成化合物、及び天然に存在する化合物からなる群から選択される。

【0038】

添付の図面と併せて読めば、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、より良く理解されるであろう。本発明を説明する目的のために、現在好ましい実施形態を図面に示している。しかし、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】図１Ａ及び図１Ｂを含み、哺乳類の赤血球生成を示す一連の画像である。（図１Ａ）生体内での定常状態の赤血球生成は、赤血球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ）、及び、網状赤血球（ｒｅｔｉｃｓ）を形成するために除核する赤血球前駆体（ＰｒｏＥ、ＢａｓｏＥ、ＰｏｌｙＥ及びＯｒｔｈｏＥ）の限られた増殖で特徴付けられる。（図１Ｂ）臍帯血と成体骨髄の生体外での培養が、制限された自己再生能力を持つ赤芽球を生成させる。

【図2】図２Ａ及び図２Ｂを含み、マウスの広範囲に自己再生する赤芽球（ＥＳＲＥ）を示す一連の画像である。（図２Ａ）成体骨髄からの赤芽球培養物は、制限された自己再生を示す。これとは対照的に、Ｅ９．５マウス卵黄嚢及びＥ１４．５肝臓からの赤芽球の培養物は、広範な自己再生を受ける。（図２Ｂ）増殖性赤芽球は、ｃ−Ｋｉｔを高レベルで発現し、前赤芽球の形態を有している。分化すると、ＴＥＲ１１９の発現が増加し、細胞が網状赤血球に成熟する。

【図3】マウス骨髄からの未成熟造血骨髄前駆細胞（ＬＳＫ）で、または、ＵＢＣ−ＧＦＰマウス由来のＥＳＲＥで、ＩＶ注射を受けたＮＳＧマウスにおける、網状赤血球及び成熟ＲＢＣの循環を示す画像である。生体内での分化の際に、ＥＳＲＥは、野生型のＲＢＣとサイズ及び形態で類似したＧＦＰ＋ＲＢＣの過渡波を発生させる（右パネル）。

【図4-1】図４Ａ〜４Ｉを含み、ヒトのＨ１ ＥＳ／ＥＢにおける赤血球出現の可能性を示す一連の画像である。（図４Ａ）赤血球前駆細胞の２つの連続波が、ヒトのＥＢから生成する。（図４Ｂ）形態（上）及び赤血球コロニーの細胞組成（下）は、原始的及び完全な赤血球の同一性と一致した形態を明らかにした。（図４Ｃ）１１日〜１９日目のＥＢ（ＥＢＤ１１、ＥＢＤ１９）からの５赤血球コロニーの遺伝子発現解析。１１日目〜１６日目のＥＢの赤血球コロニーは、主に、胚ε−グロビン遺伝子（上パネル）を発現するが、グルココルチコイド受容体（ＧＲ、Ｎｒ３ｃ１遺伝子：下パネル）を発現しない。これとは対照的に、１７日目及び１９日目のＥＢからの赤血球コロニーは、主に、胎児γ−グロビン遺伝子（上パネル）、並びに、ＧＲ（下パネル）を発現する。（図４Ｄ）上パネル：１９日間の生体外で分化したＨ１ヒトＥＳ細胞由来のヒト赤芽球の自己再生。下パネル：ＥＰＯ及びインスリン中で分化したヒト赤芽球は、生体外で網状赤血球に成熟する。（図４Ｅ）血液細胞運命への胚様体（ＥＢ）としてのヒトＥＳＣの無血清分化のためのスキーム。図４Ｆ〜４Ｈは、ヒト完全自己再生赤芽球の画像である。（図４Ｆ）ヒトの自己再生赤芽球（ＳＲ）は、赤血球の特異的マーカーＣＤ２３５ａを発現し、大規模な核（ＤＡＰＩ）を含有する。これらの細胞の生体外分化（Ｄｉｆｆ）の結果は、ＤＮＡを欠く小ＲＢＣをもたらす。（図４Ｇ）自己再生（ＳＲ）及び分化した（Ｄｉｆｆ）ｈＥＳＣ由来の赤血球細胞で発現したβ様グロビンのｍＲＮＡの相対レベル。ヒト赤芽球の成熟は、胎児γ−グロビンから成体β−グロビンへのグロビン「スイッチ」に関連する。（図４Ｈ）マウスＥＳＲＥ（ＧＦＰ標識化）は、完全に生体内で成熟し、数週間に亘って生体内でＲＢＣのように循環することができる。（図４Ｉ）赤芽球の増殖の形態（増殖の３６日目）が示されている。

【図4-2】図４Ａ〜４Ｉを含み、ヒトのＨ１ ＥＳ／ＥＢにおける赤血球出現の可能性を示す一連の画像である。（図４Ａ）赤血球前駆細胞の２つの連続波が、ヒトのＥＢから生成する。（図４Ｂ）形態（上）及び赤血球コロニーの細胞組成（下）は、原始的及び完全な赤血球の同一性と一致した形態を明らかにした。（図４Ｃ）１１日〜１９日目のＥＢ（ＥＢＤ１１、ＥＢＤ１９）からの５赤血球コロニーの遺伝子発現解析。１１日目〜１６日目のＥＢの赤血球コロニーは、主に、胚ε−グロビン遺伝子（上パネル）を発現するが、グルココルチコイド受容体（ＧＲ、Ｎｒ３ｃ１遺伝子：下パネル）を発現しない。これとは対照的に、１７日目及び１９日目のＥＢからの赤血球コロニーは、主に、胎児γ−グロビン遺伝子（上パネル）、並びに、ＧＲ（下パネル）を発現する。（図４Ｄ）上パネル：１９日間の生体外で分化したＨ１ヒトＥＳ細胞由来のヒト赤芽球の自己再生。下パネル：ＥＰＯ及びインスリン中で分化したヒト赤芽球は、生体外で網状赤血球に成熟する。（図４Ｅ）血液細胞運命への胚様体（ＥＢ）としてのヒトＥＳＣの無血清分化のためのスキーム。図４Ｆ〜４Ｈは、ヒト完全自己再生赤芽球の画像である。（図４Ｆ）ヒトの自己再生赤芽球（ＳＲ）は、赤血球の特異的マーカーＣＤ２３５ａを発現し、大規模な核（ＤＡＰＩ）を含有する。これらの細胞の生体外分化（Ｄｉｆｆ）の結果は、ＤＮＡを欠く小ＲＢＣをもたらす。（図４Ｇ）自己再生（ＳＲ）及び分化した（Ｄｉｆｆ）ｈＥＳＣ由来の赤血球細胞で発現したβ様グロビンのｍＲＮＡの相対レベル。ヒト赤芽球の成熟は、胎児γ−グロビンから成体β−グロビンへのグロビン「スイッチ」に関連する。（図４Ｈ）マウスＥＳＲＥ（ＧＦＰ標識化）は、完全に生体内で成熟し、数週間に亘って生体内でＲＢＣのように循環することができる。（図４Ｉ）赤芽球の増殖の形態（増殖の３６日目）が示されている。

【図4-3】図４Ａ〜４Ｉを含み、ヒトのＨ１ ＥＳ／ＥＢにおける赤血球出現の可能性を示す一連の画像である。（図４Ａ）赤血球前駆細胞の２つの連続波が、ヒトのＥＢから生成する。（図４Ｂ）形態（上）及び赤血球コロニーの細胞組成（下）は、原始的及び完全な赤血球の同一性と一致した形態を明らかにした。（図４Ｃ）１１日〜１９日目のＥＢ（ＥＢＤ１１、ＥＢＤ１９）からの５赤血球コロニーの遺伝子発現解析。１１日目〜１６日目のＥＢの赤血球コロニーは、主に、胚ε−グロビン遺伝子（上パネル）を発現するが、グルココルチコイド受容体（ＧＲ、Ｎｒ３ｃ１遺伝子：下パネル）を発現しない。これとは対照的に、１７日目及び１９日目のＥＢからの赤血球コロニーは、主に、胎児γ−グロビン遺伝子（上パネル）、並びに、ＧＲ（下パネル）を発現する。（図４Ｄ）上パネル：１９日間の生体外で分化したＨ１ヒトＥＳ細胞由来のヒト赤芽球の自己再生。下パネル：ＥＰＯ及びインスリン中で分化したヒト赤芽球は、生体外で網状赤血球に成熟する。（図４Ｅ）血液細胞運命への胚様体（ＥＢ）としてのヒトＥＳＣの無血清分化のためのスキーム。図４Ｆ〜４Ｈは、ヒト完全自己再生赤芽球の画像である。（図４Ｆ）ヒトの自己再生赤芽球（ＳＲ）は、赤血球の特異的マーカーＣＤ２３５ａを発現し、大規模な核（ＤＡＰＩ）を含有する。これらの細胞の生体外分化（Ｄｉｆｆ）の結果は、ＤＮＡを欠く小ＲＢＣをもたらす。（図４Ｇ）自己再生（ＳＲ）及び分化した（Ｄｉｆｆ）ｈＥＳＣ由来の赤血球細胞で発現したβ様グロビンのｍＲＮＡの相対レベル。ヒト赤芽球の成熟は、胎児γ−グロビンから成体β−グロビンへのグロビン「スイッチ」に関連する。（図４Ｈ）マウスＥＳＲＥ（ＧＦＰ標識化）は、完全に生体内で成熟し、数週間に亘って生体内でＲＢＣのように循環することができる。（図４Ｉ）赤芽球の増殖の形態（増殖の３６日目）が示されている。

【図4-4】図４Ａ〜４Ｉを含み、ヒトのＨ１ ＥＳ／ＥＢにおける赤血球出現の可能性を示す一連の画像である。（図４Ａ）赤血球前駆細胞の２つの連続波が、ヒトのＥＢから生成する。（図４Ｂ）形態（上）及び赤血球コロニーの細胞組成（下）は、原始的及び完全な赤血球の同一性と一致した形態を明らかにした。（図４Ｃ）１１日〜１９日目のＥＢ（ＥＢＤ１１、ＥＢＤ１９）からの５赤血球コロニーの遺伝子発現解析。１１日目〜１６日目のＥＢの赤血球コロニーは、主に、胚ε−グロビン遺伝子（上パネル）を発現するが、グルココルチコイド受容体（ＧＲ、Ｎｒ３ｃ１遺伝子：下パネル）を発現しない。これとは対照的に、１７日目及び１９日目のＥＢからの赤血球コロニーは、主に、胎児γ−グロビン遺伝子（上パネル）、並びに、ＧＲ（下パネル）を発現する。（図４Ｄ）上パネル：１９日間の生体外で分化したＨ１ヒトＥＳ細胞由来のヒト赤芽球の自己再生。下パネル：ＥＰＯ及びインスリン中で分化したヒト赤芽球は、生体外で網状赤血球に成熟する。（図４Ｅ）血液細胞運命への胚様体（ＥＢ）としてのヒトＥＳＣの無血清分化のためのスキーム。図４Ｆ〜４Ｈは、ヒト完全自己再生赤芽球の画像である。（図４Ｆ）ヒトの自己再生赤芽球（ＳＲ）は、赤血球の特異的マーカーＣＤ２３５ａを発現し、大規模な核（ＤＡＰＩ）を含有する。これらの細胞の生体外分化（Ｄｉｆｆ）の結果は、ＤＮＡを欠く小ＲＢＣをもたらす。（図４Ｇ）自己再生（ＳＲ）及び分化した（Ｄｉｆｆ）ｈＥＳＣ由来の赤血球細胞で発現したβ様グロビンのｍＲＮＡの相対レベル。ヒト赤芽球の成熟は、胎児γ−グロビンから成体β−グロビンへのグロビン「スイッチ」に関連する。（図４Ｈ）マウスＥＳＲＥ（ＧＦＰ標識化）は、完全に生体内で成熟し、数週間に亘って生体内でＲＢＣのように循環することができる。（図４Ｉ）赤芽球の増殖の形態（増殖の３６日目）が示されている。

【図5】図５Ａ〜５Ｃを含み、制限された、対、広範な赤血球自己再生でのｐ５３の生物学を実証する一連の画像である。（図５Ａ）制限下、または、広範囲のいずれかの自己再生を受ける赤芽球のマイトマイシンＣに対する応答。（図５Ｂ）非アポトーシス及び０．１uＭマイトマイシンＣに暴露されたアポトーシス自己再生赤芽球のイメージングフローサイトメトリー。アポトーシス細胞は、核小疱を形成する。（図５Ｃ）マイトマイシンＣ、または、ビヒクルで処置した赤芽球におけるｐ５３応答性遺伝子の発現（ｑＰＣＲ）。アポトーシスエフェクターＰＥＲＰは、ＥＳＲＥにより発現されない。ｎｄ＝検出せず。

【図6】ｐ５３タンパク質の免疫組織化学的な局在化を示した画像である。上パネル：照射されたマウス脾臓細胞におけるｐ５３は、主に、核である。中間パネル：制限された自己再生を受けた赤芽球におけるｐ５３は、細胞質及び核の両方である。下パネル：広範囲の自己再生を受けた赤芽球におけるｐ５３は、主に、細胞質である。

【図7】Ｂｍｉ−１を過剰発現するヒト胎児肝細胞が、７５日以上の間、増殖し続けたことを実証した画像である。

【図8】後期赤芽球への、Ｂｍｉ−１を過剰発現し、さらに、網状赤血球を形成するために除核する、増殖したヒト胎児肝細胞の成熟を示した画像である。

【図9】Ｂｍｉ−１を過剰発現する細胞を含む培養からのヒト赤芽球の例を示す画像である。

【図10】ＳｔｅｍＳｐａｎ増殖培地からの脂質補充の中止が赤芽球増殖を遅らせることを示すチャートである。

【図11】ＳｔｅｍＰｒｏ３４型拡張培地からの脂質補充の中止が、制限された自己再生（ＳＲＥ）を受けた赤芽球の、「広範囲」の段階に突入し、ＥＳＲＥとなる能力をブロックすることを示すチャートである。

【図12】ＥＳＲＥが、５日間の脂質補充がある場合と、ない場合で培養したとき、Ｂｍｉ１の転写レベルは、脂質を含む対照となる培養物と比較して、「無脂質」状態では減少したことを示すチャートである。

【図13A】図１３Ａ及び図１３Ｂを含む、成体マウス細胞におけるＢｍｉ−１の誘導発現が、強化された自己再生につながることを示す一連のチャートである。図１３Ａは、Ｂｍｉ−１の過剰発現を感染させた（野生型成体マウス由来の）成体骨髄細胞が、空のベクターの対照群と比較して、少なくとも２倍長く増殖し続けていることを示す。図１３Ｂは、Ｂｍｉ−１の過剰発現を感染させた（タンパク質４．１ノックアウトマウス由来の）マウス成体骨髄細胞は、空ベクター対照群と比較して、少なくとも３０日以上増殖し続けていることを示す。

【図13B】図１３Ａ及び図１３Ｂを含む、成体マウス細胞におけるＢｍｉ−１の誘導発現が、強化された自己再生につながることを示す一連のチャートである。図１３Ａは、Ｂｍｉ−１の過剰発現を感染させた（野生型成体マウス由来の）成体骨髄細胞が、空のベクターの対照群と比較して、少なくとも２倍長く増殖し続けていることを示す。図１３Ｂは、Ｂｍｉ−１の過剰発現を感染させた（タンパク質４．１ノックアウトマウス由来の）マウス成体骨髄細胞は、空ベクター対照群と比較して、少なくとも３０日以上増殖し続けていることを示す。

【図14】増殖した細胞（タンパク質４．１ノックアウト細胞；増殖１６日目；下のパネル）が、未成熟赤芽球（ギムザ染色）の形態を有することを示すチャートである。３日間赤血球成熟培地に置かれたとき、これらの未熟赤芽球は、後期赤芽球に成熟し、さらに、網状赤血球を形成するために除核する。これらのデータは、ＥＳＲＥが赤血球特有の疾患を研究するためのモデル系として機能することができる概念をサポートする。

【図15】ヒト赤芽球におけるＢｍｉ−１の誘導発現が、その広範な自己再生につながることを示すチャートである。

【図16A】図１６Ａ〜１６Ｃを含み、ＥＳＲＥの生成を実証する一連の概略図である。１６Ａは、ＥＳＲＥを生成するための２つの方法の概略図であり、それにより、１）ＥＳＲＥは、完全胚性造血前駆細胞の集団を増殖することから誘導することができ、または、２）胎児／成体造血前駆細胞へＢｍｉ１を形質導入し、及び、この細胞集団を増殖する。図１６Ｂは、ヒト胚性幹細胞の多機能状態から除核された赤血細胞への進行が、一連の異なった段階を含むことを示す概略図である。第一に、ヒトＥＳＣは、「完全赤血球前駆細胞」に向かって分化する。完全な可能性が見つかった場合、その後、これらの赤血球細胞は、赤芽球の自己再生を誘導するために、ＥＰＯ、ＳＣＦ、及びＤＥＸでさらに培養される。また、これらの自己再生赤芽球は、最終的に成熟するために、それらの機能的能力を維持する。図１６Ｃは、成体骨髄からの完全赤血球前駆体が、Ｂｍｉ１の過剰発現で形質導入されることを示す概略図であり、その後、Ｂｍｉ１過剰発現による赤血球細胞は、赤芽球の広範な自己再生を誘導するために、ＥＰＯ、ＳＣＦ、及びＤＥＸと一緒に培養を続ける。また、Ｂｍｉ１の過剰発現を有するこれらの自己再生赤芽球は、最終的に成熟するその機能的能力を維持する。

【図16B】図１６Ａ〜１６Ｃを含み、ＥＳＲＥの生成を実証する一連の概略図である。１６Ａは、ＥＳＲＥを生成するための２つの方法の概略図であり、それにより、１）ＥＳＲＥは、完全胚性造血前駆細胞の集団を増殖することから誘導することができ、または、２）胎児／成体造血前駆細胞へＢｍｉ１を形質導入し、及び、この細胞集団を増殖する。図１６Ｂは、ヒト胚性幹細胞の多機能状態から除核された赤血細胞への進行が、一連の異なった段階を含むことを示す概略図である。第一に、ヒトＥＳＣは、「完全赤血球前駆細胞」に向かって分化する。完全な可能性が見つかった場合、その後、これらの赤血球細胞は、赤芽球の自己再生を誘導するために、ＥＰＯ、ＳＣＦ、及びＤＥＸでさらに培養される。また、これらの自己再生赤芽球は、最終的に成熟するために、それらの機能的能力を維持する。図１６Ｃは、成体骨髄からの完全赤血球前駆体が、Ｂｍｉ１の過剰発現で形質導入されることを示す概略図であり、その後、Ｂｍｉ１過剰発現による赤血球細胞は、赤芽球の広範な自己再生を誘導するために、ＥＰＯ、ＳＣＦ、及びＤＥＸと一緒に培養を続ける。また、Ｂｍｉ１の過剰発現を有するこれらの自己再生赤芽球は、最終的に成熟するその機能的能力を維持する。

【図16C】図１６Ａ〜１６Ｃを含み、ＥＳＲＥの生成を実証する一連の概略図である。１６Ａは、ＥＳＲＥを生成するための２つの方法の概略図であり、それにより、１）ＥＳＲＥは、完全胚性造血前駆細胞の集団を増殖することから誘導することができ、または、２）胎児／成体造血前駆細胞へＢｍｉ１を形質導入し、及び、この細胞集団を増殖する。図１６Ｂは、ヒト胚性幹細胞の多機能状態から除核された赤血細胞への進行が、一連の異なった段階を含むことを示す概略図である。第一に、ヒトＥＳＣは、「完全赤血球前駆細胞」に向かって分化する。完全な可能性が見つかった場合、その後、これらの赤血球細胞は、赤芽球の自己再生を誘導するために、ＥＰＯ、ＳＣＦ、及びＤＥＸでさらに培養される。また、これらの自己再生赤芽球は、最終的に成熟するために、それらの機能的能力を維持する。図１６Ｃは、成体骨髄からの完全赤血球前駆体が、Ｂｍｉ１の過剰発現で形質導入されることを示す概略図であり、その後、Ｂｍｉ１過剰発現による赤血球細胞は、赤芽球の広範な自己再生を誘導するために、ＥＰＯ、ＳＣＦ、及びＤＥＸと一緒に培養を続ける。また、Ｂｍｉ１の過剰発現を有するこれらの自己再生赤芽球は、最終的に成熟するその機能的能力を維持する。

【図17】広範囲の自己再生を受ける可能性を最大化するヒト培養条件の最適化を示すチャートである。９日目の胚様体（ＥＢ）からの原始赤血球細胞は、増殖培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ；ＥＰＯ、ＳＣＦ、Ｄｅｘ、ＩＧＦ１、ＥｘＣｙｔｅ）で、自己再生することができない。これらの赤血球細胞は、自己再生細胞分裂より、むしろ最終的な赤血球の成熟を受ける。「ＳｔｅｍＳｐａｎ培地」中で、１６日目または３８日目からの誘導されたＥＢの完全赤芽球は、２〜３週間自己再生する。ヒト化「ＳｔｅｍＳｐａｎ−ＡＣＦ培地」中で、ＥＢ３８日目から誘導された完全赤芽球は、約５〜６週間、自己再生を続行する。

【発明を実施するための形態】

【0040】

本発明は、広範囲に自己再生でき、及び、赤血細胞（ＲＢＣ）に分化する能力を未だ、保持することができる、ヒト細胞集団の生成の発見に関する。これらの細胞は、本明細書では、広範囲に自己再生する赤芽球（ＥＳＲＥ）と称される。本発明の細胞は、とりわけ、ＲＢＣの再生可能な供給源として機能する。

【0041】

一実施形態において、本発明のＥＳＲＥは、完全赤血球前駆体の可能性の出現につながる分化手順を使用して、幹細胞を分化することから生成される。一実施形態において、この方法は、ＥＳＲＥを生体外で生成することが可能な赤血球前駆体の可能性を生成する条件で幹細胞を培養することを含む。一実施形態において、ＥＳＲＥは、増殖培地に分化した幹細胞を配置することによって生成される。一実施形態において、増殖培地は、ＥＰＯ、ＳＣＦ、デキサメタゾン、インスリン様成長因子−１、及び脂質混合物を補充した無血清培地を含む。一実施形態において、本発明の増殖培地中で分化した幹細胞の培養が、分化することなく増殖し続ける、即ち、それらは自己再生分裂を受ける、赤血球前駆体の成長をもたらす。一実施形態において、これらの自己再生赤芽球は、少なくとも４５日間連続して自己再生を続行する。一実施形態において、ＥＳＲＥは、不死化されていない。本発明のＥＳＲＥは、その後、ＲＢＣに分化することができる。一実施形態において、分化培地中のＥＳＲＥの配置が、後期赤芽球及び網状赤血球への成熟をもたらす。一実施形態において、生体内に注入された場合、ＥＳＲＥが分化する。

【0042】

一実施形態において、本発明のＥＳＲＥの生成及び維持は、細胞におけるＢｍｉ−１を活性化する薬剤を細胞に提供することにより改良される。これは、本発明が、Ｂｍｉ−１が赤血球自己再生の中心的な調節剤であるという発見に部分的に基づいているからである。即ち、限定された（ＳＲＥ）自己再生を受けた赤芽球、並びに、初期の複数集団の前赤芽球（ＰｒｏＥ）に比較して、ＥＳＲＥは、Ｂｍｉ−１の高い発現レベルを示すことが観察された。更に、Ｂｍｉ−１を過剰発現する細胞は、７５日間以上に亘って増殖し続けたことが観察された。従って、一実施形態において、本発明は、赤血球自己再生を調節するための方法を含む。一実施形態において、方法は、赤血球前駆体の可能性、Ｂｍｉ−１、または、その変異体、若しくはその断片、及び／または、細胞の赤血球自己再生を調整するのに十分な量のＢｍｉ−１調節剤を有する、細胞を提供すること；及び赤血球の自己再生の調節のために十分な時間で細胞を培養することを含む。一実施形態において、細胞の赤血球自己再生を調節することは、細胞の増殖を促進する。

【0043】

本発明の一実施形態において、Ｂｍｉ−１、または、その変異体若しくはその断片、及び／または、Ｂｍｉ−１調節剤は、小分子、脂質分子、糖、及びその複合体からなる群から選択される。

【0044】

別の実施形態において、Ｂｍｉ−１調節剤は、脂質、リポタンパク質、コレステロール、リン脂質及び脂肪酸を含むが、それらに限定されない。一実施形態において、脂質、リポタンパク質、コレステロール、リン脂質、及び脂肪酸の混合物は、赤血球自己再生を調節するために細胞培養物に補充することができる脂質の供給源である。一実施形態において、Ｂｍｉ−１調節剤は、ヘッジホッグリガンドである。別の実施形態において、Ｂｍｉ−１調節剤は、２５−ヒドロキシコレステロールである。

【0045】

一実施形態において、Ｂｍｉ−１の活性化は、臍帯血細胞または骨髄細胞からＥＳＲＥを生成するために使用することができる。

【0046】

別の実施形態において、本発明は、赤血球の自己再生を調節する薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。方法は、（ｉ）薬剤のための候補物質を提供する段階；（ｉｉ）Ｂｍｉ−１を含む細胞を物質に曝露する段階；及び（ｉｉｉ）Ｂｍｉ−１が調整されるか、否かを決定する段階を含み、ここで、Ｂｍｉ−１が調整されるとき、物質は、赤血球自己再生を調節することができる薬剤であると判定される。

【0047】

本発明は、また、赤血球細胞（ＲＢＣ）へのＥＳＲＥの分化の間に生成された任意の細胞型、または、ＲＢＣの少なくとも１つの特性を示す細胞を含むＥＳＲＥの子孫を含む。一実施形態において、本発明は、ＥＳＲＥ、及び、その子孫細胞を作製する方法を含む。別の実施形態において、本発明は、ＥＳＲＥを誘導するためだけでなく、ＥＳＲＥの子孫のための培養系を含む。様々な実施形態において、本発明は、ＲＢＣを必要とする対象を治療するために、ＥＳＲＥ及びその子孫を使用する方法を含む。一実施形態において、本発明のＥＳＲＥは、ＲＢＣの生成を可能にする。本発明の細胞は、ＲＢＣの制限のない供給源を提供する。

【0048】

一実施形態において、本発明は、幹細胞、または等価の細胞からの増加した数の赤血球前駆細胞を生成または作成するための組成物及び方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ＲＢＣを作製するための新しい方法論を提供する。別の実施形態において、本発明は、赤血球系統に向かって関連づけられた幹細胞分化の傾向を増加させる方法を教示する。

【0049】

一実施形態において、本発明は、組成物、製造された製品（物品）、及び／または、その子孫を含む胚様体（ＥＢ）、若しくは、幹細胞；十分な量の成長因子；ＥＳＲＥの形成（またはそれへの分化）を誘導するための、赤血球系統の関与を促進するための組成物または薬剤、または、その等価物を含む細胞の単離物、混合物、または、培養物を提供する。

【0050】

本発明は、ＥＳＲＥを作製するために、組成物、製造された製品、または本発明の細胞の単離体、混合物または培養物の使用を提供する。

【0051】

一実施形態において、本発明のＥＳＲＥは、赤血球膜の障害、グロビン遺伝子発現の障害、及び赤血球成熟の障害を含む、赤血細胞に固有の疾患の生物学を研究するために使用することができる。

【0052】

一実施形態において、本発明のＥＳＲＥは、所望の遺伝子、及び／または、タンパク質を発現するためのビヒクルとして使用することができる。例えば、本発明のＥＳＲＥ由来のＲＢＣは、所望の遺伝子、及び／または、タンパク質を発現するためのビヒクルとして使用することができる。所望の遺伝子は、遺伝的に、幹細胞の段階で改変することができる（例えば、発明のＥＳＲＥに到達する前に）。あるいは、本発明のＥＳＲＥは、所望の遺伝子を発現させるために、自己再生段階で遺伝的に改変することができる。

【0053】

定義
特に指示のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者により理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。

【0054】

本明細書で使用される場合、以下の各々の用語は、本項でそれと関連する意味を有する。

【0055】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書において、１つ若しくはそれ以上（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的語を意味するために使用される。一例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素またはそれ以上の要素を意味する。

【0056】

量、持続時間などの測定可能な値を意味する場合、本明細書中で使用される「約」は、指定された値からの±２０％、または、±１０％、より好ましくは、±５％、さらにより好ましくは、±１％、及び、尚、より好ましくは、±０．１％の変動を、その様な変動が開示された方法を実施するのに適切であるため、包含することを意味する。

【0057】

用語「異常」は、生物、組織、細胞またはそれらの構成要素の文脈で使用するとき、「正常な」（期待した）それぞれの特徴を提示する、それら生物、組織、細胞またはそれらの構成要素から、少なくとも１つの観察可能な若しくは検出可能な特徴（例えば、年齢、処置、時刻など）において異なる生物、組織、細胞またはそれらの構成要素を指す。一つの細胞または組織タイプに対して、正常な、または、期待される特徴は、異なった細胞または組織タイプに対して、異常であるかもしれない。

【0058】

本明細書で使用する場合、「自家」とは、物質が後に再導入される個体と同一の個体由来の生物学的物質を指す。

【0059】

本明細書で使用される場合、「同種異系」とは、物質が導入される個体の同種の個体と遺伝的に異種の個体由来の生物学的物質を指す。

【0060】

本明細書で使用する用語「基礎培地」とは、アミノ酸、ビタミン、塩、及び、培養中の細胞の増殖をサポートするのに有効である栄養剤の溶液を指すが、追加の化合物を補充しなければ、通常、これらの化合物は、細胞の成長をサポートしない。栄養剤は、細胞により代謝できる炭素源（例えば、グルコースなどの糖）、並びに、細胞の生存に必要な他の化合物が挙げられる。これらは、細胞自体が、化合物（例えば、必須アミノ酸）を合成するのに必要な単数若しくは複数のタンパク質をコードする１つ若しくはそれ以上の遺伝子の非存在のために合成できない化合物であり、または、細胞が合成できる化合物に関しては、特定の発生状態のため、生合成に必要なタンパク質をコードする単数若しくは複数の遺伝子は、十分なレベルまで発現していない。霊長類の胚性幹細胞の成長をサポートする任意の基礎培地が、実質的に未分化状態で使用することができるが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ノックアウト−ＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ）、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２などの多くの基礎培地が、哺乳動物の細胞培養の当該分野では、公知である。

【0061】

用語「Ｂｍｉ−１」は、発生を通して多くの遺伝子の転写抑圧的な状態を維持するために必要な複合体クラスである、ポリコーム群多タンパク質ＰＲＣ−１様複合体の構成成分を意味する。Ｂｍｉ−１は、成体自己再生造血幹細胞の維持のために必要とされる（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｎａｔｕｒｅ ４２３：３０２−３０５）。

【0062】

本明細書で意図するように、「細胞培養培地」という語句は、真核細胞、特に哺乳動物細胞、より詳細にはヒト細胞の成長を維持しやすい任意の培地、特に、任意の液体培地に関する。

【0063】

用語「細胞」及び「細胞の集団」は、相互に交換可能に使用され、複数の細胞、即ち、１個より多くの細胞を意味する。集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団であってもよい。あるいは、集団は、１つより多くの細胞型を含んでもよい。本発明において、細胞集団が含んでもよい細胞型の数に制限はない。

【0064】

本明細書で意図する通り、「造血系統の細胞」という語句は、哺乳動物、特にヒトの血液中に見出される細胞に関し、及び、分化時に、そのような血液細胞を生成しやすい細胞に関する。より具体的には、本発明に基づく「造血系統の細胞」という語句は、赤血球系列の細胞、すなわち、赤血細胞（赤血球とも呼ばれる）、及び、分化時に、直接的に、即ち、１段階で、または、間接的に、即ち、数段階のいずれかで、赤血細胞を生成しやすい細胞に関する。当業者によく知られているように、赤血球系列の細胞は、特に、分化の上昇する程度で分類されて、胚性幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、プロ赤芽球、赤芽球、網状赤血球、除核細胞（特に、除核網状赤血球）、及び、赤血細胞を含む。本発明に基づく造血系統の細胞は、その結果、特に、幹細胞、特に、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの成体幹細胞、並びに、胚様体、また、プロ赤芽球、赤芽球、網状赤血球、及び、除核細胞（特に除核網状赤血球）を包含する。好ましくは、本発明の造血系統の細胞はヒト細胞である。

【0065】

本明細書で使用する場合、用語「凝固因子」は、対象における出血症状の持続時間を予防し、または、減少させる分子、若しくは、その類似体を指す。

【0066】

本明細書で使用される用語「コンパレータ制御」は、疾患状態、例えば、単数若しくは複数の癌性、非癌性状態が知られている対象から事前に収集した、及び保存した試料を用いて、試験試料と同時に決定され得る発現または活性のレべルに関する。

【0067】

用語「分化細胞」は、細胞の分化プロセスにおいて、より特殊化していない細胞型（例えば、幹細胞またはＥＳＲＥ）の細胞由来の、より特殊化した細胞型の細胞を指す。

【0068】

「分化培地」は、完全に分化していない幹細胞、ＥＳＲＥ、または、他のそのような前駆細胞が、培地中で培養した場合、分化した細胞の幾つか、または、すべての特徴を有する細胞に発達するように、添加剤を含むか、または添加剤が欠如した細胞成長培地を参照するために本明細書中で使用される。

【0069】

「疾患」は、動物の健康状態であり、ここで、動物が恒常性を維持することが不可能であり、病気が、その後、改善されない場合、その結果、動物の健康は悪化し続ける。

【0070】

これとは対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持することができるが、しかし障害のない状態にあるよりも、むしろ、動物の健康状態があまり良好でない健康状態である。未治療に放置しても、障害は必ずしも動物の健康状態の更なる低下を引き起こすことにはならない。

【0071】

疾患または障害は、疾患または障害の徴候または症状の深刻度、そのような徴候または症状を患者が経験する頻度、またはその両者が低減するならば、「緩和」される。

【0072】

本明細書で使用する用語「赤血球前駆細胞」とは、赤血細胞に分化することができる赤血細胞の前駆細胞を指す。

【0073】

本明細書で用いる用語「広範囲に増殖した」は、少なくとも約３０、または、それ以上の細胞集団に倍加することを経験した細胞集団を指し、ここで、細胞が非老化であり、不死化されず、元となる細胞種で見られる正常な核型を維持し続ける。

【0074】

本明細書で使用する場合、「説明資料」は、出版物、記録、図面、または化合物、組成物、ベクター、または本明細書に引用した様々な疾患若しくは障害の緩和をもたらすためのキット中の本発明の送達系の有用性を伝達するために使用することができる任意の他の表現媒体を含む。場合により、または、交互に、説明資料は、哺乳動物の細胞または組織における疾患または障害を緩和する１つ若しくはそれ以上の方法を記述することができる。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクター、または送達系を含む容器に貼り付けることができる、または、同定された化合物、組成物、ベクター、または送達系を含む容器と一緒に出荷することができる。また、説明資料は、説明資料及び化合物が、レシピエントの協力により使用することを意図して、容器とは別に出荷することもできる。

【0075】

本明細書で意図する、用語「成長」は、培養細胞の増殖に関連する。本明細書で意図する、用語「分化」は、培地で培養した細胞が最初に細胞培養培地に播種するために使用される細胞には存在しない細胞特徴を取得することに関する。本明細書で意図する、「分化」とは、特に、更に赤血細胞への分化に向かう経路に細胞を関係付ける特徴の取得を意味する。その結果、本発明の細胞培養培地は、胚性幹細胞などの未分化細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）などの成体幹細胞、または、胚様体を成長させるために、及び、網状赤血球、除核細胞、または、赤血細胞にそれらを分化させるために、特に有用である。

【0076】

本明細書で使用する、止血障害は、自発的に、または、フィブリン血栓を形成する能力の障害または不能に起因する外傷の結果としてのいずれかで、出血する傾向により特徴付けられる、遺伝性または後天性の状態を意味する。その様な障害の例としては、血友病が挙げられる。三つの主要な形態は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症、または「クリスマス病」）、及び、血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠損症、軽度の出血傾向）、フォン・ヴィレブランド病、第ＸＩ因子欠損症（ＰＴＡ欠損症）、第ＸＩＩ因子欠損症、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、または、第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常であり、ベルナール・スーリエ症候群は、ＧＰＩｂの欠陥や欠損症である。ｖＷＦのための受容体であるＧＰＩｂは、欠陥があると初期血栓形成（初期止血）の欠如につながり、出血傾向を増加させ、グランツマン及びナエゲイ（グランツマン血小板無力症）の血小板無力症に導くことになる。肝不全（急性及び慢性型）では、肝臓による凝固因子の不十分な生成がある。これは、出血リスクを増加させるかもしれない。

【0077】

「単離された細胞」とは、他の成分から分離された細胞、及び／または、組織または哺乳動物における単離された細胞に自然に付随する細胞を指す。

【0078】

用語「患者」、「対象」、「個体」などは本明細書において交換可能に使用され、そして、任意の動物、または、本明細書に記載の方法に従い、生体外またはその場でのその細胞を指す。ある非限定の実施形態において、患者、対象または個体は、ヒトである。

【0079】

本明細書で使用する場合、「実質的に精製された」細胞は、本質的に他の細胞型が存在しない細胞である。従って、実質的に精製された細胞は、それが通常はその天然に存在する状態に関連付けられている他の細胞型から、精製された細胞を指す。

【0080】

本明細書で用いられる用語「自己再生の実質的な能力」は、細胞の子孫の複数世代の生成をもたらす細胞分裂の多数のサイクルを実行する能力を有することを意味する（従って、各細胞分裂で、１つの細胞が、２つの「娘細胞」を生成し、ここで、少なくとも１つの娘細胞が、更に細胞分裂を行うことが可能である）。「自己再生のための実質的な能力」の一つの尺度は、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の細胞倍加を経験する細胞集団の能力で示される。「自己再生の実質的な能力」の別の尺度は、細胞培養継代後の組織培養容器において、再集団化する、または、コンフルエンスに近づく、細胞集団の能力の維持により示される（同一または類似の培養条件が維持される場合）。従って、「自己再生のための実質的能力」の例は、細胞集団が早期の細胞培養倍加の間（細胞集団が、約１０回より多くの集団倍加を受ける前など）、このような再集団化のために必要な時間の、少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の時間の期間中に組織培養皿に再集団化し続けるときに実証される。「自己再生のための実質的能力」の別の尺度は、集団倍加時間の一定した速度、または、集団倍加時間の一定した、及び比較的速い速度の維持である。

【0081】

「試験薬剤」、または、そうでなければ、本明細書で使用される「試験化合物」は、本明細書に記載の１つ若しくはそれ以上のアッセイにおいてスクリーニングされるべき薬剤または化合物を指す。試験薬剤は、有機小分子、公知の医薬品、ポリペプチド；オリゴ糖及び多糖類などの炭水化物；ポリヌクレオチド；脂質またはリン脂質；脂肪酸；ステロイド；または、アミノ酸類似体を含む多様な一般タイプの化合物を含むが、それらに限定されない。試験薬剤は、天然産物ライブラリー及びコンビナトリアルライブラリーなどのライブラリーから得ることができる。また、短時間で数千の化合物のスクリーニングを可能にする自動化アッセイの方法が公知である。

【0082】

「治療的」処置は、病状の徴候または症状を示す対象に、それらの徴候または症状を減少させるか、または、排除する目的で、投与される処置である。

【0083】

本明細書で使用するように、「疾患または障害を処置する」は、疾患または障害の徴候または症状の患者が経験する頻度、または重症度を低下させることを意味する。

【0084】

本明細書で使用される語句「治療上有効量」は、疾患または障害を予防または治療（発病の遅延または予防；進行の予防；阻止、減少または逆転）するのに、十分な量または有効な量を指す。

【0085】

範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様が、範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に、便宜上、及び、簡潔さのためであることを理解すべきであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、具体的には、すべての可能なサブ範囲、並びに、その範囲内の個々の数値を開示していると考えるべきである。たとえば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、並びに、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などの具体的に開示されたサブ範囲を有すると考えるべきでる。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。

【0086】

説明
本発明は、広範囲に自己再生でき、及び、未だ、赤血細胞（ＲＢＣ）に分化する能力を保持することができるヒト細胞集団の生成の発見に関する。これらの細胞は、本明細書では、広範囲に自己再生する赤芽球（ＥＳＲＥ）と称される。本発明の細胞は、とりわけ、輸血可能なＲＢＣの再生可能な供給源として、機能する。

【0087】

一実施形態において、本発明のＥＳＲＥは、初期赤芽球を表すが、除核ＲＢＣを生成する能力を維持しながら、限界のない増殖能を保持する細胞である。従って、ＥＳＲＥは、血液を生成するための供給源として機能する。

【0088】

一実施形態において、本発明のＥＳＲＥは、完全赤血球前駆体の可能性の出現につながる分化手順を使用して、幹細胞の分化から生成される。幹細胞の例としては、胚性幹細胞、成体幹細胞、ｉＰＳ細胞などを含むが、それに限定されない。典型的な幹細胞の更なる非限定的な例としては、異なる成体または胚性幹細胞；全能性、多能性、若しくは、多分化能性幹細胞または始原細胞もしくは前駆細胞；臍帯血幹細胞；胎盤幹細胞；骨髄幹細胞；羊水幹細胞；神経幹細胞；循環する末梢血幹細胞；間葉系幹細胞；胚性幹細胞；脂肪組織由来の幹細胞；剥離歯由来の幹細胞由来；毛包幹細胞；皮膚幹細胞；単為生殖的に誘導した幹細胞；再プログラムした幹細胞；及び、側集団の幹細胞を含む。

【0089】

ある実施形態において、本発明で使用される幹細胞は多能性である。一実施形態において、多能性幹細胞は、胚幹細胞または胚由来の細胞である。ある実施形態において、多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞である。ある実施形態において、多能性幹細胞は、成体幹細胞である。ある実施形態において、多能性幹細胞は、ヒト細胞である。ある実施形態において、多能性幹細胞は、分化する前に、遺伝的に操作される。

【0090】

一実施形態において、本発明のＥＳＲＥに幹細胞を分化することは、胚様体（ＥＢ）の生成、及び、造血系統への分化の形成を誘導する条件下で幹細胞を培養することを含む。一実施形態において、幹細胞の分化は、所望の造血運命を生成するための成長因子の逐次適用を含む。

【0091】

輸血用の利用可能な血液のために、重要な必要性がある。本発明は、ＲＢＣのための再生可能な供給源として機能するヒトＥＳＲＥを生成するための方法及び組成物を提供する。一実施形態において、本発明のＥＳＲＥ由来のＲＢＣは、輸血可能なＲＢＣの源である。従って、一実施形態において、本発明の細胞は、血液銀行及び輸血に有用である。本発明の細胞及び方法は、また、献血に関する伝統的な依存性を超え、安全で信頼性の高い進歩を提供し、及び、利用可能な血液の深刻な不足を防ぐのを助ける。

【0092】

本発明は、本発明の細胞を生成するために、完全赤血球の運命に対して、原始赤血球の運命を過ぎた幹細胞と区別することが必要であるという発見に基づいている。

【0093】

一実施形態において、この方法は、ＥＳＲＥを生体外で生成することが可能な赤血球前駆体の可能性を発生する条件で幹細胞を培養することを含む。これらのＥＳＲＥは、その後、望ましい分化細胞、例えば、ＲＢＣに分化させることができる。

【0094】

一実施形態において、ＥＳＲＥは、本発明のＥＳＲＥに出発細胞集団の分化を促進する条件下で、出発細胞集団を培養することにより生成される。一実施形態において、出発細胞源は、幹細胞の任意のタイプとすることができる。一実施形態において、幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。

【0095】

一実施形態において、本発明のＥＳＲＥへのヒト多能性幹細胞の分化は、造血運命を生成するための成長因子の逐次適用を含む方法により生体外で達成される。また、培地には、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｓｔｒｏｇｅｎ社）を、細菌汚染を防ぐために含む。一実施形態において、培養の最初の段階は、少なくとも２つの成長因子の存在下で無血清培地中でヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を培養することを含有し、ここで、成長因子は、胚様体へのヒト多能性幹細胞の分化を誘導するのに十分な量である。一実施形態において、成長因子は、胚様体へのヒト多能性幹細胞の分化を誘導するのに十分な時間で存在する。一実施形態において、少なくとも２つの成長因子は、ＢＭＰ４及びＶＥＧＦを含む。従って、本発明は、ＢＭＰ４を約２５ｎｇ／ｍｌの濃度で；ＶＥＧＦを約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、造血系細胞の成長、及び／または、分化のための細胞培養培地に関する。一実施形態において、培養の第一段階は、約２日間（４８時間）、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、ＢＭＰ４は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＶＥＧＦは、約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲である。

【0096】

一実施形態において、培養の第二段階は、少なくとも３つの成長因子の存在下で無血清培地中での培養の第一段階からの細胞を含む細胞培養物を培養することを含有し、ここで、成長因子は、中胚葉分化経路に沿って分化の第一段階からの細胞の分化を誘導するのに十分な量である。一実施形態において、成長因子は、中胚葉分化経路に沿って、培養の第一段階からの細胞の分化を誘導するのに十分な時間で存在する。一実施形態において、少なくとも３つの成長因子は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及び、Ｆｌｔ３Ｌを含む。従って、本発明は、造血系の細胞の成長、及び／または、分化のため、約２５ｎｇ／ｍＬ濃度のＢＭＰ４；約５０ｎｇ／ｍＬ濃度のＶＥＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ濃度のｂＦＧＦ；約１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＦｌｔ３Ｌを含む細胞培養培地に関する。別の実施形態において、ＢＭＰ４は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＶＥＧＦは、約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり；ｂＦＧＦは、約５ｎｇ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；Ｆｌｔ３Ｌは、２ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲である。また、培地は、細菌汚染を防ぐために１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｓｔｒｏｇｅｎ社）を含有することができる。一実施形態において、培養の第二段階は、２日間（４８時間）細胞を培養することを含む。

【0097】

一実施形態において、培養の第三段階は、少なくとも４つの成長因子の存在下で無血清培地中での培養の第二段階からの細胞を含む細胞培養物を培養することを含み、ここで、成長因子は、造血分化経路に沿って分化の第二段階からの細胞の分化を誘導するのに十分な量である。一実施形態において、成長因子は、造血分化経路に沿って分化の第二段階からの細胞の分化を誘導するのに十分な時間で存在する。一実施形態において、少なくとも４つの成長因子は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及び、ＳＣＦを含む。従って、本発明は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度のｂＦＧＦ；約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦ；約１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦｌｔ３Ｌ；約５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＳＣＦを含む造血系の細胞の成長、及び／または、分化のための細胞培養培地に関する。別の実施形態において、ｂＦＧＦは、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇの濃度範囲であり；ＶＥＧＦは、約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇの濃度範囲であり；Ｆｌｔ３Ｌは、２ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＳＣＦは、約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲である。また、培地は、細菌汚染を防ぐために１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有する。一実施形態において、培養の第三段階は、２日間（４８時間）、細胞を培養することを含む。

【0098】

一実施形態において、ＥＳ細胞の分化の第四段階は、少なくとも７つの成長因子の存在下で、無血清培地中で培養することを含み、ここで、成長因子は、造血分化経路に沿ってさらに培養の第三段階からの細胞の分化を誘導するのに十分な量である。一実施形態において、成長因子は、造血分化経路に沿ってさらに培養の第三段階からの細胞の分化を誘導するのに十分な時間で存在する。一実施形態において、少なくとも７つの成長因子は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＴＰＯ、ＩＬ１１、ＩＧＦ１、及びＥＰＯが含まれる。従って、本発明は、約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦ；約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＣＦ；約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ６；約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＰＯ；約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ１１；約２５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＧＦ１；約０．０５Ｕ／ｍＬの濃度のＥＰＯを含む、造血系の細胞の成長、及び／または、分化のための細胞培養培地に関する。一実施形態において、ＶＥＧＦは、約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＳＣＦは、約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＩＬ６は、約２ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＴＰＯは、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＩＬ１１は、約２ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＩＧＦ１は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＥＰＯは、約０．０１Ｕ／ｍＬ〜約０．２Ｕ／ｍＬの濃度範囲である。また、媒地は、汚染を避けるために、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｓｔｒｏｇｅｎ社）を含有する。一実施形態において、培養の第四段階は、２日間（４８時間）、細胞を培養することを含む。

【0099】

一実施形態において、培養の５段階は、少なくとも３つの成長因子の存在下で無血清培地中での培養の第四段階からの細胞を含む細胞培養物を培養することを含み、ここで、成長因子は、造血成熟経路に沿って培養の第四段階からの細胞の分化を誘導するのに十分な量である。一実施形態において、成長因子は、造血成熟経路に沿って培養の第四段階からの細胞の分化を誘導するのに十分な時間で存在する。一実施形態において、少なくとも３つの成長因子は、ＳＣＦ、ＩＧＦ１、及び、ＥＰＯを含む。従って、本発明は、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＣＦ；約２５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＧＦ１；約２Ｕ／ｍＬの濃度のＥＰＯを含む、造血系の細胞の成長、及び／または、分化のための細胞培養培地に関する。一実施形態において、ＳＣＦは、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＩＧＦ１は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲であり；ＥＰＯは、約０．０５Ｕ／ｍＬ〜約５Ｕ／ｍＬの濃度範囲である。一実施形態において、培養の第五段目は、８日目〜３８日目で、細胞を培養することを含む。

【0100】

一実施形態において、本発明は、表１に記載の分化手順を提供する。

【表1】

【0101】

しかし、本発明は、表１に記載されたヒトＥＳ細胞の分化に限定されない。むしろ、本発明は、本発明のＥＳＲＥにより得られる中胚葉／血液の運命へのヒトＥＳ細胞の分化に対する代替アプローチを含む。これは、本発明がｈＥＳＣから出現する完全赤血球前駆細胞は、差次的遺伝子発現及び細胞形態により原始的赤血球前駆細胞と区別できるという発見に、部分的に、基づいているためである。

【0102】

ヒトＥＳ細胞を中胚葉／血液運命に分化するための例示的な代替アプローチは、ヒト胎児肝クローンＢ（ＦＨ−Ｂ−ｈＴＥＲＴ）細胞とＥＳ細胞を共培養すること；ＥＳ細胞におけるＨｏｘＢ４の発現を増加させること；ＥＳ細胞の分化中、ＤＫＫのようなアンタゴニストを使用してＷｎｔシグナル伝達経路を阻害すること；及び、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）欠損間質細胞株ＯＰ９で、ＥＳ細胞を共培養することを含むが、それらに限定されない。参照：Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１６３５−１６４２、Ｋｙｂａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ １０９：２９−３７、Ｐａｌｕｒｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１２：４４１−４５１、及びＶｏｄｙａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｌｏｏｄ １０５：６１７−６２６；これらのそれぞれは、その全体を参照することにより、本明細書に組み入れたものとする。

【0103】

ＥＳＲＥの生成：
一実施形態において、ＥＳＲＥは、本明細書の他の場所で考察したＥＳ細胞の分化手順に起因する完全赤血球前駆細胞集団に由来する。一実施形態において、完全赤血球前駆細胞集団は、表１の手順からのＥＳ細胞の分化の約１７〜４０日の間に発生する。これらの完全赤血球前駆細胞は、ＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）及びＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充したメチルセルロースでコロニーアッセイを実施することにより認識できる。

【0104】

一実施形態において、ＥＳＲＥは、増殖培地に分化したＥＳ細胞を配置することにより生成される。一実施形態において、増殖培地は、２Ｕ／ｍＬのヒト組換えＥＰＯ（Ａｍｇｅｎ社）、１００ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、１０^−６Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社）、４０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン様成長因子−１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、０．４％脂質混合物ＥＸ−ＣＹＴＥ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）及び、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）−ＡＣＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含む。一実施形態において、ヒトＥＳ細胞は、ＥＳＲＥが生体外培養することにより生成できる完全赤血球の可能性を含むために、約１７〜４０日間分化される。一実施形態において、本発明の増殖培地中で分化したＥＳ細胞の培養は、分化することなく増殖し続ける赤血球前駆体の増殖をもたらし、即ち、それらが自己再生分裂を受ける。一実施形態において、これらの自己再生赤芽球は、少なくとも４５日間連続して自己再生を続行する。

【0105】

一実施形態において、所望の細胞集団（例えば、自己再生赤芽球）の増殖は、細胞中のＢｍｉ−１を調節することにより調節できる。これは、本発明の一部が、Ｂｍｉ−１は、赤血球自己再生の中心的な調節剤であるという発見に基づいているからである。従って、本発明は、赤血球自己再生を調節するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、（ｉ）自己再生赤芽球に、自己再生赤芽球の増殖を調節するために十分な量のＢｍｉ−１、または、その変異体、若しくは、その断片、及び／または、Ｂｍｉ−１調節剤を提供し；及び（ｉｉ）増殖の調節のために十分な時間で自己再生赤芽球を培養する段階を含む。自己再生赤芽球に、Ｂｍｉ−１、または、その変異体、若しくは、その断片、及び／または、Ｂｍｉ−１調節剤を提供するための技術は、当該分野で周知である。例えば、技術は、媒地中で細胞を培養すること、及び培地に薬剤を提供することを含む。本発明は、これに限定されない。増殖調節を行うのに十分な量は、適切に、当業者によって決定されることができる。自己再生赤芽球は、当該分野で周知の一般的な技術を用いて培養することができる。増殖の調節のための十分な時間は、本明細書の視点で当業者により、適切に決定することができる。

【0106】

従って、本発明の別の態様によれば、増殖の調節のために十分な量のＢｍｉ−１またはその変異体もしくは断片、及び／または、Ｂｍｉ−１調節剤を含む、自己再生赤芽球の増殖を調節するための組成物が提供される。

【0107】

好ましくは、本発明は、自己再生赤芽球の増殖を促進するための組成物及び方法を提供する。本発明は、当該分野で顕著な効果を提供する。本明細書で使用する場合、用語「増殖の促進」は、自己再生赤芽球の自己再生を促進することを指す。細胞集団に関連した用語「増殖の促進」は、未分化状態を維持する自己再生赤芽球の割合が細胞集団において増加することを意味する。細胞を観察することにより、増殖の促進が発生するか、否かを決定できる。

【0108】

本発明で使用するためのＢｍｉ−１、または、その変異体、若しくは、その断片、及び／または、Ｂｍｉ−１の調節剤は、外因性または内因性であり得る。好ましくは、薬剤は、外因性である。本発明では、外因性のＢｍｉ−１、または、その等価物が細胞に提供され、それにより、細胞の増殖を調節（特に促進）することを可能にする。この効果は、従来予測することができなかった。本発明のＢｍｉ−１、または、その変異体、若しくは、その断片、及び／または、Ｂｍｉ−１調節剤は、内因性であってもよい。この場合には、内因性のＢｍｉ−１は、その効果を高めるために、外因性薬剤を補充してもよい。

【0109】

本発明での使用のためのＢｍｉ−１、及び、その変異体、若しくは、その断片、及び／または、Ｂｍｉ−１調節剤は、核酸、または、タンパク質、若しくは、他の形態であってもよい（例えば、小分子、脂質分子、糖、または、その複合体）。

【0110】

別の実施形態において、本発明のＢｍｉ−１調節剤は、Ｂｍｉ−１の活性化剤を含む。そのような活性化剤は、当該分野で公知の技術を用いて、物質のライブラリーを選別することにより得られる。そのようなＢｍｉ−１活性化剤の例としては、Ｂｍｉ−１のリン酸化状態を制御することができる分子、転写レベルでのＢｍｉ−１の発現を制御することができる分子などを含むが、それらに限定されない。

【0111】

一実施形態において、本発明のＥＳＲＥの生成及び維持は、細胞におけるＢｍｉ−１を活性化する薬剤を細胞に提供することにより改善される。一実施形態において、自己再生赤芽球においてＢｍｉ−１を活性化することは、細胞が７５日間以上増殖し続けることを可能にする。

【0112】

しかし、本発明は、自己再生を促進するために、及び／または、自己再生赤芽球の自己再生を促進するために、Ｂｍｉ−１を活性化することに限定するべきではない。むしろ、本発明は、自己再生を促進する、及び／または、自己再生赤芽球の自己再生を促進するためにヘッジホッグを調整することを含む。

【0113】

ヘッジホッグリガンドは、ヘッジホッグ経路においてシグナルを誘導することにより、ヘッジホッグを調節することができ、そして本発明の組成物及び方法において有用であり得る。非限定のヘッジホッグリガンドの例は、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、デザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、ティギー・ウィンクルヘッジホッグ（Ｔｈｈ）、プルモルファミン、及びオキシステロールを含む。オキシステロールは、天然に発生するコレステロールの酵素的及び非酵素的酸化から誘導される分子である。オキシステロールの例としては、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（２０（Ｓ）−ＯＨＣ）、７β−ヒドロキシコレステロール（７β−ＯＨＣ）、１９−ヒドロキシコレステロール（１９−ＯＨＣ）、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（２２（Ｒ）−ＯＨＣ）、２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（２２（Ｓ）−ＯＨＣ）、２４−ヒドロキシコレステロール（２４−ＯＨＣ）、２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＯＨＣ）、２６−ヒドロキシコレステロール（２６−ＯＨＣ）、天然の２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（ｎａｔ−２０（Ｓ）−ＯＨＣ）、天然の２０（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（ｎａｔ−２０（Ｒ）−ＯＨＣ）、天然の末端にアルキン基を有する２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（ｎａｔ−２０（Ｓ）−ｙｎｅ）、及び天然の２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールのエナンチオマー（ｅｎｔ−２０（Ｓ）−ＯＨＣ）を含むが、それらに限定されない。参照：Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２１：１３０５−１３１５、Ｎａｃｈｔｅｒｇａｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：２１１−２２０、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３１：１８７−１９９；これらのそれぞれは、その全体を参照することにより、本明細書に組み入れたものとする。

【0114】

更に、当業者は、本明細書に例示した本開示及び方法を備えるとき、ヘッジホッグリガンドは、生化学及び細胞生物学の分野で公知の基準により同定することができるので、将来発見されるリガンドも含まれることを認識するであろう。従って、本発明は、本明細書に例示または開示される特定のヘッジホッグリガンド活性体に何ら限定されるものではなく、むしろ、本発明は、当該分野で知られるように、及び、将来、発見されるように有用であることが、通常の技術者（ｒｏｕｔｉｎｅｅｒ）により理解されるこれらの活性化剤を包含する。

【0115】

従って、本発明の一態様は、自己再生赤芽球の自己再生の発生、及び／または、促進を行なうために、臍帯血細胞または骨髄細胞において、Ｂｍｉ−１を活性化する方法を提供する。別の態様において、本発明は、自己再生赤芽球の自己再生を発生し、及び／または、自己複製を促進するために、臍帯血細胞または骨髄細胞においてヘッジホッグを調節する方法を提供する。

【0116】

ＥＳＲＥからのＲＢＣの生成：
一実施形態において、分化培地におけるＥＳＲＥの配置は、それらの後期赤芽球及び網状赤血球への成熟をもたらす。

【0117】

本発明は、時間の広範な期間、ヒト赤芽球を増殖するための組成物及び方法を提供する。これは、本発明が広範な自己再生を受けることができるが、未だ、ＲＢＣに分化する能力を保持することができる、ＥＳＲＥを生成する組成物及び方法を提供するためである。本発明のＥＳＲＥは、生体外で、成熟赤血球を大量に製造するために使用することができる。

【0118】

一実施形態において、本発明は、赤血球細胞と多能性幹細胞由来の除核赤血球細胞を作製し、及び、使用するための組成物及び方法を提供する。

【0119】

従って、本発明は、また、ヒトＥＳＲＥに対して分化した細胞を提供し、ここで、細胞は、ヒトＥＳＲＥの子孫である。ＥＳＲＥの「子孫」は、クローン増殖または分化の結果としてＥＳＲＥ由来の任意の、及び、全ての細胞を指す。本明細書で使用する場合、「始原細胞」は、一連の細胞分裂により、異なる細胞系譜を発生させることを約束する親細胞である。特定の始原細胞型は、時には、マーカーによって同定することができる。「前駆細胞」は、別の細胞がそれから形成された細胞を指す。それは、後に、発生的に成熟した細胞の存在に先行する細胞を包含する。細胞分裂によって特徴付けられる始原細胞の成熟とは対照的に、前駆細胞の発生成熟は、差次的遺伝子発現、またはサイズ、形態、若しくは、位置の変更を含む、任意の数のプロセスまたは事象を含むが、それらに限定されない。本明細書で使用する場合、始原細胞及び前駆細胞の両方は、多能性幹細胞からの子孫であり、多能性幹細胞とは異なる。「発生中間体」の細胞は、多能性幹細胞とは異なり、最終的に分化した細胞型である始原細胞または前駆細胞のいずれかである任意の細胞を指す。

【0120】

本発明のＥＳＲＥには、ＥＳＲＥの集団、及び、複数のＥＳＲＥ（及びその子孫）、及び、ＥＳＲＥの培養物（細胞培養物、及び、子孫の培養物）が挙げられる。ＥＳＲＥの集団、または複数のＥＳＲＥ、またはＥＳＲＥの培養物（またはその子孫）は、このような細胞の集まりがあることを意味する。様々な実施形態において、ＥＳＲＥ集団、複数のＥＳＲＥまたは、ＥＳＲＥの培養物（またはその子孫）は、集団、複数または、培養物における細胞の全数の少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、または、それ以上を表すヒトＥＳＲＥを含む。

【0121】

ＥＳＲＥの集団または複数のＥＳＲＥで、またはＥＳＲＥの培養物において、大部分の細胞は、存在するすべての細胞とは限らないが、ＥＳＲＥを示す特定の発現型マーカーを発現するかもしれず、または、しないかもしれない。このような細胞は、一般的に、存在するＥＳＲＥ総数のより小さいパーセンテージの集団、複数または、培養物に存在する。様々な実施形態において、ＥＳＲＥ集団、複数のＥＳＲＥまたは、ＥＳＲＥの培養物は、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％〜９５％、若しくはそれ以上の（例えば、９６％、９７％、９８％など）の細胞が特定の発現型マーカーを発現する細胞を含む。

【0122】

所定の発現型のマーカーの存在または非存在は、本明細書の他の箇所に開示される方法を用いて決定することができる。それ故、所定の発現型のマーカーの存在または非存在は、マーカーに結合する抗体により決定することができる。従って、マーカーの発現が、所定のＥＳＲＥ集団、複数のＥＳＲＥまたは、ＥＳＲＥの培養物中に存在しているどの、または、どれだけ多くのＥＳＲＥが、マーカーを発現するかを示すために、それぞれのマーカーに結合する抗体により決定することができる。これら、及び、他の発現型マーカーを検出するさらなる方法は、当業者に公知である。

【0123】

一実施形態において、本発明は、本発明の方法により生成されるＥＳＲＥを提供する。一実施形態において、本発明は、本発明の方法により生成される赤血球細胞を提供する。一実施形態において、本発明は、本発明の方法により生成されるＲＢＣを提供する。

【0124】

本発明のＥＳＲＥは、輸血のための安全で、十分な細胞の代替供給源だけでなく、欠陥ＲＢＣ（例えば、低酸素症及び鎌状赤血球貧血症）が関与する状態の治療用に提供するために、十分な量のＲＢＣを生成する機会を提供する。

【0125】

細胞の培養
本発明は、除核赤血細胞（ＲＢＣ）を生成する能力を維持する間、形態学的に、約束された初期赤芽球を表すが、しかし、制限のない増殖能を保持すると思われるヒト細胞集団が生成されたことの予想外の発見から生じる。従って、ＥＳＲＥは、血液の生体外生成のための実行可能な系として機能する。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも４５日間、連続した自己再生を示す。

【0126】

本発明は、また、ヒト赤芽球が長時間（例えば、連続培養の４５日間を通して）に亘って、ヒト胚性幹細胞、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などから、ＲＢＣ、または、網状赤血球の大量生成を可能にするために増殖することができたという発見に基づく。一実施形態において、本発明は、ヒトＥＳＲＥを製造する組成物及び方法を提供し、それにより、ＥＳＲＥが膨大な量のＲＢＣの発生源を提供する。

【0127】

ＥＳＲＥの細胞培養物は、様々な形式を取ることができる。例えば、「接着培養」は、適切な成長培地と接触している細胞が存在し、基材に接着しながら、生存または増殖可能な培地を指す。同様に、「連続流培養」は、細胞の生存性、例えば成長を維持するために、新鮮な培地の連続流中の細胞の培養を指す。

【0128】

一実施形態において、本発明は、少なくともＥＳＲＥ由来のＲＢＣを有する培養系を含む。本明細書の他の箇所で記載した様々な実施形態において、本発明は、ＲＢＣ細胞分化の分析を実施し、ＲＢＣ細胞分化の調節剤をスクリーニングし、同定し、そして、ＲＢＣ細胞分化の調節剤の効果を監視するために、本発明のＥＳＲＥ由来ＲＢＣ細胞培養系を使用する方法を含む。

【0129】

本発明の培養系は、細胞を培養するために有用な、当該分野で公知のいずれかの種類の基質、表面、足場、または、容器を含むことができる。このような容器の非限定的な例としては、細胞培養プレート、皿、フラスコを含む。その他の好適な基材、表面、及び、容器は、以下の文献で、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），１９９４，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｅｌｌｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（ｖｏｌ．１），１９９８，Ｄ．Ｌ．Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｒ．Ｄ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｌ．Ａ．Ｌｅｉｎｗａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００７，Ｊ．Ｒ．Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｂ．Ｏ． Ｐａｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，２００８，Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；及び、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｄｉａ，１９９４，Ｄ．Ｃ．Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｒｇａｎ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ、に記載されている。いくつかの実施形態において、培養系は、二次元足場を含む。他の実施形態において、培養系は、三次元足場を含む。

【0130】

ヒトＥＳＲＥ及びその子孫は、単離した、または精製した、個々の細胞、及び細胞集団及び複数の細胞を含む。本明細書で使用する場合、用語「単離した」、または、「精製した」は、天然の状態から「ヒトの手により」、作られた、または、改変されたことを指す（即ち、それは、元の天然の生体内環境の１つ若しくはそれ以上の構成要素から除去、または、分離されたとき）。単離された組成物は、組成物が天然に存在する生物の他の生物学的成分から、実質的に、分離される必要はない。単離された細胞の例としては、ヒトなどの対象から得られたＥＳＲＥであろう。「単離された」は、また、組成物、例えば、一つまたはそれ以上の汚染物質（即ち、細胞とは異なる、材料及び物質）から分離されたＥＳＲＥを指す。ＥＳＲＥの集団、複数のＥＳＲＥまたは、ＥＳＲＥの培養物（またはそれらの子孫）は、一般的には、天然に関連している細胞及び物質を実質的に含まない。用語「精製された」は、一般的に、多くの、大半の、若しくは、全ての天然に関連する物質が排除された組成物を指す。従って、ＥＳＲＥまたはその子孫は、他の組織成分から分離したときに、実質的に精製されたと見なされる。従って、精製されたというのは、絶対的な純度を必要とはしない。更にその上、「精製された」組成物は、１つ若しくはそれ以上の他の分子と組み合わせることができる。それ故、用語「精製された」とは、組成物の組み合わせを排除しない。精製されたというのは、数値または質量で、少なくとも、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上であり得る。純度は、また、約７０％若しくは８０％、若しくはそれ以上にすることができ、そして、例えば、９０％、またはそれ以上にも大きくすることができる。純度は、例えば、薬学的担体中では、重量％での細胞または分子の量が、重量で、質量の５０％、または６０％より少ない量であり得るが、通常、天然に関連している他の構成成分と比較して、細胞または分子の相対的割合が大きくなるであろう。細胞の集団または細胞の組成物の純度は、当業者に知られる適切な方法により評価することができる。

【0131】

本発明のＥＳＲＥ及びその子孫は、滅菌され、及び滅菌環境に維持することができる。その様なＥＳＲＥ、その複数、集団、及び培養物は、また、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）の投与に好適な液体培地など培地に含まれ得る。

【0132】

ＥＳＲＥ及びその分化した子孫を生成するための方法が、本明細書に提供される。一実施形態において、方法は、組織または血液試料を得ること、試料から１つ若しくはそれ以上の細胞をクローニングすること、形態または成長速度または発現型マーカーの発現プロフィールに基づいて、１つ若しくはそれ以上の細胞を選択することを含み、それにより、ＥＳＲＥを単離する。

【0133】

ＥＳＲＥ集団及び複数のＥＳＲＥの製造方法も、また、提供される。このような方法で、所望数の細胞分裂のために、ＥＳＲＥを増殖し（倍化し）、それにより、増大した数の、または、集団の、または、複数のＥＳＲＥを生成する。細胞培養物内のＥＳＲＥの相対的な割合または量は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上のＥＳＲＥを、細胞の集団または複数の細胞で含む。

【0134】

ＥＳＲＥからＥＳＲＥの分化した子孫細胞（例えば、始原細胞、前駆細胞、発生中間体、分化した細胞、ＲＢＣ）を生成するための方法もまた、提供される。

【0135】

様々な実施形態において、ＥＳＲＥ由来のＲＢＣの製造方法は、１）幹細胞からＥＳＲＥを生成すること、２）ＥＳＲＥをＲＢＣに分化することを含む多段階の方法を含む。一実施形態において、本発明は、ＥＳＲＥ由来のＲＢＣ細胞を含む。一実施形態において、本発明は、ＥＳＲＥ由来のＲＢＣ細胞を製造する方法を含む。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも３０日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも３５日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも４０日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも４５日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも５０日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも５５日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも６０日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも６５日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも７０日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも７５日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも８０日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも８５日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも９０日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも９５日の連続培養を通して増殖することができる。一実施形態において、ＥＳＲＥは、少なくとも１００日の連続培養を通して増殖することができる。

【0136】

様々な実施形態において、ＥＳＲＥ由来のＲＢＣの製造方法は、１）幹細胞からＥＳＲＥを生成し、２）ＥＳＲＥをＲＢＣに分化することを含む多段階の方法である。一実施形態において、本発明は、幹細胞由来のＲＢＣ細胞を含む。一実施形態において、本発明は、幹細胞由来のＲＢＣ細胞を作製する方法を含む。一実施形態において、ＲＢＣは、少なくとも約３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、または１００日中に本発明に基づく幹細胞から生成される。

【0137】

ＥＳＲＥ由来のＲＢＣの品質は、形態学的に検出され、並びに、細胞分化関連マーカーが発現される。ＥＳＲＥ由来のＲＢＣの生体内で機能する能力は、動物モデルを用いて、または、臨床試験中に使用して研究することができる。

【0138】

様々な実施形態において、貯蔵する、貯蔵された、保存する、及び、保存された幹細胞、及び馴化培地は、例えば、個々のＥＳＲＥ、または、その子孫、ＥＳＲＥの集団または複数のＥＳＲＥまたはそれらの子孫、ＥＳＲＥの培養物またはその子孫、ＥＳＲＥの共培養物及びＥＳＲＥの混合集団またはそれらの子孫、並びに、他の細胞型及び馴化培地などの、冷凍する（冷凍された）、または、貯蔵する（貯蔵された）ＥＳＲＥ、及び、馴化培地を含む。ＥＳＲＥ、その子孫、及びそれらの馴化培地は、例えば−２０℃以下、例えば、−７０℃などの極低温条件下で保存または凍結することができる。このような条件の下での保存または貯蔵は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの膜または細胞の保護剤を含むことができる。

【0139】

ＥＳＲＥ、ＥＳＲＥの集団、または複数のＥＳＲＥ、またはＥＳＲＥの培養物、ＥＳＲＥの子孫（例えば、任意のクローン子孫、または、いずれか、若しくは、全ての種々の発生、成熟及び分化段階）、及び、ＥＳＲＥ細胞の馴化培地は、様々な用途のために使用でき、治療及び治療法を含む本発明の方法に従って使用することができる。従って、本発明は、ＥＳＲＥ、ＥＳＲＥの集団、及び、複数のＥＳＲＥ、及び、ＥＳＲＥの培養物、ＥＳＲＥの子孫、及び、ＥＳＲＥの馴化培地を用いる生体内及び生体外治療、及び、治療方法を提供する。

【0140】

ＥＳＲＥ、ＥＳＲＥの集団、または、複数のＥＳＲＥ、または、ＥＳＲＥの培養物、ＥＳＲＥの子孫（例えば、任意のクローン子孫、または、いずれか、若しくは、全ての種々の発生、成熟及び分化段階）、及びＥＳＲＥ細胞の馴化された培地は、細胞ベース、または、培地ベースの治療として、インプラントまたは移植して対象に効果をもたらすために、対象に投与し、または使用できる。

【0141】

治療
本発明は、生体外、及び、生体内の両方の設定で、本発明の細胞の使用を企図する。従って、本発明は、研究目的のための、及び、医学的／獣医学的目的のための、本発明の細胞の使用のために、提供される。研究の設定では、実用的応用の膨大な数が、技術のために存在する。このような応用の一例は、大規模なＲＢＣを生成するために、本発明の細胞を使用することである。ＲＢＣを大量に生成することは、少なくとも臨床輸血のために有益である。

【0142】

一実施形態において、本発明の組成物及び方法から生成されたＲＢＣは、成体及び機能的天然型ＲＢＣの特徴を有している。いくつかの例においては、本発明の組成物及び方法から生成されたＲＢＣは、成体及び機能的天然型ＲＢＣのすべての特徴を有している。

【0143】

一実施形態において、従って、本発明は、（網状赤血球及び成熟赤血細胞を含む）除核赤血球を生成するための生体外の方法を提供する。

【0144】

本発明の方法は、除核した赤血球の均一な集団の大量生成を可能にする。潜在的な細胞収率は、輸血のための臨床要件に適合している。いくつかの例では、細胞の増殖、及び、ＲＢＣの生成のレベルは、１０^７〜１０^６０倍であることが可能である。供給及び感染の安全性の面での輸血用の関心とは別に、本発明により、一人のドナー及び／または自家輸血患者由来の数個のユニットを、容易に、製造することができる。

【0145】

本発明は、また、輸血効果に関して有利である。１２０日に近い寿命を持つ似たような年齢の細胞集団の注入ができ、一方、ドナーから得られたＲＢＣの平均半減期は、変動可能な年齢の細胞の同時存在に起因して２８日間である。これは、必要とする輸血の数を低下させるであろう。

【0146】

いくつかの実施形態では、ＥＳＲＥまたはその子孫は、対象に対して自家性であることが可能である。即ち、方法で使用されるＥＳＲＥ（または馴化培地を生成するために）は、方法に従って治療される対象からの細胞から得られるか、または、誘導される。他の実施形態では、ＥＳＲＥ、ＥＳＲＥの子孫、または、ＥＳＲＥの馴化培地、または、それらの子孫は、対象に対して同種異系であり得る。即ち、方法において使用されるＥＳＲＥ（または馴化培地を生成するためには）は、方法に従って治療される対象とは異なる対象からの細胞から得られるか、または、誘導される。

【0147】

本発明の方法は、また、追加の医薬品または生物製剤の投与のその前に、同時に、若しくは、その後に、ＥＳＲＥ、ＥＳＲＥの子孫、または、ＥＳＲＥの馴化培地の投与を含む。医薬品または生物製剤は、ＥＳＲＥまたはその子孫を活性化または刺激する可能性がある。このような薬剤の非限定的な例としては、例えば、ＥＰＯ、ＳＣＦ、及びＩＧＦ１が挙げられる。

【0148】

遺伝子改変
遺伝的に改変されたか否かにかかわらず本発明の細胞は、止血障害などの血液の疾患または障害を治療するために用いることができる。一実施形態において、本発明の細胞は、止血障害を有する対象における急性の出血エピソードを治療するために使用することができる。

【0149】

遺伝子治療との関連で、本発明の細胞は、レシピエントへの細胞の送達の前に、目的とする遺伝子を用いて処置することができる。いくつかの場合において、このような細胞ベースの遺伝子送達は、対象への組換えタンパク質の投与、または遺伝子療法の形態などの対象への遺伝子送達の他の手段の重要な利点を提示することができる。細胞内に予め挿入された治療遺伝子の送達は、対象の標的細胞への遺伝子治療ベクターの侵入に関連する問題を回避する。

【0150】

従って、本発明は、本発明の方法に従って培養された遺伝的に改変された細胞の使用を提供する。遺伝子改変は、例えば、外来遺伝子（「導入遺伝子」）の発現、または、内因性遺伝子の発現の変化をもたらし得る。そのような遺伝子改変は、治療上の利益を有することができる。あるいは、遺伝子改変は、本発明の組成物の個体への移植後、例えば、そのように改変された細胞を追跡または同定するための手段を提供することができる。細胞を追跡することは、移植され、遺伝的に改変された細胞の移行、同化、及び、生存の追跡を含んでもよい。遺伝子改変は、また、少なくとも第二の遺伝子を含むことができる。第二の遺伝子は、例えば、選択可能な抗生物質耐性遺伝子または別の選択可能マーカーをコードすることができる。

【0151】

細胞を追跡するのに有用なタンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、他の蛍光タンパク質（例えば、強化緑色、シアン、黄色、青色、及び、赤色蛍光タンパク質；（クローンテック社、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のいずれか、または他のタグタンパク質（例えば、ＬａｃＺ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ_６など）が挙げられるが、それらに限定されない。

【0152】

細胞の遺伝子改変の目的が、生物学的に活性な物質の生成のためである場合、物質は、一般的に、特定の障害の治療に有用であるものになる。例えば、血液または骨に関連する特定の因子産物を分泌するように、遺伝的に細胞を改変することが望ましいことがある。

【0153】

本発明の細胞は、遺伝的に、凝固因子のような分子を生成するために、細胞に導入された外因性の遺伝物質を有することにより、改変することができる。更に、そのような分子を生成するために細胞を遺伝的に改変することにより、細胞は、それを必要とする哺乳動物に移植したとき、哺乳動物への付加的な治療効果を得ることができる。例えば、遺伝的に改変された細胞は、哺乳動物における移植部位を隣接する細胞に有益となる分子を分泌することができる。

【0154】

本発明の細胞は、遺伝的に、当業者に公知の任意の方法を用いて改変することができる。参照：例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，．Ｅｄｓ，（１９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。例えば、細胞は、核酸が、導入遺伝子が細胞内で発現されるのに適切な条件下で細胞に導入されるように、導入遺伝子を含む核酸を含有する発現ベクターに曝露され得る。導入遺伝子は、一般的に、適切なプロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチドを含む発現カセットである。ポリヌクレオチドは、タンパク質をコードすることができ、またはそれは、生物学的に活性なＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）をコードすることができる。

【0155】

発現カセット内で、コーディングポリヌクレオチドは、適切なプロモーターに、操作可能に連結される。適切なプロモーターの例としては、原核生物プロモーター及びウイルスプロモーター（例えば、レトロウイルスのＩＴＲ、ＬＴＲ、ヘルペスウイルスＩＥｐ（例えば、ＩＣＰ４−ＩＥｐ及びＩＣＰ０−ＩＥＥｐ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥｐなどの即時型初期ウイルスプロモーター（ＩＥｐ）；及び、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどの他のウイルスプロモーター；及び、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター）を含む。他の適切なプロモーターは、エンハンサーなどの真核生物プロモーター（例えば、ウサギβ−グロビン調節エレメント）；構成的に活性なプロモーター（例えば、β−アクチンプロモーターなど）；シグナル特異的プロモーター（例えば、ＲＵ４８６に応答するプロモーターなどの誘導性プロモーター）、及び、組織特異的プロモーターである。事前定義された細胞の関連で、遺伝子発現を駆動するのに適切なプロモーターを選択することは、当該分野の範囲内である。発現カセットは、１つより多くのコードポリヌクレオチドを含むことができ、そして、それは、必要に応じて、他の要素（例えば、ポリアデニル化配列、膜挿入シグナルまたは分泌リーダーをコードする配列、リボソームエントリー配列、転写調節エレメント（例えば、エンハンサー、サイレンサーなど）など）を含むことができる。

【0156】

導入遺伝子を含む発現カセットは、細胞に導入遺伝子を送達するのに適した遺伝子ベクターに組み込むべきである。望ましい最終用途に応じて、任意のそのようなベクターは、遺伝的に細胞を改変するために用いることができる（例えば、プラスミド；裸のＤＮＡ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、パピローマウイルス、レトロウイルスなどのウイルス）。そのようなベクター内の望ましい発現カセットを構築する任意の方法を使用することができ、その多くが当該分野で公知である（例えば、直接クローニング、相同組換えなど）。ベクターの選択が、主に、一般的に当該分野で公知の、細胞内にベクターを導入するために使用される方法を決定する（例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラン、または、脂質キャリア媒介トランスフェクション、ウイルスベクターによる感染などにより）。

【0157】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、及び他のＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ媒介技術を含む、生体外増幅方法を介して当業者を指導するのに十分な技術の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ １−３（３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ ２００１）に見出される。

【0158】

タンパク質のための核酸は、クローン化されると、当業者は、さまざまな方法で、単数若しくは複数の組換え遺伝子を発現することができる。当業者は所望の導入遺伝子を発現させるために利用可能な多数の発現系に精通していることが予想される。

【0159】

一実施形態において、望ましい導入遺伝子は、凝固因子である。凝固因子は、凝固活性を有するか、または凝固活性を有する分子を活性化する任意の分子を含むことができる。凝固因子は、ポリペプチド、小有機分子、または無機小分子で構成することができる。凝固因子は、それが、少なくともいくつかの凝固活性を維持する限り、変異された凝固因子、または、凝固因子の類似体であり得る。凝固因子は、例として、しかし限定ではなく、Ｂドメインを削除した第ＶＩＩＩ因子を含む第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子（米国特許第４,９９４,３７１号）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、または、第ＸＩＩＩ因子であることができる。一実施形態において、凝固因子は、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子である。別の実施形態において、凝固因子は、変異第ＶＩＩ因子、または、第ＶＩＩａ因子である（参照：例えば、Ｐｅｒｓｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１３５８３）。凝固因子は、外因性経路に関与する因子であり得る。凝固因子は、内因性経路に関与する因子であり得る。或いは、凝固因子は、外因性及び内因性経路の両方に関与する要因となり得る。

【0160】

凝固因子は、ヒト凝固因子、または、例えば、非ヒト霊長類、ブタ、または任意の哺乳動物由来の非ヒト凝固因子であり得る。凝固因子は、キメラ凝固因子であり得る。例えば、凝固因子は、ヒト凝固因子の一部及びブタの一部、または任意の非ヒト凝固因子、または、第一の非ヒト凝固因子の一部及び第二の非ヒト凝固因子の一部を含むことができる。

【0161】

治療
本発明の細胞は、遺伝的に改変されたかどうかにかかわらず、任意の止血障害を治療するために用いることができる。一実施形態において、本発明の細胞を投与することにより、治療することができる止血障害は、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、第ＸＩ因子欠損症（ＰＴＡ欠損症）、第ＸＩＩ因子欠損症、並びに、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、または第ＸＩＩＩ因子における欠損、または、構造異常が挙げられるが、それらに限定されない。

【0162】

本発明の細胞は、止血障害を有する対象を、予防的に、治療するのに使用することができる。本発明の細胞は、止血障害を有する対象において、急性の出血エピソードを治療するために使用することができる。

【0163】

一実施形態において、止血障害は、凝固因子の欠損、例えば、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩ因子欠損の結果である。別の実施形態において、止血障害は、欠損のある凝固因子、例えば、欠損のあるフォンウィルブランド因子の結果でもあり得る。

【0164】

別の実施形態において、止血障害は、後天性の障害でもあり得る。後天性障害は、基礎となる二次疾患または状態から発生するかも知れない。無関係の状態は、癌、自己免疫疾患、または妊娠などが一例としてあり得るが、これらは限定ではない。後天性の障害は、高齢から、または、基礎となる二次障害を治療（例えば癌化学療法）するための薬物治療からもたらされる。

【0165】

別の実施形態において、本発明は、第二の因子と組み合わせて、少なくとも一つの凝固因子を発現するように遺伝的に改変された本発明の細胞の治療上有効量を投与することを含む、止血障害を有する対象を治療する方法に関し、ここで、第２の因子は、止血を促進する少なくとも一つの他の凝固因子、または、薬剤であり得る。一実施形態において、止血を促進する第二の因子または薬剤は、実証された凝固活性を有する任意の治療であることができる。例として、しかし限定ではないが、凝固因子または止血剤は、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノゲン、フォンウィルブランド因子、または、組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）、若しくは、上記の任意の活性化形態を含むことができる。止血剤の凝固因子は、また、抗線維素溶解薬、例えば、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸を含むことができる。

【0166】

生体外スクリーニング方法
本発明によれば、本発明の細胞は、遺伝子プロモーターに操作可能に結合された検出可能なレポーターを含む、組換えプロモーター（例えば、グロビン遺伝子プロモーター）を含むように操作される。候補薬剤は、宿主細胞の生体外細胞培養物に加えられ、そして、レポーター遺伝子の活性を測定する。様々な生体外系は、所望のプロモーターの制御下で、レポーター遺伝子の発現に対する新規化合物の効果を分析するために使用することができる。

【0167】

本発明における使用のためのレポーター遺伝子は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその誘導体、黄色蛍光タンパク質及びその誘導体を含むが、それらに限定されない、検出可能なタンパク質、アルカリホスファターゼ、検出可能な産物を生成するように適合させることができる他の酵素、及び、例えば、免疫学的に（免疫測定法により）検出することができる他の遺伝子産物をコードする。

【0168】

本発明の宿主細胞のスクリーニング系は、２種類のアッセイ：直接活性化アッセイ（アゴニストのスクリーニング）、及び、阻害アッセイ（アンタゴニストのスクリーニング）を可能にする。アゴニストのスクリーニングは、試験化合物を接触させた宿主細胞によるレポーター遺伝子の発現レベルの変化を検出することを含み、一般的に、レポーター遺伝子の発現が低下する。レポーター遺伝子が発現される場合、試験化合物は、プロモーターに影響を与えていない。レポーター遺伝子の発現が減少した場合、試験化合物は、プロモーターに対する抑制薬を開発するための候補である。

【0169】

本発明の薬剤は、細胞ベース、または、無細胞のアッセイを限定なしで含む、ハイスループットアッセイにおけるスクリーニングにより同定される。異なるタイプアッセイが、異なるタイプの薬剤を検出するために使用可能であることは、当業者により理解されるであろう。短期間で数万の化合物のスクリーニングを可能にするように自動化アッセイのいくつかの方法が近年開発されている（参照：例えば、米国特許第５,５８５,２７７号；同第５,６７９,５８２号；及び同第６,０２０,１４１号）。そのようなハイスループットスクリーニング法が、特に好ましい。或いは、本明細書で記載したものなどの単純なレポーター遺伝子ベースの細胞アッセイは、また、非常に望ましい。本発明により提供される、薬剤を試験するためのハイスループットスクリーニングアッセイの使用は、精製されたポリペプチドが多量に利用可能性になり、大幅に促進される。

【0170】

実験実施例
本発明は、以下の実験実施例を参照してさらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示のみの目的で提供され、特に指示のない限り、限定することを意図するものではない。従って、本発明は、決して、以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書中に提供される教示の結果として明らかとなるあらゆる変更も包含すると解釈されるべきである。

【0171】

更なる説明なしで、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を作製し、利用し、及び、特許請求範囲の方法を実施することができることが考えられる。従って、以下の実施例は、具体的には、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘し、そしていかなる方法でも開示の残りを限定するものとして解釈すべきではない。

【0172】

［実施例１］
広範囲に自己再生する赤芽球（ＥＳＲＥ）
本明細書中に提示された結果は、広範囲に自己再生する赤芽球（ＥＳＲＥ）の開発、及び、特徴付けを示す。結果は、ＥＳＲＥが、初期赤芽球を表すが、除核赤血細胞（ＲＢＣ）を生成する能力を維持しながら、明らかに制限のない増殖能を保持する細胞であることを示している。従って、ＥＳＲＥは、血液の生体外生成のための実行可能な系の基盤として機能する約束を提供する。

【0173】

実験は、（１）ヒトＲＢＣの生成を可能にする；（２）非常に高価な成長因子、及び、試薬を含む、大規模培養の現在の非常に高いコストは、より実用的なレベルまで低減可能であることを実証する；及び（３）ＥＳＲＥが薬物スクリーニング及び生物工学における実用的な利点を持つ赤血球生成のための生体外モデルとして使用できることを実証する様に設計された。

【0174】

完全定常状態の赤血球生成
ヒトは、約２．５×１０^１３のＲＢＣの定常状態赤血球量を維持するために、秒あたり、２００万以上のＲＢＣを合成する。図１Ａにまとめたように、ＲＢＣのこれらの膨大な数は、半固体培地中の赤血球細胞のコロニーを形成することが可能な、系統的に拘束された前駆細胞に分化するより少数の造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導される。未成熟の赤血球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）が、形態学的に認識可能な赤血球前駆細胞に成熟する後期赤血球前駆細胞（ＣＦＵ−Ｅ）に分化する。これらの前赤芽球は、順番に、物理的に、骨髄でマクロファージ細胞と相互作用し、３〜４回の成熟細胞分裂を受け（その間にヘモグロビンを蓄積する）、サイズが減少し、そしてそれらの核を凝縮する（Ｂｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ，，１９７８，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ ４：１５５−１７４）。ＣＦＵ−Ｅ、及び、未成熟の赤血球前駆体は、その生存のためにサイトカインであるエリスロポエチン（ＥＰＯ）に非常に依存している（Ｋｏｕｒｙ ａｎｄ Ｂｏｎｄｕｒａｎｔ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：３７８−３８１）。最も成熟した赤血球前駆細胞は、正染性赤芽球と呼ばれるが、若いＲＢＣ（網状赤血球）を形成するために、核押し出しを受ける。網状赤血球は、すべての細胞小器官を失い、両凹形状をとるようにその細胞骨格を再構築し、そして、血流に入り、１２０日間、成熟したＲＢＣとして循環する。

【0175】

赤芽球の自己再生
赤血球「前駆細胞」は、ＥＰＯ、ＳＣＦ及びデキサメタゾンを用いて培養したとき、生体外での増幅が、相対的に制限されるように（１０^５〜１０^６倍）誘導することができる（ｖｏｎ Ｌｉｎｄｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｌｏｏｄ ９４：５５０−５５９；図１Ｂ、上部）。グルココルチコイドが赤血球分化を阻害しながら、ＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）、及び、ＳＣＦ受容体（ｃｋｉｔ）により開始されたシグナル伝達経路は、赤血球前駆細胞の生存、及び、増殖を強化するために相乗作用する（Ｐａｎｚｅｎｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２：３６５８−３６６８；ｖｏｎ Ｌｉｎｄｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｌｏｏｄ ９４：５５０−５５９）。これらの培養骨髄由来の赤血球「前駆細胞」は、ＥＰＯ単独での存在下で培養したとき、除核赤血球に分化する能力を保持し、ＳＣＦ及びデキサメタゾンが、赤芽球の自己再生を刺激することを示す。

【0176】

マウス卵黄嚢及び早期の胎児の肝臓由来の赤血球細胞が、ＥＰＯ、ＳＣＦ、デキサメタゾンで培養したとき、制限された増殖のみならず、生体外での広範な増殖（１０^７〜１０^６０倍）を可能にすることが発見されている（Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ １１７：２７０８−２７１７；図１Ｂ、下部；図２Ａ）。更にその上、この増殖能は、後期の胎児肝臓、または、出生後の骨髄由来の培養物中に以前に見られたものよりもはるかに大きい。これらの細胞は、それらの生体外での培養を通して、前赤芽球細胞の形態を維持し（図２Ｂ）、そして、それらは、細胞表面に低レベルのｔｅｒ１１９（後期赤血球成熟のマーカー）で、ｃｋｉｔ（ＣＤ１１７）を大量に発現する（図２Ｂ）。ＣＦＳＥの標識化研究は、培養中の大多数の赤芽球が、毎日分割することを示している（Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ １１７：２７０８−２７１７）。毎日の細胞分裂を伴う何ヶ月にもわたる長期培養にもかかわらず、これらの未熟赤芽球は、ＥＰＯ、ＳＣＦ、及びデキサメタゾンに依存したままであり、デキサメタゾンを欠く培地に移したとき、除核ＲＢＣ（始原細胞あたり８〜１６個のＲＢＣ）に成熟する可能性を維持する（図２Ｂ）。赤血球成熟は、ｃｋｉｔの損失、及び、ｔｅｒ１１９の細胞表面発現の上方調節に関連付けられる（図２Ｂ）。まとめると、これらの知見は、これらの増殖する赤血球の細胞が、１）対称的自己再生細胞の分裂を受け；２）ＲＢＣの上流で、３〜４回のみの細胞分裂を受け、成熟の前赤芽球の段階にあり；及び、３）生体外で、網状赤血球に成熟することができることを示す。これらの細胞は、「広範囲に自己再生する赤芽球」（ＥＳＲＥ）と呼ばれる。その胚起源に関係なく、ＥＳＲＥ由来の網状赤血球は、骨髄で生成した、完全ＲＢＣに似た、成人型（α、β１、及びβ２）グロビンを発現する。

【0177】

造血系の開発
成体細胞では、すべての血液細胞は、それぞれ、マウス及びヒト胚における、Ｅ１０．５、及び、妊娠５週目で始まるいくつかの血管床において、「造血」内皮から細胞クラスターとして初めて出現するＨＳＣに由来する（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：２９１−３０１；Ｉｖａｎｏｖｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０８，２４１７−２４２７）。ＨＳＣは、その後、生涯造血を維持するために、胎児の肝臓及び周産期の骨髄に播種する。

【0178】

プレＨＳＣの造血
ＨＳＣの前にマウス胚の卵黄嚢で生じる造血前駆細胞の２つの過渡波が同定されている（Ｐａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６：５０７３−５０８４）。最初の波は、マウスで最初の大規模な、有核原始ＲＢＣを生成する原始的赤血球前駆細胞で構成されている。複数の骨髄前駆細胞を伴う第二波は、完全赤血球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）で構成されている（Ｐａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２６：５０７３−５０８４；Ｐａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４５２８−４５３３）。赤血球生成の過渡的、原始的、及び、完全な波は、ヒト及びゼブラフィッシュの胚で同定されており（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７８：５１−６０；Ｂｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４：４１４７−４１５６）、プレＨＳＣ造血の進化的保存性を示す。マウスＥＳ細胞（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：４７３−４８６）、及び、ヒトＥＳ細胞（図３参照）における類似の知見は、分化ＥＳ細胞が、プレＨＳＣ胚の造血を再現するという仮定に導いた。マウス胚及びマウスＥＳ細胞の研究は、ＥＳＲＥが、完全赤血球系統から生成し、及び、ＧＲ発現を欠き、生体外で自己再生することができない原始赤血球系統からは、生成されないことを示す（Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ １１７：２７０８−２７１７）。従って、ＥＳＲＥは、胚卵黄嚢に源を発し、その後、初期の胎児肝臓に移行する、完全赤血球生成の過渡波に対応して、赤血球開発の狭い範囲から排他的に誘導することができる。

【0179】

マウスＥＳＲＥは、生体内での成熟ＲＢＣの波を生成することができる
生体内で分化するＥＳＲＥの能力をテストするために、ＥＳＲＥ培養物は、ＵＢＣ−ＧＦＰマウスから作成した。ＵＢＣ−ＧＦＰマウスの骨髄から選別した対照のＬＳＫ細胞は、他のレシピエントのＮＳＧマウスにＩＶ注射し、そして永続的な網状赤血球及び成熟ＲＢＣを、５日目から生じ、その生着と一貫している（図３、黒線）。重要なことに、ＵＢＣ−ＧＦＰ由来のＥＳＲＥは、７７日間の自己再生培養で成長し、レシピエントのＮＳＧマウスにＩＶ注射した。これらのＧＦＰ＋ＥＳＲＥは、網状赤血球及び成熟ＲＢＣの過渡波に５日目に始まる上昇を起こした（図３、赤線）。イメージングフローサイトメトリーによる、これらＥＳＲＥ由来のＲＢＣの分析は、野生型（非ＧＦＰ）ＲＢＣと比較した場合、それらは通常のサイズ及び形状を有することを示す（図３、右側パネル）。まとめると、これらのデータは、ＥＳＲＥは、長期培養にもかかわらず、変換されず、完全に成熟したＲＢＣに生体内で分化することができるという証拠を提供する。

【0180】

分化するヒトＥＳ／ＥＢにおける原始的及び完全／ＥＭＰの出現
未分化Ｈ１（ＷＡ０１、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ヒトＥＳ細胞は、フィーダー無しで、毎日培地を変える、マトリゲル被覆プレート上の、ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で培養した。表１に概略を示したとおり、細胞は、酵素により、コラゲナーゼＩＶで収穫し、毎週継代し、無血清条件下での血液細胞の運命に分化した。結果は、このヒトＥＳ細胞の分化手順が、赤血球前駆細胞の２波の出現につながったことを示し（図４Ａ）、それは、一般的に、原始的で及び完全赤血球とそれぞれ関連した形態、及び、細胞の含有量を有するコロニーを含んでいた（図４Ｂ）。１１日〜１９日目のＥＢからの５つの分離したコロニーの遺伝子発現を解析した。図４Ｃで示す通り、１１日目と１４日目のＥＢからのコロニーは、主にε−グロビンを発現したが、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）をコードする遺伝子であるＮｒ３ｃ１を発現しなかった。これらのデータは、原始的赤芽球が、主に、胚性グロビンを発現するが、ＧＲを発現しないマウスでの知見と一致していた（Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ １１７：２７０８−２７１７）。１７日、及び、１９日目のＥＢからのコロニーは、主に、γ−グロビン、並びに、ＧＲを発現し、完全赤血球の識別と一致した（図４Ｂ）。これらのデータは、マウスの卵黄嚢で見られる原始的及び完全赤血球生成（Ｐａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９,Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６：５０７３−５０８４）、及び、マウスＥＳ細胞分化（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３,Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：４７３−４８６）の連続波と一致する。実験は、さらに、正常な胚造血を通して、ヒトＥＳ細胞を分化するとき、造血の動態を特徴づけるように設計した。いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ヒトＥＳ細胞における造血可能性の出現が、原始的ＥＭＰ／完全（プレＨＳＣ）造血波の重複により特徴づけられる。

【0181】

赤血球系統特異的マーカーは、さらに、原始的及び完全赤血球細胞を区別するために使用される。実験は、ヒトＥＳ細胞の分化から出現する赤血球前駆細胞の第一及び第二の波に由来するコロニー中で、差動的に発現される遺伝子を試験するように設計することができる。ヒトＥＳ細胞を分化時に出現する原始的及び完全赤血球可能性を明確に区別するための、２〜４つの赤血球系統特異的マーカーを同定することが望ましい。

【0182】

いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ヒトＥＳ細胞を分化することは、初期胚事象を再現し、そして、原始的、及び、ＥＭＰ／完全造血前駆細胞集団の発生の両方につながると考えられている。更に、赤血球系統特異的マーカーのセットは、原始的及び完全赤血球細胞のカテゴリ識別を容易にすることができると期待されている。

【0183】

自己再生する完全赤芽球は、Ｈ１ヒトＥＳ細胞から誘導できる
Ｈ１のヒトＥＳ／ＥＢにおける完全赤血球形成の出現を定義することにより、赤芽球の自己再生培養は、１６〜１９日目のＥＢ細胞を用いて、開始した（ＥＰＯ、ＳＣＦ、デキサメタゾン）。最初の培養は、２０〜３０日間増殖し続けた未熟赤芽球の均一な集団を発生させた（図４Ｄ、上パネル）。ＥＰＯ及びインスリンを含有する成熟培地に置かれたとき、これらの赤芽球は、正染性赤芽球及び網状赤血球に分化した（図４Ｄ、下部パネル）。自己再生ヒト赤芽球は、低いレベルのε−グロビンと一緒に、主として、γ−グロビンを発現し、そして、成熟時に成人β−グロビン遺伝子を上方調節した。これらのデータは、完全自己再生の赤芽球が、ヒトＥＳ／ＥＢから生成され得ることの重要な証拠を提供する。

【0184】

ヒトＥＳＲＥを生成し、その増殖及び成熟を最適化する
ヒトＥＳ細胞から大規模な自己再生能を持つ赤芽球を誘導することは、ヒト胚を使用した実際的かつ倫理的な問題を回避することができる。結果は、現在のヒトＥＳ分化手順（表１）がヒト自己再生の赤芽球のその後の発生を促進することを示している（図４Ｄ）。これらの赤芽球は、広範の期間に、自己再生可能であることを示すことが重要である。ヒト臍帯血からの赤芽球の培養物は、以前に他者が定義した通り、すべての赤芽球が自発的に分化する前に、１０〜１５日間維持することができ、これは、それらの制限された自己再生能力と一致する（ｖｏｎ Ｌｉｎｄｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｌｏｏｄ ９４：５５０−５５９）。いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ＥＳＲＥ培養が広範な自己再生をする証拠として、少なくとも３倍長く確実に増殖し続けることが望ましい。場合によっては、４５日以上の間自己再生するヒトＥＳ細胞からの赤芽球培養物を生成することが望ましい。

【0185】

ＥＳＲＥ培養物は、本明細書の他の箇所で考察するように、ＥＢ分化の特定日から分化したヒトＥＳ細胞を使用して開始される。例示的な現在の無血清のヒトＥＳＲＥ培養条件は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１０^−６Ｍ）、ＩＧＦ１（４０ｎｇ／ｍｌ）及びＥｘＣｙｔｅ（０．４％；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を含む。培養物は、細胞数、生存率の測定、新鮮な培地での部分体積変化を毎日監視する。以前に他者（ｖｏｎ Ｌｉｎｄｅｒｎ，１９９９）が定義した通り、すべての赤芽球が自発的に分化する前に、ヒト臍帯血由来の赤芽球の培養物は、１０〜１５日間維持することができ、これはその制限された自己再生能力と一致する。ヒトＥＳ細胞由来の赤芽球培養物は、毎日監視され、そして、制限された自己再生能力のみならず、広範囲の自己再生能力を備えた赤芽球を生成する能力について試験する。胚、胎児及び成体グロビン遺伝子の発現は、自己再生細胞の「完全」赤血球（主にγ−、及び、β−グロビンの発現）の性質を確認するために、ｑＰＣＲにより特徴付けられる。原始的、対、完全赤血球細胞のより明確なマーカーは、完全赤芽球の識別を容易にすることができる。

【0186】

重要な目標は、大規模な自己再生を受ける胚赤芽球の可能性を最大にするために、ヒト赤芽球の培養条件を最適化することである。現在の手順は、基礎培地としてのＳｔｅｍＳｐａｎのＳＦＥＭに依存する。本明細書中に提示された結果は、具体的に、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）−ＡＣＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含む増殖培地が、ヒトＥＳ細胞由来のヒト赤芽球の生体外での広範な自己再生をサポートすることを示している。マウスＥＳＲＥの増殖をサポートする基礎培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）−ＳＦＥＭ）は、ヒト赤芽球の広範な増殖自己再生をサポートしない。ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）−ＡＣＦとは異なり、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭＩＩ、及び、ＱＢＳＦ６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を含む、その他の基礎培地の初期の研究では、大規模なヒト赤芽球の自己再生をもたらさなかった。従って、マウス細胞を培養するための手順は、ヒト細胞の培養に適用することはできない。

【0187】

自己再生培養物がヒトＥＳＣから誘導することができる効率を向上させるために必要な他の試薬を試験することができる。これは、非常に強力なグルココルチコイド剤であるプロピオン酸フルチカゾンなどの別のステロイドが含まれる。マウスＥＳＲＥの我々の予備的研究は、一番低くて１０^−９Ｍのフルチカゾンの用量が、１０^−６Ｍのデキサメタゾンと同等に有効で赤芽球の自己再生をサポートすることを示した。ＥｘＣｙｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、及び、ヒトＬＤＬは（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を含む、様々な脂質添加物も、また、ヒト赤芽球の自己再生のサポートを最適化するために試験することができる。

【0188】

ヒト赤芽球の培養条件は、広範な自己再生を受ける胚赤芽球の可能性を最大にするように最適化される。培養条件は、ＨＥＭＡ^ｄｅｆ、及び、ＨＥＭＡ^ｓｅｒ培養条件などの他の成体由来のヒト赤芽球により生じた培養条件と比較される（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ，２０１０）。非常に強力なグルココルチコイド剤であるプロピオン酸フルチカゾンを含む、異なったステロイドに対する用量応答は、赤芽球自己再生をサポートするために試験することができる。ＥｘＣｙｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）及びヒトＬＤＬ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を含む、種々の脂質の添加剤は、ヒト赤芽球の自己再生を最適にサポートするために試験することができる。

【0189】

ＥＳＲＥは、培養されたＲＢＣを生成する赤芽球の再生可能な供給源として役立つと考えられている。分化する／分化されたヒトＥＳ細胞の培養物において、完全赤血球前駆細胞を同定することにより、自己再生ヒト赤芽球の培養物、及び、最終的にヒトＥＳＲＥが生成できる。研究は、自己再生赤芽球をヒトＥＳ細胞から生成することができることを示している。本明細書中の他の場所で考察したように、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞に由来する、ヒト赤芽球の自己再生培養物の最適化が、ヒトＥＳＲＥの生成を促進することが期待される。ＥＳＲＥはｐ５３を欠いた胎児及び成体マウスから生成されているので（ｖｏｎ Ｌｉｎｄｅｒｎ，２００１；Ｓｃｈｍｉｄｔ，２００５）、ヒトＥＳ細胞からＥＳＲＥを生成するための別のアプローチは、ｐ５３のノックダウンである。ヒトＥＳ細胞またはヒトＥＳ細胞由来の自己再生赤芽球の分化において、必要に応じて、ヒト新生児及び成体供給源からＥＳＲＥを使用することができる。

【0190】

網状赤血球への自己再生ヒト胚性赤芽球の分化を特徴づける
マウス自己再生の胚性赤芽球は、ＥＰＯ及びインスリンを含む無血清培地を使用して生体外で、ＲＢＣに分化させることができる（Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ １１７：２７０８−２７１７）。複数の手順が、網状赤血球へヒト未熟赤芽球を分化するために利用可能である（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ２０１１）。これらの手順は、２、３または４つの連続相を含む。イメージングフローサイトメトリーは、細胞サイズ、核凝縮、網状赤血球成熟に関連する細胞形状変化、ＲＮＡ及びミトコンドリアの含量の進行性喪失、及び、除核率を含むＲＢＣ成熟のパラメータを定量化するために使用される。胚性、胎児及び成体ヘモグロビンは、セルロースアセテート電気泳動により定量化することができる。ベンジジン陽性、分光光度法によるヘモグロビン含有量、及び、ｑＰＣＲによるグロビン遺伝子発現は、また、生体外で分化したヒトＲＢＣで決定できる。

【0191】

生体内で分化する自己再生赤芽球の能力は、また、免疫不全（ＮＳＧ）マウスモデルを用いて分析することができる。ヒトＥＳ細胞由来の１億の自己再生赤芽球は、成体ＮＳＧマウスにＩＶ注射し、末梢血は、ヒト（グリコホリンＡ＋）、対、マウス（ｔｅｒ１１９＋）のＲＢＣの数をＦＡＣＳにより決定するために、２日おきにサンプリングした。ヒトのＲＢＣが、もはや検出できなくなるまで分析を続行する。生体外で分化されたＥＳＲＥの輸血製品として機能する能力を試験するために、ＥＳＲＥ由来の網状赤血球が、成体ＮＳＧマウスに注入され、その数は経時的に追跡される。ヒトＲＢＣ機能の研究のために、生体内での実験モデルの妥当性が、最近出版された（Ｋｏｂａｒｉ，２０１２）。イメージングフローサイトメトリーは、循環ヒトＲＢＣのサイズ及び形態を分析するために使用される。

【0192】

生体外分化の研究は、現在、ヒトＥＳ細胞から誘導されているヒト自己再生赤芽球を用いて実施できる。広範なヒト自己再生赤芽球は、また、網状赤血球に分化するそれらの潜在能力について試験することができる。限定的、及び、広範ないずれかの自己再生を受けたマウスの赤芽球は、一般的に、９０％〜９５％の高い除核率で生体外での分化が可能である（Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ １１７：２７０８−２７１７）。予備的結果は、ヒト赤芽球が高い除核率を再現することを示唆している。グルココルチコイドの作用に拮抗する分子は、赤血球前駆体の分化の任意の固有的な残留阻害を克服するために使用することができる（Ｌｉｅｂｅｒｂａｕｅｒ，２００５；Ｍｉｈａｒａｄａ，２００６）。赤芽球の生体外分化に対する代替のアプローチは、間質細胞、特にＭＳ５細胞との共培養を含む（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ，２００５）。しかしながら、除核率が、一貫して、５０〜６０％未満であり、または、成熟ＲＢＣのパラメータ、例えば、ヘモグロビン含有量が、正常なＲＢＣのそれに接近していない場合、これらの代替的なアプローチが使用される。

【0193】

ＥＰＯ及びインスリンを使用して、胚ヒト赤芽球の生体外での分化を最適化する
イメージングフローサイトメトリーは、細胞のサイズ、核凝縮、網状赤血球の成熟に関連する細胞形状の変化、ＲＮＡ及びミトコンドリア含量の進行性喪失、及び、除核率を含む、ＲＢＣ成熟のパラメータを定量するために使用することができる。胚性、胎児及び成体ヘモグロビンは、セルロースアセテート電気泳動によって定量化できる。ベンジジン陽性、分光光度法によるヘモグロビン含量、及び、ｑＰＣＲによるグロビン遺伝子発現は、また、生体外で分化したヒトＲＢＣで決定できる。また、ＲＢＣ変形能は、マイクロピペットアッセイを用いて、分析することができる。

【0194】

ヒトＥＳＲＥの誘導、及び、成長、並びに、ヒト赤芽球の培養方法
マウスの胚形成の間に、原始的及び完全赤血球前駆細胞の連続波が、恒常的な造血幹細胞由来の血液系が確立される前に、必要なＲＢＣを提供するために卵黄嚢で出現する。ヒトの胚における研究は、原始的及び完全赤血球系統が同様に卵黄嚢に出現することを示す。いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ＥＳＣは、哺乳類の胚に見られる初期の造血個体発生を再現すると考えられる。卵黄嚢及びＥＳＣの中で完全赤血球前駆細胞は、ＥＳＲＥの供給源となる。

【0195】

実験は、ｈＥＳＣから出現する完全赤血球前駆細胞は、差次的遺伝子発現及び細胞形態により原始的赤血球前駆細胞と区別することができるという仮説をテストするために設計された。例えば、実験で使用される代表的な無血清のｈＥＳＣの分化手順は、図４Ｅに概説されているが、それは、赤血球前駆細胞の２つの波が、Ｈ１のｈＥＳＣ（図４Ａ）に出現することを示している。第一波からの赤血球前駆細胞は、胚様体（ＥＢ）培養の６〜１５日目で出現し、主に、胚（ε）グロビンを発現するが、Ｎｒ３ｃ１を発現しないＲＢＣのコロニーを生成し（図４Ｃ）、これは、原始的赤血球の識別に一致する。これとは対照的に、コロニーは、１６日目の後に、第二波から誘導され、主に、胎児（γ）グロビン及びＮｒ３ｃ１を発現し（図４Ｃ）、これは、完全赤血球の識別と一致する。

【0196】

ｈＥＳＣ／ＥＢから出現する赤血球前駆細胞の２つの波は、メチルセルロースでクローン性コロニーアッセイを使用して特徴化することができる。個々のコロニーを構成する細胞の形態及び遺伝子発現も分析することができる。原始的及び完全赤血球前駆細胞を区別することを助ける候補遺伝子の例は、表２に示されている以下の遺伝子を含むが、それらに限定されない。

【表2】

【0197】

この手順は、また、完全赤血球前駆体出現の再現性とタイミングを決定するために、幾つかの他のＮＩＨで承認されたｈＥＳＣ株、並びに、ヒトｉＰＳ細胞株では、原始的で及び完全赤血球前駆体出現の動態を描写するために適用することができる。

【0198】

いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ｈＥＳＣ／ＥＢが、差次的遺伝子発現、及び、細胞形態により区別することができる原始的及び完全赤血球前駆細胞の重複波を生成すると考えられている。例えば、成熟した原始的赤芽球はより大きく、そして、核：細胞質の比が完全赤芽球に比較して小さい。異なるｈＥＳＣ株における血球出現の動態は変化するが、赤血球前駆細胞の２つの波の連続出現が保存されていると考えられている。

【0199】

完全赤血球前駆細胞を含むｈＥＳＣ由来の分化したｈＥＢは、ヒトＥＳＲＥの供給源として機能する。本明細書中に提示された結果は、完全赤血球前駆細胞は、分化の１６日後に、Ｈ１ ｈＥＳＣ／ＥＢに出現するという証拠を提供する（図４Ｂ、４Ｃ）。無血清自己再生赤芽球培養（ＥＰＯ、ＳＣＦ、Ｄｅｘ）は、１６日目のｈＥＳＣ／ＥＢからの細胞で開始した。これらの初期培養は、２４〜３０日間の自己再生を継続する赤芽球の均質な集団の成長につながった。フローサイトメトリーは、赤血球前駆体の成熟に関連する、形態学的、及び、免疫発現的特徴を視覚化及び定量化するために使用した。図４Ｆに示すように、増殖性赤芽球は、大きい核を有する大きい未熟細胞である（上部パネル）。これらの細胞は、「完全」赤血球の識別からなる、主に、胎児（γ）グロビン（図４Ｇ）を発現する。成熟培地（ＥＰＯ、血清）中のこれらの自己再生赤芽球の分化は、成体（β）グロビン遺伝子の発現（図４Ｇ）を上方調節した、小型の除核されたＲＢＣ（図４Ｆ、下パネル）をもたらした。

【0200】

マウスＥＳＲＥが、生体内でＲＢＣに分化することができることが見出されている。ＧＦＰ＋ＥＳＲＥの輸血は、網状赤血球（若いＲＢＣ）の過渡波をもたらし、循環を４０日間超維持する成熟ＲＢＣの集団がその後に続く（図４Ｈ）。これらのデータは、ＥＳＲＥは、１）非悪性であり、２）５〜６日間で生体内で完全に成熟することができ、及び３）循環における長い機能寿命で通常のＲＢＣを生成することができるという概念をサポートする。

【0201】

ｈＥＳＣ／ＥＢ由来の赤芽球は、その広範な自己再生をサポートする条件下で培養される。グルココルチコイド受容体（ＧＲ）を活性化し、赤血球の成熟を遮断する種々のＧＲアゴニストは、広範囲のヒト赤芽球の自己再生を促進する能力について試験される。培養赤芽球の細胞生存率（トリパン染色）、赤血球成熟（ベンジジン染色）、及び、細胞形態（ギムザ染色）は、定量することができる。ヒト臍帯血由来の赤芽球培養物は、これらの細胞が、約１５日間自己再生するだけなので、「負」の対照として提供される。ヒト自己再生赤芽球は、ヘモグロビン含有量、酸素結合の親和性、及び、レーザー回折を用いたＲＢＣ変形能力のために分析される間質共培養を用いて生体外で分化される。ヒトＲＢＣの生体内での機能は、ヒト特異的赤血球マーカーＣＤ２３５を有する細胞を追跡する、免疫不全（ＮＳＧ）マウスで試験することができる。

【0202】

いかなる特定の理論に拘泥するものではないが、培養条件の最適化は、臍帯血、ヒト赤芽球由来ではなく、ｈＥＳＣ由来の広範な自己再生を促進すると考えられている。ＥＳＲＥは、ｐ５３遺伝子欠損胎児及び成体マウスから生成されているので、ヒト臍帯血液由来、または、骨髄由来赤芽球におけるｐ５３のノックダウンは、ヒトＥＳＲＥを生成するための代替的なアプローチである。また、これらのヒト赤芽球は、それらの成体の対応物と同様に、動物モデルにおいて、生体外での除核ＲＢＣに分化することができ、そして、成体内で機能することができることが期待されている。

【0203】

生体外で分化したヒト胚性幹細胞由来のＥＳＲＥ
ヒトＥＳＣ（ＷＡ０１）は、酵素的（コラーゲンＩＶを用いて：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び機械的（セルスクレーパーを用いて）に、細胞の小さな塊に解離した。いくつかの例においては、表１に示すように、低酸素環境（５％：Ｏ_２）において、Ｈ１ヒト胚性幹細胞（ＷＡ０１）を解離し、無血清の培地中で、順次培養した。ヒト胚性幹細胞は、最初に胚様体（ＥＢ）を形成し、続いて、造血系統に向かって分化する。ＥＢ分化の６日目からは、造血細胞は、懸濁液中に放出され、これらの細胞は、その後の赤芽球増殖培養のために回収した。

【0204】

赤芽球増殖培養は、幹細胞因子、エリスロポエチン及びデキサメタゾンを含む、本明細書の他の箇所で考察した条件下で維持した。いくつかの異なる培地は、ヒト赤芽球の継続的な自己再生を維持する能力について試験した。試験された４つの内の３つの異なる培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ−ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、及び、ＱＢＳＦ６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）は、１０〜１５日間の赤芽球の増殖拡大をサポートしたが、４つの培地の１つ（ＳｔｅｍＳｐａｎ−ＡＣＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））は、５０日間赤芽球の連続増殖をもたらした。増殖した赤芽球（３６日目の増殖）の形態を、図４Ｉに示す。これらの細胞は、高い核：細胞質比を有する前赤芽球の古典的な外観、及び、核を備えた開放クロマチン、及び深い好塩基性の細胞質を有する。これらの細胞の増殖は、ＥＳＲＥの識別と一致している。分化培地中のこれらの細胞の配置は、後期赤芽球及び除核赤血球の成熟をもたらした。

【0205】

一実験において、３８日目のヒトＨ１胚様体から放出された赤芽球が得られ、そして、赤芽球の培養を開始した。簡単に説明すると、ＥＢ分化の３８日目（ＷＡ０１、継代番号３８）から放出された細胞は、無血清のヒト赤血球増殖培地中で２４ウェルの組織培養皿に再懸濁した。この培地は、２Ｕ／ｍＬのヒト組換えＥＰＯ（Ａｍｇｅｎ社）；１００ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）；１０^−６Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社）；４０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン様成長因子−１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）；０．４％の脂質混合物ＥＸ−ＣＹＴＥ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で補充された、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）−ＡＣＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含む。増殖培地を新たに、毎週調製した。細胞は、部分的培地交換により、毎日、１×１０^６以下の細胞／ｍＬに維持した。

【0206】

本明細書中に提示された結果は、連続培養の５０日を通してヒト赤芽球の成功した増殖を示している。これは、ＥＳＲＥがヒト胚性幹細胞に由来することができる原理の証明として機能する。本明細書に提示された結果に基づいて、実験は、ヒト赤芽球のための培養条件を最適化し、広範な自己再生を受ける胚赤芽球の可能性を最大化するために実施できる。

【0207】

本発明の開示に対して特有なのは、ＥＳＲＥが、具体的に、胚形成の間に出現する、最初の「完全」赤血球前駆細胞から誘導することができるという概念である。本明細書に提示された結果は、ＥＳＲＥ集団がヒト胚性幹細胞から生成することができるという証拠を提供する。ヒトＥＳＲＥは、臨床使用のために生体外で成熟赤血細胞を大量に製造するために使用することができる。

【0208】

［実施例２］
ヒト胎児グロビン発現の活性化因子についてスクリーニングするためのＥＳＲＥの使用
ＥＳＲＥの特徴である、ＲＢＣを生成するために、高効率で最終的に成熟する能力とともに通常の倍数性の維持を有する急速な増殖は、多くの実用的な応用を提供する。例えば、ＥＳＲＥが、人工的に操作されたタンパク質組成物を用いてＲＢＣを誘導するために、安定的に組み込まれた導入遺伝子から誘導できる、または、ｓｉＲＮＡノックダウンを行うことができる、更に、ＥＳまたはｉＰＳからＥＳＲＥを誘導する能力は、内因性遺伝子座内の標的化された変更もまた可能にする。このような操作は、ＥＳＲＥ技術の応用を表す。

【0209】

いくつかの例では、ＥＳＲＥは、ヒトβ−グロビン遺伝子の発現に影響を与えることができる化学物質のためのハイスループットスクリーニングを実行するために使用される。変異β−グロビン遺伝子（鎌状赤血球貧血でのような）、または、成体のβ−グロビン遺伝子の発現における有意な減少（β−サラセミア削除において）のいずれかを含む、β−異常ヘモグロビン症は、世界の遺伝性疾患の最も一般的なクラスを表す。変異対立遺伝子の効果は、しかしながら、容易に通常のβ−グロビン遺伝子の発現により逆転される。例えば、鎌状赤血球貧血のマウスモデルは、症状が軽減されるか、または、通常のβ−グロビンの過剰発現時に排除されることを実証するために使用されているが、ヘモグロビンＳのためのヘテロ接合は、ほとんど、常に、良性状態である（Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｌｏｏｄ １０２：４３１２−４３１９）。正常なβ−グロビン発現の提供に向けた臨床経路は、β−グロビン遺伝子クラスター内からの発現が、発生的に調節されているという事実に由来する。胚ε−グロビン及び胎児γ−グロビン遺伝子は、成体では沈黙しているが、潜在的に再活性化することができる。限られた範囲で、そのような「再活性化」治療は、現在、使用されているが、成人患者ではγ−グロビンの発現レベルで控えめな上昇を達成する利用可能な多くの薬剤が存在する（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｌｏｏｄ １２０：２９４５−２９５３）。

【0210】

ＥＳＲＥにおけるヒト胎児γ−グロビン遺伝子の発現を上方調節する化合物に対する、ハイスループットの化学スクリーニングを実施できる。人工的に設計されたヒトβ−グロビン遺伝子座を保有するＥＳＲＥを使用することができる。成体β−グロビン遺伝子は、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎ）のコード配列に置き換えられてきたが、この導入遺伝子において、胎児Ａγ−グロビン遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）のコード配列で置換されている。これらの遺伝子置換は、対応するγ−、及び、β−グロビン制御配列により駆動される発現のための便利な読み出しを提供し、ハイスループット蛍光アッセイに使用することができる。変更されたヒトの導入遺伝子を保有するＥＳＲＥは、これらのマウスの交配から誘導される胚性赤血球組織から生成することができる。

【0211】

胎児γ−グロビンレベルを上昇させることのできる新薬の開発プロセスを開始し、その結果、多数のβ−異常ヘモグロビン症を軽減するのに加えて、このアプローチは、ＥＳＲＥ系がＲＢＣの生成及び機能の障害のための新たな治療法のためのハイスループットスクリーニング用に使用できる原理の証明として機能する。

【0212】

［実施例３］
ｐ５３の生物学と広範な赤血球の自己再生
実験は、ｐ５３が制限された、及び、広範な自己再生を対比した赤芽球において、差次的に規制されているかどうかを決定するために実施した。制限された自己再生を有するをマウス赤芽球は、成体骨髄及び後期胎児の肝臓から培養し、培養の６〜９日目に分析し、Ｅ１０．５の卵黄嚢由来の、１９９日間連続培養したＥＳＲＥと比較した。制限された、及び、広範囲に自己再生する赤芽球集団の両方は、毎日、同じ速度で増殖し、倍増した。培養赤芽球は、１４時間の培養物に添加したマイトマイシンＣを使用して、遺伝毒性傷害に供した。図５Ａで示す通り、ＥＳＲＥは、マイトマイシンＣのすべての試験濃度で、制限下での自己再生した培養物よりもより多く生存可能であった。アポトーシス率は、核小疱形成した赤芽球を同定するために、イメージングフローサイトメトリーを用いて定量した（図５Ｂ）。マイトマイシンＣのすべての濃度において、アポトーシス率は、例えば、マイトマイシンＣの０．１uＭの用量で、制限された自己再生を受ける細胞よりＥＳＲＥで著しく低く、アポトーシスの割合は、ＥＳＲＥで１７％、及び、制限された自己再生を受けた培養物に対しては５２％及び６２％であった。更に、いくつかのｐ５３標的遺伝子のｍＲＮＡ発現は、ｑＰＣＲで定量した。マイトマイシンＣの曝露は、全ての培養物中でのＭｄｍ２の、及び、ＥＳＲＥ中のみでのＰＵＭＡの上方調節と関連していた（図５Ｃ、それぞれ、青色及び赤色バー）。注目すべきは、アポトーシスエフェクターＰＥＲＰは、その定常状態での増殖中、または、マイトマイシンＣ曝露後のどちらにおいてもＥＳＲＥにより発現されなかった（図５Ｃ、黒色バー）。

【0213】

対照である照射マウスの脾臓細胞中のｐ５３は、主に、核である（図６、上段パネル）。ｐ５３は、制限された自己再生を受けた赤芽球における細胞質、及び、核の両方で存在する（図６、中段パネル）。著しく対照的に、ｐ５３は、ＥＳＲＥで、主に、細胞質である（図６、下段パネル）。図５のデータと合わせて、ｐ５３は、広範囲に自己再生した、対、制限された自己再生した赤芽球において、差次的に制御されると考えられている。従って、実験は、ｐ５３機能がＥＳＲＥにおいて下方調節され、その広範な自己再生能に寄与するという仮説を試験するように設計することができる。

【0214】

制限された自己再生、対、広範囲な自己再生を経験する野生型のｐ５３及びｐ５３なしの赤芽球におけるｐ５３の機能を描写する
ｐ５３の機能のメカニズムのより良い理解は、赤血球前駆体の自己再生の規制への洞察を提供し、及び、臍帯血または成体末梢血の単核細胞から、ＥＳＲＥの生成を容易にするために潜在的な標的としてのｐ５３を識別する。結果は、ＥＳＲＥが遺伝毒性ストレスに対しより寛容的であり（図５Ａ）、そして、ｐ５３それ自体及びｐ５３の下流経路は、広範な自己再生、対、制限された自己再生を受けた赤芽球で差次的に規制されている（図６、５Ｃ）証拠を提供する。ｐ５３、ＭＤＭ２、または、ＭＤＭ４のｍＲＮＡレベルにおける有意差は、制限された自己再生、対、広範な自己再生を受けたマウス、対、赤芽球において見い出されていないが、ｐ５３の翻訳後の調節は、劇的に異なるように見える。

【0215】

マイトマイシンＣ、並びに、１、２、４Ｇｙでのγ線照射の両方を使用して、遺伝毒性傷害に対する、制限された自己再生、対、広範な自己再生を受けた赤芽球の差次的応答を確認するために、実験を実施した。細胞数、生存率、アポトーシス率、及び、細胞周期の状態は、イメージングフローサイトメトリーを使用して、ビヒクルで処置したもの／非照射の対照群赤芽球培養物に比較する。野生型、ｐ５３＋／−、及び、ｐ５３−／−の同腹仔から誘導した自己再生の赤芽球の遺伝毒性ストレスに対する応答を、分析することができる。これらの実験は、赤芽球増殖の制限された相の間で、即ち、培養の最初の２週間の間で実施する。増殖率の変動、広範な自己再生培養を生成する性向、及び、ｐ５３＋／−赤芽球における遺伝毒性ストレスに対する応答は、このプロセスのｐ５３調節における役割のさらなる証拠を提供する。いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ヒト細胞におけるｐ５３の欠如は、赤血球の成熟を妨害しないと考えられている。

【0216】

ｐ５３機能喪失のヒト臍帯血からのＥＳＲＥ生成を促進する能力
ＳｈＲＮＡを含むレンチウイルスベクター（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）は、広範な自己再生能力をそれらに付与するために、成体由来の自己再生赤芽球におけるｐ５３をノックダウンするために使用することができる。ｑＰＣＲ及びウェスタンブロットにより分析した種々の程度でノックダウンしたｐ５３を有する赤芽球の培養物は、広範囲に自己再生する能力を試験することができる。ＥＳＲＥにおける遺伝子発現のレンチウイルスによるノックダウンは、ＥＰＯ、ＳＣＦ、及び、デキサメタゾンでの自己再生を受けた赤芽球で２０％〜９５％の遺伝子ノックダウンを達成することができる。重要なことは、ピューロマイシンの選択が、自己再生能を妨害することである。

【0217】

ｐ５３をノックダウンするための実験は、１０〜１５日間、制限された自己再生を受けた臍帯血由来の自己再生するヒト赤芽球において実施することができる。いくつかのｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスベクター（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）が、個別に、培養を開始した後、２〜４日以内に赤芽球に導入することができる。ｐ５３のノックダウンの程度は、ｑＰＣＲ及びウェスタンブロットにより分析することができ、そして、最も効果的な配列が、その後、使用された。

【0218】

いかなる特定の理論に縛られることを望まないが、ｐ５３は、広範な自己再生、対、制限された自己再生を経験したヒト赤芽球において差次的に調節され、及び、減弱したｐ５３機能が、広範な赤芽球の自己再生に関連付けられ、かつ、寄与することが考えられている。細胞生存、細胞分裂、分化、及び老化における下流のｐ５３の効果の一式を考慮すると、それは、具体的に、アポトーシスを変更することが期待されるＰＥＲＰ単独の下方調節が、ｐ５３のノックダウンと比較した場合、自己再生能を拡大するのにより効果的であることを証明する可能性は低い。

【0219】

本発明は、広範な自己再生能力を持つヒト赤芽球の生成に関するものである。本発明のＥＳＲＥは、分化した細胞生成物を生成するために使用することができ、血液単位が、２．５×１０^１２のＲＢＣを含むので、診療所で、特に、規模が問題となる場合で、使用することができる。幾つかの例では、ＥＳＲＥの増殖、及び、分化のためにバイオリアクターを使用することが望ましい。本発明は、ＲＢＣの制限のない供給源を生成するために、組成物及び方法を提供する。成体組織からＥＳＲＥを生成する能力は、個別の血液細胞治療のための基礎を築く。また、本発明の細胞は、異常ヘモグロビン症、細胞骨格障害、及び、ＲＢＣの異常酵素症などの赤血球特有の疾患の生体外モデルの作成を可能にする。

【0220】

［実施例４］
Ｂｍｉ−１は、赤血球自己再生の中心的な調節剤である
本明細書に提示される結果は、Ｂｍｉ−１が赤血球自己再生の中心的な調節剤であることを示している。機能獲得型の実験は、ヒト胎児肝細胞においてＢｍｉ−１を発現するために実施した。実験は、また、骨髄由来細胞においてＢｍｉ−１を発現するように設計された。

【0221】

簡単に説明すると、９週目のヒト胎児肝細胞を解離させ、増殖培地を用いて培養した。増殖の６日後、ヒト細胞は、ＦＵＧＷバックボーン（Ａｄｄｇｅｎｅ社）で、マウスのＢｍｉ−１を含むレンチウイルスを感染させた。空のベクターに感染した細胞は、増殖日３８日目で増殖を止めたが、一方、Ｂｍｉ−１の過剰発現に感染した細胞は、７５日以上の間、増殖（明視野画像）を続けた（図７）。これらの増殖細胞は、未熟な赤芽球（ギムザ染色）の形態を有する。５日間赤血球成熟培地に置かれたとき、これらの未熟赤芽球は、後期赤芽球に成熟し、さらに網状赤血球を形成するために除核される（図８）。図９は、Ｂｍｉ−１の過剰増殖を含む培養からのヒト赤芽球の例を示す。

【0222】

［実施例５］
脂質の補充及び赤芽球の自己再生
本明細書に提示した結果は、赤芽球の自己再生の脂質補充の重要性を示している。例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ増殖培地からの脂質補充の中止が、赤芽球増殖を鈍化させたことが観察された（図１０）。ＳｔｅｍＰｒｏ３４増殖培地からの脂質補充の中止は、「広範な」相に入り、そして、ＥＳＲＥになるためのＳＲＥの能力を封鎖した（図１１）。更に、ＥＳＲＥが、５日間、脂質補充有り、または、なしで培養した場合、Ｂｍｉ１の転写レベルは、脂質を含む対照の培養物と比較して、「無脂質」状態では、低下したことが観察された（図１２）。

【0223】

本明細書に引用された各々及び全ての特許、特許出願、並びに、刊行物の開示は、その全体を参照することにより、本明細書に組み込まれたものとする。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されてきたが、本発明の他の実施形態及び変更は、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者により考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような実施形態及び同等の変更を含むと解釈されるべきことを意図している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17】