特許 6704850 人工核酸分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6704850

(24)【登録日】2020年5月15日

(45)【発行日】2020年6月3日

(54)【発明の名称】人工核酸分子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/67 20060101AFI20200525BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20200525BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20200525BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20200525BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20200525BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/67 ZZNA

   C12N5/10

   A61K48/00

   A61K35/12

   A61K31/7105

   A61K35/76

   !C12P21/02 C

【請求項の数】26

【全頁数】118

(21)【出願番号】特願2016-543590(P2016-543590)

(86)(22)【出願日】2014年12月30日

(65)【公表番号】特表2017-502670(P2017-502670A)

(43)【公表日】2017年1月26日

(86)【国際出願番号】EP2014003480

(87)【国際公開番号】WO2015101414

(87)【国際公開日】20150709

【審査請求日】2017年12月27日

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2013/003946

(32)【優先日】2013年12月30日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】509014386

【氏名又は名称】キュアバック アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス・テース

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１８１４２７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１４３６９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１４３７００（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１３／１４３６９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 RNA Biology，２０１２年，Vol. 9, No. 11，pp. 1319-1330

【文献】 Biochim. Biophys. Acta，１９９６年，Vol. 1305，pp. 151-162

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｐ ２１／００−２１／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ．少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
ｂ．リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ又はリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの機能的変異体に由来する核酸配列を含む少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）と、
ｃ．更なる５’−末端エレメントとして５’−ＵＴＲとを含み、
前記リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの機能的変異体に由来する核酸配列が、その機能的変異体が由来する自然界に存在する３’−ＵＴＲに由来する核酸配列と少なくとも９０％同一であり、
前記５’−ＵＴＲが、５’−ＴＯＰ ＵＴＲであり、５’ＴＯＰモチーフを含まないことを特徴とする人工核酸分子。

【請求項2】

前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、前記人工核酸分子からのタンパク質産生の増強、安定化、及び延長の少なくともいずれかを行う請求項１に記載の人工核酸分子。

【請求項3】

前記３’−ＵＴＲが、前記ＯＲＦと異種である請求項１から２のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項4】

前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、脊椎動物のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ、哺乳類のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ、霊長類のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ、ヒトのリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲを含む真核生物のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ、又はマウスのリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲを含むげっ歯類のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む請求項１から３のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項5】

前記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、レポーター遺伝子をコードしておらず、又はレポーター遺伝子に由来していない請求項１から４のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項6】

前記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、リボソームタンパク質をコードしていない請求項１から５のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項7】

前記３’−ＵＴＲが、ポリ（Ａ）配列もポリアデニル化シグナルも含まないか、又は
前記３’−ＵＴＲが、ポリ（Ａ）配列及びポリアデニル化シグナルの少なくともいずれかを更に含む請求項１から６のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項8】

前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、リボソームタンパク質Ｌ９（ＲＰＬ９）、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）、リボソームタンパク質Ｌ４（ＲＰＬ４）、リボソームタンパク質Ｌ５（ＲＰＬ５）、リボソームタンパク質Ｌ６（ＲＰＬ６）、リボソームタンパク質Ｌ７（ＲＰＬ７）、リボソームタンパク質Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、リボソームタンパク質Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、リボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）、リボソームタンパク質Ｌ２３（ＲＰＬ２３）、リボソームタンパク質Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、リボソームタンパク質Ｌ１８ａ（ＲＰＬ１８Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、リボソームタンパク質Ｌ２１（ＲＰＬ２１）、リボソームタンパク質Ｌ２２（ＲＰＬ２２）、リボソームタンパク質Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、リボソームタンパク質Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、リボソームタンパク質Ｌ２６（ＲＰＬ２６）、リボソームタンパク質Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、リボソームタンパク質Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、リボソームタンパク質Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、リボソームタンパク質Ｌ２９（ＲＰＬ２９）、リボソームタンパク質Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、リボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質Ｌ３５ａ（ＲＰＬ３５Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３８（ＲＰＬ３８）、リボソームタンパク質Ｌ３９（ＲＰＬ３９）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０（ＲＰＬＰ０）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ１（ＲＰＬＰ１）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ２（ＲＰＬＰ２）、リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）、リボソームタンパク質Ｓ３Ａ（ＲＰＳ３Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ４、Ｘ連鎖（ＲＰＳ４Ｘ）、リボソームタンパク質Ｓ４、Ｙ連鎖１（ＲＰＳ４Ｙ１）、リボソームタンパク質Ｓ５（ＲＰＳ５）、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、リボソームタンパク質Ｓ７（ＲＰＳ７）、リボソームタンパク質Ｓ８（ＲＰＳ８）、リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、リボソームタンパク質Ｓ１２（ＲＰＳ１２）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、リボソームタンパク質Ｓ１５（ＲＰＳ１５）、リボソームタンパク質Ｓ１５ａ（ＲＰＳ１５Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、リボソームタンパク質Ｓ１９（ＲＰＳ１９）、リボソームタンパク質Ｓ２０（ＲＰＳ２０）、リボソームタンパク質Ｓ２１（ＲＰＳ２１）、リボソームタンパク質Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、リボソームタンパク質Ｓ２５（ＲＰＳ２５）、リボソームタンパク質Ｓ２６（ＲＰＳ２６）、リボソームタンパク質Ｓ２７（ＲＰＳ２７）、リボソームタンパク質Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７ａ）、リボソームタンパク質Ｓ２８（ＲＰＳ２８）、リボソームタンパク質Ｓ２９（ＲＰＳ２９）、リボソームタンパク質Ｌ１５（ＲＰＬ１５）、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）、リボソームタンパク質Ｌ１４（ＲＰＬ１４）、リボソームタンパク質Ｓ１４（ＲＰＳ１４）、リボソームタンパク質Ｌ１０（ＲＰＬ１０）、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３６（ＲＰＬ３６）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ（ＲＰＬ３６Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、リボソームタンパク質Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、リボソームタンパク質Ｌ８（ＲＰＬ８）、リボソームタンパク質Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、リボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、リボソームタンパク質ＳＡ（ＲＰＳＡ）、ユビキチンＡ−５２残基リボソームタンパク質融合生成物１（ＵＢＡ５２）、遍在的に発現するＦｉｎｋｅｌ−Ｂｉｓｋｉｓ−Ｒｅｉｌｌｙマウス肉腫ウイルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）（ＦＡＵ）、リボソームタンパク質Ｌ２２様１（ＲＰＬ２２Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ３９様（ＲＰＬ３９Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ１０様（ＲＰＬ１０Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、リボソームタンパク質Ｌ３様（ＲＰＬ３Ｌ）、リボソームタンパク質Ｓ２７様（ＲＰＳ２７Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ２６様１（ＲＰＬ２６Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ７様１（ＲＰＬ７Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａシュードジーン（ＲＰＬ１３ＡＰ）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａシュードジーン８（ＲＰＬ３７ＡＰ８）、リボソームタンパク質Ｓ１０シュードジーン５（ＲＰＳ１０Ｐ５）、リボソームタンパク質Ｓ２６シュードジーン１１（ＲＰＳ２６Ｐ１１）、リボソームタンパク質Ｌ３９シュードジーン５（ＲＰＬ３９Ｐ５）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０シュードジーン６（ＲＰＬＰ０Ｐ６）、及びリボソームタンパク質Ｌ３６シュードジーン１４（ＲＰＬ３６Ｐ１４）からなる群から選択される配列の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む請求項１から７のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項9】

前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが、配列番号１０〜配列番号２０５からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる請求項１から８のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項10】

５’−キャップ構造、ポリ（Ｃ）配列、ヒストンステムループ、及びＩＲＥＳモチーフの少なくともいずれかを更に含む請求項１から９のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項11】

前記ヒストンステムループが、配列番号５に係る配列を含む請求項１０に記載の人工核酸分子。

【請求項12】

前記人工核酸分子が、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されており、及び／又は、前記オープンリーディングフレームが、コドンが最適化されている領域を含む請求項１から１１のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項13】

前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量が、野生型オープンリーディングフレームに比べて増加している、及び／又は、前記オープンリーディングフレームのコドンが最適化されている請求項１２に記載の人工核酸分子。

【請求項14】

ＲＮＡ分子である請求項１から１３のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項15】

ｍＲＮＡ分子である請求項１から１４のいずれかに記載の人工核酸分子。

【請求項16】

ａ．オープンリーディングフレーム及びクローニングサイトの少なくともいずれかと、
ｂ．リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ又はリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの機能的変異体に由来する核酸配列を含む少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）と、
ｃ．更なる５’−末端エレメントとして５’−ＵＴＲとを含み、
前記リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの機能的変異体に由来する核酸配列が、その機能的変異体が由来する自然界に存在する３’−ＵＴＲに由来する核酸配列と少なくとも９０％同一であり、
前記５’−ＵＴＲが、５’−ＴＯＰ ＵＴＲであり、５’ＴＯＰモチーフを含まないことを特徴とするベクター。

【請求項17】

前記オープンリーディングフレーム、前記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント、及び／又は前記５’−ＵＴＲは、前記人工核酸分子に関して、請求項２から１５のいずれかで定義される特徴のいずれか１つによって特徴付けられる請求項１６に記載のベクター。

【請求項18】

プラスミドベクター又はウイルスベクターである請求項１６から１７のいずれかに記載のベクター。

【請求項19】

請求項２から１５のいずれかに記載の人工核酸分子を含む請求項１６から１８のいずれかに記載のベクター。

【請求項20】

請求項１から１５のいずれかに記載の人工核酸分子又は請求項１６から１９のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。

【請求項21】

請求項１から１５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項１６から１９のいずれかに記載のベクター、又は請求項２０に記載の細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項22】

１以上の薬学的に許容できるビヒクル、希釈剤、賦形剤、及び１以上のアジュバントの少なくともいずれかを更に含む請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

医薬として使用するための請求項１から１５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項１６から１９のいずれかに記載のベクター、請求項２０に記載の細胞、又は請求項２１から２２のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項24】

ワクチンとして使用するための又は遺伝子治療において使用するための請求項１から１５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項１６から１９のいずれかに記載のベクター、請求項２０に記載の細胞、又は請求項２１から２２のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項25】

請求項１から１５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項１６から１９のいずれかに記載のベクター、請求項２０に記載の細胞、及び請求項２１から２２のいずれかに記載の医薬組成物の少なくともいずれかを含むことを特徴とするキット又はキットオブパーツ。

【請求項26】

使用説明書と、トランスフェクション用の細胞と、アジュバントと、医薬組成物の投与手段と、前記人工核酸分子、前記ベクター、前記細胞、又は前記医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び薬学的に許容できる溶液の少なくともいずれかとを更に含む請求項２５に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オープンリーディングフレームと、３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）と、任意で、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子に関する。本発明は、更に、好ましくは遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種の分野で使用するための、３’−ＵＴＲエレメントを含むベクター、前記人工核酸分子又は前記ベクターを含む細胞、前記人工核酸分子又は前記ベクターを含む医薬組成物、並びに前記人工核酸分子、前記ベクター、及び／又は前記医薬組成物を含むキットに関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種は、現代医学の最も有望且つ急速に発展している方法に属する。これらは、非常に広範囲に亘る疾患を治療するための非常に特異的且つ個人的な選択肢を提供することができる。具体的には、遺伝性の遺伝子疾患だけでなく、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患に加えて、炎症性疾患も、かかる治療アプローチの対象となり得る。また、これらアプローチによってかかる疾患の発症を早期に予防することも考えられる。

【0003】

遺伝子治療の背後にある主な概念的理論は、特定の疾患の病態に関連している遺伝子発現の欠陥を適切に調節することである。遺伝子発現の病理学的変化は、重要な遺伝子産物、例えば、ホルモン等のシグナル伝達因子、ハウスキーピング因子、代謝酵素、構造タンパク質等の欠失又は過剰産生を引き起こす場合がある。遺伝子発現の変化は、転写及び／又は翻訳の誤制御によるだけではなく、特定のタンパク質をコードしているＯＲＦ内部の突然変異による場合もある。病理学的突然変異は、例えば、染色体の異常によって、又は点突然変異若しくはフレームシフト突然変異等のより特異的な突然変異によって引き起こされる場合があり、これらは全て、遺伝子産物の機能を限定したり、場合によっては、機能全てを失わせたりする。しかし、細胞の転写又は翻訳機構に関与しているタンパク質をコードしている遺伝子が突然変異によって影響を受ける場合、転写又は翻訳の誤制御が生じる場合もある。かかる突然変異は、制御機能を有する遺伝子の病理学的なアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを導く場合がある。かかる制御機能を発揮する遺伝子産物をコードしている遺伝子は、例えば、転写因子、シグナル受容体、メッセンジャータンパク質等であり得る。しかし、かかる制御タンパク質をコードしている遺伝子の機能が失われても、特定の状況下では、欠陥のある遺伝子産物の更に下流で作用する他の因子を人工的に導入することによって復帰させることができる。また、異常のある遺伝子自体を置換することを介して、遺伝子治療によってかかる遺伝子の欠陥を補償することもできる。

【0004】

遺伝子ワクチン接種は、選択された抗原（例えば、細菌表面、ウイルス粒子、腫瘍抗原等の特徴的な成分）に対する所望の免疫応答を誘起する。一般的に、ワクチン接種は、現代医学の重要な偉業のうちの１つである。しかし、現在有効なワクチンを利用できる疾患は限定的な数でしかない。したがって、未だ毎年数百万の人々が、ワクチン接種によって予防することができない感染症に冒されている。

【0005】

一般的に、ワクチンは、「第１」世代、「第２」世代、及び「第３」世代のワクチンに更に分類することができる。「第１世代」のワクチンは、典型的に、全生物ワクチンである。これは、ウイルス、細菌等の生病原体及び弱毒化病原体又は殺病原体に基づく。生病原体及び弱毒化病原体のワクチンの主な問題点は、生命に危険を及ぼすような変異体に戻ってしまうリスクがあることである。したがって、かかる病原体は、たとえ弱毒化されていても、本質的に予測不可能なリスクを有している場合がある。死病原体は、特異的免疫応答を発生させるのに望ましいほど有効ではない場合がある。これらリスクを最小限に抑えるために、「第２世代」のワクチンが開発された。これは、典型的に、病原体に由来する所定の抗原又は組み換えタンパク質成分からなるサブユニットワクチンである。

【0006】

遺伝子ワクチン、即ち、遺伝子ワクチン接種用ワクチンは、通常、「第３世代」のワクチンとして理解される。これは、典型的に、インビボで病原体又は腫瘍抗原に特徴的なペプチド又はタンパク質（抗原）の断片を発現させる遺伝的に改変された核酸分子で構成される。遺伝子ワクチンは、患者に投与され、標的細胞によって取り込まれた後に発現する。投与された核酸が発現することにより、コードされているタンパク質が産生される。これらタンパク質が患者の免疫系によって外来タンパク質であると認識された場合、免疫応答が誘発される。

【0007】

上記から分かる通り、遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の両方法は、本質的に、核酸分子を患者に投与し、次いで、コードされている遺伝情報を転写及び／又は翻訳させることに基づいている。或いは、遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療は、治療を受ける患者から特定の身体細胞を単離し、次いで、かかる細胞をエクスビボでトランスフェクトし、処理された細胞を前記患者に再投与することを含む方法を含んでいてもよい。

【0008】

ＤＮＡ及びＲＮＡは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種を行う際に、投与するための核酸分子として用いることができる。ＤＮＡは、比較的安定で取り扱いが容易であることが知られている。しかし、ＤＮＡの使用には、投与されたＤＮＡ断片が患者のゲノムに不所望に挿入されて、欠陥の生じた遺伝子の機能が失われてしまう等の突然変異誘発事象の可能性があるというリスクがある。更なるリスクとして、抗ＤＮＡ抗体の不所望な産生が生じたことがある。別の問題点は、ＤＮＡを投与して得ることができる、コードされているペプチド又はタンパク質の発現レベルが限定的である点である。これは、転写された後で、生じたｍＲＮＡが翻訳されるためには、当該ＤＮＡが核に入らなければならないからである。数ある理由の中でも、投与されるＤＮＡの発現レベルは、ＤＮＡ転写を制御する特定の転写因子の存在に依存する。かかる因子が存在しない場合、ＤＮＡ転写によって満足のいく量のＲＮＡが得られない。その結果、翻訳されるペプチド又はタンパク質のレベルが限定される。

【0009】

遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のためにＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いることによって、不所望のゲノムへの組み込み及び抗ＤＮＡ抗体の産生のリスクが最小限に抑えられるか又はなくなる。しかし、ＲＮＡは、遍在するＲＮＡｓｅによって容易に分解され得る比較的不安定な分子種であると考えられている。

【0010】

インビボでは、ＲＮＡの分解は、ＲＮＡの半減期の制御に寄与している。この効果により真核生物の遺伝子発現の制御が微調整されていると考えられ、立証されている（非特許文献１）。したがって、各自然界に存在するｍＲＮＡは、前記ｍＲＮＡが由来する遺伝子及び発現する細胞型に依存する個々の半減期を有している。このことは、前記遺伝子の発現レベルの制御に寄与している。不安定なＲＮＡは、異なる時点で一過的に遺伝子を発現させるために重要である。しかし、寿命の長いＲＮＡは、別個のタンパク質の蓄積又は遺伝子の連続的発現に関連している場合がある。インビボでは、ｍＲＮＡの半減期は、例えば、インスリン様成長因子Ｉ、アクチン、及びアルブミンのｍＲＮＡについて示されている通り、ホルモン処理等の環境要因にも依存している場合がある（非特許文献２）。

【0011】

遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の場合、通常、安定なＲＮＡが望ましい。これは、通常、ＲＮＡ配列によってコードされている産物がインビボで蓄積されることが望ましいという事実によるものである。他方、ＲＮＡは、好適な剤形に調製されたとき、保存の過程で、及び投与したときに、構造的且つ機能的に一体性を維持しなければならない。したがって、早期に分解又は崩壊するのを防ぐために、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の安定なＲＮＡ分子を提供する努力が行われてきた。

【0012】

核酸分子のＧ／Ｃ含量がその安定性に影響を及ぼす場合があることが報告されている。したがって、多量のグアニン（Ｇ）及び／又はシトシン（Ｃ）残基を含む核酸は、多量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有する核酸よりも機能的に安定であり得る。これに関連して、特許文献１は、コード領域の配列を改変することによって安定化したｍＲＮＡを含有する医薬組成物を提供している。かかる配列改変は、遺伝子コードの縮重を利用する。したがって、あまり好ましくない（ＲＮＡの安定性の観点であまり好ましくない）組み合わせのヌクレオチドを含有するコドンを、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに別のコドンに置換してよい。このＲＮＡの安定化方法は、所望のアミノ酸配列の余地を残してはならない各単一のＲＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列の提供によって限定される。また、このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に制限される。

【0013】

ｍＲＮＡを安定化するための別の選択肢として、自然界に存在する真核生物のｍＲＮＡ分子は、特徴的な安定化エレメントを含有することが見出されている。例えば、真核生物のｍＲＮＡ分子は、５’末端（５’−ＵＴＲ）及び／又は３’末端（３’−ＵＴＲ）に所謂非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、更に５’−キャップ構造又は３’−ポリ（Ａ）テール等の他の構造的特徴を含む。５’−ＵＴＲ及び３’−ＵＴＲは、典型的に、ゲノムＤＮＡから転写されるので、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。５’−キャップ及び３’−ポリ（Ａ）テール（ポリ（Ａ）テール又はポリ（Ａ）配列とも呼ばれる）等の成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造的特徴は、通常、ｍＲＮＡのプロセシング中に転写（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。

【0014】

３’−ポリ（Ａ）テールは、典型的に、転写ｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデノシンヌクレオチドの単調な一続きの配列である。これは、最高約４００個のアデノシンヌクレオチドを含み得る。かかる３’−ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性にとって重要な要素である可能性があることが見出されている。

【0015】

また、α−グロビンｍＲＮＡの３’−ＵＴＲは、α−グロビンｍＲＮＡの周知の安定性にとって重要な因子であり得ることが示されている（非特許文献３）。α−グロビンｍＲＮＡの３’−ＵＴＲは、その存在がインビトロにおけるｍＲＮＡの安定性と相関している特定のリボ核タンパク質複合体（α−複合体）の形成に関与していることが明らかである（非特許文献４）。

【0016】

更に、リボソームタンパク質のｍＲＮＡにおけるＵＴＲについて興味深い調節機能が実証されている：リボソームタンパク質のｍＲＮＡの５’−ＵＴＲは、ｍＲＮＡの成長関連翻訳を制御するが、その調節のストリンジェンシーは、リボソームタンパク質のｍＲＮＡにおけるそれぞれの３’−ＵＴＲによって付与される（非特許文献５）。この機序は、リボソームタンパク質の特異的発現パターンに寄与し、前記リボソームタンパク質は、典型的に、リボソームタンパク質Ｓ９又はリボソームタンパク質Ｌ３２等の幾つかのリボソームタンパク質のｍＲＮＡがハウスキーピング遺伝子と称されるように、一定レベルで転写される（非特許文献６）。したがって、リボソームタンパク質の成長関連発現パターンは、主に、翻訳レベルの調節に起因するものである。

【0017】

ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす因子にかかわらず、投与された核酸分子が標的細胞又は組織によって有効に翻訳されることは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の核酸分子を用いる任意のアプローチにとって非常に重要である。上に引用した例から分かる通り、安定性の調節とともに、大部分のｍＲＮＡの翻訳も、ＵＴＲ、５’−キャップ、及び３’−ポリ（Ａ）テール等の構造的特徴によって調節されている。これに関連して、ポリ（Ａ）テールの長さも同様に翻訳効率にとって重要な役割を果たしている可能性があることが報告されている。しかし、３’−エレメントの安定化は、翻訳を減少させる効果を有している可能性もある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0018】

【特許文献1】国際公開第０２／０９８４４３号パンフレット

【非特許文献】

【0019】

【非特許文献1】Ｆｒｉｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ＲＮＡ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３７（１７）：１−１２

【非特許文献2】Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ＲＮＡ：Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ様ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ，ａｃｔｉｎ，ａｎｄ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．５２８７−５２９１，１９９１

【非特許文献3】Ｒｏｄｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ α−ｇｌｏｂｉｎ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ ｉｓ ａ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｖｅｎｔ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ３’−ｔｏ−５’ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｃａｐｐｉｎｇ，ＲＮＡ，８，ｐｐ．１５２６−１５３７，２００２

【非特許文献4】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｍＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｍＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １９，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ １９９９，ｐ．４５５２−４５６０

【非特許文献5】Ｌｅｄｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ３’−ＵＴＲ ｌｅｎｇｔｈ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ５’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｌｉｇｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｍＲＮＡｓ，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．３４４，２００５，ｐ．２１３−２２０

【非特許文献6】Ｊａｎｏｖｉｃｋ−Ｇｕｒｅｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｏｖｉｎｅ Ｌｉｖｅｒ ｉｓ Ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｔｅ，Ｆｅｅｄ Ｉｎｔａｋｅ，ａｎｄ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．９０，２００７，ｐ．２２４６−２２５２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0020】

本発明の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種に応用するのに好適であり得る核酸分子を提供することにある。具体的には、本発明の目的は、翻訳効率において著しい機能喪失を示すことなしに、早期の分解又は崩壊に対して安定化されているｍＲＮＡ種を提供することにある。また、本発明の目的は、核酸分子によってコードされているそれぞれのタンパク質の発現が増強されることを特徴とする人工核酸分子、好ましくはｍＲＮＡを提供することにある。本発明の１つの具体的な目的は、それぞれのコードされているタンパク質の翻訳効率が増強されるｍＲＮＡを提供することにある。本発明の別の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用することができる優れたｍＲＮＡ種をコードする核酸分子を提供することにある。本発明の更なる目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用するための医薬組成物を提供することにある。要約すると、本発明の目的は、コスト効率が高く且つ簡単なアプローチによって関連技術の上記問題点を克服する改善された核酸種を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0021】

本発明の根底にある目的は、請求する発明主題によって解決される。

【0022】

本発明は、ＤＡＲＰＡにより与えられたＡｇｒｅｅｍｅｎｔ Ｎｏ．ＨＲ００１１−１１−３−０００１の下で、政府よる支援を受けてなされた。当該政府は、本発明における一定の権利を有している。

【0023】

以下の図、配列、及び実施例は、本発明を更に説明することを意図する。これらは、本発明の発明主題を限定することを意図するものではない。
図１〜３は、インビトロ転写によって得ることができるｍＲＮＡをコードしている配列を示す。以下の略記を用いる：
・ｒｐｌ３２：５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’−ＵＴＲ
・ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）：キタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼをコードしているＧＣリッチｍＲＮＡ配列
・Ａ６４：６４アデニレートを含むポリ（Ａ）配列
・ａｇ：ヒトα−グロビンの３’−ＵＴＲの中央のα複合体結合部分
・ｒｐｓ９：ヒトリボソームタンパク質スモール９の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲエレメント
・Ｃ３０：３０シチジレートを含むポリ（Ｃ）配列
・ヒストンＳＬ：（Ｃａｋｍａｋｃｉ，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｗａｇｎｅｒ，Ｚｈｅｎｇ，＆ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｆ Ｍａｒｚｌｕｆｆ，２００８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８（３）：１１８２−９４）から得たヒストンステムループ配列
・アルブミン：ヒトアルブミンの３’−ＵＴＲ

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】ｍＲＮＡ ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号８）をコードしている配列を示す。

【図2】ｍＲＮＡ ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号９）をコードしている配列を示す。ヒトα−グロビンの３’−ＵＴＲの中央のα複合体結合部分をＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のＯＲＦをイタリック体でハイライトする。α−グロビンに由来する３’−ＵＴＲエレメントに下線を引く。

【図3】ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ９−Ａ６４−Ｃ３０−ｈＳＬ（配列番号７）のｍＲＮＡ配列。ヒトリボソームタンパク質スモール９の３’−ＵＴＲをＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のＯＲＦをイタリック体でハイライトする。ｒｐｓ９に由来する３’−ＵＴＲエレメントに下線を引く。

【図4】リボソームタンパク質スモール９の３’−ＵＴＲが、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を著しく増加させることを示す。３’−ＵＴＲを有しないか又はヒトα−グロビン３’−ＵＴＲを含有するｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現と比べて、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する本発明のヒトリボソームタンパク質スモール９の３’−ＵＴＲの効果を調べた。したがって、様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ルシフェラーゼは、明らかに、３’−ＵＴＲを含有しないｍＲＮＡから発現した。しかし、ルシフェラーゼ発現は、周知のα−グロビン３’−ＵＴＲによっては増加しなかった。対照的に、リボソームタンパク質スモール９の３’−ＵＴＲは、ルシフェラーゼ発現を著しく増加させた。三連トランスフェクションについての平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵについては、実施例５．１に要約する。

【図5】ｍＲＮＡ ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号２０６）をコードしている配列を示す。ヒトアルブミンの３’−ＵＴＲをＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のＯＲＦをイタリック体でハイライトする。アルブミンに由来する３’−ＵＴＲエレメントに下線を引く。

【図6】マウスリボソームタンパク質遺伝子ｒｐｓ２１、ｒｐｓ２９、ｒｐｓ９、ｒｐｓ２７、ｒｐｓ２８、ｒｐｓ１９、ｒｐｌ３５ａ、ｒｐｌ１３、ｒｐｌ３６、及びｒｐｌ２３ａに由来する３’−ＵＴＲは、ＨＤＦ細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）において、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることが既に示されている（国際公開第２０１３１４３６９８号）アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡと少なくとも同程度まで、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることを示す。

【図7】マウスリボソームタンパク質遺伝子ｒｐｓ２１、ｒｐｓ２９、ｒｐｓ９、ｒｐｓ２７、ｒｐｓ２８、ｒｐｓ１９、ｒｐｌ３５ａ、ｒｐｌ１３、ｒｐｌ３６、及びｒｐｌ２３ａに由来する３’−ＵＴＲは、ＨｅＬａ細胞において、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることが既に示されている（国際公開第２０１３１４３６９８号）アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡと少なくとも同程度まで、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることを示す。

【図8】マウスリボソームタンパク質遺伝子ｒｐｌ２３、ｕｂａ５２、ｒｐｌ２２ｌ１、ｒｐｌ３６ａ、ｒｐｓ４ｘ、ｒｐｌ２７、ｒｐｌ３、ｒｐｓ２３、ｒｐｓ１３、ｒｐｌ２６、ｒｐｓ１７、ｒｐｓ１８、ｒｐｓ８、Ｆａｕ、ｒｐｓ１３、ｒｐｌ１１、及びｒｐｌ３８に由来する３’−ＵＴＲは、ＨＤＦ細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）において、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることが既に示されている（国際公開第２０１３１４３６９８号）アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡと少なくとも同程度まで、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることを示す。

【図9】マウスリボソームタンパク質遺伝子ｒｐｌ２３、ｕｂａ５２、ｒｐｌ２２ｌ１、ｒｐｌ３６ａ、ｒｐｓ４ｘ、ｒｐｌ２７、ｒｐｌ３、ｒｐｓ２３、ｒｐｓ１３、ｒｐｌ２６、ｒｐｓ１７、ｒｐｓ１８、ｒｐｓ８、Ｆａｕ、ｒｐｓ１３、ｒｐｌ１１、及びｒｐｌ３８に由来する３’−ＵＴＲは、ＨｅＬａ細胞において、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることが既に示されている（国際公開第２０１３１４３６９８号）アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡと少なくとも同程度まで、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

明確に且つ読みやすくするために、以下の定義を提供する。これら定義について言及される任意の技術的特徴は、本発明の各実施形態及び全実施形態において読み取ることができる。これら実施形態に関連して更なる定義及び説明を具体的に提供する場合がある。

【0026】

適応免疫応答：適応免疫応答は、典型的に、免疫系の抗原特異的応答であると理解される。抗原特異性により、特定の病原体又は病原体に感染している細胞に合わせた応答を生じさせることができる。これら病原体又は細胞に合わせた応答を開始させる能力は、通常、「記憶細胞」によって体内に維持されている。身体がある病原体に１回超感染した場合、これら特異的記憶細胞を用いて、前記病原体を速やかに除去する。これに関連して、適応免疫応答の第１の工程は、抗原提示細胞による抗原特異的免疫応答を誘導することができる抗原特異的なナイーブＴ細胞又は様々な免疫細胞の活性化である。これは、ナイーブＴ細胞が常に通過しているリンパ組織及び器官で生じる。抗原提示細胞として機能し得る３種の細胞は、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞である。これら細胞は、それぞれ、免疫応答の誘発において異なる機能を有する。樹状細胞は、食作用及びマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込むことができ、また、例えば外来抗原と接触することによって刺激されて、樹状細胞が成熟樹状細胞に分化する局所リンパ組織に遊走することができる。マクロファージは、細菌等の特定の抗原を摂取し、感染因子又は他の適切な刺激によって誘導されてＭＨＣ分子を発現させる。また、受容体を介して可溶性タンパク質抗原に結合し、内部に取り込むＢ細胞の独自の能力は、Ｔ細胞の誘導にとって重要であり得る。ＭＨＣ分子は、典型的に、抗原のＴ細胞への提示を担当する。ＭＨＣ分子における抗原の提示により、Ｔ細胞が活性化されて、前記Ｔ細胞の増殖及びアームドエフェクターＴ細胞への分化が誘導される。エフェクターＴ細胞の最も重要な機能は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞によって感染細胞を殺傷し、共に細胞媒介免疫を構成するＴｈ１細胞によってマクロファージを活性化させ、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１細胞の両方によってＢ細胞を活性化させて様々な分類の抗体を産生させ、それによって体液性免疫応答を駆動することである。Ｔ細胞は、抗原を直接認識したり結合したりはしないが、その代わり、例えば、他の細胞の表面上のＭＨＣ分子に結合している病原体由来のタンパク質抗原の短いペプチド断片（例えば、所謂エピトープ）を認識するＴ細胞受容体によって抗原を認識する。

【0027】

適応免疫系：適応免疫系は、本質的に、病原体の成長を停止させる又は妨げることに専念している。適応免疫系は、典型的に、特定の病原体を認識及び記憶し（免疫を生じさせ）、前記病原体に遭遇したときにより強い攻撃を開始する能力を脊椎動物の免疫系に付与することによって適応免疫応答を制御する。前記系は、体細胞超変異（体細胞の突然変異が加速されるプロセス）及びＶ（Ｄ）Ｊ組み換え（抗原受容体遺伝子セグメントの不可逆的な遺伝子組み替え）により、高度に適応可能である。この機序により、少数の遺伝子が膨大な数の様々な抗原受容体を産生することができ、前記抗原受容体は、後に、個々のリンパ球で一意的に発現する。遺伝子の再配置により各細胞のＤＮＡが不可逆的に変化するので、かかる細胞の後代（子孫）は全て、長命特異的免疫にとって重要であるメモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞を含む、同じ受容体特異性をコードしている遺伝子を受け継ぐ。

【0028】

アジュバント／アジュバント成分：アジュバント又はアジュバント成分は、最も広い意味では、典型的に、薬物又はワクチン等の他の剤の効果を変化させ得る、例えば、増強し得る薬理学的及び／又は免疫学的剤である。アジュバント又はアジュバント成分は、広義で解釈すべきであり、広範囲に亘る物質を指す。典型的に、これら物質は、抗原の免疫原性を高めることができる。例えば、アジュバントは、自然免疫系によって認識され得、例えば、自然免疫応答を誘発することができる。「アジュバント」は、典型的に、適応免疫応答を誘発しない。したがって、「アジュバント」は、抗原として適切ではない。アジュバントの作用機序は、適応免疫応答を生じさせる抗原によって誘発される効果とは異なる。

【0029】

抗原：本発明において、「抗原」は、典型的に、免疫系によって、好ましくは適応免疫系によって認識され得る物質を指し、例えば、適応免疫応答の一部として抗体及び／又は抗原特異的Ｔ細胞を形成することによって抗原特異的免疫応答を誘発することができる。典型的に、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチド又はタンパク質であってもよく、前記ペプチド又はタンパク質を含んでいてもよい。本発明の意味では、抗原は、提供される核酸分子、好ましくは本明細書に定義するｍＲＮＡの翻訳産物であってよい。この状況では、少なくとも１つのエピトープを含むペプチド及びタンパク質の断片、変異体、及び誘導体も抗原として理解される。本発明の状況では、本明細書に定義する腫瘍抗原及び病原性抗原が特に好ましい。

【0030】

人工核酸分子：人工核酸分子は、典型的に、自然界には存在しない核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であると理解してよい。言い換えれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子として理解してよい。かかる核酸分子は、その個々の配列（自然界には存在しない）及び／又は他の修飾（例えば、自然界には存在しないヌクレオチドの構造的修飾）から非天然であり得る。人工核酸分子は、ＤＮＡ分子であってもよく、ＲＮＡ分子であってもよく、ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを含むハイブリッド分子であってもよい。典型的に、人工核酸分子は、所望の人工ヌクレオチド配列（異種配列）に相当するように遺伝子改変方法によって設計及び／又は作製することができる。これに関連して、人工配列は、通常、自然界には存在し得ない配列である、即ち、少なくとも１つのヌクレオチドが野生型配列とは異なる。用語「野生型」とは、自然界に存在する配列であると理解してよい。更に、用語「人工核酸分子」の意味は、「１つの単一分子」には限定されず、典型的に、同一分子の集合体を含むと理解される。したがって、アリコートに含有される複数の同一分子を指す場合がある。

【0031】

２シストロン性ＲＮＡ、多シストロン性ＲＮＡ：２シストロン性又は多シストロン性のＲＮＡは、典型的に２つ（２シストロン性）又はそれ以上（多シストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し得るＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである。これに関連して、オープンリーディングフレームは、ペプチド又はタンパク質に翻訳可能なコドンの配列である。

【0032】

担体／高分子担体：本発明における担体は、典型的に、別の化合物（カーゴ）の輸送及び／又は複合体化を促進する化合物であってよい。高分子担体は、典型的に、高分子で形成される担体である。担体は、共有相互作用又は非共有相互作用によってカーゴに結合し得る。担体は、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を標的細胞に輸送することができる。担体は、幾つかの実施形態では、カチオン性成分であってよい。

【0033】

カチオン性成分：用語「カチオン性成分」は、典型的に、典型的に１〜９のｐＨ値、好ましくは９以下（例えば、５〜９）、８以下（例えば、５〜８）、７以下（例えば、５〜７）のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ（例えば、７．３〜７．４）を有する正に帯電している帯電分子（カチオン）を指す。したがって、カチオン性成分は、任意の正に帯電している化合物又はポリマーであってよく、好ましくは、生理学的条件下で、特にインビボにおける生理学的条件下で正に帯電しているカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。「カチオン性のペプチド又はタンパク質」は、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＯｒｎから選択される、少なくとも１つの正に帯電しているアミノ酸、又は１超の正に帯電しているアミノ酸を含有していてよい。したがって、所与の条件下で１超の正電荷を呈する「ポリカチオン性」成分も、カチオン性成分の範囲内である。

【0034】

５’−キャップ：５’−キャップは、一般的に成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する実体、典型的に修飾ヌクレオチド実体である。５’−キャップは、典型的に、修飾ヌクレオチド、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−三リン酸結合を介して５’末端に結合する。５’−キャップは、メチル化されていてもよく、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’−キャップを有する核酸の５’末端のヌクレオチド、典型的に、ＲＮＡの５’末端である）である。５’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、逆転デオキシ非塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆転ヌクレオチド部分、３’−３’−逆転非塩基部分、３’−２’−逆転ヌクレオチド部分、３’−２’−逆転非塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。

【0035】

細胞免疫／細胞免疫応答：細胞免疫は、典型的に、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、及び抗原に応答する様々なサイトカインの放出を指す。より一般的な用語では、細胞免疫は、抗体に基づくのではなく、免疫系の細胞の活性化に基づく。典型的に、細胞免疫応答は、細胞（例えば、樹状細胞又は他の細胞等の特定の免疫細胞）においてアポトーシスを誘導することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化し、その表面上に外来抗原のエピトープを提示することを特徴とし得る。かかる細胞は、ウイルスに感染していてもよく、細胞内細菌に感染していてもよく、腫瘍抗原を提示する癌細胞であってもよい。更なる特徴は、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して病原体を破壊させたり、細胞を刺激して適応免疫応答及び自然免疫応答に関与している他の細胞の機能に影響を及ぼす様々なサイトカインを分泌させたりすることであり得る。

【0036】

ＤＮＡ：ＤＮＡは、デオキシリボ核酸の一般的な略称である。ＤＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸のモノマーであり、これらは、単独で、糖部分（デオキシリボース）、塩基部分、及びリン酸部分で構成され、特徴的な骨格構造により重合する。前記骨格構造は、典型的に、第１のヌクレオチドの糖部分（即ち、デオキシリボース）と、隣接する第２のモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の順序、即ち、糖／リン酸骨格に結合している塩基の順序が、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖形態では、第１の鎖のヌクレオチドは、典型的に、例えばＡ／Ｔ塩基対合及びＧ／Ｃ塩基対合によって第２の鎖のヌクレオチドとハイブリダイズする。

【0037】

エピトープ：（「抗原決定基」とも呼ばれる）は、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープとに分けることができる。本発明におけるＴ細胞エピトープ又はタンパク質の一部は、好ましくは約６アミノ酸長〜約２０アミノ酸長又はそれ以上のアミノ酸長を有する断片、例えば、好ましくは約８アミノ酸長〜約１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長、９アミノ酸長、又は１０アミノ酸長（又は更には１１アミノ酸長又は１２アミノ酸長）を有するＭＨＣクラスＩ分子によって処理及び提示される断片、或いは、好ましくは約１３アミノ酸長以上、例えば、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、又はそれ以上のアミノ酸長を有するＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理及び提示される断片を含んでよく、これら断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択してよい。これら断片は、典型的に、ペプチド断片及びＭＨＣ分子からなる複合体の形態でＴ細胞によって認識される。即ち、前記断片は、典型的に、そのネイティブな形態では認識されない。Ｂ細胞エピトープは、典型的に、好ましくは５アミノ酸〜１５アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸〜１２アミノ酸、更により好ましくは６アミノ酸〜９アミノ酸を有する、本明細書に定義する（ネイティブな）タンパク質又はペプチド抗原の外表面上に位置する断片であり、これは、即ちそのネイティブな形態で抗体によって認識され得る。

【0038】

更に、タンパク質又はペプチドのかかるエピトープは、かかるタンパク質又はペプチドの本明細書に記載する変異体のいずれかから選択してよい。これに関連して、抗原決定基は、本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列において不連続であるが、三次元構造では結合する本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのセグメントで構成される高次構造エピトープ又は不連続エピトープであってもよく、単一ポリペプチド鎖で構成される連続エピトープ又は線状エピトープであってもよい。

【0039】

配列の断片：配列の断片は、典型的に、例えば、核酸分子又はアミノ酸の配列の完全長配列のより短い部分であってよい。したがって、断片は、典型的に、完全長配列内の相当する一続きと同一である配列からなる。本発明における好ましい配列の断片は、前記断片が由来する分子における連続する一続きの実体に相当するヌクレオチド又はアミノ酸等の連続する一続きの実体からなり、前記断片が由来する分子全体（即ち、完全長分子）の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。

【0040】

Ｇ／Ｃ改変：Ｇ／Ｃ改変核酸は、典型的に、好ましくは野生型配列よりも多数のグアノシン／シトシンヌクレオチドを含む改変野生型配列に基づく核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子であってよい。グアノシン又はシトシンヌクレオチドを含有するコドンでアデノシン又はチミジンヌクレオチドを含有するコドンを置換することによって、このように数を増加させることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡのコード領域におけるＧ／Ｃ含量を増加させる場合、遺伝コードの縮重を利用する。したがって、コドン置換は、コードされているアミノ酸残基は変化させず、核酸分子のＧ／Ｃ含量のみを増加させることが好ましい。

【0041】

遺伝子治療：遺伝子治療は、典型的に、ペプチド又はタンパク質をコードしている核酸による患者の身体又は患者の身体の単離要素（例えば、単離組織／細胞）の治療を意味すると理解してよい。遺伝子治療は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を任意の投与経路によって患者に直接投与するか、又はインビトロで前記患者の単離細胞／組織に投与して、インビボ／エクスビボ又はインビトロで前記患者の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意でｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を前記患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含んでよい。

【0042】

遺伝子ワクチン接種：遺伝子ワクチン接種は、典型的に、抗原若しくは免疫原をコードしている核酸分子又はその断片を投与することによるワクチン接種であると理解してよい。前記核酸分子は、被験体の身体又は被験体の単離細胞に投与してよい。身体の特定の細胞をトランスフェクトした際又は単離細胞をトランスフェクトした際、これら細胞は、前記抗原又は免疫原を発現し、次いで、免疫系に提示して、適応免疫応答、即ち、抗原特異的免疫応答を誘発し得る。したがって、遺伝子ワクチン接種は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を被験体、好ましくは患者、又は被験体、好ましくは患者の単離細胞に投与して、通常、インビボ又はインビトロで前記被験体の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意で、ｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を被験体、好ましくは患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含む。

【0043】

異種配列：２つの配列は、典型的に、同一の遺伝子に由来していない場合、「異種」であると理解される。即ち、異種配列は、同一の生物に由来し得たとしても、天然で（自然界で）同一の核酸分子（例えば、同一のｍＲＮＡ等）中に存在することはない。

【0044】

体液性免疫／体液性免疫応答：体液性免疫は、典型的に、抗体産生と、任意で抗体産生に付随する付属プロセスとを指す。体液性免疫応答は、典型的に、例えば、Ｔｈ２活性化及びサイトカイン産生、胚中心の形成及びアイソタイプの切り換え、親和性成熟及び記憶細胞の産生を特徴とし得る。また、体液性免疫は、典型的に、病原体及び毒素の中和、古典的補体活性化、並びに食作用及び病原体排除のオプソニンによる促進を含む抗体のエフェクター機能を指す場合もある。

【0045】

免疫原：本発明において、免疫原は、典型的に、免疫応答を刺激することができる化合物であると理解してよい。好ましくは、免疫原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。特に好ましい実施形態では、本発明の意味における免疫原は、提供される核酸分子、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子の翻訳産物である。典型的に、免疫原は、少なくとも適応免疫応答を誘発する。

【0046】

免疫賦活組成物：本発明において、免疫賦活組成物は、典型的に、免疫応答を誘導することができるか、又は免疫応答を誘導することができる成分が由来する少なくとも１つの成分を含有する組成物であると理解してよい。かかる免疫応答は、好ましくは、自然免疫応答又は適応免疫応答と自然免疫応答との組み合わせであってよい。本発明における免疫賦活組成物は、好ましくは、少なくとも１つの人工核酸分子、より好ましくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ分子）を含有する。ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分は、好適な担体と複合体化し得る。したがって、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ／担体複合体を含んでいてよい。更に、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分のアジュバント及び／又は好適なビヒクルを含んでいてよい。

【0047】

免疫応答：免疫応答は、典型的に、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的反応（所謂、特異的又は適応免疫応答）、自然免疫系の非特異的反応（所謂、非特異的又は自然免疫応答）、又はこれらの組み合わせであってよい。

【0048】

免疫系：免疫系は、生物を感染から保護することができる。病原体が、生物の物理的障壁の通過に成功し、この生物に侵入した場合、自然免疫系が、即座にではあるが非特異的に応答する。病原体がこの自然応答から逃れた場合、脊椎動物は、第２の保護層である適応免疫系を有している。ここで、免疫系は、感染中の応答に適応してその病原体認識を向上させる。その後、この向上した応答は、病原体が排除された後も免疫記憶の形態で保持され、この病原体に遭遇したときにはいつも適応免疫系がより速やかに且つより強力な攻撃を行うことが可能になる。これによれば、免疫系は、自然免疫系及び適応免疫系を含む。これら２つの部分はそれぞれ、典型的に、所謂体液性成分及び細胞性成分を含有する。

【0049】

免疫賦活ＲＮＡ：本発明における免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）は、典型的に、自然免疫応答を誘導することができるＲＮＡであってよい。これは、通常、オープンリーディングフレームを有しないので、ペプチド抗原又は免疫原を提供しないが、例えば、特定の種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）又は他の好適な受容体に結合することによって免疫応答を誘発する。しかし、無論、オープンリーディングフレームを有し且つペプチド／タンパク質をコードしているｍＲＮＡも自然免疫応答を誘導し得るので、免疫賦活ＲＮＡであり得る。

【0050】

自然免疫系：非特異的免疫系としても知られている自然免疫系は、典型的に、非特異的に他の生物による感染からホストを守る細胞及び機構を含む。これは、自然免疫系の細胞は、包括的に病原体を認識し、応答することができるが、適応免疫系とは異なり、ホストに対して長期間免疫を付与することも、防御免疫を付与することもないことを意味する。自然免疫系は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド、リポ多糖類等の他の補助物質、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４０リガンド、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、成長因子及びｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０のリガンド、マウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、又はＴＬＲ１３のリガンド、ＮＯＤ様受容体のリガンド、ＲＩＧ−Ｉ様受容体のリガンド、免疫賦活核酸、免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ、抗菌剤、又は抗ウイルス剤によって活性化され得る。本発明に係る医薬組成物は、１以上のかかる物質を含んでいてよい。典型的に、自然免疫系の応答は、サイトカインと呼ばれる特殊な化学メディエーターを含む化学因子の産生を介して感染部位に免疫細胞を動員し、補体カスケードを活性化し、特殊な白血球によって器官、組織、血液、及びリンパ中に存在する外来物質を同定及び除去し、適応免疫系を活性化し、及び／又は感染因子に対する物理的及び化学的な障壁として作用することを含む。

【0051】

クローニングサイト：クローニングサイトは、典型的に、核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームを含む核酸配列の挿入に好適である核酸分子のセグメントであると理解される。挿入は、例えば、制限酵素処理及びライゲーションによって当業者に公知の任意の分子生物学的方法によって実施してよい。クローニングサイトは、典型的に、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含む。これら１以上の制限酵素部位は、これら部位においてＤＮＡを切断する制限酵素によって認識され得る。１超の制限酵素部位を含むクローニングサイトは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）又はポリリンカーと呼ばれる場合もある。

【0052】

核酸分子：核酸分子は、核酸成分を含む、好ましくは核酸成分からなる分子である。核酸分子という用語は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子を指す。好ましくは、用語「ポリヌクレオチド」と同義的に用いられる。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含むか又はからなるポリマーである。また、用語「核酸分子」は、例えば、塩基が修飾されている、糖が修飾されている、又は骨格が修飾されているＤＮＡ又はＲＮＡの分子等の修飾核酸分子も含む。

【0053】

オープンリーディングフレーム：本発明におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、典型的に、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得る幾つかのヌクレオチドトリプレットの配列であってよい。オープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン、即ち、その５’末端における通常アミノ酸メチオニンをコードしている３つの連続するヌクレオチドの組み合わせ（ＡＴＧ）と、その後に、通常３の倍数である長さのヌクレオチドを有する領域とを含む。ＯＲＦは、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって終結する。典型的に、これは、オープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。したがって、本発明におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）で始まり、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）で終結する、３で割り切れる多数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは、単離することができたり、例えば、ベクター又はｍＲＮＡにおけるより長い核酸配列に組み込むことができたりする。また、オープンリーディングフレームは、「タンパク質コード領域」と呼ばれる場合もある。

【0054】

ペプチド：ペプチド又はポリペプチドは、典型的に、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸モノマーのポリマーである。典型的に、５０個未満のモノマーユニットを含む。しかし、ペプチドという用語は、５０個超のモノマーユニットを有する分子を除外するものではない。また、典型的に５０個〜６００個のモノマーユニットを有する長いペプチドは、ポリペプチドとも呼ばれる。

【0055】

薬学的に有効な量：本発明において薬学的に有効な量は、典型的に、免疫応答等の薬学的効果を誘導して、ペプチド又はタンパク質の病的レベルの発現を変化させるか又は例えば、病理学的状況の場合、欠損している遺伝子産物を置換するのに十分な量であると理解される。

【0056】

タンパク質：タンパク質は、典型的に、１以上のペプチド又はタンパク質を含む。タンパク質は、典型的に、３次元形態に折り畳まれており、これは、タンパク質がその生物学的機能を発揮するのに必要である場合がある。

【0057】

ポリ（Ａ）配列：ポリ（Ａ）テール又は３’−ポリ（Ａ）テールとも呼ばれるポリ（Ａ）配列は、典型的に、アデノシンヌクレオチドの配列、例えば、約４００個以下のアデノシンヌクレオチドの配列、約２０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは約５０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは約５０個〜約３００個のアデノシンヌクレオチドの配列、更により好ましくは約５０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは約６０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列であると理解される。ポリ（Ａ）配列は、典型的に、ｍＲＮＡの３’末端に位置する。本発明において、ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡ内に位置してもよく、又は例えば、ベクターの転写によってＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を作製するためのテンプレートとして機能するベクター等のベクターにおける任意の他の核酸分子内に位置してもよい。

【0058】

ポリアデニル化：ポリアデニル化は、典型的に、ＲＮＡ分子等の核酸分子、例えば、未成熟ｍＲＮＡにポリ（Ａ）配列を付加することであると理解される。ポリアデニル化は、所謂ポリアデニル化シグナルによって誘導され得る。このシグナルは、好ましくは、ポリアデニル化される核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の３’末端における一続きのヌクレオチド内に位置している。ポリアデニル化シグナルは、典型的に、アデニン及びウラシル／チミンヌクレオチドからなるヘキサマー、好ましくは、ヘキサマー配列ＡＡＵＡＡＡを含む。他の配列、好ましくはヘキサマー配列も考えられる。ポリアデニル化は、典型的に、プレｍＲＮＡ（未成熟ｍＲＮＡとも呼ばれる）のプロセシング中に生じる。典型的に、ＲＮＡの成熟（プレｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへ）は、ポリアデニル化工程を含む。

【0059】

制限酵素部位：「制限酵素認識部位」とも呼ばれる制限酵素部位は、制限酵素によって認識されるヌクレオチド配列である。制限酵素部位は、典型的に短く、好ましくは、回文構造のヌクレオチド配列、例えば、４個〜８個のヌクレオチドを含む配列である。制限酵素部位は、好ましくは、制限酵素によって特異的に認識される。制限酵素は、典型的に、この部位において制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を切断する。二本鎖ＤＮＡ配列等の二本鎖ヌクレオチド配列では、制限酵素は、典型的に、ヌクレオチド配列の両方の鎖を切断する。

【0060】

ＲＮＡ、ｍＲＮＡ：ＲＮＡは、リボ核酸の一般的な略称である。ＲＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、所謂骨格に沿って互いに結合しているアデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、グアノシン一リン酸、及びシチジン一リン酸のモノマーである。骨格は、第１のモノマーの糖（即ち、リボース）と第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。特定の連続するモノマーをＲＮＡ配列と呼ぶ。通常、ＲＮＡは、例えば、細胞内部のＤＮＡ配列の転写によって得ることができる。真核細胞では、転写は、通常、核又はミトコンドリア内部で実施される。インビボでは、ＤＮＡの転写により、通常、所謂未成熟ＲＮＡが得られ、これは、所謂メッセンジャーＲＮＡ（通常、ｍＲＮＡと略される）にプロセシングされなければならない。例えば、真核生物における未成熟ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’−キャッピング、ポリアデニル化、核又はミトコンドリアからのエクスポート等の様々な異なる転写後修飾を含む。これらプロセス全体をＲＮＡの成熟とも呼ぶ。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的に、成熟ｍＲＮＡは、５’−キャップ、５’−ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’−ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。メッセンジャーＲＮＡは別として、転写及び／又は翻訳の制御に関与し得る幾つかの非コード型のＲＮＡが存在する。

【0061】

核酸分子の配列：核酸分子の配列は、典型的に、そのヌクレオチドの特定の及び個々の順序、即ち、連続物であると理解される。タンパク質又はペプチドの配列は、典型的に、そのアミノ酸の順序、即ち、連続物であると理解される。

【0062】

配列同一性：同じ長さ及び順序のヌクレオチド又はアミノ酸を有する場合、２以上の配列は同一である。同一性の割合は、典型的に、２つの配列が同一である程度について説明する。即ち、典型的に、その配列位置においてレファレンス配列の同一ヌクレオチドと一致するヌクレオチドの割合について説明するものである。同一性の程度を決定する場合、比較する配列は、同じ長さ、即ち、比較する配列のうちの最長の配列の長さを有するとみなされる。これは、８ヌクレオチドからなる第１の配列が、前記第１の配列を含む１０ヌクレオチドからなる第２の配列と８０％同一であることを意味する。言い換えれば、本発明において、配列同一性は、好ましくは、同じ長さを有する２以上の配列において配列のうちの同一位置を有するヌクレオチドの割合に関する。ギャップは、アラインメントにおけるその実際の位置にかかわらず、通常、非同一位置であるとみなされる。

【0063】

安定化核酸分子：安定化核酸分子は、例えば、環境因子又はエキソヌクレアーゼ若しくはエンドヌクレアーゼによる分解等の酵素分解によって、修飾されていない核酸分子よりも崩壊又は分解に対して安定であるように修飾されている核酸分子、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡの分子である。好ましくは、本発明における安定化核酸分子は、細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において安定化される。また、安定化効果は、例えば、安定化核酸分子を含む医薬組成物の製造過程において、細胞外、例えば、バッファ溶液中でも発揮され得る。

【0064】

トランスフェクション：用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分子等の核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを指す。本発明において、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳類細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法を含む。かかる方法は、例えば、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクションを含む。好ましくは、導入は、非ウイルスである。

【0065】

ワクチン：ワクチンは、典型的に、少なくとも１つの抗原、好ましくは免疫原を提供する予防的又は治療的材料であると理解される。抗原又は免疫原は、ワクチン接種に好適な任意の材料に由来してよい。例えば、抗原又は免疫原は、病原体（例えば、細菌若しくはウイルス粒子等）又は腫瘍若しくは癌性組織に由来してよい。抗原又は免疫原は、身体の適応免疫系を刺激して、適応免疫応答を提供する。

【0066】

ベクター：用語「ベクター」は、核酸分子、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明におけるベクターは、オープンリーディングフレームを含む核酸配列等の所望の核酸配列を組み込む又は有するのに好適である。かかるベクターは、ストレージベクター、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクター等であってよい。ストレージベクターは、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を便利に保管することができるベクターである。したがって、このベクターは、例えば、所望のｍＲＮＡ配列又はその一部に相当する配列（例えば、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム及び３’−ＵＴＲに相当する配列）を含んでいてよい。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質等の発現産物を産生するために用いることができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）等のベクターの一続きの配列の転写に必要な配列を含んでいてよい。クローニングベクターは、典型的に、核酸配列をベクターに組み込むために用いることができるクローニングサイトを含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってよい。トランスファーベクターは、細胞又は生物に核酸分子を移入するのに好適なベクター、例えば、ウイルスベクターであってよい。本発明におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクターであってもＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡ分子である。好ましくは、本発明におけるベクターは、クローニングサイト、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性因子）、及びベクターの増殖に好適な配列（例えば、複製起点）を含む。好ましくは、本願におけるベクターは、プラスミドベクターである。

【0067】

ビヒクル：ビヒクルは、典型的に、化合物（例えば、薬学的に活性のある化合物）を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であると理解される。例えば、薬学的に活性のある化合物を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容可能な液体であってよい。

【0068】

３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）：一般的に、用語「３’−ＵＴＲ」は、オープンリーディングフレームの３’側（即ち、「下流」）に位置し、タンパク質には翻訳されない、人工核酸分子の部分を指す。典型的に、３’−ＵＴＲは、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又はコード配列（ＣＤＳ））とポリ（Ａ）配列との間に位置するｍＲＮＡの部分である。本発明の状況では、用語３’−ＵＴＲは、それからＲＮＡが転写されるテンプレートにコードされているのではなく、転写後成熟中に付加されるエレメント、例えば、ポリ（Ａ）配列を含んでいてもよい。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、アミノ酸配列には翻訳されない。３’ＵＴＲ配列は、一般的に、遺伝子発現プロセス中にそれぞれのｍＲＮＡに転写される遺伝子によってコードされている。ゲノム配列は、先ず、任意のイントロンを含む未成熟ｍＲＮＡに転写される。次いで、前記未成熟ｍＲＮＡは、成熟プロセスにおいて成熟ｍＲＮＡに更にプロセシングされる。この成熟プロセスは、５’キャッピング工程、未成熟ｍＲＮＡをスプライシングして、任意のイントロンを除去する工程、及び３’末端を修飾する工程（例えば、未成熟ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化、及び任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによる切断等）を含む。本発明において、３’ＵＴＲは、タンパク質コード領域の終止コドン、好ましくはタンパク質コード領域の終止コドンの直ぐ３’側とｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列との間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に相当する。用語「相当する」とは、３’ＵＴＲ配列が、３’ＵＴＲ配列を定義するために用いられるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明の状況において、用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」、例えば、「リボソームタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相当する配列、即ち、遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡである。用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」は、３’ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列（センス鎖及びアンチセンス鎖の両方、並びに成熟及び未成熟の両方）を含む。

【0069】

５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）：５’−ＵＴＲは、典型的に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定のセクションであると理解される。これは、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームの５’側に位置する。典型的に、５’−ＵＴＲは、転写開始点から始まり、オープンリーディングフレームの開始コドンの１つ前のヌクレオチドで終わる。５’−ＵＴＲは、制御エレメントとも呼ばれる、遺伝子発現を制御するためのエレメントを含んでいてよい。かかる制御エレメントは、例えば、リボソーム結合部位であってよい。５’−ＵＴＲは、例えば、５’−キャップの付加によって、転写後翻訳され得る。本発明の状況では、５’−ＵＴＲは、５’−キャップと開始コドンとの間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に相当する。好ましくは、５’−ＵＴＲは、５’−キャップの３’側に位置するヌクレオチドから、好ましくは、５’−キャップの直ぐ３’側に位置するヌクレオチドから、タンパク質コード領域の開始コドンの５’側に位置するヌクレオチドまで、好ましくは、タンパク質コード領域の開始コドンの直ぐ５’側に位置するヌクレオチドまで延在する配列に相当する。成熟ｍＲＮＡの５’−キャップの直ぐ３’側に位置するヌクレオチドは、典型的に、翻訳開始点に相当する。用語「相当する」とは、５’−ＵＴＲ配列が、５’−ＵＴＲ配列を定義するために用いられるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明の状況では、用語「遺伝子の５’−ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡ、即ち、遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡの５’−ＵＴＲに相当する配列である。用語「遺伝子の５’−ＵＴＲ」は、５’−ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含む。本発明の実施形態では、かかる５’−ＵＴＲは、ＯＲＦの５’末端に提供され得る。その長さは、典型的に、５００ヌクレオチド未満、４００ヌクレオチド未満、３００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、又は２００ヌクレオチド未満である。他の実施形態では、その長さは、少なくとも１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、又は４０ヌクレオチド、好ましくは１００ヌクレオチド以下又は１５０ヌクレオチド以下の範囲であってよい。

【0070】

５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）：５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）は、典型的に、特定の遺伝子の核酸分子の５’末端領域（例えば、特定のｍＲＮＡ分子の５’末端領域又は機能的実体、例えば、転写領域の５’末端領域）に位置する一続きのピリミジンヌクレオチドである。この配列は、シチジン（通常、転写開始点に相当する）で始まり、その後に、通常約３個〜約３０個の一続きのピリミジンヌクレオチドが続く。例えば、ＴＯＰは、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、又は更に多くのヌクレオチドを含み得る。一続きのピリミジン、延いては５’ＴＯＰは、ＴＯＰの下流に位置する最初のプリンヌクレオチドの１ヌクレオチド５’側で終わる。５’末端オリゴピリミジン領域を含有するメッセンジャーＲＮＡは、多くの場合、ＴＯＰ ｍＲＮＡと呼ばれる。したがって、かかるメッセンジャーＲＮＡを提供する遺伝子は、ＴＯＰ遺伝子と呼ばれる。ＴＯＰ配列は、例えば、ペプチド伸長因子及びリボソームタンパク質をコードしている遺伝子及びｍＲＮＡにおいて見出されている。

【0071】

ＴＯＰモチーフ：本発明の状況では、ＴＯＰモチーフは、上に定義した５’ＴＯＰに相当する核酸配列である。したがって、本発明の状況におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、３ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長を有する一続きのピリミジンヌクレオチドである。好ましくは、ＴＯＰモチーフは、少なくとも３ピリミジンヌクレオチド、好ましくは、少なくとも４ピリミジンヌクレオチド、好ましくは、少なくとも５ピリミジンヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも６ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも７ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも８ピリミジンヌクレオチドからなり、この一続きのピリミジンヌクレオチドは、好ましくは、シトシンヌクレオチドを有するその５’末端で始まる。ＴＯＰ遺伝子及びＴＯＰ ｍＲＮＡでは、ＴＯＰモチーフは、好ましくは、その５’末端における転写開始点で始まり、前記遺伝子又はｍＲＮＡにおける最初のプリン残基の１ヌクレオチド５’側で終わる。本発明の意味におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、５’ＵＴＲを表す配列の５’末端、又は５’ＵＴＲをコードしている配列の５’末端に位置する。したがって、好ましくは、３以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、この一続きが、人工核酸分子、人工核酸分子の５’ＵＴＲエレメント、又は本明細書に記載するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列等、それぞれの配列の５’末端に位置している場合、本発明の意味において「ＴＯＰモチーフ」と呼ばれる。言い換えれば、５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲエレメントの５’末端ではなく、５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲエレメント内のどこかに位置する、３以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、好ましくは、「ＴＯＰモチーフ」とは呼ばれない。

【0072】

ＴＯＰ遺伝子：ＴＯＰ遺伝子は、典型的に、５’末端オリゴピリミジン領域の存在を特徴とする。更に、殆どのＴＯＰ遺伝子は、成長に関連する翻訳制御を特徴とする。しかし、組織特異的に翻訳制御するＴＯＰ遺伝子も知られている。上に定義した通り、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、ＴＯＰ遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの配列に相当し、これは、好ましくは、５’−キャップの３’側に位置するヌクレオチドから開始コドンの５’側に位置するヌクレオチドまで延在する。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、典型的に、開始コドンを全く含まず、好ましくは、上流ＡＵＧ（ｕＡＵＧ）も上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）も含まない。本明細書では、上流ＡＵＧ及び上流オープンリーディングフレームは、典型的に、翻訳されるべきオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＵＧ）の５’側に存在するＡＵＧ及びオープンリーディングフレームであると理解される。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、一般的に、短めである。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの長さは、２０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドで変動してよいが、典型的に、約２００ヌクレオチド未満、好ましくは、約１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは、約１００ヌクレオチド未満である。本発明の意味における例示的なＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、国際公開第２０１３／１４３７００号（この開示は、参照により本明細書に援用される）の配列番号１〜１３６３に係る配列における５位のヌクレオチドから開始コドン（例えば、ＡＴＧ）の直ぐ５’側に位置するヌクレオチドまで延在する核酸配列である。この状況では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの特に好ましい断片は、５’ＴＯＰモチーフの欠失したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲである。用語「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ」又は「５’−ＴＯＰ ＵＴＲ」は、好ましくは、天然のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲを指す。

【0073】

第１の態様では、本発明は、
ａ．少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
ｂ．リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）と
を含む人工核酸分子に関する。

【0074】

用語「３’−ＵＴＲエレメント」は、３’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる核酸配列を指す。「３’−ＵＴＲエレメント」は、好ましくは、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲを表すか、又は人工核酸分子の３’−ＵＴＲをコードしている核酸配列を指す。したがって、本発明の意味において、好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ（好ましくは、人工ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲであってもよく、ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲの転写テンプレートであってもよい。したがって、３’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは、ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ、好ましくは人工ｍＲＮＡ（例えば、遺伝的に改変されているベクターコンストラクトの転写によって得られるｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲに相当する核酸配列である。好ましくは、本発明の意味における３’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲとして機能するか、又は３’−ＵＴＲの機能を発揮するヌクレオチド配列をコードしている。

【0075】

用語「リボソームタンパク質遺伝子」は、典型的に、リボソームタンパク質をコードしている遺伝子を指す。本明細書で使用するとき、この用語は、それが由来する種にかかわらず、任意のリボソームタンパク質遺伝子を指す。具体的には、この用語は、真核生物のリボソームタンパク質遺伝子を指す。更に、本発明の状況では、用語「リボソームタンパク質遺伝子」は、構造的に又は機能的にリボソームタンパク質遺伝子に類似している遺伝子を指す場合もある。特に、この用語は、「リボソームタンパク質様」遺伝子、シュードジーン、及び特に３’−ＵＴＲ領域においてリボソームタンパク質遺伝子と配列又は構造的特徴を共有している遺伝子も含む。好ましくは、この用語は、脊椎動物のリボソームタンパク質遺伝子、より好ましくは、哺乳類のリボソームタンパク質遺伝子、更により好ましくは、霊長類リボソームタンパク質遺伝子、特に、ヒトのリボソームタンパク質遺伝子を指す。更に、用語「リボソームタンパク質遺伝子」は、げっ歯類のリボソームタンパク質遺伝子、特に、マウスのリボソームタンパク質遺伝子も包含する。本発明の意味におけるリボソームタンパク質遺伝子の例としては、リボソームタンパク質Ｌ９（ＲＰＬ９）、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）、リボソームタンパク質Ｌ４（ＲＰＬ４）、リボソームタンパク質Ｌ５（ＲＰＬ５）、リボソームタンパク質Ｌ６（ＲＰＬ６）、リボソームタンパク質Ｌ７（ＲＰＬ７）、リボソームタンパク質Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、リボソームタンパク質Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、リボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）、リボソームタンパク質Ｌ２３（ＲＰＬ２３）、リボソームタンパク質Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、リボソームタンパク質Ｌ１８ａ（ＲＰＬ１８Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、リボソームタンパク質Ｌ２１（ＲＰＬ２１）、リボソームタンパク質Ｌ２２（ＲＰＬ２２）、リボソームタンパク質Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、リボソームタンパク質Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、リボソームタンパク質Ｌ２６（ＲＰＬ２６）、リボソームタンパク質Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、リボソームタンパク質Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、リボソームタンパク質Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、リボソームタンパク質Ｌ２９（ＲＰＬ２９）、リボソームタンパク質Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、リボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質Ｌ３５ａ（ＲＰＬ３５Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３８（ＲＰＬ３８）、リボソームタンパク質Ｌ３９（ＲＰＬ３９）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０（ＲＰＬＰ０）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ１（ＲＰＬＰ１）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ２（ＲＰＬＰ２）、リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）、リボソームタンパク質Ｓ３Ａ（ＲＰＳ３Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ４、Ｘ連鎖（ＲＰＳ４Ｘ）、リボソームタンパク質Ｓ４、Ｙ連鎖１（ＲＰＳ４Ｙ１）、リボソームタンパク質Ｓ５（ＲＰＳ５）、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、リボソームタンパク質Ｓ７（ＲＰＳ７）、リボソームタンパク質Ｓ８（ＲＰＳ８）、リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、リボソームタンパク質Ｓ１２（ＲＰＳ１２）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、リボソームタンパク質Ｓ１５（ＲＰＳ１５）、リボソームタンパク質Ｓ１５ａ（ＲＰＳ１５Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、リボソームタンパク質Ｓ１９（ＲＰＳ１９）、リボソームタンパク質Ｓ２０（ＲＰＳ２０）、リボソームタンパク質Ｓ２１（ＲＰＳ２１）、リボソームタンパク質Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、リボソームタンパク質Ｓ２５（ＲＰＳ２５）、リボソームタンパク質Ｓ２６（ＲＰＳ２６）、リボソームタンパク質Ｓ２７（ＲＰＳ２７）、リボソームタンパク質Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７ａ）、リボソームタンパク質Ｓ２８（ＲＰＳ２８）、リボソームタンパク質Ｓ２９（ＲＰＳ２９）、リボソームタンパク質Ｌ１５（ＲＰＬ１５）、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）、リボソームタンパク質Ｌ１４（ＲＰＬ１４）、リボソームタンパク質Ｓ１４（ＲＰＳ１４）、リボソームタンパク質Ｌ１０（ＲＰＬ１０）、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３６（ＲＰＬ３６）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ（ＲＰＬ３６Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、リボソームタンパク質Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、リボソームタンパク質Ｌ８（ＲＰＬ８）、リボソームタンパク質Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、リボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、リボソームタンパク質ＳＡ（ＲＰＳＡ）、ユビキチンＡ−５２残基リボソームタンパク質融合生成物１（ＵＢＡ５２）、遍在的に発現するＦｉｎｋｅｌ−Ｂｉｓｋｉｓ−Ｒｅｉｌｌｙマウス肉腫ウイルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）（ＦＡＵ）、リボソームタンパク質Ｌ２２様１（ＲＰＬ２２Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、リボソームタンパク質Ｌ３９様（ＲＰＬ３９Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ１０様（ＲＰＬ１０Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、リボソームタンパク質Ｌ３様（ＲＰＬ３Ｌ）、リボソームタンパク質Ｓ２７様（ＲＰＳ２７Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ２６様１（ＲＰＬ２６Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ７様１（ＲＰＬ７Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａシュードジーン（ＲＰＬ１３ＡＰ）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａシュードジーン８（ＲＰＬ３７ＡＰ８）、リボソームタンパク質Ｓ１０シュードジーン５（ＲＰＳ１０Ｐ５）、リボソームタンパク質Ｓ２６シュードジーン１１（ＲＰＳ２６Ｐ１１）、リボソームタンパク質Ｌ３９シュードジーン５（ＲＰＬ３９Ｐ５）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０シュードジーン６（ＲＰＬＰ０Ｐ６）、及びリボソームタンパク質Ｌ３６シュードジーン１４（ＲＰＬ３６Ｐ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、用語「リボソームタンパク質遺伝子」とは、哺乳類、好ましくはヒト又はマウスに由来する前述の遺伝子のうちの１つを指す。

【0076】

好ましくは、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントとは、異種である。これに関連して、用語「異種」は、自然界（天然）では、オープンリーディングフレームと３’−ＵＴＲエレメント等、人工核酸分子によって含まれる２つの配列エレメントがこの組み合わせでは存在しないことを意味する。好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、オープンリーディングフレームとは異なる遺伝子に由来する。例えば、ＯＲＦは、例えば、異なるタンパク質をコードしているか又は同じタンパク質であるが異なる種のタンパク質をコードしている、３’−ＵＴＲエレメントとは異なる遺伝子に由来していてよい。好ましくは、オープンリーディングフレームは、リボソームタンパク質をコードしていない。好ましい実施形態では、ＯＲＦは、ヒトのリボソームタンパク質又は植物（特に、アラビドプシス）のリボソームタンパク質、特に、ヒトリボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、ヒトリボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、又はアラビドプシスリボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）をコードしていない。更に好ましい実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、又はリボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）をコードしていない。

【0077】

具体的な実施形態では、オープンリーディングフレームは、例えば、グロビンタンパク質（特に、ベータ−グロビン）、ルシフェラーゼタンパク質、ＧＦＰタンパク質、又はこれらの変異体（例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、又はＧＦＰタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を示す変異体）からなる群から選択されるレポータータンパク質をコードしていないことが好ましい。特に好ましい実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、レポーター遺伝子をコードしてもおらず、レポーター遺伝子に由来してもおらず、前記レポーター遺伝子は、好ましくは、グロビンタンパク質（特にベータ−グロビン）、ルシフェラーゼタンパク質、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、及びＧＦＰタンパク質若しくはその変異体（好ましくはＥＧＦＰ）、又は典型的に、これらレポーター遺伝子のいずれか、好ましくはグロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、若しくはＧＦＰタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を示す上記遺伝子のいずれかの変異体からなる群からは選択されない。

【0078】

更により好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、本明細書に定義する人工核酸に含まれる任意の他のエレメントと異種である。例えば、本発明に係る人工核酸分子が所与の遺伝子由来の３’−ＵＴＲエレメントを含む場合、それは、その遺伝子のＯＲＦの５’末端及び３’末端における調節配列を含む、同じ遺伝子由来の任意の他の核酸配列、特に、機能的核酸配列（例えば、コード配列エレメント又は調節配列エレメント）を含まないことが好ましい。特に好ましい実施形態では、人工核酸分子は、ＯＲＦと、３’−ＵＴＲと、５’−ＵＴＲとを含み、これらは全て互いに異種である。例えば、これらは、それぞれが異なる遺伝子（並びにその５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ）に由来する組み換え体である。別の好ましい実施形態では、３’−ＵＴＲは、ウイルス遺伝子の３’−ＵＴＲに由来しないか、又は非ウイルス起源である。

【0079】

好ましくは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、ＯＲＦに機能的に連結している。これは、好ましくは、例えば、コードされているペプチド又はタンパク質の発現に対する増強若しくは安定化機能又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を発揮することができるように、３’−ＵＴＲエレメントがＯＲＦに連結していることを意味する。好ましくは、ＯＲＦと３’−ＵＴＲエレメントとは、５’→３’方向に連結する。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、以下の構造：５’−ＯＲＦ−（任意の）リンカー−３’−ＵＴＲエレメント−３’（リンカーは、存在していても存在していなくてもよい）を含む。例えば、リンカーは、例えば、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むか又はからなる一続きの１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド又は１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド等、１以上のヌクレオチドであってよい。

【0080】

好ましくは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、真核生物のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ、より好ましくは哺乳類のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ、更により好ましくは霊長類のリボソームタンパク質遺伝子、特にヒトのリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ、又はげっ歯類のリボソームタンパク質遺伝子、特にマウスのリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む。

【0081】

好ましい実施形態では、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、ＮＭ＿０００６６１．４、ＮＭ＿００１０２４９２１．２、ＮＭ＿０００９６７．３、ＮＭ＿００１０３３８５３．１、ＮＭ＿０００９６８．３、ＮＭ＿０００９６９．３、ＮＭ＿００１０２４６６２．１、ＮＭ＿０００９７０．３、ＮＭ＿０００９７１．３、ＮＭ＿０００９７２．２、ＮＭ＿０００９７５．３、ＮＭ＿００１１９９８０２．１、ＮＭ＿０００９７６．３、ＮＭ＿０００９７７．３、ＮＭ＿０３３２５１．２、ＮＭ＿００１２４３１３０．１、ＮＭ＿００１２４３１３１、ＮＭ＿０００９７８．３、ＮＭ＿０００９７９．３、ＮＭ＿００１２７０４９０．１、ＮＭ＿０００９８０．３、ＮＭ＿０００９８１．３、ＮＭ＿０００９８２．３、ＮＭ＿０００９８３．３、ＮＭ＿０００９８４．５、ＮＭ＿０００９８５．４、ＮＭ＿００１０３５００６．２、ＮＭ＿００１１９９３４０．１、ＮＭ＿００１１９９３４１．１、ＮＭ＿００１１９９３４２．１、ＮＭ＿００１１９９３４３．１、ＮＭ＿００１１９９３４４．１、ＮＭ＿００１１９９３４５．１、ＮＭ＿０００９８６．３、ＮＭ＿０００９８７．３、ＮＭ＿０００９８８．３、ＮＭ＿０００９８９．３、ＮＭ＿０００９９０．４、ＮＭ＿００１１３６１３４．１、ＮＭ＿０００９９１．４、ＮＭ＿００１１３６１３５．１、ＮＭ＿００１１３６１３６．１、ＮＭ＿００１１３６１３７．１、ＮＭ＿０００９９２．２、ＮＭ＿０００９９３．４、ＮＭ＿００１０９８５７７．２、ＮＭ＿００１０９９６９３．１、ＮＭ＿０００９９４．３、ＮＭ＿００１００７０７３．１、ＮＭ＿００１００７０７４．１、ＮＭ＿０００９９６．２、ＮＭ＿０００９９７．４、ＮＭ＿０００９９８．４、ＮＭ＿０００９９９．３、ＮＭ＿００１０３５２５８．１、ＮＭ＿００１０００．３、ＮＭ＿００１００２．３、ＮＭ＿０５３２７５．３、ＮＭ＿００１００３．２、ＮＭ＿２１３７２５．１、ＮＭ＿００１００４．３、ＮＭ＿００１００５．４、ＮＭ＿００１２５６８０２．１、ＮＭ＿００１２６０５０６．１、ＮＭ＿００１２６０５０７．１、ＮＭ＿００１００６．４、ＮＭ＿００１２６７６９９．１、ＮＭ＿００１００７．４、ＮＭ＿００１００８．３、ＮＭ＿００１００９．３、ＮＭ＿００１０１０．２、ＮＭ＿００１０１１．３、ＮＭ＿００１０１２．１、ＮＭ＿００１０１３．３、ＮＭ＿００１２０３２４５．２、ＮＭ＿００１０１４．４、ＮＭ＿００１２０４０９１．１、ＮＭ＿００１０１５．４、ＮＭ＿００１０１６．３、ＮＭ＿００１０１７．２、ＮＭ＿００１０１８．３、ＮＭ＿００１０３０００９．１、ＮＭ＿００１０１９．４、ＮＭ＿００１０２０．４、ＮＭ＿００１０２２．３、ＮＭ＿００１１４６２２７．１、ＮＭ＿００１０２３．３、ＮＭ＿００１０２４．３、ＮＭ＿００１０２５．４、ＮＭ＿００１０２８．２、ＮＭ＿００１０２９．３、ＮＭ＿００１０３０．４、ＮＭ＿００２９５４、ＮＭ＿００１１３５５９２．２、ＮＭ＿００１１７７４１３．１、ＮＭ＿００１０３１．４、ＮＭ＿００１０３２．４、ＮＭ＿００１０３０００１．２、ＮＭ＿００２９４８．３、ＮＭ＿００１２５３３７９．１、ＮＭ＿００１２５３３８０．１、ＮＭ＿００１２５３３８２．１、ＮＭ＿００１２５３３８３．１、ＮＭ＿００１２５３３８４．１、ＮＭ＿００２９５２．３、ＮＭ＿００１０３４９９６．２、ＮＭ＿００１０２５０７１．１、ＮＭ＿００１０２５０７０．１、ＮＭ＿００５６１７．３、ＮＭ＿００６０１３．３、ＮＭ＿００１２５６５７７．１、ＮＭ＿００１２５６５８０．１、ＮＭ＿００７１０４．４、ＮＭ＿００７２０９．３、ＮＭ＿０１２４２３．３、ＮＭ＿００１２７０４９１．１、ＮＭ＿０３３６４３．２、ＮＭ＿０１５４１４．３、ＮＭ＿０２１０２９．５、ＮＭ＿００１１９９９７２．１、ＮＭ＿０２１１０４．１、ＮＭ＿０２２５５１．２、ＮＭ＿０３３０２２．３、ＮＭ＿００１１４２２８４．１、ＮＭ＿００１０２６．４、ＮＭ＿００１１４２２８５．１、ＮＭ＿００１１４２２８３．１、ＮＭ＿００１１４２２８２．１、ＮＭ＿０００９７３．３、ＮＭ＿０３３３０１．１、ＮＭ＿０００９９５．３、ＮＭ＿０３３６２５．２、ＮＭ＿００１０２１．３、ＮＭ＿００２２９５．４、ＮＭ＿００１０１２３２１．１、ＮＭ＿００１０３３９３０．１、ＮＭ＿００３３３３．３、ＮＭ＿００１９９７．４、ＮＭ＿００１０９９６４５．１、ＮＭ＿００１０２１．３、ＮＭ＿０５２９６９．１、ＮＭ＿０８０７４６．２、ＮＭ＿００１００１．４、ＮＭ＿００５０６１．２、ＮＭ＿０１５９２０．３、ＮＭ＿０１６０９３．２、ＮＭ＿１９８４８６．２、ＮＧ＿０１１１７２．１、ＮＧ＿０１１２５３．１、ＮＧ＿０００９５２．４、ＮＲ＿００２３０９．１、ＮＧ＿０１０８２７．２、ＮＧ＿００９９５２．２、ＮＧ＿００９５１７．１、ＮＭ＿０５２８３５．３、ＮＭ＿０１１２８７．２、ＮＭ＿００１１６２９３３．１、ＮＭ＿００９０７６．３、ＮＭ＿００９４３８．５、ＮＭ＿０２５９７４．２、ＮＭ＿０２５５８６．３、ＮＭ＿００１００２２３９．３、ＮＭ＿００９０７７．２、ＮＭ＿０２９７５１．４、ＮＭ＿００９０７８．２、ＮＭ＿０１９６４７．６、ＮＭ＿００９０７９．３、ＮＭ＿０２２８９１．３、ＮＭ＿０２４２１８．４、ＮＭ＿０１１９７５．３、ＮＭ＿００９０８１．２、ＮＭ＿００９０８２．２、ＮＭ＿００９０８３．４、ＮＭ＿０５３２５７．３、ＥＮＳＭＵＳＴ００００００８１８４０（ＮＭ＿１７２０８６．２）、ＮＭ＿０２６７２４．２、ＮＭ＿０２５５９２．３、ＮＭ＿０２５５８９．４、ＮＭ＿０２６０６９．３、ＮＭ＿００９０８４、ＮＭ＿０２６０５５．１、ＮＭ＿０２６５９４．２、ＮＭ＿００１１６３９４５．１、ＮＭ＿０２４２１２．４、ＮＭ＿０１６９８０．２、ＮＭ＿０１１２９０．５、ＮＭ＿０１１２９１．５、ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０２８９８（ＮＭ＿０１３７２１．３）、ＮＭ＿０２５４３３．３、ＮＭ＿０１２０５３．２、ＮＭ＿０１１２９２．２、ＮＭ＿００７４７５．５、ＮＭ＿０１８８５３．３、ＮＭ＿０２６０２０．６、ＮＭ＿０２５９６３．３、ＮＭ＿０１３７２５．４、ＮＭ＿０１１２９５．６、ＮＭ＿０２０６００．４、ＮＭ＿００９０９１．２、ＮＭ＿１７０６６９．２、ＮＭ＿０１３６４７．２、ＮＭ＿００９０９２．３、ＮＭ＿００８５０３．５、ＮＭ＿０２６１４７．５／ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１３８５０２、ＮＭ＿２０７６３５．１、ＮＭ＿０２４２６６．３、ＮＭ＿０１３７６５．２、ＮＭ＿０２４２７７．２、ＮＭ＿０２６４６７．３、ＮＭ＿０１２０５２．２、ＮＭ＿０１６９５９．４、ＥＮＳＭＵＳＴ００００００７１７４５、ＮＭ＿００９０９５．２、ＮＭ＿００９０９６．３、ＮＭ＿０１１３００．３、ＮＭ＿０１１０２９．４、ＮＭ＿０１８８６０．４、ＮＭ＿００１２７７１１３．１、ＮＭ＿００１２７７１１４．１、ＮＭ＿００１２７１５９０．１、ＮＭ＿００７９９０、ＮＭ＿０２５９１９、ＮＭ＿０１６７３８、ＮＭ＿０２６５１７、ＮＭ＿２０７５２３、ＮＭ＿００９０８０、ＮＭ＿０１１２８９、ＮＭ＿０１３７６２、ＮＭ＿０２１３３８、ＮＭ＿０１８７３０、ＮＭ＿０１９８６５、ＮＭ＿０２３３７２．２、ＮＭ＿０２６５３３．３、ＮＭ＿００９０９２、ＮＭ＿０１１２９６、ＮＭ＿０２３１３３、ＥＮＳＭＵＳＴ００００００５９０８０（ＮＭ＿０２５５８７．２）、ＮＭ＿０２４１７５、ＮＭ＿０２７０１５、ＮＭ＿０１６８４４、ＮＭ＿００９０９３．２、ＮＭ＿００９０９４、ＮＭ＿００９０９８、ＮＭ＿０２９７６７、及びＮＭ＿０１９８８３からなる群から選択される転写産物の３’−ＵＴＲ配列に由来する核酸配列を含むか又は対応する。

【0082】

語句「リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列」とは、好ましくは、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ配列、又はその断片若しくは一部に基づく核酸配列を指す。この語句は、リボソームタンパク質遺伝子の全３’−ＵＴＲ配列に対応する配列（即ち、完全長３’−ＵＴＲ配列）、及びリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。好ましくは、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの断片は、リボソームタンパク質遺伝子の完全長３’−ＵＴＲの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、リボソームタンパク質遺伝子の完全長３’−ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる断片は、本発明の意味において、好ましくは本明細書に記載する機能的断片である。好ましくは、前記断片は、３’−ＵＴＲ又はその断片に連結されているＯＲＦを翻訳するための調節機能を保持している。用語「リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ」は、好ましくは、自然界に存在するリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲを指す。

【0083】

用語「リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体」及び「その変異体」は、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲに関連して、自然界に存在するリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体、好ましくは、脊椎動物のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体、より好ましくは、哺乳類のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体、更により好ましくは、霊長類のリボソームタンパク質遺伝子（具体的には、上記ヒトリボソームタンパク質遺伝子）の３’−ＵＴＲの変異体を指す。かかる変異体は、リボソームタンパク質遺伝子の改変３’−ＵＴＲであってよい。例えば、変異体３’−ＵＴＲは、その変異体が由来する自然界に存在する３’−ＵＴＲに比べて、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加、及び／又は置換を示してよい。好ましくは、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する３’−ＵＴＲと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。好ましくは、変異体は、本明細書に記載する機能的変異体である。

【0084】

語句「リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列」は、好ましくは、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ配列の変異体、又は上記その断片若しくは一部に基づく核酸配列を指す。この用語は、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体の全配列（即ち、リボソームタンパク質遺伝子の完全長変異体３’−ＵＴＲ配列）に対応する配列、及びリボソームタンパク質遺伝子の変異体３’−ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。好ましくは、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体の断片は、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの完全長変異体の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの完全長変異体における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる変異体の断片は、本発明の意味において、好ましくは、本明細書に記載する変異体の機能的断片である。

【0085】

本発明において、用語「機能的変異体」、「機能的断片」、及び「変異体の機能的断片」（「機能的変異体断片」とも呼ばれる）は、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの断片、３’−ＵＴＲの変異体、又は３’−ＵＴＲの変異体の断片が、前記変異体、前記断片、又は前記変異体の断片が由来するリボソームタンパク質遺伝子の自然界に存在する３’−ＵＴＲの少なくとも１つの機能、好ましくは１超の機能を発揮することを意味する。かかる機能は、例えば、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）における、ｍＲＮＡの安定化、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の増強、安定化、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の延長、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質発現若しくは全タンパク質産生の増加であってよい。好ましくは、３’−ＵＴＲの機能は、ＯＲＦによってコードされているタンパク質の翻訳に関する。より好ましくは、前記機能は、３’−ＵＴＲ又はその断片若しくは変異体に連結されているＯＲＦの翻訳効率を増強することを含む。本発明における変異体、断片、及び変異体の断片は、以下のうちの少なくともいずれかの機能を発揮することが特に好ましい：好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス３’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡを安定化させる機能；好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス３’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を増強、安定化及び／又は延長する機能；並びに好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス３’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる機能。レファレンス３’−ＵＴＲは、例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲであってよい。更に、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片は、その変異体、断片、又は変異体断片が由来する野生型の３’−ＵＴＲに比べて、かかる３’−ＵＴＲの変異体、断片、又は変異体断片を含むｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じる効果を有しないことが好ましい。本発明において、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」又は「変異体の機能的断片」の特に好ましい機能は、上記機能的断片、機能的変異体、又は変異体の機能的断片を有するｍＲＮＡの発現によるタンパク質産生の増強、安定化及び／又は延長である。

【0086】

好ましくは、機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片によって発揮される１以上の機能の効率、例えば、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生安定化効率及び／又はタンパク質の産生増加効率は、前記変異体、前記断片、又は前記変異体断片が由来するリボソームタンパク質遺伝子の自然界に存在する３’−ＵＴＲによって発揮されるｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生安定化効率及び／又はタンパク質の産生増加効率に関して少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％増加する。

【0087】

本発明に関連して、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの断片又はリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体は、好ましくは、少なくとも約３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、又は少なくとも約３０ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの断片又はリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体の断片は、上記機能的断片である。好ましい実施形態では、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ又はその断片若しくは変異体は、３ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、より好ましくは１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、更により好ましくは１５ヌクレオチド〜９０ヌクレオチド、最も好ましくは２０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さを有する。

【0088】

好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」を含むか又はからなる。

【0089】

好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ）を含むそれぞれの核酸（レファレンス核酸）と比べて人工核酸分子の安定性を上昇させる、例えば、本発明に係るｍＲＮＡの安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ）を含むそれぞれの核酸と比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生の安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ）を含むそれぞれの核酸と比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を延長する。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ）を含むそれぞれの核酸と比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質発現及び／又は全タンパク質産生を増加させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ）を含むそれぞれの核酸の翻訳効率と比べて、核酸の翻訳効率に悪影響を与えない。更により好ましくは、その自然界の状況におけるそれぞれのＯＲＦによってコードされているタンパク質の翻訳効率に比べて、３’−ＵＴＲによって翻訳効率が増強される。

【0090】

この状況では、用語「それぞれの核酸分子」又は「レファレンス核酸分子」は、異なる３’−ＵＴＲは別にして、レファレンス核酸分子が、３’−ＵＴＲエレメントを含む本発明の人工核酸分子と類似している、好ましくは同一であることを意味する。

【0091】

人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からの「タンパク質産生を安定化及び／又は延長する」という用語は、好ましくは、哺乳類発現系（例えば、ＨｅＬａ又はＨＤＦ細胞）において（例えば、レファレンス３’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲを有しない）レファレンス人工核酸分子（例えば、レファレンスｍＲＮＡ）からのタンパク質産生と比べて、人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からのタンパク質産生が安定化及び／又は延長されることを意味する。したがって、人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質は、レファレンス核酸分子から産生されるタンパク質についてみられ得る期間よりも長い期間観察可能である。言い換えれば、経時的に測定される人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質の量は、経時的に測定されるレファレンス核酸分子（例えば、レファレンスｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質の量よりも遅い時点で閾値を下回る。かかる閾値は、例えば、核酸分子の発現開始（例えば、トランスフェクション）の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後等、発現の初期相において測定されるタンパク質の量であってよい。

【0092】

例えば、人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からのタンパク質産生は、哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞等の哺乳類細胞）において、レファレンス核酸分子（例えば、レファレンスｍＲＮＡ）からのタンパク質産生と比べて、少なくとも核酸分子の発現開始（例えば、トランスフェクション）の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後、発現の初期相において観察される量である量において、少なくとも約５時間、好ましくは少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも約２４時間延長される。したがって、本発明に係る人工核酸分子は、好ましくは、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子と比べて、少なくとも発現開始（例えば、トランスフェクション）の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後等、発現の初期相において観察される量である量において、タンパク質産生を少なくとも約５時間、好ましくは少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも約２４時間延長することができる。

【0093】

好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生期間は、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも２．５倍延長される。

【0094】

このタンパク質産生を延長する効果は、（ｉ）好ましくは哺乳類発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞）において、例えば、ルシフェラーゼ等のコードされているレポータータンパク質の発現によって得られるタンパク質量を経時的に測定し、（ｉｉ）タンパク質量が、人工核酸分子の発現開始の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後（例えば、トランスフェクションの１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後）等に観察されるタンパク質量を下回る時点を求め、（ｉｉｉ）前記タンパク質量が発現開始の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後に観察されたタンパク質量を下回る時点を、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲを含む核酸分子について求めた前記時点と比較することによって求めることができる。

【0095】

好ましくは、タンパク質産生に対するこの安定化及び／又は延長効果が得られると同時に、例えば、４８時間又は７２時間の期間内に本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量は、少なくとも、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲ（例えば、自然界において人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’−ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から産生されるタンパク質の量である。したがって、本発明は、上記の通り、哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞等の哺乳類細胞）においてタンパク質産生を延長及び／又は安定化させる人工核酸分子であって、例えば、４８時間又は７２時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲ（例えば、自然界において人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’−ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から前記期間内に産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。

【0096】

したがって、「安定したタンパク質発現」とは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、レファレンス３’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲを有しないｍＲＮＡ）と比べたとき、所定の期間、例えば、２４時間、より好ましくは４８時間、更により好ましくは７２時間に亘って本発明に係る人工核酸分子からより均一にタンパク質が産生されることを意味する。したがって、本発明に係る３’−ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからの（例えば、哺乳類系における）タンパク質産生のレベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、上記レファレンスｍＲＮＡ）について観察される程度まで低下することはない。例えば、発現開始の６時間後、例えば、本発明に係る人工核酸分子を細胞（例えば、哺乳類細胞）にトランスフェクトした６時間後に観察される（ＯＲＦによってコードされている）タンパク質の量は、発現開始の４８時間後、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質の量と同等であってよい。したがって、発現開始の４８時間後、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察される、例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）等のＯＲＦによってコードされているタンパク質の量の、発現開始の６時間後、例えば、トランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質の量に対する比は、本発明に係る核酸分子の場合、好ましくは少なくとも約０．４、より好ましくは少なくとも約０．５、より好ましくは少なくとも約０．６、更により好ましくは少なくとも約０．７である。好ましくは、前記比は、約０．４〜約４、好ましくは約０．６５〜約３、より好ましくは約０．７〜約２である。それぞれのレファレンス核酸分子（例えば、レファレンス３’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲを有しないｍＲＮＡ）の場合、前記比は、例えば、約０．０５〜約０．３であってよい。

【0097】

したがって、本発明は、ＯＲＦと上記３’−ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子であって、発現開始の４８時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量（例えば、ルシフェラーゼの量）の、発現開始の６時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量に対する比が、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞）において、好ましくは約０．４超、より好ましくは約０．５超、より好ましくは約０．６超、更により好ましくは約０．７超（例えば、約０．４〜約４、好ましくは約０．６５〜約３、より好ましくは約０．７〜約２）であり、好ましくは、例えば４８時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲ（例えば、自然界において前記人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’−ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から前記期間内に産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ＯＲＦと上記３’−ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子であって、例えば、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞）において、発現開始の７２時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量（例えば、ルシフェラーゼの量）の、発現開始の６時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量に対する比が、好ましくは、約０．４超、より好ましくは約０．５超、より好ましくは約０．６超、更により好ましくは約０．７超、例えば、約０．４〜約１．５、好ましくは約０．６５〜約１．１５、より好ましくは約０．７〜約１．０であり、好ましくは、例えば７２時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲ（例えば、自然界において前記人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’−ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から前記期間内に産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。

【0098】

本発明において、「タンパク質発現の増加」又は「タンパク質発現の増強」とは、好ましくは、レファレンス核酸分子によって誘導される発現と比べて発現開始後のある時点におけるタンパク質発現が増加／増強すること又は発現するタンパク質の合計量が増加／増強することを意味する。したがって、本発明に係る人工核酸分子の発現開始後（例えば、トランスフェクション後）、例えば、本発明に係るｍＲＮＡのトランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、又は７２時間後において観察されるタンパク質レベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、レファレンス３’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲを有しないレファレンスｍＲＮＡ）の発現開始後（例えば、トランスフェクション後）の同時点で観察されるタンパク質レベルよりも高い。好ましい実施形態では、人工核酸分子から発現するタンパク質の最大量（例えば、タンパク質の活性又は質量によって決定）は、レファレンス３’−ＵＴＲを含むか又は３’−ＵＴＲを有しないレファレンス核酸から発現するタンパク質量に比べて増加する。例えば、トランスフェクション後好ましくは４８時間以内、より好ましくは２４時間以内、更により好ましくは１２時間以内にピーク発現レベルに達する。

【0099】

１つの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子からの「合計タンパク質産生量の増加」又は「合計タンパク質産生量の増強」とは、３’−ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’−ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子と比べて、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞等の哺乳類細胞）において、人工核酸分子からタンパク質が産生される期間に亘って、タンパク質産生量が増加／増強することを指す。好ましい実施形態によれば、経時的に発現するタンパク質の累積量は、本発明に係る人工核酸分子を用いたときに増加する。

【0100】

本発明によれば、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ若しくはリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含む、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントを含まないか又はレファレンス３’−ＵＴＲを含むそれぞれの核酸分子（「レファレンス核酸」）と比べて、コードされているタンパク質の発現が増加することを特徴とする人工核酸分子が提供される。本発明の人工核酸分子によるインビボにおけるタンパク質産生を評価するために、標的細胞／組織に人工核酸分子を注入／トランスフェクトした後、コードされているタンパク質の発現を測定し、レファレンス核酸によって誘導されるタンパク質発現と比較した。タンパク質発現を測定する定量的な方法は、当該技術分野において公知である（例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、質量分析）。この状況において特に有用なのは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）等のレポータータンパク質の発現の測定である。したがって例えば、トランスフェクション又は注入を介して、本発明に係る人工核酸分子又はレファレンス核酸を標的組織又は細胞に導入する。核酸分子の発現開始又は導入の数時間又は数日間（例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、又は７２時間）後に、標的細胞サンプルを回収し、ＦＡＣＳを介して測定する及び／又は溶解させる。その後、溶解物を用いて、例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、質量分析等の幾つかの方法を用いて、又は蛍光若しくは発光測定によって、発現したタンパク質を検出することができる（延いては、タンパク質発現の効率を求めることができる）。

【0101】

したがって、特定の時点（例えば、核酸分子の発現開始又は導入の６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、又は７２時間後）において、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現をレファレンス核酸分子からのタンパク質発現と比較する場合、両核酸分子を別々に標的組織／細胞に導入し、特定の時点後に前記組織／細胞からサンプルを回収し、特定の検出方法（例えば、当該技術分野において公知であるウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等）に合わせた特定のプロトコールに従ってタンパク質溶解物を調製し、選択した検出方法によってタンパク質を検出する。細胞溶解物中の発現タンパク質量を測定する代わりに、又は回収した細胞を溶解させる前に若しくは並行してアリコートを用いて細胞溶解物中のタンパク質量を測定することに加えて、ＦＡＣＳ分析を用いることによってタンパク質量を求めてもよい。

【0102】

特定の期間における合計タンパク質量を測定する場合、人工核酸分子の導入後の幾つかの時点で（例えば、人工核酸分子の発現開始又は導入の６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後；通常、異なる試験動物から）組織又は細胞を回収し、上に説明した通り、時点当たりのタンパク質量を求めることができる。累積タンパク質量を計算するために、合計タンパク質量を求める数学的方法を用いてよく、例えば、以下の式に従って曲線下面積（ＡＵＣ）を求めてよい：

【数1】

。

【0103】

合計タンパク質量についての曲線下面積を計算するために、各エンドポイント（ａ及びｂ）からの発現曲線の積分式を計算する。

【0104】

したがって、「合計タンパク質産生量」は、好ましくは、経時的なタンパク質産生量を表す曲線下面積（ＡＵＣ）を指す。

【0105】

人工核酸分子の安定性上昇、タンパク質産生の安定性上昇、タンパク質産生の延長、並びに／又はタンパク質発現及び／若しくは全タンパク質産生の増加／増強は、好ましくは、３’−ＵＴＲを有しないそれぞれのレファレンス核酸分子（例えば、３’−ＵＴＲを有しないｍＲＮＡ）、又はレファレンス３’−ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子（例えば、上記の通り自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ）と比較することによって求められる。

【0106】

リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体、断片、及び／又は変異体断片のｍＲＮＡ及びタンパク質の少なくともいずれかの産生安定化効果及び効率、並びに／又はタンパク質産生増加効果及び効率に加えて、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントの産生安定化効果及び効率、並びに／又はタンパク質産生増加効果及び効率は、当業者に公知であるこの目的に適した任意の方法によって求めることができる。例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）のコード配列／オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、３’−ＵＴＲを含まない人工ｍＲＮＡ分子；自然界に存在するリボソームタンパク質遺伝子由来の３’−ＵＴＲを含む人工ｍＲＮＡ分子；レファレンス遺伝子由来の３’−ＵＴＲ（即ち、レファレンス３’−ＵＴＲ、例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’−ＵＴＲ）を含む人工ｍＲＮＡ分子；３’−ＵＴＲとして、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体を含む人工ｍＲＮＡ分子：３’−ＵＴＲとして、自然界に存在するリボソームタンパク質遺伝子の断片を含む人工ｍＲＮＡ分子；又は３’−ＵＴＲとして、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体の断片を含む人工ｍＲＮＡ分子を作製してよい。かかるｍＲＮＡは、例えば、Ｔ７プロモーターとそれぞれのｍＲＮＡ配列をコードしている配列とを含むプラスミドベクター等、それぞれのベクターのインビトロ転写によって作製することができる。作製されるｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡをトランスフェクトするのに適した任意のトランスフェクション法によって細胞にトランスフェクトしてよい。例えば、ＨＥＬＡ細胞等の哺乳類細胞にエレクトロポレーションし、トランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にサンプルを分析してよい。前記サンプルは、当業者に周知の方法によってｍＲＮＡ量及び／又はタンパク質量について分析してよい。例えば、サンプリング時点で細胞中に存在するレポーターｍＲＮＡの量は、定量ＰＣＲ法によって求めることができる。それぞれのｍＲＮＡによってコードされているレポータータンパク質の量は、例えば、用いられるレポータータンパク質に依存して、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳ分析、又はレポーターアッセイ（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）によって求めることができる。タンパク質発現の安定化及び／又はタンパク質発現の延長の効果は、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質レベルのトランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質レベルに対する比を求めることによって分析することができる。好ましくは、前記比の値は１を超える、即ち、より遅い時点におけるタンパク質発現がより早い時点におけるタンパク質発現よりも大きい。その比の値が１よりも小さい場合、前記値が１に近いほど、タンパク質がより安定になる。かかる測定は、無論、７２時間以上の時点で実施してもよく、タンパク質発現の安定性を求めるために、トランスフェクションの７２時間後に観察されるタンパク質レベルとトランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質レベルとの比を求めてもよい。

【0107】

好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の３’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ領域、好ましくは、リボソームタンパク質Ｌ９（ＲＰＬ９）、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）、リボソームタンパク質Ｌ４（ＲＰＬ４）、リボソームタンパク質Ｌ５（ＲＰＬ５）、リボソームタンパク質Ｌ６（ＲＰＬ６）、リボソームタンパク質Ｌ７（ＲＰＬ７）、リボソームタンパク質Ｌ７ａ（ＲＰＬ７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、リボソームタンパク質Ｌ１２（ＲＰＬ１２）、リボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）、リボソームタンパク質Ｌ２３（ＲＰＬ２３）、リボソームタンパク質Ｌ１８（ＲＰＬ１８）、リボソームタンパク質Ｌ１８ａ（ＲＰＬ１８Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、リボソームタンパク質Ｌ２１（ＲＰＬ２１）、リボソームタンパク質Ｌ２２（ＲＰＬ２２）、リボソームタンパク質Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ１７（ＲＰＬ１７）、リボソームタンパク質Ｌ２４（ＲＰＬ２４）、リボソームタンパク質Ｌ２６（ＲＰＬ２６）、リボソームタンパク質Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、リボソームタンパク質Ｌ３０（ＲＰＬ３０）、リボソームタンパク質Ｌ２７ａ（ＲＰＬ２７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ２８（ＲＰＬ２８）、リボソームタンパク質Ｌ２９（ＲＰＬ２９）、リボソームタンパク質Ｌ３１（ＲＰＬ３１）、リボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質Ｌ３５ａ（ＲＰＬ３５Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａ（ＲＰＬ３７Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３８（ＲＰＬ３８）、リボソームタンパク質Ｌ３９（ＲＰＬ３９）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０（ＲＰＬＰ０）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ１（ＲＰＬＰ１）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ２（ＲＰＬＰ２）、リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）、リボソームタンパク質Ｓ３Ａ（ＲＰＳ３Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ４、Ｘ連鎖（ＲＰＳ４Ｘ）、リボソームタンパク質Ｓ４、Ｙ連鎖１（ＲＰＳ４Ｙ１）、リボソームタンパク質Ｓ５（ＲＰＳ５）、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、リボソームタンパク質Ｓ７（ＲＰＳ７）、リボソームタンパク質Ｓ８（ＲＰＳ８）、リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ＲＰＳ１０）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ＲＰＳ１１）、リボソームタンパク質Ｓ１２（ＲＰＳ１２）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、リボソームタンパク質Ｓ１５（ＲＰＳ１５）、リボソームタンパク質Ｓ１５ａ（ＲＰＳ１５Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）、リボソームタンパク質Ｓ１９（ＲＰＳ１９）、リボソームタンパク質Ｓ２０（ＲＰＳ２０）、リボソームタンパク質Ｓ２１（ＲＰＳ２１）、リボソームタンパク質Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、リボソームタンパク質Ｓ２５（ＲＰＳ２５）、リボソームタンパク質Ｓ２６（ＲＰＳ２６）、リボソームタンパク質Ｓ２７（ＲＰＳ２７）、リボソームタンパク質Ｓ２７ａ（ＲＰＳ２７ａ）、リボソームタンパク質Ｓ２８（ＲＰＳ２８）、リボソームタンパク質Ｓ２９（ＲＰＳ２９）、リボソームタンパク質Ｌ１５（ＲＰＬ１５）、リボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）、リボソームタンパク質Ｌ１４（ＲＰＬ１４）、リボソームタンパク質Ｓ１４（ＲＰＳ１４）、リボソームタンパク質Ｌ１０（ＲＰＬ１０）、リボソームタンパク質Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３５（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３６（ＲＰＬ３６）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ（ＲＰＬ３６Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ４１（ＲＰＬ４１）、リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、リボソームタンパク質Ｓ２４（ＲＰＳ２４）、リボソームタンパク質Ｌ８（ＲＰＬ８）、リボソームタンパク質Ｌ３４（ＲＰＬ３４）、リボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）、リボソームタンパク質ＳＡ（ＲＰＳＡ）、又はリボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）の３’−ＵＴＲ領域に由来する。別の実施形態では、３’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードしている遺伝子又はユビキチンＡ−５２残基リボソームタンパク質融合生成物１（ＵＢＡ５２）、遍在的に発現するＦｉｎｋｅｌ−Ｂｉｓｋｉｓ−Ｒｅｉｌｌｙマウス肉腫ウイルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）（ＦＡＵ）、リボソームタンパク質Ｌ２２様１（ＲＰＬ２２Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ３９様（ＲＰＬ３９Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ１０様（ＲＰＬ１０Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、リボソームタンパク質Ｌ３様（ＲＰＬ３Ｌ）、リボソームタンパク質Ｓ２７様（ＲＰＳ２７Ｌ）、リボソームタンパク質Ｌ２６様１（ＲＰＬ２６Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ７様１（ＲＰＬ７Ｌ１）、リボソームタンパク質Ｌ１３ａシュードジーン（ＲＰＬ１３ＡＰ）、リボソームタンパク質Ｌ３７ａシュードジーン８（ＲＰＬ３７ＡＰ８）、リボソームタンパク質Ｓ１０シュードジーン５（ＲＰＳ１０Ｐ５）、リボソームタンパク質Ｓ２６シュードジーン１１（ＲＰＳ２６Ｐ１１）、リボソームタンパク質Ｌ３９シュードジーン５（ＲＰＬ３９Ｐ５）、リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０シュードジーン６（ＲＰＬＰ０Ｐ６）、及びリボソームタンパク質Ｌ３６シュードジーン１４（ＲＰＬ３６Ｐ１４）から選択される遺伝子に由来していてもよい。更に、本発明に係る人工核酸分子の３’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは、リボソームタンパク質Ｓ４様（ＲＰＳ４ｌ）、推定６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａ、推定６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３７ａ様タンパク質、推定４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１０様、推定４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２６様１、推定６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３９様５、又は６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ０−様からなる群から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲ領域に由来する。

【0108】

特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の３’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲ領域、好ましくは、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ＲＰＬ１１）、リボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）、リボソームタンパク質Ｌ２３（ＲＰＬ２３）、リボソームタンパク質Ｌ２３ａ（ＲＰＬ２３Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ２６（ＲＰＬ２６）、リボソームタンパク質Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、リボソームタンパク質Ｌ３５ａ（ＲＰＬ３５Ａ）、リボソームタンパク質Ｌ３８（ＲＰＬ３８）、リボソームタンパク質Ｓ４、Ｘ連鎖（ＲＰＳ４Ｘ）、リボソームタンパク質Ｓ８（ＲＰＳ８）、リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、リボソームタンパク質Ｓ１９（ＲＰＳ１９）、リボソームタンパク質Ｓ２１（ＲＰＳ２１）、リボソームタンパク質Ｓ２３（ＲＰＳ２３）、リボソームタンパク質Ｓ２７（ＲＰＳ２７）、リボソームタンパク質Ｓ２８（ＲＰＳ２８）、リボソームタンパク質Ｓ２９（ＲＰＳ２９）、リボソームタンパク質Ｌ３６（ＲＰＬ３６）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ（ＲＰＬ３６Ａ）、リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）、又はリボソームタンパク質Ｓ１７（ＲＰＳ１７）の３’−ＵＴＲ領域に由来する。別の好ましい実施形態では、３’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードしている遺伝子、又はユビキチンＡ−５２残基リボソームタンパク質融合生成物１（ＵＢＡ５２）、遍在的に発現するＦｉｎｋｅｌ−Ｂｉｓｋｉｓ−Ｒｅｉｌｌｙマウス肉腫ウイルス（ＦＢＲ−ＭｕＳＶ）（ＦＡＵ）、及びリボソームタンパク質Ｌ２２様１（ＲＰＬ２２Ｌ１）から選択される遺伝子に由来していてよい。

【0109】

好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１０〜配列番号１１５に係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列等のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの核酸配列に対して少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【表15】

【表16】

【表17】

【表18】

【表19】

【表20】

【表21】

【0110】

更に好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１１６〜配列番号２０５に係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列等、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの核酸配列に対して少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。

【表22】

【表23】

【表24】

【表25】

【表26】

【表27】

【表28】

【表29】

【表30】

【表31】

【表32】

【表33】

【表34】

【0111】

好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質スモール９（ＲＰＳ９）の３’−ＵＴＲ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。最も好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。

【表35】

【0112】

また、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１０〜配列番号２０５に係る配列の３’−ＵＴＲ等のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列の断片を含んでいてもよく又はからなっていてもよく、前記断片は、好ましくは、上記の機能的断片又は機能的変異体断片である。かかる断片は、好ましくは、少なくとも約３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、又は少なくとも約３０ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチドの長さを有する。好ましい実施形態では、その断片又は変異体は、３ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、より好ましくは１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、更により好ましくは１５ヌクレオチド〜９０ヌクレオチド、最も好ましくは２０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さを有する。

【0113】

好ましくは、前記変異体、断片、又は変異体断片は、配列番号１０〜配列番号２０５に係る核酸配列の少なくとも１つの機能（例えば、本発明に係る人工核酸分子の安定化、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現の安定化及び／又は延長、タンパク質産生の増加の少なくともいずれか）を、配列番号１又は配列番号２に係る核酸配列を含む人工核酸分子によって示される安定化効率及び／又はタンパク質産生増加効率の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の効率で示す上記機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片である。

【0114】

好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、少なくとも約３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、又は少なくとも約３０ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチドの長さを有する。３’−ＵＴＲエレメントの長さの上限は、５００ヌクレオチド以下、例えば、４００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、又は１００ヌクレオチドであってよい。他の実施形態については、上限は、５０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲内で選択してよい。例えば、その断片又は変異体は、３ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、好ましくは５ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、より好ましくは１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、更により好ましくは１５ヌクレオチド〜９０ヌクレオチド、最も好ましくは２０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さを有する。

【0115】

更に、本発明に係る人工核酸分子は、１超の上記３’−ＵＴＲエレメントを含んでいてよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、１、２、３、４、又はそれ以上の３’−ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、個々の３’−ＵＴＲエレメントは、同一であっても異なっていてもよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、２つの本質的に同一の上記３’−ＵＴＲエレメント（例えば、配列番号１０〜２０５に係る配列等、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲに由来するか、又は配列番号１若しくは２に係る核酸配列等、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの断片若しくは変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる２つの３’−ＵＴＲエレメント）、その機能的変異体、その機能的断片、又はその機能的変異体断片を含んでいてよい。

【0116】

驚くべきことに、本発明者らは、上記３’−ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子が、タンパク質産生を増強、延長及び／又は安定化できるｍＲＮＡ分子を表し得るか又は提供し得ることを見出した。したがって、本明細書に記載する３’−ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ分子からのタンパク質発現の安定性を改善する及び／又は翻訳効率を改善することができる。

【0117】

本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡベクター）であってよく、改変ＲＮＡ分子又は改変ＤＮＡ分子であってもよい。それは、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖分子として、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するＤＮＡ分子として提供され得る。

【0118】

本発明に係る人工核酸分子は、更に、任意で５’−ＵＴＲ及び／又は５’−キャップを含んでいてよい。任意の５’−キャップ及び／又は５’−ＵＴＲは、好ましくは、本発明に係る人工核酸分子内のＯＲＦの５’側に位置する。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルを更に含む。好ましくは、任意のポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントの３’側に位置し、好ましくは、任意のポリ（Ａ）配列が、３’−ＵＴＲエレメントの３’末端に連結されている。直接連結されていてもよく、又は（例えば、１以上の制限酵素部位を含むか又はからなる１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド、好ましくは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドのリンカーを介する等、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等のヌクレオチドを介して）間接的に連結されていてもよい。

【0119】

１つの実施形態では、任意のポリアデニル化シグナルは、３’−ＵＴＲエレメントの３’の下流に位置する。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎは、Ａ又はＵである）、好ましくはＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡを含む。かかるコンセンサス配列は、大部分の動物及び細菌の細胞系によって、例えば、ＣｓｔＦ、ＰＡＰ、ＰＡＢ２、ＣＦＩ及び／又はＣＦＩＩと協働する切断／ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）等のポリアデニル化因子によって認識され得る。ポリアデニル化シグナルは、好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントの３’末端の約５０ヌクレオチド未満下流、より好ましくは約３０塩基未満下流、最も好ましくは約２５塩基未満下流、例えば、２１塩基下流に位置することが好ましい。

【0120】

例えば、３’−ＵＴＲエレメントの下流にポリアデニル化シグナルを含む本発明に係る人工核酸分子（例えば、人工ＤＮＡ分子）の転写により、その３’−ＵＴＲエレメントの下流にポリアデニル化シグナルを含有する未成熟ＲＮＡが得られる。例えば、配列番号１に係る３’−ＵＴＲエレメントを含むＤＮＡ分子の転写により、配列番号２に係る３’−ＵＴＲエレメントを有するＲＮＡが得られる。

【0121】

次いで、適切な転写系を用いることにより、ポリ（Ａ）配列を未成熟ＲＮＡに結合させる。例えば、本発明の人工核酸分子は、上記３’−ＵＴＲエレメントとポリアデニル化シグナルとを含むＤＮＡ分子であってよく、このことにより、前記ＤＮＡ分子の転写時にＲＮＡがポリアデニル化され得る。したがって、得られるＲＮＡは、本発明の３’−ＵＴＲエレメントとそれに続くポリ（Ａ）配列との組み合わせを含んでいてよい。

【0122】

潜在的な転写系は、インビトロ転写系又は細胞転写系等である。したがって、本発明に係る人工核酸分子の転写、例えば、オープンリーディングフレームと、３’−ＵＴＲエレメントと、ポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子の転写により、オープンリーディングフレームと、３’−ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子を得ることができる。

【0123】

したがって、本発明は、また、オープンリーディングフレームと、上記３’−ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。

【0124】

１つの実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号１に係る配列、又は配列番号１に対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又は上記これらの断片とを含む人工ＤＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。更に、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号２に係る配列、又は配列番号２に対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又は上記これらの断片とを含む人工ＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。

【0125】

したがって、本発明は、翻訳効率に関して安定化及び最適化されているＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子のテンプレートとして機能し得る人工核酸分子を提供する。言い換えれば、人工核酸分子は、ｍＲＮＡを産生するためのテンプレートとして用いることができるＤＮＡであってよい。得ることができるｍＲＮＡは、次いで、オープンリーディングフレームによってコードされている所望のペプチド又はタンパク質を産生するために翻訳され得る。人工核酸分子がＤＮＡである場合、例えば、インビトロ又はインビボでｍＲＮＡを継続して繰り返し産生するための二本鎖保管形態として用いてよい。

【0126】

別の実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の３’−ＵＴＲは、ポリアデニル化シグナルもポリ（Ａ）配列も含まない。更に好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ポリアデニル化シグナルもポリ（Ａ）配列も含まない。より好ましくは、人工核酸分子又は本発明の人工核酸分子の３’−ＵＴＲは、ポリアデニル化シグナルを含まず、特に、ポリアデニル化シグナルＡＡＵ／ＴＡＡＡを含まない。

【0127】

１つの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列を更に含む。例えば、ＯＲＦに続いてリボソーム３’ＵＴＲを含むＤＮＡ分子は、得られるｍＲＮＡにおいてポリ（Ａ）配列に転写され得る一続きのチミジンヌクレオチドを含有し得る。ポリ（Ａ）配列の長さは、変動してよい。例えば、ポリ（Ａ）配列は、約２０アデニンヌクレオチド〜約３００アデニンヌクレオチド、好ましくは約４０アデニンヌクレオチド〜約２００アデニンヌクレオチド、より好ましくは約５０アデニンヌクレオチド〜約１００アデニンヌクレオチド、例えば、約６０アデニンヌクレオチド、約７０アデニンヌクレオチド、約８０アデニンヌクレオチド、約９０アデニンヌクレオチド、又は約１００アデニンヌクレオチドの長さを有していてよい。より好ましくは、本発明の核酸分子は、約６０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、最も好ましくは６４アデニンヌクレオチドのポリ（Ａ）配列を含む。

【0128】

例えば、本発明に係る人工核酸分子は、以下のＤＮＡ配列に対応する核酸配列を含んでいてよい。

【表36】

【0129】

かかる配列の転写により、以下の配列を含む人工核酸分子を得ることができる。

【表37】

【0130】

また、かかる人工ＲＮＡ分子、即ち、配列番号４に係る配列を含む人工核酸分子は、必ずしもＤＮＡ親から転写されることなしに一般的な化学合成法によってインビトロで得ることもできる。

【0131】

特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、５’から３’方向に、オープンリーディングフレームと、上記３’−ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子である。

【0132】

好ましくは、オープンリーディングフレームは、リボソームタンパク質をコードしていない。好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは、本発明の人工核酸の３’−ＵＴＲエレメントが由来するリボソームタンパク質、特に哺乳類のリボソームタンパク質をコードしていないが、但し、３’−ＵＴＲエレメントは、哺乳類のリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲと同一である。幾つかの更なる好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは、ＲＰＳ９又はその変異体をコードしていないが、但し、３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１又は配列番号２と同一の配列である。

【0133】

好ましい実施形態では、ＯＲＦは、ヒト又は植物、特にアラビドプシスのリボソームタンパク質をコードしておらず、特に、ヒトリボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、ヒトリボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、又はアラビドプシスリボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）をコードしていない。更に好ましい実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、どんな起源であろうと、リボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）、リボソームタンパク質Ｌ３６ａ様（ＲＰＬ３６ＡＬ）、又はリボソームタンパク質Ｓ１６（ＲＰＳ１６）をコードしていない。

【0134】

１つの実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、３’−ＵＴＲが由来するリボソームタンパク質以外のペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと；配列番号１に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’−ＵＴＲエレメントと；ポリアデニル化シグナル及び／又はポリ（Ａ）配列とを含む人工ＤＮＡ分子を提供する。更に、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、３’−ＵＴＲが由来するリボソームタンパク質以外の任意のペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと；配列番号３に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’−ＵＴＲエレメントとを含む人工ＤＮＡ分子を提供する。

【0135】

更に、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、３’−ＵＴＲが由来するリボソームタンパク質以外のペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと；配列番号２に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’−ＵＴＲエレメントと；ポリアデニル化シグナル及び／又はポリ（Ａ）配列とを含む人工ＲＮＡ分子、好ましくは、人工ｍＲＮＡ分子、又は人工ウイルスＲＮＡ分子を提供する。更に、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、３’−ＵＴＲが由来するリボソームタンパク質以外のペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと；配列番号４に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’−ＵＴＲエレメントとを含む人工ＲＮＡ分子（好ましくは、人工ｍＲＮＡ分子又は人工ウイルスＲＮＡ分子）を提供する。

【0136】

本発明は、コードされているペプチド又はタンパク質発現の安定性を増強し、延長することを特徴とし得る人工核酸分子（好ましくは、人工ｍＲＮＡ）を提供する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、タンパク質発現の安定性の増強、延いてはタンパク質発現の延長は、人工核酸分子（例えば、本発明に係る人工ｍＲＮＡ分子）の分解減少に起因している可能性がある。したがって、本発明の３’−ＵＴＲエレメントは、人工核酸が分解及び崩壊するのを防ぐことができる。

【0137】

幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列に加えて、ヒストンステムループを含んでいてよい。本発明に係る人工核酸分子は、例えば、５’から３’方向に、ＯＲＦと、３’−ＵＴＲエレメントと、任意のヒストンステムループ配列と、任意のポリ（Ａ）配列／又はポリアデニル化シグナルと、任意のポリ（Ｃ）配列とを含んでいてよい。また、前記人工核酸分子は、５’から３’方向に、ＯＲＦと、３’−ＵＴＲエレメントと、任意のポリ（Ａ）配列と、任意のポリ（Ｃ）配列と、任意のヒストンステムループ配列とを含んでいてもよい。

【0138】

好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも１つのヒストンステムループを含む。

【0139】

かかるヒストンステムループ配列は、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１２／０１９７８０号に開示されているヒストンステムループ配列から選択することが好ましい。

【0140】

本発明において用いるのに好適なヒストンステムループ配列は、以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）のうちの少なくとも１つから選択することが好ましい：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：

【化1】

式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：

【化2】

（式中、
ステム１又はステム２の境界エレメントＮ_１−６は、１個〜６個、好ましくは２個〜６個、より好ましくは２個〜５個、更により好ましくは３個〜５個、最も好ましくは４個〜５個、又は５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１［Ｎ_０−２ＧＮ_３−５］は、エレメントステム２に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ_０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ_３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｇは、グアノシン又はそのアナログであり、任意でシチジン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム２におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列［Ｎ_０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ_０−４］は、エレメントステム１とステム２との間に位置し、且つ３個〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、
各Ｎ_０−４は、互いに独立して、０個〜４個、好ましくは１個〜３個、より好ましくは１個〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、Ｕ／Ｔは、ウリジン又は任意でチミジンを表し、
ステム２［Ｎ_３−５ＣＮ_０−２］は、エレメントステム１に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５個〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ_３−５は、３個〜５個、好ましくは４個〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ_０−２は、０個〜２個、好ましくは０個〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、若しくはＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｃは、シチジン又はそのアナログであり、任意でグアノシン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム１におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム１及びステム２は、互いに塩基対合して逆相補的配列を形成することができる（前記塩基対合は、例えば、ヌクレオチドＡとＵ／Ｔ若しくはＧとＣとのワトソン−クリック塩基対合、又は非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対合、逆ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合、逆フーグスティーン塩基対合）によってステム１とステム２との間で生じ得る）か、或いは、互いに塩基対合して部分的に逆相補的な配列を形成することができる（一方のステムにおける１以上の塩基が、他方のステムの逆相補的な配列において相補的塩基を有しないことに基づいて、ステム１とステム２との間で不完全な塩基対合が生じ得る）。

【0141】

更に好ましい実施形態によれば、ヒストンステムループ配列は、以下の特定の式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）のうちの少なくとも１つに従って選択してよい：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：

【化3】

式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：

【化4】

（式中、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵは、上に定義した通りである）。

【0142】

第１の態様の更により特に好ましい実施形態によれば、人工核酸分子配列は、以下の特定の式（Ｉｂ）又は（ＩＩｂ）のうちの少なくともに係る少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含んでよい：
式（Ｉｂ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：

【化5】

式（ＩＩｂ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：

【化6】

（式中、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵは、上に定義した通りである）。

【0143】

特に好ましいヒストンステムループ配列は、配列番号５：ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡに係る配列、又はより好ましくは、配列番号５に係る核酸配列に対応するＲＮＡ配列である。

【0144】

一例として、単一エレメントは、以下の順に人工核酸分子中に存在してよい：
５’−ｃａｐ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列；
５’−ｃａｐ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ；
５’−ｃａｐ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列；
５’−ｃａｐ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列；
５’−ｃａｐ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ；
５’−ｃａｐ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ；
５’−ｃａｐ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列；
５’−ｃａｐ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ；等。

【0145】

幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、更なるエレメント（例えば、５’−キャップ、ポリ（Ｃ）配列、及び／又はＩＲＥＳモチーフ）を含む。５’−キャップは、転写中又は転写後にＲＮＡの５’末端に付加してよい。更に、本発明の人工核酸分子は、特に核酸がｍＲＮＡの形態であるか又はｍＲＮＡをコードしている場合、少なくとも１０個のシチジン、好ましくは少なくとも２０個のシチジン、より好ましくは少なくとも３０個のシチジンの配列（所謂「ポリ（Ｃ）配列」）によって修飾されてよい。具体的には、本発明の人工核酸分子は、特に核酸が（ｍ）ＲＮＡの形態であるか又はｍＲＮＡをコードしている場合、典型的に約１０シチジンヌクレオチド〜約２００シチジンヌクレオチド、好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約１００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約７０シチジンヌクレオチド、又は更により好ましくは約２０シチジンヌクレオチド〜約５０シチジンヌクレオチド、又は更には２０シチジンヌクレオチド〜３０シチジンヌクレオチドのポリ（Ｃ）配列を含有していてよい。最も好ましくは、本発明の核酸は、３０シチジン残基のポリ（Ｃ）配列を含む。したがって、好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、好ましくは５’から３’方向に、ＯＲＦと、上記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルと、ポリ（Ｃ）配列とを含む。

【0146】

配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列又はＩＲＥＳモチーフは、例えば、人工核酸分子が２以上のペプチド又はタンパク質をコードしている場合、幾つかのオープンリーディングフレームを分離することができる。ＩＲＥＳ配列は、人工核酸分子が２シストロン性又は多シストロン性の核酸分子である場合、特に有用であり得る。

【0147】

更に、人工核酸分子は、更なる５’エレメント、好ましくは５’−ＵＴＲ、プロモーター、又は５’−ＵＴＲ及びプロモーター含有配列を含んでいてよい。プロモーターは、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係る人工ＤＮＡ分子の転写を駆動及び／又は制御することができる。更に、５’−ＵＴＲは、本明細書に定義する遺伝子の５’−ＵＴＲを含んでよい。更に、５’−ＵＴＲは、本発明の３’−ＵＴＲエレメントと相互作用し得、それによって、本発明の３’−ＵＴＲエレメントの安定化効果を支持し得る。かかるエレメントは、更に、安定性及び翻訳効率を支持し得る。したがって、幾つかの実施形態では、本発明は、５’から３’方向に、以下の構造のうちの少なくとも１つを含む人工核酸分子、好ましくはｍＲＮＡ分子を提供する：
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列
５’−キャップ−５’−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’−ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ。

【0148】

本発明の特に好ましい実施形態では、人工核酸分子は、好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの断片、ホモログ、若しくは変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる、５００ヌクレオチド未満、４００ヌクレオチド未満、３００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、１５０ヌクレオチド未満、若しくは１００ヌクレオチド未満及び／又は２０ヌクレオチド超、３０ヌクレオチド超、４０ヌクレオチド超、５０ヌクレオチド超、若しくは６０ヌクレオチド超の長さの少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）を含む。

【0149】

５’ＵＴＲエレメントは、上に定義した通り、ＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰも含まないことが特に好ましい。

【0150】

ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列は、真核生物ＴＯＰ遺伝子、好ましくは、植物又は動物のＴＯＰ遺伝子、より好ましくは、脊索動物ＴＯＰ遺伝子、更により好ましくは、脊椎動物ＴＯＰ遺伝子、最も好ましくは、哺乳類ＴＯＰ遺伝子（例えば、ヒトＴＯＰ遺伝子）に由来する。

【0151】

例えば、５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２からなる群から選択される核酸配列；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２のホモログ；これらの変異体；又は好ましくは、対応するＲＮＡ配列に由来する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントから選択される。「国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２のホモログ」という用語は、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２に係る配列に対して相同である、ヒト以外の種の配列を指す。

【0152】

好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、５位ヌクレオチド（即ち、配列において５位に位置するヌクレオチド）から（配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２から選択される核酸配列；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２のホモログ；これらの変異体；又は対応するＲＮＡ配列のＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に由来する核酸配列を含むか又はからなる。５’ＵＴＲエレメントは、５’ＴＯＰの直ぐ３’側のヌクレオチド位置から（配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、（例えば、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２から選択される核酸配列；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２のホモログ；これらの変異体；又は対応するＲＮＡ配列のＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に由来することが特に好ましい。

【0153】

特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを有しない、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１２８４、１２８５、１２８６、１２８７、１２８８、１２８９、１２９０、１２９１、１２９２、１２９３、１２９４、１２９５、１２９６、１２９７、１２９８、１２９９、１３００、１３０１、１３０２、１３０３、１３０４、１３０５、１３０６、１３０７、１３０８、１３０９、１３１０、１３１１、１３１２、１３１３、１３１４、１３１５、１３１６、１３１７、１３１８、１３１９、１３２０、１３２１、１３２２、１３２３、１３２４、１３２５、１３２６、１３２７、１３２８、１３２９、１３３０、１３３１、１３３２、１３３３、１３３４、１３３５、１３３６、１３３７、１３３８、１３３９、１３４０、１３４１、１３４２、１３４３、１３４４、１３４６、１３４７、１３４８、１３４９、１３５０、１３５１、１３５２、１３５３、１３５４、１３５５、１３５６、１３５７、１３５８、１３５９、又は１３６０のいずれかに係る核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又はこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。上記の通り、５位から（配列の３’末端に位置する）ＡＴＧの直ぐ５’側のヌクレオチドまで延在する配列は、前記配列の５’ＵＴＲに相当する。

【0154】

好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲのホモログ若しくは変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを有しない、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号６７、２５９、１２８４〜１３１８、１３４４、１３４６、１３４８〜１３５４、１３５７、１３５８、１４２１、及び１４２２のいずれかに係る核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。

【0155】

特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子、好ましくは、脊椎動物リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、より好ましくは、哺乳類リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、最も好ましくは、ヒトリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲ、又はリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子、好ましくは、脊椎動物リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、より好ましくは、哺乳類リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、最も好ましくは、ヒトリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、前記５’ＵＴＲエレメントは、前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。

【0156】

したがって、特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号６に係る核酸配列（５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’ＵＴＲ：ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＴＡＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣ；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８に対応）、又は好ましくは、対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号６に係る核酸配列、又はより好ましくは対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなり、好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、完全長５’ＵＴＲの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。好ましくは、前記断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上の長さを有する。好ましくは、前記断片は、本明細書に記載する機能的断片である。

【0157】

幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１Ｄ、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｆ、ＥＩＦ３Ｈ、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＩＦ３ＥＩＰ、ＥＩＦ４Ａ２、ＰＡＢＰＣ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＰＴ１、ＴＵＢＢ１、ＵＢＡ５２、ＮＰＭ１、ＡＴＰ５Ｇ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＵＱＣＲＢ又はこれらのホモログ若しくは変異体から選択される脊椎動物のＴＯＰ遺伝子（例えば、ヒト等の哺乳類のＴＯＰ遺伝子）の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含み、好ましくは、前記５’ＵＴＲエレメントは、前記遺伝子のＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰも含まず、任意で、前記５’ＵＴＲエレメントは、その５’末端において、５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に位置するヌクレオチドで始まり、更に、任意で、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、その３’末端において、それが由来する遺伝子の開始コドン（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に位置するヌクレオチドで終結する。

【0158】

好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはオープンリーディングフレームは、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されている。したがって、本発明の人工核酸分子は、前記分子のＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量を改変することによって熱力学的に安定化させることができる。好ましくは遺伝コードの縮重を用いることによって、相当する野生型配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量と比べて本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させてよい。したがって、人工核酸分子のコードされているアミノ酸配列は、好ましくは、特定の野生型配列のコードされているアミノ酸配列と比べて、Ｇ／Ｃ改変によって改変されないことが好ましい。したがって、翻訳されるアミノ酸配列を維持しながら含まれるＧ／Ｃヌクレオチドの量が増えるように、野生型コード配列と比べてコード配列又は人工核酸分子全体（例えば、ｍＲＮＡ）のコドンを変化させてよい。幾つかのコドンが１つの同じアミノ酸をコードしている（所謂、遺伝コードの縮重）という事実に起因して、コードされているペプチド／タンパク質配列を変化させることなくコドンを変化させることが実行可能である（所謂、代替コドンの利用）。したがって、（同じアミノ酸をコードしているそれぞれの野生型コドンへの交換において）特異的に特定のコドンを導入することが可能であり、これは、被験体におけるＲＮＡの安定性及び／又はコドン利用に関してより好ましい（所謂、コドンの最適化）。

【0159】

本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のコード領域によってコードされているアミノ酸によっては、その野生型コード領域に対して、核酸配列、例えばコード領域を様々に改変できる可能性がある。Ｇ又はＣヌクレオチドのみを含有するコドンによってコードされているアミノ酸の場合、コドンを改変する必要はない。したがって、Ｐｒｏ（ＣＣＣ又はＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ又はＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣ又はＧＣＧ）、及びＧｌｙ（ＧＧＣ又はＧＧＧ）のコドンは、ＡもＵ／Ｔも存在しないので、改変する必要がない。

【0160】

対照的に、Ａ及び／又はＵ／Ｔヌクレオチドを含有するコドンは、同じアミノ酸をコードしているがＡ及び／又はＵ／Ｔを含有していない他のコドンで置換することによって改変してよい。例えば、
Ｐｒｏのコドンは、ＣＣ（Ｕ／Ｔ）又はＣＣＡからＣＣＣ又はＣＣＧに改変してよい；
Ａｒｇのコドンは、ＣＧ（Ｕ／Ｔ）又はＣＧＡ又はＡＧＡ又はＡＧＧからＣＧＣ又はＣＧＧに改変してよい；
Ａｌａのコドンは、ＧＣ（Ｕ／Ｔ）又はＧＣＡからＧＣＣ又はＧＣＧに改変してよい；
Ｇｌｙのコドンは、ＧＧ（Ｕ／Ｔ）又はＧＧＡからＧＧＣ又はＧＧＧに改変してよい。

【0161】

他の場合、Ａ又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドをコドンからなくすことはできないが、Ａ及び／又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドの含量が低いコドンを使用することによってＡ及び（Ｕ／Ｔ）含量を減少させることができる。その例は、以下の通りである：
Ｐｈｅのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｌｅｕのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ａ、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｇ、Ｃ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＣ（Ｕ／Ｔ）ＡからＣ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＣ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ｓｅｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｃ（Ｕ／Ｔ）又は（Ｕ／Ｔ）ＣＡ又はＡＧ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＣＣ、（Ｕ／Ｔ）ＣＧ又はＡＧＣに改変してよい；
Ｔｙｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ａ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＡＣに改変してよい；
Ｃｙｓのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｇ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＧＣに改変してよい；
Ｈｉｓのコドンは、ＣＡ（Ｕ／Ｔ）からＣＡＣに改変してよい；
Ｇｌｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに改変してよい；Ｉｌｅのコドンは、Ａ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＡ（Ｕ／Ｔ）ＡからＡ（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｔｈｒのコドンは、ＡＣ（Ｕ／Ｔ）又はＡＣＡからＡＣＣ又はＡＣＧに改変してよい；
Ａｓｎのコドンは、ＡＡ（Ｕ／Ｔ）からＡＡＣに改変してよい；
Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに改変してよい；
Ｖａｌのコドンは、Ｇ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＧ（Ｕ／Ｔ）ＡからＧ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＧ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ａｓｐのコドンは、ＧＡ（Ｕ／Ｔ）からＧＡＣに改変してよい；
Ｇｌｕのコドンは、ＧＡＡからＧＡＧに改変してよい；
終止コドン（Ｕ／Ｔ）ＡＡは、（Ｕ／Ｔ）ＡＧ又は（Ｕ／Ｔ）ＧＡに改変してよい。

【0162】

他方、Ｍｅｔ（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）及びＴｒｐ（（Ｕ／Ｔ）ＧＧ）のコドンの場合、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに配列を改変することはできない。

【0163】

上記置換は、その特定の野生型オープンリーディングフレーム（即ち、オリジナル配列）と比べて、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させるために個々に又は全ての可能な組み合わせで用いることができる。したがって、例えば、野生型配列に存在するＴｈｒの全てのコドンをＡＣＣ（又はＡＣＧ）に改変してもよい。

【0164】

好ましくは、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量は、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに、即ち、遺伝子コードの縮重を用いて、野生型コード領域のＧ／Ｃ含量と比べて、少なくとも７％、好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％増加させる。特定の実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、又はその断片、変異体、若しくは誘導体のオープンリーディングフレームにおける置換可能なコドンのうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は更には１００％を置換して、前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させる。

【0165】

これに関連して、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに、野生型オープンリーディングフレームと比べて最大限（即ち、置換可能なコドンの１００％）増加させることが特に好ましい。

【0166】

更に、オープンリーディングフレームは、好ましくは、少なくとも部分的にコドンが最適化されている。コドンの最適化は、細胞内のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発生頻度が異なることによって翻訳効率が決定され得るという知見に基づいている。したがって、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のコード領域に所謂「レアコドン」が存在している場合、前記レアコドンに相当する改変核酸配列は、比較的「高頻度の」ｔＲＮＡをコードしているコドンが存在する場合よりも翻訳効率が低くなる確率が高い。

【0167】

したがって、本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、好ましくは、細胞内で比較的レアなｔＲＮＡをコードしている野生型配列のうちの少なくとも１つのコドンが、細胞内で比較的高頻度で存在するｔＲＮＡをコードしており且つ前記比較的レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換されるように、相当する野生型コード領域に対して改変される。この改変により、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、高頻度で存在するｔＲＮＡを利用可能なコドンが、レアなｔＲＮＡに対応するコドンに置き換わることができるように改変される。言い換えれば、本発明によれば、この改変により、レアなｔＲＮＡをコードしている野生型オープンリーディングフレームの全てのコドンを、細胞内においてより高頻度で存在し且つ前記レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換してよい。どのｔＲＮＡが細胞内で比較的高頻度で存在するか、及び対照的にどのｔＲＮＡが比較的低頻度で存在するかは、当業者に公知である。例えば、Ａｋａｓｈｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２００１，１１（６）：６６０−６６６を参照されたい。したがって、好ましくは、オープンリーディングフレームは、好ましくは本発明に係る人工核酸分子が発現する系に関して、好ましくは本発明に係る人工核酸分子が翻訳される系に関して、コドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームのコドン使用頻度は、哺乳類のコドン使用頻度、より好ましくはヒトのコドン使用頻度に従ってコドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームは、コドンが最適化されており且つＧ／Ｃ含量が改変されている。

【0168】

分解耐性、例えば、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによるインビボ分解に対する耐性を更に改善するために、及び／又は本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現の安定性を更に改善するために、人工核酸分子は、骨格修飾、糖修飾、及び／又は塩基修飾、例えば、脂質修飾等の修飾を更に含んでいてよい。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の転写及び／又は翻訳は、前記修飾によって殆ど損なわれない。

【0169】

一般的に、本発明の人工核酸分子は、任意のネイティブ（＝天然）ヌクレオチド、例えば、グアノシン、ウラシル、アデノシン、及び／若しくはシトシン、又はこれらのアナログを含んでいてよい。これに関して、ヌクレオチドアナログは、天然ヌクレオチドであるアデノシン、シトシン、チミジン、グアノシン、及びウリジンのネイティブ又は非ネイティブの変異体として定義される。したがって、アナログは、例えば、非ネイティブの官能基で化学的に誘導体化されたヌクレオチドであり、好ましくは、前記非ネイティブの官能基を天然ヌクレオチドに付加するか又は天然ヌクレオチドから欠失させ、或いは、前記非ネイティブの官能基でヌクレオチドの天然官能基を置換する。したがって、天然ヌクレオチドの各構成成分、即ち、ＲＮＡ配列の骨格（上記を参照）を形成する塩基成分、糖（リボース）成分、及び／又はリン酸成分を修飾することができる。グアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、及びシトシンのアナログとしては、限定するものではないが、（例えば、アセチル化、メチル化、ヒドロキシ化等によって、化学的に）改変されている、任意のネイティブ又は非ネイティブのグアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、又はシトシンが挙げられ、例えば、１−メチル−アデノシン、１−メチル−グアノシン、１−メチル−イノシン、２，２−ジメチル−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン、２’−アミノ−２’−デオキシグアノシン、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド、２−アミノプリン−リボシド、２’−アラアデノシン、２’−アラシチジン、２’−アラウリジン、２’−アジド−２’−デオキシアデノシン、２’−アジド−２’−デオキシシチジン、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン、２’−アジド−２’−デオキシウリジン、２−クロロアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、２’−フルオロ−２’−デオキシグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、２’−フルオロチミジン、２−メチル−アデノシン、２−メチル−グアノシン、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペネニル−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−２−アミノアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシシチジン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−チオシチジン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、４−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５，６−ジヒドロウリジン、５−アミノアリルシチジン、５−アミノアリル−デオキシ−ウリジン、５−ブロモウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−クロロ−アラ−シトシン、５−フルオロ−ウリジン、５−ヨードウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン、５−メトキシ−ウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン、６−アザシチジン、６−アザウリジン、６−クロロ−７−デアザ−グアノシン、６−クロロプリンリボシド、６−メルカプト−グアノシン、６−メチル−メルカプトプリン−リボシド、７−デアザ−２’−デオキシ−グアノシン、７−デアザアデノシン、７−メチル−グアノシン、８−アザアデノシン、８−ブロモ−アデノシン、８−ブロモ−グアノシン、８−メルカプト−グアノシン、８−オキソグアノシン、ベンズイミダゾール−リボシド、ベータ−Ｄ−マンノシル−クエオシン、ジヒドロ−ウラシル、イノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、Ｎ６−（［６−アミノヘキシル］カルバモイルメチル）−アデノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、Ｎ６−メチル−アデノシン、Ｎ７−メチル−キサントシン、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、クエオシン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトシン（Ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、キサントシン、及びキシロアデノシンを含む。このようなアナログの調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、及び米国特許第５，７００，６４２号から当業者に公知である。上記アナログの場合、本発明の特定の実施形態に従って、コードされているペプチド若しくはタンパク質のタンパク質発現を増加させる、又は本発明の人工核酸分子の免疫原性を増大させる及び／若しくは導入されている人工核酸分子の更なる修飾に干渉しないアナログが特に好ましい場合がある。

【0170】

特定の実施形態によれば、本発明の人工核酸分子は、脂質修飾を含有してよい。

【0171】

好ましい実施形態では、人工核酸分子は、好ましくは、５’から３’方向に、以下のエレメントを含む：
５’−ＵＴＲ；
少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、好ましくは、野生型配列に対して少なくとも１つの修飾を含むＯＲＦ；
リボソームタンパク質の３’−ＵＴＲ、好ましくは、配列番号１０〜配列番号１１５のいずれかに係る核酸配列、より好ましくは、ＲＰＳ９の３’−ＵＴＲ、より好ましくは、ヒトＲＰＳ９の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲ；
好ましくは６４アデニレートを含むポリ（Ａ）配列；
好ましくは３０シチジレートを含むポリ（Ｃ）配列；
ヒストンステムループ配列。

【0172】

別の好ましい実施形態では、人工核酸分子は、配列番号７に示すヌクレオチド配列（図３を参照）又は相補的なＤＮＡ配列を含むか又はからなる。

【0173】

特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、以下に記載する修飾のうちの１以上を更に含んでよい。

【0174】

化学修飾：
人工核酸分子に関して本明細書で使用するとき、用語「修飾」とは、骨格修飾に加えて、糖修飾又は塩基修飾を含む化学修飾を指し得る。

【0175】

この状況では、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくは、ＲＮＡ分子は、ヌクレオチドアナログ／修飾、例えば、骨格修飾、糖修飾、又は塩基修飾を含有し得る。本発明に関連する骨格修飾は、本明細書に定義する核酸分子に含有されているヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾されている修飾である。本発明に関連する糖修飾は、本明細書に定義する核酸分子のヌクレオチドの糖の化学修飾である。更に、本発明に関連する塩基修飾は、核酸分子の核酸分子のヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この状況では、ヌクレオチドアナログ又は修飾は、好ましくは、転写及び／又は翻訳に適用可能なヌクレオチドアナログから選択される。

【0176】

糖修飾：
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（本明細書に記載する通り、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡに組み込まれ得る）は、糖部分が修飾されていてよい。例えば、ＲＮＡ分子の２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾又は置換され得る。「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（−ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、又は糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−０（ＣＨ２ＣＨ２ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に結合している「ロック」核酸（ＬＮＡ）；及びアミノ基（−Ｏ−アミノ、式中、アミノ基、例えば、ＮＲＲは、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）又はアミノアルコキシが挙げられるが、これらに限定されない。

【0177】

「デオキシ」修飾としては、水素、アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸）が挙げられ；又はアミノ基は、リンカーを介して糖に結合してもよく、前記リンカーは、原子Ｃ、Ｎ、及びＯのうちの１以上を含む。

【0178】

また、糖基は、リボースにおける対応する炭素とは逆の立体化学的配置を有する１以上の炭素を含有し得る。したがって、修飾された核酸分子は、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。

【0179】

骨格修飾：
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（本明細書に記載する通り、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡに組み込まれ得る）は、リン酸骨格が更に修飾されていてもよい。骨格のリン酸基は、酸素原子のうちの１以上を異なる置換基で置換することによって修飾することができる。更に、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載する通り、非修飾リン酸部分を修飾リン酸で完全に置換することを含み得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、非結合酸素が両方とも硫黄によって置換されている。また、リン酸リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレン−ホスホネート）で結合酸素を置換することによって修飾してもよい。

【0180】

塩基修飾：
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（本明細書に記載する通り、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子に組み込まれ得る）は、ヌクレオ塩基部分が更に修飾されていてもよい。ＲＮＡにみられるヌクレオ塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書に記載するヌクレオシド及びヌクレオチドは、主溝面において化学修飾され得る。幾つかの実施形態では、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、又はハロ基を含み得る。

【0181】

本発明の特に好ましい実施形態では、ヌクレオチドアナログ／修飾は、塩基修飾から選択され、これは、好ましくは、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスフェート、２−アミノプリン−リボシド−５’−トリホスフェート；２−アミノアデノシン−５’−トリホスフェート、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−トリホスフェート、２−チオシチジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、２’−フルオロチミジン−５’−トリホスフェート、２’−Ｏ−メチルイノシン−５’−トリホスフェート４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェート、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、５−メチルウリジン−５’−トリホスフェート、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェート、６−アザシチジン−５’−トリホスフェート、６−アザウリジン−５’−トリホスフェート、６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスフェート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、８−アザアデノシン−５’−トリホスフェート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスフェート、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、シュードウリジン−５’−トリホスフェート、又はピューロマイシン−５’−トリホスフェート、キサントシン−５’−トリホスフェートから選択される。５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、及びシュードウリジン−５’−トリホスフェートからなる塩基修飾されたヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。

【0182】

幾つかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、及び４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジンが挙げられる。

【0183】

幾つかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、及び４−メトキシ−ｌ−メチル−シュードイソシチジンが挙げられる。

【0184】

他の実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニンが挙げられる。

【0185】

他の実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、ｌ−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンが挙げられる。

【0186】

幾つかの実施形態では、ヌクレオチドは、主溝面で修飾されてよく、ウラシルのＣ−５における水素をメチル基又はハロ基で置換することを含んでよい。

【0187】

特定の実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シチジン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−ウリジン、又は５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シュードウリジンである。

【0188】

更に特定の実施形態では、人工核酸分子、好ましくは、ＲＮＡ分子は、６−アザ−シチジン、２−チオ−シチジン、アルファ−チオ−シチジン、シュード−イソ−シチジン、５−アミノアリル−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、アルファ−チオ−ウリジン、４−チオ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン、デオキシ−チミジン、５−メチル−ウリジン、ピロロ−シチジン、イノシン、アルファ−チオ−グアノシン、６−メチル−グアノシン、５−メチル−シチジン、８−オキソ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、２−アミノ−６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン、シュード−イソ−シチジン、６−クロロ−プリン，Ｎ６−メチル−アデノシン、アルファ−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾を含んでいてよい。

【0189】

脂質修飾：
更なる実施形態によれば、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、脂質修飾を含有してよい。かかる脂質修飾されたＲＮＡは、典型的に、本明細書に定義するＲＮＡを含む。かかる脂質修飾された本明細書に定義するＲＮＡ分子は、典型的に、そのＲＮＡ分子と共有結合する少なくとも１つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合する少なくとも１つの脂質とを更に含む。或いは、脂質修飾されたＲＮＡ分子は、本明細書に定義する少なくとも１つのＲＮＡ分子と、そのＲＮＡ分子と（リンカー無しで）共有結合する少なくとも１つの（二官能性）脂質とを含む。第３の代替例によれば、脂質修飾されたＲＮＡ分子は、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子と、そのＲＮＡ分子と共有結合する少なくとも１つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合する少なくとも１つの脂質とを含み、また、そのＲＮＡ分子と（リンカー無しで）共有結合する少なくとも１つの（二官能性）脂質も含む。この状況では、脂質修飾は、直鎖状ＲＮＡ配列の末端に存在することが特に好ましい。

【0190】

修飾されたＲＮＡの５’末端の修飾：
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子は、所謂「５’キャップ」構造の付加によって修飾してよい。
５’−キャップは、一般的に、成熟ｍＲＮＡの５’−末端に「蓋をする」実体、典型的には、修飾されたヌクレオチド実体である。５’−キャップは、典型的に、修飾されたヌクレオチド、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−三リン酸結合を介して５’−末端に結合する。５’−キャップは、メチル化されていてもよく、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’−キャップを有する核酸の５’末端のヌクレオチド、典型的に、ＲＮＡの５’末端である）である。ｍ７ＧｐｐｐＮは、ポリメラーゼＩＩによって転写されたｍＲＮＡ中に天然に存在する５’−キャップ構造であり、したがって、本発明に係る修飾ＲＮＡに含まれる修飾とはみなされない。これは、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子は、５’−キャップとしてｍ７ＧｐｐｐＮを含んでよいが、更に、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子は、本明細書に定義する少なくとも１つの更なる修飾を含む。

【0191】

５’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、逆転デオキシ非塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆転ヌクレオチド部分、３’−３’−逆転非塩基部分、３’−２’−逆転ヌクレオチド部分、３’−２’−逆転非塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。これら修飾５’−キャップ構造は、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子に含まれる少なくとも１つの修飾としてみなされる。

【0192】

特に好ましい修飾５’−キャップ構造は、ＣＡＰ１（ｍ７Ｇに隣接するヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ２（ｍ７Ｇの下流の２番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ３（ｍ７Ｇの下流の３番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ４（ｍ７Ｇの下流の４番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＡＲＣＡ（抗リバースＣＡＰアナログ、修飾ＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオエート修飾ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンである。

【0193】

好ましい実施形態では、少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、治療用タンパク質又はペプチドをコードしている。別の実施形態では、抗原は、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルギー抗原、又は自己免疫抗原等、少なくとも１つのオープンリーディングフレームによってコードされている。ここでは、抗原が関与する疾患に対する遺伝子ワクチン接種アプローチにおいて、前記抗原をコードする人工核酸分子の投与を用いる。

【0194】

別の実施形態では、抗体は、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つのオープンリーディングフレームによってコードされている。

【0195】

抗原：
病原性抗原：
本発明に係る人工核酸分子は、病原性抗原又はその断片、変異体、若しくは誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードしていてよい。かかる病原性抗原は、病原性生物、特に、細菌、ウイルス、又は原生動物（多細胞）の病原性生物に由来し、これらは、被験体、具体的には、哺乳類被験体、より具体的には、ヒトにおいて免疫反応を誘発する。より具体的には、病原性抗原は、好ましくは、ウイルス又は細菌又は原生動物の表面に位置する表面抗原、例えば、タンパク質（又はタンパク質の断片、例えば、表面抗原の外側部分）である。

【0196】

病原性抗原は、好ましくは感染性疾患に関連する病原体に由来するペプチド又はタンパク質抗原であり、好ましくは、以下の病原体に由来する抗原から選択される：アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ヘンセラ菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属の種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）科、セパシア菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）及び他のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の種、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の種、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ＣＪＤプリオン、肝臓ジストマ（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の種、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属の種、コロナウイルス、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、及びＤＥＮ−４）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギイ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルス及びエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）属の種、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１、及びＯ１０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）及び巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ＦＦＩプリオン、フィラリア（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａ）上科、フラビウイルス、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ）属の種、ＧＳＳプリオン、グアナリトウイルス、デュクレー菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパーウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１及び２（ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２））、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ホルタエ・ウェルネッキー（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）及びヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラヌロマチス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マラセジア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）属の種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋａｇａｗａｉ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）門、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、流行性耳下腺炎ウイルス、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）及びマイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属の種、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科（インフルエンザ）、ブラジルパラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）属の種、ヴェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パルボウイルスＢ１９、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、ニューモシスチス肺炎菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、鼻炎ウイルス、ライノウイルス、痘瘡リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、斑点熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス（Ｓａｂｉａ ｖｉｒｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、テニア（Ｔａｅｎｉａ）属、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）又はネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属の種、ヒト鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡又は小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、黄熱病ウイルス、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、及び偽結核エルジニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。

【0197】

この状況では、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、プラスモディウム、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、デングウイルス、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、結核菌、狂犬病ウイルス、及び黄熱病ウイルスから選択される病原体由来の抗原が特に好ましい。

【0198】

腫瘍抗原：
更なる実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、タンパク質又はペプチドをコードしてよく、前記タンパク質又はペプチドは、腫瘍抗原、前記腫瘍抗原の断片、変異体、又は誘導体を含むペプチド又はタンパク質を含み、好ましくは、前記腫瘍抗原は、メラニン形成細胞特異的抗原、癌−精巣抗原、及び腫瘍特異的抗原、好ましくは、ＣＴ−Ｘ抗原、非Ｘ ＣＴ抗原、ＣＴ−Ｘ抗原の結合パートナー、非Ｘ ＣＴ抗原の結合パートナー、又は腫瘍特異的抗原、より好ましくは、ＣＴ−Ｘ抗原、非Ｘ ＣＴ抗原の結合パートナー、又は腫瘍特異的抗原、或いは前記腫瘍抗原の断片、変異体、又は誘導体であり；前記核酸配列は、それぞれ、異なるペプチド又はタンパク質をコードし；前記核酸配列の少なくとも１つは、以下をコードしている：５Ｔ４、７０７−ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ、ＡｌｂＺＩＰ ＨＰＧ１、アルファ−５−ベータ−１−インテグリン、アルファ−５−ベータ−６−インテグリン、アルファ−アクチニン−４／ｍ、アルファ−メチルアシル補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ−４、ＡＲＴＣ１／ｍ、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬ−２、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ−カテニン／ｍ、ＢＩＮＧ−４、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡ１５−３／ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤＥ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＥＡ、ＣＬＣＡ２、ＣＭＬ２８、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ−１／ｍ、コアクトシン様タンパク質、ｃｏｌｌａｇｅ ＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ−２、ＣＴ−９／ＢＲＤ６、Ｃｔｅｎ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ−Ｂ、ＣＹＰＢ１、ＤＡＭ−１０、ＤＡＭ−６、ＤＥＫ−ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＧＦＲ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、ＥＺＨ２、ＦＧＦ−５、ＦＮ、Ｆｒａｕ−１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ７ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＧＤＥＰ、ＧｎＴ−Ｖ、ｇｐ１００、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＡＧＥ、ＨＡＳＴ−２、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７Ｉ、ＨＬＡ−Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ−Ａ２／ｍ、ＨＮＥ、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１４／ＳＣＰ−１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン−２、カリクレイン−４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、ＫＫ−ＬＣ−１、Ｋ−Ｒａｓ／ｍ、ＬＡＧＥ−Ａ１、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ３、ＭＡＧＥ−Ｂ４、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｂ１０、ＭＡＧＥ−Ｂ１６、ＭＡＧＥ−Ｂ１７、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｄ１、ＭＡＧＥ−Ｄ２、ＭＡＧＥ−Ｄ４、ＭＡＧＥ−Ｅ１、ＭＡＧＥ−Ｅ２、ＭＡＧＥ−Ｆ１、ＭＡＧＥ−Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２、マンマグロビンＡ、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ−２／ｍ、基質タンパク質２２、ＭＣ１Ｒ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＥ１／ｍ、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ、ＭＭＰ１１、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ−抗原、ＭＲＰ−３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＭ−１／ｍ、ＭＵＭ−２／ｍ、ＭＵＭ−３／ｍ、ミオシンクラスＩ／ｍ、ＮＡ８８−Ａ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、Ｎｅｏ−ＰＡＰ、Ｎｅｏ−ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、ＮＧＥＰ、ＮＭＰ２２、ＮＰＭ／ＡＬＫ、Ｎ−Ｒａｓ／ｍ、ＮＳＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｂ、ＯＡ１、ＯＦＡ−ｉＬＲＰ、ＯＧＴ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ−９、ＯＳ−９／ｍ、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５、ｐ１９０マイナー ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐ５３、ｐ５３／ｍ、ＰＡＧＥ−４、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、ＰＡＰ、ＰＡＲＴ−１、ＰＡＴＥ、ＰＤＥＦ、Ｐｉｍ−１−キナーゼ、Ｐｉｎ−１、Ｐｍｌ／Ｐａｒアルファ、ＰＯＴＥ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５／ｍ、プロステイン、プロテイナーゼ−３、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＧＲ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ／ｍ、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１、ＲＵ２、Ｓ−１００、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＳＣＣ、ＳＩＲＴ２／ｍ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２／ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０、ＳＳＸ−４、ＳＴＡＭＰ−１、ＳＴＥＡＰ−１、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＳＹＴ−ＳＳＸ−１、ＳＹＴ−ＳＳＸ−２、ＴＡ−９０、ＴＡＧ−７２、ＴＡＲＰ、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＴＧＦベータ、ＴＧＦベータＲＩＩ、ＴＧＭ−４、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＧ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２／６ｂ、ＴＲＰ／ＩＮＴ２、ＴＲＰ−ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１、ＷＴ１、及びリンパ血球の免疫グロブリンイディオタイプ又はリンパ血球のＴ細胞受容体イディオタイプ、或いは前記腫瘍抗原の断片、変異体、又は誘導体；好ましくは、サバイビン又はそのホモログ、ＭＡＧＥファミリー又はその結合パートナー由来の抗原、或いは前記腫瘍抗原の断片、変異体、又は誘導体。この状況では、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、５Ｔ４、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、サバイビン、Ｍｕｃ−１、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＳＴＥＡＰ 及びＰＡＰが特に好ましい。

【0199】

好ましい実施形態では、人工核酸分子は、タンパク質又はペプチドをコードし、前記タンパク質又はペプチドは、治療用タンパク質、又はその断片、変異体、若しくは誘導体を含む。

【0200】

本明細書に定義する治療用タンパク質は、任意の遺伝性疾患若しくは後天性疾患の治療に有益であるか、又は個体の症状を改善するペプチド又はタンパク質である。特に、治療用タンパク質は、数ある機能の中でも、遺伝子エラーを修正及び修復し、癌細胞又は病原体感染細胞を破壊し、免疫系疾患を治療し、代謝性疾患又は内分泌疾患を治療することができる治療剤の作製において重要な役割を果たす。例えば、タンパク質ホルモンであるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、腎臓合併症の一般的な原因である赤血球欠乏の患者の治療において利用することができる。更に、アジュバントタンパク質、治療用抗体も治療用タンパク質に含まれ、また、例えば閉経期の女性の治療において用いられるホルモン補充療法も含まれる。より最近のアプローチでは、患者の体細胞を用いて、前記体細胞の多能性幹細胞へのリプログラムが行われている。これは、論争になっている幹細胞療法に取って代わるものである。また、体細胞のリプログラム又は幹細胞の分化に用いられるこれらタンパク質も、本明細書では治療用タンパク質として定義される。更に、治療用タンパク質は、例えば、創傷治癒、組織再生、血管形成等の他の目的のために用いることもできる。更に、抗原特異的Ｂ細胞受容体、並びにこれらの断片及び変異体が、本明細書において治療用タンパク質として定義される。

【0201】

したがって、治療用タンパク質は、遺伝性疾患であるか後天性疾患であるかにかかわらず、例えば、感染性疾患、新生物（例えば、癌又は腫瘍疾患）、血液及び造血器官の疾患、内分泌疾患、栄養疾患、代謝性疾患、神経系の疾患、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚及び皮下組織の疾患、筋骨格系及び結合組織の疾患、並びに尿生殖器系の疾患等の様々な疾患の治療を含む様々な目的のために使用することができる。

【0202】

この状況では、特に代謝性疾患又は内分泌疾患の治療において用いることができる特に好ましい治療用タンパク質は、以下から選択される（括弧内は、治療用タンパク質が治療で用いられる具体的な疾患である）：酸性スフィンゴミエリナーゼ（ニーマン−ピック病）、アジポタイド（肥満）、アガルシダーゼ−ベータ（ヒトガラクトシダーゼＡ）（ファブリー病；腎臓及び心血管系合併症を引き起こす可能性のある脂質の蓄積を防ぐ）、アルグルコシダーゼ（ポンペ病（ＩＩ型糖原病））、アルファ−ガラクトシダーゼＡ（アルファ−ＧＡＬ Ａ、アガルシダーゼアルファ）（ファブリー病）、アルファ−グルコシダーゼ（糖原病（ＧＳＤ）、ポンぺ病）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ハーラー症候群、シャイエ症候群）、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（サンフィリポ症候群）、アンフィレグリン（癌、代謝性疾患）、アンジオポエチン（（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、Ａｎｇ４、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、ＡＮＧＰＴＬ７）（血管新生、脈管を安定化させる）、ベータセルリン（代謝性疾患）、ベータ−グルクロニダーゼ（スライ症候群）、骨形成タンパク質ＢＭＰ（ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５）（再生効果、骨関連症状、慢性腎疾患（ＣＫＤ））、ＣＬＮ６タンパク質（ＣＬＮ６疾患−不定型遅発性小児型、遅発性異型、早発性若年型、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、上皮成長因子（ＥＧＦ）（創傷治癒、細胞の成長、増殖、及び分化の制御）、エピゲン（代謝性疾患）、エピレギュリン（代謝性疾患）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３）（創傷治癒、血管新生、内分泌疾患、組織再生）、ガルスルファーゼ（ムコ多糖症ＶＩ）、グレリン（過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、肥満、プラダー−ウィリー症候群、ＩＩ型糖尿病）、グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病）、ＧＭ−ＣＳＦ（再生効果、白血球の産生、癌）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（創傷治癒、心臓肥大、並びに心臓の発生及び機能）、肝細胞成長因子ＨＧＦ（再生効果、創傷治癒）、ヘプシジン（鉄代謝障害、ベータ−サラセミア）、ヒトアルブミン（アルブミン産生の減少（低タンパク血症）、アルブミン喪失の増加（ネフローゼ症候群）、血液量減少、高ビリルビン血症）、イズルスルファーゼ（イズロン酸−２−スルファターゼ）（ムコ多糖症ＩＩ（ハンター症候群））、インテグリンαＶβ３、αＶβ５、及びα５β１（マトリクス高分子及びプロテイナーゼに結合、血管新生）、イズロン酸スルファターゼ（ハンター症候群）、ラロニダーゼ（ハーラー型及びハーラー−シャイエ型のムコ多糖症Ｉ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ；ガルスルファーゼ、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ））（アリールスルファターゼＢ欠乏症、マロトー−ラミー症候群、ムコ多糖症ＶＩ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（サンフィリポ症候群）、神経成長因子（ＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、及びニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）（再生効果、心血管疾患、冠状動脈アテローム性硬化症、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、急性冠状動脈症候群、痴呆、鬱病、統合失調症、自閉症、レット症候群、神経性食欲不振症、神経性過食症、創傷治癒、皮膚潰瘍、角膜潰瘍、アルツハイマー病）、ニューレグリン（ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４）（代謝性疾患、統合失調症）、ニューロピリン（ＮＲＰ−１、ＮＲＰ−２）（血管新生、軸索ガイダンス、細胞生存、遊走）、オベスタチン（過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、肥満、プラダー−ウィリー症候群、ＩＩ型糖尿病）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ（ＰＤＦＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ）（再生効果、創傷治癒、血管新生の障害、動脈硬化症、線維症、癌）、ＴＧＦベータ受容体（エンドグリン、ＴＧＦ−ベータ１受容体、ＴＧＦ−ベータ２受容体、ＴＧＦ−ベータ３受容体）（腎線維症、腎疾患、糖尿病、最後には末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、血管新生）、トロンボポイエチン（ＴＨＰＯ）（巨核球増殖発達因子（ＭＧＤＦ））（血小板疾患、輸血用血小板、骨髄抑制療法後の血小板数の回復）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ（ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、及びＴＧＦベータ３）））（再生効果、創傷治癒、免疫、癌、心疾患、糖尿病、マルファン症候群、ロイス−ディーズ症候群）、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、及びＰＩＧＦ）（再生効果、血管新生、創傷治癒、癌、透過性）、ネシリチド（急性非代償性鬱血性心不全）、トリプシン（褥創、静脈瘤性潰瘍、焼痂デブリードマン、裂創、日焼け、胎便性イレウス）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）（「アディソン病、小細胞癌、副腎白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、クッシング症候群、ネルソン症候群、点頭てんかん）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（内分泌疾患）、コレシストキニン（多様）、ガストリン（高ガストリン血症）、レプチン（糖尿病、高トリグリセリド血症、肥満）、オキシトシン（母乳栄養を刺激、分娩の非進行）、ソマトスタチン（カルチノイド症候群の対症療法、急性静脈瘤出血、及び先端巨大症、肝臓及び腎臓の多嚢胞性疾患、先端巨大症、及び神経内分泌腫瘍によって引き起こされる症状）、バソプレシン（抗利尿ホルモン）（尿崩症）、カルシトニン（閉経後骨粗鬆症、高カルシウム血症、パジェット病、骨転移、幻肢痛、脊椎管狭窄症）、エクセナチド（メトホルミン及びスルホニルウレアによる治療に対して抵抗性である２型糖尿病）、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトトロピン（ＧＨ欠乏又は慢性腎不全による成長不全、プラダー−ウィリー症候群、ターナー症候群、抗ウイルス療法によるＡＩＤＳ消耗又は悪液質）、インスリン（糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、高カリウム血症）、インスリン様成長因子１ ＩＧＦ−１（ＧＨ遺伝子欠損又は重症原発性ＩＧＦ１欠乏の小児における成長不全、神経変性疾患、心血管疾患、心不全）、メカセルミンリンファベート、ＩＧＦ−１アナログ（ＧＨ遺伝子欠損又は重症原発性ＩＧＦ１欠乏の小児における成長不全、神経変性疾患、心血管疾患、心不全）、メカセルミン、ＩＧＦ−１アナログ（ＧＨ遺伝子欠損又は重症原発性ＩＧＦ１欠乏の小児における成長不全、神経変性疾患、心血管疾患、心不全）、ペグビソマント（先端巨大症）、プラムリンタイド（糖尿病、インスリンと組み合わせる）、テリパラチド（ヒト副甲状腺ホルモン残基１−３４）（重症骨粗鬆症）、ベカプレルミン（糖尿病性潰瘍のデブリードマン補助）、ジボテルミン−アルファ（骨形成タンパク質２）（脊椎固定術、骨損傷修復）、酢酸ヒストレリン（性腺刺激ホルモン放出ホルモン；ＧｎＲＨ）（早発思春期）、オクトレオチド（先端巨大症、ＶＩＰ分泌線腫及び転移カルチノイド腫瘍の症状緩和）、及びパリフェルミン（ケラチノサイト成長因子；ＫＧＦ）（化学療法を受けている患者における重症口腔粘膜炎、創傷治癒）。

【0203】

これら及び他のタンパク質は、内因的に産生される欠陥のある機能的タンパク質を十分な量置き換えることによって被験体を治療することを意味するので、治療用であると理解される。したがって、かかる治療用タンパク質は、典型的に、哺乳類、特にヒトのタンパク質である。

【0204】

血液疾患、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、癌若しくは腫瘍疾患、感染性疾患、又は免疫不全の治療のために、以下の治療用タンパク質を用いてよい：アルテプラーゼ（組織プラスミノーゲン活性化因子；ｔＰＡ）（肺塞栓症、心筋梗塞、急性虚血発作、中心静脈アクセス装置の閉塞）、アニストレプラーゼ（血栓溶解）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）（遺伝性ＡＴ−ＩＩＩ欠乏、血栓塞栓症）、ビバリルジン（冠状動脈形成術における血液凝固リスクの低減及びヘパリン誘発性血小板減少症）、ダルベポエチン−アルファ（慢性腎機能不全及び慢性腎不全の患者における貧血の治療（＋／−透析））、ドロトレコギン−アルファ（活性化プロテインＣ）（死亡のリスクが高い重症敗血症）、エリスロポイエチン、エポエチン−アルファ、エリスロポエチン、エリスロポイエチン（慢性疾患の貧血、脊髄形成異常症、腎不全又は化学療法による貧血、術前調製）、第ＩＸ因子（血友病Ｂ）、第ＶＩＩａ因子（血友病Ａ又はＢの患者における出血、及び第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の阻害剤）、第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）、レピルジン（ヘパリン誘発性血小板減少症）、プロテインＣ濃縮物（静脈血栓、電撃性紫斑病）、レテプラーゼ（ｔＰＡの欠損変異体）（急性心筋梗塞の管理、心室機能の改善）、ストレプトキナーゼ（急性貫壁性心筋梗塞、肺塞栓症、深部静脈血栓、動脈血栓又は塞栓症、動静脈カニューレの閉塞）、テネクテプラーゼ（急性心筋梗塞）、ウロキナーゼ（肺塞栓症）、アンギオスタチン（癌）、抗ＣＤ２２免疫毒素（再発性ＣＤ３３＋急性骨髄性白血病）、デニロイキンジフチトクス（皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ））、イムノシアニン（膀胱及び前立腺癌）、ＭＰＳ（メタロパンスチムリン）（癌）、アフリバーセプト（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性結直腸癌（ｍＣＲＣ）、ホルモン抵抗性転移性前立腺癌、滲出型黄斑変性症）、エンドスタチン（癌、関節リウマチ等の炎症性疾患に加えてクローン病、糖尿病性網膜症、乾癬、及び子宮内膜症）、コラゲナーゼ（慢性皮膚潰瘍及び重篤な焼損領域のデブリードマン、デュピュイトラン拘縮、ペイロニー病）、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ（嚢胞性線維症；ＦＶＣが４０％超と予測される選択された患者における気道感染症の減少）、ヒアルロニダーゼ（注入された薬物、特に眼科手術における麻酔薬及び特定のイメージング剤の吸収及び分散を増加させる補助剤として使用される）、パパイン（壊死組織のデブリードマン、又は褥瘡、静脈瘤性潰瘍及び糖尿病性潰瘍、火傷、術後創、毛巣嚢胞創傷、癰、及び他の創傷等の急性及び慢性病変における瘡蓋の液化）、Ｌ−アスパラギナーゼ（急性リンパ性白血病、増殖に内因性アスパラギンを必要とする）、Ｐｅｇ−アスパラギナーゼ（急性リンパ性白血病、増殖に内因性アスパラギンを必要とする）、ラスブリカーゼ（腫瘍崩壊症候群を引き起こす可能性のある抗癌療法を受けている白血病、リンパ腫、及び固形腫瘍の小児患者）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）（生殖補助）、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（生殖補助）、ルトロピン−アルファ（黄体形成ホルモン欠乏による不妊）、プロラクチン（低プロラクチン血症、血清プロラクチン欠乏、女性の卵巣機能不全、不安症、動脈性勃起不全、精液早漏、乏精子症、精子無力症、精嚢の機能低下、男性の低アンドロゲン症）、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤（先天性抗トリプシン欠乏症）、ラクターゼ（ラクトースを消化できないことによるガス、膨満感、痙攣、及び下痢）、膵臓酵素（リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ）（嚢胞性線維症、慢性膵炎、膵不全、ビルロートＩＩ法胃バイパス手術後、膵管閉塞、脂肪便、消化不良、ガス、膨満感）、アデノシンデアミナーゼ（ウシペガデマーゼ、ＰＥＧ−ＡＤＡ）（アデノシンデアミナーゼ欠乏による重症複合免疫不全症）、アバタセプト（関節リウマチ（特に、ＴＮＦアルファ阻害に対して不応である場合））、アレファセプト（尋常性乾癬）、アナキンラ（関節リウマチ）、エタネルセプト（関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、尋常性乾癬、強直性脊椎炎）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体アンタゴニスト、アナキンラ（関節リウマチに関連する炎症及び軟骨分解）、チムリン（神経変性疾患、リウマチ、神経性食欲不振症）、ＴＮＦ−アルファアンタゴニスト（関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、化膿性汗腺炎、難治性喘息等の自己免疫疾患）、エンフビルチド（ＨＩＶ−１感染症）、及びチモシンα１（Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎）。（括弧内は、治療用タンパク質が治療で用いられる具体的な疾患である）。

【0205】

更なる態様では、本発明は、
ａ．オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又は例えば、オープンリーディングフレーム若しくはオープンリーディングフレームを含む配列を挿入するためのクローニングサイトと、
ｂ．リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）と
を含むベクターを提供する。

【0206】

少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメント及びＯＲＦは、本発明に係る人工核酸分子について上記する通りである。クローニングサイトは、オープンリーディングフレームを導入するのに好適な任意の配列又はオープンリーディングフレームを含む配列、例えば、１以上の制限酵素部位等であってよい。したがって、クローニングサイトを含むベクターは、好ましくは、オープンリーディングフレームをベクターに挿入するのに好適である。好ましくは、オープンリーディングフレームを３’−ＵＴＲエレメントの５’側に挿入するのに好適である。好ましくは、クローニングサイト又はＯＲＦは、好ましくは３’−ＵＴＲエレメントの５’末端に近接して、３’−ＵＴＲエレメントの５’側に位置する。例えば、クローニングサイト又はＯＲＦは、３’−ＵＴＲエレメントの５’末端に直接連結していてもよく、本発明に係る人工核酸分子について上記した通り一続きのヌクレオチド（例えば、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等）を介して連結していてもよい。

【0207】

好ましくは、本発明に係るベクターは、例えば、任意でオープンリーディングフレーム又はオープンリーディングフレームを含む配列をベクターに挿入し、前記ベクターを転写することによって、本発明に係る人工核酸分子を作製するのに、好ましくは、本発明に係る人工ｍＲＮＡを作製するのに好適である。したがって、好ましくは、ベクターは、プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）等の転写に必要なエレメントを含む。好ましくは、ベクターは、真核生物、原核生物、ウイルス若しくはファージの転写系（例えば、真核細胞、原核細胞等）、又は真核生物、原核生物、ウイルス、若しくはファージのインビトロ転写系を用いる転写に好適である。したがって、例えば、ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ（例えば、真核生物、原核生物、ウイルス、又はファージのＲＮＡポリメラーゼ）によって認識されるプロモーター配列を含んでいてよい。好ましい実施形態では、ベクターは、ＳＰ６、Ｔ３、又はＴ７等のファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、好ましくはＴ７プロモーターを含む。好ましくは、ベクターは、ファージに基づくインビトロ転写系（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに基づくインビトロ転写系等）を用いるインビトロ転写に好適である。

【0208】

別の好ましい実施形態では、ベクターは、コードされているペプチド又はタンパク質を細胞又は組織で発現させるために直接用いてよい。この目的のために、ベクターは、例えば、ＣＭＶプロモーター等の特定のプロモーター配列等、その細胞／組織における発現に必須の特定のエレメントを含む。

【0209】

ベクターは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルを更に含んでいてよい。

【0210】

ベクターは、ＲＮＡベクターであってもよく、ＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡベクターである。ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドベクター等の当業者に公知の任意のベクターであってよい。好ましくは、ベクターは、プラスミドベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドベクターである。

【0211】

好ましい実施形態では、本発明に係るベクターは、本発明に係る人工核酸分子を含む。

【0212】

１つの実施形態では、本発明に係るＤＮＡベクターは、配列番号１０〜配列番号１１５に係る核酸配列等、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの核酸配列に対して少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含む。

【0213】

好ましくは、本発明に係るＤＮＡベクターは、配列番号１、配列番号３に係る配列、若しくは配列番号７と相補的な配列、又は配列番号１、配列番号３、配列番号７に係る核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、又は上記これらの断片、好ましくはこれらの機能的断片を含む。

【0214】

好ましくは、本発明に係るＲＮＡベクターは、配列番号２、配列番号４、配列番号７に係る配列、又は配列番号２、配列番号４、配列番号７に係る核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列、又はこれらの断片、好ましくはこれらの機能的断片を含む。

【0215】

好ましくは、ベクターは、環状分子である。好ましくは、ベクターは、二本鎖ＤＮＡ分子等の二本鎖分子である。かかる環状の、好ましくは二本鎖のＤＮＡ分子は、本発明の人工核酸分子の保管形態として便利に用いることができる。更に、細胞、例えば培養細胞のトランスフェクションに用いることができる。また、本発明に係る人工ＲＮＡ分子を得るためのインビトロ転写に用いることができる。

【0216】

好ましくは、ベクター、好ましくは環状ベクターは、例えば、制限酵素で切断することによって線形にすることができる。好ましい実施形態では、ベクターは、３’−ＵＴＲエレメントの直ぐ３’側、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナルの３’側、又は（存在する場合）ポリ（Ｃ）配列の３’側、又は（存在する場合）ヒストンステムループの３’側に位置する制限酵素部位等の切断部位、好ましくは唯一の切断部位を含む。したがって、好ましくは、ベクターの線形化によって得られる生成物は、３’末端において、３’−ＵＴＲエレメントの３’末端、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナルの３’末端、又は（存在する場合）ポリ（Ｃ）配列の３’末端で終結する。本発明に係るベクターが、本発明に係る人工核酸分子を含む実施形態では、制限酵素部位、好ましくは唯一の制限酵素部位が、人工核酸分子の３’末端の直ぐ３’側に位置することが好ましい。

【0217】

更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターを含む細胞に関する。前記細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、脊椎動物細胞、例えば哺乳類細胞等の任意の細胞であってよい。前記細胞は、例えば、細菌細胞において本発明のベクターを複製するために用いることができる。更に、前記細胞は、本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターを転写するため、及び／又は本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターのオープンリーディングフレームを翻訳するために用いることができる。例えば、前記細胞は、組み換えタンパク質を産生するために用いることができる。

【0218】

本発明に係る細胞は、例えば、標準的なトランスフェクション、形質移入、又は形質転換の方法等の標準的な核酸移入法によって得ることができる。例えば、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクション等によって細胞に移入してよい。

【0219】

好ましくは、前記細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト被験体、家畜、実験動物（例えば、マウス又はラット）の細胞等である。好ましくは、前記細胞は、ヒトの細胞である。前記細胞は、確立されている細胞株の細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、ＨＥＬＡ、ＨＥＫ等であってもよく、一次細胞、例えば、ヒト皮膚線維芽（ＨＤＦ）細胞等であってもよい。好ましくは、生物から単離された細胞である。好ましい実施形態では、前記細胞は、哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の単離細胞である。例えば、前記細胞は、好ましくは哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の免疫細胞（例えば、樹状細胞）、癌細胞若しくは腫瘍細胞、又は任意の体細胞等であってよい。

【0220】

更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、又は本発明に係る細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子ワクチン接種用のワクチンとして用いてよい。したがって、ＯＲＦは、ワクチン接種のために患者に投与される抗原をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、ワクチンである。更に、本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子治療に用いることができる。

【0221】

好ましくは、医薬組成物は、更に、１以上の薬学的に許容できるビヒクル、希釈剤、及び／又は賦形剤、及び／又は１以上の補助剤を含んでいてよい。本発明では、薬学的に許容できるビヒクルは、典型的に、本発明の医薬組成物用の液体又は非液体の基剤を含む。１つの実施形態では、医薬組成物は、液体形態で提供される。これに関連して、前記ビヒクルは、好ましくは、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸、クエン酸等のバッファ溶液等の水に基づく。バッファは、特定のレファレンス媒体に対して高張、等張、又は低張であってよい。即ち、前記バッファは、特定のレファレンス媒体に対してより高い、同一の、又はより低い塩含量を有してよく、好ましくは、浸透圧又は他の濃度効果により哺乳類細胞を損傷させない濃度の前述の塩を用いてよい。レファレンス媒体は、例えば、血液、リンパ液、サイトゾル液、又は他の体液等の「インビボ」法で用いられる液体であるか、或いは一般的なバッファ若しくは液体等の「インビトロ」法でレファレンス媒体として用いることができる液体である。かかる一般的なバッファ又は液体は、当業者に公知である。乳酸リンゲル液が、液体基剤として特に好ましい。

【0222】

本発明の医薬組成物のために、患者に投与するのに適している１以上の相溶性の固体又は液体の充填剤又は希釈剤、或いは封入化合物を同様に用いてもよい。用語「相溶性」とは、本明細書で使用するとき、好ましくは、典型的な使用条件下で本発明の医薬組成物の薬学的有効性を実質的に低減させる相互作用が生じないように、本発明の医薬組成物のこれら成分と本明細書に定義する本発明の人工核酸、ベクター、又は細胞とを混合できることを意味する。

【0223】

本発明に係る医薬組成物は、任意で、１以上の更なる医薬活性成分を更に含んでいてよい。これに関連して医薬活性成分とは、特定の適応症又は疾患を治癒させる、寛解させる、又は予防する治療効果を示す化合物である。前記化合物としては、限定するものではないが、ペプチド又はタンパク質、核酸、（治療的に活性のある）低分子量の有機化合物又は無機化合物（分子量：５，０００未満、好ましくは１，０００未満）、糖類、抗原又は抗体、関連技術において既に知られている治療剤、抗原細胞、抗原細胞断片、細胞画分、細胞壁成分（例えば、多糖類）、（例えば、化学的に又は放射線照射により）改変、弱毒化、又は不活化された病原体（ウイルス、細菌等）等が挙げられる。

【0224】

更に、本発明の医薬組成物は、人工核酸分子又はベクター用の担体を含んでいてよい。かかる担体は、医薬的に活性のある人工核酸分子又はベクターの生理学的に許容できる液体への溶解、輸送及び細胞内取り込みを媒介するのに好適であり得る。したがって、かかる担体は、本発明に係る人工核酸分子又はベクターのデポー製剤及び送達に好適であり得る成分であってよい。かかる成分は、例えば、トランスフェクション剤又は複合体化剤として機能し得るカチオン性又はポリカチオン性の担体又は化合物であってよい。

【0225】

これに関連して、特に好ましいトランスフェクション剤又は複合体化剤は、カチオン性又はポリカチオン性の化合物であり、例えば、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン若しくはスペルミジン、又は他のカチオン性のペプチド又はタンパク質（例えば、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチド又はアナログペプチドを含む）、ＨＳＶ ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リシンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特にショウジョウバエのアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、又はヒストン）が挙げられる。

【0226】

更に、かかるカチオン性又はポリカチオン性の化合物又は担体は、好ましくは少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているカチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。好ましくは、カチオン性又はポリカチオン性の担体は、以下の合計式（Ｉ）を有するカチオン性ペプチドから選択される：
｛（Ａｒｇ）_ｌ；（Ｌｙｓ）_ｍ；（Ｈｉｓ）_ｎ；（Ｏｒｎ）_ｏ；（Ｘａａ）_ｘ｝；式（Ｉ）
（式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘは、３〜１００であり、ｌ、ｍ、ｎ、又はｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、及び９１〜１００から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％であり；Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＯｒｎを除くネイティブ（即ち、自然界に存在する）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり；ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ｘａａの総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の９０％を超えない）。アミノ酸Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、及びＸａａはいずれも、ペプチドの任意の位置に位置してよい。これに関連して、７アミノ酸〜３０アミノ酸のカチオン性ペプチド又はタンパク質が特に好ましい。

【0227】

更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質は、上に示す通り、式｛（Ａｒｇ）_ｌ；（Ｌｙｓ）_ｍ；（Ｈｉｓ）_ｎ；（Ｏｒｎ）_ｏ；（Ｘａａ）_ｘ｝（式（Ｉ））に従って定義され、少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているとき、限定されるものではないが、部分式（Ｉａ）から選択してよい：
｛（Ａｒｇ）_ｌ；（Ｌｙｓ）_ｍ；（Ｈｉｓ）_ｎ；（Ｏｒｎ）_ｏ；（Ｘａａ’）_ｘ（Ｃｙｓ）_ｙ｝ 部分式（Ｉａ）
（式中、（Ａｒｇ）_ｌ；（Ｌｙｓ）_ｍ；（Ｈｉｓ）_ｎ；（Ｏｒｎ）_ｏ；及びｘは、本明細書に定義する通りであり、Ｘａａ’は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、又はＣｙｓを除くネイティブ（即ち、自然界に存在する）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり、ｙは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％である）。更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチドは、部分式（Ｉｂ）から選択してよい：
Ｃｙｓ_１｛（Ａｒｇ）_ｌ；（Ｌｙｓ）_ｍ；（Ｈｉｓ）_ｎ；（Ｏｒｎ）_ｏ；（Ｘａａ）_ｘ｝Ｃｙｓ_２ 部分式（Ｉｂ）
（式中、経験式｛（Ａｒｇ）_ｌ；（Ｌｙｓ）_ｍ；（Ｈｉｓ）_ｎ；（Ｏｒｎ）_ｏ；（Ｘａａ）_ｘ｝（式（ＩＩＩ））は、本明細書に定義する通りであり、（半経験）式（ＩＩＩ）に係るアミノ酸配列のコアを形成し、Ｃｙｓ_１及びＣｙｓ_２は、（Ａｒｇ）_ｌ；（Ｌｙｓ）_ｍ；（Ｈｉｓ）_ｎ；（Ｏｒｎ）_ｏ；（Ｘａａ）_ｘに近接するか又は末端に存在するシステインである）。

【0228】

トランスフェクション剤又は複合体化剤として用いることができる更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、カチオン性多糖類（例えば、キトサン）、ポリブレン、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（ −トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、又はカチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー（例えば、−アミノ酸ポリマー又は逆ポリアミド等の修飾ポリアミノ酸；ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））等の修飾ポリエチレン；ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルメタクリレート））等の修飾アクリレート；ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等の修飾アミドアミン；ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）；ポリプロピルアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭ系デンドリマー等のデンドリマー；ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）等のポリイミン；ポリアリルアミン；シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサン等の糖骨格系ポリマー；ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー等のシラン骨格系ポリマー）、１以上のカチオン性ブロック（例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される）と１以上の親水性又は疎水性のブロックとの組み合わせからなるブロックポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）等を含んでいてよい。

【0229】

別の実施形態によれば、本発明に係る医薬組成物は、医薬組成物の免疫賦活性を増強するために、アジュバントを含んでよい。この状況では、アジュバントは、本発明に係る医薬組成物に含まれる人工核酸分子又はベクター等の成分の投与及び送達を支援するのに好適な任意の化合物として理解してよい。更に、かかるアジュバントは、理論に束縛されるものではないが、自然免疫系の免疫応答、即ち、非特異的免疫応答を開始又は増大させることができる。言い換えれば、投与したとき、本発明に係る医薬組成物は、典型的に、人工核酸分子によってコードされている抗原に対する適応免疫応答を開始させる。更に、本発明に係る医薬組成物は、本発明に定義するアジュバントを本発明に係る医薬組成物に添加することにより、（支持的）自然免疫応答を発生させることができる。

【0230】

かかるアジュバントは、当業者に公知であり且つ本発明の場合に好適な、即ち、哺乳類における免疫応答の誘導を支援する任意のアジュバントから選択してよい。好ましくは、アジュバントは、ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミルジペプチド、プルロニック、アルム溶液、水酸化アルミニウム、ＡＤＪＵＭＥＲ（登録商標）（ポリホスファゼン）、リン酸アルミニウムゲル、藻類由来のグルカン、アルガミュリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）、水酸化アルミニウムゲル（アルム）、高タンパク質吸着性水酸化アルミニウムゲル、低粘度水酸化アルミニウムゲル、ＡＦ又はＳＰＴ（スクアレン（５％）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１（１．２５％）、リン酸緩衝生理食塩水のエマルジョン、ｐＨ７．４）、ＡＶＲＩＤＩＮＥ（商標）（プロパンジアミン）、ＢＡＹ Ｒ１００５（登録商標）（（Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシル−ドデカノイル−アミドヒドロアセテート）、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（商標）（１−アルファ，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３）、リン酸カルシウムゲル、ＣＡＰ（商標）（リン酸カルシウムナノ粒子）、コレラホロトキシン、コレラ毒素Ａ１−プロテインＡ−Ｄ断片融合タンパク質、コレラ毒素のＢサブユニット、ＣＲＬ１００５（ブロックコポリマーＰ１２０５）、サイトカイン含有リポソーム、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＯＣ／アルム複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ガンマイヌリン、Ｇｅｒｂｕアジュバント（以下の混合物：ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄグルタミン（ＧＭＤＰ）、ｉｉ）ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド（ＤＤＡ）、ｉｉｉ）亜鉛Ｌ−プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８））、ＧＭ−ＣＳＦ）、ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（β１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌアラニル−Ｄ−イソグルタミン）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（１−（２−メチプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）、ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミテート）、ＤＲＶ類（脱水−再水和小胞から調製した免疫リポソーム）、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−１ベータ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、ＩＳＣＯＭＳ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ７．０．３．（商標）、リポソーム、ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥ（商標）（７−アリル−８−オキソグアノシン）、ＬＴ経口アジュバント（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）不安定内毒素プロトキシン）、任意の組成物のミクロスフェア及びミクロ粒子、ＭＦ５９（商標）、（スクアレン水エマルジョン）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１（商標）（精製不完全フロイントアジュバント）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ７２０（商標）（代謝可能油アジュバント）、ＭＰＬ（商標）（３−Ｑ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ）、ＭＴＰ−ＰＥ及びＭＴＰ−ＰＥリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ））−エチルアミド、一ナトリウム塩）、ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３）、ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）及びＤＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−イソＧｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）、ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼ−ガラクトースオキシダーゼ）、任意の組成物のナノスフェア又はナノ粒子、ＮＩＳＶ類（非イオン性界面活性剤小胞）、ＰＬＥＵＲＡＮ（商標）（ベータ−グルカン）、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ及びＰＬＡ（乳酸及びグリコール酸のホモポリマー及びコポリマー、ミクロスフェア／ナノスフェア）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ１２１（商標）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＯＤＤＳ（商標）（プロテイノイドミクロスフェア）、ポリエチレンカルバメート誘導体、ポリ−ｒＡ：ポリ−ｒＵ（ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、渦巻き型タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ））、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（ＱＳ−２１）、Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）、Ｓ−２８４６３（４−アミノ−オテック−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）、ＳＡＦ−１（商標）（「Ｓｙｎｔｅｘアジュバント配合物」）、センダイプロテオリポソーム及びセンダイ含有脂質マトリックス、Ｓｐａｎ−８５（トリオレイン酸ソルビタン）、Ｓｐｅｃｏｌ（Ｍａｒｃｏｌ５２、Ｓｐａｎ８５、及びＴｗｅｅｎ８５のエマルジョン）、スクアレン又はＲｏｂａｎｅ（登録商標）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサン及び２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）、ステアリルチロシン（オクタデシルチロシンヒドロクロリド）、Ｔｈｅｒａｍｉｄ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド）、スレオニル−ＭＤＰ（Ｔｅｒｍｕｒｔｉｄｅ（商標）又は［ｔｈｒ１］−ＭＤＰ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン）、Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰ又はウイルス様粒子）；Ｗａｌｔｅｒ−Ｒｅｅｄリポソーム（水酸化アルミニウムに吸着させた脂質Ａを含有するリポソーム）及びリポペプチド（Ｐａｍ３Ｃｙｓを含む）、特に、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ及びＲｅｈｙｄｒａｇｅｌ等のアルミニウム塩；ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＩＦＡ、ＭＦ５９、Ｐｒｏｖａｘ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを含むエマルジョン；Ｏｐｔｉｖａｘ（ＣＲＬ１００５）、Ｌ１２１、及びＰｏｌｏａｘｍｅｒ４０１０を含むコポリマー；Ｓｔｅａｌｔｈを含むリポソーム、ＢＩＯＲＡＬを含む渦巻き型のもの；ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、ＩＳＣＯＭを含む植物由来のアジュバント；トマチンを含む同時刺激に好適なアジュバント、ＰＬＧ、ＰＭＭ、及びイヌリンを含むバイオポリマー；Ｒｏｍｕｒｔｉｄｅを含む微生物由来のペプチド、ＤＥＴＯＸ、ＭＰＬ、ＣＷＳ、マンノース、ＣｐＧ核酸配列、ＣｐＧ７９０９、ヒトＴＬＲ１−１０のリガンド、マウスＴＬＲ１−１３のリガンド、ＩＳＳ−１０１８、ＩＣ３１、イミダゾキノリン類、Ａｍｐｌｉｇｅｎ、Ｒｉｂｉ５２９、ＩＭＯｘｉｎｅ、ＩＲＩＶ類、ＶＬＰ類、コレラ毒素、易熱性毒素、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、フラジェリン、ＧＰＩアンカー、ＬＮＦＰＩＩＩ／Ｌｅｗｉｓ Ｘ、抗菌ペプチド、ＵＣ−１Ｖ１５０、ＲＳＶ融合タンパク質、ｃｄｉＧＭＰ、並びにＣＧＲＰ神経ペプチドを含むアンタゴニストとして好適なアジュバントからなる群から選択してよいが、これらに限定されない。

【0231】

また、好適なアジュバントは、カチオン性又はポリカチオン性の化合物から選択してもよく、前記アジュバントは、好ましくは、医薬組成物の人工核酸分子又はベクターとカチオン性又はポリカチオン性の化合物とを複合体化させる際に調製される。医薬組成物の人工核酸分子又はベクターと本明細書に定義するカチオン性又はポリカチオン性の化合物とを会合又は複合体化させることにより、好ましくは、医薬組成物の人工核酸分子又はベクターにアジュバント特性が提供され、また、安定化効果が付与される。このように特に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質から選択され、例えば、以下が挙げられる：プロタミン、ヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎｅ）、スペルミン又はスペルミジン、或いは他のカチオン性のペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、ＨＩＶ結合ペプチドを含む細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、Ｔａｔ、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来又は類似のペプチド、ＨＳＶ、ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特に、ショウジョウバエアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、又はヒストン。更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、例えばキトサン等のカチオン性多糖類、ポリブレン、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のカチオン性ポリマー、例えばＤＯＴＭＡ：１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド等のカチオン性脂質、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（ −トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、或いは、カチオン性又はポリカチオン性のポリマー、例えば、−アミノ酸ポリマー又は逆向きポリアミド等の修飾ポリアミノ酸、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））等の修飾ポリエチレン、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート））等の修飾アクリレート、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等の修飾アミドアミン、ジアミン末端修飾１，４−ブタンジオールジアクリレート−コ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータ−アミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピルアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭ系デンドリマー等のデンドリマー、ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）等のポリイミン、ポリアリルアミン、シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー及びキトサン等の糖骨格系ポリマー、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー等のシラン骨格系ポリマー、１以上のカチオン性ブロック（例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される）及び１以上の親水性ブロック又は疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）の組合せからなるブロックポリマー。

【0232】

更に、組成物の人工核酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡを複合体化することによってアジュバントとして用いることができる好ましいカチオン性又はポリカチオン性のタンパク質又はペプチドは、以下の合計式（Ｉ）：（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ（式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８〜１５であり、ｌ、ｍ、ｎ又はｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＯｒｎの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも５０％を表し；Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＯｒｎを除くネイティブの（＝天然）又は非ネイティブのアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であってよく；ｘは、０、１、２、３又は４から選択される任意の数であってよいが、但し、Ｘａａの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えない）を有する以下のタンパク質又はペプチドから選択してよい。この状況において特に好ましいオリゴアルギニンは、例えば、Ａｒｇ７、Ａｒｇ８、Ａｒｇ９、Ａｒｇ７、Ｈ３Ｒ９、Ｒ９Ｈ３、Ｈ３Ｒ９Ｈ３、ＹＳＳＲ９ＳＳＹ、（ＲＫＨ）４、及びＹ（ＲＫＨ）２Ｒ等である。

【0233】

人工核酸分子又はベクターのカチオン性又はポリカチオン性の化合物に対する比は、核酸複合体全体の窒素／リン酸比（Ｎ／Ｐ比）に基づいて計算することができる。例えば、１μｇのＲＮＡは、ＲＮＡが塩基の統計的分布を示す場合、典型的に、約３ｎｍｏｌのリン酸残基を含有する。更に、１μｇのペプチドは、塩基性アミノ酸の分子量及び数に依存して、典型的に、約ｘｎｍｏｌの窒素残基を含有する。例示として（Ａｒｇ）９（分子量：１，４２４ｇ／ｍｏｌ、９窒素原子）について計算する場合、１μｇの（Ａｒｇ）９は、約７００ｐｍｏｌの（Ａｒｇ）９を含有するので、７００×９＝６，３００ｐｍｏｌ塩基性アミノ酸＝６．３ｎｍｏｌ窒素原子である。質量比約１：１のＲＮＡ／（Ａｒｇ）９については、Ｎ／Ｐ比約２と計算することができる。例示として、２μｇのＲＮＡとの質量比が約２：１であるプロタミン（分子量：約４，２５０ｇ／ｍｏｌ、２１窒素原子、サケ由来のプロタミンを用いる場合）について計算する場合、ＲＮＡについて６ｎｍｏｌのリン酸を計算すべきであり、１μｇのプロタミンは、約２３５ｐｍｏｌのプロタミン分子を含有するので、２３５×２１＝４，９３５ｐｍｏｌ塩基性アミノ酸＝４．９ｎｍｏｌ窒素原子である。ＲＮＡ／プロタミンの質量比が約２：１の場合、Ｎ／Ｐ比は約０．８１と計算することができる。ＲＮＡ／プロタミンの質量比が約８：１の場合、Ｎ／Ｐ比は約０．２と計算することができる。本発明の状況では、Ｎ／Ｐ比は、好ましくは、約０．１〜約１０の範囲、好ましくは、約０．３〜約４の範囲、最も好ましくは約０．５〜約２の範囲であるか、又は複合体中の核酸：ペプチドの比に関しては０．７〜２の範囲、最も好ましくは、約０．７〜約１．５の範囲である。

【0234】

参照により本明細書に援用される国際公開第２０１０／０３７５３９号には、免疫賦活組成物及び免疫賦活組成物を調製する方法が記載されている。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の効率的な免疫賦活効果及び効率的な翻訳の両方を得るために、組成物は、２つの別々の工程で得られる。ここでは、所謂「アジュバント成分」は、第１の工程で、アジュバント成分の人工核酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡとカチオン性又はポリカチオン性の化合物とを特定の比で複合体化させて、安定な複合体を形成することによって調製される。この状況では、核酸の複合体化後に、アジュバント成分中に遊離カチオン性又はポリカチオン性の化合物が存在しないか、又は無視できる程度に少ない量しか残っていないことが重要である。したがって、アジュバント成分中の核酸及びカチオン性又はポリカチオン性の化合物の比は、典型的に、核酸全部が複合体化され、且つ組成物中に遊離カチオン性又はポリカチオン性の化合物が存在しないか、又は無視できる程度に少ない量しか残らない範囲で選択される。好ましくは、アジュバント成分の比、即ち、核酸のカチオン性又はポリカチオン性の化合物に対する比は、約６：１（ｗ／ｗ）〜約０，２５：１（ｗ／ｗ）、より好ましくは、約５：１（ｗ／ｗ）〜約０，５：１（ｗ／ｗ）、更により好ましくは、約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）、又は約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）、最も好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約２：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択される。

【0235】

好ましい実施形態によれば、本発明の（免疫賦活）組成物を形成するために、本発明に係る人工核酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡを、第２の工程で、アジュバント成分の複合体化核酸分子、好ましくはＲＮＡに添加する。ここでは、本発明の人工酸分子又はベクター、好ましくはＲＮＡ分子は、遊離核酸、即ち、他の化合物によって複合体化されない核酸として添加される。添加前、遊離核酸分子又はベクターは複合体化されておらず、アジュバント成分を添加した際、任意の検出可能な又は著しい複合体化反応を受けないことが好ましい。

【0236】

好適なアジュバントは、更に、式（ＩＩ）：ＧｌＸｍＧｎ（式中、Ｇは、グアノシン、ウラシル、又はグアノシン若しくはウラシルのアナログであり；Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、又は上記ヌクレオチドのアナログであり；ｌは、１〜４０の整数であり、ｌ＝１であるとき、Ｇは、グアノシン又はそのアナログであり、ｌ＞１であるとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％が、グアノシン又はそのアナログであり；ｍは、整数であり且つ少なくとも３であり、ｍ＝３であるとき、Ｘは、ウラシル又はそのアナログであり、ｍ＞３であるとき、少なくとも３つの連続するウラシル又はウラシルのアナログが存在し；ｎは、１〜４０の整数であり、ｎ＝１であるとき、Ｇは、グアノシン又はそのアナログであり、ｎ＞１であるとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％が、グアノシン又はそのアナログである）を有する核酸から選択してよい。

【0237】

他の好適なアジュバントは、更に、式（ＩＩＩ）：ＣｌＸｍＣｎ（式中、Ｃは、シトシン、ウラシル、又はシトシン若しくはウラシルのアナログであり；Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、又は上記ヌクレオチドのアナログであり；ｌは、１〜４０の整数であり、ｌ＝１であるとき、Ｃは、シトシン又はそのアナログであり、ｌ＞１であるとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％が、シトシン又はそのアナログであり；ｍは、整数であり且つ少なくとも３であり、ｍ＝３であるとき、Ｘは、ウラシル又はそのアナログであり、ｍ＞３であるとき、少なくとも３つの連続するウラシル又はウラシルのアナログが存在し；ｎは、１〜４０の整数であり、ｎ＝１であるとき、Ｃは、シトシン又はそのアナログであり、ｎ＞１であるとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％が、シトシン又はそのアナログである）を有する核酸から選択してよい。

【0238】

本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、「安全且つ有効な量」の医薬組成物の成分、特に、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子、ベクター、及び／又は細胞を含む。本明細書で使用するとき、「安全且つ有効な量」とは、本明細書に定義する疾患又は疾病の好ましい変化を著しく誘導するのに十分である量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、好ましくは、重篤な副作用を避け、且つ利益とリスクとの間の道理に適った関係を可能にする。これらの限度は、典型的に、道理に適った医学的判断の範囲内で決定される。

【0239】

更なる態様では、本発明は、医薬として、例えば（遺伝子ワクチン接種における）ワクチンとして、又は遺伝子治療において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。

【0240】

本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の治療作用又は効果を利用するか或いは特定のペプチド又はタンパク質の追加が必要である任意の医学的用途に特に好適である。したがって、本発明は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の治療作用又は効果によって治療することができるか、或いは特定のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の追加によって治療することができる疾患又は疾病の治療又は予防において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。例えば、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療によって、遺伝性疾患、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患、感染性疾患、慢性疾患等を治療又は予防するために用いることができる。

【0241】

特に、本発明の３’−ＵＴＲエレメントは、本発明の人工核酸分子又はベクターにコードされているペプチド又はタンパク質を安定的に長期に亘って発現させるので、治療を受ける被験体において治療用のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が安定的に且つ長期に亘って存在することから利益を得るかかる治療的処置は、本発明に関連する医学的用途に特に好適である。したがって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物に特に好適な医学的用途は、ワクチン接種である。したがって、本発明は、被験体、好ましくは哺乳類の被験体、より好ましくはヒトの被験体のワクチン接種のための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。好ましいワクチン接種処理は、細菌、原生動物、又はウイルスによる感染症等の感染性疾患に対するワクチン接種、及び抗腫瘍ワクチン接種である。かかるワクチン接種処理は、予防的であってもよく、治療的であってもよい。

【0242】

治療又は予防される疾患に応じてＯＲＦを選択してよい。例えば、オープンリーディングフレームは、遺伝性疾患に罹患している患者等、タンパク質が完全に欠失しているか又は機能が少なくとも部分的に喪失している患者に供給すべきタンパク質をコードしていてよい。更に、オープンリーディングフレームは、被験体の疾患又は症状に有益な影響を与えるペプチド又はタンパク質をコードしているＯＲＦから選択してよい。更に、オープンリーディングフレームは、天然のペプチド若しくはタンパク質の病的過剰産生をダウンレギュレートするか又は病的にタンパク質若しくはペプチドを発現する細胞を除去するペプチド又はタンパク質をコードしていてもよい。かかる欠失、機能喪失、又は過剰産生は、例えば、腫瘍及び新生物、自己免疫疾患、アレルギー、感染症、慢性疾患等に関連して生じる場合がある。更に、オープンリーディングフレームは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍抗原のエピトープ）をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍関連抗原のエピトープ）と、上記３’−ＵＴＲエレメント、及びポリ（Ａ）配列等の任意の更なる成分とを含むか又はからなるアミノ酸配列をコードしているＯＲＦを含む。

【0243】

医学的用途に関連して、特に、ワクチン接種に関連して、ＤＮＡは、抗ＤＮＡ免疫応答を誘発するリスクを有し且つゲノムＤＮＡに挿入される傾向を有するので、本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであることが好ましい。しかし、幾つかの実施形態では、例えば、アデノウイルス送達ビヒクル等のウイルス送達ビヒクルを、例えば、遺伝子治療的処置において本発明に係る人工核酸分子又はベクターを送達するために用いる場合、人工核酸分子又はベクターがＤＮＡ分子であることが望ましい場合もある。

【0244】

本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、埋め込まれたレザーバを介して、又はジェット注射を介して投与してよい。本明細書で使用するとき、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を含む。好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、無針注射（例えば、ジェット注射）を介して投与される。

【0245】

好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、非経口的に、例えば非経口注射によって投与され、より好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を介して投与される。皮内及び筋肉内への注射が特に好ましい。本発明の医薬組成物の滅菌注射用形態は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これら懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤と懸濁化剤とを用いて当技術分野において公知の技術に従って製剤され得る。好ましくは、溶液又は懸濁液は、無針注射（例えば、ジェット注射）を介して投与される。

【0246】

また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない任意の経口的に許容できる剤形で経口投与してよい。

【0247】

また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば、皮膚又は任意の他のアクセス可能な上皮組織の疾患を含む、局所塗布によって容易にアクセス可能な領域又は器官が治療標的に含まれる場合は特に、局所投与してもよい。これら領域又は器官のそれぞれについて、好適な局所製剤は容易に調製される。局所塗布については、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を、１以上の担体に懸濁又は溶解している好適な軟膏に製剤してよい。

【0248】

１つの実施形態では、医薬としての使用は、哺乳類細胞のトランスフェクション、好ましくは哺乳類細胞のインビトロ又はエクスビボトランスフェクション、より好ましくは前記医薬により治療される被験体の単離細胞のインビトロトランスフェクションの工程を含む。前記使用が単離細胞のインビトロトランスフェクションを含む場合、医薬としての使用は、トランスフェクトされた細胞を患者に再投与することを更に含んでいてよい。医薬としての本発明の人工核酸分子又はベクターの使用は、トランスフェクションに成功した単離細胞を選択する工程を更に含んでいてよい。したがって、ベクターが選択マーカーを更に含むことが有益である場合がある。また、前記医薬としての使用は、単離細胞のインビトロトランスフェクションと、前記細胞からの発現産物（即ち、コードされているペプチド又はタンパク質）の精製とを含んでいてよい。この精製ペプチド又はタンパク質は、後に、それを必要としている被験体に投与してよい。

【0249】

また、本発明は、上記疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物をそれを必要としている被験体に投与することを含む方法を提供する。

【0250】

更に、本発明は、疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターで細胞をトランスフェクトすることを含む方法を提供する。トランスフェクションは、インビトロで実施してもよく、エクスビボで実施してもよく、インビボで実施してもよい。好ましい実施形態では、細胞のトランスフェクションは、インビボで実施され、トランスフェクトされた細胞は、それを必要としている被験体、好ましくはヒト被験体に投与される。好ましくは、インビトロでトランスフェクトされる細胞は、被験体、好ましくはヒト患者の単離細胞である。したがって、本発明は、被験体、好ましくはヒト患者から細胞を単離する工程と、本発明に係る人工核酸又は本発明に係るベクターで前記単離細胞をトランスフェクトする工程と、前記トランスフェクトされた細胞を前記被験体、好ましくは前記ヒト患者に投与する工程とを含む治療方法を提供する。

【0251】

本発明に係る疾患を治療又は予防する方法は、好ましくは、上記ワクチン接種方法又は遺伝子治療方法である。

【0252】

上記の通り、本発明の３’−ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ分子を安定化することができる並びに／又はｍＲＮＡ分子からのタンパク質産生を増強、安定化及び／若しくは延長することができる。したがって、更なる態様では、本発明は、ＲＮＡ分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）を安定化させる方法であって、ＲＮＡ分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）又は前記ＲＮＡ分子をコードしているベクターと、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ又はリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’−ＵＴＲエレメント）とを結合させる工程を含む方法に関する。

【0253】

更に、本発明は、人工核酸分子若しくはベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）からのタンパク質産生を増強、安定化及び／若しくは延長させる、並びに／又は人工核酸分子若しくはベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）からのタンパク質産生を安定化及び／若しくは延長する方法であって、前記人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）と、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ又はリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’−ＵＴＲエレメント）とを結合させる工程を含む方法に関する。

【0254】

用語「人工核酸分子又はベクターと３’−ＵＴＲエレメントとを結合させる」とは、本発明において、好ましくは、人工核酸分子又はベクターと３’−ＵＴＲエレメントとを機能的に結合させるか又は機能的に組み合わせることを意味する。これは、人工核酸分子又はベクターと、３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’−ＵＴＲエレメント）とが、３’−ＵＴＲエレメントの機能（例えば、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生を安定化させる機能）が発揮されるように結合又はカップリングされることを意味する。典型的に、これは、３’−ＵＴＲエレメントが、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）の、オープンリーディングフレームの３’側、好ましくはオープンリーディングフレームの直ぐ３’側、好ましくはオープンリーディングフレームとポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれることを意味する。好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ）に３’−ＵＴＲとして、即ち、前記３’−ＵＴＲエレメントが、前記人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲになるように、即ち、任意で短いリンカー（例えば、１以上の制限酵素部位を含むか又はからなる配列）を介して連結されている、オープンリーディングフレームの３’側からポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルの５’側まで延在するように組み込まれる。したがって、好ましくは、用語「人工核酸分子又はベクターと３’−ＵＴＲエレメントとを結合させる」とは、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）内に位置するオープンリーディングフレームと３’−ＵＴＲエレメントとを機能的に結合させることを意味する。３’−ＵＴＲ及びＯＲＦは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りであり、例えば、好ましくは、ＯＲＦと３’−ＵＴＲとは、異種であり、例えば、上記の通り異なる遺伝子に由来する。

【0255】

更なる態様では、本発明は、ＲＮＡ分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）の安定性を上昇させるための３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’−ＵＴＲエレメント）の使用であって、前記３’−ＵＴＲエレメントが、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ又はリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる使用を提供する。

【0256】

更に、本発明は、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）からのタンパク質産生を増加させるため、並びに／又は人工核酸分子又はベクター分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）からのタンパク質産生を安定化及び／若しくは延長するための３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’−ＵＴＲエレメント）の使用であって、前記３’−ＵＴＲエレメントが、リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ又はリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる使用を提供する。

【0257】

本発明に係る使用は、好ましくは、人工核酸分子、ベクター、又はＲＮＡと上記３’−ＵＴＲエレメントとを結合させることを含む。

【0258】

本発明の医薬組成物の化合物及び成分は、互いに独立して製造及び取引されてもよい。したがって、本発明は、更に、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、及び／又は本発明に係る医薬組成物を含むキット又はキットオブパーツに関する。好ましくは、かかるキット又はキットオブパーツは、更に、使用説明書と、トランスフェクション用の細胞と、アジュバントと、医薬組成物の投与手段と、人工核酸分子、ベクター、細胞、又は医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び／又は薬学的に許容できる溶液とを含んでいてよい。

【実施例】

【0259】

１．ＤＮＡテンプレートの調製
Ｔ７プロモーター及びキタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼをコードしているＧＣリッチ配列（ｐｐＬｕｃ（ＧＣ））を含有するインビトロ転写用ベクターを構築した。リボソームタンパク質ラージ３２の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）をＰｐＬｕｃ（ＧＣ）の５’側に挿入した。Ａ６４ポリ（Ａ）配列と、それに続くＣ３０及びヒストンステムループ配列をＰｐＬｕｃ（ＧＣ）の３’側に挿入した。ヒストンステムループの後には、インビトロ転写前にベクターを線形化するために用いられる制限酵素部位が続く。インビトロ転写によってこのベクターから得られたｍＲＮＡを、「ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ」と命名する。
このベクターを、オープンリーディングフレームの３’側に非翻訳配列（３’−ＵＴＲ）を含むように改変した。要約すると、以下のｍＲＮＡコード配列を含むベクターを作製した（ｍＲＮＡコード配列の一部を図１〜３に例として示す）。
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号８、図１）
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号９、図２）
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ９−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号７、図３）
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ２１−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ２９−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ９−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ２７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ２８−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ１９−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ３５ａ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ１３−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ３６−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ２３ａ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ２３−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｕｂａ５２−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ２２ｌ１−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ３６ａ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ４ｘ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ２７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ３−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ２３−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ１３−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ２６−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ１７−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ１８−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ｆａｕ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｓ１３−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ１１−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ
ｒｐｌ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｒｐｌ３８−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ

【0260】

２．インビトロ転写
実施例１に係るＤＮＡテンプレートを線形化し、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写した。次いで、ＤＮＡテンプレートをＤＮａｓｅ処理によって分解した。ｍＲＮＡ転写産物は、過剰のＮ７−メチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシンを転写反応に添加することによって得られた５’−キャップ構造を含有していた。このようにして得られたｍＲＮＡを精製し、水に再懸濁させた。

【0261】

３．ｍＲＮＡリポフェクションによるルシフェラーゼ発現
ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞又はＨｅＬａ細胞を、培地（１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％グルタミンを添加した、Ｌ−グルタミン及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）中１ウェル当たり３×１０^４細胞の密度でトランスフェクションの３日間前に２４ウェルプレートに播種した。リポフェクションの直前、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と複合体化した１ウェル当たり２５ｎｇのＰｐＬｕｃコードｍＲＮＡで、細胞をリポフェクトした。トランスフェクション効率を制御するために、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（ＲｒＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡをＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした（１ウェル当たりＲｒＬｕｃ ｍＲＮＡ２．５ｎｇ）。トランスフェクション開始の９０分間後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを培地に交換した。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後、培地を吸引し、細胞をリシスバッファ１００μＬ（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓバッファ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶解させた。ルシフェラーゼ活性を測定するまで溶解物を−８０℃で保管した。

【0262】

４．ルシフェラーゼ測定
Ｈｉｄｅｘ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎプレートリーダーにおいて、ルシフェラーゼ活性を相対光単位（ＲＬＵ）として測定した。溶解物２０μＬ及びルシフェリンバッファ（Ｂｅｅｔｌｅジュース、ＰＪＫ ＧｍｂＨ）５０μＬを用いて、２秒間の測定時間でＰｐＬｕｃ活性を測定した。溶解物２０μＬ及びセレンテラジンバッファ（Ｒｅｎｉｌｌａジュース、ＰＪＫ ＧｍｂＨ）５０μＬを用いて、２秒間の測定時間でＲｒＬｕｃ活性を測定する。

【0263】

５．結果
５．１リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲは、タンパク質発現を増加させる。
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの影響を調べるために、様々なＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した：３’−ＵＴＲを有しないｍＲＮＡ、ヒトα−グロビン（ａｇ）の３’−ＵＴＲの中央のα−複合体結合部分を含むｍＲＮＡ、又はヒトリボソームタンパク質スモール９（ｒｐｓ９）の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡ。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。これらデータから、０時間〜７２時間に発現した合計タンパク質を曲線下面積（ＡＵＣ）として計算した（以下の表１及び図４を参照）。

【表38】

【0264】

ルシフェラーゼは、明らかに、３’−ＵＴＲを有しないｍＲＮＡから発現した。しかし、ルシフェラーゼ発現は、周知のα−グロビン３’−ＵＴＲによって増加しなかった。対照的に、リボソームタンパク質スモール９の３’−ＵＴＲは、ルシフェラーゼ発現を著しく増加させた。

【0265】

５．２ マウスリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲは、タンパク質発現を増加させる。
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するマウスリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの影響を調べるために、様々なＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した：様々なマウスリボソームタンパク質（ｒｐｓ２１、ｒｐｓ２９、ｒｐｓ９、ｒｐｓ２７、ｒｐｓ２８、ｒｐｓ１９、ｒｐｌ３５ａ、ｒｐｌ１３、ｒｐｌ３６、及びｒｐｌ２３ａ）の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡ、及び比較のための、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることが知られている（国際公開第２０１３１４３６９８号）アルブミンの３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡ。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表２及び図６を参照）。

【表39】

【0266】

結果は、タンパク質産生を増加させることが既に報告されているアルブミンの３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡに比べて、マウスリボソームタンパク質の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡからより多くのルシフェラーゼが発現したことを示す。

【0267】

５．３ マウスリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲは、タンパク質発現を増加させる。
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するマウスリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの影響を調べるために、様々なＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した：様々なマウスリボソームタンパク質（ｒｐｓ２１、ｒｐｓ２９、ｒｐｓ９、ｒｐｓ２７、ｒｐｓ２８、ｒｐｓ１９、ｒｐｌ３５ａ、ｒｐｌ１３、ｒｐｌ３６、及びｒｐｌ２３ａ）の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡ、及び比較のためのアルブミンの３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡ。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表３及び図７を参照）。

【表40】

【0268】

結果は、タンパク質産生を増加させることが既に報告されているアルブミンの３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡに比べて、マウスリボソームタンパク質の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡからより多くのルシフェラーゼが発現したことを示す。

【0269】

５．４ マウスリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲは、タンパク質発現を増加させる。
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するマウスリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの影響を調べるために、様々なＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した：様々なマウスリボソームタンパク質（ｒｐｌ２３、ｕｂａ５２、ｒｐｌ２２ｌ１、ｒｐｌ３６ａ、ｒｐｓ４ｘ、ｒｐｌ２７、ｒｐｌ３、ｒｐｓ２３、ｒｐｓ１３、ｒｐｌ２６、ｒｐｓ１７、ｒｐｓ１８、ｒｐｓ８、Ｆａｕ、ｒｐｓ１３、ｒｐｌ１１及びｒｐｌ３８）の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡ、及び比較のためのアルブミンの３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡ。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表４及び図８を参照）。

【表41】

【0270】

結果は、タンパク質産生を増加させることが既に報告されているアルブミンの３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡに比べて、マウスリボソームタンパク質の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡからより多くのルシフェラーゼが発現したことを示す。

【0271】

５．５ マウスリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲは、タンパク質発現を増加させる。
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するマウスリボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲの影響を調べるために、様々なＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した：様々なマウスリボソームタンパク質（ｒｐｌ２３、ｕｂａ５２、ｒｐｌ２２ｌ１、ｒｐｌ３６ａ、ｒｐｓ４ｘ、ｒｐｌ２７、ｒｐｌ３、ｒｐｓ２３、ｒｐｓ１３、ｒｐｌ２６、ｒｐｓ１７、ｒｐｓ１８、ｒｐｓ８、Ｆａｕ、ｒｐｓ１３、ｒｐｌ１１及びｒｐｌ３８）の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡ、及び比較のためのアルブミンの３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡ。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表５及び図９を参照）。

【表42】

【0272】

結果は、タンパク質産生を増加させることが既に報告されているアルブミンの３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡに比べて、マウスリボソームタンパク質の３’−ＵＴＲを含むｍＲＮＡからより多くのルシフェラーゼが発現したことを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]