特許 6706836 単核球培養用無血清培地

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6706836

(24)【登録日】2020年5月21日

(45)【発行日】2020年6月10日

(54)【発明の名称】単核球培養用無血清培地

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/00 20060101AFI20200601BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20200601BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20200601BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20200601BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20200601BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20200601BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/00

   C12N5/0786

   A61K35/15 Z

   A61P9/10

   A61P1/04

   A61P9/10 101

   A61P9/00

【請求項の数】4

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2016-22313(P2016-22313)

(22)【出願日】2016年2月9日

(65)【公開番号】特開2017-139975(P2017-139975A)

(43)【公開日】2017年8月17日

【審査請求日】2019年2月1日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２７年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「再生医療実用化研究事業」「難治性四肢潰瘍患者を対象とした自己抹消血単核球生体外増幅培養細胞移植による血管・組織再生治療」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】502285457

【氏名又は名称】学校法人順天堂

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】田中 里佳

(72)【発明者】

【氏名】平野 理恵

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／０５１１５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０９０８８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Diabetes Complications，２０１５年 ９月３０日，vol.30，p.12-20

【文献】 Cancer，２０１５年，p.432-440

【文献】 Nature Communications，２０１５年，DOI: 10.1038/ncomms8333，p.1-12

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

幹細胞因子、γ−セクレターゼ阻害剤、血管内皮細胞増殖因子、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド及びトロンボポエチンを含有し、インターロイキン６を含有しない単核球培養用無血清培地。

【請求項2】

請求項１記載の無血清培地中で単核球を培養することを特徴とする、少なくとも血管内皮前駆細胞が富化した細胞群の製造法。

【請求項3】

請求項１記載の無血清培地中で培養された単核球の培養物であって、少なくとも血管内皮前駆細胞が富化した細胞群を含有する培養物を有効成分とする虚血性疾患治療剤又は組織再生療法剤。

【請求項4】

虚血性疾患治療剤又は組織再生療法剤が、難治性潰瘍、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症、バージャー病及び全身の虚血性疾患から選ばれる疾患の治療剤又は組織再生療法剤である請求項３記載の虚血性疾患治療剤又は組織再生療法剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、難治性潰瘍等の虚血性疾患の治療に有用な単核球培養用無血清培地及びその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

難治性潰瘍、虚血性心疾患等の虚血性疾患に対する再生医療の一つとして、骨髄や末梢血由来の単核球を培養して得られる血管内皮前駆細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ：ＥＰＣ）を用いた細胞移植治療法が検討されている。そのためには、ＥＰＣを大量に培養する技術の開発が望まれている。
そのような技術として、ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性細胞から血管内皮前駆細胞の生体増殖法（特許文献１）、血管内皮細胞分化動態解析方法による内皮細胞様大コロニー（分化型ＥＰＣコロニー）形成細胞と内皮細胞様小コロニー（未分化型ＥＰＣコロニー）形成細胞の作製法（特許文献２）、骨髄単核球からＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性細胞の増幅方法（特許文献３）が報告されている。さらに、本発明者らは、単核球から血管新生に寄与する細胞群へと分化、増殖し得る培養条件として、単核球を幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子の５種の因子を含有する無血清培地中で培養する方法を開発した（特許文献４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】国際公開第２００６／０９０８８２号

【特許文献2】国際公開第２００６／０９０８８６号

【特許文献3】国際公開第２００６／０９３１７２号

【特許文献4】国際公開第２０１４／０５１１５４号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、前記５種の因子を含有する無血清培地を用いて、糖尿病患者由来の単核球を培養して得られた細胞群を用いて糖尿病患者に試験したところ、細胞数の減少、血管再生機能不良等の問題が生じることが判明した。
従って、本発明の課題は、虚血性疾患、組織再生、特に難治性潰瘍の治療に有効な十分量のＥＰＣが増幅可能な新たな無血清培地を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

そこで本発明者は、前記特許文献４記載の培地成分である５種の因子について種々検討したところ、インターロイキン６（ＩＬ−６）をγ−セクレターゼ阻害剤に変更すれば、単核球から少なくとも血管内皮前駆細胞が十分に富化した細胞群が効率良く得られ、糖尿病患者においても血管内皮前駆細胞の増加が確認できることを見出し、本発明を完成した。

【0006】

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。

【0007】

〔１〕幹細胞因子、γ−セクレターゼ阻害剤、血管内皮細胞増殖因子、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド及びトロンボポエチンを含有する単核球培養用無血清培地。
〔２〕〔１〕記載の無血清培地中で単核球を培養することを特徴とする、少なくとも血管内皮前駆細胞が富化した細胞群の製造法。
〔３〕〔１〕記載の無血清培地中の単核球培養物を有効成分とする虚血性疾患治療剤及び／又は組織再生療法剤。
〔４〕虚血性疾患治療剤及び／又は組織再生療法剤が、難治性潰瘍、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症、バージャー病及び全身の虚血性疾患から選ばれる疾患の治療剤、組織再生療法剤である〔３〕記載の虚血性疾患治療剤及び／又は組織再生療法。
〔５〕〔１〕記載の無血清培地中の単核球培養物を投与することを特徴とする虚血性疾患治療方法及び／又は組織再生療法。
〔６〕難治性潰瘍、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症、バージャー病及び全身の虚血性疾患から選ばれる疾患の治療方法、組織再生療法である〔５〕記載の治療方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明の無血清培地を用いれば、単核球から少なくとも血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が十分量富化された細胞群が効率良く得られる。従って、本発明の無血清培地を用いて単核球を培養して得られた培養物を用いれば、難治性潰瘍、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症、バージャー病、慢性と急性を含む全身の虚血性疾患（脳、腎臓、消化管等）等の虚血性疾患の治療、さらに創傷、乳房再建等の組織再生療法に有効である。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】末梢血単核球（Peripheral blood mononuclear cell;以下PBMNC）を２×１０⁶細胞で播種し、本発明の無血清培地で７日間培養した細胞（Restoration Culture Cell;以下ＲＣＣ）の細胞数と培養開始時の細胞数の比較を示す。＊＊＊は図に示された対象に対する有意差（Ｐ＜０．０００１）を示す。

【図2】ＰＢＭＮＣとＲＣＣをフローサイトメトリー解析し細胞の散布図をそれぞれ、細胞サイズにより3つの集団（即ち、リンパ球サイズ、単球サイズ、大型細胞サイズ）にゲートしたものである。

【図3】ＰＢＭＮＣとＲＣＣにおけるＣＤ３４陽性細胞の発現をフローサイトメーターによって計測しその発現割合（％）を示したものである。＊は図に示された対象に対する有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。

【図4】ＰＢＭＮＣとＲＣＣにおけるＣＤ２０６陽性細胞の発現をフローサイトメーターによって計測しその発現割合（％）を示したものである。＊は図に示された対象に対する有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。

【図5】左に未分化型ＥＰＣコロニーを、右に分化型ＥＰＣコロニーを示す。スケールは５００μｍである。

【図6】ＰＢＭＮＣとＲＣＣを播種した後の未分化型ＥＰＣコロニー（青枠）と分化型ＥＰＣコロニー（赤枠）数を計測したものを示す。＊は図に示された対象に対する有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。

【図7】糖尿病患者のＰＢＭＮＣを、前記特許文献４記載の培地成分（特４）と本発明の培地成分で培養後、ＥＰＣコロニーアッセイにて比較したものを示す。＊は図に示された対象に対する有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。

【図8】図８は糖尿病患者と健常人のＰＢＭＮＣとＲＣＣから得られた各コロニー数について、ＲＣＣをＰＢＭＮＣで比較した際の割合を示す。未分化型ＥＰＣコロニー（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ−ＣＦＵ：青枠）、分化型ＥＰＣコロニー（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ−ＣＦＵ：赤枠）、総コロニー（ｔｏｔａｌ−ＣＦＵ：灰色枠）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明の単核球培養用無血清培地は、（ａ）幹細胞因子（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ）、（ｂ）γ−セクレターゼ阻害剤（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、（ｃ）血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、（ｄ）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）及び（ｅ）トロンボポエチンを含有する。

【0011】

本発明に用いられる（ａ）幹細胞因子（ＳＣＦ）は、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、本発明に用いるＳＣＦはＥＰＣ等の富化に有用である限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。ＳＣＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。
無血清培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なるが、ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、好ましくは１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。

【0012】

本発明に用いられる（ｂ）γ−セクレターゼ阻害剤としては、γ−セクレターゼ阻害作用を有する物質であればよいが、例えば次の化合物が挙げられる。

【0013】

【化1】

【0014】

【化2】

【0015】

本発明に用いられるγ−セクレターゼ阻害剤は、Ｎｏｔｃｈシグナルの伝達物質であるγセクレターゼの切断を阻害し、Ｎｏｔｃｈ伝達経路を制御する化合物である。Ｎｏｔｃｈシグナルは血管新生において正常脈管形成やリモデリングに必須なシグナルであるが、過剰な活性は逆に異常血管形成や血管機能障害を来すことが知られている。
無血清培地中のγ−セクレターゼ阻害剤の濃度は、用いるγ−セクレターゼ阻害剤の種類によっても異なるが、０．００１〜１０μＭが好ましく、０．１〜５μＭがより好ましく、ＰＦ−０３０８４０１４の場合であれば１μＭが好ましい。

【0016】

本発明に用いられる（ｃ）血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＥＰＣに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種のＶＥＧＦタンパク質が産生されるが、本発明に用いるＶＥＧＦはＥＰＣのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプのＶＥＧＦでもよい。好ましくはＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。
無血清培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なるが、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、好ましくは５〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。

【0017】

本発明に用いられるＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）は、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チロシンキナーゼのリガンドとして知られている。いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。本発明に用いられるＦＬは、ＥＰＣ等の富化に有用である限り、いずれのタイプのＦＬであってもよい。
無血清培地中のＦＬの濃度は、用いるＦＬの種類によっても異なるが、ヒト組換えＦｌｔ−３リガンドの場合であれば、好ましくは１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１００ｎｇ／ｍＬである。

【0018】

本発明に用いられるトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。本発明に用いるＴＰＯの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。
無血清培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯの種類によっても異なるが、ヒト組換えＴＰＯの場合であれば、好ましくは１〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０ｎｇ／ｍＬである。

【0019】

本発明の無血清培地に添加される各種因子はまた、単核球が由来する動物と同種の動物に由来する因子で統一することが好ましい。このように単核球及び各種因子の由来を統一することで、同種異系移植等の同種移植に好適な細胞培養物が得られる。また、細胞移植が意図される個体由来の単核球を用いることで、同種同系移植に好適な細胞培養物を得ることも可能である。このように異種動物由来の成分を一切含有しない環境でＥＰＣ等を含む細胞群の培養が可能であるため、得られる細胞培養物は、移植等に際して感染リスク・拒絶反応を回避できるという利点を有する。

【0020】

上記した各成分は無血清培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各成分の濃縮液（ストック溶液）を調製し、無血清培地で所定の濃度に希釈することによって本発明の無血清培地を調製することができる。例えば市販の無血清培地に必要な成分を所定の濃度となるように溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により減菌したストック溶液を無菌的に市販の無血清培地に添加、希釈することによって本発明の無血清培地を調製することができる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０．２２μｍや０．４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。

【0021】

本発明で用いられる「無血清培地」は、当分野で通常用いられている培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている無血清培地を用いることができる。無血清培地として用いられる基礎培地としては、例えばＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が挙げられる。

【0022】

本発明で用いられる単核球とは、末梢血、骨髄または臍帯血等に含まれる円形核を持つ細胞の総称で、リンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等が含まれる。単核球はさらにＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を含んでいる。動物から骨髄、臍帯血または末梢血を採取し、それを例えば密度勾配遠心法に付して該分画を抽出することにより単核球が得られる。好ましくは末梢血由来である。密度勾配遠心法としては、単核球分画が形成されれば特に限定されないが好ましくはＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が用いられる。
本発明で用いられる単核球は、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別（陽性選別）を行うことなく、取得した単核球をそのまま細胞培養に用いることができる。

【0023】

本発明で用いられる細胞が由来する動物種は、虚血性疾患等の疾患に対する細胞移植療法が適用されるヒトを含む哺乳動物一般を意味するが、臨床応用を考慮すれば、好ましくはヒトである。

【0024】

本発明の無血清培地中での単核球の培養は、単核球を含有する細胞懸濁液を、本発明の無血清培地に添加することにより行われる。細胞懸濁液としてはまた、単核球を含有する体液自体（例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）を用いることもできる。単核球の培養条件は特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。例えば、５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で７日間以上（例えば１０日間以上）培養される。単核球の無血清培地中の濃度は、ＥＰＣ等の富化を可能とする限り特に限定されないが、好ましくは０．５〜１０×１０⁵細胞／ｍＬ、より好ましくは１〜５×１０⁵細胞／ｍＬ、最も好ましくは３〜４×１０⁵細胞／ｍＬである。

【0025】

本発明の無血清培地中で単核球を培養すると、特許文献４の５成分を含有する無血清培地で単核球を培養した場合に比べてＣＤ３４陽性細胞及びＣＤ２０６陽性細胞が顕著に増加する。また、ＥＰＣコロニー形成アッセイでは、健常者においても糖尿病患者でも分化型ＥＰＣコロニー形成細胞が顕著に増加していた。また、糖尿病患者におけるＥＰＣコロニー生産能も増加していた。
従って、本発明の無血清培地は、特許文献４記載の無血清培地に比べて、ＣＤ３４陽性細胞及びＣＤ２０６陽性細胞の増加、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞の増加により、優れた血管内皮前駆細胞富化能に優れており、血管新生を必要とする虚血性疾患治療用の培地あるいは組織再生療法用の培地として優れている。そのような虚血性疾患としては、難治性潰瘍（例えば糖尿病性潰瘍）、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症、バージャー病、慢性と急性を含む全身の虚血性疾患（脳、腎臓、消化管等）等が挙げられる。組織再生療法の対象としては、創傷、乳房再建等が挙げられる。

【実施例】

【0026】

次に糖尿病患者に対して行った実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

【0027】

実施例１
（１）ＳＣＦ、γ−セクレターゼ阻害剤、ＶＥＧＦ、ＦＬ及びＴＰＯ含有無血清培地の調製
培地に用いる無血清培地（Restoration culture ; 以下ＲＣ）は、stemline^TMII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma-Aldrich, Cat No. Ｓ０１９２)を用いて表１に示す組成に基づいて作成した。即ち、表１に示す各成分を、所定の最終濃度となるように無血清培地に無菌的に添加した。

【0028】

【表1】

【0029】

表１中、「ｈ」はヒト由来であることを示す。「ｒ」は組み換え体であることを示す。それ以外の略語は上述の通りである。

【0030】

（２）各培地中での単核球の培養
１．単核球の入手
２０〜８０歳の糖尿病（ＤＭ）患者から、翼付採血セットを用いて末梢血を４０〜６５ｍＬ、ＥＤＴＡ−２ＮＡ入り真空採血管へ採取した。採取は順天堂大学医学部医学調査委員会の承認の下で行い、得られた末梢血サンプルの取り扱いはヒトサンプルに対する生物学的ガイドラインに沿って行った。末梢血からの単核球（ＰＢＭＮＣ）単離は、末梢血を遠心後、バッフィーコート層を採取しＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７(Sigma-Aldrich, #10771)を用いた密度勾配遠心分離法にて単離した。単離されたＰＢＭＮＣはＰＢＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、緩衝液中に懸濁し、細胞懸濁液を調整した。単離されたＰＢＭＮＣにおいて得られる細胞数は末梢血１ｍＬあたり約０．８２×１０⁶個細胞、ＣＤ３４陽性率は０．０６±０．０４％、ＣＤ１３３陽性率は０．０４±０．０２％であった。

【0031】

２．培養条件
上記方法により単離されたＰＢＭＮＣを、Ｐｒｉｍａｒｉａ Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ(6well Primaria^TM tissue culture plate, BD Falcon, #353846)を用い、１ウェル当たり２×１０^６細胞／２ｍＬ ＲＣ培地の条件下、（１）で調整された無血清培地中で７日間培養した。

【0032】

３．培養細胞の種々の測定法
・ＲＣ細胞数
培養の結果、培養開始前のＰＢＭＮＣに対する上記培養後の細胞（以下、ＲＣＣといい、上記培養法をＲＣＣという場合がある）の数は、全ての糖尿病被験者において減少していた（平均で０．５６倍；図１）。血液１００ｍＬの末梢血に換算すると、血液１００ｍＬから平均で約４．６×１０^７個のＲＣ細胞が得られた。

【0033】

・フローサイトメトリー
上記培養条件により得られたＲＣＣの特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリーにより、血液血管系の幹細胞、血液系細胞、または血管系細胞の細胞表面マーカーの発現を調べた。フローサイトメトリー解析は下記の通りに行った。
ＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ中に懸濁した細胞（１．５×１０^６細胞／３００μＬ−ＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）にＦＣブロッキング試薬を１０μＬ添加し４℃で３０分間培養する。その後染色反応用チューブに等量ずつ分注した（１００μＬ／チューブ×３チューブ）。各アリコートに各一次抗体を２μＬ添加し４℃で２０分間培養した。その後１ｍＬのＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、染色した細胞をＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ中に懸濁した（５×１０^５細胞／２００〜３００μＬ−ＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）。フローサイトメトリー計測はＦＡＣＳＡｒｉａ^ＴＭIIIセルソーター（ＢＤ）を用いて行った。なお、抗体はいずれも市販のものを使用した。
計測された細胞の解析はＦｌｏｗＪｏ^ＴＭソフトウェア（Ｔｏｍｙ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を用いて行った。ＰＢＭＮＣまたはＲＣＣの散布図をそれぞれ、細胞サイズにより３つの集団、即ちリンパ球サイズ（Ｌｙｍｐｈ ｇａｔｅ）、単球サイズ（Ｍｏｎｏ ｇａｔｅ）、および大型細胞サイズ（Ｌａｒｇｅ ｇａｔｅ）にゲートした（図２）。先ずＰＢＭＮＣまたはＲＣＣ各々の生存細胞率を各ゲートにおいて推定する。次に、３つの細胞サイズ領域ごとに各細胞表面マーカー陽性細胞を測定し、ゲートした細胞集団中の生存細胞分画における陽性率（％）を計算した。
また、上記３集団にゲートした細胞の合計を１００％とした場合の陽性率を算出し、さらにこの場合のＲＣＣ前後の細胞全体における各マーカー発現細胞の％変化も算出した。
解析の結果、ＣＤ３４陽性幹細胞の比率が、ＰＢＭＮＣでは約０．０６％であるのに対してＲＣＣでは約１．０２％となり、ＲＣＣ前後で比較するとＣＤ３４陽性細胞の割合は１７倍と大幅に増加していた（図３）。内皮系細胞マーカーの陽性率はＣＤ３１で０．９３倍となりわずかに減少がみられた。
更に、抗炎症性Ｍ２型マクロファージのパラメーターであるＣＤ２０６は、ＰＢＭＮＣでは１．３１％、ＲＣＣでは２２．９１％で、ＲＣＣ前後比較は１７．４倍に増加していた。ＣＤ３４陽性細胞の増加と同程度に増加していた（図４）。
この結果は上記３集団にゲートした細胞の合計を１００％とした場合の陽性率でも同様の傾向であった。

【0034】

・ＥＰＣコロニー形成アッセイ
ＰＢＭＮＣおよびＲＣＣの血管形成能を調べるため、ＥＰＣコロニー形成アッセイ（ＥＰＣ−ＣＦＡ）によりＥＰＣコロニーを定量した。ＥＰＣ−ＣＦＡは、Ｍａｓｕｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０９：２０−３７（２０１１）に記載される方法を元に実施した。具体的には、３５ｍｍ Ｐｒｉｍａｒｉａ^ＴＭ ｄｉｓｈ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）中、表２に示す組成に基づいて作製した半固形培地中でＰＢＭＮＣ／ＲＣＣを培養し（２×１０^５細胞／１ディッシュ）、培養開始から１６日前後に位相差光学顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ−Ｕ，Ｎｉｋｏｎ）下にて、１ディッシュあたりのＥＰＣコロニー数を測定した。形成されるＥＰＣコロニーの種類として未分化型ＥＰＣコロニー（ＰＥＰＣ−ＣＦＵ（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ＥＰＣ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）；図５左）と、分化型ＥＰＣコロニー（ＤＥＰＣ−ＣＦＵ（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ＥＰＣ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）；図５右）があり、これらをそれぞれカウントした。

【0035】

【表2】

【0036】

ＥＰＣ−ＣＦＡの結果、ＰＢＭＮＣと比較してＲＣＣでは、ディッシュあたりの形成されたＥＰＣコロニーの総コロニー（ｔｏｔａｌ−ＣＦＵ）数、および特に分化型ＥＰＣコロニー（ＤＥＰＣ−ＣＦＵ）数について優位な増加が観察された（図６）。分化型ＥＰＣコロニーは未分化型ＥＰＣコロニーよりも更に強力な血管形成活性を持ち、また未分化型ＥＰＣコロニー（ＰＥＰＣ−ＣＦＵ）数も増加傾向にあることで総コロニー数が更に増幅し血管再生能を持つ細胞数の増加を示している。この結果はＰＢＭＮＣに対してＲＣＣは顕著に優れた血管再生能を有する細胞集団であることを実証している。ＥＰＣコロニー形成細胞分化度（総コロニー数に占めるＰＥＰＣ−ＣＦＵとＤＥＰＣ−ＣＦＵの割合（％））についても、ＰＢＭＮＣではＥＰＣコロニー形成細胞全体のうち未分化型コロニー形成細胞が８７．１％、分化型コロニー形成細胞が１２．９％であったのに対し、ＲＣＣでは未分化型コロニー形成細胞が３５．０％、分化型コロニー形成細胞が６５．０％と、分化型コロニー形成細胞の比率が大きく増加していた。
更に本発明のＲＣ培養（本ＲＣ）と前記特許文献４記載の培地成分を元にした培養（特４）を行ったＲＣＣをＥＰＣコロニー形成アッセイにて比較したところ、特４に比べ本ＲＣＣはＤＥＰＣ−ＣＦＵ及びｔｏｔａｌ−ＣＦＵが優位に増加した（図７）。
以上のことから、本発明のＲＣ培養は、血管形成能を有する細胞が量的にも機能的（質的）にも大いに向上することが実証された。

【0037】

（３）健常人との比較
本発明のＲＣ培養が虚血性疾患（この場合、特に糖尿病患者を示す）に対してより有効であるのを示すため、糖尿病患者と健常者のＰＢＭＮＣおよびＲＣＣでＥＰＣコロニー形成アッセイ（ＥＰＣ−ＣＦＡ）を行いＥＰＣコロニーを定量し血管形成能を比較した。
その結果、ＲＣＣにおけるＥＰＣコロニー形成頻度はＰＢＭＮＣに対して、各コロニーいずれにおいても健常者（Ｈｅａｌｔｈｙ）より糖尿病患者（ＤＭ）で増加していた（図８）。（ＰＥＰＣ−ＣＦＵはＤＭ：１．５７倍、Ｈｅａｌｔｈｙ：１．０８倍、ＤＥＰＣ−ＣＦＵはＤＭ：２３．３２倍、Ｈｅａｌｔｈｙ：１８．９１倍、ｔｏｔａｌ−ＣＦＵはＤＭ：７．４３倍、Ｈｅａｌｔｈｙ：５．２９倍。）。
故に、本発明のＲＣ培養が健常者よりもむしろ糖尿病患者においてより優れた効果を発揮することを示している。ＥＰＣ機能障害の生じている各疾患由来の血液からでも血管形成能を高めた細胞集団を培養することが可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】