特許 6707072 核酸増幅のための核酸

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6707072

(24)【登録日】2020年5月21日

(45)【発行日】2020年6月10日

(54)【発明の名称】核酸増幅のための核酸

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20200601BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20200601BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C12Q1/6876 Z

【請求項の数】14

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2017-250216(P2017-250216)

(22)【出願日】2017年12月26日

(62)【分割の表示】特願2015-503279(P2015-503279)の分割

【原出願日】2013年3月13日

(65)【公開番号】特開2018-64587(P2018-64587A)

(43)【公開日】2018年4月26日

【審査請求日】2018年1月15日

(31)【優先権主張番号】61/617,562

(32)【優先日】2012年3月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】595117091

【氏名又は名称】ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】メイドポグ、ポール

(72)【発明者】

【氏名】コフィンバーガー、ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ソートン、キース

【審査官】 田名部 拓也

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１４８２１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特許第６２７０８１４（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特表２００７−５００５１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１５５８５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 HOSKINS R. A. et al.，Database GenBank [online], Accession No.FI342570，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucgss/FI342570>，２００９年 １月１５日，CH322-41D21.yCHORI-322 Drosophila melanogaster genomic clone CH322-41D21, genomic survey sequence

【文献】 HOSKINS R. A. et al.，Database GenBank [online], Accession No.FI463486，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucgss/FI463486>，２００９年 １月１５日，CH322-41D21.yCHORI-322 Drosophila melanogaster genomic clone CH322-41D21, genomic survey sequence

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ／ＤＤＢＪ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１と少なくとも９７％同一である標的対照配列を含む単離核酸；
配列番号３または配列番号５のうちの少なくとも１つと、少なくとも８５％同一であるオリゴヌクレオチドを含む順方向プライマー；
配列番号４または配列番号６のうちの少なくとも１つと、少なくとも８５％同一であるオリゴヌクレオチドを含む逆方向プライマー；
付着された検出可能部分および配列番号２と少なくとも９５％同一である配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ；並びに、
試料、を含有する、核酸の検出及び／又は定量化における内部対照のための組成物。

【請求項2】

前記順方向プライマーのオリゴヌクレオチドが、配列番号３と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記逆方向プライマーのオリゴヌクレオチドが、配列番号４と少なくとも９５％同一である、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記順方向プライマーのオリゴヌクレオチドが配列番号３を含み、および、前記逆方向プライマーのオリゴヌクレオチドが配列番号４を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記順方向プライマーのオリゴヌクレオチドが配列番号５を含み、および、前記逆方向プライマーのオリゴヌクレオチドが配列番号６を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記単離核酸が、配列番号１を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

試料中の核酸の量を定量化するための方法であって、
配列番号１の配列と少なくとも約９７％同一の配列を含むポリヌクレオチドを、試料と組み合わせるステップと、
該ポリヌクレオチドを順方向プライマーおよび逆方向プライマーと接触させるステップであって、該順方向プライマーは、配列番号３または５のうちの少なくとも１つと、少なくとも８５％同一のオリゴヌクレオチドを含み、逆方向プライマーは、配列番号４または６のうちの少なくとも１つと、少なくとも８５％同一のオリゴヌクレオチドを含み、該接触させるステップは、標準的なＰＣＲ条件下で行われる、ステップと、
該順方向プライマーおよび逆方向プライマーを伸長し、それによって少なくとも１種の標的アンプリコンを生成するステップと、
オリゴヌクレオチドプローブを前記少なくとも１種の標的アンプリコンと接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドプローブが配列番号２と少なくとも９５％同一である配列を含み、さらに検出可能部分を含む、ステップと、
該少なくとも１種の標的アンプリコンの量に比例する信号を検出するステップと、を含む、方法。

【請求項9】

前記順方向プライマーのオリゴヌクレオチドが、配列番号３と少なくとも９５％同一である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記逆方向プライマーのオリゴヌクレオチドが、配列番号４と少なくとも９５％同一である、請求項８又は９に記載の方法。

【請求項11】

前記順方向プライマーのオリゴヌクレオチドが配列番号３を含み、および、前記逆方向プライマーのオリゴヌクレオチドが、配列番号４を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記ポリヌクレオチドが、配列番号１を含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記試料から核酸を抽出するステップであって、該抽出前に前記ポリヌクレオチドが試料と組み合わせられる、ステップをさらに含む、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれている、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７５６２号の優先権を主張するものである。

【0002】

配列表への参照
本願は、電子形式での配列表とともに出願されている。配列表は、サイズが１５，２５７バイトである、２０１３年３月１３日に作成された、２０１３年３月１３日に最後に保存されたＰＣＴ＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＧＥＮＯＭ＿１１５ＷＯ．ｔｘｔという表題のファイルとして提供されている。この情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0003】

本明細書の実施形態は一般に、核酸検査（ＮＡＴ）において試料からの核酸の増幅および／または抽出を監視するのに有用である内部対照核酸に関する。

【背景技術】

【0004】

核酸検査（ＮＡＴ）アッセイは、標的核酸を迅速検出および／または定量化するための強力なツールを提供する。したがって、ＮＡＴアッセイは一般に、試料中、例えば、臨床現場での患者試料中、食品試料中、環境試料中などで生物の存在を検出するのに使用される。ＮＡＴアッセイはまた、一般に、例えば、疾患または障害などの状態を示すものとして、遺伝的多型、遺伝子のリピート、挿入、欠失など、または遺伝子発現の変化を検出するための診断現場において使用される。

【0005】

多くの状況では、所与の試料中の標的核酸配列の量に関する定量的な情報を得ることが望ましい。例えば、定量的核酸アッセイ、例えば、増幅アッセイは、生体試料中に存在する病原体特異的標的配列の存在および／または量を検出して、試料が病原体に感染しているか否かを判定し、かつ／または感染の進行もしくは重症度を監視するのに使用することができる。定量的核酸アッセイは、細胞もしくは組織中に存在するマーカー核酸配列の量を監視することによって細胞もしくは組織の状態を監視するのに、または試料中に存在する特定のＤＮＡエレメント、例えば、リピートもしくは転位因子の量を定量化するのにも有用であり得る。

【0006】

定量的核酸増幅反応は、試料中に存在する標的核酸配列の相対量および／または絶対量を定量化するのに使用することができる。このような方法は、高度に進んだ、感度のよいものになっており、その結果、試料中で標的核酸の少数のコピーが検出され得る。定量的核酸増幅反応の高感度性に起因して、偽陽性、偽陰性、標的もしくは産物の量の過大評価、または標的もしくは産物の量の過小評価を回避するために、適切な内部対照を選択する際に細心の注意を払わなければならない。内部対照（例えば、内部対照鋳型、プライマー、および／またはプローブ）の特異性に関する考慮事項に加えて、例えば、ヘアピン、非常に低いアニーリング温度でのＡ／Ｔの実行、核酸を増幅および／またはプローブハイブリダイゼーションに適用可能にしない非常に高いアニーリング温度でのＧ／Ｃの実行を含めた、対照核酸配列の固有の特徴に関する考慮事項が存在する。さらに、様々な標的配列についての様々な多重反応において、同じ内部対照鋳型配列、プライマーセット、およびプローブを使用することが望ましい場合がある。しかし、多くの核酸配列は、反応条件の狭いセット下で増幅および／またはプローブハイブリダイゼーションに適用可能であり、多種多様な反応条件下で内部対照として使用されるのに十分にロバストでない。

【0007】

したがって、内部対照を実施して核酸増幅を監視するための内部対照配列、プライマー、およびプローブのロバストな組合せを同定することの複雑な性質を、当業者は理解するであろう。さらに、当業者は、ポリヌクレオチド鋳型配列、プライマー対、プローブ、またはこれらの組合せが定量的核酸増幅にとって実行可能な／十分な内部対照として機能することになるのを検証するのに、広範な経験的なバリデーションが実施されることが多いことを理解するであろう。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本明細書に開示の実施形態は、核酸検査（ＮＡＴ）アッセイの内部対照として有用な改善された組成物に関する。したがって、内部対照試薬、内部対照試薬を含有するキット、ならびに核酸検査アッセイでこれを作製および使用する方法が本明細書に提供されている。以下でさらに詳細に記載するように、本明細書に開示の内部対照試薬は、極めて大きい感度および再現性を含めた、高度に有利な性質を呈する。さらに、本明細書に開示の内部対照試薬は、異なる標的配列の広いアレイを検出および／または定量化するためのＮＡＴアッセイにおける対照として高度に多用途であり、有用である。

【0009】

したがって、いくつかの実施形態では、それだけに限らないが、定量的および／または定性的核酸増幅反応を含めた核酸増幅反応で鋳型として使用され得るポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、定量的ＰＣＲなどの定量的核酸検査アッセイの内部対照鋳型として使用することができる。例示的な内部対照鋳型ポリヌクレオチドは、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５の配列、またはこれらの部分配列を含めたこれらのバリアントを含み、これらから本質的になり、またはこれらからなる。

【0010】

いくつかの実施形態では、例えば、標準物質および／または内部対照として使用される鋳型対照配列を増幅するための核酸増幅のプライマーとして使用され得るオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドは、核酸増幅のための個々のプライマーおよび／またはプライマー対を含み得る。いくつかの実施形態では、これらのプライマーは、対照鋳型配列（例えば、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、およびこれらの部分配列を含めたこれらのバリアント）を増幅するのに使用することができる。例示的なプライマーは、配列番号３、４、５、もしくは６の配列、またはこれらのバリアントを含み、これらから本質的になり、またはこれらからなる。

【0011】

いくつかの実施形態では、プローブとして使用され得るオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、これらのプローブは、本明細書に開示の対照配列のアンプリコンにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、およびこれらのバリアントを含む。例示的なプローブは、配列番号２の配列、またはそのバリアントを含み、それから本質的になり、またはそれからなる。

【0012】

いくつかの実施形態では、キットが提供される。キットは、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、定量的核酸増幅内部対照のポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを含み得る。キットは、ポリヌクレオチド鋳型、鋳型配列を特異的に増幅するプライマーのうちの少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、鋳型配列を特異的に増幅する増幅プライマー対を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズするプローブを任意選択により含み得る。本明細書に開示のキットは、ポリメラーゼ、反応緩衝液、１種または複数のｄＮＴＰ、またはこれらの任意の組合せ、および増幅反応で使用される他の試薬を任意選択により含むことができる。

【0013】

いくつかの実施形態は、ＮＡＴアッセイを実施する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号１を含み、それから本質的になり、またはそれからなるポリヌクレオチド鋳型配列を準備するステップと、この鋳型配列を、鋳型配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマー、例えば、配列番号３、４、５、または６のプライマーと接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１のバリアントを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、プライマーを伸長し、こうして鋳型配列のアンプリコンを生成するステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、アンプリコンの存在および／または量を検出するステップを含む。いくつかの実施形態では、検出ステップは、アンプリコンをプローブと接触させることであって、プローブは、検出可能部分を含み、アンプリコンに結合する、ことを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、アンプリコンに特異的に結合されているプローブの量を判定するステップを含む。いくつかの実施形態では、判定ステップは、アンプリコンが生成される際にリアルタイムで実施される。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能部分を含み、検出可能部分からの信号の量が測定される。いくつかの実施形態では、アンプリコンに特異的にハイブリダイズされ、または結合されているプローブの蓄積が、時間またはサイクルの関数として測定され、増幅曲線が生成される。いくつかの実施形態では、一連の反応が実施され、各反応では、異なる既知量の鋳型配列が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、一連の増幅曲線から検量線を生成するステップを含む。いくつかの実施形態では、検量線は、増幅反応におけるポリヌクレオチド配列の初期濃度を判定するのに使用される。いくつかの実施形態では、増幅反応は、多重増幅反応を含む。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】配列番号８の配列を有する修飾されたＰＵＣ１１９ベクターのベクターマップを例示する図である。

【図2A-2B】例示的な内部対照鋳型配列（「ＤｒｏｓＳｃａｆｆ２」；配列番号８）を含むインサートを含有する修飾されたＰＵＣ１１９ベクターの配列（図２Ａは、配列の１〜１８００位を示し、図２Ｂは、配列の１８０１〜３３５０位を示す）、ならびに配列番号３と配列番号４を含むプライマー、および配列番号２を含むプローブの相対的な位置を示す図である。菱形記号で注記されているように、この配列の１６６８位の「ｔ」残基は、配列番号１５（「ＤｒｏｓＳｃａｆｆ１」）中の対応する位置で見つかる「Ｃ」残基と異なる。

【図3A】増幅プライマー対５を使用して、５コピーの鋳型、５０コピーの鋳型、および５００コピーの配列番号８を含む内部対照鋳型のリアルタイム増幅反応から導出される検量線を例示する図である。５コピーの鋳型、５０コピーの鋳型、および５００コピーの鋳型の各出発量について、４回の複製を実施し、Ｃｑを決定した。検量線は、Ｃｑ対鋳型の対数出発量を表す。

【図3B】図３Ａに示した検量線を生成するのに使用した一連の増幅反応の増幅曲線（蛍光対サイクル）を示す図である。

【図4A】初期鋳型濃度が、配列番号８を含む直線化プラスミドの２００、５０、２５、または５コピーであり、プライマー対５のプライマーを増幅プライマーとして使用した、一連の増幅反応の増幅曲線（蛍光対サイクル）を示す図である。配列番号２の配列を含む蛍光プローブを反応で使用した。

【図4B】初期鋳型濃度が、配列番号８を含む直線化プラスミドの２００、５０、２５、または５コピーであり、プライマー対１のプライマーを増幅プライマーとして使用した、一連のリアルタイム増幅反応の増幅曲線（蛍光対サイクル）を示す図である。配列番号２の配列を含む蛍光プローブを反応で使用した。

【図4C】初期鋳型濃度が、配列番号８を含む直線化プラスミドの２００、５０、２５、または５コピーであり、プライマー対５のプライマーを増幅プライマーとして使用した、一連のリアルタイム増幅反応の増幅曲線（蛍光対サイクル）を示す図である。配列番号２の配列を含む蛍光プローブを反応で使用した。

【図4D】初期鋳型濃度が、配列番号８を含む直線化プラスミドの２００、５０、２５、または５コピーであり、プライマー対５のプライマーを増幅プライマーとして使用した、一連のリアルタイム増幅反応の増幅曲線（蛍光対サイクル）を示す図である。配列番号２の配列を含む蛍光プローブを反応で使用した。

【図5】配列番号１５の配列を有する直線化プラスミド（「ＤｒｏｓＳｃａｆｆ１」プラスミド）のわずか５コピー／反応を検出する、ＰＣＲ性能（ＰＣＲ効率、Ｒ２、および勾配）、ならびに感度を例示する図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

前述の一般的な記述および以下の詳細な説明はともに、例示的で説明的であるだけであり、本教示の範囲を限定するように意図されていないことが理解されるべきである。本願では、単数形の使用は、別段に特に明言されていない限り、複数形を含む。また、「含む（comprise）」、「含有する」、および「含む（include）」、またはこれらの語根の修飾、例えば、それだけに限らないが、「含む（comprises）」、「含有した」、および「含む（including）」の使用は、限定的であるように意図されていない。「または」の使用は、別段に明言されていない限り、「および／または」を意味する。用語「および／または」は、前後の用語が、一緒に、または別個に採用され得ることを意味する。限定としてではなく、例示の目的で、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」もしくは「Ｙ」、または「ＸおよびＹ」を意味し得る。

【0016】

値の範囲が本明細書に提供されているときはいつでも、その範囲は、別段に特に明言されていない限り、開始値および終了値、ならびにその間の任意の値または値の範囲を含むことを意味する。例えば、「０．２〜０．５」は、０．２、０．３、０．４、０．５；その間の範囲、例えば、０．２〜０．３、０．３〜０．４、０．２〜０．４など；その間の増分、例えば、０．２５、０．３５、０．２２５、０．３３５、０．４９など；０．２６〜０．３９などのその間の増分範囲などを意味する。

【0017】

本明細書に使用される節の表題は、編成の目的のみであり、記載される主題を限定するものとして決して解釈されるべきでない。それだけに限らないが、特許、特許出願、記事、書籍、論文、およびインターネットウェブページを含めた、本願で引用されるすべての文献および同様の資料は、このような文献および同様の資料の形式にかかわらず、任意の目的に関してこれらの全体が参照により明白に組み込まれている。組み込まれた文献および同様の資料の１つまたは複数が、ある用語を、本願におけるその用語の定義と矛盾する様式で定義または使用する場合には、本願が支配する。本教示を、様々な実施形態と併せて記載するが、本教示がこのような実施形態に限定されることは意図されていない。反対に、本教示は、当業者が理解することになる様々な代替案、改変、および均等物を包含する。

【0018】

本開示の様々な実施形態により、核酸検査（ＮＡＴ）アッセイで使用するための組成物、およびキット、ならびにこれらを使用する方法が記載されている。したがって、いくつかの実施形態は、ＮＡＴアッセイ、例えば、増幅アッセイで使用するための核酸配列を提供する。任意の核酸配列について、逆相補鎖を容易に得ることができ、１つの核酸配列の開示は、その配列の逆相補鎖も開示することを、当業者は理解するであろう。本明細書に開示の核酸配列の部分配列を容易に得ることができることを、当業者は理解するであろう。

【0019】

本明細書に提供される核酸は、様々な形態であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、溶液、例えば、緩衝液中に溶解されている（単独で、または様々な他の核酸と組み合わせて）。いくつかの実施形態では、核酸は、塩として、単独で、または他の単離核酸と組み合わせて提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、再構成され得る凍結乾燥形態で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の単離核酸は、単独の凍結乾燥ペレットで、または他の単離核酸を含む凍結乾燥ペレットで提供することができる。いくつかの実施形態では、核酸は、固体物質、例えば、ビーズ、膜などに付けられて提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、宿主細胞、例えば、プラスミドを担持する細胞系統、または安定に組み込まれた配列を担持する細胞系統内で提供される。

【0020】

対照配列
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、ＮＡＴアッセイ用の対照核酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、対照配列は、検査試料と並行してプロセシングされる外部対照または標準物質として使用することができる。いくつかの実施形態では、対照配列は、内部対照として使用することができ、プロセシングの前に検査試料と組み合わされる。

【0021】

用語「核酸」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、およびプリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドであるポリヌクレオチドの任意の他のタイプ、ならびに非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））、およびポリモルホリノ（ＮＥＵＧＥＮＥ（商標）ポリマーとしてＡｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、Ｏｒｅｇ．から市販されている）、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマーを包含し、ただし、ポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡ中に見つかるものなどの塩基対合および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含有することを、当業者は理解するであろう。

【0022】

用語ヌクレオチドならびにポリヌクレオチドは、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホラミデート、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ならびにＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを含む。この用語は、公知のタイプの修飾、例えば、当技術分野で公知である標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）、負に帯電した連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および正に帯電した連結（例えば、アミノアルキルホスホラミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有するもの、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなどを含む）などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）など、およびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの無修飾形態も含む。

【0023】

本明細書において、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含有する部分を含むことになることが理解されるであろう。このような修飾としては、メチル化されたプリンもしくはピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、または他の複素環がある。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分上の修飾も含むことになり、例えば、水酸基の１つまたは複数は、ハロゲン、脂肪族基で置き換えられており、またはエーテル、アミンなどとして官能化されている。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの他の修飾は、それぞれの相補的なピリミジンまたはプリン、例えば、イソグアニン、イソシステインなどへの水素結合を形成するプリン塩基もしくはピリミジン塩基上の官能基の再配置、付加、置換、またはさもなければ変更を伴う。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドおよび／またはプローブは、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの修飾ヌクレオチドを含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸は、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む。本明細書において、用語「ユニバーサル塩基」は、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧから選択される１つを超えるヌクレオチドにハイブリダイズし得るヌクレオチド類似体を指す。いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、６−ニトロインドール、５−ニトロインドールからなる群から選択することができる。

【0025】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の対照核酸配列は、核酸増幅反応の鋳型である標的対照配列（「ＴＣＳ」）である。本明細書に開示のＴＣＳの部分配列を、本明細書に開示のＴＣＳの全体を増幅することができるように、本明細書でさらに詳細に論じられるＰＣＲまたは他の増幅法によって増幅することができることを、当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＴＣＳは、マルチプレックスアッセイの対照として提供され、このアッセイでは、既知量のＴＣＳ、および定量化される少なくとも１つの標的核酸がそれぞれ、同じ反応混合物中で増幅される。いくつかの実施形態では、既知量のＴＣＳは、第１の反応混合物中で増幅され、一方、定量化される標的核酸は、第２の反応混合物中で増幅される。

【0026】

いくつかの実施形態では、ＴＣＳは、配列番号１の配列、またはそのバリアントからなり、それから本質的になり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＳは、ベクター、例えば、プラスミド内に提供される。したがって、いくつかの実施形態は、プラスミド内に配列番号１からなり、それから本質的になり、またはそれを含むポリヌクレオチド配列、例えば、配列番号８からなり、それから本質的になり、またはそれを含む配列を提供する。ＴＣＳがプラスミドで提供される実施形態では、プラスミドは、直線化されている場合があり、または代わりに、プラスミドは、非直線化されている場合がある（例えば、スーパーコイル形態またはほどかれた環状形態で）。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、配列番号９、１０、１１、１２、もしくは１３の配列、またはこれらのバリアントのうちの少なくとも１つを含むポリヌクレオチドを含む。本明細書に開示の配列の「バリアント」を以下で論じる。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＴＣＳは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｅｃｈｅｌｌｉａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｙａｋｕｂａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｅｒｅｃｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｆｉｃｕｓｐｈｉｌａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｅｕｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｉａｒｍｉｐｅｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｔａｋａｈａｓｈｉｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｒｈｏｐａｌｏａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｋｉｋｋａｗａｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎａｎａｓｓａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｉｐｅｃｔｉｎａｔａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓ、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｌｌｉｓｔｏｎｉの生物のゲノムＤＮＡ、またはゲノム断片、またはこれらの修飾に由来する単離ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、ＴＣＳ配列は、配列番号１または配列番号１４を含み、それからなり、またはそれから本質的になる。例えば、配列番号１４は一般に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのゲノム中に見つかる配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣ２４６４３６；ヌクレオチド３５７７９〜３５９７８）に対応し、配列番号１は、配列番号１４への修飾を含み、すなわち、配列番号１４の９３位の「Ｃ残基」は、配列番号１の同じ位置で「Ｔ」に変更されていた。この修飾は、配列番号８のプラスミド内にも見つかり、図２で菱形の記号で注記されている。

【0028】

オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、例えば、プライマーおよび／またはプローブが提供される。本明細書において、用語「プライマー」および「プローブ」は、それだけに限らないが、オリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、長さが８から４５ヌクレオチドの間であり得る。例えば、プライマーおよび／またはプローブは、長さが少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。プライマーおよび／またはプローブは、例えば、固体支持体に結合したもの、液体、および凍結乾燥したものを含めた、任意の適当な形態で提供され得る。本明細書に開示のプライマー配列およびプローブ配列は、５’もしくは３’末端、または両方で追加のヌクレオチドを含有するように修飾することができる。しかし、増幅プライマー（必ずしもプローブではない）の３’末端への追加の塩基は、一般に、鋳型配列と相補的であることを、当業者は理解するであろう。本明細書に開示のプライマー配列およびプローブ配列は、５’末端または３’末端でヌクレオチドを除去するように修飾することもできる。増幅のために機能するために、プライマーまたはプローブは、本明細書に開示される最小限の長さおよびアニーリング温度のものとなることを、当業者は理解するであろう。

【0029】

オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、融解温度（Ｔ_ｍ）未満の温度であるアニーリング温度でこれらの標的に結合することができる。本明細書において、「Ｔ_ｍ」および「融解温度」は、二本鎖ポリヌクレオチド分子の集団の５０％が解離して一本鎖になる温度を指す互換性の用語である。ポリヌクレオチドのＴ_ｍを計算するための式は、当技術分野で周知である。例えば、Ｔ_ｍは、以下の式、すなわち、Ｔ_ｍ＝６９．３＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−６−５０／Ｌによって計算することができ、式中、Ｌは、ヌクレオチド中のプローブの長さである。ハイブリッドポリヌクレオチドのＴ_ｍも、１Ｍの塩中のハイブリダイゼーションアッセイから採用され、ＰＣＲプライマーのＴ_ｍを計算するのに一般に使用される式、すなわち、［（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃］を使用して推定することができる。例えば、Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎら、ＰＣＲ、２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７）、２４頁を参照。Ｔ_ｍを計算するために構造特性および配列特性を考慮に入れる他のより洗練された計算が当技術分野で存在する。オリゴヌクレオチドの融解温度は、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブと結合配列との間の相補性、および塩条件に依存し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で約９０℃未満、例えば、列挙される値の任意の２つの間の範囲を含めた、約８９℃、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９℃、またはそれ未満のＴ_ｍを有する。以下でさらに詳細に論じるように、いくつかの実施形態では、本明細書に開示のプライマーは、例えば、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む増幅プライマー対として提供される。好ましくは、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、１０℃超異ならない、例えば、１０℃未満、９℃未満、８℃未満、７℃未満、６℃未満、５℃未満、４℃未満、３℃未満、２℃未満、または１℃未満異なるＴ_ｍを有する。

【0030】

プライマー配列およびプローブ配列は、オリゴヌクレオチド配列内にヌクレオチド置換（標的配列と比べて）を有することによって修飾することができ、ただし、オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な相補性を含有する。このようにして、少なくとも１、２、３、４、または最大約５個のヌクレオチドが置換され得る。本明細書において、用語「相補的」は、２つのポリヌクレオチド鎖の領域間、または同じポリヌクレオチド鎖の２つの領域間の配列相補性を指す。２つの領域が逆平行様式で配置されるとき、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチドが第２の領域の塩基と塩基対合することができる場合、ポリヌクレオチドの第１の領域は、同じまたは異なるポリヌクレオチドの第２の領域と相補的である。したがって、２つの相補的なポリヌクレオチドがすべてのヌクレオチド位置で塩基対形成することは要求されない。「完全に相補的」は、第２のポリヌクレオチドと１００％、または「完全に」相補的である第１のポリヌクレオチドを指し、したがって、すべてのヌクレオチド位置で塩基対を形成する。「部分的に相補的」はまた、１００％相補的でなく（例えば、９０％、または８０％、または７０％相補的）、１つまたは複数のヌクレオチド位置でミスマッチしたヌクレオチドを含有する第１のポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。

【0031】

本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な（部分的に相補的を含む）ポリヌクレオチド鎖の対形成を参照して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、ポリヌクレオチド鎖同士間の会合の強度）は、ポリヌクレオチド同士間の相補性の程度や、塩の濃度、形成されるハイブリッドの融解温度、他のコンポーネントの存在（例えば、ポリエチレングリコールの存在または非存在）、ハイブリダイジング鎖のモル濃度、およびポリヌクレオチド鎖のＧ：Ｃ含量などの条件によって影響される、関与する条件のストリンジェンシーを含めた、当技術部分野で周知の多くの要因によってインパクトを受ける。いくつかの実施形態では、プライマーは、セット内の１つのプライマーのＴ_ｍがセット内の他のプライマーのＴ_ｍの２℃以内であるように設計される。核酸のハイブリダイゼーションへの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉ部、２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見つかる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。本明細書でさらに論じるように、用語「特異的なハイブリダイゼーション」または「特異的にハイブリダイズする」は、核酸増幅に一般に使用される条件下で、無関係な配列に対してではなく、標的配列、例えば、試料中の定量化される配列、陽性対照標的核酸配列などに対するポリヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブなどのハイブリダイゼーションを指す。

【0032】

いくつかの実施形態では、プライマーおよび／またはプローブは、オリゴヌクレオチド配列の全長にわたって標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。このような配列は、互いに対して「完全に相補的」と呼ぶことができる。オリゴヌクレオチドが本明細書の核酸配列に対して「実質的に相補的」と呼ばれる場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、またはこれらは、ハイブリダイゼーションの際にミスマッチを形成するが、以下に論じるストリンジェントな条件または標準的なＰＣＲ条件下でハイブリダイズする能力を保持する場合がある。本明細書において、用語「実質的に相補的」は、２つの核酸、例えば、オリゴヌクレオチドの相補性領域と標的配列との間の相補性を指す。相補性は、完全である必要はなく、２つの核酸間に任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得る。しかし、ミスマッチの数が多すぎてハイブリダイゼーションが最低のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でさえまったく起こり得ない場合、配列は、実質的に相補的な配列でない。２つの配列が本明細書で「実質的に相補的」と呼ばれる場合、それは、配列が選択された反応条件下でハイブリダイズするのに互いに十分に相補的であることを意味する。特異性を実現するのに十分な核酸相補性とハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとの関係は、当技術分野で周知であり、配列同一性、融解温度、およびハイブリダイゼーション条件を参照して以下でさらに記載されている。したがって、実質的に相補的な配列を、本明細書に開示の検出法のいずれにおいても使用することができる。このようなプローブは、例えば、完全に相補的であり得、またはハイブリダイゼーション条件が、例えば、標的配列と非標的配列との間の識別を可能にするのに十分である限り、１つから多くのミスマッチを含有し得る。したがって、実質的に相補的な配列は、参照配列と比較して、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、もしくはそれ未満、または間の任意の数値のパーセント同一性の範囲である配列を指すことができる。例えば、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的配列と比較して、１、２、３、４、５、またはそれ以上のミスマッチおよび／または縮重塩基を含有することができ、ただし、オリゴヌクレオチドは、例えば、標準的な核酸増幅条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる。

【0033】

本明細書に記載のプライマーは、それだけに限らないが、適切な配列のクローニングおよび消化、ならびに直接化学合成を含めた、当技術分野で公知の技法を使用して調製することができる。本明細書に記載のプライマーを作製するのに使用され得る化学合成法としては、それだけに限らないが、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８：９０によって記載されたホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８：１０９によって開示されたホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２：１８５９によって開示されたジエチルホスホラミデート法、および米国特許第４，４５８，０６６号に記載された固体支持体法がある。本明細書に記載の合成オリゴヌクレオチドプライマーを調製するための自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーの使用も、本明細書で企図されている。さらに、必要に応じて、プライマーは、当技術分野で公知であり、以下に記載される技法を使用して標識することができる。

【0034】

好ましくは、本明細書に開示のオリゴヌクレオチドは、標的配列または標的ポリヌクレオチド、例えば、ＴＣＳと完全または実質的に相補的である。本明細書において、用語「標的ポリヌクレオチド」および「標的核酸」は、その存在が反応内で判定されるポリヌクレオチド、例えば、内部対照配列、および／または測定される試料の配列を指す。

【0035】

したがって、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の１つの配列、またはそのバリアントを含み、それから本質的になり、またはそれからなるプライマーが本明細書で提供されている。

【0036】

プライマーセット
いくつかの実施形態では、増幅プライマーのセットが提供される。増幅プライマーのセットは、１つまたは複数の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のプライマー対を含み得る。本明細書において、用語「プライマー対」は、標的核酸、例えば、定量的ＰＣＲ内部対照配列の反対の鎖に個々にハイブリダイズする２つのプライマーを指すことができ、ここで、各プライマーは、例えば、ＰＣＲにおいて、その３’末端で伸長されて標的増幅産物を形成することができる。プライマー対は、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含み得る。

【0037】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物および方法は、標的対照配列にハイブリダイズし、これを増幅する増幅プライマーの少なくとも１つのセットを含むプライマー対を含む。配列番号３の配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなる第１のオリゴヌクレオチド、および配列番号４の配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなる第２のオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示の実施形態に関連して有用な、例示的なプライマー対（以下、「プライマー対５」）である。配列番号５の配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなる第１のオリゴヌクレオチド、および配列番号６の配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなる第２のオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示の実施形態に関連して有用な、別の例示的なプライマー対（以下、「プライマー対１」）である。プライマー対１およびプライマー対２の特徴を表１に記載する。

【0038】

【表1】

【0039】

いくつかの実施形態では、プライマー対は、配列番号３もしくは配列番号５の配列、または配列番号３もしくは配列番号５のバリアントを含む第１のプライマー、および配列番号４もしくは配列番号６の配列、または配列番号４もしくは配列番号６のバリアントを含む第２のプライマーを含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、プライマー対は、標的対照配列（ＴＣＳ）のアンプリコン、例えば、配列番号１の配列、配列番号８の配列、またはこれらのバリアントを含む鋳型を増幅するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、プライマー対１またはプライマー対５は、配列番号１または配列番号８の配列（例えば、鋳型対照配列）を増幅するのに使用される。いくつかの実施形態では、したがってプライマー対５は、配列番号９に示したアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態では、プライマー対１またはプライマー対５は、配列番号１のバリアント、例えば、配列番号１０、１１、１２、または１３の配列を含む鋳型を増幅する。いくつかの実施形態では、プライマー対１またはプライマー対５は、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａゲノムＤＮＡ、またはゲノム断片を含む鋳型を増幅する。

【0041】

プローブ
いくつかの実施形態では、配列特異的プローブが提供される。プローブには、それだけに限らないが、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列特異的プローブは、ＴＣＳなどの標的配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、配列特異的プローブは、本明細書に開示の順方向プライマーおよび逆方向プライマーの結合部位が隣接したヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし、それと完全または実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、配列特異的プローブは、配列番号３、４、５、または６の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のヌクレオチドを含み、その結果、配列特異的プローブは、本明細書に開示の増幅プライマーの結合部位と重複する。

【0042】

増幅産物を検出するための検出可能部分の様々なタイプが記載されている。検出可能部分の１つのクラスは、二本鎖核酸に非特異的に結合するインターカレート剤である。インターカレート剤は、非結合であるとき相対的に低い蛍光、および二本鎖核酸に結合すると相対的に高い蛍光を有する。したがって、インターカレート剤は、核酸増幅反応の間の二本鎖核酸の蓄積を監視するのに使用することができる。このような非特異的な色素の例としては、インターカレート剤、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）、ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウムなどがある。検出可能部分の他のタイプは、配列特異的核酸プローブの誘導体を使用する。例えば、鋳型核酸にハイブリダイズすると、蛍光の検出可能な変化が生じるように１種または複数の色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ。非特異的色素がいくつかの用途にとって望ましい場合があるが、配列特異的プローブは、増幅のより正確な測定をもたらし得る。配列特異的プローブの一構成は、フルオロフォアに繋ぎ止められたプローブの一端、およびクエンチャーに繋ぎ止められたプローブの他端を含み得る。プローブがハイブリダイズしていないとき、これは、ステムループ構成を維持することができ、ここでフルオロフォアは、クエンチャーによってクエンチされ、したがってフルオロフォアが蛍光を発するのが妨げられる。プローブが鋳型核酸配列にハイブリダイズしているとき、これは、直線化され、フルオロフォアをクエンチャーから遠ざけ、したがってフルオロフォアが蛍光を発することが可能になる。配列特異的プローブの別の構成は、ＦＲＥＴ対の第１のフルオロフォアに繋ぎ止められた第１のプローブ、およびＦＲＥＴ対の第２のフルオロフォアに繋ぎ止められた第２のプローブを含み得る。第１のプローブおよび第２のプローブは、第１のプローブおよび第２のプローブが同じアンプリコンにハイブリダイズされているとき、ＦＲＥＴによるエネルギー移動を可能にするのに十分近接した範囲内にあるアンプリコンの配列にハイブリダイズするように配置することができる。

【0043】

いくつかの実施形態では、配列特異的プローブは、フルオロフォアにコンジュゲートされた本明細書に開示のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、２種以上のフルオロフォアにコンジュゲートされている。フルオロフォアの例としては、キサンテン色素、例えば、フルオレセインおよびローダミン色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２−［（エチルアミノ）−３−（エチルイミノ）−２−７−ジメチル−３Ｈ−キサンテン−９−イル］安息香酸エチルエステル一塩酸塩（Ｒ６Ｇ）（約５００〜５６０ｎｍの範囲の波長で応答放射線（response radiation）を発する）、１，１，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドジカルボシアニンヨージド（ＨＩＤＣ）（約６００〜６６０ｎｍの範囲の波長で応答放射線を発する）、６−カルボキシフルオレセイン（略語ＦＡＭおよびＦによって一般に公知）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）、およびローダミン１１０など；シアニン色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ７色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８；フェナントリジン色素、例えば、テキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、Ｃｙ３（約５４０〜５８０ｎｍの範囲の波長で応答放射線を発する）、Ｃｙ５（約６４０〜６８０ｎｍの範囲の波長で応答放射線を発する）などのシアニン色素など；ＢＯＤＩＰＹ色素、ならびにキノリン色素がある。対象とする特定のフルオロフォアとしては、ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ＦＡＭ、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、Ｒ１１０、エオシン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、ＨＩＤＣ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、リッサミン、ＲＯＸ、ナフトフルオレセイン、テキサスレッド、ナフトフルオレセイン、Ｃｙ３、およびＣｙ５などがある。

【0044】

いくつかの実施形態では、プローブは、クエンチャーにコンジュゲートされている。クエンチャーは、電磁放射線を吸収し、それを熱として散逸することができ、したがって暗いままである。例示的なクエンチャーとしては、ダブシル、ＮＦＱ、例えば、ＢＨＱ−１またはＢＨＱ−２（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、ＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ ＦＱ（ＩＤＴ）、およびＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ ＲＱ（ＩＤＴ）などがある。いくつかの実施形態では、クエンチャーは、フルオロフォアが発する電磁放射線を吸収するようにフルオロフォアと対を形成するように選択される。本明細書に開示の組成物および方法で有用なフルオロフォア／クエンチャー対は、当技術分野で周知であり、ワールドワイドウェブサイトｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｅａｃｏｎｓ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｍａｒｒａｓ，ｍｍｂ０６％２８３３５％２９３．ｐｄｆで入手可能なＳ．Ｍａｒｒａｓ、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ａｎｄ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ Ｐａｉｒｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ」に見つけることができ、例えば、記載されている場合がある。

【0045】

いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、プローブの第１の末端に付着されており、クエンチャーは、プローブの第２の末端に付着されている。付着は、共有結合を含み得、任意選択により、プローブとフルオロフォアまたはクエンチャーとの間に位置した少なくとも１つのリンカー分子を含み得る。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、プローブの５’末端に付着されており、クエンチャーは、プローブの３’末端に付着されている。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、プローブの３’末端に付着されており、クエンチャーは、プローブの５’末端に付着されている。定量的核酸増幅で使用することができるプローブの例としては、分子ビーコン、ＳＣＯＲＰＩＯＮＳ（商標）プローブ（Ｓｉｇｍａ）、およびＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）がある。

【0046】

本明細書に開示のいくつかの実施形態は、配列番号１もしくは配列番号８の鋳型対照配列、もしくは鋳型対照配列のアンプリコン、またはその部分配列に特異的にハイブリダイズするプローブを提供する。したがって、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、プライマー対１またはプライマー対５の１つによる配列番号１または配列番号８を含む鋳型の増幅からのアンプリコンにハイブリダイズするプローブを提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号８、９、１０、１１、１２、または１３の少なくとも１つのアンプリコンにハイブリダイズすることによって、配列番号１のバリアントまたはその部分配列の増幅を測定する。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号２もしくは１６の配列、またはそのバリアントを含み、それから本質的になり、またはそれからなるオリゴヌクレオチドプローブが提供される。いくつかの実施形態では、プローブは、本明細書に記載のフルオロフォアおよび／またはクエンチャーを含む。好適な実施形態では、プローブは、フルオロフォア６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（「ＲＯＸ」または「Ｒ」）がプローブの５’末端に付着しており、クエンチャーＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ Ｂｌａｃｋ−ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）２（ＩＤＴ）（「ＢＨＱ」）がプローブの３’末端に付着している配列番号２を含むことができる（例えば、５’−（ＲＯＸ）−ＴＧＡ ＴＧＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＣＡ ＴＴＧ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＣＣ Ｔ−ＢＨＱ−２−３’）。

【0047】

いくつかの実施形態では、２種以上のプローブが提供される。いくつかの実施形態では、第１のプローブが提供され、第２のプローブが提供される。第１のプローブは、第１のＦＲＥＴフルオロフォアに付着することができる。第２のプローブは、第２のＦＲＥＴフルオロフォアに付着することができる。第１のプローブおよび第２のプローブはそれぞれ、定量化されるアンプリコンの配列にハイブリダイズするように配置することができる。いくつかの実施形態では、第１のプローブは、アンプリコンの第１の部分配列にハイブリダイズするように配置され、第２のプローブは、アンプリコンの第２の部分配列にハイブリダイズするように配置される。いくつかの実施形態では、第１の部分配列は、第２の部分配列の５’に位置され、第１の部分配列の３’末端と第２の部分配列の５’末端との間の塩基の数は、約１０塩基以下、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または０塩基である。いくつかの実施形態では、第１のプローブおよび第２のプローブはそれぞれ、配列番号１の部分配列、またはそのバリアントである配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１のプローブは、配列番号２の配列、または配列番号２のバリアントもしくは部分配列を含み、第２のプローブは、本明細書に記載した通りである。

【0048】

ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される核酸配列（例えば、ＴＣＳ）は、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルス内に存在する。ベクターは、当技術分野で周知であり、当業者は、多くのベクターを、核酸配列をもたらすのに使用することができることを理解するであろう。さらに、ベクターの多くのバリアントが存在し、追加のベクターを当業者によって生成することができる。ベクターを、部位特異的突然変異誘発によって、ランダム突然変異誘発によって、または１つまたは複数のクローニングステップによって修飾して、ベクターの少なくとも１つの核酸配列、例えば、複数のクローニング部位、抗生物質耐性遺伝子、起始部もしくは複製、またはベクターを担持する細胞の可視化を促進するマーカー、例えば、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、もしくは緑色蛍光タンパク質などをコードする遺伝子を付加、除去、および／または置換することができる。

【0049】

いくつかの実施形態では、ベクターは、核酸増幅鋳型配列を含有する。核酸増幅鋳型配列は、例えば、第１のベクターから核酸増幅鋳型配列を取り出すための制限消化、および第２のベクター内に核酸増幅鋳型配列を挿入するためのライゲーションによって、または核酸増幅鋳型配列の核酸増幅、例えば、ＰＣＲ増幅、および第２のベクター内への核酸増幅鋳型配列のライゲーションによって異なるベクターに移動させることができる。

【0050】

例として、ｐＵＣ１１９に由来するプラスミドを配列番号７に示す。いくつかの実施形態では、内部対照鋳型配列（例えば、ＴＣＳ）を含有しないプラスミド、例えば、配列番号７のプラスミドを、ＮＡＴアッセイにおける陰性対照として使用することができる。配列番号１のＰＣＲ鋳型配列を含有するｐＵＣ１１９由来プラスミドの配列は、配列番号８に提供されている。図１は、配列番号８の配列を含むプラスミドのマップを例示する。

【0051】

バリアント
列挙した核酸配列のバリアントは、当技術分野で公知の技法を使用して、例えば、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、または所望のバリアントの化学合成によって生成することができることを、当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、列挙した配列のバリアントが提供され、ここで、各バリアントは、少なくとも１つのヌクレオチドが参照配列と異なる配列を有する。いくつかの実施形態では、バリアント核酸は、参照配列と少なくとも約７０％、例えば、列挙される値の任意の２つの間の範囲を含めた、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または９９．９９％のｎｔ−ｎｔ同一性を有する実質的に相補的な配列を含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、バリアントは、参照配列と実質的に等価な、または同様の機能を有する。例えば、プライマーおよび／またはプローブ結合部位を有する参照配列について、プライマーおよび／またはプローブ結合側の外側の核酸中の多くのバリアントは、プライマー結合、および後続の増幅、またはプローブハイブリダイゼーションに影響しない。

【0053】

いくつかの実施形態では、参照鋳型のバリアントは、参照鋳型と同じプライマーによって増幅される。いくつかの実施形態では、参照プローブハイブリダイゼーション部位のバリアントは、参照配列と同じプローブにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ＴＣＳのバリアントは、同じプライマーによって増幅され、ＴＣＳと同じプライマーによってハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、ＴＣＳのバリアントが提供され、１種または複数の対応するバリアントプライマーがバリアントＴＣＳにアニールされるように提供される。いくつかの実施形態では、プローブ結合部位のバリアントが提供され、１種または複数の対応するバリアントプローブがバリアントプローブ結合部位にハイブリダイズされるように提供される。いくつかの実施形態では、定量的核酸増幅内部対照配列のバリアントが提供され、対応するバリアントプライマーおよび／またはプローブがバリアント内部対照配列にアニールされるように提供される。

【0054】

いくつかの実施形態では、バリアントは、プライマーおよび／またはプローブハイブリダイゼーション部位中に部分的なミスマッチをもたらすが、依然としてプライマーまたはプローブの結合を可能にする。バリアントは、プローブおよび／またはプライマー中にあり得る。代わりに、バリアントは、プローブおよび／またはプライマーが結合する配列中にあり得る。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブのバリアントは、５核酸以下、例えば、５、４、３、２、または１ヌクレオチドのミスマッチをもたらす。いくつかの実施形態では、ミスマッチが存在する場合でも、ミスマッチがプライマーの３’末端の最初の２つのヌクレオチド内にない限り、プライマーは、結合部位にアニールし、ＰＣＲ増幅のために機能することができる。いくつかの実施形態では、ミスマッチが存在する場合でも、ミスマッチの位置にかかわらず、プローブは、標的配列にハイブリダイズすることができる。

【0055】

いくつかの実施形態では、バリアントＰＣＲプライマーまたはプローブは、本明細書に記載のアニーリング温度で標的配列に結合し、したがって、核酸配列の増幅および／または検出に機能的である。

【0056】

いくつかの実施形態では、配列番号１と少なくとも約８５％、例えば、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するバリアントが提供される。配列番号１は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの単離配列を表す。配列番号３および配列番号４のプライマーが配列番号１を増幅するのに使用されるとき、配列番号９の配列が生成される。いくつかの実施形態では、配列番号３または配列番号５の配列を含む順方向プライマー、および配列番号４または配列番号６の配列を含む逆方向プライマーを含むプライマー対が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのゲノムＤＮＡを増幅するのに使用される。このゲノムＤＮＡ中にリピートが存在するために、配列番号８、９、１０、もしくは１１、またはその部分配列を含む配列が、本明細書に記載のプライマー対によって生成され得る。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１の配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上のヌクレオチドバリアントを含むが、この配列は、配列番号３もしくは配列番号５の配列を含むプライマーの１つ、および配列番号４もしくは配列番号６の配列を含むプライマーの１つを含むプライマー対によって増幅することができ、かつ／または配列番号２のプローブによってハイブリダイズすることができる。

【0057】

方法
例えば、ＮＡＴアッセイパフォーマンスの効率を監視するために、本明細書に開示の組成物を使用する方法が本明細書に提供されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、検査試料の調製、およびプロセシングの効率を監視するのに使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、検査試料と組合せ、核酸抽出および／またはプロセシング（例えば、増幅および／または検出）を監視するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、検査試料と組み合わされないが、核酸抽出および／またはプロセシング（例えば、増幅および／または検出）を監視するために並行してプロセシングされる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のプライマーおよび核酸鋳型は、様々な分析物の増幅の対照としてさらに機能を果たしながら、抽出効率、または様々な自動もしくはマニュアルプロセスの試料プロセシングシステムの他のパフォーマンス測定基準を判定するためのロバストで再現可能な方法をもたらす。例えば、本明細書に開示の組成物は、それだけに限らないが、ＮＡＴアッセイにおいて試料を自動的に調製およびプロセシングする（例えば、核酸抽出および調製、ならびに増幅および検出を自動的に実施する）デバイスを含めた、ＮＡＴアッセイを自動的に実行するデバイスとともに有利には使用することができる。

【0058】

いくつかの実施形態では、抽出パフォーマンス対照が提供される。核酸は、当技術分野で公知の様々な技法を使用して、生物検体または臨床検体、例えば、組織試料、体液、または細胞培養試料、および食品試料、土壌試料などを含めた様々なタイプの検体から抽出することができる。核酸抽出は、生体試料、例えば、タンパク質、脂質、膜、小器官、炭水化物、および無機分子中の他の物質から核酸を分離することを含み得る。核酸抽出は、手作業で、または様々な自動システムの１つによって実施することができる。本明細書で提供される方法は、核酸抽出の効率を監視するのに、例えば、抽出法、デバイス、および／もしくは試薬をバリデートし、抽出プロセスが実施される際の陽性対照を提供し、かつ／または自動プロセシングデバイスの１種または複数のコンポーネントの保守点検を実施するのに有用となり得る。

【0059】

いくつかの実施形態では、既知量の核酸鋳型、例えば、標的対照配列（ＴＣＳ）が、生体試料、例えば、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、１３、これらのバリアント、またはその逆相補鎖に添加される。いくつかの実施形態では、既知量の核酸鋳型が、核酸抽出プロトコールの任意のステップを実施する前に検査試料に添加される。いくつかの実施形態では、既知量の核酸鋳型が、核酸抽出プロトコールにおける少なくとも１つのステップが実施された後に添加される。

【0060】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、核酸増幅法で使用することができる。いくつかの実施形態では、核酸増幅は、例えば、試料中に存在する核酸の相対量または絶対量を測定するための定量的核酸増幅を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、核酸配列が試料中に存在するか、存在しないかを判定するための定性的核酸増幅を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸増幅は、例えば、核酸配列が試料中に存在するか否かを判定し、存在する場合、試料中に存在する核酸配列の相対量または絶対量を測定するための定量的および定性的核酸増幅を含み得る。核酸増幅の方法として、それだけに限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、例えば、多置換増幅（ＭＤＡ）、ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、免疫増幅、および転写媒介増幅（ＴＭＡ）を含めた様々な転写ベース増幅手順、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己持続配列複製（３ＳＲ）、およびローリングサークル増幅を挙げることができる。例えば、Ｍｕｌｌｉｓ、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ， Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ，ａｎｄ／ｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｗａｌｋｅｒ、「Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、米国特許第５，４５５，１６６号；Ｄｅａｎら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、米国特許第６，９７７，１４８号；Ｎｏｔｏｍｉら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ」、米国特許第６，４１０，２７８号；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、米国特許第４，９８８，６１７号、「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」；Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇａｐ Ｆｉｌｌｉｎｇ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、米国特許第５，４２７，９３０号；Ｃａｓｈｍａｎ、「Ｂｌｏｃｋｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｋｉｔ」、米国特許第５，８４９，４７８号；Ｋａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、米国特許第５，３９９，４９１号；Ｍａｌｅｋら、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ」、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｌｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１１９７（１９８８）；Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，８５４，０３３号、「Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ」を参照。いくつかの実施形態では、列挙した核酸増幅法の２つ以上が、例えば、順次、実施される。

【0061】

いくつかの実施形態では、検量線を生成するために、一連の個々の増幅反応が、既知量の核酸鋳型、例えば、本明細書に開示の鋳型対照配列（ＴＣＳ）を用いて実施される。検量線に基づいて、別個の増幅反応における標的鋳型の量を決定することができる。いくつかの実施形態では、既知量の内部対照鋳型（例えば、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、もしくは１３、またはそのバリアントなどの鋳型対照配列）が、増幅される標的核酸を含有しても、含有していなくてもよい試料と組み合わされ、鋳型対照配列および標的核酸（存在する場合）の両方が多重反応で増幅される。いくつかの実施形態では、各反応が既知の量の鋳型対照配列（例えば、配列番号１、８、９、１０、１１、１２、または１３）を有する一連の核酸増幅反応、検出閾値が内部対照鋳型の各量について決定され、それによって検量線が生成される。いくつかの実施形態では、対照鋳型の各量の複数の複製、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の複製が実施される。次いで、内部対照配列の検量線を使用して、試料中の標的反応物の量を判定することができる。核酸定量化の多重および標準曲線方法は、ＭｃＭｉｌｌａｎら（米国特許第６，７８３，９３４号）によって詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、標的アンプリコンが検出閾値に到達するまで実施される増幅サイクルの数が計算される（「Ｃｑ」）。いくつかの実施形態では、本方法は、増幅反応中にプローブを提供するステップを含む。例えば、いくつかの実施形態では、非配列特異的プローブが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、増幅反応中に配列特異的プローブ、例えば、配列番号２、またはそのバリアントを含み、それからなり、またはそれから本質的になるプローブを提供するステップを含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、本方法は、生成されるアンプリコンの量を検出するステップを含む。検出は、連続的に、または定期的に実施することができる。例えば、検出は、各Ｎ番目のサイクルまたはその画分の最後に実施することができ、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などの１つである。いくつかの実施形態では、検出は、蛍光、例えば、プローブに繋ぎ止められたフルオロフォアの発光波長、またはプローブに繋ぎ止められたフルオロフォアの発光波長を含む波長範囲における電磁放射線の強度を測定することを含み得る。いくつかの実施形態では、検出は、ＦＲＥＴを検出することを含み得る。

【0063】

いくつかの実施形態では、定量的核酸増幅の効率が測定される。これは、定量的核酸増幅反応の効率を測定する、例えば、低コピー数の核酸に対する反応の感度を判定し、または定量的核酸増幅のためのプロトコール、試薬、および／もしくはデバイスを最適化もしくはバリデートするのに有用となり得る。いくつかの実施形態では、既知量の核酸鋳型が定量的核酸反応に添加される。いくつかの実施形態では、鋳型は、内部対照鋳型である。いくつかの実施形態では、核酸鋳型のアンプリコンを増幅するように構成されたプライマー対が、反応に添加される。プライマー対の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、鋳型にハイブリダイズし、伸長し、こうしてアンプリコンを生成することができる。生成されるアンプリコンの量は、増幅反応中の１つまたは複数の時点で監視することができ、または本明細書に開示の方法を使用して連続的に監視することができる。いくつかの実施形態では、閾値サイクルＣｑは、相対蛍光単位（ＲＦＵ）のレベル、例えば、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１７００、２０００、２５００、または３０００ＲＦＵとして規定することができる。本明細書の実施例２では、Ｃｑは、５００ＲＦＵとして規定されている。いくつかの実施形態では、検量線は、Ｃｑ対鋳型の出発量、またはその対数変換として表される。いくつかの実施形態では、検量線は、相対蛍光単位対鋳型の出発量、またはその対数変換として表される。

【0064】

いくつかの実施形態では、既知量の核酸鋳型が、本明細書に記載の定量的核酸増幅反応、例えば、定量的ＰＣＲによって定量化される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＮＡが抽出される実施形態では、ＲＮＡが定量化ステップの前に逆転写されてＤＮＡにされる。いくつかの実施形態では、既知量の核酸鋳型が、抽出手順が完了した後に定量化される。いくつかの実施形態では、例えば、抽出プロセスという後続ステップの効率を判定するために、既知量の核酸鋳型が、抽出プロセスにおける中間ステップ後に定量化される。

【0065】

本明細書に開示の組成物は、本明細書に開示されるように、様々なタイプの核酸増幅反応において使用することができることを、当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用することができる。臨床微生物学に適用される、標準的なＰＣＲ条件を含めたＰＣＲ技術の総説については、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ；Ｂｏｓｔｏｎ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ、（２０００）が出版したＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ Ｐ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６７：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ（１９９７）におけるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、および 「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９１年〜１９９５年（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照。「ＰＣＲ条件」の非限定例としては、本明細書で引用した参考文献に開示された条件、例えば、７２℃のアニーリング温度を用いた５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、または５９℃のアニーリング温度を用いた４ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１５ｍｇのＢＳＡ、４％のトレハロース、または５５℃のアニーリング温度を用いた５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２などがある。

【0066】

いくつかの実施形態では、少なくとも１種のポリメラーゼが提供される。ポリメラーゼは、定量的ＰＣＲに使用することができる。それだけに限らないが、ＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、ＫｌｅｎＴａｑ １（ＡＢ ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．）、ＨＯＴＧＯＬＤＳＴＡＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、ＫＡＰＡＴＡＱ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＫＡＰＡ２Ｇ（商標）Ｆａｓｔ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｓ）、およびＰＨＵＳＩＯＮ（商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を含めた様々な核酸ポリメラーゼが使用のために利用可能である。

【0067】

いくつかの実施形態では、単一のプライマー、例えば、配列番号３、４、５、６、またはそのバリアントが増幅に使用される。

【0068】

温度サイクリング
温度サイクリング条件は、使用されるサーマルサイクラー、および増幅のパフォーマンスを改変し得る他の変数に応じて、異なるステップのそれぞれについて時間および温度が多様となり得る。いくつかの実施形態では、２−ステッププロトコールが実施され、その中でこのプロトコールは、プライマーおよびプローブのアニーリングならびに伸長ステップの両方に最適な一般的な温度でアニーリングステップとエロンゲーションステップを組み合わせる。いくつかの実施形態では、３−ステッププロトコールが実施され、その中で、変性ステップ、アニーリングステップ、およびエロンゲーションステップが実施される。

【0069】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、リアルタイム増幅反応用デバイス、例えば、ＢＤ ＭＡＸ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＶＩＰＥＲ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＶＩＰＥＲ ＬＴ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＳＭＡＲＴＣＹＬＣＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＩＭＸ４０００（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）などとともに使用することができる。

【0070】

等温増幅
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、核酸の等温増幅を含む方法において使用することができる。等温増幅条件は、変数、例えば、使用される方法、酵素、鋳型、および１種または複数のプライマーなどに応じて時間および温度が多様となり得る。等温条件下で実施され得る増幅法の例としては、それだけに限らないが、ＬＡＭＰ、ＳＤＡなどのいくつかのバージョンがある。

【0071】

等温増幅は、任意選択の変性ステップ、その後の、核酸が増幅される等温インキュベーションを含み得る。いくつかの実施形態では、等温インキュベーションは、最初の変性ステップを伴わないで実施される。いくつかの実施形態では、等温インキュベーションは、少なくとも約２５℃、例えば、列挙される値の任意の間の範囲を含めた、約２５℃、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、または７５℃で実施される。いくつかの実施形態では、等温インキュベーションは、約３７℃で実施される。いくつかの実施形態では、等温インキュベーションは、約６４℃で実施される。いくつかの実施形態では、等温インキュベーションは、１８０分以下、例えば、列挙される値の任意の２つの間の範囲を含めた、約１８０、１６５、１５０、１３５、１２０、１０５、９０、７５、６０、４５、３０、または１５分にわたって実施される。

【0072】

ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの方法が提供される。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、本明細書に記載の試料、またはその切片に対して実施することができる。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、例えば、細胞内、細胞の集団の中、組織もしくは臓器内、および／または生物全体内の核酸標的配列の局在化を特定するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、試料中の標的核酸のコピー数を定量化するのに使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプローブを、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで使用することができる。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号２、またはそのバリアントおよび／もしくは部分配列から実質的になるオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、プローブは、配列番号３〜６のうちの１つ、またはそのバリアントおよび／もしくは部分配列を含み、またはそれから実質的になるオリゴヌクレオチドを含み得る。

【0073】

マスターミックス
いくつかの実施形態では、マスターミックスが提供される。マスターミックスは、ＮＡＴアッセイにおける試薬の相対濃度に比例する相対濃度で提供されるアッセイ用の少なくとも２種の試薬を含み得る。したがって、単一量のマスターミックスを反応に添加して、２種以上の試薬の適切な相対濃度をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、マスターミックスは、ポリメラーゼ、緩衝液、塩、例えば、マグネシウム、ヌクレオチド三リン酸、プライマー対、および水のうちの少なくとも２つを含み得る。いくつかの実施形態では、マスターミックスは、反応で使用されることになるより高い濃度で提供される場合がある。いくつかの実施形態では、マスターミックスは、凍結乾燥形態で提供され、反応で使用されることになるより高い濃度で再構成される。いくつかの実施形態では、マスターミックスは、反応濃度の少なくとも約２倍、例えば、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、２５０倍、または５００倍の濃度の試薬を含む。

【0074】

キット
いくつかの実施形態では、キットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、プライマー対、１つのプローブ、鋳型ポリヌクレオチド、例えば、定量的ＮＡＴ内部対照鋳型配列、ポリメラーゼ、緩衝液、１種または複数のヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰミックス）、指示書、または包装のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、キットの少なくとも１種の試薬は、マスターミックス中で提供される。

【0075】

いくつかの実施形態では、内部対照鋳型、内部対照鋳型を増幅するための少なくとも１種のプライマー対、およびプライマー対のアンプリコンにハイブリダイズした少なくとも１種のプローブが、標的ポリヌクレオチドの少なくとも１種のプライマー対および少なくとも１種のプローブとともに提供される。

【0076】

いくつかの実施形態では、キットの内部対照配列は、配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３のうちの少なくとも１つを含むポリヌクレオチド鋳型を含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の少なくとも１種のプライマー、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のうちの１つを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の少なくとも１種のプライマー対、例えば、プライマー対１、および／またはプライマー対５を含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の少なくとも１種のプローブ、例えば、配列番号２または１６を含むオリゴヌクレオチドプローブを含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、キットは、逆転写酵素；ＲＮＡｓｅ、例えば、ＲＮＡａｓｅ Ｈ；またはＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのうちの少なくとも１つを含む。

【実施例1】

【0080】

感度、ロバスト性、および再現性を伴った定量的ＰＣＲ
対照／標準配列としての本明細書に開示の組成物の感度、ロバスト性、および再現性を評価するために、一連のポリメラーゼ連鎖反応増幅反応を実施した。

【0081】

各反応は、既知数のコピーの鋳型プラスミド、配列番号２（もしくは図４Ｄに示したアッセイの場合では配列番号１６）の配列を有するＴＡＱＭＡＮ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プローブ、およびプライマー対１またはプライマー対５のうちの１つを含んでいた。図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄに表したアッセイでは、鋳型は、配列番号８の配列を有するプラスミドであった。図５に表したアッセイでは、鋳型は、配列番号１５の配列を有する直線化プラスミドであった。反応は、５コピーの鋳型、５０コピーの鋳型、および５００コピーの鋳型で実施し、４回の複製を実施した。リアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，）を使用して、光学９６ウェル反応プレート内で実施した。温度サイクリングプロファイルは、９５℃、１５分（１サイクル）；９５℃、１５秒、６０℃、１分（５０サイクル）であった。ＰＣＲ反応条件は、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（７０ｍＭ）、ＮａＯＨ ５．０ｍＭ、逆方向プライマー０．６０μＭ、順方向プライマー０．６０μＭ、Ｄｒｏｓ．ＭＡＸプローブ（０．４０μＭ）（注：本明細書に記載の４つの異なるプローブロットを使用した）、ＭｇＣｌ_２（３．５ｍＭ）、ｄＡＴＰ（０．０５ｍＭ）、ｄＣＴＰ（０．０５ｍＭ）、ｄＧＴＰ（０．０５ｍＭ）、ｄＴＴＰ（０．０５ｍＭ）、ＨＧＳポリメラーゼ（２．７ユニット）であった。各量の鋳型について、各サイクルの最後における産物の量を相対蛍光単位で測定し、産物の閾値レベルを検出するのに必要であったサイクルの数（Ｃｑ）（蛍光プローブのハイブリダイゼーションで測定した場合の）を判定した。Ｃｑの閾値レベルは、５００ＲＦＵに設定した。

【0082】

図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、これらのアッセイの結果を例示する。わずか５コピーのプラスミドを有する反応についてでさえ、高度に再現可能な結果が得られた。図３Ａに示したように、複製のそれぞれのＣｑに対する鋳型のコピー数をプロットする検量線のＲ^２値は、０．９９３であった。

【0083】

ＰＣＲ反応１回当たり２００、５０、２５、および５コピーのプラスミドでの定量的ＰＣＲ反応に関して、図４Ａ、図４Ｃ、および図４Ｄに示した増幅曲線は、プライマー対５について高い感度および再現性を実証し、図４Ｂは、プライマー対１について高い感度および再現性を実証する。図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃは、各アッセイが、異なるプローブロット（図４Ａ＝ロット１；図４Ｂ＝ロット２、図４Ｃ＝ロット３）からの、配列番号２の配列（すなわち、プローブの５’末端で単一の「Ｔ」）を有するプローブを使用した結果を表し、一方、図４Ｄは、配列番号１６の配列（すなわち、プローブの５’末端で「ＴＴ」ダブレット）を有するプローブを使用するアッセイからの結果を表す。図４Ｄの結果は、このシステムは、バリアントプローブが使用される場合でさえ（プローブの５’末端上のＴは、配列番号１６の等価な鎖上の「Ｃ」に対応するので、配列番号１６のプローブは、配列番号８の鋳型のプローブ結合配列を完全には補完しないことに留意されたい）、高い感度および再現性を有することを実証する。図４Ｂに示したように、検出閾値および増幅率は、５コピーの鋳型（参照番号１）、５０コピーの鋳型（参照番号２）、および５００コピーの鋳型（参照番号３）を有する反応について、再現可能で感度が良かった。

【実施例2】

【0084】

定量的増幅反応
細胞試料を収集する。ＲＮＡを細胞試料から単離する。単離した試料ＲＮＡを逆転写し、こうして試料ｃＤＮＡを生成する。ポリメラーゼ、緩衝液、マグネシウム、およびヌクレオチド三リン酸を含む凍結乾燥したマスターミックスを、希釈剤を添加することによって２倍の濃度に再構成する。等分のマスターミックス、ならびに２倍濃度の試料ｃＤＮＡ（または陰性対照もしくは陽性対照）；ウイルスＲＮＡマーカーを増幅するためのプライマー、増幅されたウイルスマーカーの量を測定するためのＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）プローブ、および内部対照核酸を含む液体を、薄壁のプラスチックアッセイチューブ内で組み合わせる。

【0085】

内部対照は、ＰＣＲ試薬の完全性を監視し、ＰＣＲ阻害剤の存在を検出するために各アッセイ試験管内に存在する。２種の外部対照も実施する。すべての試薬を含有するが鋳型ＤＮＡをまったく含有しない１つの陰性対照、および標的遺伝子を含有することが分かっている試料である１つの陽性対照を、試料としてプロセシングするが、対照として機能を果たすように実行する。すべての対照は、同じ増幅反応内で同じ試薬を使用して同時に実施する。内部対照は、配列番号８の核酸配列を有するプラスミドを含む鋳型を使用して実施する。内部対照は、配列番号３の配列を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号４の配列を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対を含む。プライマー対は、配列番号６の部分配列を増幅し、配列番号７の配列を有するポリヌクレオチド産物を生成する。内部対照は、配列番号２の配列のＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）プローブを含む。

【0086】

反応混合物は、鋳型核酸、それぞれ約０．４μＭの濃度のオリゴヌクレオチドプライマー、約０．３５μＭのプローブ、酵素に適切な緩衝液、塩（この場合、ＭｇＣｌ_２）、およびもちろん、約０．０６Ｕ／反応の最低濃度でのポリメラーゼ酵素の古典的な組合せである。ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素をポリメラーゼとして使用する。それぞれ（ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）について約０．１５ｍＭの濃度のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ならびに約０．１５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）も、反応混合物に添加する。ＢＳＡは、任意選択であり、ＰＣＲ阻害剤の存在下でさえ反応を実施するのに役立ち得る。

【0087】

プライマー伸長、および標的ＤＮＡの増幅を可能にするサイクリング条件は、変性ステップ、アニーリングステップ、および重合ステップを含む。第１のステップは、９５℃で１５分の初期変性ステップである。この後に、９５℃で１秒間の短い変性ステップ、６０℃で９秒間のアニーリングステップ、および７２℃で１０秒間のエロンゲーションステップが続く。このサイクルを４５回繰り返す。酵素がすべての一本鎖ＤＮＡを伸長するのを完了することを保証するために、最後に７２℃で１０分の最終エロンゲーションステップもある。

【0088】

増幅の各サイクルの後、内部対照ポリヌクレオチド産物の量を、内部対照ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）プローブのフルオロフォアによって放出される蛍光強度の強度（相対蛍光単位での）によって測定する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]