特許 6707576 側鎖結合を介する固相ペプチド合成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6707576

(24)【登録日】2020年5月22日

(45)【発行日】2020年6月10日

(54)【発明の名称】側鎖結合を介する固相ペプチド合成

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20200601BHJP

   C07K 1/04 20060101ALI20200601BHJP

   C07K 1/06 20060101ALI20200601BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   C07K1/04

   C07K1/06

【請求項の数】4

【外国語出願】

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2018-71644(P2018-71644)

(22)【出願日】2018年4月3日

(62)【分割の表示】特願2013-32164(P2013-32164)の分割

【原出願日】2013年2月21日

(65)【公開番号】特開2018-138556(P2018-138556A)

(43)【公開日】2018年9月6日

【審査請求日】2018年5月2日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 刊行物名：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌｕｍｅ １８、第Ｓ１３４頁、発行年月日：２０１２年８月２１日、発行者名：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／１０．１００２／（ＩＳＳＮ）１０９９−１３８７、に発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 集会名：３２ｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、開催場所：ギリシャ国アテネ ザ メガロン アテネ インターナショナル カンファレンス センター（エム．エー．アイ．シー．シー．）、開催日：２０１２年９月２日〜２０１２年９月７日、にて発表

(73)【特許権者】

【識別番号】513042676

【氏名又は名称】ケミカル アンド バイオファーマシューティカル ラボラトリーズ オブ パトラ エス．エー．

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(72)【発明者】

【氏名】クレオメニス ケー．バルロス

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５１３１９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−３０６０９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Tetrahedron Letters，２０１１年，Vol.52，p.2808-2811

【文献】 Tetrahedron Letters，２００４年，Vol.45，p.923-925

【文献】 Tetrahedron Letters，２００２年，Vol.43，p.5021-5024

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式：
E-D-2-Nal-Cys(A)-Tyr(C)-D-Trp(F)-Lys(E)-Val-Cys(A)-Thr(Resin)-NH₂
（式中：
D-は、Ｄ−アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mmt、Acm又はStBuから選択されるチオール保護基であり；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；
Ｅは、Mtt、Mmt、Trt又はBocから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂であって、トリチル型樹脂又はベンズヒドリル型樹脂である）
により表されるペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドが、ランレオチド（lanreotide）の樹脂に結合した前駆体である、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

ランレオチド（lanreotide）の製造方法において、請求項２に記載のペプチド樹脂接合体を、所望によりスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液から選択される１〜３％の酸溶液により処理し；そして
生ずるペプチドを、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される酸化剤を用いて酸化する；
ことを含んでなる方法。

【請求項4】

ランレオチド（lanreotide）の製造方法において、請求項２に記載のペプチド樹脂接合体を１〜３％の酸溶液、例えばヨウ素を含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理する、ことを含んでなる方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はペプチドの合成に関する。

【発明の概要】

【0002】

要約
ポリマーに側鎖を介して取付けられたヒドロキシアミノ酸、ヒドロキシアミノ酸アミド、ヒドロキシアミノアルコール又はヒドロキシアミノ酸を含む小ペプチドを出発樹脂として使用する固相ペプチド合成により、高純度のペプチド及びぺプタイボル（peptaibol）が得られた。

【発明を実施するための形態】

【0003】

定義及び略号
「Hya」又は「ヒドロキシルアミノ酸」は、ヒドロキシル（-OH）基を含むアミノ酸を意味する。
Ｎ−末端又はアミノ末端は、ペプチド鎖中の最初のアミノ酸である。
Ｃ−末端又はカルボキシ末端は、ペプチド鎖中の最後のアミノ酸であり、下記のように示される。

【0004】

【化1】

【0005】

「Ｐ」又は「固体支持体」又は「樹脂」は、アミノ酸又はペプチドと反応又は連結するのに適当な官能基を含む不溶性材料を意味する。当該固体支持体又は樹脂は、当業界においてよく知られている。

【0006】

「アルキル」、例えばC_1-10-アルキル又はC_1-6-アルキルは、分岐した、または分岐していない、十分に飽和した非環式炭化水素基（すなわち、二重結合又は三重結合を含まない、炭素及び水素から構成される）を意味する。幾つかの態様において、アルキルは置換されていても置換されていなくてもよい。アルキルには、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、へキシル、などが含まれるがこれらに限定されず、そして幾つかの態様においてはそれらのそれぞれは場合によっては置換されていてもよい。アルキル置換基には、C_1-3−アルコキシ、ハロゲン（F、Cl、Br又はI）、ニトロ、アミノ、-SH及び-OHが含まれるがこれらに限定されない。

【0007】

「取付け」は、不溶性支持体へのアミノ酸又はペプチド若しくはペプチド誘導体の連結（linking）を意味する。
「Hse」はホモセリンを意味し、「Hnv」はヒドロキシルノルバリンを意味する。
「SPPS」又は「固相ペプチド合成」は、本明細書に記載されているような樹脂の使用を伴うペプチドの合成を意味する。
「pNA」は４−ニトロアニリドを意味する。
「DME」はジメトキシエタンを意味する。

【0008】

「酸感受性樹脂」は、アミノ酸又はペプチドとの反応又は連結に適する官能基を含む不溶性材料又は樹脂を意味し、これらは酸性処理によりペプチドから開裂されることができる。
「酸感受性保護基」は、酸性処理により又は酸性条件下でアミノ酸又はペプチド若しくはペプチド誘導体から開裂されうる保護基を意味する。
「ペプタイボル」（Peptaibol）は、ペプチドであってそのＣ−末端位置にアミノ酸又はアミノ酸アミドではなくアミノアルコールを含むものを意味する。

【0009】

「段階的」（ステップ−バイ−ステップ；Step-by-step）は、ペプチド鎖中に含まれるアミノ酸のそれぞれが個別的に且つ逐次的に導入されるペプチド合成法を意味する。この方法は、中間精製工程を含んでも含まなくてもよい。
「保護されたペプチド」は、すべての官能基が保護基により保護されているか又はブロックされているペプチドを意味する。
「部分的に保護されたペプチド」は、少なくとも１個の官能基が保護基により保護されているか又はブロックされているペプチドを意味する。

【0010】

固相ペプチド合成は伝統的に、Ｃ−末端アミノ酸のそのα−カルボキシル官能基を介しての適当な固体支持体への取付け、及び段々に成長するペプチド鎖におけるアミノ酸残基の逐次的付加によるペプチドのアミノ末端方向へのペプチド鎖の延長により行われる。数十万の発表及び特許がこの方法及びペプチド医薬の製造へのその適用を記載している。

【0011】

Ｃ−末端カルボキシル官能基の取付けとは逆に、アミノ酸側鎖を介してのアミノ酸及びペプチドの適当な樹脂への取付け及びSPPSにおけるその応用が、非常に手短に、特に30未満の発表及び特許において記載されている。これらの発表の殆どが、Asp及びGluの側鎖カルボキシル官能基を介してのアミノ酸の取付けを記載している。

【0012】

本発明者の知識では、側鎖ヒドロキシル官能基を介してのアミノ酸の側鎖取付け及びペプチド合成における応用は限定されている：Fmoc-Hya-pNA（式A1）の側鎖取付け[A. Bernhardt, M. Drewello and M. Schutkowski, The solid-phase synthesis of side-chain-phosphorylated peptide-4-nitroanilides J. Peptide Res. 50, 1997. 143-152]及び短いニトロアニリド基質の合成のためのそれらの使用、環状ペプチド調製における応用のためのマイクロウエーブの助けによる２−クロロトリチル樹脂上でのFmoc-Hya-O‐アリルエステルの合成（式A2 [L. Rizzi, K. Cendic, N. Vaiana, S. Romeo, Alcohols immobilization onto 2-chlorotritylchloride resin under microwave irradiation, Tetrahedron Letters 52 (2011) 2808-2811 ]）、及びTyr-フェノキシ官能基のMitsunobu酸化還元アルキル化によるベンジル型の樹脂上に取付けられたFmoc-Tyr-O-メチルエステルの合成（式A3 [C. Cabrele, M. Langer and A. G. Beck-Sickinger, Amino Acid Side Chain Attachment Approach and Its Application to the Synthesis of Tyrosine-Containing Cyclic Peptides, J. Org. Chem. 1999, 64, 4353-4361]）及び短い環状ペプチドの合成のためのそれらの応用。

【0013】

本発明者の知識では、Hse及びHypの側鎖取付けは開示されていない。更に、保護されたペプチド、保護されたペプチドフラグメント並びに保護されたペプチドアミド及びぺプタイボル（peptaibol）の固相合成のための酸感受性樹脂上に側鎖取付けされたHyaの応用は報告されていない。

【0014】

【化2】

【0015】

固相ペプチド合成
１つの態様において、医薬的に興味あるペプチド酸、ペプチドアミド、及びペプタイボル（peptaibol）の改良された合成が提供される。

【0016】

【化3】

【0017】

本発明の１つの観点において、ヒドロキシアミノ酸をそのアミノ酸側鎖を介して、又は配列中にヒドロキシアミノ酸を含む小ペプチドをトリチル又はベンズヒドリル型の樹脂上に取付けて式Ｉ〜IVのアミノ酸−樹脂接合体又はペプチド樹脂接合体を生じさせることにより、ペプチドが高い収率及び純度で非常に効果的に製造された。ここで、式Ｉ〜IV中、Ｐは、固相ペプチド合成において使用される支持体から選択され、Pr¹は、Ｈ又はFmoc、Boc、Trt、Dde及びAllocから選択されるアミノ保護基であり、Pr²は、Trt、Clt、Mmt、Mtt、Dpm及びtBuから選択される酸感受性ヒドロキシ保護基であり、Hyaは、D- 若しくは L-Ser、Thr、Tyr、Hse、Hyp、Hnvなどから選択されるヒドロキシアミノ酸であり、そしてＡは、OH、OTrt、OClt、OMmt、OMtt、ODpm及びOtBuから選択される酸感受性アルコキシ基、NH₂、NHR¹、NR¹R²（ここで、R¹及びR²は独立に、アルキル基又は配列中に１〜10個のアミノ酸を含む保護された若しくは半保護されたペプチドである。

【0018】

他の態様において、本発明者は、天然のヒドロキシアミノ酸に由来するアミノアルコールから選択される式III〜VI（式中、Ｐ、Ｘ、Ｖ、Ｚ及びPr¹は上に定義したとおりであり、R³及びR⁴はアルキル、アリール又はアラルキル基であり、そしてPr²はトリチル、ベンズヒドリル又はベンジル型の酸感受性保護基である）の樹脂結合アミノアルコールを用いる固相合成によりペプタイボル（peptraibol）例えばオクトレオチド（octreotide）が得られたことを開示する。

【0019】

【化4】

【0020】

更に、本件発明者は、式Ｉ〜IVの樹脂の応用により調製されたペプチドは、ヒドロキシアミノ酸の側鎖ヒドロキシル官能基を介してトリチル型の樹脂上に取付けられる場合、穏和な酸性処理により当該樹脂から開裂されることができ、そしてこの場合tBu及びベンジル型の側鎖保護基はそのまま残ることを最初に開示する。１つの観点において、樹脂からの開裂は、１〜３％の酸溶液、例えばTFA、希釈HCl溶液による処理により、場合によっては溶剤中スカベンジャーを添加して生じさせる。１つの観点において、開裂は、溶剤、例えばDCM又はアセトン中で行うことができる。そのような部分的に保護されたペプチドは、溶液中又は固相上でのフラグメント縮合による更に長いペプチドの合成において有用であることが見出された。本発明の方法は、この明細書に記載される樹脂の応用の多様性を拡張し、そしてまた、得られる医薬ペプチド純度に有意な改良をもたらし、そして同時にそれらの合成のコストを実質的に低下させる。

【0021】

医薬的に興味ある若干のペプチドが、この明細書に記載される新規な方法の代表として、溶液中及び固相上での段階的（ステップ−バイ−ステップ）方法又はフラグメント縮合、あるいはそれらの組合せにより製造された。下記の例は代表例であり、他のペプチドへの応用はなんら限定されない。

【0022】

ランレオチド（Lanreotide）:
１つの態様において、ランレオチドは、下記に示すように、樹脂に結合したThr-アミドを用いた固相合成によって製造された。

【0023】

【化5】

【0024】

ヒトインスリンＢ鎖：
任意には、ヒトインスリンＢ鎖は、SPPSにより合成された。１つの観点において、合成は、４−メトキシベンズヒドリル樹脂を用いて、実施例に記載されるような樹脂に結合したThr-t-ブチルから始まる。任意には、合成はまた、固相上で１−８部分保護されたBoc-Phe-Val-Asn(Trt)-Gln(Trt)-His(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH フラグメントを樹脂に結合した９−30フラグメントとの縮合により行うことができ、或いは部分的に保護された９−30フラグメントの樹脂からの開裂の後、１−８フラグメント及び９−30フラグメントの溶液中での縮合により行うことができる。

【0025】

【化6】

【0026】

サケカルシトニン:
任意には、サケカルシトニンは、樹脂に結合したFmoc-Thr-Pro-NH₂からの合成を開始することにより製造することができる。次に、ペプチド鎖はFmoc-アミノ酸を用いて延長される。

【0027】

【化7】

【0028】

任意には、樹脂に結合したサケカルシトニンは、２〜４フラグメントを用いて、上に示すように樹脂上での、又は下に示すように溶液中での、フラグメント縮合により製造される。

【0029】

【化8】

【0030】

オクトレオチド（Octreotide）:
他の態様において、オクトレオチドは、下に示すようにスレオニノール（threoninol ）の側鎖を介しての４−メトキシベンズヒドリル樹脂へのFmoc-threoninol-OTrt の取付け、それに続くFmoc-アミノ酸を用いてのオクトレオチド鎖の集合、及び最後に逐次的又は同時的Cys−酸化を用いる樹脂からのオクトレオチドの開裂により効率的に合成された。Fmoc-スレオニノール-OTrtは、適当な樹脂上のスレオニノールのヒドロキシメチル基を介して樹脂上に取付けられ得るFmoc-Thr(tBu)-オールに比べて非常に製造しやすい。この理由は、Fmoc-Thr(tBu)-オールの製造のための出発材料として使用されるH-Thr(OtBu)-オールが、樹脂上への側鎖を介してのスレオニノールの取付けに使用されるFmoc-スレオニノール-OTrtに比べて非常に製造しにくいからである。

【0031】

【化9】

【0032】

エキセナチド（Exenatide）:
他の例において、Fmoc-Ser-NH₂は、その側鎖を介してトリチル樹脂に取付けられ、そしてエキセナチドの合成のために使用される。この合成は、下記のように、穏和な酸性処理による樹脂からの、部分的の保護されたエキセナチドフラグメントの開裂の後に溶液中で又は固相上で、段階的（ステップ−バイ−ステップ）態様により、又はフラグメント縮合により、実施することができる。この方法によれば、多くのPro及びGly残基を含むペプチドの合成の間に典型的に生成される殆どの不純物が完全に回避され、そして高純度のペプチドが得られる。この方法はまた、当業界において知られている他の方法を用いるペプチドアミドリンカーからのペプチドの開裂から生ずる不純物の完全な回避を可能にする。上記の当業界で知られている方法は、ペプチドの収率及び純度を有意に低下させる。

【0033】

【化10】

【0034】

１つの観点において、エキセナチドは、部分的に保護されたペプチド12−39を樹脂から開裂させ、そしてそれを、下に示すように溶液中で、部分的に保護された１−11フラグメントと縮合させることにより製造することができる。或いは、フラグメント１−13及びフラグメント１４−39を用いて縮合を行い、保護されたエキセナチドを得ることができる。

【0035】

【化11】

【0036】

プラムリンチド（Pramlintide）:
この方法はまた、アミリン（amylin）ペプチドの製造においても非常に効果的に使用される。１つの観点において、アミリン又はその誘導体、例えばプラムリンチドのＣ−末端Ser、Thr又はTyr残基の１つを用いて側鎖の取付けを行うことができる。合成は、溶液中又は固相上での段階的（ステップ−バイ−ステップ）態様により又はフラグメント縮合により行うことができる。シュードプロリン（pseudoprolines）(Ψ, Mutter et al, Peptide Res. (1995 8, 145) を参照のこと）を成長中のペプチド鎖に導入することにより、合成が加速され、そして得られるペプチドの純度が改良される。

【0037】

【化12】

【0038】

或いは、プラムリンチドの合成は、プラムリンチドの純度及び収率に関して同様の成功をもって、液相中で行うことができる。１つの態様において、Fmoc-Tyr-NH₂の側鎖を介して樹脂の結合した保護されたペプチドは、tBu−型の側鎖保護基をそのまま残して、穏和な酸性処理を用いてペプチド鎖の種々の位置で、樹脂から定量的に開裂させることができる。１つの例において、下に示すように、２−クロロトリチル樹脂上で調製された部分的に保護された１−10フラグメントが、部分的に保護された11−37フラグメントアミドと、段階的（ステップ−バイ−ステップ）態様で成功裏に縮合された。

【0039】

プラムリンチド（Pramlintide）:

【化13】

【0040】

テトラコサクチド（Tetracosactide）（ACTH 1-24）:
他の例において、下に示すように、ACTH 1-24が、樹脂に結合したFmoc-Tyr-Pro-OtBuから出発して段階的（ステップ−バイ−ステップ）方法により、或いは部分的に保護された１−10フラグメントを溶液中で11−24フラグメントと、又は樹脂の結合した11−24フラグメントと縮合させることにより効果的に調製された。

【0041】

【化14】

【0042】

ビバリルジン（Bivalirudin）:
他の例において、下に示すように、ビバリルジンが、樹脂に結合したFmoc-Tyr-Leu-OtBuから出発して、Fmoc-アミノ酸により段階的（ステップ−バイ−ステップ）態様でペプチド鎖を延長し、最後に脱保護し、そしてペプチドを樹脂から開裂させることにより、高収量で且つ高純度で製造された。

【0043】

或いは、ビバリルジンは、保護されたフラグメントを樹脂上で縮合させることにより、或いは４〜15アミノ酸残基を含む部分的に保護されたペプチドを樹脂から開裂させ、そしてそれを５〜16アミノ酸を含むビバリルジンフラグメントと溶液中で縮合させることにより得られた。部分的に保護された１−10ビバリルジンフラグメントと、樹脂に結合した部分的に保護された11−20ビバリルジンフラグメントとの、樹脂上でのフラグメント縮合によるビバリルジンの合成を下に記載する。

【0044】

【化15】

【実施例】

【0045】

実施例１. Fmoc-Thr(4-メトキシベンズヒドリルポリスチリル)-OtBuの調製

【化16】

【0046】

H-Thr-OtBuとFmoc-OSuとの常法に従う反応により調製した30 mmolのFmoc-Thr-OtBuを、20 g（30 mmol）の４−メトキシベンズヒドリルポリスチレン樹脂（CBL-Patrasの製品）及び60 mmolのDIPEAと、250 mlのTHF中で10時間、室温にて反応させた。次に、この混合物に60 mmolのメタノールを添加し、そしてこの混合物を更に４時間振盪した。樹脂を濾過し、そしてTHF/MeOH/DIPEA (85:10:5)により３回、DMFにより６回、IPAにより４回、DEEにより３回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.95 mmol/g 樹脂の負荷をもって、29 gの樹脂結合Fmoc-Thr-OtBuを得た。

【0047】

実施例２. Fmoc-Thr(4-メトキシベンズヒドリルポリスチリル)-O-Clt

【化17】

【0048】

H-Thr-OMeとTrt-Cl/Me₃SiCl及びDIPEAとの常法に従う反応により調製した30 mmolのTrt-Thr-OMeを、20 g（30 mmol）の４−メトキシ４’ポリスチリルベンズヒドリルブロミド樹脂（CBL-Patrasの製品）及び60 mmolのDIPEAと、250 mlのTHF中で10時間、室温にて反応させた。次に、この混合物に60 mmolのメタノールを添加し、そしてこの混合物を更に４時間振盪した。樹脂を濾過し、そしてTHF/MeOH/DIPEA (85:10:5)により３回、DCMにより３回、DCM中1% TFAにより３回、THFにより４回、THF/水/メタノール（70:15:15）中1N-LiOHにより３回、THF/水（75:25）により３回、DMFにより４回洗浄し、そして次に室温にて２時間、60 mmolのFmoc-OSu及び30 mmolのDIPEAと反応させ、DMFにより３回、DCMにより３回洗浄し、そして次に、室温にて３時間50 mmolのTrt-Cl及び50 mmolのDIPEAと反応させ、DMFにより４回、DEEにより６回洗浄し、そして一定重量に真空乾燥した。0.78 mmol/g樹脂の負荷をもって、32.3 gの樹脂結合Fmoc-Thr-OtBuを得た。

【0049】

実施例３. Fmoc-Throl(4-メトキシベンズヒドリルポリスチリル)-O-Clt
Ａ）Fmoc-スレオニノールから出発

【化18】

【0050】

350 mlのDCM中50 mmolの市販のFmoc-スレオニノール（CBL-Patras）を、55 mmolのモノマーClt-Cl及び55 mmolのDIPEAと、室温にて４時間反応させた。得られた混合物を通常通り水で抽出し、そしてDCM相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥しそして濾過した。生じた溶液に、30 gの４−メトキシ,４−ポリスチリルベンズヒドリルブロミド（CBL-Patras）及び50 mmolのDIPEAを添加し、そして生ずる混合物を室温にて４時間撹拌した。樹脂を濾過し、そしてDMFにより６回、IPAにより４回及びDEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.82 mmol/gの負荷をもって、38.4 gの樹脂結合Fmoc-スレオニノールを得た。

【0051】

Ｂ）Trt-Thr(Resin)-OMeから出発

【化19】

【0052】

常法に従ってH-Thr-OMeとTrt-Cl/Me₃SiCl及びDIPEAとの反応により調製された30 mmolのTrt-Thr-OMeを、20 g (30 mmolの４−メトキシ４’−ポリスチリルベンズヒドリルブロミド樹脂（CBL-Patrasの製品）及び60 mmolのDIPEAと、250 mlのTHF中で、室温にて10時間反応させた。次に、この混合物に60 mmolのメタノールを添加し、そして混合物を更に４時間撹拌した。樹脂を濾過し、そしてTHF/MeOH/DIPEA (85:10:5)により３回、THFにより５回洗浄し、そしてTHF中30 mmolのLiBH₄と反応させた。

【0053】

次に、樹脂を濾過し、そしてTHFにより６回、DCMにより４回、DCM中１%TFAにより６回、DMF/DIPEA（97:3）により３回洗浄し、そして次に室温にて２時間、60 mmolのFmoc-OSu及び30 mmolのDIPEAと反応させ、DMFにより３回、DCMにより３回洗浄し、そして次に室温にて３時間、50 mmolのClt-Cl及び50 mmol DIPEAと反応させ、DMFにより４回、IPAにより６回及びDEEにより６回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.74 mmol/g樹脂の負荷をもって、34.7 gの樹脂結合Fmoc-Throl-O-Cltを得た。

【0054】

実施例４. Fmoc-Ser(トリチル樹脂)-NH₂
当業界において知られている標準的手順により調製された50 mmolのFmoc-Ser-NH₂を、0.5リットルのDCMに溶解した。この懸濁液に、30 gのトリチルクロリド樹脂（36 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて６時間撹拌した。次々と25 mlのメタノール及び30 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を、更に室温にて２時間撹拌した。次に、樹脂を濾過し、そしてDCM/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.71 mmol/gの負荷をもって、41.1 gのFmoc-Ser-NH₂-含有樹脂を得た。

【0055】

実施例５. Fmoc-Tyr(2-クロロトリチル樹脂)-NH₂
上記の手順に従って、50 mmolのFmoc-Tyr-NH₂及び30 gの2-CTCクロリド樹脂から、0.81 g Tyr/g樹脂の負荷をもって、43.7 gの樹脂を得た。

【0056】

実施例６. Fmoc-Hyp(4-メチルベンズヒドリル樹脂)-NH₂
上記の手順に従って、50 mmolのFmoc-Hyp-NH₂及び30 gの４−メチルベンズヒドリルブロミド樹脂から、0.49 g Hyp/g樹脂の負荷をもって、39.8 gの樹脂を得た。

【0057】

実施例７. Fmoc-Thr(4-メトキシベンズヒドリル樹脂)-Pro-NH₂
当業界において知られている標準的手順に従ってFmoc-Thr(tBu)-OHとH-Pro-NH₂とのカップリングにより調製された50 mmolのFmoc-Thr-Pro-NH₂を、0.5リットルDMEに溶解した。得られた溶液に、30 gの４−メトキシベンズヒドリルブロミド樹脂（45 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて６時間撹拌した。次に、25 mlのメタノール及び50 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて２時間撹拌した。次に樹脂を濾過し、そしてDME/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.77 mmol/gの負荷をもって、44.5 gのFmoc-Thr-Pro-NH₂含有樹脂を得た。

【0058】

実施例８. Fmoc-Tyr(2-クロロトリチル樹脂)-Pro-OtBu
当業界において知られている標準的手順に従って、50 mmolのFmoc-Tyr-Pro-OtBuを調製し、0.5リットルのDCMに溶解した。得られた溶液に、30 gの２−クロロトリチルクロリド樹脂（48 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて12時間撹拌した。次に、25 mlのメタノール及び50 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を更に２時間室温にて撹拌した。次に樹脂を濾過し、そしてDCM/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.64 mmol/gの負荷をもって、44.5 gのFmoc-Tyr-Pro-OtBu含有樹脂を得た。

【0059】

実施例９. Fmoc-Tyr(2-クロロトリチル樹脂)-Leu-OtBu
当業界において知られている標準的手順に従って調製した50 mmolのFmoc-Tyr-Leu-OtBuを、0.5リットルのTHFに溶解した。得られた溶液に、30 gの2-CTCクロリド樹脂（48 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を60℃にて12時間撹拌した。次に、25 mlのメタノール及び50 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて更に２時間撹拌した。次に樹脂を濾過し、そしてDCM/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量に真空乾燥した。0.64 mmol/gの負荷をもって、44.5 gのFmoc-Tyr-Leu-OtBu含有樹脂を得た。

【0060】

実施例10. ペプチド及び保護されたペプチドセグメントの固相合成
一般的手順
A1. 負荷された２−クロロトリチル樹脂の調製 一般的手順
２−クロロトリチルクロリド樹脂（CTC-Cl）（100 g;負荷1.6 mmol/g）（CBL-Patras）を、２Ｌのペプチド合成反応器に入れ、そして700 mLのジクロロメタン（DCM）：ジメチルホルムアミド（DMF）1:1により25℃にて30分間膨潤させる。樹脂を濾過し、そして500 mLのDCM中100 mmolのFmoc-アミノ酸及び300 mmolのジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の溶液を添加する。この混合物を25℃にて２時間窒素の下で撹拌する。

【0061】

次に、2-CTC樹脂の残っている活性部位を、10 mLのメタノール（MeOH）の添加及び１時間の反応により中和する。樹脂を濾過し、そして400 mLのDMFにより２回洗浄する。樹脂を濾過し、そしてDMF中25体積％のピペリジン500 mLにより30分間で２回洗浄する。次に樹脂を、500 mLのDMFにより４回処理する。樹脂を、500 mLのイソプロパノール（IPA）による３回の洗浄によって解膨潤する。樹脂を一定重量に乾燥する。この樹脂に、使用したアミノ酸のmmolの70〜95％が結合した。

【0062】

Ｂ． 固相合成 一般的プロトコール
パートＡ又は実施例１に記載したように、トリチル若しくはベンズヒドリル型の樹脂にエステル化された又は側鎖を介して取付けられた1.0ｇのアミノ酸又はペプチドを用いて、24℃にて固相合成を実施した。合成においては下記のプロトコールを使用した。

【0063】

B1. 樹脂の膨潤
樹脂を15 mlの反応器に入れ、そして7 mLのNMPにより２回処理し、次に濾過した。
B2. アミノ酸の活性化
アミノ酸（3.0当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（4.0当量）を秤り取り、そしてそれらの2.5体積を有するNMPに反応器中で溶解し、そして０℃に冷却した。次に、DICを添加し（3.0当量）、そしてこの混合物を15分間撹拌した。

【0064】

B3. カップリング
次に、B2で調製された溶液をB1の反応器に添加した。反応器を１体積のDCMにより１回洗浄し、そしてこの反応器に加え、これを25℃〜30℃において１〜３時間撹拌した。サンプルにおいてカイゼルテスト（Kaiser Test）を行うことにより、反応の完結を決定した。３時間後にカップリング反応が完結していない場合（カイゼルテスト陽性）、反応混合物を濾過し、そして活性化されたアミノ酸の新たな溶液を用いて再カップリングを行った。カップリングの完結の後、反応混合物を濾過し、そしてNMP（洗浄当たり５体積）により４回洗浄した。

【0065】

B4. Fmoc-基の除去
B3において得られた樹脂を濾過し、そして次に、25体積％のピペリジンを含む5 mLの溶液により30分間処理した。次にこの樹脂を５mLのNMPにより３回洗浄した。

【0066】

B5. ペプチド鎖の延長
各アミノ酸の導入の後、工程B1〜B5を、ペプチド鎖の完成まで反復した。
各個々のアミノ酸の導入のため次のFmoc-アミノ酸を使用した：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-D-Trp-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Clt)-OH、Fmoc-Val-OH、Boc-D-Cys(Trt)-OH、Boc-His(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH、Boc-D-2-Nal-OH、Boc-D-Phe-OH、Boc-Ser(tBu)-OH。

【0067】

Ｃ. Ｎ−末端にFmoc-又はBoc-基を含むペプチド又は保護されたペプチドセグメントのCTC−樹脂からの酸性開裂のための一般的方法
上記B1〜B5において記載されたようにして製造された、樹脂の結合したぺプチド又はペプチドセグメントを、5 mLのNMPにより４回、５mlのIPAにより３回そして最後に７mlのDCMにより５回洗浄することにより、すべての残留NMP又は他の塩基性成分を完全に除去した。次に、樹脂を０℃に冷却し、DCMから濾過し、そして10 mLの１〜２％TFA/DCM溶液により２回、５℃にて処理した。次にこの混合物を０℃にて20分間撹拌し、そして濾過した。次に樹脂を10 mLのDCMにより３回洗浄した。

【0068】

次に、ロ液にピリジンを添加（TFAに対して1.3当量）してTFAを中和した。次に、DCM中の開裂溶液を同体積の水と混合する。生ずる混合物を減圧下で蒸留してDCMを除去する（28℃にて350 torr）。DCMの除去後にペプチド又はペプチドセグメントが沈殿する。次に、生ずるペプチドを水で洗浄し、そして15 Torrの真空の下で30〜35℃にて乾燥する。

【0069】

実施例11. Ｎ−末端が保護されたフラグメントと樹脂に結合したＣ−末端が保護されたフラグメントとの縮合による樹脂に結合した保護されたペプチドの合成
一般的手順
DMSO/DCM（95:5）中0.15 mmol/mlのＮ−末端が保護されたペプチドフラグメントの溶液に、0.2 mmolのHOBtを添加し、そして生ずる溶液を５℃に冷却する。次に、0.14 mmolのDICを添加し、そして混合物を15℃にて20分間撹拌し、そして次に0.1 mmolの樹脂結合Ｃ−末端フラグメントに加え、そして室温にて更に６時間撹拌する。縮合反応の完結をカイゼルテストによりチェックする。カイゼルテストが青色のままである場合、縮合を完結させるため第２の縮合を行った。

【0070】

実施例12. Ｎ−末端が保護されたフラグメントとＣ−末端が保護されたフラグメントとの溶液中での縮合による部分的に保護されたペプチドの合成
一般的手順
DCM中0.15 mmol/mlのＮ−末端が保護されたフラグメントの溶液に、0.2 mmolのHOBtを添加し、そして生ずる溶液を５℃に冷却する。次に、0.15 mmolのEDACを添加し、そしてこの混合物を15℃にて20分間撹拌し、そして次に0.15 mmolのＣ−末端が保護されたフラグメントに添加し、そして室温にて更に２〜５時間撹拌する。縮合反応の完結をHPLCによりチェックする。不完全な縮合が観察された場合には、追加分の0.015 mmolのEDACを添加し、そして室温にて更なる時間にわたって反応を続ける。

【0071】

実施例13. 樹脂からのペプチドの同時的開裂及び脱保護
一般的方法
上記のようにして製造された1.00 gの保護された樹脂結合ペプチドを、20 mLのTFA/DTT/水（90:5:5）により５℃にて３時間及び15℃にて１時間処理する。次に、樹脂を開裂溶液により３回洗浄し、そして次に、一緒にしたロ液を真空濃縮し、そして粗ペプチドをエーテルの添加により沈澱させ、エーテルにより数回洗浄し、そしてKOH上で一定重量まで真空乾燥する。

【0072】

実施例14. ペプチドの脱保護
一般的方法
上記のようにして製造された1.00 gの保護されたペプチドを、20 mLのTFA/DTT/水（90:5:5）により、５℃にて３時間及び15℃にて１時間処理した。生ずる溶液を真空濃縮し、そして次に、脱保護されたペプチドをジイソプロピルエーテルの添加により沈澱させ、そして10 mLのジイソプロピルエーテルにより３回洗浄した。生ずる固体を、KOHの下で一定重量まで真空乾燥（25℃、15 Torr）した。

【0073】

実施例15. 粗ペプチドの精製 ペプチドの単離
一般的手順
上記のようにして得られたペプチドの溶液を真空濃縮し、そして氷水及びエーテルを添加した。有機相を分離した後、ペプチドの残った水溶液をエーテルにより更に２回抽出し、そして生ずる溶液に窒素又はヘリウムを吹き込み、濾過しそして半調製用カラム10x25 cm, Lichrospher 100, RP-18, 12ミクロン（Merck）に直接付加した；Ａ相＝アセトニトリル中１％-TFA、Ｂ相＝水中１％-TFA；又はクロマシル（Kromasil）。精製されたペプチドを含むHPLC画分を真空濃縮してできるだけ多くの汚染アセトニトリルを除去し、そして標準的凍結乾燥プログラムを用いて凍結乾燥した。

【0074】

下に記載する実施例16〜23を、上記の手順を用いて実施して、下記にリストされた化合物を調製した。
実施例16. ランレオチド（Lanreotide）
実施例17. インスリンＢ−鎖
実施例18. サケカルシトニン
実施例19. オクトレオチド（Octreotide）
実施例20. エキセナチド（Exenatide）
実施例21. プラムリンチド（Pramlintide）
実施例22. テトラコサクチド（Tetracosactide）（ACTH 1-24）
実施例23. ビバリルジン（Bivalirudin）

本件明細書の開示の概要
〔項１〕
下記式Ｉ又はII：

【化20】

（式中、Hyaは、ヒドロキシアミノ酸の残基であり；
Pr¹は、Ｈ又は樹脂に対して及び他の保護基に対してオルソゴナル（orthogonal）アミノ保護基であり；
Ａは、ヒドロキシル基、又はtBu、Trt及びCltから選択される酸感受性ヒドロキシル保護基、又はNR¹R²（式中、R¹及びR²はＨ又はC_1-10アルキルである）、或いは０〜30個のアミノ酸を含むペプチドエステル、ペプチドアミド又はペプタイボルであり；
Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＶは、それぞれ独立の、オルト、メタ又はパラ位の置換基であり、そしてＨ、Cl、Ｆ、C_1-10アルキル又はC_1-10アルコキシから選択され；そして
Ｐは、ペプチドの固相合成のために適当な不溶性支持体又は不溶性リンカー−樹脂接合体である）
により表される樹脂接合体。
〔項２〕
下記式III〜VI：

【化21】

（式中、Pr¹は、Ｈ、又は樹脂に対して及び他の保護基に対してオルソゴナル（orthogonal）アミノ保護基であり；
Pr²は、Ｈ、又は樹脂に対してオルソゴナル（orthogonal）ヒドロキシル保護基であり；
R³及びR⁴は、それぞれ独立に、Ｈ又はC_1-10アルキルであり；
Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＶは、それぞれ独立の、オルト、メタ又はパラ位の置換基であり、そしてＨ、Cl、Ｆ、C_1-10アルキル又はC_1-10アルコキシから選択され；そして
Ｐは、ペプチドの固相合成のために適当な不溶性支持体又は不溶性リンカー−樹脂結合体である）
により表される樹脂接合体。
〔項３〕
式Ｉ〜VIの樹脂接合体の製造方法において、
ヒドロキシル含有アミノ酸若しくはアミノアルコール又はペプチド誘導体であって、含まれるヒドロキシルアミノ酸若しくは含まれるアミノアルコールの側鎖の少なくとも１つにおいて保護されていないものを調製し、或いはヒドロキシルアミノ酸若しくはヒドロキシルアミノアルコール又はペプチド誘導体をヒドロキシルアミノ酸若しくはヒドロキシルアミノアルコールの側鎖において選択的に脱保護し、そして次に、それを樹脂ハライドとの反応により適当な樹脂に取付け、ここで当該樹脂はトリチル型樹脂及びリンカー、又はベンズヒドリル型樹脂、又はベンジル型樹脂の群から選択され；そして
未反応の樹脂ハライドをマスクするためにアルコール又はチオアルコールを添加する；
工程を含む方法。
〔項４〕
モノアルキル化されたFmoc−アミノジアルコールの製造方法において、Fmoc−ジアミノアルコールとアルキルハライドとを、塩基、例えばtert−アミン塩基の存在下で、有機溶媒、例えばジクロロメタン中で反応させることを含んでなり、この前記アルキルがトリチル、４−メチルトリチル、４−メトキシトリチル及び２−クロロトリチルから選択される、当該製造方法。
〔項５〕
生物学的に活性な遊離の又は部分的に保護されたペプチド、環状ペプチド又はペプタイボル（peptaibol）の固相合成方法であり、固相ペプチド合成において、項１又は２に記載の樹脂接合体を官能化された樹脂として使用することを含む方法。
〔項６〕
下記式：
E-D-2-Nal-Cys(A)-Tyr(C)-D-Trp(F)-Lys(E)-Val-Cys(A)-Thr(Resin)-NH₂
（式中：
D-は、Ｄ−アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mmt、Acm又はStBuから選択されるチオール保護基であり；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；
Ｅは、Mtt、Mmt、Trt又はBocから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。
〔項７〕
前記ペプチドが、樹脂に結合したランレオチド（lanreotide）である、項６に記載のペプチド。
〔項８〕
ランレオチド（lanreotide）の製造方法において、項７に記載のペプチド樹脂接合体を、所望によりスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液から選択される穏和な酸により処理し；そして
生ずるペプチドを、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される酸化剤を用いて酸化する；
ことを含んでなる方法。
〔項９〕
ランレオチド（lanreotide）の製造方法において、項７に記載のペプチド樹脂接合体を穏和な酸、例えばヨウ素を含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理する、ことを含んでなる方法。
〔項１０〕
下記式：
E-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys(B)-Gly-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(A)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(Resin)-O-C
（式中、
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド又はイミダゾール保護基であり；
Ｂは、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ−、カルボキシル−又はフェノキシ−保護基であり；
Ｄは、Pbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ、或いは固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。
〔項１１〕
前記ペプチドが、ヒトインスリンＢ−鎖である、項10に記載のペプチド。
〔項１２〕
インスリンＢ−鎖の製造方法において、項10に記載の樹脂結合ペプチドを、酸溶液、例えば所望によりスキャベンジャーを含むジクロロメタン中トリフルオロ酢酸の溶液と接触させることを含んでなる方法。
〔項１３〕
下記式：
E-Ser(C)-His(A)-Leu-Val-Glu(C)-Ala-Leu-Tyr(C)-Leu-Val-Cys(B)-Gly-Glu(C)-Arg(D)-Gly-Phe-Phe-Tyr(C)-Thr(C)-Pro-Lys(E)-Thr(Resin)-O-
（式中、
Ａは、Trt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｂは、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ−、カルボキシル−又はフェノキシ−保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。
〔項１４〕
前記ペプチドが、ヒトインスリンＢ−鎖の部分的に保護された９−30フラグメントに対応する、項13に記載のペプチド。
〔項１５〕
インスリンＢ−鎖の製造方法において、項13に記載のペプチドを、保護された１−８インスリンフラグメントBoc-Phe-Val-Asn(A)-Gln(A)-His(A)-Leu-Cys(B)-Gly-OHと縮合させることを含んでなる方法：
ここで、Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mtt及びMmtから選択される、カルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；そして
Ｂは、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基である。
〔項１６〕
下記式：
E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-Lys(E)-Leu-Ser(C)-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr(C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(Resin)-Pro-NH₂
（式中、
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル−、カルボキシ−又はフェノキシ−保護基であり；
Ｄは、Pbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表されるペプチド。
〔項１７〕
前記ペプチドがサケカルシトニンである、項16に記載のペプチド。
〔項１８〕
サケカルシトニンの製造方法において、
項16に記載のペプチドを、穏和な酸、例えば所望によりスキャベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；
得られたペプチド溶液を、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される適当な酸化剤を用いて酸化し；
ペプチドを脱保護し；
ペプチドをクロマトグラフィーにより精製し；そして
ペプチドを凍結乾燥する；
ことを含んでなる方法。
〔項１９〕
サケカルシトニンの製造方法において、
項16に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸、例えばトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；
ペプチドをヨウ素により酸化し；
ペプチドを、酸、例えば場合によってはスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸又は塩酸の溶液で処理することにより脱保護し；そして
サケカルシトニンペプチドをクロマトグラフィーにより精製し、そして凍結乾燥する；
ことを含んでなる方法。
〔項２０〕
項17に記載のペプチドの製造方法において、式：H-Lys(E)-Leu-Ser(C)-Gln(A)-Glu(C)-Leu-His(A)-Lys(E)-Leu-Gln(A)-Thr(C)-Tyr(C)-Pro-Arg(D)-Thr(C)-Asn(A)-Thr(C)-Gly-Ser(C)-Gly-Thr(Resin)-Pro-NH₂で表される、サケカルシトニンの部分的に保護された11−32フラグメントを、式：E-Cys(B)-Ser(C)-Asn(A)-Leu-Ser(C)-Thr(C)-Cys(B)-Val-Leu-Gly-OHで表される、サケカルシトニンの部分的に保護された１−10フラグメントと縮合させることを含んでなる方法：
ここで、
Ａは、それぞれ独立に、Trt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル−、カルボキシ−又はフェノキシ−保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。
〔項２１〕
下記式：

【化22】

（式中、
Ａは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt又はMmtから選択されるアミノ保護基であり；
D-は、Ｄ−アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ｂは、Trt、Mmt、Acm又はStBuから選択されるチオール保護基であり；
Ｃは、Ｈ又はBocであり；
Ｅは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される部分的に保護されたペプチド。
〔項２２〕
前記ペプチドが、樹脂に結合したオクトレオチド（octreotide）である、項21に記載のペプチド。
〔項２３〕
オクトレオチド（octreotide）の製造方法において、
項22に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸、例えば場合によってはスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；そして
得られたペプチド溶液を、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される適当な酸化剤を用いて酸化する；
ことを含んでなる方法。
〔項２４〕
オクトレオチド（octreotide）の製造方法において、
項22に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸、例えばヨウ素を含むトリフルオロ酢酸の溶液により処理し；そして
脱保護し、精製し、凍結乾燥し、そして99％より高い純度のオクトレオチドを得る、
ことを含んでなる方法。
〔項２５〕
下記式：
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Lys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH₂
（式中、
Ｘは、Leu-Ser(tBu)又はLeu-ΨSerであり；
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル−、カルボキシ−又はフェノキシ−保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；そして
Resinは、固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される部分的に保護されたペプチド。
〔項２６〕
前記ペプチドがエキセナチド（exenatide）である、項25に記載のペプチド。
〔項２７〕
下記式：
Y-Glu(C)-Glu(C)-Ala-Val-Arg(D)-Leu-Phe-Ile-Glu(C)-Trp(F)-Leu-Lys(E)-Asn(A)-Gly-Gly-Pro-Ser(C)-Ser(C)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Resin)-NH₂
（式中、
Ｙは、Ｈ、E-Glu(C)、E-Met-Glu(C)、E-Gln(A)-Met-Glu(C)又はE-Lys(E’)-Gln(A)-Met-Glu(C)であり；
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド保護基であり；
Ｅ及びＥ’は、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ−又はカルボキシル−保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、部分的に保護されたエキセナチド（exenatide）フラグメント12−39、13−39又は14−39であるペプチド。
〔項２８〕
下記式：
E-His(A)-Gly-Glu(C)-Gly-Thr(C)-Phe-Thr(C)-Ser(C)-Asp(C)-X-Y
（式中、
Ｘは、Leu-Ser(tBu)又はLeu-ΨSerであり；
Ｅは、Fmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシ−又はカルボキシル−保護基であり；
Ｙは、OZ、Lys(E)-Gln(A)-OZ、Lys(E)-Gln(A)-Met-OZ、又はLys(E)-Gln(A)-Met-Glu(C)-OZであり、ここで、Ｚは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはBt、Su、Pfp、Tcp又はPnpから選択される、カルボキシル基を親電子的に活性化する基である）
により表される部分的に保護されたペプチド、特にエキセナチド（exenatide）フラグメント１−11、１−13、１−14及び１−15。
〔項２９〕
エキセナチド（exenatide）の製造方法において、
項27に記載の１つのフラグメントを、項28に記載の１つのフラグメントと縮合させて、部分的に保護された又は樹脂に結合したエキセナチド配列を形成し、
脱保護し又は樹脂から開裂させ、そして
エキセナチドを脱保護し、クロマトグラフィー精製し、凍結乾燥する、
ことを含んでなる方法。
〔項３０〕
下記式：
E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin)-NH₂
（式中、
Ｘは、Ser(tBu)-Ser(tBu)又はSer(tBu)-ΨSerであり；
Ｙは、Ala-Thr(tBu)又はAla-ΨThrであり；
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択される、カルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり;
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択される、ヒドロキシル−、カルボキシル−又はフェノキシ−保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、部分的に保護されたペプチド。
〔項３１〕
保護されているか又は部分的に保護されているプラムリンチドである、項30に記載のペプチド。
〔項３２〕
下記式：
配列Z-Asn(A)-Phe-Leu-Val-His(A)-X-Asn(A)-Asn(A)-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(C)-Asn(A)-Val-Gly-Ser(C)-Asn(A)-Thr(C)-Tyr(Resin)-NH₂
（式中、
Ｚは、Ｈ、或いはE-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala、E-Arg(D)-Leu-Ala、E-Leu-Ala又はE-Alaであり；
Ｘは、Ser(tBu)-Ser(tBu)又はSer(tBu)-ΨSerであり；
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択されるカルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシル−、カルボキシ−又はフェノキシ−保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたペプチド、特に保護された又は部分的に保護された10−38、11−38、12−38及び14−38のプラムリンチド（pramlintide）フラグメント。
〔項３３〕
下記式：

【化23】

を含んでなる部分的に保護された及び酸化されたプラムリンチド（pramlintide）フラグメントの製造方法において、
保護されたペプチドを、酸感受性樹脂、例えば2-CTC-樹脂上で集合（assembling）し；
樹脂から保護されたペプチドを開裂させ；
樹脂に結合したペプチドを、穏和な酸、例えばジクロロメタンのごとき有機溶媒中希トリフルオロ酢酸と接触させることにより酸化する、ここで、当該溶剤は、フラグメントに対して２〜200モル過剰量のヨウ素を含む；
ことを含んでなる方法。
〔項３４〕
プラムリンチド（pramlintide）の製造方法において、項33に記載のフラグメントを、溶液中又は固相上で、請求項32若しくは請求項33に記載のフラグメントの１つ、又は次の式：E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-Leu-Ala-OZ、E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-Arg(D)-OZ、E-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-Gln(A)-OZ、若しくはE-Lys(E)-Cys(B)-Asn(A)-Thr(C)-Y-Cys(B)-Y-OZで表されるフラグメントの１つと縮合させることを含んでなる方法：
ここで、
Ｙは、それぞれ独立に、Ala-Thr(tBu)又はAla-ΨThrであり；
Ｚは、Ｈ、或いはBt、Su、Pfp、Tcp又はPnpから選択される基であり;
Ａは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択されるカルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシ−、カルボキシ−又はフェノキシ−保護基であり；
Ｄは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立に、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｂは、それぞれ独立に、Mmt、Trt、Acm又はStBuから選択されるCys保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。
〔項３５〕
下記式：
E-D-Phe-Pro-Arg(D)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(A)-Gly-Asp(C)-Phe-Glu(C)-Glu(C)-Ile-Pro-Glu(C)-Glu(C)-Tyr(Resin)-Leu-O-C
（式中、
Ａは、Ｈ、或いはMtt又はMmtから選択されるカルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシル−又はカルボキシル−保護基であり；
Ｄは、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたペプチド。
〔項３６〕
前記保護されたペプチドがビバリルジン（bivalirudin）である、項35に記載の保護されたペプチド。
〔項３７〕
下記式：
E-X-Tyr(Resin)-Leu-O-C
（式中、
Ｘは、ビバリルジン（bivalirudin）ペプチド配列であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシル−又はカルボキシル−保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたフラグメント。
〔項３８〕
ビバリルジン（bivalirudin）の製造方法において、請求項37に記載の式：E-X-Tyr(Resin)-Leu-O-Cのビバリルジンフラグメントを、溶液中で又は固相上で、式：E-D-Phe-Y-OZのビバリルジンフラグメントと縮合させてE-D-Phe-Y-X-Tyr(Resin)-Leu-O-Cを生じさせ；
脱保護、又は樹脂からの開裂と脱保護によりビバリルジンをもたらし；
ビバリルジンをクロマトグラフィーにより精製し；
凍結乾燥により99％より高純度のビバリルジンを得る、
ことを含んでなる方法。
ここで、
Ｘ及びＹは、独立に、ビバリルジンペプチド配列である；
D-は、Ｄ−アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｅは、Fmoc、Mtt、Mmt、Trt、Boc又はNpsから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。
〔項３９〕
下記式：
E-Ser(C)-Tyr(C)-Ser(C)-Met-Glu(C)-His(A)-Phe-Arg(D)-Trp(F)-Gly-Lys(E)-Pro- Val-Gly-Lys(E)-Lys(E)-Arg(D)-Arg(D)-Pro-Val-Lys(E)-Val-Tyr(Resin)-Pro-O-C
（式中、
Ａは、Ｈ、或いはTrt、Mtt又はMmtから選択されるカルボキサミド−又はイミダゾール−保護基であり；
Ｃは、それぞれ独立に、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシ−、カルボキシル−又はフェノキシ−保護基であり；
Ｄは、それぞれ独立の、Ｈ、或いはPbf又はPmcから選択されるグアニジン保護基であり；
Ｅは、それぞれ独立の、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；
Ｆは、Ｈ又はBocであり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたペプチド。
〔項４０〕
ACTH(1-24)ペプチドである、項39に記載の保護された又は部分的に保護されたペプチド。
〔項４１〕
下記式：
E-X-Tyr(Resin)-Pro-O-C
（式中、
Ｘは、ACTH(1-24)配列であり；
Ｅは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt、Mmt又はCltから選択されるアミノ保護基であり；そして
Ｃは、tBu、Trt又はCltから選択されるヒドロキシ−、カルボキシル−又はフェノキシ−保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である）
により表される、保護された又は部分的に保護されたフラグメント。
〔項４２〕
ACTH(1-24)の製造方法において、
項37に記載の式：E-X-Tyr(Resin)-Pro-O-CのACTHフラグメントを、溶液中で又は固相上で、式：E-Y-OZのACTHフラグメントと縮合させてE-Y-X-Tyr(Resin)-Pro-O-Cを生じさせ；
脱保護、又は樹脂からの開裂と脱保護によりACTH(1-24)をもたらし；
ACTH(1-24)をクロマトグラフィーにより精製し；
凍結乾燥により99％より高純度のACTH(1-24)を得る、
ことを含んでなる方法：
ここで、
Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、ACTH配列であり；
Ｃは、Clt、Trt又はtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；
Ｅは、Fmoc, Mtt、Mmt、Trt、Boc又はNpsから選択されるアミノ保護基であり；そして
Resinは、Ｈ又は固相ペプチド合成のために適当な酸感受性樹脂である。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]