特許 6707773 細胞刺激装置、細胞刺激方法、培養生成物の製造方法、単離細胞の製造方法及び細胞増殖方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6707773

(24)【登録日】2020年5月25日

(45)【発行日】2020年6月10日

(54)【発明の名称】細胞刺激装置、細胞刺激方法、培養生成物の製造方法、単離細胞の製造方法及び細胞増殖方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/42 20060101AFI20200601BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20200601BHJP

   C12N 5/00 20060101ALI20200601BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/42

   C12M3/00 A

   C12N5/00

【請求項の数】20

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2019-137058(P2019-137058)

(22)【出願日】2019年7月25日

(65)【公開番号】特開2020-22443(P2020-22443A)

(43)【公開日】2020年2月13日

【審査請求日】2020年3月11日

(31)【優先権主張番号】特願2018-139593(P2018-139593)

(32)【優先日】2018年7月25日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】591101490

【氏名又は名称】エイブル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100076428

【弁理士】

【氏名又は名称】大塚 康徳

(74)【代理人】

【識別番号】100115071

【弁理士】

【氏名又は名称】大塚 康弘

(74)【代理人】

【識別番号】100188857

【弁理士】

【氏名又は名称】木下 智文

(74)【代理人】

【識別番号】100168284

【弁理士】

【氏名又は名称】菅原 英夫

(72)【発明者】

【氏名】小山 純弘

(72)【発明者】

【氏名】田村 泰之

(72)【発明者】

【氏名】石川 陽一

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０５２７１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−６５９６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平５−１３７５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１７／７５２９５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／４２

Ｃ１２Ｍ ３／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

培養基材に接着した接着性の細胞を、前記細胞への刺激を介して前記培養基材から剥離させる細胞刺激装置であって、
細胞と前記細胞を浸す溶液とを挟んで対向する第１電極及び第２電極の間に交流電場を印加可能な印加手段を備え、
前記第１電極及び前記第２電極の少なくとも一方は、前記細胞及び前記溶液と非接触であり、
前記細胞及び前記溶液は容器内に収納されており、
前記第１電極及び前記第２電極は、前記容器の外側に配置されることを特徴とする細胞刺激装置。

【請求項2】

前記第１電極及び前記第２電極は平行平板電極であることを特徴とする請求項１に記載の細胞刺激装置。

【請求項3】

前記第１電極及び前記第２電極が、前記細胞を上下方向から挟んで配置されることを特徴とする請求項２に記載の細胞刺激装置。

【請求項4】

前記第１電極及び前記第２電極が、前記細胞を横方向から挟んで配置されることを特徴とする請求項２に記載の細胞刺激装置。

【請求項5】

前記交流電場の周波数を、０．５ＭＨｚ〜１０００ＭＨｚとすることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の細胞刺激装置。

【請求項6】

前記交流電場の強度を、±０．３Ｖ／ｍ以上とすることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の細胞刺激装置。

【請求項7】

前記第１電極及び前記第２電極は、複数段に積層された前記容器を挟んで対向するように配置されることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の細胞刺激装置。

【請求項8】

前記第１電極及び前記第２電極は、並列に配置された複数の前記容器を挟んで対向するように配置されることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の細胞刺激装置。

【請求項9】

前記容器を振盪させる振盪手段をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の細胞刺激装置。

【請求項10】

前記振盪手段は、前記交流電場を印加しながら、前記容器を振盪させることを特徴とする請求項９に記載の細胞刺激装置。

【請求項11】

前記振盪手段は、前記交流電場を印加した後に、前記容器を振盪させることを特徴とする請求項９に記載の細胞刺激装置。

【請求項12】

前記第１電極及び前記第２電極を囲むシールド手段をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１項に記載の細胞刺激装置。

【請求項13】

前記第１電極及び前記第２電極の間の電圧を計測する計測手段をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至１２の何れか１項に記載の細胞刺激装置。

【請求項14】

前記印加手段は、前記計測手段の計測値に基づいて、出力を調整するように構成されていることを特徴とする請求項１３に記載の細胞刺激装置。

【請求項15】

前記培養基材は平板状の培養基材であることを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１項に記載の細胞刺激装置。

【請求項16】

培養基材に接着した接着性の細胞を、前記細胞への刺激を介して前記培養基材から剥離させる細胞刺激装置であって、
細胞と前記細胞を浸す溶液とを挟んで対向する第１電極及び第２電極の間に交流電場を印加可能な印加手段を備え、
前記第１電極及び前記第２電極の少なくとも一方は、前記細胞及び前記溶液と非接触であり、
前記培養基材はマイクロキャリアであることを特徴とする細胞刺激装置。

【請求項17】

培養基材に接着した接着性の細胞を、前記細胞への刺激を介して前記培養基材から剥離させる細胞刺激方法であって、
第１電極と、前記第１電極と対向する第２電極との間に細胞及び前記細胞を浸す溶液を配置する工程と、
前記第１電極と前記第２電極との間に交流電場を印加する工程と、を有し、
前記第１電極と前記第２電極の少なくとも一方は、前記細胞及び前記溶液と非接触であり、
前記細胞及び前記溶液は容器内に収納されており、
前記第１電極及び前記第２電極は、前記容器の外側に配置されることを特徴とする細胞刺激方法。

【請求項18】

請求項１７に記載の細胞刺激方法を含む培養生成物の製造方法。

【請求項19】

第１電極と、前記第１電極と対向する第２電極との間に、培養基材に接着した接着性の細胞及び前記細胞を浸す溶液を配置する工程と、
前記培養基材から前記細胞が剥離して単離するように、前記第１電極と前記第２電極との間に交流電場を印加する工程と、を有し、
前記第１電極と前記第２電極の少なくとも一方は、前記細胞及び前記溶液と非接触であり、
前記細胞及び前記溶液は容器内に収納されており、
前記第１電極及び前記第２電極は、前記容器の外側に配置されることを特徴とする単離細胞の製造方法。

【請求項20】

第１電極と、前記第１電極と対向する第２電極との間に、培養基材に接着した接着性の細胞及び前記細胞を浸す溶液を配置する工程と、
前記培養基材から前記細胞が剥離して単離するように、前記第１電極と前記第２電極との間に交流電場を印加する工程と、
前記培養基材から剥離した単離細胞を培養して増殖させる工程と、を有し、
前記第１電極と前記第２電極の少なくとも一方は、前記細胞及び前記溶液と非接触であり、
前記細胞及び前記溶液は容器内に収納されており、
前記第１電極及び前記第２電極は、前記容器の外側に配置されることを特徴とする細胞増殖方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞刺激装置、細胞刺激方法、培養生成物の製造方法、単離細胞の製造方法及び細胞増殖方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

特許文献１は、３電極培養系を利用して、電極に付着した細胞を剥離する技術を開示している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許５５１５０９４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、特許文献１に記載の技術では、３電極の培養系を利用し、かつ、細胞を電極上で培養する必要があることから、構成が複雑化するという課題がある。

【0005】

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、簡易な構成で容易に細胞を刺激することが可能な技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記の目的を達成する本発明に係る細胞刺激装置は、
培養基材に接着した接着性の細胞を、前記細胞への刺激を介して前記培養基材から剥離させる細胞刺激装置であって、
細胞と前記細胞を浸す溶液とを挟んで対向する第１電極及び第２電極の間に交流電場を印加可能な印加手段を備え、
前記第１電極及び前記第２電極の少なくとも一方は、前記細胞及び前記溶液と非接触であり、
前記細胞及び前記溶液は容器内に収納されており、
前記第１電極及び前記第２電極は、前記容器の外側に配置される。

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、簡易な構成で容易に細胞を刺激することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】水の誘電損失の周波数特性を示す図である。

【図2】本発明の一実施形態に係る細胞刺激装置の構成例を示す図である。

【図3】（ａ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞についての時間経過に応じた細胞の剥離の様子を示す図であり、（ｂ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞についての細胞剥離率の測定結果を示す図である。

【図4】（ａ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞についての電界強度に応じた細胞剥離率及び生存率の測定結果を示す図であり、（ｂ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞についての周波数に応じた細胞剥離率及び生存率の測定結果を示す図である。

【図5】交流電場とトリプシン処理による細胞継代後の増殖曲線の比較結果を示す図である。

【図6】（ａ）ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞についての時間経過に応じた細胞の剥離の様子を示す図であり、（ｂ）ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞についての電界強度に応じた細胞剥離率及び生存率の測定結果を示す図であり、（ｃ）ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞についての周波数に応じた細胞剥離率及び生存率の測定結果を示す図である。

【図7】（ａ）重ねたカルチャーフラスコ内のＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する上下方向からの交流電場の印加による、時間経過に応じた細胞の剥離の様子を示す図であり、（ｂ）重ねたカルチャーフラスコ内のＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する側方（横方向）からの交流電場の印加による、時間経過に応じた細胞の剥離の様子を示す図であり、（ｃ）各条件下での細胞剥離率及び生存率の測定結果を示す図である。

【図8】（ａ）カルシウム含有ＰＢＳ（＋）を用いた場合の時間経過に応じた細胞の剥離の様子を示す図であり、（ｂ）各条件下での細胞剥離率及び生存率の測定結果を示す図である。

【図9】本発明の一実施形態に係る細胞刺激装置の構成例を示す図である。

【図10】（ａ）ラミニンコートが施された電極上のＣＨＯ−Ｋ１細胞についての時間経過に応じた細胞の剥離の様子を示す図であり、（ｂ）ラミニンコートが施された電極上のＣＨＯ−Ｋ１細胞についての細胞剥離率を示す図であり、（ｃ）ラミニンコートが施された電極上のＣＨＯ−Ｋ１細胞についての生存率を示す図である。

【図11】（ａ）及び（ｂ）ビトロネクチンコートが施されたカルチャーフラスコ上のＣＨＯ−Ｋ１細胞についての時間経過に応じた細胞の剥離の様子を示す図であり、（ｃ）各条件下での細胞剥離率及び生存率の測定結果を示す図である。

【図12】（ａ）交流電場を印加していない場合のｉＰＳ細胞についての細胞剥離の様子を示す図であり、（ｂ）交流電場を印加した場合のｉＰＳ細胞についての細胞剥離の様子を示す図である。

【図13】（ａ）比較のためのｃｏｎｔｒｏｌについての時間経過に応じた細胞増殖の様子を示す図であり、（ｂ）交流電場を印加した場合の細胞増殖の様子を示す図であり、（ｃ）ｃｏｎｔｒｏｌ及び交流電場印加時のそれぞれの時間経過に応じた細胞密度の測定結果を示す図である。

【図14】交流電場の印加の有無による時間経過に伴う細胞密度の値の変化を示す図である。

【図15】（ａ）マイクロキャリアビーズ上で増殖された細胞の様子を示す図であり、（ｂ）各種条件下での細胞数の測定結果を示す図であり、（ｃ）各種条件下での生存率の測定結果を示す図である。

【図16】本発明の一実施形態に係る細胞刺激装置の構成例を示す図である。

【図17】（ａ）及び（ｂ）時間経過に伴う細胞剥離の様子を示す図であり、（ｃ）細胞剥離率及び生存率の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、図面を参照しながら実施形態を説明する。なお、以下の実施形態において示す構成は一例に過ぎず、本発明はこれらの構成に限定されるものではない。

【0010】

本発明の実施形態に係る細胞刺激装置は、細胞に刺激を与えて、細胞の挙動や性質を変化させる装置として構成される。以下、細胞刺激装置の概略について説明する。

【0011】

（細胞の種類）
細胞刺激装置で刺激を与えることが可能な細胞は限定されるものではなく、種々の細胞に適用することができ、例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、微生物、細菌等が挙げられる。動物由来の細胞として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が挙げられるが、特に限定されるものではない。あるいは、種々の幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞など）、株化細胞や腫瘍細胞に適用することも可能である。

【0012】

（細胞の状態）
細胞刺激装置で刺激を与える細胞の状態は、特に限定されるものではない。

【0013】

細胞刺激装置は、例えば、培養基材に接着した状態の細胞に刺激を与えるように構成することができる。培養基材は、平板状のものや、いわゆるマイクロキャリアと呼ばれる球状や粒状のもの、ローラーボトルと呼ばれる円筒状のものを例示することができる。平板状の培養基材としては、培養用途に一般的に利用される部材（いわゆるカルチャーフラスコやシャーレ、スタックプレート）の培養面であってもよい。あるいは、平板状の培養基材として、金属製の平板や、ガラス面にＩＴＯ電極が形成された導電性の部材を適用することも可能である。なお、培養基材の表面は、細胞を培養するための種々の処理（表面粗さを調整するエッチング処理や、コーティング処理）が行われていてもよい。

【0014】

ただしこれとは別に、細胞刺激装置は、培養基材から単離された状態や、細胞同士が凝集して凝集塊を構成している状態、組織の状態や生体の状態、種子の状態、発芽後の植物の状態の細胞に刺激を与えるように構成することも可能である。

【0015】

細胞刺激装置は、溶液に浸された状態（組織や生体として細胞が体液に浸されている状態や、細胞が生体から取り出されて溶液に浸された状態を含む）の細胞に刺激を与えるように構成される。例えば細胞は、溶液とともにカルチャーフラスコやシャーレなどの容器に保持された状態で、刺激付与の処理がなされてもよい。溶液の種類は特に限定されるものではないが、細胞種類や刺激の目的に応じて、種々のものを適用することができる。例えば溶液として、血清培地などの培養液を利用してもよく、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳ（−）を利用してもよい。また、溶液として、目的に応じた添加物を含む液体を利用することも可能である。

【0016】

（目的）
細胞刺激装置で細胞に刺激を与える目的は、細胞の挙動や性質を変化させることにあり、種々のものが例示できる。例えば、培養基材からの細胞の剥離（シート状などのまま剥がれること、及び、単一の細胞に分離しながら剥がれることを含む）、形態変化、増殖抑制、遺伝子発現やタンパク質生成、培養生成物の変性や生成量の変化、分化誘導や初期化など、種々の目的で利用することができる。また、細胞刺激装置は、生体内の細胞に刺激を与えることにより、生物（ヒトを含む動物や植物）の治療や生育のコントロールを目的として利用することも可能である。

【0017】

（構成）
細胞刺激装置は、２つの電極の間に交流電場を印加可能な印加手段を備えており、生成された交流電場（交流電界）内に細胞を配置することにより、細胞に刺激を与える（交流電場を作用させる）構成となっている。交流電場の波形は、一例として正弦波、矩形波、三角波、のこぎり波が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一例として正弦波を用いることができる。細胞は、溶液に浸された状態で交流電場内に配置され、２つの電極の少なくとも一方は、細胞及び溶液と接触しないように構成される。なお、２つの電極は、平板状の電極が互いに平行に配置された、いわゆる平行平板電極であってもよい。このとき、電極の配置は特に限られるものではなく、細胞及び溶液を上下方向から挟むように配置することも、側方（横方向）から挟むように配置することも可能である。また、容器に収納された細胞に刺激を付与する場合、電極は、一つの容器を挟むように構成することも可能であり、複数の容器を挟むように構成することも可能である。

【0018】

細胞刺激装置が生成する交流電場の周波数は、水の誘電損失が所定値以下となる範囲を適用することができる。例えば、水の誘電損失εの周波数特性を表す図１に示す通り、周波数が０．５ＭＨｚ〜１０００ＭＨｚの交流電場は、水の誘電損失εが小さくなることが知られており、この範囲の交流電場を利用することができる。

【0019】

細胞刺激装置が生成する交流電場の強度（電界強度）は、細胞刺激の目的に応じて決定することが可能であるが、±０．３Ｖ／ｍ程度の交流電場でも細胞が刺激を受けて挙動を変化させることが確認された（詳細は後述）。

【0020】

以下、本発明の実施の形態に係る細胞刺激装置について、より具体的な例を挙げて説明する。

【0021】

[実施形態１]
＜細胞刺激装置の構成＞
以下、図２を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞刺激装置の構成例を説明する。細胞を刺激する細胞刺激装置１は、ファンクションジェネレータ１０を備える。ファンクションジェネレータ１０は、電極２０（第１電極）と電極３０（第２電極）との間に交流電場を印加可能な印加手段として機能する。ファンクションジェネレータ１０は、電極２０と、電極２０と対向する電極３０と、の間に配置された細胞を刺激するために、交流電場を印加する。また、細胞刺激装置１は電圧計５（オシロスコープ）を備えている。電圧計５により２つの電極２０、電極３０の間の電圧を測定することができる。そして、測定した電圧と、２つの電極２０、電極３０の間の距離とに基づいて、交流電場（電界）を算出することができる。ただし、細胞刺激装置は、電圧計を有しない構成とすることも可能である。すなわち、ファンクションジェネレータ１０の設定値と、電極間に印加される電場強度を予め確認しておくことにより、ファンクションジェネレータ１０の設定値を調整することで、電極間に所望の強度の電場を印加することが可能になる。

【0022】

ファンクションジェネレータ１０は、所望の周波数と波形を持った交流電圧信号を生成することができる電子機器で、これを電極２０と電極３０に接続することにより、電極２０と電極３０との間に、交流電場を生成することができる。なお、本実施の形態に適用可能なファンクションジェネレータ１０の種類は特に限定されるものではないが、対象となる細胞や刺激の目的に応じた出力（周波数や電圧、波形）を持つファンクションジェネレータ１０を選定・設計することが好ましい。

【0023】

電極２０、電極３０の種類も特に限定されるものではなく、例えば透明電極（酸化インジウム（ＩＴＯ）／ガラス電極）や、ステンレス、銅、アルミなどの金属電極を利用することができる。また、電極２０及び電極３０は、例えば平板電極として構成することができる。平板状の電極を平行に配置して対向させれば、電極間に均一に（むらが発生しないように）電界を生成することができる。なお、平板電極は、いわゆる板状のものの他に、実質的に平板とみなせる形態も含む。例えば、メッシュ構造になった平板電極や、周縁部での電界の発散を避けるために端部を内側に向けて屈曲させたもの、電極間の電界を均一にするために全体を緩やかに湾曲させたものなど、を例示することができる。

【0024】

本実施形態において、電極２０及び電極３０は、刺激の対象となる細胞及び細胞を浸す溶液と接触しないように配置される。例えば、細胞は溶液とともに容器内に封入されていてもよく、この容器が電極２０及び電極３０の間に配置されてもよい。すなわち、電極２０及び電極３０は、容器の外側に配置することができる。これによると、電極が細胞及び溶液と接触しないため、電極２０及び電極３０の物性が細胞に影響を与えることを防止することができる。なお、電極２０及び電極３０を容器の外側に配置する場合、当該容器は、電場に与える影響が小さい材料によって構成されていることが好ましい。これによると、電極２０及び電極３０の間に生成された電場が容器による影響を受けにくくなることから、細胞に対して電場を均等に作用させることが可能になる。具体的には、金属や磁性体を含まない樹脂容器が例示される。また、電極２０及び電極３０を容器の外側に配置することにより、容器を開閉することなく細胞刺激処理を行うことが可能になることから、容器内のコンタミネーションの発生リスクを低減することができる。また、容器に特別な工夫をする必要がないため、一般に流通している培養容器を利用して、細胞刺激処理を行うことが可能になる。

【0025】

本実施形態においては、容器としてカルチャーフラスコ４０が用いられており、ファンクションジェネレータ１０は、２つの電極２０、３０の間にカルチャーフラスコ４０を配置した状態で交流電場を印加する。

【0026】

カルチャーフラスコ４０の中には、細胞４１及び液体４２が含まれていて、ファンクションジェネレータ１０を用いて２つの電極２０、３０の間の細胞４１を刺激する。カルチャーフラスコ４０の内面（底面の内壁面）は培養基材となっており、細胞４１は、カルチャーフラスコ４０の内面に接着した接着性の細胞であってもよい。あるいは、細胞４１は、マイクロキャリアとよばれる、微細な球状又は粒状の培養基材に接着した状態で、カルチャーフラスコ４０内に配置されていてもよい。

【0027】

電極間に印加する交流電場の周波数は、細胞の種類や刺激の目的のような条件に応じて適宜調整することができる。一実施形態において、交流電場の周波数は、０．１ＭＨｚ以上であり、好ましくは０．５ＭＨｚ以上であり、より好ましくは２ＭＨｚ以上であり、さらに好ましくは５ＭＨｚ以上であり、一方で、１０００ＭＨｚ以下であり、好ましくは２００ＭＨｚ以下であり、より好ましくは５０ＭＨｚ以下であり、さらに好ましくは２５ＭＨｚ以下である。細胞刺激の目的に応じて、このような周波数を選択することにより、細胞の刺激効率が向上しうる。

【0028】

また、電極間に印加する交流電場の周波数（帯域）は、一実施形態において、水の誘電損失に基づいて設定することができる。すなわち、水に交流電界を印加した場合、低周波数では水中のイオンが移動することにより誘電損失が生じ、周波数が高くなるにしたがって誘電損失が小さくなることが知られている。水の誘電損失が小さくなる領域の交流電場（概ね０．５ＭＨｚ以上１０００ＭＨｚ以下の交流電場）を利用することで、溶液中のイオンの移動が最小限にとどまるため、細胞には、イオンの移動に伴う刺激ではなく、電界による刺激を直接に細胞に与えることができ、細胞の刺激効率が向上しうる。

【0029】

また、電極間に印加する交流電場の強度（電界強度）については、特に限定されず、細胞の種類や刺激の目的に応じて適宜設定することができる。交流電場の強度は、例えば、±０．３Ｖ／ｍ以上とすることができる。

【0030】

一実施形態において、交流電場の強度は、±１ｍＶ／２．６ｃｍ以上であり、より好ましくは±５ｍＶ／２．６ｃｍ以上であり、より好ましくは±１５ｍＶ／２．６ｃｍ以上であり、特に好ましくは±５０ｍＶ／２．６ｃｍ以上であり、一方で、±１００００ｍＶ／２．６ｃｍ以下であり、好ましくは±３０００ｍＶ／２．６ｃｍ以下であり、より好ましくは±２０００ｍＶ／２．６ｃｍ以下である。ここで、電極間の距離が２．６ｃｍよりも長い又は短い場合には、比例して電圧を増減させればよい。細胞刺激の目的に応じて、このような電場強度を選択することにより、細胞の刺激効率が向上しうる。

【0031】

なお、細胞に印加する交流電場の周波数や電界強度の具体的な値は、細胞の種類や刺激の目的に応じて適宜設定され、その最適値は実験的に導出することができる。

【0032】

また、一実施形態において、交流電場の強度（電界強度）や交流電場を印加する時間、あるいはその際の細胞が置かれる環境は、細胞の種類や刺激を与える目的に応じて適宜設定され、その最適値は、実験的に導出することができる。

【0033】

また、一実施形態において、細胞刺激装置１は、電極２０及び電極３０の間の電圧を計測する計測手段を備えた構成とすることができる。このとき、計測手段の計測値に基づいて、ファンクションジェネレータ１０の出力を調整するように構成することも可能である。これにより、電極２０及び電極３０の間に、所望の強度の電場（電界）を印加することが可能になる。

【0034】

本実施の形態に適用可能な容器についても、特に限定されるものではない。容器として、例えばカルチャーフラスコを例示したが、シャーレなどの既に公知となっているいずれかの容器を用いることもできる。また、容器は、図２に示すように一つのみを利用してもよいが、これに限られるものではない。すなわち、複数の容器を縦に積層して利用してもよく、横に並列して利用しても良い。

【0035】

本発明によれば、ファンクションジェネレータを用いて２つの電極間に交流電場を印加するだけで、２つの電極間に配置された細胞を刺激することができるため、簡易な構成で細胞を刺激することができる。

【0036】

＜細胞刺激方法＞
次に、本発明の一実施形態に係る細胞刺激方法を説明する。細胞刺激方法は、その準備として、刺激を与える対象となる細胞を用意する工程を含む。細胞は、培養して用意してもよいが、培養されたものを入手して刺激を与える工程を行ってもよい。細胞は、培養基材に接着した状態のものを利用することも可能であるが、これに限られるものではない。例えば単離された状態のものや、細胞同士が凝集して凝集塊を構成しているものを適用することができる。あるいは細胞は組織片であってもよく、生体の状態であっても、生体から切り離された状態であっても良い。細胞は、液体に浸された状態で用意する。例えば、細胞は、液体とともに容器に収納された状態で用意することができる。ここで、液体は、刺激の目的に合わせて適宜選択することができる。液体は、培養に利用された培養液であってもよく、培養液を置換した液体（細胞刺激工程に適した溶液）であってもよい。

【0037】

細胞刺激方法は、電極２０及び電極３０の間に、細胞４１及び細胞４１を浸す液体４２を配置する工程を含む。細胞４１及び液体４２が、カルチャーフラスコ４０に収納されている場合、電極２０及び電極３０の間にカルチャーフラスコ４０を配置することで、本工程を実現することができる。なお、本工程は、電極２０及び電極３０の少なくとも一方が、細胞４１及び液体４２と非接触となるように実施される。図２に示す例では、本工程は、電極２０及び電極３０の双方が、細胞４１及び液体４２と非接触となっている。

【0038】

細胞刺激方法は、電極２０と電極３０との間に、交流電場を印加する工程を含む。本工程で印加される交流電場（周波数、波形、強度、時間）は、刺激の目的に合わせて適宜設定することができる。また、本工程中の細胞の環境（温度、湿度、照度、明度）も、刺激の目的に合わせて適宜設定することができる。

【0039】

以上の工程によって細胞を刺激することができ、種々の生成物を製造することができる。例えば細胞刺激方法を、培養基材から細胞を剥離（単離）する目的で利用する場合、培養基材から剥離（単離）された単離細胞を、生成物とすることができる。また、細胞刺激により培養基材から剥離した単離細胞を培養して増殖させる細胞増殖方法にも本発明を適用可能である。あるいは、細胞刺激方法を、細胞の代謝物の物性変化や生成量の調整に利用する場合、細胞の代謝物を生成物とすることができる。あるいは刺激方法を、細胞の変性（遺伝子発現や分化誘導、初期化など）に利用する場合、変性した細胞を生成物とすることができる。

【0040】

（実施例１）
実施例１では、細胞への刺激の一例として培養基板上の細胞の剥離について説明を行う。なお、細胞が剥離した割合である剥離率は、５００μｍ×５００μｍの培養基板上の細胞密度を６ヵ所、剥離処理前後で無作為に測定して算出する。剥離率が９５％を超えた場合は完全剥離したものとする。剥離した細胞が生存している割合である生存率は、トリパンブルー染色による生死判別法を用いて算出する。

【0041】

＜実験内容及び実験結果＞
交流電場による細胞剥離の実験内容を説明する。事前に、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０に細胞４１を８割以上のサブコンフルエントまで培養した。培養後、培養液を取り除き、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０内の細胞４１を液体４２（カルシウム、マグネシウム不含リン酸バッファ（ＰＢＳ（−）））で軽く洗浄した。洗浄後、新鮮な５ｍｌの液体４２（ＰＢＳ（−））に置き換えた。ＰＢＳ（−）を５ｍｌ加えた結果、液深は約２ｍｍとなった。

【0042】

Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０は、厚みが約２．６ｃｍで容量が約５０ｍｌであり、フラスコ内のＰＢＳ（−）の上方は空気で満たされている。Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０の上下を２つの電極２０、３０で挟み、両電極間に±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を室温で印加した。１０分間の交流電場の印加後、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０内にある５ｍＬのＰＢＳ（−）で７〜１０回ピペッティングし、細胞剥離の有無を確認した。

【0043】

[ＣＨＯ−Ｋ１細胞]
その結果、図３に示されるように、細胞４１としてＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合、ファンクションジェネレータ１０による５分間の交流電場の印加によって、培養基板上に付着していた細胞の１割が剥離し、１０分間の交流電場の印加により完全剥離した。

【0044】

具体的には、図３（ａ）は、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を印加してＰＢＳ（−）中のＣＨＯ−Ｋ１細胞に０分間、５分間、１０分間刺激を加えたときの、それぞれにおけるＣＨＯ−Ｋ１細胞の様子を示している。図３（ｂ）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の剥離率を示している。図３（ｂ）の一番左側の結果は、０ｍＶ且つ１０分間、すなわちＣＨＯ−Ｋ１細胞は交流電場を印加せず、ＰＢＳ（−）中に１０分間室温で静置した場合の結果であり、その場合は培養基板表面からＣＨＯ−Ｋ１細胞は剥離しなかった。また、左から２番目は、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を３分間印加した場合の結果であり、この場合も培養基板表面からＣＨＯ−Ｋ１細胞は殆ど剥離しなかった。左から３番目は±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を５分間印加した場合の結果であり１０％弱の剥離率となった。そして、一番右は、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を１０分間印加した場合の結果であり９５％超の剥離率となった。すなわち完全剥離した。

【0045】

このように、交流電場を印加することにより、培養基板上に付着していた細胞が刺激を受けて剥離することが確認された。

【0046】

続いて、図４（ａ）は、ＰＢＳ（−）中のＣＨＯ−Ｋ１細胞について、２０ＭＨｚ且つ±１０〜±６５００ｍＶ／２．６ｃｍの範囲の交流電場をそれぞれ１０分間印加した場合の細胞剥離率及び剥離した細胞の生存率の測定結果である。図４（ａ）において、各印加条件について左側の棒グラフが細胞剥離率を示し、右側の棒グラフが生存率を示している。

【0047】

図４（ａ）からは、広い範囲の電場強度について細胞が剥離することが確認された。とりわけ、±２０〜±６４０ｍＶ／２．６ｃｍの範囲で細胞の剥離率が９割に達することが確認された。また、±１０ｍＶ／２．６ｃｍという低い電場強度でも細胞が剥離すること、±１３００ｍＶ／２．６ｃｍを超えても細胞の剥離率は低下するものの依然として細胞の剥離が生じることが確認された。また、±１０〜±６５００ｍＶ／２．６ｃｍという広い範囲の電場強度について、８割超という高い生存率が得られることが確認された。

【0048】

すなわち、±１０ｍＶ／２．６ｃｍ以上の電場を印加することにより、細胞が刺激を受けて挙動を変化させることが確認された。特に、±１０〜±６５００ｍＶ／２．６ｃｍの電場を印加することにより、細胞が剥離すること、及び、±１０〜±２６００ｍＶ／２．６ｃｍの電場を印加することによって細胞の剥離率が高まることが確認された。

【0049】

また、図４（ｂ）は、ＰＢＳ（−）中のＣＨＯ−Ｋ１細胞について、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ０．５〜１５０ＭＨｚの範囲の交流電場をそれぞれ１０分間印加した場合の細胞剥離率及び剥離した細胞の生存率の測定結果である。図４（ｂ）において、各印加条件について左側の棒グラフが細胞剥離率を示し、右側の棒グラフが生存率を示している。

【0050】

すなわち、０．５ＭＨｚ以上の周波数の交流電場を印加することにより、細胞が刺激を受けて挙動を変化させることが確認された。特に、０．５〜１５０ＭＨｚの交流電場を印加することによって細胞が剥離すること、及び、１〜１００ＭＨｚの交流電場を印加することによって細胞の剥離率が高くなることが確認された。

【0051】

図４（ｂ）からは、広い範囲の周波数について細胞が剥離することが確認された。とりわけ、５．５〜２０ＭＨｚの範囲で剥離率が９割超に達することが確認された。この範囲より周波数が低い又は高い場合、細胞の剥離率は低下するものの、なお細胞が剥離していることが確認された。また、広い範囲の周波数について、９割超という高い生存率が保たれることも確認された。

【0052】

特に、図４からは、２０ＭＨｚ且つ±１０〜±６５００ｍＶ／２．６ｃｍの交流電場、及び、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ０．５〜１５０ＭＨｚの範囲の交流電場で、９割超の生存率となった。

【0053】

また、交流電場の印加により継代した細胞が、その後どのような増殖曲線を示すのか、トリプシン処理を行う場合の増殖曲線と比較しながら調査した。具体的には、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場をＰＢＳ（−）に置換したＴ−２５カルチャーフラスコ４０の上下方向から１０分間、室温で印加することで、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を剥離した。また、ＰＢＳ（−）で洗浄した後、１×Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ（１０×Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ溶液をＰＢＳ（−）で１０倍希釈した水溶液）で３７℃、１０分間処理することにより、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０からＣＨＯ−Ｋ１細胞を剥離した。剥離したそれぞれの細胞を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／Ｔ−２５ｃｕｌｔｕｒｅｆｌａｓｋの細胞密度で播種した。そして、細胞播種３時間後を０時間として細胞密度を測定した。

【0054】

動物細胞の増殖は一般的に、誘導期（または遅延期：Ｌａｇ ｐｈａｓｅ、ラグタイム）、対数増殖期（Ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）、定常期（Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）、死滅期（Ｄｅａｔｈ ｐｈａｓｅ）の４つの期間を含む増殖曲線を示す。誘導期とは、細胞が分裂しない時期で、新しい環境に適応しようとしている状態の期間である。誘導期の長さは、細胞密度や播種時の損傷回復の時間に依る。

【0055】

ここで、図５は、上記の調査を行った際の交流電場の印加とトリプシン処理による細胞継代後の増殖曲線の比較結果を示す図である。図５に示される通り、交流電場によるＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖曲線は、トリプシン処理を行う場合の増殖曲線とは異なり、細胞分裂しない誘導期がほとんど存在せず、すぐに対数増殖期に入ることが明らかとなった。すなわち、図５に示されるように、交流電場の印加により剥離した細胞がその後増殖するとともに、増殖のラグタイム（誘導期）がトリプシン処理を行う場合よりも短くなることが見いだされた。特に、０〜２４時間の間において、交流電場を印加した場合の方が、トリプシン処理を行った場合に比べて細胞密度の上昇が大きいことが分かる。

【0056】

[ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞]
次に、細胞４１としてＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を用いた場合の結果について説明する。図６（ａ）は、±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を１０分間印加してＰＢＳ（−）中のＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞に刺激を加えたときのＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞の様子を示している。１０分間の交流電場の印加により細胞は完全剥離した。

【0057】

図６（ｂ）は、ＰＢＳ（−）中のＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞について、２０ＭＨｚ且つ±８０〜±６５００ｍＶ／２．６ｃｍの範囲の交流電場をそれぞれ１０分間印加した場合の細胞剥離率及び剥離した細胞の生存率の測定結果である。図６（ｂ）及び図６（ｃ）において、各印加条件について左側の棒グラフが細胞剥離率を示し、右側の棒グラフが生存率を示している。

【0058】

図６（ｂ）からは、広い範囲の電場強度について細胞が剥離することが確認された。とりわけ、±１６０〜±１３００ｍＶ／２．６ｃｍの範囲で細胞の剥離率が８割に達することが確認された。また、電場強度がこの範囲より低く又は高くなっても、細胞の剥離率は低下するものの依然として細胞の剥離が生じることが確認された。また、±８０〜±６５００ｍＶ／２．６ｃｍという広い範囲の電場強度について、９割超という高い生存率が得られることが確認された。

【0059】

図６（ｃ）は、ＰＢＳ（−）中のＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞について、±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ０．５〜１５０ＭＨｚの範囲の交流電場をそれぞれ１０分間印加した場合の細胞剥離率及び剥離した細胞の生存率の測定結果である。

【0060】

図６（ｃ）からは、１０〜２０ＭＨｚの範囲で剥離率が９割超に達することが確認された。この範囲より周波数が低い又は高い場合、細胞の剥離率は低下する傾向がみられた。また、広い範囲の周波数について、８割超という高い生存率が保たれることも確認された。

【0061】

特に、図６によれば、２０ＭＨｚ且つ±３２０〜±６４０ｍＶ／２．６ｃｍの印加条件で完全剥離すると共に、９割超の生存率となった。また、２０ＭＨｚ且つ±８０〜±６５００ｍＶ／２．６ｃｍの印加条件で９割超の生存率となった。また、±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ１０〜１００ＭＨｚの印加条件で９割超の生存率となった。

【0062】

上記のように、様々な種類の細胞について、交流電場の印加により細胞が刺激され、剥離する効果が得られることがわかる。細胞の剥離を行うためには、幅広い電場強度及び周波数が適用可能であり、特に有効な電場強度及び周波数を選択することにより、細胞の生存率を保ちながら、細胞の剥離効率を向上させることができる。また、細胞の剥離効率を向上させるために適した電場強度及び周波数は、細胞の種類により異なることが示された。実施例で用いられた細胞以外の細胞を用いる場合であっても、上記の結果を参考に適用する電場強度及び周波数を選択することが可能である。

【0063】

[実施形態２]
実施形態２では、細胞への刺激の一例として、細胞４１としてＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養したＴ−２５カルチャーフラスコ４０を複数用意し、それらを鉛直上下方向に重ねた状態で交流電場を上下に又は側方に印加する。図２と同様の装置構成で、一度に複数の容器（例えばＴ−２５カルチャーフラスコ）を処理することができるため、処理効率を向上させることができる。

【0064】

なお、容器を上下方向に重ねることに限定されるものではなく、左右方向に複数の容器を配置してもよい。複数の容器を配置することで、電極同士の距離は離間するが、その距離に応じて電圧を調整することで所望の電場強度を保つことができる。

【0065】

（実施例２）
実施例１と同様に、事前に、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０に細胞４１（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）を８割以上のサブコンフルエントまで培養した。培養後、培養液を取り除き、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０内の細胞４１を液体４２（ＰＢＳ（−））で軽く洗浄した。洗浄後、新鮮な５ｍｌの液体４２（ＰＢＳ（−））に置き換えた。２つのＴ−２５カルチャーフラスコ４０を重ねて２つの電極２０、３０で挟み、両電極間に６２ｍＶｐｐ／ｃｍ（＝±３１ｍＶ／ｃｍ＝±８０ｍＶ／２．６ｃｍ）且つ２０ＭＨｚの交流電場を室温で印加した。１０分間の交流電場印加後、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０内にある５ｍＬのＰＢＳ（−）で７〜１０回ピペッティングし、細胞剥離の有無を確認した。

【0066】

その結果、図７（ａ）のＴｏｐａｎｄｂｏｔｔｏｍのように、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０を２つ重ねた後に２つの電極２０、３０を上下に配置して上下方向から交流電場を印加した結果と、図７（ｂ）のＳｉｄｅｓのように、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０の側面に電極２０、３０を配置して横方向から交流電場を印加した結果とは、略同じであった。すなわち、いずれの印加条件においてもＣＨＯ−Ｋ１細胞は生存率９６％で完全剥離した。このように、交流電場の印加方向に依存せずに細胞剥離を行うことができ、さらにはＴ−２５カルチャーフラスコ４０が複数存在していても円滑な細胞剥離を実現することができる。

【0067】

上記のように、処理対象の細胞を含む容器が複数存在しても、交流電場の印加により細胞が刺激され、剥離する効果が得られることがわかる。また、実施例で用いられた細胞以外の細胞を用いる場合であっても、上記の結果を参考に適用する電場強度及び周波数を選択することが可能である。

【0068】

[実施形態３]
実施形態３では、溶液４２の種類や量によって細胞刺激の結果が変化することを説明する。

【0069】

（実施例３）
実施例１と同様に、事前に、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０に細胞４１（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）を８割以上のサブコンフルエントまで培養した。

【0070】

培養後、培養液を取り除き、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０内の細胞４１を液体４２（ＰＢＳ（−））で軽く洗浄した。洗浄後、新鮮な５ｍｌの液体４２（ＰＢＳ（−））に置き換えた。このＴ−２５カルチャーフラスコ４０を２つの電極２０、３０で挟み、両電極間に６２ｍＶｐｐ／ｃｍ（＝±３１ｍＶ／ｃｍ＝±８０ｍＶ／２．６ｃｍ）且つ２０ＭＨｚの交流電場を室温で印加した。１０分間の交流電場印加後、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０内にある５ｍＬのＰＢＳ（−）で７〜１０回ピペッティングし、細胞剥離の有無を確認した（条件１）。

【0071】

また、比較のため、洗浄後、新鮮な１ｍｌの液体４２（ＰＢＳ（−））に置き換える点以外は条件１と同様の条件で細胞剥離の有無を確認した（条件２）。また、比較のため、洗浄後、液体４２（ＰＢＳ（−））を除去した状態（０ｍｌ）にする点以外は条件１と同様の条件で細胞剥離の有無を確認した（条件３）。また、比較のため、交流電場を印加しない点以外は条件１と同様の条件で細胞剥離の有無を確認した（条件４）。

【0072】

また、比較のため、カルシウムを含有するＰＢＳ（＋）で洗浄する点、及び、洗浄後、新鮮な５ｍｌのＰＢＳ（＋）に置き換える点以外は条件１と同様の条件で細胞剥離の有無を確認した（条件５）。また、比較のため、培養後の培地（１ｍｌ）をそのまま使用して洗浄をしない点以外は、条件１と同様の条件で細胞剥離の有無を確認した（条件６）。

【0073】

図８（ａ）は、室温中（Ｒｏｏｍ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を印加してカルシウムを含有するＰＢＳ（＋）中のＣＨＯ−Ｋ１細胞に０分間、１０分間刺激を加えた時の、それぞれにおけるＣＨＯ−Ｋ１細胞の様子を示している。１０分経過後も細胞は剥離しなかった。

【0074】

図８（ｂ）は、各印加条件での細胞剥離率及び生存率の測定結果である。図中の生存率におけるＮ．Ｄはデータを測定していないことを表している。

【0075】

交流電場を印加しない場合（図８（ｂ）の一番左（条件４））や、培地中で±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を上下方向から１０分間印加した場合（図８（ｂ）の左から２番目（条件６））には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は剥離しなかった。

【0076】

また、０．９ｍＭの塩化カルシウムを加えたＰＢＳ（＋）中のＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を上下方向から１０分間印加しても、剥離しなかった（図８（ｂ）の左から３番目（条件５））。なお、図８（ａ）は、図８（ｂ）の左から３番目の例に対応している。

【0077】

また、ＰＢＳ（−）でＣＨＯ−Ｋ１細胞を洗浄後、ＰＢＳ（−）を除去した状態（０ｍｌ）で±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を上下方向から１０分間印加した場合は、その後ＰＢＳ（−）を加えてピペッティングしても、剥離しなかった（図８（ｂ）の右から３番目（条件３））。

【0078】

ＰＢＳ（−）でＣＨＯ−Ｋ１細胞を洗浄後、ＰＢＳ（−）を除去した後、改めてＰＢＳ（−）を１ｍｌ加えたところ、液深はほぼ０．４ｍｍとなり、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を上下方向から１０分間印加した所、４２．７％が剥離した（図８（ｂ）の右から２番目（条件２））。なお、図８（ｂ）の一番右（条件１）は、図４（ｂ）の右から５番目と同じであり、完全剥離するとともに９５％超の生存率が得られた。

【0079】

このように、培地中およびＰＢＳ（＋）中のＣＨＯ−Ｋ１細胞は交流電場を印加しても剥離しないという結果が得られた。また、ＰＢＳ（−）の量を減少させる（例えば５ｍｌから１ｍｌへ減少させる）と交流電場の印加時における細胞の剥離率も低下するという結果が得られた。

【0080】

以上より、細胞を刺激したときの細胞の挙動が、溶液の種類や量によって変化することが見いだされた。

【0081】

[実施形態４]
実施形態４では、電極の一方が、細胞及び細胞を浸す溶液と接触している系における細胞刺激について説明を行う。

【0082】

（実施例４）
＜細胞剥離装置の構成＞
図９を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞刺激装置の構成例を説明する。細胞刺激装置２は、ファンクションジェネレータ１０を備えており、ファンクションジェネレータ１０は、２つの電極２１、３１により形成された培養シャーレ３の細胞４１（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）に対して交流電場を印加する印加手段として機能する。電極２１は、例えばＩＴＯ／ＰＥＴフィルム電極であり、電極３１は例えばＩＴＯ／ガラス電極である。

【0083】

＜実験内容及び実験結果＞
図９に示されるように、上部に電極２１（ＩＴＯ／ＰＥＴフィルム電極）、底部に電極３１（ＩＴＯ／ガラス電極）を配置し、交流電場を印加可能な培養シャーレ３を作成した。まず、電極３１（ＩＴＯ／ガラス電極）上にｆｌｅｘｉＰＥＲＭ５０を付着させ、５μｇ／ｃｍ^２のラミニンコート６０を施す。ラミニンをコートした電極３１（ＩＴＯ／ガラス電極）上で細胞４１（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）を８割以上のサブコンフルエントまで培養した。そして、培地を５ｍｌの液体４２（ＰＢＳ（−））に置き換え、±８０ｍＶ／１．１ｃｍ且つ各種周波数条件の交流電場を室温で１０分間印加した。

【0084】

図１０（ａ）は、上記条件の下でＣＨＯ−Ｋ１細胞に０分間、１０分間刺激を加えたときの、それぞれにおけるＣＨＯ−Ｋ１細胞の様子を示している。図１０（ｂ）は、上記条件の下での細胞剥離率の測定結果であり、図１０（ｃ）は、上記条件の下での生存率の測定結果である。

【0085】

図１０（ｂ）に示されるように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１．４ＭＨｚ、５．５ＭＨｚ、１１ＭＨｚ、２０ＭＨｚの印加条件で完全剥離した。なお、図１０（ａ）は図１０（ｂ）の２０ＭＨｚの印加条件の時の結果に対応しており、細胞が剥離している様子が観察できる。

【0086】

また、図１０（ｃ）に示されるように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、５．５ＭＨｚ、１１ＭＨｚ、２０ＭＨｚの交流電場で９割超の生存率が得られた。

【0087】

このように、対向する電極の一方が、細胞及び溶液に接触している場合であっても、幅広い周波数において細胞が刺激され、高い細胞剥離率、生存率が得られることが確認された。

【0088】

[実施形態５]
実施形態５では、コート剤の細胞剥離率及び生存率への影響について説明を行う。なお、細胞剥離装置の構成は図２を参照して説明した構成と同様であるため、説明を省略する。

【0089】

（実施例５）
＜実験内容及び実験結果＞
０．５μｇ／ｃｍ^２のビトロネクチンコートを施したＴ−２５カルチャーフラスコ４０に細胞４１（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）を培養し、交流電場を液体４２（ＰＢＳ（−））中、室温で１０分間印加した場合の細胞剥離の様子を観察した。

【0090】

図１１（ａ）は、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ２０ＭＨｚの交流電場の印加（室温１０分間）による結果であり、図１１（ｂ）は、±８０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ１０ＭＨｚの交流電場の印加（室温１０分間）による結果である。

【0091】

図１１（ｃ）は、±８０ｍＶ／２．６ｃｍの交流電場の印加室温１０分間による細胞剥離率及び生存率の測定結果である。このグラフから分かるとおり、２０ＭＨｚの交流電場を印加した場合は完全剥離しているものの、１０ＭＨｚの交流電場を印加した場合の剥離率は５０％を下回っている。これに対して、前述の実施形態で図４（ｂ）に示したように、コート材を利用しない場合には、１０ＭＨｚに比較的近い値である５．５ＭＨｚ及び１１ＭＨｚの電場を印加した場合の剥離率は９０％程度になっている。これらのことから、カルチャーフラスコ（コート剤無し）を培養基材とした場合と、ビトロネクチンコートされた表面を培養基材とした場合とで、細胞の剥離率が変化していることが分かる。すなわち、培養基材の違いが、細胞に影響を与えることが確認された。

【0092】

[実施形態６]
実施形態６では、細胞への刺激の一例としてｉＰＳ細胞の剥離を例に説明を行う。その結果、ｉＰＳ細胞に対しても細胞が刺激されることが見いだされた。装置構成は図２と同様であるため、説明を省略する。

【0093】

（実施例６）
＜実験内容及び実験結果＞
０．５μｇ／ｃｍ^２のラミニン５１１Ｅ８コートを施したＴ−２５カルチャーフラスコ４０において細胞４１（ｉＰＳ細胞（７７１−２株、継代数６））を培養した。液体４２（ＰＢＳ（−））でｉＰＳ細胞を洗浄した後、０．５×ＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔを５ｍＬ加えた。５％ＣＯ２インキュベータ内にｉＰＳ細胞を配置し、３７℃で４分間ＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔ処理した後、ＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔで１０回ピペッティングした。図１２（ａ）はその結果を示しており、ピペッティングをしてもｉＰＳ細胞のコロニーは培養基板表面から殆ど剥がれなかった。

【0094】

次に、同様に準備したｉＰＳ細胞について、４分間のＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔ処理時に、±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ２０ＭＨｚの交流電場を印加した。４分間の交流電場の印加とＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔ処理の後、ピペッティングよりも弱い剥離方法であるタッピングを、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０の側面から２０回行った。

【0095】

図１２（ｂ）はその結果を示しており、ｉＰＳ細胞のコロニーが全て又は部分的に剥離した。また、剥離したｉＰＳ細胞の生存率は９７％であった。このように、交流電場の印加によって、ｉＰＳ細胞についても細胞が刺激されて剥離しやすくなることが確認された。

【0096】

[実施形態７]
実施形態７では、細胞への刺激の一例として、交流電場の印加によって増殖が抑制（阻害）される例、及び、交流電場の印加の停止によって再び正常に増殖が開始される例を説明する。本実施形態では、Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１２培地のＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して±０．５Ｖ／ｃｍ、１００ＭＨｚ交流電場を２日間に渡って印加しながら培養した場合に、増殖速度に影響があるかどうかを確認した。その結果、細胞が刺激されて増殖速度が抑制されることが見いだされた。また、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖が抑制された後に、±０．５Ｖ／ｃｍ且つ１００ＭＨｚの交流電場の印加を停止すると、細胞が再び正常に増殖を開始するかを確認した。その結果、細胞が再び正常に増殖を開始することが見いだされた。装置構成は図２と同様であるため、説明を省略する。

【0097】

（実施例７）
図１３（ａ）は、比較対照のためのＣｏｎｔｒｏｌにおけるＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖の様子を示す図である。図１３（ｂ）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して±０．５Ｖ／ｃｍ、１００ＭＨｚ交流電場を印加した場合のＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖の様子を示す図である。

【0098】

図１３（ｃ）は、図１３（ａ）及び図１３（ｂ）の各条件における細胞密度の測定結果を示している。横軸の０、２４、４８はそれぞれ増殖を開始してからの時間を表しており、縦軸の数値は細胞密度を表している。左の３つは図１３（ａ）に対応しており、ｃｏｎｔｒｏｌにおける結果を示している。右の３つは、図１３（ｂ）に対応しており、±０．５Ｖ／ｃｍ、１００ＭＨｚ交流電場を印加した場合の結果を示している。

【0099】

その結果、交流電場を印加すると２４時間培養後から統計的に有意なＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖抑制が確認され、４８時間後には、Ｃｏｎｔｒｏｌの６０％の細胞密度となることが確認された。

【0100】

このように、±０．５Ｖ／ｃｍ且つ１００ＭＨｚの交流電場の印加により、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖が抑制されることが確認された。従って、本実施形態に係る細胞刺激装置は細胞増殖抑制装置として機能することが見いだされた。

【0101】

次に、図１４は、時間経過に伴う細胞密度（個数／ｃｍ^２）の値の変化（増殖の様子）を示す図である。±０．５Ｖ／ｃｍ且つ１００ＭＨｚの交流電場を印加しない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）、２４時間印加してから印加を停止した場合、そして４８時間印加してから印加を停止した場合の３通りの結果が示されている。

【0102】

２４時間の時点では、比較対象のためのｃｏｎｔｒｏｌと比べて、細胞密度は６６％となっており、増殖が抑制されている。すなわち、細胞密度がｃｏｎｔｒｏｌよりも緩やかな勾配で増加していくことが分かる。

【0103】

２４時間後に交流電場の印加を停止した場合、２４時間〜４８時間の間で細胞密度がｃｏｎｔｒｏｌと同じ勾配で増加していくことが分かる。そして、４８時間の時点では、ｃｏｎｔｒｏｌと比べて、細胞密度が８１％の割合になるほど増殖が進んでいる。

【0104】

一方、交流電場を４８時間印加してから印加を停止した場合、０〜４８時間では細胞密度は、細胞密度がｃｏｎｔｒｏｌよりも緩やかな勾配で増加していくことが分かる。そして４８時間以降は勾配が急になり、ｃｏｎｔｒｏｌと同じような勾配で増加していくことが分かる。

【0105】

このように、交流電場の印加を停止すると、細胞は再び正常に増殖を開始することが見いだされた。また、交流電場の印加停止後には増殖の勾配がｃｏｎｔｒｏｌと同じようになることから、交流電場の印加によって細胞にダメージが与えられて増殖が抑制されているのではなく、交流電場の印加中は増殖機能が単に抑制されているだけであることが確認された。

【0106】

[実施形態８]
実施形態８では、細胞への刺激の一例として、マイクロキャリアビーズ上で培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して、ファンクションジェネレータにより交流電場を印加する。その結果、マイクロキャリアビーズ上で培養した細胞についても交流電場の印加によって細胞が刺激され、細胞が剥離することが見いだされた。なお、装置構成は図２と同様であるため、説明を省略する。また、マイクロキャリアビーズはコーニング社製のポリスチレンビーズを用いるが、当該ビーズに限らず、他のマイクロキャリアビーズを用いてもよい。

【0107】

（実施例８）
図１５（ａ）は、マイクロキャリアビーズ上で培養されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の一例を示す図である。複数のマイクロキャリアビーズ上でＣＨＯ−Ｋ１細胞が培養されている様子が観察できる。

【0108】

図１５（ｂ）は、各種条件下での剥離した細胞の数の測定結果を示す。図中、ｖｅｒｔｉｃａｌ ｓｗｉｎｇの標記がなされているグラフが、交流電場と上下振動とを同時に加えている場合の結果であり、ｖｏｒｔｅｘの標記がなされているグラフが、交流電場の印加後に振動を加えた結果を表している（後述の図１５（ｃ）も同様）。なお、上下振動処理（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｓｗｉｎｇ）は２５００ｒｐｍのｖｅｒｔｉｃａｌ ｓｗｉｎｇである。

【0109】

図１５（ｂ）において、一番左はトリプシンＥＤＴＡ処理を１０分間行った時の結果である。左から２番目は、ＥＤＴＡのみを添加した溶液を加えて±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ、２０ＭＨｚの交流電場を１０分間印加しながら上下振動処理（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｓｗｉｎｇ）を行った時の結果である。左から３番目は、ＥＤＴＡのみを添加した溶液を加えて±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ２０ＭＨｚの交流電場を印加してから１０分後に１分間ボルテックス処理した時の結果である。左から４番目は、ＥＤＴＡ処理を１０分間行った時の結果である。これらのグラフから、交流電場を印加することで、トリプシンを利用することなく、トリプシンＥＤＴＡ処理と同程度の細胞剥離を実現できることが分かる。また、交流電場を印加することで、ＥＤＴＡ処理に比べて多くの細胞が剥離することが分かる。

【0110】

また、図１５（ｂ）の右から３番目は、ＥＤＴＡを含まない溶液を加えて±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ２０ＭＨｚの交流電場を１０分間印加しながら上下振動処理（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｓｗｉｎｇ）を行った時の結果である。右から２番目は、ＥＤＴＡを含まない溶液を加えて±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ２０ＭＨｚの交流電場を印加してから１０分後に１分間ボルテックス処理した時の結果である。これらのグラフと左から４番目のグラフから、交流電場を印加することで、ＥＤＴＡを利用することなく、ＥＤＴＡ処理と同程度の細胞剥離を実現できることが分かる。なお、一番右は、ＥＤＴＡを含まない溶液を加えて、交流電場を印加せずに１分間ボルテックス処理した時の結果である。このように、交流電場を印加した方が、より多くの細胞が剥離することが確認された。すなわち、マイクロキャリアビーズ上で培養された細胞についても、交流電場の印加により細胞が刺激を受けて挙動が変わる（剥離が促される）ことが見いだされた。

【0111】

図１５（ｃ）は、各種条件下での剥離した細胞の生存率の測定結果を示す。トリプシンＥＤＴＡ処理を行った場合は、生存率９９％であった（図１５（ｃ）の一番左）。±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ２０ＭＨｚの交流電場を印加しながら、上下振動処理（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｓｗｉｎｇ）を行った場合は、生存率９５％であった（図１５（ｃ）の右から３番目）。

【0112】

また、±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ２０ＭＨｚの交流電場を印加してから１０分後に１分間ボルテックス処理を行った場合は、生存率９６％であった（図１５（ｃ）の右から２番目）。その他の条件においても、９割程度以上の生存率が得られた。

【0113】

以上より、細胞基板上で培養された細胞だけではなく、マイクロキャリアビーズ上で培養された細胞についても、交流電場の印加によって細胞が刺激され、剥離することが見いだされた。

【0114】

以上説明したように、前述の各実施形態によれば、交流電場の印加により細胞に刺激を加えることによって、細胞に様々な効果（細胞の剥離率の増加、生存率の増加、細胞の増殖抑制など）をもたらすことが確認された。

【0115】

なお、前述の各実施形態では、電極が細胞刺激装置に含まれる構成について説明したが、電極が細胞刺激装置に含まれなくてもよい。例えば、Ｔ−２５カルチャーフラスコ４０等の上部や底部を電極板により構成し、ファンクションジェネレータ１０と接続するような構成であってもよい。また、交流電場の強度に応じて、細胞を配置した細胞刺激装置の周囲にステンレス製のシールド（囲い）を設け、装置周囲への影響を低減する構成としてもよい。

【0116】

[実施形態９]
実施形態９では、細胞刺激装置の別の形態を説明する。以下、図１６を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞刺激装置４の構成例を説明する。

【0117】

細胞刺激装置４は、電極２０及び電極３０の間に生成される交流電場に細胞を配置することによって、細胞に刺激を与える装置として構成される。

【0118】

電極２０及び電極３０は、アンプ１２に接続される。アンプ１２は、ファンクションジェネレータ１０の電気信号を受け付けて、強度を増幅して電極に印加する。アンプ１２を利用することにより、電極２０及び電極３０の間に生成される電場強度を、容易に調整することができる。

【0119】

電極２０及び電極３０は、シールド１４内に配置される。シールド１４は、内部で発生する電磁波を閉じ込めて、外部に漏らさない役割を果たす。これによると、アンプ１２の出力を上げた場合にも、電極２０及び電極３０間で発生する電磁波（電波）が周囲に影響を与えることを防止することができる。

【0120】

細胞刺激装置４は、支持体１６を有する。支持体１６は、容器を支持する役割を果たす。支持体１６は、シールド１４内に配置される。支持体１６は、電極２０及び電極３０で生成される交流電場に影響を与えない素材で構成することが好ましい。支持体１６は、例えば金属や磁性体を含まない樹脂素材によって構成することができる。

【0121】

支持体１６は、容器を振盪させることが可能な構成となっている。例えば支持体１６は、水平方向に往復運動や旋回運動をするように構成されていてもよい。あるいは支持体１６は、上下方向に運動するように構成されていてもよい。すなわち、支持体１６は、図示しないアクチュエータに接続され、所望の運動をするように構成することができる。なお、この場合、アクチュエータのうち、シールド１４内に配置される部材は、交流電場に影響を与えない素材で構成することが好ましい。

【0122】

支持体１６は、電極２０及び電極３０に交流電場を印加しながら、容器を振盪させることが可能に構成されていてもよい。あるいは支持体１６は、電極２０及び電極３０に交流電場を印加した後に、容器を振盪させることが可能に構成されていてもよい。

【0123】

細胞刺激装置４で利用することが可能な容器は、特に限定されるものではないが、図１６に示すように、複数段の容器が多段に積層された形態のもの（いわゆるスタックプレート６０）を利用することが可能である。これによると、一度に多量の細胞を処理することが可能になる。

【0124】

細胞刺激装置４では、電極２０及び電極３０は、容器の側方に配置され、容器の横から交流電場を印加するように構成される。かかる構成によっても、細胞に交流電場を作用させることができ、細胞刺激装置１と同様の効果を発揮することができる。

【0125】

[実施形態１０]
実施形態１０では、振動を与えながら交流電場を印加する例を説明する。具体的には、液深をＰＢＳ（−）で２ｍｍとしたＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞のＴ−２５カルチャーフラスコ４０に上下方向から、±３２０ｍＶ／２．６ｃｍ且つ２０ＭＨｚの交流電場を印加しながら１２００ｒｐｍで水平旋回（Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｔｕｒｎ）した場合（条件ａ）の、細胞剥離の様子を調査した。

【0126】

また、比較のため、水平旋回処理を行わずに、当該交流電場を印加した場合（条件ｂ）の細胞剥離の様子、当該交流電場を印加せずに１２００ｒｐｍでの水平旋回処理のみを行った場合（条件ｃ）の細胞剥離の様子をそれぞれ調査した。

【0127】

その結果、水平旋回による振動を与えながら交流電場を印加することで細胞剥離に要する時間が短縮されることが見いだされた。

【0128】

（実施例１０）
図１７（ａ）は、条件ａの下での時間経過に伴う細胞剥離の様子を示す図である。左から０分、２分、５分の時点での様子が示されている。その結果、細胞剥離率は、図１７（ｃ）の右から２番目、一番右に示される通り、２分で６３％、５分で９７％となった。細胞の生存率は２分、５分でともに９８％であった。

【0129】

一方、図１７（ｂ）は、条件ｃの下での時間経過に伴う細胞剥離の様子を示す図である。左から０分、５分の時点での様子が示されている。図１７（ｂ）の一番右は、水平旋回を行う旋回装置上に電極２０、３０に挟まれたＴ−２５カルチャーフラスコ４０を載置した様子を示している。その結果、図１７（ｃ）の一番左に示される通り、細胞剥離率は５分で２０％となり、細胞の生存率は５分で９４％となった。

【0130】

また、図１７（ｃ）の左から２番目は、条件ｂに対応しており、細胞剥離率は５分で６７％程度、細胞の生存率は５分で９５％となった。

【0131】

以上より、特に、条件ａ及び条件ｂの比較の結果、交流電場を印加しながら水平旋回を行った場合の方が、交流電場を印加するだけで水平旋回を行わない場合よりも早く細胞が剥離することが確認された。すなわち、水平旋回による振動を与えながら交流電場を印加することで細胞剥離に要する時間が短縮されることが見いだされた。

【0132】

また、条件ｃのように水平旋回のみを行った場合には５分の時点で２０％しか細胞が剥離されていない。そして、前述した通り、条件ｂのように交流電場を印加するだけで水平旋回を行わない場合には５分の時点で６７％であった。これらを単純に合計した場合は８７％であり、条件ａのように交流電場を印加しながら水平旋回を行った場合は５分の時点の９７％の方が大きい。このように、水平旋回と交流電場の印加との組み合わせによって、細胞剥離が効率的に行われていることが分かる。

【0133】

以上、前述の各実施形態で説明したように、本発明によれば、簡易な構成で容易に細胞を刺激することが可能となる。

【符号の説明】

【0134】

１：細胞刺激装置、１０：ファンクションジェネレータ、２０，３０：電極、４１：細胞、４２：液体

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】