特許 6709217 皮膚の修復および／または再生において使用するためのヘパラン硫酸

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6709217

(24)【登録日】2020年5月26日

(45)【発行日】2020年6月10日

(54)【発明の名称】皮膚の修復および／または再生において使用するためのヘパラン硫酸

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/10 20060101AFI20200601BHJP

   A61K 31/727 20060101ALI20200601BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20200601BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20200601BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20200601BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20200601BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20200601BHJP

   C07K 14/50 20060101ALN20200601BHJP

   C07K 1/04 20060101ALN20200601BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALN20200601BHJP

【ＦＩ】

   C08B37/10

   A61K31/727

   A61K38/18

   A61K35/12

   A61P17/02

   C07K7/06

   C07K7/08

   !C07K14/50ZNA

   !C07K1/04

   !C12N5/0775

【請求項の数】8

【全頁数】99

(21)【出願番号】特願2017-526910(P2017-526910)

(86)(22)【出願日】2015年11月19日

(65)【公表番号】特表2017-536454(P2017-536454A)

(43)【公表日】2017年12月7日

(86)【国際出願番号】SG2015050464

(87)【国際公開番号】WO2016080916

(87)【国際公開日】20160526

【審査請求日】2018年11月14日

(31)【優先権主張番号】10201408007P

(32)【優先日】2014年11月19日

(33)【優先権主張国】SG

(73)【特許権者】

【識別番号】503231882

【氏名又は名称】エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100128750

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 しのぶ

(72)【発明者】

【氏名】クール，サイモン

(72)【発明者】

【氏名】ヌルカム，ビクター

【審査官】 桜田 政美

(56)【参考文献】

【文献】 特許第６３２１７８６（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特開２００２−３２７００２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０７−５０５１７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００７１４４３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００４５２４９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５０５９３３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｂ ３７／１０

Ａ６１Ｋ ３１／７２７

Ａ６１Ｋ ３５／１２

Ａ６１Ｋ ３８／１８

Ａ６１Ｐ １７／０２

Ｃ０７Ｋ ７／０６

Ｃ０７Ｋ ７／０８

Ｃ０７Ｋ １／０４

Ｃ０７Ｋ １４／５０

Ｃ１２Ｎ ５／０７７５

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

皮膚の修復および／または再生のための薬学的組成物であって、ヘパラン硫酸ＨＳ８を含み、ヘパラン硫酸ＨＳ８は、アミノ酸配列ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、前記薬学的組成物。

【請求項2】

皮膚の修復および／または再生が、皮膚火傷、潰瘍、切除創傷、切り傷、刺し傷または穿刺傷より選択されてもよい皮膚創傷または瘢痕の治療を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

皮膚の修復および／または再生が、皮膚移植治癒、皮膚再構築、または皮膚形成手術を含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

局所または経皮投与のために製剤化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

ジェル、スプレー、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、膏薬（ｓａｌｖｅ）、オイル、水溶液、懸濁物、分散物、パッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング剤、デポ剤またはリザーバーとして製剤化される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

増殖因子および／または間葉系幹細胞との組み合わせ調製物として製剤化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

増殖因子が、ＦＧＦ２である、請求項６に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ８が：

【化1】

を含む二糖組成を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＦＧＦ２に結合するヘパラン硫酸を含むヘパラン硫酸に、そして特に、排他的ではないが、皮膚の修復および／または再生におけるその療法的使用に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚は、人体の最大の臓器を構成し、物理的な傷害、放射線および温度に対する防御バリアとして働く。皮膚は、根底にある間葉系（真皮）層および外部上皮（表皮）層からなる。

【0003】

皮膚創傷治癒は、細胞間相互作用、細胞外マトリックス産生、ならびに多くのサイトカインおよび増殖因子を含む多様な機構によって制御される（Ｐａｕｌ Ｍａｒｔｉｎ． 創傷治癒−完璧な皮膚再生を目指して Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６（７５）１９９７を参照されたい）。創傷治療の重要な目的には、迅速な創傷閉鎖、ならびに機能的および美的に満足出来る瘢痕が含まれる。

【0004】

皮膚における創傷治癒は、凝血、炎症、組織形成（上皮化、肉芽組織の形成、マトリックス）および組織リモデリングを含む、重複する事象パターンを通じて進行する。修復プロセスは、大部分、相互作用性分子シグナル、主にサイトカインによって仲介される。最初の傷害は、凝血および急性局所炎症反応を誘発し、その後、間葉系幹細胞補充、増殖およびマトリックス合成が続く。炎症の消散に失敗すると、慢性非治癒創傷につながる可能性もあり、一方、未調節のマトリックス集積は、過剰な瘢痕形成につながる可能性もある。

【0005】

皮膚創傷治癒に非常に重要であることが知られる主な増殖因子の１つは、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）であり、これは、線維芽細胞、メラニン形成細胞、内皮細胞および特に幹細胞を含む、多くのタイプの細胞によって作製される類似のヘパリン結合タンパク質ファミリーに属する。ＦＧＦ−２は、肢発生、組織修復、中胚葉誘導、肺発生、およびニューロン生存の維持を含む、多数の発生および生物学的プロセスにおいて役割を果たし；特に、ＦＧＦ−２は、真皮および表皮を含む、細胞増殖、遊走、および分化を制御する。ＦＧＦ−２変異体は、末梢血管新生を含む、いくつかの第ＩＩＩ相臨床試験に関して、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されてきている。ＦＧＦ−２は、角化細胞に対して増殖性および運動性両方の影響を有し、そして皮膚由来間葉系幹細胞の活性を増大させる。ＦＧＦ−２はまた、癌原性（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）であり、これによって、高濃度での使用には問題があり、そしてしたがって代替療法が必要とされる。

【0006】

ＦＧＦ−２は、創傷治癒中、角化細胞に対して増殖性および運動性の影響を有し、そして皮膚由来間葉系幹細胞を増大させる。ＦＧＦ−２治療は、放射線曝露皮膚の修復に有効である。第二度熱傷創傷の局所治療としてのその使用もまた評価されてきており、この場合、有意により迅速な創傷治癒、ならびにより大きい最大瘢痕伸長、瘢痕退縮対最大瘢痕伸長比および伸縮性が確認された。これはまた、筋線維芽細胞アポトーシスを誘導するが、線維芽細胞に対する同じ影響は控えることによって、瘢痕不含創傷治癒を補助する。

【0007】

上皮角化細胞が側方性に遊走して創傷を閉鎖する再上皮化は、ヒト皮膚創傷治癒における非常に重要な事象である。慢性創傷において、角化細胞遊走はブロッキングされ、そして創傷は開放されたままであり、患者の病的状態、そしてさらには死亡まで引き起こす。ヒト皮膚創傷治癒中、重要な工程は、創傷縁での上皮および真皮細胞の創傷床への遊走の開始である。ヒト角化細胞（ＨＫＣ）は、切断縁から創傷床を渡って側方性に遊走し、最終的に創傷を閉鎖する（再上皮化）。真皮線維芽細胞（ＤＦ）および真皮微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）を含む真皮細胞が、ＨＫＣ遊走後に創傷内に移動し、ここでこれらの細胞は、マトリックスタンパク質を沈着させ、収縮し、そして新規閉鎖創傷をリモデリングし、そして新規血管を構築する。

【0008】

Ｂｒｉｃｋｍａｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏ． ８ Ｎｏ． ５ ｐｐ． ４６３−４７１， １９９８）は、ＦＧＦ２と相互作用可能であると報告された、ＨＳ２と称されるヘパラン硫酸を記載する。ＨＳ２は、Ｂｒｉｃｋｍａｎ（上記）によって記載されるように、胚第１０日のネズミ細胞のヘパランプロテオグリカンから得られうる。ＨＳ２は、およそ２５ｋＤａの分子重量を有すると記載されており、そしてしたがって、二糖あたり４００Ｄａの平均分子量と想定され、約６０の二糖からなる。ＨＳ２の二糖組成は、その全体が本明細書に援用される、Ｂｒｉｃｋｍａｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏ． ８ Ｎｏ． ５ ｐｐ． ４６３−４７１， １９９８）、ＷＯ２０１０／０１１１８５に示される。ＨＳ２の亜硝酸およびヘパランリアーゼ消化プロファイルは、図２９および３０に示される。

【0009】

Ｍａｃｃａｒａｎａら（塩基性線維芽細胞増殖因子の結合に必要とされるヘパリン／ヘパラン硫酸における最小配列。 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｖｏｌ． ２６８， Ｎｏ．３２， 第１５号， ｐｐ２３８９８−２３９０５， １９９３）は、ヒト大動脈由来のヘパリンまたはＨＳから生成されるいくつかの小分子オリゴ糖によるＦＧＦ−２結合を調べる実験を記載する。１つの八糖分画（Ｂ２）を用いて、構造を、著者らがＨＳ−８と呼ぶ八糖に属すると見なした。これは本発明のＨＳ−８ではなく、そして命名はまったくの偶然の一致であることに注目すべきである。

【0010】

ブタ腸粘膜由来のヘパリン、選択的にＯ−脱硫酸化されたヘパリンの２つの試料であって、一方の試料は、出発材料を優先的に６−Ｏ−脱硫酸化するとともにＮ−脱硫酸化し、その後、再度Ｎ−硫酸化することによって生じたものであり、別の試料は、アルカリ条件下で、選択的に２−Ｏ−脱硫酸化することによって得られたものである、前記の２つの試料、ヒト動脈から単離された低硫酸化ＨＳ、ならびにウシ腎臓由来のＨＳを用いて、偶数または奇数の短鎖長オリゴ糖を生成した。

【0011】

偶数のオリゴ糖は、亜硝酸での部分的脱アミノ化切断を通じた脱重合によって、ヘパリンから生じ、そして生じた２，４−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基を、ＮＡＢ^３Ｈ_４で還元した。標識オリゴ糖を分離して、４〜１４糖の偶数種、および２０〜２４糖を含有する分画を生成した。選択的に６−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンを同様に処理して、４〜１２糖を得た。単離され、そして脱塩されたオリゴ糖を穏やかな酸処理に供した。奇数ヘパリンオリゴ糖は、２０〜２４量体糖をヘパリナーゼＩでさらに処理することによって得られた。

【0012】

ヒト大動脈ＨＳから、Ｎ−アセチル化ＧｌｃＮ単位によって占められる部位での切断を伴う異なる戦略によって、４〜１４量体のオリゴ糖を生成した。試料をＮ−脱アセチル化し、そして次いで、亜硝酸で脱アミノ化した。この処理は、Ｎ−硫酸化ＧｌｃＮ単位を損なわれない（ｉｎｔａｃｔ）ままにする一方、非置換ＧｌｃＮ単位の脱アミノ化およびグルコサミン性（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｉｃ）連結の切断を導く。産物には、ＧｌｃＡ−［１−^３Ｈ］ａＭａｎ_Ｒ二糖（（−ＧｌｃＮＡｃ）−（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮａｃ）_ｎ−配列に由来）およびＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳＯ_３−ＨｅｘＡ）_ｎ−［１−^３Ｈ］ａＭａｎ_Ｒオリゴ糖（（−ＧｌｃＮａｃ）−ＧｌｃＡ−（ＧｌｃＮＳＯ_３−ＨｅｘＡ）_ｎ−ＧｌｃＮａｃ−配列に由来）が含まれる。

【0013】

これらの処理によって生じるオリゴ糖は、短く、そしてかつそれらの調製プロセスによって化学的に修飾されており、これによって、それらは本発明のＨＳとは区別される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】ＷＯ２０１０／０１１１８５

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Ｐａｕｌ Ｍａｒｔｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６（７５）１９９７

【非特許文献2】Ｂｒｉｃｋｍａｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏ． ８ Ｎｏ． ５ ｐｐ． ４６３−４７１， １９９８）

【非特許文献3】Ｍａｃｃａｒａｎａら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｖｏｌ． ２６８， Ｎｏ．３２， 第１５号， ｐｐ２３８９８−２３９０５， １９９３）

【発明の概要】

【0016】

本発明は、ヘパラン硫酸調製物、ヘパラン硫酸ＨＳ８に関する。ＨＳ８は、ＦＧＦ２に結合し、そして幹細胞の多能性／多分化能を維持しながら、幹細胞の増殖を増進させることが見出されてきている。ＨＳ８は、構造的および機能的に関連する単離ヘパラン硫酸の新規クラスを指す。本発明者らは、短いコンセンサス配列（ＹＣＫＮＧＧＦ）を共有するＦＧＦ２由来のヘパリン結合ドメインに結合する共通の特性を有する、いくつかの緊密に関連するＨＳ８クラスメンバーを同定してきている。ＨＳ８クラスのメンバーは、幹細胞の増殖を刺激し、そしてコロニー形成単位に関して濃縮することが可能である。

【0017】

本発明の１つの側面において、ヘパラン硫酸ＨＳ８を提供する。ＨＳ８は、単離された形態または実質的に精製された形態で提供されてもよい。これは、ヘパラン硫酸構成要素が、少なくとも８０％のＨＳ８、より好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つである組成物を提供することを含んでもよい。

【0018】

好ましい態様において、ＨＳ８は、ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに結合可能である。ペプチドはこの配列の一端または両端に、１またはそれより多いさらなるアミノ酸配列を有してもよい。例えば、ペプチドは、この配列の一端または両端に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多いアミノ酸のいずれかを有することも可能である。

【0019】

いくつかの態様において、ＨＳ８は：
・ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）、または
・ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）
のいずれか１つのアミノ酸配列を有するかまたは該配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である。

【0020】

他の態様において、ポリペプチドはＦＧＦ２タンパク質である。いくつかの態様において、ＨＳ８は、配列番号１、２またはＦＧＦ２タンパク質のいずれかのアミノ酸配列を有するかまたは該配列からなるペプチドに、１００μＭ未満、より好ましくは５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、または１０μＭの１つ未満のＫ_Ｄで結合する。

【0021】

ＨＳ８は、本明細書に記載する本発明者らの方法論にしたがって、得られ、同定され、単離され、または濃縮されることも可能であり、該方法論は、以下の工程：
（ｉ）固体支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここでポリペプチドは、アミノ酸配列ＹＣＫＮＧＧＦを有するヘパリン結合ドメインを含む；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体の形成が可能になるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること；
（ｉｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を混合物の残りから分離すること；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカンを収集すること
を含むことも可能である。

【0022】

いくつかの態様において、支持体に付着するポリペプチドは
・ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）、または
・ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）
より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなることも可能である。

【0023】

本発明者らの方法論において、混合物は商業的に入手可能な供給源から得られるグリコサミノグリカンを含むことも可能である。１つの適切な供給源は、ヘパラン硫酸分画、例えば商業的に入手可能なヘパラン硫酸である。１つの適切なヘパラン硫酸分画は、ブタ腸粘膜由来のヘパリンの単離中に得られうる（例えばＣｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、時に、「Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ」と称される）。

【0024】

ヘパラン硫酸の他の適切な供給源には、任意の哺乳動物（ヒトまたは非ヒト）由来の、特に腎臓、肺または腸粘膜由来のヘパラン硫酸が含まれる。いくつかの態様において、ヘパラン硫酸は、ブタまたはウシ腸粘膜、腎臓または肺由来である。

【0025】

本発明の別の側面において、上記側面のいずれか１つに記載のＨＳ８およびＦＧＦ２タンパク質を含む組成物を提供する。
本発明の１つの側面において、上述の側面記載のＨＳ８を含む薬学的組成物または薬剤を提供する。該薬学的組成物または薬剤は、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤をさらに含んでもよい。

【0026】

いくつかの態様において、薬学的組成物は、治療法に使用するためのものであり、該治療法は、組織、例えば折れた骨の修復および／または再生を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物または薬剤は、ＦＧＦ２タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、薬学的組成物または薬剤は、間葉系幹細胞をさらに含んでもよい。

【0027】

本発明の別の側面において、医学的治療法において使用するためのＨＳ８を提供する。医学的治療法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒、組織の修復および／または再生、結合組織の修復および／または再生、骨の修復および／または再生、ならびに／あるいは哺乳動物またはヒトにおける骨の修復および／または再生の方法を含んでもよい。

【0028】

本発明の関連する側面において、医学的治療法において使用するための薬剤製造におけるＨＳ８の使用を提供する。いくつかの態様において、医学的治療法は、哺乳動物またはヒトにおいて、折れた骨の修復および／または再生を含む。

【0029】

本発明のさらなる側面において、バイオマテリアルおよびＨＳ８を含む生体適合性移植物または装具を提供する。いくつかの態様において、移植物または装具は、ＨＳ８でコーティングされている。いくつかの態様において、移植物または装具は、ＨＳ８で含浸されている。移植物または装具は、さらに、ＦＧＦ２タンパク質で、そして／または間葉系幹細胞でコーティングまたは含浸されていてもよい。

【0030】

本発明の別の側面において、生体適合性移植物または装具を形成する方法であって、バイオマテリアルをＨＳ８でコーティングするかまたは含浸させる工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、ＦＧＦタンパク質および間葉系幹細胞の一方または両方でバイオマテリアルをコーティングするかまたは含浸させる工程をさらに含む。

【0031】

本発明の別の側面において、患者において骨折を治療する方法であって、療法的有効量のＨＳ８を患者に投与する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、骨折周囲の組織にＨＳ８を投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、骨折周囲の組織にＨＳ８を注射する工程を含む。こうした方法において、ＨＳ８を、ＨＳ８および薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含む薬学的組成物または薬剤として製剤化してもよい。

【0032】

いくつかの態様において、方法は、ＦＧＦ２タンパク質を患者に投与する工程をさらに含んでもよい。こうした方法において、ＨＳ８およびＦＧＦ２タンパク質、ならびに薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含む薬学的組成物として、ＨＳ８およびＦＧＦ２タンパク質を製剤化してもよい。

【0033】

いくつかの態様において、方法は、間葉系幹細胞を患者に投与する工程をさらに含んでもよい。こうした方法において、ＨＳ８、ＦＧＦ２タンパク質および間葉系幹細胞の少なくとも２つを、ＨＳ８、ＦＧＦ２タンパク質および間葉系幹細胞の少なくとも２つ、ならびに薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含む薬学的組成物に製剤化してもよい。

【0034】

好ましくは、ＨＳ８、ＦＧＦ２タンパク質および間葉系幹細胞をそれぞれ、療法的有効量で提供する。いくつかの態様において、骨折を治療する方法は、ＨＳ８、および／またはＦＧＦ２タンパク質および／または間葉系幹細胞の療法的有効量を、ＨＳ８、および／またはＦＧＦ２タンパク質および／または間葉系幹細胞、ならびに薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含む薬学的組成物として製剤化する工程をさらに含み、ここで該薬学的組成物を患者に投与する。

【0035】

本発明の別の側面において、患者において骨折を治療する方法であって、バイオマテリアルおよびＨＳ８を含む生体適合性移植物または装具を、骨折部位でまたは骨折部位周囲で患者組織内に、外科的に移植する工程を含む、前記方法を提供する。

【0036】

いくつかの態様において、移植物または装具をＨＳ８でコーティングする。いくつかの態様において、移植物または装具をＨＳ８で含浸させる。いくつかの態様において、移植物または装具を、ＦＧＦ２タンパク質および間葉系幹細胞の１つまたは両方でさらに含浸させる。

【0037】

本発明のさらにさらなる側面において、こうした治療が必要なヒトまたは動物患者において、組織の修復、置換または再生のための方法であって：
（ｉ）間葉系幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＨＳ８と接触させて、前記細胞が組織を形成するために十分な期間、培養し；
（ｉｉ）前記組織を収集し；
（ｉｉｉ）前記組織を、傷害または疾患部位で、患者体内に移植して、患者において、組織を修復するか置換するかまたは再生する
工程を含む、前記方法を提供する。

【0038】

組織は結合組織、例えば骨、軟骨、腱、または脂肪であってもよい。いくつかの態様において、方法は、培養中、外因性ＦＧＦ２タンパク質と間葉系幹細胞を接触させる工程をさらに含む。

【0039】

本発明の別の側面において、ＨＳ８の存在下で間葉系幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養によって得られる組織を提供する。いくつかの態様において、組織は、ＨＳ８およびＦＧＦ２タンパク質の存在下で、間葉系幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養によって得られる。

【0040】

本発明のさらにさらなる側面において、あらかじめ決定した量のＨＳ８およびあらかじめ決定した量のＦＧＦ２を含む、部分のキットを提供する。キットは、あらかじめ決定した量のＨＳ８を含有する第一の容器、およびあらかじめ決定した量のＦＧＦ２を含有する第二の容器を含んでもよい。キットは、あらかじめ決定した量の間葉系幹細胞をさらに含んでもよい。医学的治療法において使用するためにキットを提供してもよい。医学的治療法は、ｉｎ ｖｉｖｏの創傷治癒、結合組織の修復および／または再生、骨の修復および／または再生、ならびに／あるいは哺乳動物またはヒトにおける骨の修復および／または再生の方法を含んでもよい。医学的治療を提供するため、ＨＳ８、ＦＧＦ２タンパク質および／または間葉系幹細胞を、別個に、連続して、または同時に投与するため、使用説明書とともに、キットを提供してもよい。

【0041】

本発明のさらなる側面において、医学的治療法で同時に、別個に、または連続して使用するための、療法的有効量の：
（ｉ）ＨＳ８；および以下の一方または両方
（ｉｉ）ＦＧＦ２タンパク質；
（ｉｉｉ）間葉系幹細胞
を含有する産物を提供する。医学的治療法は、ｉｎ ｖｉｖｏの創傷治癒、結合組織の修復および／または再生、骨の修復および／または再生、ならびに／あるいは哺乳動物またはヒトにおける骨の修復および／または再生の方法を含んでもよい。産物は、場合によって、同時投与のための組み合わせ調製物として製剤化されてもよい。

【0042】

本発明の１つの側面において、皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのヘパラン硫酸ＨＳ８を提供する。本発明の別の側面において、皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するための薬剤製造における、ヘパラン硫酸ＨＳ８の使用を提供する。本発明の別の側面において、皮膚の修復および／または再生の療法的方法であって、治療が必要な被験体に、ヘパラン硫酸ＨＳ８を投与する工程を含む、前記方法を提供する。

【0043】

いくつかの態様において、療法的方法は、場合によって皮膚火傷、潰瘍、切除創傷、切り傷、刺し傷または穿刺傷より選択される、皮膚創傷または瘢痕の治療を含んでもよい。いくつかの態様において、療法的方法は、皮膚移植治癒、皮膚再構築、または皮膚形成手術を含んでもよい。

【0044】

本発明の別の側面において、皮膚創傷を治癒させる方法であって、ＨＳ８を含む薬学的組成物の有効量と皮膚創傷を接触させる工程を含む、前記方法を提供する。本発明の別の側面において、皮膚創傷を治癒させる方法において使用するためのヘパラン硫酸ＨＳ８であって、該方法が、ＨＳ８を含む薬学的組成物の有効量と皮膚創傷を接触させる工程を含む、前記ＨＳ８を提供する。本発明の別の側面において、皮膚創傷を治癒させる方法において使用するための薬剤製造におけるヘパラン硫酸ＨＳ８の使用であって、該方法が、ＨＳ８を含む薬学的組成物の有効量と皮膚創傷を接触させる工程を含む、前記使用を提供する。

【0045】

本発明の別の側面において、皮膚創傷を有する被験体を治療する方法であって、ヘパラン硫酸ＨＳ８の療法的有効量を、被験体に投与して、創傷での皮膚の修復および／または再生を導く工程を含む、前記方法を提供する。本発明の別の側面において、皮膚創傷を有する被験体を治療する方法において使用するためのヘパラン硫酸ＨＳ８であって、該方法が、ヘパラン硫酸ＨＳ８の療法的有効量を、被験体に投与して、創傷での皮膚の修復および／または再生を導く工程を含む、前記ＨＳ８を提供する。本発明の別の側面において、皮膚創傷を有する被験体を治療する方法において使用するための薬剤製造におけるヘパラン硫酸ＨＳ８の使用であって、該方法が、ヘパラン硫酸ＨＳ８の療法的有効量を、被験体に投与して、創傷での皮膚の修復および／または再生を導く工程を含む、前記使用を提供する。

【0046】

いくつかの態様において、皮膚創傷は、皮膚火傷、潰瘍、切除創傷、切り傷、刺し傷または穿刺傷である。
本発明の別の側面において、皮膚移植、皮膚再構築または皮膚形成手術の方法であって、移植、再構築または形成手術の領域のまたは該領域に隣接した皮膚を、ＨＳ８を含む薬学的組成物の有効量と接触させる工程を含む前記方法を提供する。本発明の別の側面において、皮膚移植、皮膚再構築または皮膚形成手術の方法において使用するためのヘパラン硫酸ＨＳ８であって、該方法が、移植、再構築または形成手術の領域のまたは該領域に隣接した皮膚を、ＨＳ８を含む薬学的組成物の有効量と接触させる工程を含む、前記ＨＳ８を提供する。本発明の別の側面において、皮膚移植、皮膚再構築または皮膚形成手術の方法において使用するための薬剤製造におけるヘパラン硫酸ＨＳ８の使用であって、該方法が、移植、再構築または形成手術の領域のまたは該領域に隣接した皮膚を、ＨＳ８を含む薬学的組成物の有効量と接触させる工程を含む、前記使用を提供する。

【0047】

本発明の別の側面において、皮膚における瘢痕不含創傷治癒の方法において使用するためのＨＳ８を提供する。本発明の別の側面において、皮膚における瘢痕不含創傷治癒の方法において使用するための薬剤製造におけるＨＳ８の使用を提供する。本発明の別の側面において、皮膚における瘢痕不含創傷治癒の方法であって、治療が必要な被験体に、ヘパラン硫酸ＨＳ８を投与する工程を含む、前記方法を提供する。

【0048】

本発明の別の側面において、被験体における真皮または上皮創傷を治療するための方法であって、被験体に、ＨＳ８を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。本発明の別の側面において、被験体における真皮または上皮創傷を治療するための方法において使用するためのヘパラン硫酸ＨＳ８を提供する。本発明の別の側面において、被験体における真皮または上皮創傷を治療するための方法において使用するための薬剤製造におけるヘパラン硫酸ＨＳ８の使用を提供する。

【0049】

いくつかの態様において、局所または経皮投与のために、ＨＳ８、あるいはＨＳ８を含有する薬剤または薬学的組成物を製剤化してもよい。いくつかの態様において、ＨＳ８、あるいはＨＳ８を含有する薬剤または薬学的組成物を、ジェル、スプレー、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、膏薬（ｓａｌｖｅ）、オイル、水溶液、懸濁物、分散物、パッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング剤、デポ剤またはリザーバーとして製剤化してもよい。

【0050】

いくつかの態様において、方法／治療は、増殖因子、好ましくはＦＧＦ２、および／または間葉系幹細胞の投与をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、ＨＳ８、あるいは薬剤または薬学的組成物は、増殖因子、好ましくはＦＧＦ２と、および／または間葉系幹細胞と共に組み合わせ調製物として製剤化される。

【0051】

本発明のさらなる側面を以下に示す。
本発明の１つの側面において、ＦＧＦ２に対して高い結合アフィニティを有するＧＡＧを提供する。より好ましくは、ＧＡＧはヘパラン硫酸（ＨＳ）である。１つの態様において、ブタ腸粘膜（Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、米国シンシナティより入手可能、例えばＩＮＷ−０８−０４５、ヘパラン硫酸Ｉ、Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂ Ｉｎｃ、ＨＯ−０３１０２、ＨＯ−１０５９５、１０ｘ１００ｍｇ）から得られるＧＡＧ混合物から、本明細書記載の方法論にしたがうことによって、ＨＳを単離し、ここで、ＹＣＫＮＧＧＦのアミノ酸配列を含有するＦＧＦ２のヘパリン結合ドメインを含むポリペプチドを、固体支持体に付着させ、そしてＧＡＧ−ポリペプチド複合体を形成させる。ＧＡＧ−ポリペプチド複合体からのＧＡＧ構成要素の解離は、「ＨＳ８」と称される、本明細書のユニークなＨＳの単離を導いた。１つの態様において、ＨＳ８は、ポリペプチドＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）を固体支持体に付着させて、ＧＡＧ−ポリペプチド複合体を形成させ、そしてＧＡＧ−ポリペプチド複合体からＧＡＧ構成要素を解離させることによって単離されるＨＳである。

【0052】

ＨＳ８は、哺乳動物（ヒトおよび非ヒト）組織および／または細胞外マトリックスを含む複数の供給源から得られるＨＳ分画から得られうると本発明者らは考える。
したがって、本発明の１つの側面において、ＨＳ８を提供する。ＨＳ８は、単離型または精製型であってもよい。別の側面において、ＨＳ８を含む培地を提供する。

【0053】

本発明のさらに別の側面において、ＨＳ８を含む薬学的組成物または薬剤を、場合によって薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と組み合わせて、提供する。いくつかの態様において、薬学的組成物または薬剤は、ＦＧＦ２タンパク質をさらに含んでもよい。傷害または疾患の防止または治療において使用するためのＨＳ８を含む薬学的組成物または薬剤を提供する。傷害または疾患の防止または治療のための薬剤製造におけるＨＳ８の使用もまた提供する。

【0054】

本発明のさらなる側面において、治療が必要な患者において傷害または疾患を防止するかまたは治療する方法であって、患者に、有効量のＨＳ８を投与する工程を含む、前記方法を提供する。投与するＨＳ８は、適切な薬学的組成物または薬剤に製剤化されてもよく、そして薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤をさらに含んでもよい。場合によって、薬学的組成物または薬剤はまた、ＦＧＦ２タンパク質も含んでもよい。

【0055】

本発明の別の側面において、骨形成（骨細胞および／または骨組織の形成）を促進するかまたは阻害する方法であって、骨前駆細胞または骨幹細胞にＨＳ８を投与する工程を含む、前記方法を提供する。

【0056】

本発明の別の側面において、軟骨組織形成（軟骨形成）を促進するかまたは阻害する方法であって、軟骨前駆細胞または軟骨幹細胞にＨＳ８を投与する工程を含む、前記方法を提供する。

【0057】

骨または軟骨前駆細胞または幹細胞を、ＨＳ８と、場合によって外因性に添加されたＦＧＦ２タンパク質の存在下で接触させることによって、骨形成または軟骨組織形成を刺激するかまたは阻害する方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよい。前駆細胞または幹細胞は、間葉系幹細胞であってもよい。組織形成を促進する場合、形成された組織を、ヒトまたは動物患者への移植のために収集し、そして用いてもよい。

【0058】

したがって、本発明の１つの側面において、ＨＳ８の存在下で（すなわち外因性ＨＳ８）、そして場合によってＦＧＦ２の存在下で（すなわち外因性ＦＧＦ２）、間葉系幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養することによって、結合組織を提供する。結合組織は、骨、軟骨、筋肉、脂肪、靱帯または腱であってもよい。

【0059】

ＨＳ８を用いた疾患の防止または治療は、組織、特に結合組織、例えば骨、軟骨、筋肉、脂肪、靱帯または腱の修復、再生または置換を伴ってもよい。
これらの組織の１つの悪化を有する患者において、悪化部位へのＨＳ８の投与を用いて、その部位での組織の成長、増殖および／または分化を刺激することも可能である。例えば、投与部位にまたはその近傍に存在する間葉系幹細胞の刺激は、好ましくはＦＧＦ２もまたその部位に存在する際に、間葉系幹細胞の増殖および適切な結合組織への分化を導き、それによって、損傷を受けた組織の置換／再生および傷害の治療を提供することも可能である。

【0060】

あるいは、ＨＳ８と接触させた間葉系幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養から得られる結合組織を収集し、そして傷害または疾患の部位に移植して、損傷を受けたまたは悪化した組織を置換することも可能である。損傷を受けたまたは悪化した組織を、場合によって、まず、傷害または疾患の部位から切除してもよい。

【0061】

別の側面において、幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞、およびＨＳ８を含有する薬学的組成物を提供してもよい。傷害、疾患または悪化の部位での組成物の投与、例えば注射は、その部位での組織の再生を提供する。

【0062】

したがって、ＨＳ８は、治療を必要とする患者への、場合によってＦＧＦ２および／または幹細胞と組み合わせた、ＨＳ８の直接適用によって達成される、組織修復、再生および／または置換（例えば瘢痕組織または折れた骨の治癒）を含む、ｉｎ ｖｉｖｏの創傷治癒において有用である。ＨＳ８は、組織修復、再生および／または置換が必要な患者への移植に適したｉｎ ｖｉｔｒｏ組織生成においてもまた有用である。

【0063】

本明細書に示すように、ＨＳ８は、ＦＧＦ２を安定化させる特性を有し、そしてそれによってその作用を延長させる。ＨＳ８は、ＦＧＦ２の培地中での分解を防止する（図４６）。これは、ＦＧＦ２調製物、およびＦＧＦ２含有培地の調製物の保存に有用に適用可能である。

【0064】

こうしたものとして、本発明の１つの側面において、増殖因子および単離ＨＳ８を含む組成物を提供する。増殖因子は、タンパク質増殖因子であってもよく、そして好ましくはＦＧＦ２である。組成物は、単離ＦＧＦ２および単離ＨＳ８を含んでもよい。いくつかの態様において、組成物は、培地であってもよい。他の態様において、組成物は、ＦＧＦ２を含有する薬学的組成物または薬剤であってもよい。

【0065】

組成物は、ＦＧＦ２および単離ＨＳ８を容器中に含む、ＦＧＦ２調製物であってもよい。適切な容器は、瓶、バイアル、試験管またはシリンジであってもよい。
増殖因子の安定性を増加させる方法であって、増殖因子を単離ＨＳ８と接触させる工程を含む、前記方法もまた提供する。

【0066】

増殖因子の安定性を、半減期、すなわち所定の組成中で、増殖因子の半分が分解され、そして／またはその活性を喪失するために掛かる時間の量で、測定することも可能である。増殖因子は、好ましくはタンパク質増殖因子、より好ましくはＦＧＦ２である。ＨＳ８は、ＦＧＦ２半減期を維持し、そして延長させるように作用する。該方法は、単離ＨＳ８を増殖因子（例えばＦＧＦ２）と、例えば増殖因子（例えばＦＧＦ２）組成物の調製、その保存または輸送の一部として、ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる工程を伴ってもよい。あるいは、該方法は、単離ＨＳ８を増殖因子（例えばＦＧＦ２）と、例えば増殖因子（例えばＦＧＦ２）［組織中に天然に存在するかまたは組織に外因性に添加される］が存在する組織に、単離ＨＳ８を投与することによって、接触させる工程を含むことも可能である。該方法はまた、外因性増殖因子（例えばＦＧＦ２）を組織に添加する工程も含んでもよい。

【0067】

単離ＨＳ８を含有する（または単離ＨＳ８が添加されている）所定の組成物または組織中のＦＧＦ２の安定性を、ＨＳ８を含有しない（または単離ＨＳ８が添加されていない）匹敵する組成物に対して比較してもよい。上述の組成物および方法において、本明細書に記載するように、ＨＳ８を精製してもよい。ＦＧＦ２は、単離および／または精製、非単離または部分的単離であってもよく、例えば細胞外マトリックス材料の一部であってもよいし、あるいは細胞の組成中に存在してもよい。単離または精製ＦＧＦ２は、組換えＦＧＦ２であってもよい。組換えＦＧＦ２は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；Ｇｉｂｃｏ；およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどのいくつかの製造者より商業的に入手可能である。

【0068】

場合によって、本発明の側面および態様には、ＨＳ１またはＨＳ２（Ｂｒｉｃｋｍａｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏ． ８ Ｎｏ． ５ ｐｐ． ４６３−４７１， １９９８およびＷＯ２０１０／０１１１８５に記載されるようなもの）は含まれない。いくつかの態様において、本発明記載のヘパラン硫酸には、ＨＳ２、および／または図２９記載の亜硝酸二糖消化プロファイルを有するヘパラン硫酸、および／または図３０記載の亜硝酸二糖消化プロファイルを有するヘパラン硫酸は含まれない。

【0069】

以下の番号付けした段落は、本明細書に開示する発明の技術的特徴の広い組み合わせの記載を含有する：
１． ヘパラン硫酸ＨＳ８。

【0070】

２． 単離された形態または実質的に精製された形態のヘパラン硫酸ＨＳ８。
３． アミノ酸配列ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）を有するかまたは該配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、段落１または２記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。

【0071】

４． ペプチドまたはポリペプチドが、アミノ酸配列ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）を有するかまたは該配列からなる、段落３記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。
５． 段落１〜４のいずれか１つに記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ８であって、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ８が：

【0072】

【化1】

【0073】

を含む二糖組成を有する、前記ＨＳ８。
６． 段落１〜４のいずれか１つに記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ８であって、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ８が：

【0074】

【化2】

【0075】

を含む二糖組成を有する、前記ＨＳ８。
７． （ｉ）固体支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここでポリペプチドは、アミノ酸配列ＹＣＫＮＧＧＦを有するヘパリン結合ドメインを含む；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体の形成が可能になるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること；
（ｉｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を混合物の残りから分離すること；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカンを収集すること
を含む方法によって得られる、段落１〜６のいずれか１つに記載の、ヘパラン硫酸ＨＳ８、あるいは単離された形態または実質的に精製された形態のヘパラン硫酸ＨＳ８。

【0076】

８． ポリペプチドが、ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）より選択されるアミノ酸配列を有するかまたは該配列からなる、段落７の方法。
９． グリコサミノグリカンを含む混合物が、ブタ腸粘膜から得られるヘパラン硫酸調製物である、段落７または８の方法。

【0077】

１０． 段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む組成物。
１１． 増殖因子、好ましくはＦＧＦ２をさらに含む、段落１０の組成物。
１２． 段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む薬学的組成物または薬剤。

【0078】

１３． ＦＧＦ２タンパク質および／または間葉系幹細胞をさらに含む、段落１２の薬学的組成物または薬剤。
１４． 医学的治療法において使用するための、段落１２または１３の薬学的組成物または薬剤。

【0079】

１５． 医学的治療法において使用するための、段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。
１６． 医学的治療法がｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒法を含む、段落１５記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。

【0080】

１７． 医学的治療法が、組織、好ましくは骨組織の修復および／または再生を含む、段落１５記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。
１８． 方法が、組織、好ましくは骨組織の修復および／または再生を含む、組織に対する疾患、状態または傷害の治療のための薬剤製造における、段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８の使用。

【0081】

１９． 患者において、組織に対する疾患、状態または傷害を治療する方法であって、患者に、療法的有効量のヘパラン硫酸ＨＳ８を投与して、組織、好ましくは骨組織の修復および／または再生を導く、前記方法。

【0082】

２０． 創傷、あるいは組織の再生または修復が必要な患者の体の位置のまたはその周囲の組織に、ヘパラン硫酸ＨＳ８を投与する工程を含む、段落１９の方法。
２１． 患者にＦＧＦ２タンパク質を投与する工程をさらに含む、段落１９または２０の方法。

【0083】

２２． 患者において、組織に対する疾患、状態または傷害を治療する方法であって、バイオマテリアルおよび段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む生体適合性移植物または装具を、疾患、状態または傷害の部位またはその周囲の患者組織に、外科的に移植して、組織の修復および／または再生を導く工程を含む、前記方法。

【0084】

２３． バイオマテリアル、および段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む、生体適合性移植物または装具。
２４． 生体適合性移植物または装具を形成する方法であって、バイオマテリアルを、段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８でコーティングするかまたは含浸させる工程を含む、前記方法。

【0085】

２５． 患者において、骨折を治療する方法であって、段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８の療法的有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法。
２６． 前記ヘパラン硫酸ＨＳ８を骨折周囲の組織に投与する工程を含む、段落２５の方法。

【0086】

２７． 前記ヘパラン硫酸ＨＳ８の投与が、骨折周囲の組織へのヘパラン硫酸の注射を含む、段落２５の方法。
２８． 前記ヘパラン硫酸が、ヘパラン硫酸および薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含む薬学的組成物または薬剤として製剤化される、段落２５〜２７のいずれか１つの方法。

【0087】

２９． 患者において、骨折を治療する方法であって、バイオマテリアル、および段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８の療法的有効量を含む、生体適合性移植物または装具を、骨折部位のまたは該部位周囲で患者組織内に外科的移植する工程を含む、前記方法。

【0088】

３６． あらかじめ決定した量の段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８、およびあらかじめ決定した量のＦＧＦ２を含む、部分のキット。
３７． 医学的治療法で同時に、別個に、または連続して使用するための、療法的有効量の：
（ｉ）段落１〜９のいずれか１つ記載のヘパラン硫酸ＨＳ８；および以下の一方または両方
（ｉｉ）ＦＧＦ２タンパク質；
（ｉｉｉ）間葉系幹細胞
を含有する産物。

【0089】

３８． 増殖因子、好ましくはＦＧＦ２の安定性を増加させる方法であって、増殖因子、好ましくはＦＧＦ２を、段落１〜９のいずれか１つに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させる工程を含む、前記方法。

【図面の簡単な説明】

【0090】

本発明の原理を例示する態様および実験を、ここで、付随する図を参照しながら論じる。

【図1】異なるＧＡＧ（５μｇ／ｍｌ）のＦＧＦ２（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）への結合を示すグラフ。ＦＧＦ２へのＨＳ８の優先的な結合が、０、２５、５０、および１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２濃度で観察された。データ線は、グラフの上部から下部へ：ＨＳ８＋（５μｇ／ｍｌ）（三角形）、ヘパリン（５μｇ／ｍｌ）（正方形）、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（５μｇ／ｍｌ）、ＨＳ８−（５μｇ／ｍｌ）、ＧＡＧなし（菱形）である。

【図2】ＦＧＦ２に対するＨＳ８（５μｇ／ｍｌ）の特異性を立証する、異なるタンパク質（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）へのＨＳ８＋結合（５μｇ／ｍｌ）を示すグラフ。データ線は、グラフの上部から下部へ：ＨＳ８＋／ＦＧＦ２（菱形）、ＨＳ８＋／ＦＧＦ１、ＨＳ８−／ＦＧＦ２、ＨＳ８＋／ＦＧＦ７、ＨＳ８＋／ＢＭＰ２、ＨＳ８＋／ＶＥＧＦ、ＳＡＢ／ＦＧＦ２、ＨＳ８＋／ＰＤＧＦＢＢである。

【図3】ＨＳ８処理に反応した、第６日の、ＳＴＲＯ１ヒト間葉系幹細胞数の用量依存性増加を示すグラフ。バーは、左から右に以下に相当する：対照、ＨＳ８＋ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ １００ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ ５００ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ １０００ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ ５０００ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ １００００ｎｇ／ｍｌ。

【図4】ＨＳ８＋ ５０００ｎｇ／ｍｌ（正方形）および対照（菱形）に反応した、６日間に渡るＳＴＲＯ１ヒト間葉系幹細胞の増殖を示すグラフ。

【図5】ＦＧＦ２ヘパリン結合ドメインペプチドを示す表。

【図6-1】［^３Ｈ］アッセイの結果を示すグラフ。（Ａ）異なる量のペプチドに関する分あたりの放射活性カウント（ＣＰＭ）を示すグラフ。（Ｂ）アフィニティクロマトグラフィによるＨＳ８プルダウンを示すグラフ。

【図6-2】［^３Ｈ］アッセイの結果を示すグラフ。（Ａ）異なる量のペプチドに関する分あたりの放射活性カウント（ＣＰＭ）を示すグラフ。（Ｂ）アフィニティクロマトグラフィによるＨＳ８プルダウンを示すグラフ。

【図7】ＧＡＧ結合アフィニティアッセイの配置を例示するダイアグラム。

【図8-1】ＦＧＦ２への異なるＧＡＧ濃度の結合の最適化を示すグラフ。（Ａ）ヘパリン（２．５、５、１０μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ２ ０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ−ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰ ２２０ｎｇ／ｍｌ。（Ｂ）ＨＳ８＋（２．５、５、１０μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ２ ０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ−ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰ ２２０ｎｇ／ｍｌ。（Ｃ）Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（２．５、５、１０μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ２ ０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ−ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰ ２２０ｎｇ／ｍｌ。（Ｄ）ＨＳ８（−）（２．５、５、１０μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ２ ０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ−ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰ ２２０ｎｇ／ｍｌ。

【図8-2】ＦＧＦ２への異なるＧＡＧ濃度の結合の最適化を示すグラフ。（Ａ）ヘパリン（２．５、５、１０μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ２ ０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ−ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰ ２２０ｎｇ／ｍｌ。（Ｂ）ＨＳ８＋（２．５、５、１０μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ２ ０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ−ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰ ２２０ｎｇ／ｍｌ。（Ｃ）Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（２．５、５、１０μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ２ ０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ−ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰ ２２０ｎｇ／ｍｌ。（Ｄ）ＨＳ８（−）（２．５、５、１０μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ２ ０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ−ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰ ２２０ｎｇ／ｍｌ。

【図9】ＦＧＦ２（０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌ）−ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰ ２２０ｎｇ／ｍｌへの異なるＧＡＧ（２．５μｇ／ｍｌ）の結合を示すグラフ。

【図10】異なるタンパク質に対する（Ａ）ＨＳ８（ＨＳ８＋）および（Ｂ）ＨＳ８（−）の結合を示すグラフ。（Ａ）異なるタンパク質ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／２２ｎｇ／ｍｌ ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰとＨＳ８＋ ５μｇ／ｍｌ。（Ｂ）異なるタンパク質ＳＡＢ／０．２％魚類ゼラチン／２２ｎｇ／ｍｌ ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ ＡＰとＨＳ８（−） ５μｇ／ｍｌ。

【図11-1】ヘパリンビーズアッセイの結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＧＦ２最適化。（Ｂ）外因性ヘパリンとのヘパリンビーズ競合。（Ｃ）異なるＧＡＧとヘパリンビーズの競合パーセント。

【図11-2】ヘパリンビーズアッセイの結果を示すグラフ。（Ａ）ＦＧＦ２最適化。（Ｂ）外因性ヘパリンとのヘパリンビーズ競合。（Ｃ）異なるＧＡＧとヘパリンビーズの競合パーセント。

【図12】ＳＴＲＯ１（ｐ７）増殖アッセイの結果を示すグラフ。（Ａ）それぞれの日の生存細胞カウント。（Ｂ）累積細胞増殖。

【図13】ＨＭ２１（ｐ５）増殖アッセイの結果を示すグラフ。（Ａ）それぞれの日の生存細胞カウント。（Ｂ）累積細胞増殖。

【図14】ＳＴＲＯ１（ｐ７）およびＨＭ２１（ｐ５）増殖アッセイの結果を示すグラフ。（Ａ）ＨＳ８＋での第６日の生存細胞カウント。（Ｂ）培地交換の異なる時間間隔でのＳＴＲＯ１細胞増殖。

【図15】ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ）によって評価されるような、ＦＧＦ２に対する異なるＧＡＧの結合能を示すグラフ。ＨＳ８（ＨＳ８＋）分画は、ヘパリンとほぼ同程度によくＦＧＦ２に結合し、そして未精製（ｒａｗ）出発Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ８−フロースルーよりも優れて結合する。

【図16-1】ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ）によって評価されるような、ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）ＢＭＰ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦに対する異なるＧＡＧの結合能を示すグラフ。（Ａ）Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、（Ｂ）ＨＳ８、（Ｃ）ＨＳ８−分画、（Ｄ）ヘパリン。ＨＳ８（ＨＳ８＋）分画は、他のＨＢＧＦすべてよりも、そしてさらにヘパリンよりも優れてＦＧＦ２に優先的に結合する。ＨＳ８−および未精製出発Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳは、ＨＢＧＦのいずれにもほとんど優先性を示さない。

【図16-2】ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ）によって評価されるような、ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）ＢＭＰ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦに対する異なるＧＡＧの結合能を示すグラフ。（Ａ）Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、（Ｂ）ＨＳ８、（Ｃ）ＨＳ８−分画、（Ｄ）ヘパリン。ＨＳ８（ＨＳ８＋）分画は、他のＨＢＧＦすべてよりも、そしてさらにヘパリンよりも優れてＦＧＦ２に優先的に結合する。ＨＳ８−および未精製出発Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳは、ＨＢＧＦのいずれにもほとんど優先性を示さない。

【図17】３６時間に渡る、ＢｒｄＵ取り込みによって監視されるような、ＨＳ８（ＨＳ８＋）に対するヒト間葉系幹細胞の用量−反応を示すグラフ。ＨＳ８＋分画は、試験した他のＧＡＧよりも有意により高い刺激を提供する。

【図18】示した時間（日数）に渡る、Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ（ＦＡＣＳに基づく）法によって監視されるような、ＨＳ８（ＨＳ８＋）（上部）およびＦＧＦ２（下部）に対するヒト間葉系幹細胞の用量−反応を示すグラフ。投与陽性対照としてＦＧＦを用いる（下部グラフ）。ＨＳ８は、有意な刺激を提供する。

【図19】示した時間（日数）に渡る、Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ（ＦＡＣＳに基づく）法によって監視されるような、増加する濃度の異なるＧＡＧに対するヒト間葉系幹細胞の用量−反応を示すグラフ。ＨＳ８（ＨＳ８＋）は、より高い細胞数になる傾向がある。

【図20】最長７継代までの、Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ（ＦＡＣＳに基づく）細胞計数法によって監視されるような、増加する濃度の異なるＧＡＧに対するヒト間葉系幹細胞の用量−反応を示すグラフ。ＦＧＦ２は、単独で最高の刺激を生じ；両濃度のＨＳ８（ＨＳ８＋）は、ヘパリン同様、より高い細胞数になる傾向がある。

【図21-1】以下のマーカーに基づく、ｈＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ）幹細胞の代表的なＦＡＣＳ免疫表現型決定の結果の例示：（Ａ）陰性マーカー：ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、および（Ｂ）陽性マーカー：ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ４９ａ。

【図21-2】以下のマーカーに基づく、ｈＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ）幹細胞の代表的なＦＡＣＳ免疫表現型決定の結果の例示：（Ａ）陰性マーカー：ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、および（Ｂ）陽性マーカー：ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ４９ａ。

【図22】非補充（対照）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）、ＨＳ８−、未精製Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（ＣＨＳ）、またはＦＧＦ２単独において、７継代に渡って増殖させたＦＡＣＳ免疫表現型決定ｈＭＳＣ幹細胞の定量化表。表は、適切な細胞表面マーカー：ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４、ＳＴＲＯ−１を発現する細胞の割合を示す。

【図23-1】非補充（対照）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）、ＨＳ８−、未精製Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、またはＦＧＦ２（２．５ｎｇ／ｍｌ）単独中、４〜７継代で増殖させたＦＡＣＳ免疫表現型決定ｈＭＳＣ幹細胞のグラフ提示。（Ａ）ＣＤ４９ａ、（Ｂ）ＳＳＥＡ−４、（Ｃ）ＳＴＲＯ−１。

【図23-2】非補充（対照）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）、ＨＳ８−、未精製Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、またはＦＧＦ２（２．５ｎｇ／ｍｌ）単独中、４〜７継代で増殖させたＦＡＣＳ免疫表現型決定ｈＭＳＣ幹細胞のグラフ提示。（Ａ）ＣＤ４９ａ、（Ｂ）ＳＳＥＡ−４、（Ｃ）ＳＴＲＯ−１。

【図24】（Ａ）非補充（対照）、ヘパリン、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ＨＳ８−、およびＨＳ８（ＨＳ８＋）を含有する培地中、４〜７継代（Ｐ４、Ｐ７）で増殖させたｈＭＳＣの培養後のｈＭＳＣ ＣＦＵアッセイの（Ａ）グラフ提示および（Ｂ）培養プレートの顕微鏡写真。

【図25】非補充（対照）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）、ＨＳ８−、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ヘパリンおよびＦＧＦ２を含有する培地中、４〜７継代（Ｐ４、Ｐ７）で増殖させたｈＭＳＣの培養後の、骨（上部、アリザリンレッド）および脂肪（下部、オイルレッドＯ）細胞に分化するｈＭＳＣの能力を示す顕微鏡写真。

【図26】ＨＳ８は、ＦＧＦ−２が仲介するＭＳＣ増殖を増進させる。正常維持（対照）培地、または多様な用量のＨＳ８（μｇ／ｍｌ）および固定用量のＦＧＦ−２（０．１５６ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中、４日間培養した後の、ｈＭＳＣの細胞数を示すグラフ。

【図27】ＨＳ８は、ＦＧＦ−２シグナル伝達を維持する。ＨＳ８および／またはＦＧＦ−２での刺激の３０分および２４時間後のＥＲＫ１／２リン酸化およびＦＲＳ２ａリン酸化を示すウェスタンブロット。

【図28】ヒトＦＧＦ２のアミノ酸配列。配列番号１を下線で示す。

【図29】Ｅ１０神経上皮由来のヘパラン硫酸の亜硝酸由来二糖組成物（ＨＳ２）。放射標識ＨＳ２を低ｐＨ ＨＮＯ_２での脱アミノ切断によって脱重合した。ＧＡＧのＨＮＯ_２処理後に二糖を単離し、そして次いで、試料を１ｘ１２０ｃｍ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２カラム上に流した。生じた二糖をＳＡＸ−ＨＰＬＣによって分画した。ピーク下面積を積分して、二糖組成を得て、そして続いて、各試料中の組成パーセントを得た。

【図30】ヘパリンリアーゼ処理後のＥ１０神経上皮由来のヘパラン硫酸の二糖組成（ＨＳ２）。ヘパラン硫酸を、ヘパランリアーゼの混合物で、完全に脱重合した。生じた不飽和二糖をＰ−２カラム上で単離し、そして強陰イオン交換カラムクロマトグラフィによって分画した。生じた曲線各々の下の面積を積分して、各試料中の各二糖の割合を計算した。数値は、２回の実行（初代ＧＡＧ試料に関して）および３回の実行（２．３Ｄ由来試料に関して）の平均を示す。９７％を超える二糖を、各試料から回収した。

【図31】Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ＨＳ８およびＨＳ３の１^Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ溶液）。

【図32】Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ＨＳ８およびＨＳ３の１^Ｈ ＮＭＲのクローズアップ（Ｄ_２Ｏ溶液）。

【図33】２ｘＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラムで分離し、５０ｍＭ酢酸アンモニウムで溶出させた、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ ＃１０６９７およびＨＳ８のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩクロマトグラム。

【図34】ヘパラン硫酸のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩクロマトグラム：Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ ＃１０６９７；保持されないＢＭＰ２（８４８／ＨＳ３／００１）；保持されるＢＭＰ２（ＨＳ３）（８４８／ＨＳ３／００１）；最初の実行（ＨＳ３−００１−０１）；最後の実行（ＨＳ３−００１−０２）。ＨＳ３調製物は、約１５ｍｌで高いピーク（０．０６〜０．０８）を示す。

【図35】ＣｅｌｓｕｓのＨＳ調製物ＨＳ ＃１０６９７およびＨＳ ＃１０５９５のヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ消化物のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩ。ヘパリンリアーゼ消化を二連で行った。垂直線は、２より大きい重合度合い（ｄｐ）での二糖およびオリゴ糖の溶出に関するカットオフを示す。

【図36】２ｘＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラム、５０ｍＭ酢酸アンモニウムで溶出させた、ＨＳ８（１８〜２０ｍｌでの広いピーク）、ＨＳ３−００１−０１（１９〜２０ｍｌでのピーク）のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩクロマトグラム。

【図37】ヘパリン結合性の配列番号１を示すグラフ。

【図38】ＨＳ８が固定されたヘパリンに結合する能力を示すグラフ。

【図39】アフィニティクロマトグラフィ（配列番号１で誘導体化されたカラム）によって精製されたＨＳ８に、ＦＧＦ−２が結合する能力を示すグラフ。これを、未精製出発ＨＳ（ＨＳ−ＰＭブタ粘膜）、または糖不含対照との結合に比較した。

【図40】ＨＳ８の存在下で６日間に渡るプラスチック接着性間葉系幹細胞の増殖を示すカラム。

【図41】未精製Ｃｅｌｓｕｓ出発ＨＳ（ＨＳ−ＰＭ）、または非結合性ＨＳフロースルー（ＨＳ８−）に比較した際の、単離ＨＳ８の存在下で３６時間に渡る、ＳＴＲＯ−１単離間葉系幹細胞のＢｒＤＵによって測定した際の増殖を示すグラフ。

【図42】Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳに関する規準化二糖組成物を示すグラフ。同じ試料に対する先の分析に対する、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳロット＃１０６９７の消化の比較。

【図43】ＨＳ３に関する規準化二糖組成物を示すグラフ。ＨＳ３−００１−０１の消化の比較。

【図44】Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ＨＳ８およびＨＳ３の二糖組成を示すグラフ。

【図45】Ｃｅｌｓｕｓ、ＨＳ、ＨＳ３およびＨＳ８の二糖組成割合を示す表。

【図46】ＨＳなし、ヘパリン、ＨＳ８、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（ＨＳＰＭ）またはＨＳ８−の存在下で、ＦＧＦ−２の安定性を示すグラフ。ＦＧＦ−２は、ＨＳ８の存在下で安定化される。

【図47】ＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ１阻害剤）が、ｈＭＳＣのＨＳ８刺激性増殖をブロックすることを示すグラフ。

【図48】ＩＭＢ−Ｒ１（ＦＧＦＲ１中和抗体）が、ｈＭＳＣのＨＳ８刺激性増殖をブロックすることを示すグラフ。

【図49】ＩＭＢ−Ｒ１（ＦＧＦＲ１中和抗体）が、ｈＭＳＣのＨＳ８刺激性増殖をブロックすることを示すグラフ。

【図50】ＦＧＦ２中和抗体が、ｈＭＳＣのＨＳ８刺激性増殖をブロックすることを示すグラフ。

【図51】ＨＳ８補充培地中で拡大させたヒトＭＳＣが、よりクローン原性であることを示すグラフ（３人の別個のドナー）。

【図52】ラット決定的サイズ頭蓋冠欠損モデルにおいて、ＨＳ８が骨治癒を有意に増進することを示す、グラフおよびマイクロＣＲＴ分析。

【図53】全層皮膚切除創傷（６ｍｍ生検パンチ）ブタモデルのＨＳ８を用いたおよび用いない治療の結果を示す写真。（Ａ）第０日の創傷、（Ｂ）キャリアー（ＣＭＣ）単独で処置したブタにおける第７日の創傷、および（Ｃ）キャリアー＋ＨＳ８（２５０μｇ／ｃｍ^３）で処置したブタにおける第７日の創傷。

【発明を実施するための形態】

【0091】

好ましい態様の説明
本発明者らは、ＨＳ８と称される、ヘパラン硫酸分子の新規クラスを同定した。本発明者らは、ＨＳ８が、以下の好適な特性を有することを示している：
・ＨＳ８は、ＳＴＲＯ１を発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を濃縮する（図１２、図１４）。

【0092】

・ＨＳ８は、ＳＴＲＯ−１陽性アフィニティ単離ＭＳＣおよびプラスチックへの接着によって単離されるＭＳＣの増殖増加を生じる（図１７、１８、１９、２０）。
・ＨＳ８を欠くヘパラン硫酸（ＨＳ８陰性分画）とは対照的に、ＨＳ８は、ヒトＭＳＣの国際的に認識される定義と一致する表面マーカー発現パターンを有するヒトＭＳＣ集団を濃縮する（図２２）；
・ＨＳ８とｈＭＳＣの培養は、高レベルのＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４およびＳＴＲＯ−１発現を有するヒトＭＳＣ集団を提供する（図２２）。対照的に、ｈＭＳＣへの培養補充物としてのＦＧＦ−２の添加は、ＳＴＲＯ−１を発現するｈＭＳＣの比率に負に影響を及ぼし、そしてｈＭＳＣの多分化能の喪失を生じる（図２２、２３および２５）。

【0093】

・ＨＳ８は、ＣＦＵ−Ｆ形成を増加させる；
・ＨＳ８は、ＦＧＦ−２が仲介するＭＳＣ増殖を増進させる；
・ＨＳ８は、ＦＧＦ−２が仲介するＥＲＫ経路のシグナル伝達を維持する。

【0094】

・ＨＳ８は、間葉系幹細胞の増殖を促進する（図４２および４３）。
ＨＳ８
本発明は、ＨＳ８と称されるヘパラン硫酸分子クラスに関する。ＨＳ８分子は、ＦＧＦ２のヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドに結合する、１またはそれより多いＧＡＧを含有する化合物の混合物を濃縮する方法によって得られうる。特に、ＨＳ８分子は、アミノ酸配列ＹＣＫＮＧＧＦを含むかまたは該配列からなるＦＧＦ２のヘパラン結合ドメインに結合するヘパラン硫酸に関して濃縮することによって得られうる。濃縮プロセスを用いて、ＨＳ８を単離することも可能である。

【0095】

本発明はまた、ＨＳ８が濃縮された化合物の混合物、およびこうした混合物を用いる方法にも関する。
本明細書に記載する方法論によって得られうることに加えて、ＨＳ８はまた、機能的にそして構造的にも定義されうる。

【0096】

機能的には、ＨＳ８は、ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するかまたは該配列からなるペプチドに結合可能である。該ペプチドは、ペプチドの一端または両端に１またはそれより多いさらなるアミノ酸を含有しうる。例えば、ペプチドは、ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）であってもよい。

【0097】

好ましくは、ＨＳ８は、１００μＭ未満、より好ましくは５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、または１０μＭの１つ未満のＫ_Ｄでペプチドに結合する。
好ましくは、ＨＳ８はまた、１００μＭ未満、より好ましくは５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、または１０μＭの１つ未満のＫ_ＤでＦＧＦ２タンパク質に結合する。ＨＳ８およびＦＧＦ２タンパク質の間の結合は、以下のアッセイ法によって決定可能である。

【0098】

ＦＧＦ２を３μｇ／ｍｌの濃度でブロッキング溶液（ＳＡＢ中の０．２％ゼラチン）中に溶解し、そしてブロッキング溶液中の０〜３μｇ／ｍｌの希釈シリーズを確立する。２００μｌのＦＧＦ２の各希釈を、ヘパリンでプレコーティングしたヘパリン／ＧＡＧ結合プレートの３つ組ウェルに分配して；３７℃で２時間インキュベーションし、ＳＡＢで３回注意深く洗浄し、そして２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化抗ＦＧＦ２の２００μｌをブロッキング溶液中に添加した。３７℃で１時間インキュベーションし、ＳＡＢで３回注意深く洗浄し、２２０ｎｇ／ｍｌのＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡＰの２００μｌをブロッキング溶液中に添加した。３７℃で３０分間インキュベーションし、ＳＡＢで３回注意深く洗浄し、そして軽く叩いて残った液体を取り除き、２００μｌの現像試薬（Ｓｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸）を添加する。室温で４０分間インキュベーションして、１時間以内に４０５ｎｍの吸光度を読み取る。

【0099】

このアッセイにおいて、結合は、吸光度を測定することによって決定されてもよく、そして添加されるヘパラン硫酸が存在しないＦＧＦ２タンパク質、またはＦＧＦ２タンパク質に結合しないヘパラン硫酸が添加されているＦＧＦ２タンパク質などの対照に比較して決定されてもよい。

【0100】

ＨＳ８の結合は、好ましくは、非特異的結合とは対照的に特異的であり、そしてＨＳ８が、配列番号１などのＹＣＫＮＧＧＦを含むペプチドと、またはＦＧＦ２タンパク質と高アフィニティ結合相互作用を示すヘパラン硫酸の選択を伴う方法によって、他のヘパラン硫酸および／またはＧＡＧから選択可能である背景におけるものである。

【0101】

本発明記載のＨＳ８は、好ましくは、多能性または多分化能を維持しながら、幹細胞の増殖を増加させる。
ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで完了するまで消化し、そして次いで生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供した後のＨＳ８の二糖組成を図４４および４５に示す。

【0102】

本発明記載のＨＳ８には、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで完了するまで消化し、そして次いで生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供することによって決定されるような、ＨＳ８保持種に関する図４５の、またはＨＳ８保持種に関する図４４の、各二糖に関して示される規準化パーセント値の±１０％（より好ましくは±９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％の１つ）以内の二糖組成を有するヘパラン硫酸が含まれる。

【0103】

ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで完了するまで消化し、そして次いで生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供することによって決定されるような、ＨＳ８の二糖組成は、以下のいずれか１つに記載の二糖組成を有することも可能である；

【0104】

【化3】

【0105】

または

【0106】

【化4】

【0107】

または

【0108】

【化5】

【0109】

または

【0110】

【化6】

【0111】

または

【0112】

【化7】

【0113】

または

【0114】

【化8】

【0115】

好ましい態様において、列挙する８つの二糖の総重量割合は、１００％である（場合によって±３．０％またはそれ未満、あるいは±２．０％またはそれ未満、±１．０％またはそれ未満、±０．５％またはそれ未満）。

【0116】

ＨＳ３と称される、増殖因子ＢＭＰ２に対して高アフィニティを有するとして単離されたＨＳ（ＷＯ２０１０／０３０２４４に記載される）とＨＳ８を比較することによって、ＨＳ３に比較したＨＳ８の構造的相違点は、以下の二糖の量によって特徴付けられることが明らかになる：ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６ＳおよびΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ。特に、ＨＳ８は、ＨＳ３よりもΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓのより高い組成割合を有し、そしてＨＳ３よりもΔＵＡ−ＧｌｃＮＳのより低い組成割合を有する。

【0117】

こうしたものとして、ＨＳ８は、１５．５±４．０またはそれ未満、あるいは±３．５またはそれ未満、あるいは±３．０またはそれ未満、あるいは±２．５またはそれ未満、あるいは±２．０またはそれ未満、±１．５またはそれ未満、あるいは±１．０またはそれ未満、あるいは±０．５またはそれ未満、あるいは±０．２５またはそれ未満、あるいは±０．１またはそれ未満のΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓの組成割合を有することによって特徴付けられうる。ＨＳ８は、さらに、またはあるいは、１５．７±４．０またはそれ未満、あるいは±３．５またはそれ未満、あるいは±３．０またはそれ未満、あるいは±２．５またはそれ未満、あるいは±２．０またはそれ未満、あるいは±１．５またはそれ未満、あるいは±１．０またはそれ未満、あるいは±０．５またはそれ未満、あるいは±０．２５またはそれ未満、あるいは±０．１またはそれ未満のΔＵＡ−ＧｌｃＮＳの組成割合を有することによって特徴付けられうる。

【0118】

ＨＳ８はまた、１２．７±１．５またはそれ未満、±１．０またはそれ未満、あるいは±０．５またはそれ未満、あるいは±０．２５またはそれ未満、あるいは±０．１またはそれ未満のΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓの組成割合を有することによって特徴付けられうる。

【0119】

ＨＳ８はまた、７．２±２．０またはそれ未満、±１．５またはそれ未満、±１．０またはそれ未満、あるいは±０．５またはそれ未満、あるいは±０．２５またはそれ未満、あるいは±０．１またはそれ未満のΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳの組成割合を有することによって特徴付けられうる。

【0120】

ＨＳ８はまた、６．５±１．５またはそれ未満、±１．０またはそれ未満、あるいは±０．５またはそれ未満、あるいは±０．２５またはそれ未満、あるいは±０．１またはそれ未満のΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓの組成割合を有することによって特徴付けられうる。

【0121】

ＨＳ８はまた、８．９±０．５またはそれ未満、あるいは±０．２５またはそれ未満、あるいは±０．１またはそれ未満のΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓの組成割合を有することによって特徴付けられうる。

【0122】

これらの態様において、残りの二糖構成要素の組成割合は、上に列挙した通り、あるいは図４４または４５に示す通り、±１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％の１つであってもよい。

【0123】

ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでのＨＳ８の消化および／または二糖のキャピラリー電気泳動分析は、好ましくは、実施例１８にしたがって行われる。
ＨＳ調製物のヘパリン・リアーゼ酵素での消化を、以下のように行うことも可能である：ＨＳ調製物（１ｍｇ）を各々、５００μＬの酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ酢酸カルシウムを含有する１００ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解し、そして各２．５ｍＵの３つの酵素を添加する；試料試験管を穏やかに反転しながら（９ｒｐｍ）試料を３７℃で一晩（２４時間）インキュベーションし；さらに各２．５ｍＵの３つの酵素を試料に添加し、試料試験管を穏やかに反転しながら（９ｒｐｍ）、３７℃でさらに４８時間インキュベーションし；加熱（１００℃、５分間）によって消化を停止し、そして次いで凍結乾燥し；消化物を５００μＬの水に再懸濁し、そしてアリコット（５０μＬ）を分析のため採取する。

【0124】

ＨＳ調製物の消化由来の二糖のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を、以下のように行うことも可能である：キャピラリー電気泳動操作緩衝液は、２０ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４の水溶液を、２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４．１２Ｈ_２Ｏの溶液に添加して、ｐＨ３．５にすることによって作製される；カラム洗浄液は１００ｍＭ ＮａＯＨ（５０％ｗ／ｗ ＮａＯＨより希釈）である；操作緩衝液およびカラム洗浄液はどちらも、０．２μｍ酢酸セルロース膜フィルターを取り付けたフィルター装置を用いて濾過される；二糖のストック溶液Ｉｓ（例えば１２）は、二糖を水（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解することによって調製される；標準の較正曲線は、１０μｇ／１００μＬの各二糖を含有するすべての標準を含有する混合物を調製することによって決定され、そして２．５μｇの内部標準（ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ，６Ｓ）を含み、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５μｇ／１００μｌを含有する希釈シリーズを調製する。ＨＳの消化物を水で希釈し（５０μＬ／ｍＬ）、そして同じ内部標準を各試料に添加する（２．５μｇ）。溶液を凍結乾燥し、そして水に再懸濁する（１ｍＬ）。ＰＴＦＥ親水性使い捨てシリンジフィルター装置を用いて、試料を濾過する。

【0125】

３０ｋＶのキャピラリー電圧とともに、２０ｍＭ操作緩衝液を用いて、２５℃で非コーティング融合シリカキャピラリーチューブ上、キャピラリー電気泳動装置を用いた分析を行う。水圧注入を用い、カソード（逆極性）端で、キャピラリーチューブに試料を導入する。各実行前に、キャピラリーを１００ｍＭ ＮａＯＨ（２分間）、水（２分間）でフラッシュし、そして操作緩衝液で前処理する（５分間）。緩衝液補充系は、入口および出口チューブの緩衝液を交換して、一定の体積、ｐＨおよびイオン強度が維持されることを確実にする。水のみのブランクを、試料配列の開始時、中間および終了時に流す。吸光度を２３２ｎｍで監視する。すべてのデータをデータベース中に保存し、そして続いて回収し、そして再プロセシングする。二つ組または三つ組消化／分析を行ってもよく、そしてＨＳ消化物中の二糖の規準化割合を、分析結果の平均として計算する。

【0126】

いくつかの態様において、ＨＳ８は、１８〜２７ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。いくつかの態様において、これは、２０〜２５ｋＤａ、２１〜２５ｋＤａ、２１〜２４ｋＤａ、２１〜２３ｋＤａ、２０〜２４ｋＤａ、２０〜２３ｋＤａ、または２０〜２２ｋＤａの１つであってもよい。

【0127】

いくつかの態様において、ＨＳ８鎖は、少なくとも２５の二糖単位を含む。いくつかの態様において、これは、少なくとも２６の二糖、少なくとも２７の二糖、少なくとも２８の二糖、少なくとも２９の二糖、少なくとも３０の二糖、少なくとも３１の二糖、少なくとも３２の二糖、少なくとも３３の二糖、少なくとも３４の二糖、少なくとも３５の二糖、少なくとも３６の二糖、少なくとも３７の二糖、少なくとも３８の二糖、少なくとも３９の二糖、少なくとも４０の二糖、少なくとも４１の二糖、少なくとも４２の二糖、少なくとも４３の二糖、または少なくとも４４の二糖の１つであってもよい。

【0128】

ＨＳ８を同定するため、本発明者らは、ヘパリン結合ドメインを有する特定のポリペプチドへの結合を示すグリコサミノグリカン分子を濃縮する工程を伴う方法を用いた。次いで、単離ＧＡＧ混合物および／または分子を同定し、そしてこれらが、ヘパリン結合ドメインを含有するタンパク質を発現している細胞および組織の増殖および分化を調節する能力に関して試験することも可能である。これによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、細胞および組織の増殖および分化に対する特定のＧＡＧ糖配列の影響の制御された分析が可能になる。この方法論は、本明細書に援用されるＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００４６９（ＷＯ２０１０／０３０２４４）に記載される。本発明者らは、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）に高い結合を有するＧＡＧを単離し、そして特徴付けるために、この方法論をＦＧＦ２に適用した。

【0129】

したがって、ＨＳ８を同定するため、本発明者らは、ヘパリン／ヘパラン結合ドメインを有するタンパク質に結合することが可能なグリコサミノグリカンを単離する方法であって：
（ｉ）支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここで、ポリペプチドがヘパリン結合ドメインを含む；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離すること；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させること；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカンを収集すること
を含む、前記方法を提供した。

【0130】

本発明者らはまた、これらが細胞または組織の増殖または分化を調節する能力によって同定される、単離グリコサミノグリカンも提供した。これを行うため、本発明者らは、細胞および／または組織の増殖および／または分化を刺激するかまたは阻害することが可能なグリコサミノグリカンを同定する方法であって：
（ｉ）支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここで、ポリペプチドがヘパリン結合ドメインを含む；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離すること；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させること；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカンを収集すること；
（ｖｉ）ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列を含有するタンパク質が存在する細胞または組織に、収集したグリコサミノグリカンを添加すること；
（ｖｉｉ）細胞の増殖、細胞の分化、１またはそれより多いタンパク質マーカーの発現の１またはそれより多くを測定すること
を含む、前記方法を提供した。

【0131】

本発明者らは、これらの方法を用いて、ＦＧＦ２に結合可能なＧＡＧ（これらをＨＳ８と呼ぶ）を同定し、本発明者らの方法論で用いたポリペプチドは、ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）のヘパリン結合ドメインを含んだ。

【0132】

本発明者らの方法論において、ＧＡＧを含む混合物は、合成グリコサミノグリカンを含有することも可能である。しかし、細胞または組織から得られるＧＡＧが好ましい。例えば、混合物は、細胞外マトリックスを含有してもよく、ここで、ｉｎ ｓｉｔｕで生存組織を掻き取ることによって（すなわち得られるヒトまたは動物体内の組織から直接）、あるいはヒトまたは動物の体から抽出されている組織（生存または死亡）から掻き取ることによって、細胞外マトリックス材料が得られる。あるいは、細胞外マトリックス材料を、培養中で増殖する細胞から得てもよい。細胞外マトリックス材料を、結合組織または結合組織細胞、例えば骨、軟骨、筋肉、脂肪、靱帯または腱から得てもよい。１つの態様において、ブタ粘膜由来の商業的に入手可能なヘパラン硫酸（Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ）を用いた。

【0133】

ＧＡＧ構成要素を、当業者に周知の一連のルーチンの分離工程（例えば陰イオン交換クロマトグラフィ）によって、組織または細胞試料または抽出物から抽出することも可能である。

【0134】

ＧＡＧ混合物は、異なるタイプのグリコサミノグリカンの混合物を含有し、これには、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびヘパラン硫酸が含まれることも可能である。好ましくは、固体支持体と接触するＧＡＧ混合物では、ヘパラン硫酸が濃縮されている。ＧＡＧ混合物に対してカラムクロマトグラフィ、例えば弱、中程度または強陰イオン交換クロマトグラフィ、ならびに強高圧液体クロマトグラフィ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）を行い、適切な分画を選択することによって、ヘパラン硫酸濃縮ＧＡＧ分画を得ることも可能である。

【0135】

ＧＡＧを同定するため、例えばＧＡＧ組成または配列を決定するため、あるいはＧＡＧの構造特性を決定するため、収集したＧＡＧをさらなる分析に供することも可能である。ＧＡＧ構造は典型的には非常に複雑であり、そして現在利用可能な分析技術を考慮すると、ＧＡＧ配列構造の正確な決定は、大部分の場合、不可能である。

【0136】

しかし、収集したＧＡＧ分子を部分的または完全糖消化（例えば亜硝酸によって化学的に、またはリアーゼ、例えばヘパリナーゼＩＩＩを用いて酵素的に）に供して、ＧＡＧの特徴的でありそしてかつ診断的である糖断片を得ることも可能である。特に、二糖（または四糖）を生じる消化を用いて、得られる各二糖の割合を測定することも可能であり、これは、ＧＡＧの特徴的な二糖「フィンガープリント」を提供するであろう。

【0137】

また、ＧＡＧの硫酸化のパターンを決定し、そしてこれを用いてＧＡＧ構造を決定することも可能である。例えば、ヘパラン硫酸に関して、アミノ糖での、そしてＣ２、Ｃ３およびＣ６位での硫酸化のパターンを用いて、ヘパラン硫酸を特徴付けることも可能である。

【0138】

二糖分析、四糖分析および硫酸化分析を、他の分析技術、例えば各々、ＧＡＧに関するユニークなスペクトルを提供可能であるＨＰＬＣ、質量分析、およびＮＭＲと組み合わせて用いることも可能である。組み合わせると、これらの技術は、ＧＡＧの定義構造特性を提供することも可能である。

【0139】

例えば、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（ここからＨＳ８を得た）およびＨＳ３（ＢＭＰ２結合性ＨＳ）を比較した、ＨＳ８の１^Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３１および３２に示す。本発明記載のＨＳ８は、図３１または３２のＨＳ８スペクトルに対応する１^Ｈ ＮＭＲスペクトルを有することも可能である。いくつかの態様において、本発明記載のＨＳ８は、４．０〜３．５ｐｐｍのスペクトルが図３２中のＨＳ８のもの（３．８〜３．７ｐｐｍの間の最上部の線）に対応する１^Ｈ ＮＭＲスペクトルを有することも可能である。いくつかの態様において、本発明記載のＨＳ８は、約３．８ｐｐｍでピークを、そして／または約３．７ｐｐｍでピークを有することも可能である。いくつかの態様において、ＨＳ８は、例えば図３２に示すような、ユニークなメチンおよび／またはメチレン１^Ｈ ＮＭＲスペクトルによって、他のＨＳ８から区別可能である。

【0140】

ＧＡＧおよびヘパリン結合ドメインの間の高アフィニティ結合相互作用は、ＧＡＧが高アフィニティ結合相互作用に寄与する特定の糖配列を含有するであろうことを示す。さらなる工程は、ＧＡＧの完全または部分的糖配列、あるいは結合相互作用に関与するＧＡＧの重要な部分の決定を含むことも可能である。

【0141】

ＧＡＧ−ポリペプチド複合体を、グリコサミノグリカン鎖を溶解する剤、例えばリアーゼでの処理に供することも可能である。リアーゼ処理は、ポリペプチドとの結合相互作用に関与しない、結合したＧＡＧの部分を切断することも可能である。ポリペプチドとの結合相互作用に関与するＧＡＧの部分はリアーゼ作用から保護されうる。リアーゼを除去した後、例えば洗浄工程後、ポリペプチドに結合したままであるＧＡＧ分子は、ポリペプチドの特異的結合パートナー（「ＧＡＧリガンド」）に相当する。より短いＧＡＧ分子はより低い複雑性を有するため、解離およびＧＡＧリガンド収集後、ＧＡＧリガンドのより高い度合いの構造的特徴付けが予期されうる。例えば、任意の糖配列（すなわち、ＧＡＧリガンド中に含有される単糖の一次（直鎖）配列）、硫酸化パターン、二糖および／または四糖消化分析、ＮＭＲスペクトル、質量分析スペクトルおよびＨＰＬＣスペクトルの任意の組み合わせが、ＧＡＧリガンドの高レベルの構造特性を提供することも可能である。

【0142】

本明細書において、用語「濃縮する」、「濃縮」、「濃縮された」等は、混合物の相対組成が、１またはそれより多くのこうした実体によって提供される混合物の割合が増加する一方、１またはそれより多くの異なる実体によって提供される混合物の割合が減少するように、改変される（またはされている）プロセス（または状態）を記載する。濃縮によって単離されるＧＡＧは、純粋である、すなわち実質的に１つのタイプのＧＡＧしか含有しないことも可能であるし、またはＧＡＧの異なるタイプの混合物であり続けることも可能であり、該混合物は、出発混合物に比較して、ヘパリン結合ドメインに結合する特定のＧＡＧのより高い比率を有する。

【0143】

同定されるＧＡＧは、好ましくは、ヘパリン結合ドメインを含有するタンパク質が発現されるかまたは含有される細胞または組織と接触させた際に、機能的影響を示す。機能的影響は、影響を調節するかまたは増強することも可能である。

【0144】

機能的影響は、特定のタイプの細胞の増殖または１つの細胞タイプの別のものへの分化、あるいは１またはそれより多いタンパク質マーカーの発現を促進する（刺激する）かまたは阻害することであることも可能である。例えば、ＧＡＧは、細胞増殖、すなわち細胞数の増加を促進するか、または幹細胞の特殊化細胞タイプへの分化（例えば間葉系幹細胞の結合組織への分化）を促進するか、細胞の多分化能または分化状態の指標となるタンパク質マーカーの発現（例えばアルカリホスファターゼ活性などのマーカー、ＲＵＮＸ２、オステリクス、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、Ｘ、オステオポンチン、オステオカルシン、ＢＳＰＩＩ、ＳＯＸ９、アグリカン、ＡＬＢＰ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰα）、脂肪細胞脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロプロテイン２（ＢＳＰＩＩ）、コラーゲン２ａ１（Ｃｏｌｌ２ａ）およびＳＯＸ９の検出）を促進するかまたは阻害することも可能である。

【0145】

本明細書において、用語「調節効果」は、第一の実体が第二の実体に有する効果であって、単数または複数の別のプロセスにおける第二の実体の正常な機能が、第一の実体の存在によって修飾される、前記効果を意味すると理解される。調節効果は、アゴニスト性またはアンタゴニスト性のいずれであることも可能である。

【0146】

調節効果は増強効果であることも可能である。用語「増強効果」は、強度を増加させる効果を意味すると理解される。本発明の好ましい態様において、用語「増強効果」は、第一の実体が第二の実体に対して有する効果であって、単数または複数の別のプロセスにおける第二の実体の強度を増加させる、前記効果を意味すると理解される。本発明のさらなる好ましい態様において、増強効果は、ヘパリン結合因子に対する単離ＧＡＧの効果を意味すると理解され、前記効果は、前記ヘパリン結合因子の強度を増加させる。

【0147】

本明細書において、「接触」プロセスは、２またはそれより多い別個の実体を緊密な物理的近傍に置くことを伴う。「接触」プロセスは、２またはそれより多い別個の実体を、分子レベルでこれらの２またはそれより多い別個の実体の部分が相互作用することを可能にするために十分な時間、および条件下で、緊密な近傍に置くことを伴う。好ましくは、本明細書において、「接触」プロセスは、１またはそれより多いＧＡＧおよびヘパリン結合因子のヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドを所持する化合物混合物を緊密な近傍に置くことを伴う。「接触」プロセスの例には、混合、溶解、膨張、洗浄が含まれる。好ましい態様において、ＧＡＧ混合物およびポリペプチドの「接触」は、共有的であることも可能であるが、好ましくは非共有的に、互いに高アフィニティを示すＧＡＧおよびポリペプチドの間で複合体が形成されるために十分である。

【0148】

ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを有する、選択されるタンパク質の全長またはほぼ全長一次アミノ酸配列を含むことも可能である。より長いポリペプチドではフォールディングが生じて、ＧＡＧ混合物からヘパリン結合ドメインのマスキングを導く可能性があるため、ポリペプチドは短いことが好ましい。好ましくは、ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを含むアミノ酸配列を有し、そして場合によって、ペプチドのＮおよびＣ末端の一方または各々に、１またはそれより多いアミノ酸を含むことも可能である。これらのさらなるアミノ酸は、固体支持体にポリペプチドを付着させるために必要な、ポリペプチドへのリンカーまたは付着分子の付加を可能にしうる。

【0149】

本発明者らの方法論の好ましい態様において、ヘパリン結合ドメイン中のアミノ酸の数に加えて、ポリペプチドは、１〜２０、より好ましくは１〜１０、さらにより好ましくは１〜５のさらなるアミノ酸を含有する。いくつかの態様において、ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％を構成する。固体支持体の表面にポリペプチドを付着させるため、ポリペプチドは、好ましくは、分子タグを含むよう修飾され、そして固体支持体表面は、該分子タグに対して高アフィニティを有する対応する分子プローブを取り込むように修飾され、すなわち分子タグおよびプローブは結合対を形成する。タグおよび／またはプローブは：抗体、細胞受容体、リガンド、ビオチン、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいはプローブが結合するかまたは別の方式で特異性を持って会合するように設計または設定されることも可能な任意の他の構造のいずれか１つより選択されることも可能である。タグおよびプローブとして使用するために適した好ましい結合対は、ビオチンおよびアビジンである。

【0150】

ポリペプチドは、関心対象のタンパク質に由来し、本発明の場合はＦＧＦ２である。「に由来する」によって、ポリペプチドが、関心対象のタンパク質中に存在するヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列を含有するため、該ポリペプチドが選ばれ、選択されまたは調製されることを意味する。ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、例えば、ＧＡＧ結合に対するヘパリン結合ドメイン配列の変化の影響を調べるため、関心対象のタンパク質に現れる形から修飾されていることも可能である。

【0151】

本明細書において、タンパク質はＦＧＦ２である。好ましいヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）［ヒトＦＧＦ２のアミノ酸１５７〜１７２に見られる］、または配列ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）を有する配列である。

【0152】

特定のポリペプチドのアミノ酸配列の小さな変動は、その部分の生得的な機能が維持されることを可能にしうることが、当業者によって理解される。ペプチド内の特定のアミノ酸残基の、等比体積のおよび／または等電子数の他のアミノ酸残基での置換が、未置換ペプチドの特定の特性を維持するかまたは改善するかいずれかでありうることもまた理解される。これらの変動もまた、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸アラニンは、ときに、ペプチドの１またはそれより多くの特性を維持しながら、アミノ酸グリシンに置換可能である（そしてその逆も可能である）。用語「等比体積」は、２つの実体間の空間的類似性を指す。中程度に上昇した温度で等比体積である部分の２つの例は、イソプロピルおよびｔｅｒｔ−ブチル基である。用語「等電子数」は、２つの実体間の電子類似性を指し、この１例は、２つの実体が同じまたは類似のｐＫａの官能性を所持する場合である。

【0153】

ヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドは、合成または組換えであることも可能である。
固体支持体は、分子が、直接または間接的に、共有または非共有結合のいずれかを通じて付着可能である表面を有する任意の支持体であることも可能である。固体支持体には、表面に付着するプローブに物理的支持を提供することが可能な任意の支持材料が含まれることも可能である。これはマトリックス支持体であることも可能である。材料は、一般的に、表面へのプローブの付着に関連する条件、およびアッセイ実行中に遭遇するいかなる続く処理、取り扱い、またはプロセシングにも耐えることが可能である。材料は、天然存在、合成、または天然存在材料の修飾であることも可能である。固体支持体は、プラスチック材料（ポリマー、例えばポリ（塩化ビニル）、シクロ−オレフィン・コポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたはテフロン（登録商標））、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル））等であることも可能であり、これら自体を用いるかまたは他の材料と組み合わせて用いることも可能である。さらなる剛性材料を考慮することも可能であり、例えばシリカを含むガラス、そしてさらに、例えばバイオガラスとして入手可能なガラスが含まれる。使用可能な他の材料には、多孔性材料、例えば制御孔ガラスビーズが含まれる。例えば表面上に取り込まれた、１またはそれより多い官能基、例えばアミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基を有することが可能な、当該技術分野に知られる任意の他の材料もまた意図される。

【0154】

好ましい固体支持体には、カラム表面上に固定されるポリペプチドを有するカラムが含まれる。表面は、カラムの壁であることも可能であり、そして／またはカラムの中央空間にパッケージングされたビーズによって提供されることも可能である。

【0155】

ポリペプチドを固体支持体上に固定することも可能である。固定法の例には：吸着、共有結合、捕捉および膜拘束が含まれる。本発明の好ましい態様において、ポリペプチドおよびマトリックスの間の相互作用は、実質的に永続性である。本発明のさらなる好ましい態様において、ペプチドおよびマトリックスの間の相互作用は、適切には、イオン交換クロマトグラフィに対して不活性である。好ましい配置において、ポリペプチドは、固体支持体表面に付着される。当業者は、化学的にそして／または物理的に２つの実体を互いに付着させるため、選択される非常に多様なオプションを有することが理解される。これらのオプションは、すべて、本発明の範囲内に含まれる。好ましい配置において、ポリペプチドは、ストレプトアビジンとビオチンの相互作用を通じて、固体支持体に吸着される。この配置の代表的な例では、ビオチン分子が、ポリペプチドに共有結合し、ビオチン−ポリペプチドコンジュゲートがストレプトアビジンに結合すると、ストレプトアビジンは次に、固体支持体に共有結合している。別の配置において、スペーサーまたはリンカー部分を用いて、ビオチン分子とポリペプチドを、そして／またはストレプトアビジンとマトリックスを連結することも可能である。

【0156】

ＧＡＧ混合物と固体支持体を接触させることによって、ＧＡＧ−ポリペプチド複合体が形成可能となる。固体支持体から混合物の残りを除去することによって、例えば固体支持体を洗浄して、非結合物質を溶出させることによって、これらを混合物の残りから分配する。カラムを固体支持体として用いる場合、ＧＡＧ混合物の非結合構成要素をカラムから溶出し、カラムに結合したＧＡＧポリペプチド複合体を残すことも可能である。

【0157】

特定のオリゴ糖は、非特異的方式でポリペプチドと相互作用する可能性もあることが理解される。特定の態様において、非特異的方式でポリペプチドと相互作用するオリゴ糖は、ヘパリン結合因子の影響を調節する１またはそれより多いＧＡＧが濃縮された化合物の混合物に含まれるか、または該混合物から排除されることも可能である。非特異的相互作用の例は、適切なサイズおよび／または形状の分子のポケット内の一時的な拘束である。さらに、これらのオリゴ糖は、ペプチドとまったく相互作用を示さないオリゴ糖よりもより緩慢に溶出する可能性もあることが理解される。さらに、非特異的に結合する化合物は、溶出させるために、特異的方式で（例えばイオン性相互作用を通じて）結合する化合物に関するものと同じ外部刺激の投入は必要としない可能性もあることが理解される。本発明者らの方法論は、オリゴ糖の混合物を：ポリペプチドと特異的様式で結合するもの；ポリペプチドと非特異的様式で結合するもの；およびポリペプチドと結合しないものの、その混合物の構成要素に分離することが可能である。これらの指摘は、各ＧＡＧ−ペプチド対に関して、操作的に定義される。

【0158】

ＧＡＧおよびポリペプチドの結合が起こる、固体支持体表面に存在する条件（例えば塩濃度）を変化させることによって、ヘパリン結合ドメインに対して最高のアフィニティおよび／または特異性を有するＧＡＧを選択することも可能である。したがって、関心対象のタンパク質および／または関心対象のタンパク質のヘパリン結合ドメインに対して高い結合アフィニティを有するＧＡＧを得ることも可能である。結合アフィニティ（Ｋ_ｄ）を：１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満の１つから選択することも可能である。

【0159】

記載する方法によって得られるＧＡＧは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏのある範囲の適用に有用である可能性もある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞または組織培養、あるいはｉｎ ｖｉｖｏの細胞または組織のいずれかにおいて、細胞または組織成長および／または増殖および／または分化の刺激または阻害に使用するために、ＧＡＧを提供することも可能である。

【0160】

ＧＡＧをこうした目的のための製剤として提供することも可能である。例えば、記載する方法によって得られるＧＡＧを含む、すなわちＨＳ８を含む培地を提供することも可能である。

【0161】

ＨＳ８の存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞または組織培養から得られる細胞または組織を収集し、そして治療が必要なヒトまたは動物患者内に移植することも可能である。したがって、細胞および／または組織の移植法であって：
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＨＳ８と接触させて、細胞および／または組織を培養し；
（ｂ）細胞および／または組織を収集し；
（ｃ）治療が必要なヒトまたは動物被験体内に細胞および／または組織を移植する
工程を含む、前記方法を提供することも可能である。

【0162】

ＨＳ８と接触させる部分（ａ）において、細胞または組織の成長、増殖または分化を可能にするために十分な期間、細胞を培養することも可能である。例えば、期間を：少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間または少なくとも４０日間から選択することも可能である。

【0163】

別の態様において、ＨＳ８を、傷害または疾患の防止または治療を含む、医学的治療法で使用するために製剤化することも可能である。ＨＳ８および薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアーまたはアジュバントを含む薬学的組成物または薬剤を提供することも可能である。こうした薬学的組成物または薬剤を、傷害または疾患の防止または治療のために提供することも可能である。傷害または疾患の防止または治療のための薬剤製造におけるＨＳ８の使用もまた提供する。場合によって、本発明記載の薬学的組成物および薬剤はまた、ＧＡＧが結合するヘパリン結合ドメインを有する関心対象のタンパク質（すなわちＦＧＦ２）も含有することも可能である。さらなる態様において、薬学的組成物および薬剤は、幹細胞、例えば間葉系幹細胞をさらに含むことも可能である。

【0164】

傷害または疾患の治療は、細胞または組織、例えば結合組織（例えば骨、軟骨、筋肉、脂肪、腱または靱帯）の修復、再生または置換を含むことも可能である。組織の修復のため、新規組織の成長、増殖および／または分化を刺激して、傷害の修復を達成するか、あるいは疾患状態を治癒させるかまたは軽減する（例えば症状の緩和を提供する）ために、ＨＳ８を含む薬学的組成物または薬剤を、傷害または疾患の部位に直接投与することも可能である。薬学的組成物または薬剤において、幹細胞を組み合わせることによって、組織の修復または再生を改善することも可能である。

【0165】

組織の置換のため、患者の傷害または疾患部位での移植用の細胞および／または組織を生成するために、細胞および／または組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中に、ＨＳ８を細胞および／または組織と接触させることも可能である。細胞または組織の移植を用いて、傷害または疾患組織の置換によって、患者において、傷害または疾患組織の修復を達成することも可能である。これは、傷害／疾患組織の切除、ならびにＨＳ８と接触させて細胞および／または組織を培養することによって調製された新規組織の移植を伴うことも可能である。

【0166】

本発明記載の薬学的組成物および薬剤は、したがって：
（ａ）ＨＳ８；
（ｂ）幹細胞と組み合わせたＨＳ８；
（ｃ）ＨＳ８によって結合されるヘパリン結合ドメイン（例えば配列番号１）を含有するタンパク質と組み合わせたＨＳ８；
（ｄ）幹細胞およびＨＳ８によって結合されるヘパリン結合ドメイン（例えば配列番号１）を含有するタンパク質と組み合わせたＨＳ８；
（ｅ）ＨＳ８と接触させた細胞または組織の培養から得られる組織または細胞
の１つを含むことも可能である。

【0167】

ＨＳ８を体性組織修復または再生、特に骨再生、神経再生、骨格組織構築、心臓欠陥傷害の修復ならびに胚性および成体幹細胞の拡大および自己再生に用いることも可能である。したがって、ＨＳ８を用いて、変形性関節症、軟骨置換、任意の種類の骨折（例えば椎間板固定治療、長骨骨折、頭蓋欠損）、決定的または癒着不能骨欠損再生を含む、広範囲の疾患および傷害を防止または治療することも可能である。

【0168】

組織の修復、再生または置換におけるＨＳ８の使用は、創傷治癒、例えば創傷治癒の加速、瘢痕または骨組織の治癒および組織移植における使用を伴うことも可能である。
別の側面において、本発明は、ＨＳ８を含む生物学的足場を提供する。いくつかの態様において、本発明の生物学的足場を、整形外科、血管、装具、皮膚および角膜適用に用いることも可能である。本発明が提供する生物学的足場には、長期放出薬剤送達デバイス、生体弁、生体弁膜（ｔｉｓｓｕｅ ｖａｌｖｅ ｌｅａｆｌｅｔｓ）、薬剤溶出ステント、血管移植片、創傷治癒または皮膚移植片、ならびに整形外科装具、例えば骨、靱帯、腱、軟骨、および筋肉が含まれる。本発明の好ましい態様において、生物学的足場は、内部（および／または外部）表面が、カテーテルに付着した１またはそれより多いＧＡＧ化合物（ＨＳ８を含む）を含むカテーテルである。

【0169】

別の側面において、本発明は、アジュバントとして使用するための、記載する方法によって単離された１またはそれより多いＧＡＧ（ＨＳ８を含む）を提供する。アジュバントは免疫アジュバントであってもよい。

【0170】

別の側面において、本発明は、１またはそれより多いＧＡＧを含む化合物の混合物を含む、薬学的に許容されうる製剤であって、前記混合物がＨＳ８に関して濃縮されている、前記製剤を提供する。別の側面において、本発明は、別個の、同時のまたは連続投与のための：
（ｉ）１またはそれより多いＧＡＧを含む化合物の混合物であって、ＨＳ８に関して濃縮されている、前記混合物；および
（ｉｉ）ＦＧＦ２
を含む、薬学的に許容されうる製剤を提供する。好ましい態様において、製剤は、１またはそれより多いＧＡＧを含む化合物の混合物であって、緊密に混合されているＨＳ８およびＦＧＦ２に関して濃縮されている、前記混合物を含み、そして治療が必要な患者に同時に投与される。

【0171】

本発明の別の側面において、組織の修復または再生において使用するためのキットであって、（ｉ）あらかじめ決定した量のＨＳ８、および（ｉｉ）あらかじめ決定した量のＦＧＦ２を含む、前記キットを提供する。

【0172】

本発明の濃縮された混合物の化合物を薬学的に許容されうる塩として被験体に投与することも可能である。例えば、本発明の濃縮された混合物の化合物の塩基塩には、限定されるわけではないが、薬学的に許容されうる陽イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムで形成されるものが含まれる。本発明には、その範囲内に、陽イオン性塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩が含まれる。カルボン酸基を所持する本発明の濃縮された混合物の化合物を、投与可能なプロドラッグの形で送達することも可能であることが認識され、ここで、酸部分はエステル化される（−ＣＯ２Ｒ’の形を有する）。用語「プロドラッグ」は、特に、−ＯＲ’基から−ＯＨ基、またはカルボン酸陰イオンへの、ｉｎ ｖｉｖｏでの変換に関する。したがって、本発明のプロドラッグは、細胞への薬剤吸着および／または薬剤送達を増進するよう作用することも可能である。プロドラッグのｉｎ ｖｉｖｏ変換は、細胞性酵素、例えばリパーゼおよびエステラーゼによって、または化学的切断、例えばｉｎ ｖｉｖｏエステル加水分解によって促進されることも可能である。

【0173】

本発明の側面にしたがった薬剤および薬学的組成物は、限定されるわけではないが、疾患または傷害の部位での注射を含む、多様な経路による投与のために製剤化されることも可能である。薬剤および組成物を液体または固体型で製剤化することも可能である。液体製剤は、ヒトまたは動物の体の選択される領域への注射による投与のために製剤化されることも可能である。

【0174】

投与は、好ましくは「療法的有効量」であり、これは個体への利益を示すために十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療しようとする傷害または疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量の決定等は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、治療しようとする障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法および医師に知られる他の要因を考慮に入れる。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第２０版， ２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。

【0175】

幹細胞
ＨＳ８と接触させる細胞には、幹細胞が含まれる。
ＨＳ８を、幹細胞の増殖および／または分化、ならびに／あるいは幹細胞の系譜拘束に用いることも可能である。

【0176】

本明細書において培養し、そして記載する幹細胞は、任意の種類の幹細胞であることも可能である。これらは、全能性または多分化能（多能性）であってもよい。これらは、任意の組織に由来する胚性または成体幹細胞であることも可能であり、そして造血幹細胞、神経幹細胞または間葉系幹細胞であることも可能である。好ましくはこれらは成体幹細胞である。

【0177】

本明細書において、幹細胞によって、分裂し（すなわち自己再生し）、そして全能性または多分化能（多能性）を維持し、そして特殊化細胞を生じさせる能力を有する、任意の細胞タイプを意味する。

【0178】

本発明において培養する幹細胞は、存在する培養から得られるかまたは由来するか、あるいは任意の成体、胚性または胎児性組織から直接得られてもよく、こうした組織には、血液、骨髄、皮膚、上皮または臍帯（通常廃棄される組織）が含まれる。

【0179】

幹細胞の多分化能は適切なアッセイを使用することによって決定可能である。こうしたアッセイは、１またはそれより多い多能性マーカー、例えばアルカリホスファターゼ活性、ＲＵＮＸ２、オステリックス、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、Ｘ、オステオポンチン、オステオカルシン、ＢＳＰＩＩ、ＳＯＸ９、アグリカン、ＡＬＢＰ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰα）、脂肪細胞脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロプロテイン２（ＢＳＰＩＩ）、コラーゲン２ａ１（Ｃｏｌｌ２ａ）およびＳＯＸ９を検出する工程を含むことも可能である。

【0180】

いくつかの好ましい態様において、幹細胞は、例えば結合組織および／または骨細胞、例えば軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞および脂肪細胞に分化することが可能な、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。

【0181】

間葉系幹細胞は、最小限に侵襲性である技術によって、骨髄から容易に得ることが可能であり、そしてこれを培養中で拡大して、所望の系譜への分化を可能にすることも可能である。特定の増殖因子の適用によって、分化を誘導することも可能である。トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーメンバータンパク質、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、間葉系幹細胞の軟骨形成および骨形成分化の重要な因子である。

【0182】

選択的マーカー、例えばＳＴＲＯ−１を用いて、骨髄再増殖に関する潜在能力を示すＣＤ３４＋分画から、間葉系幹細胞を単離し、そして検出することも可能である。これらの細胞表面マーカーは、間葉系幹細胞の細胞表面上でのみ見出され、そしてこれは、細胞の多能性の指標である。

【0183】

適切な間葉系幹細胞は、骨髄吸引物から収集される骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）（例えば、Ｗｅｘｌｅｒら 成体骨髄は、ヒト間葉系「幹」細胞の豊富な供給源であるが、臍帯および可動化（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）成体血液はそうではない ＨＡＥＭＯＰＯＩＥＳＩＳ ＡＮＤ ＬＥＵＣＯＣＹＴＥＳ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １２１ （２）：３６８−３７４， ２００３年４月）または臍帯のワルトンゼリー（例えばＴａら ワルトンゼリー由来間葉系幹細胞の長期拡大および多能性マーカーアレイ分析 Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ． ２００９年７月２０日（Ｅｐｕｂ））から得られるかまたはこれに由来することも可能である。

【0184】

当該技術分野において周知であるように、適切な分化因子を適用することによって、多能性幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞の分化によって、間葉系幹細胞を得ることも可能である。

【0185】

間葉系幹細胞は、軟骨、骨、筋肉、腱、靱帯、および脂肪の構成要素を生成する能力を持つ、多分化能（多能性）前駆細胞である。これらの原始的前駆細胞は、出生後に存在し、そして幹細胞特性を示し、すなわち出現率が低く、そして広範な再生潜在能力を持つ。これらの特性とその発生可塑性が組み合わさり、損傷を受けた組織を置換する潜在的な使用に多大な関心が生じてきている。本質的には、これらの幹細胞を培養して、その数を拡大し、次いで、傷害部位に移植するか、または足場中／上に植え付けた後、適切な組織構築物を生成することも可能である。

【0186】

したがって、骨格、筋肉、腱、靱帯および血液修復／再生のための代替アプローチは、特定の組織増殖因子の賢明な選択とともに、再生を支持し、そしてガイドする、伝導性または誘導性足場と組み合わせた、適切な前駆細胞、例えば骨の場合、骨前駆細胞（例えば間葉系幹細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、骨幹細胞または骨前駆細胞）の選択、拡大および調節である。

【0187】

任意の動物またはヒト、例えば非ヒト動物、例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類（齧歯類目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）の任意の動物由来の細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物；および／または非ヒト哺乳動物；および／またはヒトから幹細胞が得られうる。好ましくはこれらはヒトである。場合によってこれらは非ヒトである。場合によってこれらは非胚性幹細胞である。場合によってこれらは全能性ではない。

【0188】

本発明のさらにさらなる側面において、本発明の方法のいずれかによって生成された幹細胞または他の細胞、あるいはその断片または産物を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、医学的治療法において有用でありうる。適切な薬学的組成物は、さらに、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を含むことも可能である。

【0189】

本発明の別の側面において、本発明の任意の方法によって生成される幹細胞または他の細胞を、医学的治療法において使用することも可能であり、好ましくは、医学的治療法であって、治療が必要な個体に、療法的に有効な量の前記薬剤または薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。

【0190】

本発明記載の培養法および技術を通じて得られる幹細胞および他の細胞を用いて、医学的治療法において使用するための別の細胞タイプに分化させることも可能である。したがって、分化した細胞タイプは、分化することが続いて許可された、記載するような培養法および技術によって得られる幹細胞に由来し、そして幹細胞の産物として見なすことも可能である。場合によって薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤とともに、こうした分化した細胞を含む薬学的組成物を提供することも可能である。こうした薬学的組成物は、医学的治療法において有用でありうる。

【0191】

間葉系幹細胞
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、元来、骨髄から単離され、そして全部で１０４〜１０５の骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）のうちのわずか１つとして存在する（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら １９６６）。これらの細胞は、ＣＦＵ−Ｆ（コロニー形成単位線維芽細胞）集団をダビングする（ｄｕｂｂｅｄ）、単細胞前駆体に由来するコロニーを産生することが可能である。ＭＳＣは、現在、脂肪組織（ＧｉｍｂｌｅおよびＧｕｉｌａｋ ２００３；Ｚｕｋら ２００１）、臍帯血（Ｂｉｅｂａｃｋら ２００４；Ｅｒｉｃｅｓら ２０００；Ｇｏｏｄｗｉｎら ２００１；Ｋｏｇｌｅｒら ２００４；Ｗａｇｎｅｒら ２００５）および筋肉（Ｊｉａｎｇら ２００２）を含む、多くの他の組織において同定されてきている。

【0192】

多分化能ヒト間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の最小限の基準が、細胞療法に関する国際会議によって示されてきている（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（２００６） Ｖｏｌ．８， Ｎｏ．４， ３１５−３１７）。彼らは、ヒトＭＳＣを定義するために、３つの基準:プラスチックへの接着、特定の表面抗原発現および多分化能分化潜在能力を提唱する。特に、彼らは、「まず、ＭＳＣは、組織培養フラスコを用いた標準培養条件下で維持された際、プラスチック接着性でなければならない。第二に、≧９５％のＭＳＣ集団は、フローサイトメトリーによって測定された際、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現していなければならない。さらに、これらの細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の発現を欠いていなければならない（≦２％陽性）。第三に、細胞は、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ分化条件下で、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化可能でなければならない」と述べた。

【0193】

Ｄｏｍｉｎｉｃｉらはまた、ＭＳＣを最もユニークに同定する生物学的特性は、標準的ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養分化条件を用いて、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞への三系譜間葉系分化の能力であると述べた。彼らは、アリザリンレッドまたはフォンコッサ染色での染色によって、骨芽細胞への分化を立証可能であり、脂肪細胞分化は、オイルレッドＯでの染色によって最も容易に立証可能であり、そして軟骨芽細胞分化は、アルシアンブルーでの染色またはコラーゲンＩＩ型に関する免疫組織化学染色によって立証可能であることを確認した。Ｄｏｍｉｎｉｃｉらは、こうしたアッセイのためのキットが商業的に入手可能であり、そして分化の立証は、すべての研究者にとって容易であるはずであると述べる。

【0194】

Ｄｏｍｉｎｉｃｉらはまた、将来、ヒトＭＳＣを定義するためにやはり使用可能な新規表面マーカーが同定されうることも認識する。現在、３つのこうしたマーカー：ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４およびＳＴＲＯ−１が知られる。

【0195】

Ｒｉｄｅｒらは、ＣＤ４９ａ＋クローンが、ソーティングされていない細胞に比較して、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現を増進したことを報告し、そしてＣＤ４９ａ＋クローンが、ソーティングされていない細胞に比較して、脂肪、骨および軟骨への多系譜分化を容易に経ることを立証し、間葉系幹細胞の濃縮のためのアルファ−１インテグリン（ＣＤ４９ａ）選択の使用を支持し、そして骨髄単核幹細胞の不均一プールから最も多分化能である細胞を選択するための戦略を提供した（Ｒｉｄｅｒら Ｊ． Ｍｏｌ． Ｈｉｓｔ（２００７）３８：４４９−４５８）。Ｒｉｄｅｒらはまた、ＣＦＵ−Ｆ細胞がＣＤ４９ａの発現と関連し、ＣＤ４９ａ発現ＣＦＵ−Ｆ細胞がまたＳＴＲＯ−１も同時発現し、そしてＣＤ４９ａを用いて、ヒトに加えてラットおよびマウスからＭＳＣを単離することも可能であり、該分子が濃縮のための保存されたマーカーでありうることを示すことも報告した。

【0196】

Ｇａｎｇらは、未分化多能性ヒト胚性幹細胞および胚盤胞段階胚への卵割に関するマーカーとして一般的に用いられる段階特異的胚性抗原ＳＳＥＡ−４がまた、成体ヒト間葉系幹細胞集団を同定し、そしてＭＳＣを単離するために使用可能であることを報告する（Ｇａｎｇら， Ｂｌｏｏｄ ２００７；１０９：１７４３−１７５１）。Ｇａｎｇらはまた、クローン原性間質細胞（ＣＦＵ−Ｆ）、いわゆるＳＴＲＯ−１^＋明の濃縮における表面マーカーＳＴＲＯ−１に結合するモノクローナル抗体の使用も記載する。

【0197】

グリコサミノグリカン
本明細書において、用語「グリコサミノグリカン」および「ＧＡＧ」は交換可能に用いられ、そしてオリゴ糖を含む分子の大きなコレクションを指すと理解され、ここで１またはそれより多いこれらの結合した糖は、アミノ置換基、またはその誘導体を所持する。ＧＡＧの例は、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびヘパラン硫酸である。

【0198】

本明細書において、用語「ＧＡＧ」はまた、ＧＡＧコンジュゲートである分子を含むよう拡大する。ＧＡＧコンジュゲートの例は、プロテオグリコサミノグリカン（ＰＧＡＧ、プロテオグリカン）であり、ここでペプチド構成要素はオリゴ糖構成要素に共有結合する。

【0199】

ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、プロテオグリカンの非常に多様な下位群に相当し、そしてタンパク質主鎖に共有結合したヘパラン硫酸グリコサミノグリカン側鎖で構成される。コアタンパク質は３つの主要な型：パールカンとして知られる分泌型、グリピカンとして知られる形質膜に係留された型、およびシンデカンとして知られる膜貫通型で存在する。これらは、哺乳動物細胞表面および大部分の細胞外マトリックスの普遍的な構成要素である。アグリン、またはアミロイド前駆体タンパク質などの他のタンパク質があり、この際、ＨＳ鎖は、より一般的に見られないコアに付着している可能性もある。

【0200】

「ヘパラン硫酸」（「ヘパラン硫酸」または「ＨＳ」）は、最初に、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のタンデム反復からなる多糖として、ゴルジ体において合成される。新生多糖は続いて、一連の工程で修飾されうる：ＧｌｃＮＡｃのＮ−脱アセチル化／Ｎ−硫酸化、ＧｌｃＡのイズロン酸（ＩｄｏＡ）へのＣ５エピマー化、ＩｄｏＡおよびＧｌｃＡのＣ２でのＯ−硫酸化、Ｎ−スルホグルコサミン（ＧｌｃＮＳ）のＣ６でのＯ−硫酸化、そしてＧｌｃＮＳのＣ３での時折のＯ−硫酸化。ＨＳのＮ−脱アセチル化／Ｎ−硫酸化、２−Ｏ−、６−Ｏ−および３−Ｏ−硫酸化は、それぞれ、ＨＳ Ｎ−脱アセチル化酵素／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳＮＤＳＴ）、ＨＳ ２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ２ＳＴ）、ＨＳ ６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ６ＳＴ）およびＨＳ ３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼの特異的作用によって仲介される。修飾の各段階で、潜在的な基質の一部のみが修飾され、かなりの配列多様性が生じる。ＨＳのこの構造の複雑さのために配列を決定し、そしてＨＳ構造および機能の間の関連を理解することが困難になってきた。

【0201】

ヘパラン硫酸側鎖は、（１→４）グリコシド結合を通じて連結された、交互に配置されたＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸およびＤ−グルコサミンからなる。グルコサミンは、しばしば、Ｎ−アセチル化またはＮ−硫酸化され、そしてウロン酸およびグルコサミンはどちらも、さらにＯ−硫酸化されていることも可能である。特定の結合パートナーに対する特定のＨＳＰＧの特異性は、グルコサミンおよびウロン酸に付着した、カルボキシル、アセチルおよび硫酸基の特定のパターンによって生成される。ヘパリンとは対照的に、ヘパラン硫酸は、より少ないＮおよびＯ−硫酸基およびより多いＮ−アセチル基を含有する。ヘパラン硫酸側鎖は、四糖連結（−グルクロノシル−β−（１→３）−ガラクトシル−β−（１→３）−ガラクトシル−β−（１→４）−キシロシル−β−１−Ｏ−（セリン））領域を通じて、コアタンパク質のセリン残基に連結される。

【0202】

ヘパラン硫酸鎖およびコアタンパク質はどちらも、生物学的活性に最終的に影響しうる、一連の修飾を経ることも可能である。ＨＳの複雑性は、核酸のものを凌ぐと見なされてきている（Ｌｉｎｄａｈｌら， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２４９７９；ＳｕｇａｈａｒａおよびＫｉｔａｇａｗａ， ２０００， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １０， ５１８）。ＨＳ種の変動は、Ｎ−アセチル化グルコサミンを含有する二糖の非硫酸化領域によって分離される、糖残基の非ランダムな非常に硫酸化された配列の合成から生じる。Ｎ−アセチルグルコサミンのＮ−スルホグルコサミンへの最初の変換は、グルクロン酸からイズロン酸へのエピマー化およびグルコサミンまたはイズロン酸に対するＯ−硫酸化の複雑なパターンを含む、他の修飾のためのフォーカスを生じる。さらに、非修飾低硫酸化Ｎ−アセチル化配列内で、ヘキサウロン酸残基はグルクロン酸として残り、一方、非常に硫酸化されたＮ−硫酸化領域において、Ｃ−５エピマーイズロン酸が優勢である。これは、任意の所定の鎖において可能である潜在的な二糖変異体の数を限定するが、各々の存在比を限定しない。成熟鎖において、高硫酸化領域が低硫酸化ドメインによって分離されるように、大部分の修飾は、Ｎ−硫酸化ドメイン、またはそれに直接隣接して起こる（本明細書にその全体が援用される、Ｂｒｉｃｋｍａｎら（１９９８）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（８）， ４３５０−４３５９）。

【0203】

非常に可変性であるヘパラン硫酸鎖が、多数の細胞外リガンドの作用の調節に重要な役割を果たすと仮定され、こうした役割には、自己分泌、接触分泌およびパラ分泌フィードバックループの複雑な組み合わせを通じた、細胞に対する増殖および接着因子の制御および提示が含まれ、こうして細胞内シグナル伝達を調節し、そしてそれによって幹細胞分化を調節する。例えば、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンは、遺伝子的に記載されている（Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ， ニューヨークおよびロンドン， ｐｐ．８０４および８０５）が、単一供給源から単離されたヘパラン硫酸グリコサミノグリカン種は、生物学的活性が多様でありうる。Ｂｒｉｃｋｍａｎら， １９９８， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８， ４６３に示されるように、神経上皮細胞から得られるヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの２つの別個のプールは、分裂促進状態に応じて、ＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２のいずれかを特異的に活性化しうる。同様に、ヘパラン硫酸（ＨＳ）がＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２のいずれかと相互作用する能力が、ＷＯ ９６／２３００３に記載される。この特許出願によると、ＦＧＦ−１と相互作用しうるそれぞれのＨＳは、約１１日〜約１３日胚のネズミ細胞から得ることが可能であり、一方、ＦＧＦ−２と相互作用可能なＨＳは、約８日〜約１０日胚で得られうる。

【0204】

上述のように、ＨＳ構造は非常に複雑であり、そしてＨＳ間で多様である。実際、ＨＳ構造における変動は、各ＨＳが細胞増殖を促進しそして細胞分化を導く際に異なる活性に向かうように寄与する際に、重要な役割を果たすと見なされる。構造の複雑さは、核酸を凌ぐと見なされ、そしてＨＳ構造は、現在では特定のそしてユニークな硫酸化パターンを有する反復二糖単位の配列として特徴付けられうるが、ＨＳ配列構造を決定するために、核酸配列決定に関して入手可能なものと同等な標準的な配列決定技術は利用可能ではない。定義的なＨＳ配列構造を決定するための単純な方法がないため、ＨＳ分子はいくつかの分析技術によって、当業者により、積極的に同定され、そして構造的に特徴付けられている。これらには、二糖分析、四糖分析、ＨＰＬＣおよび分子量決定の１つまたは組み合わせが含まれる。これらの分析技術は、当業者に周知であり、そして用いられている。

【0205】

ＨＳから二糖および四糖を産生するための２つの技術には、亜硝酸消化およびリアーゼ消化が含まれる。これらの消化技術を実行する１つの方法の説明は、純粋に例として以下に提供され、こうした説明は本発明の範囲を限定しない。

【0206】

亜硝酸消化
亜硝酸に基づくヘパラン硫酸の脱重合は、完了した際には、炭水化物鎖の個々の二糖構成要素への最終的な分解を導く。

【0207】

例えば、亜硝酸は、２５０μｌの０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４および０．５Ｍ Ｂａ（ＮＯ_２）_２を別個に氷上で１５分間冷却することによって調製可能である。冷却後、Ｂａ（ＮＯ_２）_２をＨ_２ＳＯ_４と併せ、そしてボルテックスした後、遠心分離して、硫酸バリウム沈殿物を除去する。１２５μｌのＨＮＯ_２を、２０μｌのＨ_２Ｏに再懸濁したＧＡＧ試料に添加し、そしてボルテックスした後、時々混合しながら、２５℃で１５分間インキュベーションする。インキュベーション後、１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３を試料に添加して、ｐＨ６にする。次に、０．１Ｍ ＮａＯＨ中の１００μｌの０．２５Ｍ ＮａＢＨ_４を試料に添加し、そして混合物を５０℃に２０分間加熱する。次いで、混合物を２５℃に冷却して、そして酸性化氷酢酸を添加して、試料をｐＨ３にする。次いで、混合物を１０Ｍ ＮａＯＨで中和し、そして凍結乾燥によって体積を減少させる。最終試料をＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２カラムに流して、二糖および四糖を分離して、分解の度合いを検証する。

【0208】

リアーゼ消化
ヘパリナーゼＩＩＩは、グルクロニド結合で糖鎖を切断する。一連のヘパリナーゼ酵素（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）は、各々、特定の硫酸化認識部位で、特定のヘパラン硫酸配列を脱重合することによって、各々、相対的に特異的な活性を示す。ヘパリナーゼＩは、ＨＳ鎖に沿ってＮＳ領域でＨＳ鎖を切断する。これは、硫酸化ドメインの破壊を導く。ヘパリナーゼＩＩＩは、ＮＡドメインでＨＳを脱重合し、炭水化物鎖の個々の硫酸化ドメインへの分離を生じる。ヘパリナーゼＩＩは、主に、ＨＳ鎖のＮＡ／ＮＳ「肩」ドメインにおいて切断し、このドメインは多様な硫酸化パターンが見られる箇所である。注：ヘパリンポリマーの反復二糖主鎖は、アミノ糖グルコサミンに連結されたウロン酸である。「ＮＳ」は、アミノ糖が、Ｃ２、Ｃ６およびＣ３の他の基の硫酸化を可能にする、アミノ基上の硫酸基を所持することを意味する。「ＮＡ」は、アミノ基が硫酸化されておらず、そしてアセチル化されたままであることを示す。

【0209】

例えば、ヘパリナーゼＩＩＩを用いたＮＡ領域における脱重合のため、酵素および凍結乾燥ＨＳ試料の両方を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび４ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中で調製する。純粋に例として、１μｇのＨＳあたりヘパリナーゼＩＩＩを５ｍＵ添加し、そして３７℃で１６時間インキュベーションした後、７０℃で５分間加熱することによって、反応を停止することも可能である。

【0210】

二糖および四糖をカラムクロマトグラフィによって溶出させることも可能である。
皮膚の修復および／または再生におけるＨＳ８の使用
本発明者らは、ＦＧＦ−２をより特異的にターゲティングする、本明細書記載の精製ＨＳ調製物、ＨＳ８を開発した。本発明者らは、ＨＳ８が、ＦＧＦ−２に増加したアフィニティを所持し、ヒト真皮線維芽細胞の増殖速度を増加させ、そして角化細胞および真皮線維芽細胞両方の引っ掻き傷アッセイ反応を誘発することを示している。ＨＳ８は、外傷、火傷、潰瘍または疾患後の皮膚の修復を誘導するアジュバントとして試験されるであろう。ＨＳ８は、全層切除創傷を含む、皮膚の慢性創傷を治療するために必要な増殖因子を安定化させ、そしてかつその量を減少させるアジュバントとして試験されるであろう。したがって、ＨＳ８は、医療制度の大きなそして増加しつつある損失であり、そして緊急のそして大きな満たされていない臨床的必要性である、糖尿病潰瘍などの非治癒性皮膚創傷の治療の有用な療法的ツールを提供する。

【0211】

したがって、本発明の側面は、皮膚の修復および／または再生におけるＨＳ８の療法的使用に関する。皮膚の修復または再生は、皮膚における傷害または創傷形成に反応して必要となりうる。療法的使用は、任意の種類の皮膚創傷または皮膚瘢痕の治療を含みうる。創傷は急性または慢性であってもよい。創傷は緩慢治癒性または非治癒性であってもよい。

【0212】

傷害は、皮膚バリアを破壊する任意の傷害であってもよい。いくつかの態様において、傷害は、物理的または機械的傷害であってもよい。傷害は、切除創傷または切除皮膚外傷であってもよい。いくつかの態様において、創傷は、切り傷、刺し傷または穿刺傷であってもよい。いくつかの態様において、創傷は外科的切断であってもよい。他の態様において、傷害は、火傷の結果であってもよく、熱または化学的火傷であってもよい。治療可能な火傷は、第一度、第二度または第三度であってもよい。ＨＳ８の作用は、こうした傷害に反応して創傷治癒プロセスを促進するかまたは加速することも可能である。

【0213】

いくつかの態様において、ＨＳ８を用いて、例えば、皮膚移植、皮膚再構築または皮膚形成手術後の、皮膚または皮膚移植治癒において、創傷治癒を促進するかまたは加速することも可能である。いくつかの態様において、ＨＳを用いて、皮膚創傷治癒中の瘢痕形成を減少させるかまたは最小限にすることも可能である。いくつかの態様において、ＨＳ８を用いて、皮膚において、瘢痕不含創傷治癒を達成する。

【0214】

皮膚創傷治癒におけるＨＳ８の療法的適用には、形成手術、結腸直腸吻合手術、閉鎖縫合、火傷の治療、血管／動脈／褥瘡治療、皮膚切開／外傷創傷修復、上皮区画への血管復帰促進、および上皮幹細胞機能の刺激が含まれる。

【0215】

いくつかの態様において、ＨＳ８を用いて、皮膚潰瘍、例えば糖尿病性皮膚潰瘍を治療することも可能である。皮膚潰瘍は、非治癒性潰瘍、例えば非治癒性下肢潰瘍であってもよい。

【0216】

いくつかの場合による態様において、ＨＳ８は、皮膚の移植片対宿主病の治療には用いられない。
皮膚移植、再構築および形成手術
皮膚移植は、皮膚の移植を伴い、そしてしばしば皮膚の広い領域が、例えば火傷、皮膚癌または壊死性筋膜炎などの感染後で損傷を受けた外傷性創傷を治療するために用いられる。

【0217】

該プロセスは、典型的には、損傷を受けた皮膚を外科的に除去した後、移植皮膚を移植することを伴う。皮膚移植片は、体の健康な部分から皮膚の薄い層または皮膚の全層部分のいずれかを除去することによって得られうる。移植片は、典型的には、治療を必要とする被験体（自己）から、または同じ種の別の個体（同種）から得られる。

【0218】

皮膚移植、再構築および形成手術技術は、例えば、Ｓｎｙｄｅｒら（分層皮膚移植の適用：段階的臨床ガイドおよび看護関連。Ｏｓｔｏｍｙ Ｗｏｕｎｄ Ｍａｎａｇｅ． ２００１ Ｎｏｖ；４７（１１）：２０−６．）； Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｅ． Ｊａｎｉｓ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， ２２ Ｊｕｌｙ ２００７） Ｚｉｅｇｌｅｒ， ＤｉｅｔｚおよびＳｃｈｍｉｄｔ （Ｓｋｉｎ Ｇｒａｆｔｓ． Ｓｕｒｇｅｒｙ ｉｎ Ｗｏｕｎｄｓ． ２００４， ｐｐ１７９−１８６）； Ｗｅｅｒｄａ， Ｈｉｌｋｏ（２００１）． Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｆａｃｉａｌ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ： Ａ Ｐｒｏｂｌｅｍ−Ｓｏｌｖｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ． Ｂａｒｒｅｔ−Ｎｅｒｉｎ， Ｊｕａｎ； Ｈｅｒｎｄｏｎ， Ｄａｖｉｄ Ｎ．（２００４）． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｂｕｒｎ Ｓｕｒｇｅｒｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒに記載されるように、当業者に知られる。

【0219】

本発明の側面および態様において、ＨＳ８は、皮膚移植、再構築、および形成手術の方法において、皮膚治癒プロセスおよび／または移植片の許容を補助するための使用のために提供される。ＨＳ８を、移植、再構築または手術の部位またはそれに隣接する皮膚に適用するかまたは投与してもよい。こうした適用は、手術法の一部を形成することも可能であるし、または手術法とは別個であることも可能であり、例えば移植、再構築または形成手術を有する皮膚の領域に手術後に適用することも可能である。

【0220】

製剤
活性化合物、ＨＳ８は単独で投与することも可能であるが、上に定義するような少なくとも１つの活性化合物を、限定されるわけではないが、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、潤滑剤、安定化剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、フレーバー剤、および甘味剤を含む当業者に周知の１またはそれより多い他の薬学的に許容されうる成分とともに含む薬学的製剤（例えば組成物、調製物、薬剤）として提示することが好ましい。製剤は、さらに、他の活性剤、例えば他の療法剤または予防剤を含んでもよい。

【0221】

したがって、本発明は、上に定義するような薬学的組成物、および上に定義するような少なくとも１つの活性化合物を、当業者に周知の１またはそれより多い他の薬学的に許容されうる成分、例えばキャリアー、アジュバント、賦形剤等とともに含む薬学的組成物を作製する方法をさらに提供する。別個の単位（例えば錠剤等）として製剤化する場合、各単位は、あらかじめ決定した量（投薬量）の活性化合物を含有する。

【0222】

用語「薬学的に許容されうる」は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比を伴って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、あるいは他の問題または合併症を伴わず、問題の被験体（例えばヒト）の組織と接触させて使用するために適切である、化合物、成分、材料、組成物、投薬型等に関する。各キャリアー、アジュバント、賦形剤等はまた、製剤の他の成分と適合するという意味でもまた、「許容されうる」ものでなければならない。

【0223】

適切なキャリアー、アジュバント、賦形剤等は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州イーストン， １９９０；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， 第２版, １９９４に見出されうる。

【0224】

薬学業に周知の任意の方法によって、製剤を調製することも可能である。こうした方法には、１またはそれより多い付属成分を構成するキャリアーと活性化合物を会合させる工程が含まれる。一般的に、製剤は、活性化合物とキャリアー（例えば液体キャリアー、細分割固形キャリアー等）と均一にそして緊密に合わせ、そして次いで、必要な場合、産物を整形することによって、調製される。

【0225】

製剤は、適切に、液体、溶液（例えば水性、非水性）、懸濁物（例えば水性、非水性）、エマルジョン（例えば水中油、油中水）、エリキシル、シロップ、舐剤、口内洗浄液、ドロップ、錠剤（例えばコーティング錠剤を含む）、顆粒、粉末、ロゼンジ、トローチ、カプセル（例えば硬および軟ゼラチンカプセルを含む）、カシェー、ピル、アンプル、ボーラス、座薬、ペッサリー、チンキ、ジェル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、油、泡、スプレー、ミスト、またはエアロゾルの形であることも可能である。

【0226】

製剤は、適切に、ＨＳ８、ならびに場合によって例えば透過、浸透、および吸収増進剤を含む、１またはそれより多い他の薬学的に許容されうる成分を含浸させたパッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング剤等として提供可能である。製剤はまた、デポまたはリザーバーの形で適切に提供可能である。

【0227】

活性化合物は、１またはそれより多い他の薬学的に許容されうる成分中に溶解されていても、懸濁されていても、またはこれらと混合されていてもよい。活性化合物は、活性化合物を、例えば血液構成要素、あるいは１またはそれより多い臓器にターゲティングするように設計されている、リポソームまたは他の微粒子中で提示されてもよい。

【0228】

非経口経粘膜投与に適した製剤には、液体、溶液（例えば水性、非水性）、懸濁物（例えば水性、非水性）、エマルジョン（例えば水中油、油中水）、座薬、ペッサリー、ジェル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、油、ならびにパッチ、絆創膏、デポ、およびリザーバーが含まれる。

【0229】

局所または経皮投与に適した製剤が好ましい可能性もあり、そしてこうした製剤には、ジェル、スプレー、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、膏薬、油、水溶液、懸濁物、および分散物、ならびにパッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング剤、デポ、およびリザーバーが含まれうる。

【0230】

軟膏は、典型的には、活性化合物およびパラフィン性または水混和性軟膏基剤から調製される。
クリームは、典型的には、活性化合物および水中油クリーム基剤から調製される。望ましい場合、クリーム基剤の水性相には、例えば、少なくとも約３０％ｗ／ｗの多価アルコール、すなわち２またはそれより多いヒドロキシル基を有するアルコール、例えばプロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコールおよびその混合物が含まれることも可能である。

【0231】

局所製剤は、望ましくは、皮膚または他の罹患した領域を通じて、活性化合物の吸収または浸透を増進する化合物を含むことも可能である。こうした皮膚浸透増進剤の例には、ジメチルスルホキシドおよび関連する類似体が含まれる。

【0232】

エマルジョンは、典型的には、活性化合物および油性相から調製され、これは、場合によって、単に乳化剤（別に、エマルジェント（ｅｍｕｌｇｅｎｔ）としても知られる）を含むことも可能であるし、あるいは、脂肪もしくは油と、または脂肪および油の両方とともに、少なくとも１つの乳化剤の混合物を含むことも可能である。好ましくは、親水性乳化剤が、安定化剤として作用する親油性乳化剤とともに含まれる。油および脂肪の両方を含むこともまた好ましい。ともに、安定化剤（単数または複数）を含むまたは含まない乳化剤（単数または複数）は、いわゆる乳化ワックスを構成し、そしてワックスは油および／または脂肪とともに、いわゆる乳化軟膏基剤を構成し、これはクリーム製剤の油性分散相を形成する。

【0233】

適切なエマルジェントおよび乳化安定化剤には、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｓｐａｎ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、およびラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。配合物に適した油または脂肪の選択は、望ましい薬学的特性を達成することに基づき、これは、薬学的エマルジョン配合物で用いられる可能性が高い大部分の油中の活性化合物の可溶性が非常に低い可能性があるためである。したがって、クリームは、好ましくは、非グリース状で、非染色性で、そしてチューブまたは他の容器からの漏洩を回避するために適切なコンシステンシーを備えた洗浄可能な産物であるべきである。直鎖または分枝鎖、一または二塩基性アルキルエステル、例えばジイソアジピン酸、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコール二エステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸２−エチルヘキシルまたはＣｒｏｄａｍｏｌ ＣＡＰとして知られる分枝鎖エステルのブレンドを用いてもよく、最後の３つが好ましいエステルである。必要な特性に応じて、これらを単独で、または組み合わせて使用することも可能である。あるいは、高融点脂質、例えば白色軟パラフィンおよび／または流動パラフィンまたは他のミネラルオイルを用いることも可能である。

【0234】

ＨＳ８を、皮膚ケアにおける、いくつかの療法適用に適用することも可能であり、これには、創傷治癒および創傷ドレッシングのためのコーティング技術が含まれる。こうしたものとして、配合物は、パッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング剤、組織足場（例えば、Ｚｈｏｎｇら， 皮膚創傷治癒および真皮再構築のための組織足場 Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７ Ａｐｒ ４；２７６（５３０９）：７５−８１）、ＨＳ８および場合によって例えば浸透、透過、および吸収増進剤を含む、１またはそれより多い薬学的に許容されうる成分で含浸またはコーティングされているバイオマテリアルとして提供されてもよい。

【0235】

ＨＳ８を含む薬学的組成物、薬剤、および他の配合物はまた、ＦＧＦ２も含んでもよい。ＨＳ８がＦＧＦ２に結合する能力を持つため、ＨＳ８は、ＦＧＦ２を創傷部位に送達する際にこれを補助する、ＦＧＦ２のキャリアーとして働きうる。

【0236】

投与は好ましくは「療法的有効量」であり、これは皮膚の修復および／または再生に十分である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、骨折の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量の決定等は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、骨折の性質、個々の患者の状態、送達部位、投与法および医師に知られる他の要因を考慮に入れるであろう。単数回または複数回のＨＳ８用量の投与を、処方する医師のガイダンスにしたがって投与してもよい。純粋に例として、ＨＳ８を少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５ｎｇ／ｍｌ、そして場合によって１０ｎｇ／ｍｌまたはそれより多い投薬量で送達してもよい。個々のＨＳ８投薬量は、１ｍｇ未満の桁であり、そして１μｇより多くてもよく、例えば約５μｇ、約１０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約０．５ｍｇ、または約１ｍｇの１つであってもよい。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第２０版， ２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。

【0237】

ＨＳ８を用いて、他の治療、例えば鎮痛剤または抗炎症性薬剤の投与とともに、皮膚を修復および／または再生することも可能である。
骨折
いくつかの側面において、本発明は、骨折を治療するためのＨＳ８の療法的使用（ヒトおよび／または獣医学的）に関する。

【0238】

骨折は、医学的状態である。本出願において、「骨折」には、骨にひびが入るか、骨が折れるかまたは削り取られる、骨に対する損傷または傷害が含まれる。骨が折れることは骨の不連続を指す。骨折は、物理的衝撃または機械的ストレスによって、あるいは骨粗鬆症または変形性関節症などの医学的状態によって引き起こされうる。

【0239】

骨折の整形外科的分類には、閉鎖または開放および単純または複雑骨折が含まれる。閉鎖骨折において、皮膚は損なわれていないままであり、開放骨折において、骨は創傷部位を通じて曝露される可能性もあり、これは感染のより高いリスクをもたらす。単純骨折は、単一の線に沿って生じ、骨を２つに分割する傾向がある。複雑骨折は、骨を多数の片に分割する。

【0240】

他の骨折タイプには、圧迫骨折、圧縮骨折（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ ｆｒａｃｔｕｒｅ）、らせん骨折、完全および不完全骨折、横骨折、線状骨折および斜骨折および粉砕骨折が含まれる。

【0241】

大部分の被験体において、骨治癒（骨折治癒）は自然に生じ、そして傷害後に開始される。出血は、通常、凝固、ならびに白血球および線維芽細胞の誘引を導き、その後、コラーゲン線維が産生される。この後、骨マトリックス（カルシウムヒドロキシアパタイト）沈着（ミネラル化）がコラーゲンマトリックスを骨に変換する。未成熟再生骨は、典型的には成熟骨よりも弱く、そして未成熟骨は、時間を掛けて、リモデリングプロセスを経て、成熟「層状」骨を産生する。完全骨治癒プロセスにはかなりの時間が掛かり、典型的には数ヶ月を要する。

【0242】

骨折が起き、そしてＨＳ８を用いた治療から利益を得る可能性がある骨には、すべての骨タイプ、特にすべての哺乳動物骨が含まれ、限定されるわけではないが、長骨（例えば大腿骨、上腕骨、指骨）、短骨（例えば手根骨、足根骨）、平板骨（例えば頭蓋骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、骨盤帯）、不規則骨（例えば椎骨）、種子骨（例えば膝蓋骨）が含まれる。

【0243】

骨折が起き、そしてＨＳ８を用いた治療から利益を得る可能性がある骨には、骨格の骨（すなわち骨格の任意の骨）、頭蓋顔面領域の骨、中軸骨格の骨（例えば椎骨、肋骨）、四肢の骨（例えば肢の骨）、骨盤骨格の骨（例えば骨盤）が含まれる。

【0244】

骨折が起き、そしてＨＳ８を用いた治療から利益を得る可能性がある骨にはまた、顔、例えば顎、鼻および頬のものを含む、頭部（頭蓋）および首のものも含まれる。ＨＳ８を用いて、歯科または顔面または頭蓋手術中の骨の修復または再生を補助することも可能であり、これには、例えば顎骨を含む、顔および／または口骨（歯とは異なる）の再構築が含まれうる。

【0245】

骨折にはまた、骨粗鬆症の被験体によって示されるような、病的多孔性が含まれる。
本発明を限定するわけではないが、ＨＳ８の一次作用は、創傷部位内の、該部位に隣接する、または該部位内に遊走が誘導された細胞に対するものであることも可能であり、そして該作用は、間葉系幹細胞、骨幹細胞、プレ骨芽細胞または骨芽細胞、あるいは創傷床内に見られるかまたは遊走が誘導される任意の補助または血管原性細胞に対するものであることも可能である。

【0246】

ＨＳ８、ならびにＨＳ８を含む薬学的組成物および薬剤を、哺乳動物被験体における骨折の治療法において使用するために提供する。治療は、骨における創傷治癒を含むことも可能である。治療は、骨の修復、再生および増殖を伴うことも可能である。ＨＳ８は、新規骨増殖を促進することによって、骨折修復を促進する。ＨＳ８は、骨折修復の速度を改善するように働き、骨治癒がより迅速に起こることを可能にし、傷害からの回復時間の改善を導く。治療は骨強度改善を導きうる。

【0247】

治療にはまた、骨粗鬆症または変形性関節症の治療も含まれうる。
ＨＳ８の投与は、好ましくは、骨折を取り巻く組織に対するものである。これには、骨折が起きた骨組織への直接の投与も含まれうる。投与は、骨または骨折を取り巻く結合組織に対するもの、あるいは骨の近傍であり、そして骨に供給する血管系（例えば血管）であることも可能である。投与は、傷害部位に対して直接であってもよいし、そして初期創傷治癒によって形成される仮骨に対してであってもよい。本発明記載の薬剤および薬学的組成物は、多くの経路による投与用に製剤化されることも可能である。最も好ましくは、ＨＳ８は、注射用の流体または液体型で製剤化される。

【0248】

いくつかの態様において、ＨＳ８は、徐放配合物として、例えば創傷部位に移植するための薬剤カプセル中に製剤化される。ＨＳ８を、キャリアー物質（例えばバイオマテリアル）、例えばナノファイバーあるいは生物分解性の紙または織物に付着させるか、含浸させるか、または浸漬させることも可能である。

【0249】

ＨＳ８を含む薬学的組成物、薬剤、移植物および装具はまた、ＦＧＦ２も含むことも可能である。ＨＳ８がＦＧＦ２に結合する能力のため、ＨＳ８は、創傷部位にＦＧＦ２を送達することを補助するＦＧＦ２のキャリアーとして作用しうる。

【0250】

投与は、好ましくは、「療法的有効量」であり、これは、対応する未処置骨折に比較して、骨折の治癒を改善するために十分な量である。投与する実際の量、ならびに投与速度および時間経過は、骨折の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量の決定等は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、骨折の性質、個々の患者の状態、送達部位、投与法および医師に知られる他の要因を考慮に入れるであろう。ＨＳ８用量の単回または多数回投与を、処方する医師の指導にしたがって、投与することも可能である。純粋に例として、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５ｎｇ／ｍｌ、そして場合によって１０ｎｇ／ｍｌまたはそれより多い投薬量でＨＳ８を送達することも可能である。個々のＨＳ８投薬量は、１ｍｇ未満であり、そして１μｇより多い桁であることも可能であり、例えば約５μｇ、約１０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約０．５ｍｇ、または約１ｍｇの１つであることも可能である。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第２０版， ２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。

【0251】

ＨＳ８を用いて、他の治療、例えば疼痛緩和または抗炎症薬剤、骨の固定および固化、例えばギプス包帯中での傷害肢の固定、例えば骨を再固化させるかまたは骨を取り除いて、ずれ、アンギュレーションまたは脱臼を修正するための外科的介入とともに、骨折を治療することも可能である。手術が必要な場合、外科的処置中に、ＨＳ８を直接、骨折に投与（例えば適用）することも可能である。

【0252】

バイオマテリアル
本発明の薬学的組成物および薬剤は、ＨＳ８でコーティングされ、そして／または含浸されるバイオマテリアルの形を取ることも可能である。バイオマテリアルから移植物または装具を形成することも可能である。こうした移植物または装具を外科的に移植して、細胞移植、骨増殖、組織再生、組織再構築、および／または組織リモデリングを補助することも可能である。

【0253】

ＨＳ８を、移植物または装具に適用して、所望の位置での新規組織形成を加速することも可能である。ヘパラン硫酸は、タンパク質とは異なり、特に頑強であり、そして合成バイオ足場の製造、ならびに移植物および装具の適用に必要な溶媒に耐える、はるかにより優れた能力を有することが認識されるであろう。

【0254】

バイオマテリアルをＨＳ８でコーティングまたは含浸してもよい。含浸は、ＨＳ８をバイオマテリアルの構成的構成要素と、例えば重合中に混合するか、またはバイオマテリアル内にＨＳ８を吸着させることによって、バイオマテリアルを形成する工程を含むことも可能である。コーティングは、バイオマテリアル表面上へのＨＳ８の吸着を含むことも可能である。

【0255】

バイオマテリアルは、被験体に投与されるかまたは移植された際に、コーティングまたは含浸ＨＳ８がバイオマテリアルから放出されることを可能にしなければならない。バイオマテリアル放出動力学は、バイオマテリアルの構造、例えば多孔性を改変することによって、改変可能である。

【0256】

ＨＳ８でのバイオマテリアルのコーティングまたは含浸に加えて、１またはそれより多い生物学的活性分子を、バイオマテリアル上に含浸またはコーティングすることも可能である。例えば：ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＯＰ−１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３；ＶＥＧＦ；コラーゲン；ラミニン；フィブロネクチン；ビトロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つである。上述の生体活性分子に加えて、またはその代わりに、１またはそれより多いビスホスホネートを、ＨＳ８とともに、バイオマテリアルに含浸またはコーティングしてもよい。有用なビスホスホネートの例には：エチドロネート；クロドロネート；アレンドロネート；パミドロネート；リセドロネート；ゾレドロネートからなる群より選択される少なくとも１つが含まれうる。

【0257】

ＨＳ８でコーティングまたは含浸されたバイオマテリアルは、医学的および獣医学的目的の両方に有用でありうる。本発明が、患者の生活の質を改善するか、または動物、例えば交配に使用するために価値ある競走馬の寿命を潜在的に延長させることも可能であることが認識されるであろう。

【0258】

バイオマテリアルは、足場またはマトリックス支持体を提供する。バイオマテリアルは、組織における移植に適切であることも可能であり、または投与に適切であることも可能である（例えば溶液中のマイクロカプセルとして）。

【0259】

移植物または装具は、生体適合性、例えば非毒性で、そして低免疫原性（最も好ましくは非免疫原性）でなければならない。バイオマテリアルは、創傷治癒が起こるに連れて、バイオマテリアルが分解し、最終的に被験体において、ｉｎ ｓｉｔｕで再生された骨のみが残るように、生物分解性であることも可能である。あるいは、非生物分解性バイオマテリアルを用いて、例えば大きな不連続に渡る骨再生をガイドし、そして／または骨治癒中の構造的支持体として作用して、創傷治癒が成功した後、バイオマテリアルの外科的除去が場合によって必要であることも可能である。

【0260】

バイオマテリアルは、柔らかく、そして／または柔軟であることも可能であり、例えばヒドロゲル、フィブリンウェブまたはメッシュ、あるいはコラーゲンスポンジであることも可能である。「ヒドロゲル」は、天然または合成であることも可能な有機ポリマーを固化するかまたは凝固して、三次元開放格子構造を生成して、これが水または他の溶液の分子を捕捉して、ゲルを形成する際に形成される物質である。凝固は、凝集、凝固、疎水性相互作用または架橋によって起こることも可能である。

【0261】

あるいは、バイオマテリアルは、比較的堅い構造であることも可能であり、例えば固形材料、例えばプラスチックまたは生物学的不活性金属、例えばチタンで形成されることも可能である。

【0262】

バイオマテリアルは、架橋ポリマーによって提供されることも可能な、多孔性マトリックス構造を有することも可能である。マトリックスは、好ましくは、骨増殖に必要な栄養素および増殖因子に対して浸透性である。

【0263】

マトリックス構造は、架橋繊維、例えばフィブリンまたはコラーゲン、あるいはアルギン酸ナトリウムの液体フィルム、キトサン、または適切な架橋剤、例えばカルシウム塩を含む他の多糖、ポリアクリル酸、ヘパリンによって形成することも可能である。あるいは、ゲルとして足場を形成し、コラーゲンまたはアルギン酸によって組み立て、当業者に知られる周知の確立された方法を用いて架橋することも可能である。

【0264】

マトリックス形成に適したポリマー材料には、限定されるわけではないが、生物分解性／生物吸収可能ポリマーが含まれ、これは：アガロース、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ポリカプロラクトン、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシアルカノエート、そのコポリマーの群より選択されることも可能であり、あるいは非生物分解性ポリマーが含まれ、これは：酢酸セルロース；酪酸セルロース、アルギン酸セルロース、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、スルホン化ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、そのコポリマーの群より選択されることも可能である。

【0265】

コラーゲンは、その生体適合性ならびに細胞付着および機能を支持する好ましい特性のため、マトリックス構築のための有望な材料である（米国特許第５，０１９，０８７号；Ｔａｎａｋａ， Ｓ．；Ｔａｋｉｇａｗａ， Ｔ．；Ｉｃｈｉｈａｒａ， Ｓ．およびＮａｋａｍｕｒａ， Ｔ． 生物吸収性ポリグリコール酸−コラーゲン神経ガイドチューブの機械的特性 Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６， ４６， １４６１−１４６７）。臨床的に許容されうるコラーゲンスポンジは、マトリックスの一例であり、そして当該技術分野に周知である（例えばＩｎｔｅｇｒａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのもの）。

【0266】

フィブリン足場（例えばフィブリン接着剤）は、代替マトリックス材料を提供する。フィブリン接着剤は、創傷密封剤、増殖因子を送達するためのリザーバー、そして生物学的移植物の配置および固定の補助として広い臨床的適用に恵まれている（Ｒａｊｅｓｈ Ｖａｓｉｔａ， Ｄｈｉｒｅｎｄｒａ Ｓ Ｋａｔｔｉ． 組織操作のための増殖因子送達系：材料の展望 Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ． ２００６；３（１）：２９−４７；Ｗｏｎｇ Ｃ， Ｉｎｍａｎ Ｅ， Ｓｐａｅｔｈｅ Ｒ， Ｈｅｌｇｅｒｓｏｎ Ｓ． Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ． ２００３ ８９（３）：５７３−５８２；Ｐａｎｄｉｔ ＡＳ， Ｗｉｌｓｏｎ ＤＪ， Ｆｅｌｄｍａｎ ＤＳ． 酸性増殖因子（ＦＧＦ−１）の送達のための有効なビヒクルとしてのフィブリン足場。 Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ２０００；１４（３）；２２９−２４２；ＤｅＢｌｏｉｓ Ｃｏｔｅ ＭＦ． Ｄｏｉｌｌｏｎ ＣＪ． ヘパリン−線維芽細胞増殖因子フィブリン複合体：コラーゲンに基づく材料へのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ適用。 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． １９９４；１５（９）：６６５−６７２．）。

【0267】

本明細書に援用されるＬｕｏｎｇ−Ｖａｎら（微量被包ヘパラン硫酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ生体適合性および生物活性 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２８（２００７）２１２７−２１３６）は、ポリカプロラクトンマイクロカプセルからのＨＳの長期局在送達を記載する。

【0268】

バイオマテリアルのさらなる例は、ヒドロキシアパタイトまたはヒアルロン酸を取り込むポリマーである。
ＨＳ８と組み合わせて使用するために適したバイオマテリアルの一例は、ＪＡＸ^ＴＭ骨空隙充填剤（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎｅｐｈｅｗ）である。Ｊａｘ顆粒は、高純度の硫酸カルシウムで構成され、そして形状を保持して、制御された顆粒内多孔および顆粒遊走安定性を伴って足場を提供する。Ｊａｘ顆粒は体内で安全にそして完全に溶解する。

【0269】

他の適切なバイオマテリアルには、セラミックまたは金属（例えばチタン）、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、脱ミネラル化骨マトリックス（ＤＢＭ）、自己移植片（すなわち患者組織から得られた移植片）、または同種移植片（患者ではない動物の組織から得られた移植片）が含まれる。バイオマテリアルは、合成（例えば金属、フィブリン、セラミック）または生物学的（例えば動物組織、例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、ブタ）またはヒトから作製されるキャリアー材料）であってもよい。

【0270】

バイオマテリアルに、さらなる細胞を補充してもよい。例えば、バイオマテリアルに未分化骨前駆細胞、例えば幹細胞、例えば間葉系幹細胞、より好ましくはヒト間葉系幹細胞を「植え付けて」（または同時に合成して）もよい。

【0271】

治療されるべき被験体は、任意の動物またはヒトであることも可能である。被験体は好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。被験体は、非ヒト哺乳動物（例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類（齧歯類目の任意の動物由来の細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌牛、例えば乳牛、またはウシ目（ｏｒｄｅｒ Ｂｏｓ）の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ目（ｏｒｄｅｒ Ｅｑｕｉｄａｅ）の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長類）であることも可能である。非ヒト哺乳動物は、家庭のペット、あるいは商業的目的のために飼育されている動物、例えば競走馬、あるいは農場家畜、例えばブタ、ヒツジまたはウシであることも可能である。被験体はオスまたはメスであることも可能である。被験体は患者であることも可能である。

【0272】

本発明記載の方法を、示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実行することも可能である。用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、培養中の細胞を用いた方法を含むよう意図され、一方、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、損なわれていない多細胞生物を用いた方法を含むよう意図される。

【0273】

ヘパラン硫酸の投薬量
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ使用の両方において、ＨＳ８を約５００ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１００ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、９０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、８０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、７０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、６０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、４０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、３０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、２０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、５ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満；あるいは約１００ｍｇまたはそれ未満、５０ｍｇまたはそれ未満、４０ｍｇまたはそれ未満、３０ｍｇまたはそれ未満、２０ｍｇまたはそれ未満、１０ｍｇまたはそれ未満、５ｍｇまたはそれ未満、４ｍｇまたはそれ未満、３ｍｇまたはそれ未満、２ｍｇまたはそれ未満、あるいは１ｍｇまたはそれ未満；あるいは約０．３〜５μｇ／ｍｌ、０．３〜４、０．３〜３、０．３〜２．５、０．３〜２、０．３〜１．５、０．３〜１．０、０．３〜０．９、０．３〜０．８、０．３〜０．７、０．３〜０．６、０．３〜０．５、０．３〜０．４、１〜２、１〜１．７５、１〜１．５、１〜１．２５、１．２５〜２、１．５〜２、または１．７５〜２μｇ／ｍｌの１つの濃度または投薬量で用いることも可能である。

【0274】

ＦＧＦ２
本明細書において、ＦＧＦ２は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである、線維芽細胞増殖因子２（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはＦＧＦ−βとしても知られる）を指す。

【0275】

ＦＧＦ２は、多くの組織の基底膜に存在し、そしてシグナル刺激の非存在下では、膜に結合したまま留まると考えられる。ＦＧＦ２は、創傷治癒、腫瘍発生および血管新生に関連づけられてきている。

【0276】

チロシンキナーゼ受容体へのＦＧＦ２の結合は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）の活性化および細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を伴うシグナルカスケードを刺激する（例えば、Ｏｋ−Ｊｉｎ Ｐａｒｋら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２８５， （２０１０） ３５６８−３５７４を参照されたい）。

【0277】

ホモ・サピエンス由来のＦＧＦ２のアミノ酸配列を図２８に示す（ヘパリン結合ドメイン配列番号１を下線で示す）。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて寄託番号ＮＰ＿００１９９７．５（ＧＩ：１５３２８５４６１）の元に入手可能である。

【0278】

本明細書において、「ＦＧＦ２」には、図２８に例示するＦＧＦ２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性の１つを有するタンパク質またはポリペプチドが含まれる。

【0279】

ＦＧＦ２タンパク質またはポリペプチドには、好ましくはまた、配列番号１のアミノ酸配列、あるいは配列番号１に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の１つを有するアミノ酸配列を有する、ヘパリン結合ドメインも含まれる。

【0280】

ＦＧＦ２タンパク質またはポリペプチドは、全長ＦＧＦ２タンパク質またはポリペプチドの断片または一部切除物（ｔｒｕｎｃａｔｅ）であることも可能である。
ＦＧＦ２タンパク質は、任意の動物またはヒト、例えば非ヒト動物、例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類（齧歯類目の任意の動物由来のものを含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌牛、例えば乳牛、またはウシ目の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ目の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物；および／または非ヒト哺乳動物；および／またはヒトからのものであるか、またはそれに由来することも可能である。

【0281】

ＦＧＦ２の投薬量
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ使用の両方において、ＦＧＦ２をＨＳ８と組み合わせて用いることも可能である。本発明のいくつかの細胞培養法において、外因性ＨＳ２を培養に添加する。ＦＧＦ２の適切な濃度または投薬量には、約５００ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１００ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、９０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、８０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、７０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、６０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、５０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、４０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、３０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、２０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、５ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満；あるいは約１００ｍｇまたはそれ未満、５０ｍｇまたはそれ未満、４０ｍｇまたはそれ未満、３０ｍｇまたはそれ未満、２０ｍｇまたはそれ未満、１０ｍｇまたはそれ未満、５ｍｇまたはそれ未満、４ｍｇまたはそれ未満、３ｍｇまたはそれ未満、２ｍｇまたはそれ未満、あるいは１ｍｇまたはそれ未満；あるいは約０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、０．１〜０．２、０．１〜０．３、０．１〜０．４、０．１〜０．５、０．１〜０．６、０．１〜０．７、０．１〜０．８、０．１〜０．９、０．１〜１．０、０．１〜１．５、０．１〜０．２．０、０．１〜２．５、０．１〜３．０、０．１〜３．５、０．１〜４．０、０．１〜４．５、０．１〜５．０ｎｇ／ｍｌの１つが含まれる
いくつかの態様において、ＨＳ１６のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの使用は、外因性ＦＧＦ２の添加を排除する。例えば、本発明のいくつかの細胞培養法において、外因性ＦＧＦ２は培養に添加されない。

【0282】

本発明には、こうした組み合わせが明らかに許可され得ないかまたは明らかに回避される場合を除いて、記載する側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれる。
本明細書で用いるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定するとは見なされないものとする。

【0283】

本発明の側面および態様はここで、例として、付随する図を参照しながら例示されるであろう。さらなる側面および態様は、当業者には明らかであろう。本文に言及するすべての文書が本明細書に援用される。

【0284】

発明の詳細な説明
本発明の１またはそれより多い態様の詳細を、例として、本発明を実行するために本発明者らが意図する最適な様式の特定の詳細を含めて、以下の付随する説明に示す。当業者には、本発明が、これらの具体的な詳細に限定されることなく実施可能であることが明らかであろう。

【実施例】

【0285】

実施例１
本発明者らは、診療所で容易に使用可能なヘパラン硫酸（ＨＳ）調製物のスケールアップに適した、商業的に入手可能なブタＣｅｌｓｕｓヘパラン硫酸供給源由来の新規ＦＧＦ２結合性ＨＳの精製を調べた。

【0286】

ＦＧＦ２由来のヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）ペプチド配列ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ［配列番号１］を選択し（グリコサミノグリカンの構造およびそのタンパク質との相互作用；Ｇａｎｄｈｉ ＮＳおよび Ｍａｎｃｅｒａ ＲＬ．， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ２００８ Ｄｅｃ； ７２（６）：４５５−８２）、そしてこれをＦＧＦ２に結合する特異的ＨＳ種の精製に用いた。

【0287】

ペプチド合成に際して、該ペプチドを^３Ｈヘパリンアッセイに供し、ここで、ニトロセルロース膜に染み込ませたペプチドへの、用量依存方式での^３Ｈヘパリンの特異的結合を、^３Ｈヘパリンの総カウントに比較した。^３ＨヘパリンのＦＧＦ２−ＨＢＤペプチドへの特異的結合が示されたら、ペプチドを用いて、アフィニティクロマトグラフィによってＦＧＦ２に結合するブタＣｅｌｓｕｓ ＨＳから特異的ＨＳをプルダウンした。この新規ＨＳ種をＨＳ８と名付けた（そして変異体名ＨＳ８Ｇを与えた）。

【0288】

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合プレートを用いて、ＦＧＦ２との結合における特異性に関してＨＳ８を分析し、ここで、ＦＧＦ２へのＨＳ８の特異的結合を、ヘパリン、ブタＣｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ８陰性分画に比較して測定した。

【0289】

ＧＡＧをＧＡＧ結合プレート上に一晩プレーティングし（５μｇ／ｍｌ）、そしてその後、組換えヒトＦＧＦ２（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）とインキュベーションし、そしてＥＬＩＳＡ法を用いて、ＦＧＦ２へのＧＡＧ結合の特異性をチェックした。

【0290】

結果は明らかに、ＨＳ８が他のＧＡＧ種に比較して、ＦＧＦ２へのより高い結合性を有することを示した（図１）。ＨＳ８がＦＧＦ２に結合する能力を、他の増殖因子（ＶＥＧＦ、ＢＭＰ２、ＰＤＧＦＢＢ、ＦＧＦ１、およびＦＧＦ７）に対して比較し、これによって、ＨＳ８がＦＧＦ２に特異的であることが明らかになった（図２）。

【0291】

ＨＳ８をまた、ＳＴＲＯ１ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイに供して、ＨＳ８の生理活性を決定した。本発明者らは、対照に比較して、ｈＭＳＣの短期増殖において、異なる用量（５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、５０００ｎｇ／ｍｌおよび１００００ｎｇ／ｍｌ）の単独培地補充物としてＨＳ８を用いた。外因性増殖因子のいかなる添加も伴わずに、本発明者らは、ＨＳ８でｈＭＳＣの用量依存性増殖を観察した（図３および４）。

【0292】

実施例２
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、骨形成性、軟骨形成性、脂肪形成性、筋肉形成性、および他の細胞系譜への分化を導くことが可能であるプラスチック接着性細胞と広く定義され、そして近年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｚｕｌｍａら， ２０１１）によって、「多分化能間葉系間質細胞」の名称もまた、ＭＳＣに対して使われるようになった。ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、真皮組織、椎間板、羊水、多様な歯科組織、ヒト胎盤および臍帯血に見出されている（Ｓｉら、２０１１およびＺｕｌｍａら、２０１１）。ＭＳＣの療法的潜在能力が認識され、そして骨組織再生および非骨格組織再生などの多くの臨床的適用において、用いられてきている。近年、ＭＳＣの免疫抑制および抗炎症効果が記載された。これは、細胞表面上に主要組織適合性複合体Ｉ分子（ＭＨＣ−１）を低レベルで発現することにより、ＭＳＣが弱い免疫原性を持つこと、ＴおよびＢリンパ球両方の活性化および増殖を抑制可能であること、ならびに損傷を受けた組織を保護しながら、傷害を受けた組織の微小環境を調節することによる（Ｓｉら、２０１１およびＺｕｌｍａら、２０１１）。ＭＳＣが仲介し、ＧＶＨＤを治療するために有効に使用可能であるこの免疫抑制は、機構の種変動を有する（Ｒｅｎら、２００９およびＳｈｉら、２０１０）。サイトカインにプライミングされるマウスＭＳＣは、一酸化窒素（ＮＯ）によって仲介され、そしてヒトＭＳＣのサイトカイン・プライミングは、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を通じて実行される。

【0293】

ヘパリンおよびヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）
ヘパリンは、マスト細胞中で産生され、そして貯蔵され、そしてこれに比較して、ＨＳＧＡＧは、すべての動物組織で見られ、そしてこれらはＨＳ鎖が細胞表面またはＥＣＭタンパク質に結合する場合、プロテオグリカンとして存在可能である。ＨＳは、代謝、輸送、情報伝達、細胞接着、細胞増殖および分化に影響を及ぼし、そしてすべての臓器系を補助する（Ｂｉｓｈｏｐら、２００７およびＧａｎｄｈｉら、２００８）。ヘパリンおよびＨＳは、反復ウロン酸−（１→４）−Ｄ−グルコサミン二糖サブユニットからなる直鎖多糖である。ウロン酸は、Ｄ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸のいずれであってもよい。さらに、特定の場所での修飾は、異なるＮ−硫酸化、Ｏ−硫酸化およびＮ−アセチル化複合体配列を生じさせる［Ｏｒｉら、２００８］。ヘパリン中で最も豊富な二糖は、ＩｄｏＡ（２Ｓ）−（１→４）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）であり、したがって、鎖の長さ全体で高い負の電荷を生じさせ、これによってヘパリンはタンパク質への結合において、劣った選択性を示すかまたは選択性を示さない。他方で、ＨＳは、最も一般的な型として、非硫酸化ＧｌｃＡ−（１→４）−ＧｌｃＮＡ二糖を有し、非硫酸化ＮＡドメインの分離ブロックおよび非常に硫酸化されたヘパリン様ＩｄｏＡ−（１→４）−ＧｌｃＮＳ二糖のブロック（ＮＳドメイン）を生じさせる。ＮＡおよびＮＳドメインは、ＮＡ／ＮＳ遷移ドメインによって分離される。ＨＳ構造のこの多様性が、広範囲の生物学的機能の原因である。

【0294】

線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質およびヘパリン結合ドメイン
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、ヒトにおいて２２のメンバーを含む、ポリペプチド増殖因子の大きなファミリーである。これらは、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）として知られるＦＧＦ細胞表面受容体チロシンキナーゼのサブファミリーに結合し、そしてこれを活性化することによって、発生、分化、細胞増殖、血管形成および創傷治癒において大きな役割を果たす（Ｏｒｎｉｔｚら、１９９６）。さらに、ＦＧＦは、最もよく研究されたヘパリン結合タンパク質の１つであり、そしてＨＳＧＡＧは、ＦＧＦＲとの直接分子会合によって、ＦＧＦシグナル伝達を制御する（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ、２００１）。さらに、ＦＧＦＲ１を通じたＦＧＦ２シグナル伝達は、ＭＳＣ拡大に重要である（Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、１９９９）。

【0295】

ヘパリン／ＨＳとＦＧＦ２の相互作用
タンパク質のヘパリン／ＨＳ結合部位において、共通の構造特徴があることが多様な研究によって認識されてきている（Ｇａｎｄｈｉら、２００８；Ｈｉｌｅｍａｎら、１９９８およびＯｒｉら、２００８）。ＣａｒｄｉｎおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂは、１９８９年に、２１のヘパリン結合タンパク質を分析した後、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を決定する最初の試みを行い、そして典型的なヘパリン結合部位が、配列ＸＢＢＸＢＸまたはＸＢＢＢＸＸＢＸ、式中、Ｂは陽性荷電アミノ酸（アルギニン、リジンおよび稀にヒスチジン）であり、そしてＸはヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）残基である、を有しうることを提唱した。次のコンセンサス配列ＴＸＸＢＸＸＴＢＸＸＸＴＢＢは、いくつかのタンパク質のＸ線およびＮＭＲを比較した後、Ｈｉｌｅｍａｎらによって１９９８年に導入された。この配列において、Ｔはターンを定義し、Ｂは塩基性アミノ酸（アルギニンまたはリジン）を定義し、そしてＸはヒドロパシー残基を定義する。

【0296】

ＧＡＧおよびタンパク質間には強いイオン性相互作用が予期され、陽性荷電塩基性アミノ酸は、ヘパリン鎖上の負に荷電した硫酸またはカルボン酸基とイオン結合を形成する。これらの役割は、ヘパリンとの、そしておそらくＨＳ様ＮＳドメイン内の非常に硫酸化された領域との相互作用の決定要因である（Ｆｒｏｍｍら、１９９７およびＯｒｉら、２００８）。さらに、他のタイプの結合、すなわちファンデルワールス力、水素結合および疎水性相互作用がある。これらの結合は、より不均一なＨＳとの相互作用で役割を果たし、この場合、中性アミノ酸もまた必要とされる(Ｆｒｏｍｍら、１９９７およびＯｒｉら、２００８）。ＦＧＦ２を考慮すると、グルタミンおよびアスパラギンアミノ酸は、イオン結合に加えて、糖のヒドロキシル基と水素結合を形成することによって、ＨＳとの相互作用に重要な役割を果たす（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）。

【0297】

これまでの多くの公表された研究にしたがって、ＦＧＦ２のヘパリン結合ドメインとして、異なるペプチド配列があり、そしてこれらを表１に編集する。ここで、本発明者らは、アミノ酸を全長ＦＧＦ２配列（２８８ａａ）にしたがって番号付けする番号付け系を採用している。

【0298】

移植片対宿主病（ＧＶＨＤ)
造血細胞移植（ＨＣＴ)は、血液学的悪性疾患を治療するために用いられる集中的療法であり、同種ＨＣＴ法は年々増加しつつある（Ｆｅｒｒａｒａら、２００９）。ＨＣＴの主な合併症は、胃腸管、肝臓、皮膚、および肺に主に影響を及ぼす免疫学的障害であるＧＶＨＤである。Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ、１９６６〜６７によれば、ＧＶＨＤが起こるには３つの必要条件が満たされる必要があり、すなわち、１）移植片が、Ｔリンパ球である免疫学的適格細胞を含有しなければならず、２）レシピエントが移植ドナーに存在しない組織抗原を発現しなければならず、そして３）患者が移植細胞を無効にするために有効な反応を開始させることが不可能でなければならない。ＧＶＨＤ病態生理は、骨髄破壊性条件付け措置を用いて、宿主防御骨髄を除去した際に始まる。宿主の抗原提示細胞は、損傷を受けた組織によって産生されるサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ１、ＬＰＳ）のために活性化される。この段階で同種ＨＣＴをひとたび行うと、ドナーＴ細胞が活性化され、それによってさらなるサイトカインが産生されて、細胞性および炎症性反応が導かれ、ＧＶＨＤが生じる。非造血性幹細胞；ＭＳＣは、強力な免疫抑制作用のため、同種Ｔ細胞反応を減少させ、そしてＧＶＨＤを軽減させうる（Ｌｅ Ｂｌａｎｃら、２００８；Ｍｅｕｌｅｍａｎら、２００９およびＴｏｕｂａｉら、２００９）。

【0299】

療法目的のため、ｈＭＳＣをスケールアップする必要性
細胞に基づく療法におけるｈＭＳＣ使用の主な欠点は、すでに診療所で用いられてはいるが、十分な細胞数を達成することが困難であることである。骨髄単核細胞の０．０１％〜０．０００１％と同程度に低い可能性もあるほどｈＭＳＣが少数であるため、その広い使用が妨げられる。Ｃａｐｌａｎ、２００９は、骨髄を異なる年齢のドナーから得て、分散させ、培養フラスコに入れ、その後、ＣＦＵ−Ｆを計数し、そして有核骨髄細胞あたりのＭＳＣに対する年齢１０年を示した。有核骨髄細胞あたりのＭＳＣの顕著な減少が観察され、誕生から１０代までに１０倍減少し、そして１０代からさらに年齢が上がるとさらに１０倍の減少があった。明らかに、骨髄中のＭＳＣの数は年齢とともに減少した。さらに、Ｃａｐｌａｎは、これらの減少が、若年層および成体で観察される骨折治癒率と平行して減少することを指摘した。これに比較して、骨髄中の造血幹細胞の力価は１０^４有核骨髄細胞あたりほぼ１であり、個体の年齢を通じて一定のままであった。

【0300】

ｈＭＳＣの現在の拡大法
研究者らは、ｈＭＳＣを培養する際、骨髄微小環境を模倣することが可能であれば、臨床使用のための療法に適した数のｈＭＳＣを達成可能であると考えてきた。基本的に、模倣は、２つの広い方法によって達成可能であり、すなわち、ｈＭＳＣをＥＣＭとともに増殖させること、および外因性増殖因子補充とともに増殖させることである。ＥＣＭ基質を用いた場合、ｈＭＳＣ付着および累積細胞数の増加が観察された（Ｇｒｕｅｎｅｒｔら、２００７およびＭａｔｓｕｂａｒａら、２００４）が、拡大された細胞は幹細胞性を欠いていた（Ｃｏｏｌら、２００５）。さらに、ＦＧＦ２は、一般的に、外因性増殖因子補充物として用いられ、これはまた、標準培地での対照と比較して、細胞数の顕著な増幅も示した（Ｌｉｎｇら、２００６およびＳｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕら、２００６）。ＥＣＭ基質とともに増殖させた細胞と一致して、ＦＧＦ２とともに増殖させた細胞は、対照における多分化能ｈＭＳＣと比較して、増加した量の分化した前駆細胞を有した（Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、１９９９およびＷａｌｓｈら、２０００）。したがって、幹細胞性に不都合に影響を及ぼすことなく療法に適した数のｈＭＳＣを達成可能である、ｈＭＳＣの増殖を促進する分子が同定されたことは、ＧＶＨＤを軽減する、骨再生および骨髄移植のためのｈＭＳＣの臨床的使用において非常に有望であることが示された。

【0301】

ＨＳ ＧＡＧは、細胞の幹細胞性に影響を及ぼすことなく、ｈＭＳＣの増殖を改善する
Ｎｕｒｃｏｍｂｅらは、１９９３年、ＨＳ ＧＡＧによって制御される、ネズミ神経前駆細胞に対するＦＧＦの活性、およびこの相互作用が、ＦＧＦ２のその受容体への結合の必要条件であることを示した。さらに、ＦＧＦへのＨＳＧＡＧの結合には有意な相違があり、第９日、これらの細胞によって産生されるＨＳ ＧＡＧは、ＦＧＦ２に優先的に結合し、そして第１１日までには、ＨＳＧＡＧ結合はＦＧＦ１にシフトした。さらに、これらのユニークなヘパラン硫酸は、神経前駆細胞上の細胞表面受容体との相互作用を通じて、特異的受容体へのＦＧＦ２の結合を仲介する（Ｂｒｉｃｋｍａｎら、１９９５）。１９８８年、Ｂｒｉｃｋｍａｎらは、不死化胚性第１０日マウス神経上皮２．３Ｄ細胞からの２つの別個のＨＳプールの単離および特徴付けによって、これらの知見をさらに補助した。１つのプールは、対数増殖期の細胞に由来し、これはＦＧＦ−２の活性を増加させ、そしてもう一方のプールは接触阻害および分化を経ている細胞に由来し、ＦＧＦ１に対する優先性を有した。本発明者らの研究室によって以前記載されたように、ＨＳ２と称される胚性ＨＳ ＧＡＧ調製物は、多分化能の有意な喪失を伴わずにｈＭＳＣ増殖を増加させ、そしてｉｎ ｖｉｖｏで移植された際、マウスにおいて骨形成増加を導く。この証拠によって、ＥＣＭ構成要素ＨＳ ＧＡＧは、多分化能に不都合に影響を及ぼすことなく、ｈＭＳＣの増殖を改善させることが示唆される。したがって、ＦＧＦ２への高い結合アフィニティを有し、ＨＳ２に比較して、臨床設定で使用されるように容易にスケールアップ可能である、細胞増殖に対するその活性を増強させる、ＨＳ変異体に対する特別な必要性がある。

【0302】

結果
カラムクロマトグラフィによる、ＦＧＦ−２に対してより高い結合アフィニティを持つヘパラン硫酸（ＨＳ８）の単離
ＦＧＦ２結合性ＨＳ２を精製する戦略と一致して、本発明者らは、診療所で容易に使用可能なＨＳ調製物をスケールアップするため、商業的に入手可能なブタＣｅｌｓｕｓヘパラン硫酸供給源（Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）から別のＦＧＦ２結合性ＨＳを精製する可能性を探る。表１に提示するこれらのペプチド配列のうち、ＦＧＦ２−Ｇａｎｄｈｉ−ＨＢＤと名付けられた、^１５７ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ^１７２（Ｇａｎｄｈｉら、２００８）を用いた。

【0303】

［^３Ｈ］ヘパリンアッセイ
ペプチド合成に際して、これらを^３Ｈヘパリンアッセイに供し、ヘパリンに対するＦＧＦ２−ＨＢＤペプチドの結合能を試験した。既知の量のペプチドまたは飽和量のペプチドを同一のニトロセルロース膜上で乾燥させ、これをまず風乾し、そして次いで、真空オーブン中、８０℃で４５分間さらに乾燥させた。次いで、膜を１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そしてカウントバイアル中、４％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ中、０．１μＣｉの［^３Ｈ］ヘパリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国ボストン）と、１６時間インキュベーションした。その後、膜を洗浄し、そしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ ２８００ ＴＣＲ液体シンチレーション分析装置によって、放射活性を決定した。

【0304】

ＢＭＰ２−ＨＢＤを陽性対照として用い、既知の量のペプチド（配列番号１）を用いた際、これらは、用量依存性にＣＰＭ増加を示した［図６（Ａ）］。しかし、ニトロセルロース膜を５００μｇ／ｍｌペプチド溶液中で飽和させた際に、最高のカウントが示された。Ｎｅａｔ［^３Ｈ］ヘパリンからのＣＰＭパーセントを、５００μｇ／ｍｌ溶液レベルで、各ペプチドに関して計算した。ＢＭＰ２−ＨＢＤ（７．２％）が最高であり、次がＦＧＦ２−Ｇａｎｄｈｉ−ＨＢＤ（４．９７％）であった。［^３Ｈ］ヘパリンアッセイから得た結果によれば、ＦＧＦ２−Ｇａｎｄｈｉ−ＨＢＤを用い、アフィニティクロマトグラフィによって、ブタＣｅｌｓｕｓ ＨＳから、ＦＧＦへのより高いアフィニティ結合を有するＨＳ（ＨＳ８）をプルダウンした。クロマトグラムを図６（Ｂ）に示す。

【0305】

ＨＳ８の特徴付け
ＧＡＧ結合アフィニティアッセイ
ＨＳ８を、９６ウェルＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ、英国）を用い、ＦＧＦ２および他のタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）への結合におけるアフィニティアッセイに供し、ここで、ＨＳ８＋のＦＧＦ２への特異的結合を、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、ブタＣｅｌｓｕｓ ＨＳ（Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）およびＨＳ８陰性分画に比較して測定した。ＧＡＧをＧＡＧ結合プレート（２．５〜１０μｇ／ｍｌ）に一晩プレーティングし、そして標準アッセイ緩衝液（ＳＡＢ）中、０．２％魚類ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）で３７℃で１時間ブロッキングした。

【0306】

次いで、２００μｌ／ウェルの０〜１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦＧＦ２と、３７℃で２時間インキュベーションし、そしてその後、２００μｌ／ウェルの２５０ｎｇ／ｍｌ一次ビオチン化抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と３７℃で１時間インキュベーションした。次の工程において、プレートを２００μｌ／ウェルの２２０ｎｇ／ｍｌ ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で３０分間インキュベーションした。一晩インキュベーションからこの工程まで、プレートを各工程の間に、ＳＡＢで３回洗浄した。最後に、２００μｌ／ウェルのＳｉｇｍａＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ）で４０分間インキュベーションし、そしてＶｉｃｔｏｒ^３ １４２０マルチラベルカウンター、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒによって、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。

【0307】

試験した３つの濃度すべて（２．５、５および１０μｇ／ｍｌ）のＧＡＧすべてのＦＧＦ２への結合は、ＦＧＦ２の量が増加するにつれて、同様に増加し、そして１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦで飽和に達した（図８）。異なるＧＡＧをＦＧＦ２への結合に関して試験した際、結果は明らかに、ＨＳ８＋が、他のＧＡＧ種に対するよりも、ＦＧＦ２への結合の最高のアフィニティを有することを示した（図９）。Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ：ＨＳ８＋の１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２ポイントでの相違倍数を比較すると、比は１：１．５１であった。

【0308】

次いで、本発明者らは、異なるタンパク質に対するＨＳ８＋およびＨＳ８（−）分画の結合能を試験した（図１０）。ＨＳ８＋は、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ２、ＰＤＧＦＢＢ、ＦＧＦ１、およびＦＧＦ７に比較して、ＦＧＦ２への結合においてより高いアフィニティを有する［図１０（Ａ）］。一方、ＨＳ８（−）分画は、他のタンパク質に比較して、ＦＧＦ１への結合において最大のアフィニティを有する［図１０（Ｂ）］。

【0309】

Ｏｎｏら、１９９９から修飾して、異なるＧＡＧが、ＦＧＦ２と、ヘパリンに関して競合する能力をこのアッセイで試験した。既知の濃度のＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と異なる濃度のＧＡＧを、室温（ＲＴ）で、マイクロチューブ中、３０分間混合した。

【0310】

この４０μｌのビーズ溶液［２０μｌのへパリン−アガロースビーズ（タイプＩ、Ｓｉｇｍａ）およびポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−３０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）］に添加し、そしてＲＴで３０分間混合した。ヘパリンビーズを、ＢＳＡ−ＰＢＳ（ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ）で遠心分離（２０００ｒｐｍ、１分間）することによって３回洗浄し、そしてＰＢＳＴ（０．０２％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、そして各試験管に１００μｌの１：５００ビオチン化抗ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、そしてＲＴで１時間インキュベーションした。上述のように洗浄した後、１００μｌの１：１０ ＴＭＢ基質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、そしてＲＴで３０分間混合した。停止溶液（５０μｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を添加し、そして遠心分離後、１００μｌの上清を９６ウェルプレートに移した。Ｖｉｃｔｏｒ^３ １４２０マルチラベルカウンター、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒによって、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。

【0311】

最初に、添加したヘパリンビーズの量と結合するために必要なＦＧＦ２の量を、ＦＧＦ２最適化によって測定し、そしてＦＧＦ２用量２０ｎｇ／ｍｌを次の実験セットのために選択した［図１１（Ａ）］。

【0312】

次いで、競合アッセイにおいて使用すべきＧＡＧの範囲を得るため、本発明者らはまず、異なる量のヘパリンを用いた。５０μｇのヘパリンを添加すると、ビーズに付着する内部ヘパリンと競合するためにほぼ十分であった［図１１（Ｂ）］。したがって、本発明者らは、競合アッセイにおいて、０〜５０μｇ ＧＡＧの範囲を用いた［図１１（Ｃ）］。競合パーセントを考慮すると、ヘパリンは、最も競合性であり、５０μｇを添加することによって、ほぼ１３％に達し、次いで、ＨＳ８＋が４３％、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳが５０％、そしてＨＳ（−）が６３％であった。

【0313】

増殖アッセイ
２１歳のヒスパニック系男性ドナー由来のｈＭＳＣの２つの変種をこのアッセイに用い、これらは、磁気活性化細胞ソーティングによって単離されたＳＴＲＯ１陽性細胞（第５〜７継代）および慣用的プラスチック接着によって単離されたＨＭ２１細胞（第５継代）であった。細胞を３０００細胞／ｃｍ^２植え付け密度で植え付け、そして２４時間プレートに付着させた。次いで、５０〜１００００ｎｇ／ｍｌの範囲の単独の培地補充物として用いた異なる濃度のＨＳ８＋、および陽性対照としての２．５ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を培地に添加した。培地交換を２または３日のいずれかで行った。ＳＴＲＯ１細胞において、培地交換を２日ごとに行った、増加する濃度のＨＳ８＋は、生存細胞数を増加させ、そして第６日までに、対照に比較して、５０００ｎｇ／ｍｌが最高のカウントを生じた（図１２）。対照的に、培地交換を３日ごとに行ったＨＭ２１細胞は、第６日までに、１００００ｎｇ／ｍｌで、対照に比較して，わずかにより高いカウントを示した（図１３）。

【0314】

２つの細胞種で、生存細胞数に有意な相違が観察されるため、本発明者らは、第５継代のＳＴＲＯ１およびＨＭ２１細胞を６日間用いた増殖アッセイを行い、そして培地交換を３日ごとに行う対照に比較した。ＳＴＲＯ１は、ＨＭ２１細胞に比較して、わずかにより高い増殖カウントを示したが、どちらの細胞タイプでも、対照および処理細胞は、ほぼ同じ細胞カウントを生じた［図１４（Ａ）］。次いで、本発明者らは、先の実験から、培地交換の異なる時間間隔に基づいて、第６日でのＳＴＲＯ１細胞の細胞カウント／ｃｍ^２を計算した［図１４（Ｂ）］。興味深いことに、３日ごとの培地交換に比較して２日ごとに培地交換を行うと、対照および処理細胞の両方でより多い細胞カウントが得られた。さらに、培地交換を２日ごとに行うと、処理細胞カウントは、未処理対照よりも高かった。

【0315】

要約
本発明者らは、配列^１５７ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ^１７２を用いて、ブタＣｅｌｓｕｓ ＨＳから、アフィニティクロマトグラフィによって、ＦＧＦ２に対してより高いアフィニティ結合性であるＨＳ（ＨＳ８）を調製した。

【0316】

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アッセイ結果において、ＨＳ８＋が、他のＧＡＧ種に比較して、ＦＧＦ２に最高の結合アフィニティを有することが明らかに示された。さらに、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ：ＨＳ８＋の１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２ポイントでの相違倍数を比較すると、比は１：１．５１であった。競合パーセントを考慮して、ヘパリンビーズ競合（ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ）アッセイにおいて、ヘパリンは、最も競合性であり、５０μｇを添加することによって、ほぼ１３％に達し、次いで、ＨＳ８＋が４３％、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳが５０％、そしてＨＳ（−）が６３％であった。磁気活性化細胞ソーティングによって単離されたＳＴＲＯ１＋ｈＭＳＣおよび慣用的プラスチック接着によって単離されたＨＭ２１ ｈＭＳＣを細胞増殖アッセイに用い、５μｇ／ｍｌの濃度でＨＳ８＋を単独の培地補充剤として用いた際、そして培地交換を２日ごとに行った際、より高い細胞カウントが得られた。結論として、本発明者らは、現在、商業的に入手可能なヘパラン硫酸供給源のプールから、ＦＧＦ２により高い結合アフィニティを有するヘパラン硫酸（ＨＳ８）を成功裡に単離してきており、ＨＳ８は、ＦＧＦ２により高い結合アフィニティを所持し、そしてｈＭＳＣが増殖する能力を増加させる。

【0317】

結論として、本発明者らは、現在、商業的に入手可能なヘパラン硫酸供給源のプールから、ＦＧＦ２により高い結合アフィニティを有するヘパラン硫酸（ＨＳ８）を成功裡に単離してきており、そしてＨＳ８が、ヘパリンを含む他のＧＡＧに比較して、より高い結合能を有することを示した。さらに、ＨＳ８＋は、単独の培地補充剤として用い、培地交換を２日ごとに行った際、細胞増殖を増加させる。したがって、本発明者らは、これらの細胞を、ＦＧＦ２に対する高いアフィニティを有するように操作されたヘパラン硫酸（ＨＳ８）中で培養することによって、高品質のｅｘ ｖｉｖｏ拡大ＭＳＣに関する必要性に取り組んだと考えている。

【0318】

さらなる研究
ＦＧＦ２に特異的なＨＳ（ＨＳ８）の単離
本発明者らは、ＦＧＦ２に対してより高い結合アフィニティを有するＨＳであるＨＳ８の単離を成功裡に達成したが、［^３Ｈ］ヘパリンアッセイ、ＧＡＧ結合アッセイ、およびＬｅｅら、２００７にしたがった細胞付着アッセイによって、他のＦＧＦ２ ＨＢＤペプチド配列（表１）をさらに試験するであろう。

【0319】

結合アフィニティアッセイ
ＨＳ８の結合アフィニティがＧＡＧ結合プレートによってすでに確認されており、そしてドットブロットアッセイおよびＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００を用いた動力学結合（Ｃａｉｎら、２００５）によって、さらに検証されるであろう。

【0320】

競合アッセイ
ＥＬＩＳＡ法由来の結果は、ウェスタンブロット法によってさらに確認されるであろう。

【0321】

増殖アッセイ
増殖アッセイの結果は、より多くのｈＭＳＣ株を用いることによって、そしてまたより低い継代の細胞を用いることによって、さらに検証されるであろう。さらに、短期増殖アッセイは、ＢＲＤＵ（Ｒｏｃｈｅ）およびＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）試薬を用いることによって、実行されるであろう。

【0322】

二糖分析
ＨＳ８の二糖分析は、Ｍｕｒａｌｉら、２００９にしたがった陰イオン交換クロマトグラフィを用いて行われるであろうし、そしてＨＳ８の組成が明らかになりうる。

【0323】

ＦＧＦ２の安定性
安定性アッセイは、ＳＹＰＲＯアッセイおよびＦＧＦ２ ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅアッセイとして行われるであろう。ＳＹＰＲＯアッセイにおいて、ＦＧＦ２タンパク質とＧＡＧの相互作用は、特異的Ｓｙｐｒｏオレンジ色素（Ｕｎｉｅｗｉｃｚら、２０１０）によって、タンパク質の変性温度として測定されるであろう。細胞培養におけるＦＧＦ２濃度を測定するため、ＦＧＦ２ ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅアッセイを製造者の推奨（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡカタログ番号ＤＦＢ５０）にしたがって行うであろう。結果を図４６に示す。

【0324】

ＨＳ８を用いて増殖させたｈＭＳＣの生物学的活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでのチェック
多分化能は、プラスチック接着、骨形成、脂肪形成および軟骨形成組織への分化、ならびに表面マーカーのＦＡＣＳに関してチェックされるであろう（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００６）。ＣＦＵ−Ｆアッセイは、骨髄吸引物、およびＨＳ８を含みまたは含まずに拡大したｈＭＳＣで行われるであろう（Ｃａｗｔｈｏｎ、２００２およびＧｕｉｌｌｏｔら、２００７）。ｈＭＳＣの免疫調節活性を混合Ｔリンパ球アッセイによって評価するであろう。

【0325】

ＨＳ８を用いて増殖させたｈＭＳＣの生物学的活性のｉｎ ｖｉｖｏでのチェック
単離しそしてＨＳ８の存在下で増殖させた細胞を、マウス骨再生モデル（Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏら、２０１０）において用い、そしてまた、ＧＶＨＤの異種移植ヒトＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデル（Ｔｉａｓｔｏら、２００７およびＴｏｕｂａｉら、２００９）において用いるであろう。

【0326】

実施例３
ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ）を用いて、ＦＧＦ２に対する異なるＧＡＧの結合能を評価した。ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）ＢＭＰ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦに関する異なるＧＡＧの結合能もまた、ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ）を用いて評価した。用いた材料および方法論を以下に記載する。

【0327】

ＨＳ８は、ヘパリンとほぼ同程度にＦＧＦ−２に結合することが見出され、そして未精製出発Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ８−フロースルー分画よりも確かによく結合することが見出された（図１５）。

【0328】

ＨＳ８（ＨＳ８＋）は、試験したすべての他のＨＢＧＦよりもＦＧＦ２に優先的に結合し、そしてヘパリンよりもＦＧＦ２により高い結合能を有し、すなわち、ＨＳ８は、ＦＧＦ２に特異的結合を示す。ＨＳ８−および未精製出発Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳは、試験したＨＢＧＦのいずれに対してもほとんど優先性を示さなかった（図１６）。

【0329】

材料
１． 標準的アッセイ緩衝液（ＳＡＢ）−１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２
２． ブロッキング緩衝液−０．４％魚類ゼラチン（Ｓｉｇｍａカタログ番号６７０４１）＋ＳＡＢ
３． ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ、英国）
４． Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ由来のタンパク質：ＢＭＰ２−カタログ番号３５５ＢＭ、ＦＧＦ１−カタログ番号２３１ＢＣ、ＦＧＦ２−２３３ＦＢ、ＦＧＦ７−カタログ番号２５１ＫＧ、ＰＤＧＦ ＢＢ−カタログ番号２２０ＢＢ、ＶＥＧＦ−カタログ番号２９３ＶＥ
５． Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ由来の抗体：ＢＭＰ２−カタログ番号ＢＡＭ３５５２、ＦＧＦ１−カタログ番号ＢＡＦ２３２、ＦＧＦ２−ＢＡＭ２３３、ＦＧＦ７−カタログ番号ＢＡＦ２５１、ＰＤＧＦ ＢＢ−カタログ番号ＢＡＦ２２０、ＶＥＧＦ−カタログ番号ＢＡＦ２９３
６． ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ２６３６）
７． Ｓｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｎ２７７０）
方法
１． ＳＡＢにＧＡＧを溶解する（５μｇ／ｍｌ）
２． ２００μｌのＧＡＧ溶液／ウェルをＧＡＧ結合プレートに添加し、そして光から保護しながら、ＲＴで一晩インキュベーションする
３． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
４． ２５０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液とプレートを、光から保護しながら、３７℃で１時間インキュベーションする
５． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
６． タンパク質をブロッキング緩衝液に溶解し、そして連続希釈：０、０．７８１、１．５６、３．１２５ｎＭを行う
７． ２００μｌ／ウェルの希釈タンパク質を、ＧＡＧコーティングプレートに分配し、そして３７℃で２時間インキュベーションする
８． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
９． ２００μｌ／ウェルの２５０ｎｇ／ｍｌのブロッキング溶液中のビオチン化一次抗体を添加し、そして３７℃で１時間インキュベーションする
１０． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
１１． ２００μｌ／ウェルの２２０ｎｇ／ｍｌのブロッキング溶液中のＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰを添加し、そして３７℃で３０分間インキュベーションする
１２． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
１３． ２００μｌ／ウェルの現像試薬：ＤＩ水中のＳｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸を添加し、そしてＲＴで４０分間インキュベーションする
１４． ４０５ｎｍで吸光度を読み取る
実施例４
ＢｒｄＵ取り込み増殖アッセイを行い、ｈＭＳＣ増殖に対するＨＳ８の効果を確立した（プロトコルを以下に記載する）。

【0330】

ヒト間葉系幹細胞のＨＳ８（ＨＳ８＋）に対する用量−反応を、ＢｒｄＵ取り込みによって、３６時間に渡って監視した。投薬陽性対照として、ＦＧＦ２を用いた。ＨＳ８＋は、ｈＭＳＣ増殖を増進し、そして他のＧＡＧよりも有意により高い刺激を提供することが見出された（図１７）。

【0331】

プロトコル（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（比色） Ｒｏｃｈｅ）
１． 細胞植え付け−１９０μｌの培地／ウェル中、５０００細胞（９６ウェルプレート）
２． 培地−１０００ｍｇ／Ｌ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）＋１％ ２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ
３． ３７℃および５％ＣＯ_２で６時間インキュベーションする
４． ６時間インキュベーションした後、レイアウトにおけるように指定したウェルに関して１０μｌの培地中、異なる用量の処理を加える
５． ＦＧＦ２（ｎｇ／ｍｌ）およびＧＡＧ（μｇ／ｍｌ）−１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５
６． 処理を伴い、３７℃および５％ＣＯ_２で３６時間インキュベーションする
７． ＢｒｄＵを各ウェルに添加する
８． 細胞をＢｒｄＵで２時間、３７℃および５％ＣＯ_２で標識する（２０μｌのＢｒｄＵ標識溶液／ウェルを添加する）
９． プレートを軽く叩くことによって、標識培地を除去する
１０． ２００μｌ／ウェルのＦｉｘＤｅｎａｔを細胞に添加し、そして１５〜２５℃で３０分間インキュベーションする
１１． 軽く振りそして叩くことによって、ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を完全に除去する
１２． １００μｌ／ウェルの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ作業溶液を添加し、そして１５〜２５℃で９０分間インキュベーションする
１３． 振り落とすことによって抗体コンジュゲートを除去し、そして２５０μｌ／ウェルの洗浄溶液（１ｘＰＢＳ）でウェルを３回リンスする
１４． 軽く叩くことによって、洗浄溶液を除去する
１５． １００μｌ／ウェルの基質溶液を添加し、そして１５〜２５℃で３０分間インキュベーションする。

【0332】

１６． ３７０ｎｍでの吸光度を測定する（参照波長：４９２ｎｍ）
実施例５
ＦＡＣＳに基づく細胞増殖アッセイを行って、ｈＭＳＣ増殖に対するＨＳ８の影響を確立した（プロトコルを以下に記載する）。

【0333】

ヒト間葉系幹細胞のＨＳ８（ＨＳ８＋）に対する用量−反応をＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ（ＦＡＣＳに基づく）法によって６日間監視した。用量陽性対照として、ＦＧＦ２を用いた。ＨＳ８は、ｈＭＳＣ増殖を増進し、そして有意な刺激を提供することが見出された。

【0334】

細胞増殖プロトコル
材料
１． ＨＭ２０ ｈＭＳＣ−男性ヒスパニック系２０歳のドナー（Ｌｏｎｚａより購入）
２． ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）
３． 維持培地：ＤＭＥＭ（１０ｍｇ／ｌグルコース）、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
４． ＨＳ８（＋）、バッチ２、ＨＳ８（−）バッチ２、ブタ粘膜ヘパラン硫酸（Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ３１４９）
５． Ｇｕａｖａ Ｆｌｅｘ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
方法
１． ＨＭ２０細胞を２４ウェルプレート上、５００μｌ／ウェルの培地中、３０００細胞／ｃｍ^２でプレーティングする（第０日）
２． 第１日−５００μｌの新鮮な培地中、増加する濃度のＦＧＦ２（ｎｇ／ｍｌ）およびＧＡＧ（μｇ／ｍｌ）で培地交換する−１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６。

【0335】

３． 培地を２日ごとに交換する
４． 指定した時点で細胞を採取する（第２日、第４日および第６日）−１００μｌのトリプシンを用い、そして１００μｌの培地（ｔ＝第２日）または３００μｌの培地（第４日および第６日）で中和する
５． 細胞をＧｕａｖａ装置中でカウントした（Ｇｕａｖａ ｆｌｅｘ試薬：細胞懸濁物は１：２００である）
実施例６−ヒト間葉系幹細胞単離
ヒト骨髄（ＢＭ）単核細胞の調製
ヒト骨髄（ＢＭ）の収集および密度勾配分離によるＢＭ単核細胞の調製
１． インフォームドコンセントの後、およそ４０ｍＬのヒト骨髄（ＢＭ）を、健康な若い志願者（１８〜４０歳）から、後部腸骨稜（寛骨）からの吸引によって収集する。ＢＭを直ちに保存剤不含、ナトリウム、ヘパリン含有５０ｍＬ試験管に入れる。

【0336】

２． １０μＬアリコットを取り除き、そして白血球液（ＷＣＦ）に１：２０で希釈し、そして有核細胞内容物を血球計算板で数える。
３． 次いで、等体積のブロッキング緩衝液をＢＭ吸引物に添加し、よく混合し、次いで、７０μｍのＦａｌｃｏｎ細胞濾過器を通じて濾過して、いかなる小さい塊および骨断片も取り除く。

【0337】

４． 次いで、３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）溶液をおよそ１２の丸底１４ｍＬポリスチレンＦａｌｃｏｎ試験管の底に分配し、そして７．５ｍＬの希釈ＢＭを注意深く重層する。

【0338】

５． 試験管を４００ｇで、室温で３０分間遠心分離する。
６． 使い捨てプラスチックパスツールピペットを用いて、白血球バンドをすべての試験管から回収し、そして４ｘ１４ｍＬポリプロピレン試験管内にプールする。

【0339】

７． 細胞をＨＨＦ洗浄緩衝液で希釈し、そして試料を４００ｇで、４℃で１０分間遠心分離することによって、ＢＭＭＮＣをペレットにする。
８． 緩衝液を吸引し、そして細胞を１つの試験管にプールする。

【0340】

接着によるＭＳＣの単離
１． ＢＭＮＣ分画を、維持培地（ＤＭＥＭ、１ｇ／ｌグルコース、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン）中、１５ｃｍプレートに植え付け、そして最初の培地交換前に、細胞を３日間接着させる。

【0341】

２． ３〜４日ごとに培地交換しながら、維持培地中で細胞を培養し、そして８５％集密になったら、０．１２５％トリプシンを用いて、ルーチンに継代する。再プレーティングの際、細胞を３，０００／ｃｍ^２で植え付ける。すべての培養を加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。

【0342】

３． 非酵素細胞解離溶液（ＣｅｌｌＳｔｒｉｐｐｅｒ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、米国）を用いて、細胞を培養から除去し、そして計数前に１回、ＰＢＳで洗浄する。次いで、１ｘ１０^５細胞を９６ウェルプレートにアリコットし、そして細胞を４５０ｘｇで５分間ペレットにする。あらかじめ希釈した、２％ＦＣＳ／ＰＢＳ中の免疫表現型決定抗体溶液を、続いて添加し、そして細胞を氷上で２０分間インキュベーションする。次いで、細胞を２％ＦＣＳ／ＰＢＳ中で２回洗浄した後、２％ＦＣＳ／ＰＢＳ中に再懸濁して、そしてＧＵＡＶＡ ＰＣＡ−９６ベンチトップフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、米国）で分析する。すべての試料を３つ組で測定する。

【0343】

ＳＴＲＯ−１陽性ＢＭＳＳＣの磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）
ＭＡＣＳの使用は、ＢＭＳＳＣ集団の部分的精製、および全体の幹細胞収量の損失となる高い喪失を伴わない多数のＢＭＭＮＣのプロセシングを可能にする。密度勾配遠心分離後、およそ１〜２ｘ１０^８単核細胞をＢＭ吸引物４０ｍＬから回収する。免疫標識前に、ＢＭＭＮＣを０．５ｍＬブロッキング緩衝液中に再懸濁し、そして氷上でおよそ３０分間インキュベーションして、抗体のＦｃ受容体仲介性結合の可能性を減少させる。

【0344】

磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を使用したＳＴＲＯ−１＋ＢＭＳＳＣの単離
１． ４００ｇ、４℃で１０分間遠心分離することによって、ＢＭＭＮＣをペレットにし、そして５ｘ１０^７ ＢＭＭＮＣあたり５００μｌのＳＴＲＯ−１上清中に再懸濁し、そして時々穏やかに混合しながら、氷上で６０分間インキュベーションする。

【0345】

２． ＢＭＭＮＣをＨＨＦ洗浄緩衝液で２回洗浄し、そして次いで、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異的）を１／５０希釈で含有する０．５ｍＬのＨＨＦに再懸濁し、そして４℃で４５分間インキュベーションする。

【0346】

３． ＢＭＭＮＣをＭＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄し、そして４５０μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、これに５０μＬのストレプトアビジンマイクロビーズを添加する（９０μＬ ＭＡＣＳ緩衝液中、１０μＬのマイクロビーズ／１０^７細胞）。混合物を氷上で１５分間インキュベーションする。

【0347】

４． 氷冷ＭＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄した後、細胞の少量のアリコットをフローサイトメトリー分析のために除去する（プレ試料）。次いで、残りの細胞をミニＭＡＣＳカラム上に入れる（１０^８細胞のカラム容量、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＳカラム）。ＳＴＲＯ−１−細胞（陰性分画）は、カラム内に保持されず、そして引力下、溶出物内で新鮮な２ｍＬポリプロピレン試験管内に通過する一方、ＳＴＲＯ−１＋細胞は磁化マトリックスに付着したままである。

【0348】

５． カラムを０．５ｍL ＭＡＣｓ緩衝液で３回洗浄して、いかなる非特異的結合ＳＴＲＯ−１−細胞も取り除き、これを新鮮な２ｍＬポリプロピレン試験管内に収集する。
６． カラムを磁場から回収した後、カラムをＭＡＣＳ緩衝液でフラッシュすることによって、ＳＴＲＯ−１＋細胞（陽性分画）を新鮮な２ｍＬポリプロピレン試験管内に回収する。次いで、ＳＴＲＯ−１＋細胞をカウントし、そして二色ＦＡＣＳのためにプロセシングする。

【0349】

７． プレＭＡＣＳ、ＳＴＲＯ−１−およびＳＴＲＯ−１＋分画各々から、少量の試料（０．５〜１．０ｘ１０^５細胞）を、０．２ｍＬのストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲート（１／５０）を含有する別個の２ｍＬポリプロピレン試験管に取り除く。次いで、細胞試料を氷上でさらに５分間インキュベーションして、濃縮処置の評価を可能にする。非標識プレＭＡＣＳ（１．０ｘ１０^５細胞）細胞の試料は、陰性対照として働く。

【0350】

８． これらの試料をＨＨＦで２回洗浄し、ＦＡＣＳ固定溶液中で固定し、そして続いて、フローサイトメトリーによって分析して、純度および回収を評価する。
９． この時点で、部分的に精製されたＳＴＲＯ−１＋ＢＭＳＳＣを培養拡大してもよいし、またはさらに二色ＦＡＣＳによって精製してもよい。

【0351】

コロニー効率アッセイによる骨髄品質の評価
ヒト骨髄吸引物におけるＣＦＵ−Ｆコロニーの予期される発生率は、プレーティングした１０^５細胞あたり、およそ５〜１０ ＣＦＵ−Ｆである。

【0352】

１． ＢＭＭＮＣを、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭ ｌ−グルタミン、１００μＭ ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、およびβ−メルカプトエタノール（５ｘ１０^−５Ｍ）を補充したα−ＭＥＭ中、ウェルあたり０．３、１．０、および３．０ｘ１０^５細胞で、６ウェル培養プレートに植え付ける。培養を３つ組でセットアップし、そして５％ＣＯ２および＞９０％湿度中、３７℃で１２日間インキュベーションする。

【0353】

２． 第１２日培養をＰＢＳで２回洗浄し、そして次いで、ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中、２０分間固定する。
３． 次いで、固定した培養を０．１％（ｗ／ｖ）トルイジンブルー（１％パラホルムアルデヒド溶液中）で１時間染色し、次いで、水道水でリンスし、そして乾燥させる。５０細胞より大きい凝集物をＣＦＵ−Ｆとしてスコア付けする。

【0354】

非常に精製されたＢＭＳＳＣの蛍光活性化細胞ソーティング
すべての測定可能なＣＦＵ−Ｆが、ＳＴＲＯ−１＋ＢＭＭＮＣ分画に含有される一方、ＢＭＳＳＣは、総ＳＴＲＯ−１＋集団の２％未満にしか相当しない。大部分のＳＴＲＯ−１＋細胞は、グリコホリン−Ａ＋有核赤血球およびある程度のＣＤ１９＋ Ｂ細胞である。したがって、ＳＴＲＯ−１発現のみに基づくＢＭＳＳＣの選択は、ＣＦＵ−Ｆの部分的な濃縮しか生じない（およそ１０倍）。クローン原性ＢＭＳＳＣは、すべて、ＳＴＲＯ−１^明細胞分画に含有され、これはさらに、有核赤血球およびリンパ球上には存在しないマーカー、特にＣＤ１０６およびＣＤ１４６の発現に基づいて、二色ＦＡＣＳによって区別されうる。以下に記載する方法は、総ＳＴＲＯ−１＋細胞分画、ＳＴＲＯ−１^明／ＣＤ１０６＋ ＢＭＭＳＣ（１．４％±０．３；ｎ＝２０）の少数の下位集団の単離を可能にし、ここで、プレーティングされた２〜３細胞のうち１つが、ＣＦＵ−Ｆを形成する能力を有する。この濃縮レベルは、未分画ＢＭＭＮＣ（プレーティングされた１０，０００細胞あたり１ ＣＦＵ−Ｆ）で観察されるＣＦＵ−Ｆの平均発生率よりほぼ５，０００倍高い。

【0355】

フローサイトメトリー細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いたＳＴＲＯ−１明/ＣＤ１０６＋ ＢＭＳＳＣの単離
１． 免疫標識前に、ＭＡＣＳ単離ＳＴＲＯ−１＋細胞ＢＭＭＮＣ（１ｘ１０^８ ＢＭＭＮＣから、ルーチンに２〜５ｘ１０^６細胞）を、２色免疫蛍光およびＦＡＣＳ用の調製において、０．５ｍＬ ＨＨＦに再懸濁する。

【0356】

２． およそ３〜５ｘ１０^５ ＭＡＣＳ単離ＳＴＲＯ−１＋細胞を３つの適切にラベリングされた試験管に分配し、これに、以下を添加する：
（ｉ）一次抗体なし（二重陰性対照）、氷上に維持
（ｉｉ）ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲート（ＨＦＦ中、１／１００希釈）、氷上で３０分間インキュベーション（ＦＩＴＣ対照）。次いで、細胞をＨＨＦで２回洗浄する。

【0357】

（ｉｉｉ）ＨＦＦ中で２０μｇ／ｍＬに希釈した０．５ｍＬのネズミＩｇＧ抗ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）。ＳＴＲＯ−１＋細胞を氷上で３０分間インキュベーションし、ＨＨＦ中で２回洗浄し、そして０．２ｍＬのＰＥコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）に再懸濁する（ＰＥ対照）。試料をインキュベーションし、そして洗浄し、次いで、ＨＦＦ中に再懸濁する。

【0358】

（ｉｖ）残りの１〜２ｘ１０^６ ＭＡＣＳ単離ＳＴＲＯ−１＋細胞を、０．５ｍＬネズミＩｇＧ抗ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）に再懸濁し、そして上述のようにインキュベーションし、ＨＨＦ中で２回洗浄し、そして０．２ｍＬのＰＥコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）およびストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲート（ＨＨＦ中、１／１００希釈）に再懸濁し、次いで、氷上で３０分間インキュベーションする（ソーティング試料）。次いで、細胞を前述のように洗浄し、次いで、ＨＨＦに再懸濁する。

【0359】

３． 試料を、ＨＨＦ中、ｍＬあたり１ｘ１０^７細胞の濃度に再懸濁した後、ＦＩＴＣおよびＰＥを同時に検出可能な４８８ｎｍの波長で、２５０ＭＷアルゴンレーザー放出光を取り付けた任意のソーター上でソーティングする。試料（ｉ〜ｉｉｉ）を用いて、ＦＩＴＣおよびＰＥ両方の補償を確立する。５． 試料（ｉｖ）からソーティングされたＳＴＲＯ−１^明／ＶＣＡＭ−１＋細胞を、適切な増殖培地を含有する試験管中に収集し、そして混合する。６． 上述のように細胞カウントを行う。次いで、ソーティングした細胞を培養する。

【0360】

ヒトＢＭＳＳＣのｅｘ ｖｉｖｏ培養
血清豊富培地
１． ＳＴＲＯ−１^明／ＣＤ１０６＋単離ＢＭＳＳＣ集団（ｃｍ^２あたり、１〜３ｘ１０^４）を、２０％ウシ胎児血清、１００μＭ ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、２ｍＭ ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したイーグル培地のα修飾（α−ＭＥＭ）を含有する組織培養フラスコまたはプレート中、４％ＣＯ２中、＞９０％の相対湿度で、３７℃で２週間培養する。培養が８０〜９０％の集密を達成したら、初代ＢＭＳＳＣ集団を継代する。

【0361】

２． 接着培養を血清不含ＨＢＳＳで１回洗浄し、そしてＴ７５フラスコあたり２ｍＬの０．５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を３７℃で５〜１０分間添加することによる酵素消化によって、細胞を解放する。

【0362】

３． ０．４％トリパンブルー／ＰＢＳ中、単細胞懸濁の１：５希釈を調製することによって、細胞生存度を評価し、そして血球計算板を用いて生存細胞数を決定する。
４． ＢＭＭＳＣ単細胞懸濁物をプールし、そして１０％ＦＢＳ、１００μＭ ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、２ｍＭ ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭ増殖培地中、ｃｍ^２あたり０．５〜１．０ｘ１０^４で再度植え付け、そして５％ＣＯ_２中、＞９０％の相対湿度で、３７℃でインキュベーションする。培地を吸引し、そして新鮮に調製し、３７℃に温めた等量の培地と交換することによって、培養に２回給餌する。

【0363】

血清枯渇培地
この方法は、造血前駆細胞の増殖のために最初に開発された血清枯渇培地（ＳＤＭ）の修飾である。

【0364】

１． ｃｍ^２あたり５μｇのフィブロネクチン溶液で、室温で９０分間プレコーティングすることによって、フィブロネクチンコーティングプレートまたはフラスコを調製する。この後、フィブロネクチン溶液を吸引し、そして培養容器を無菌ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を植え付ける。

【0365】

２． ＳＴＲＯ−１^明／ＣＤ１０６＋単離ＢＭＳＳＣ集団（ｃｍ^２あたり、１〜３ｘ１０^４）を、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｃｏｈｎ分画Ｖ）、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン、ヒト低密度リポタンパク質、２００μｇ／ｍＬ鉄飽和ヒトトランスフェリン、２ｍＭ ｌ−グルタミン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム（１０^−８Ｍ）、１００μＭ ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、β−メルカプトエタノール（５ｘ１０^−５Ｍ）、１０ｎｇ／ｍＬ血小板由来増殖因子−ＢＢ、５０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭ含有培地中に懸濁されたフィブロネクチンコーティング組織培養フラスコまたはプレート中で培養する。

【0366】

３． 次いで、培養を、３７℃、４％ＣＯ_２、＞９０％の相対湿度で２週間インキュベーションする。培養が８０〜９０％集密を達成したら、初代ＢＭＳＳＣ集団を継代する。
ｅｘ ｖｉｖｏ拡大ＭＳＣの凍結保存
１． ルーチンに、上述のようなトリプシン／ＥＤＴＡ消化によって、培養拡大されたＭＰＣの単細胞懸濁物を調製する。次いで、細胞を希釈し、そして冷ＨＦＦ中で洗浄する。

【0367】

２． 細胞ペレットをＦＢＳ中、ｍＬあたり１ｘ１０^７細胞の濃度で再懸濁し、そして氷上で維持する。次いで、細胞を穏やかに混合しながら、等体積の凍結混合物（冷ＦＢＳ中、２０％ＤＭＳＯ）を漸次添加して、１０％ＤＭＳＯ／ＦＢＳ中、ｍＬあたり、５ｘ１０^６細胞の最終濃度を生じる。次いで、１ミリリットルのアリコットを、氷上であらかじめ冷却した１．８ｍＬの凍結バイアル中に分配し、次いで、速度調節フリーザーを用いて、分あたり−１℃の速度で凍結させる。

【0368】

３． 次いで、凍結バイアルを、長期保存のため、液体窒素に移す。３７℃水槽中で細胞を迅速に融解することによって、凍結ストックの回収を達成する。次いで、細胞を冷ＨＦＦ中に再懸濁し、そして２８０ｇで１０分間回転させる。

【0369】

４． 細胞の生存度を評価するため、１：５希釈を０．４％トリパンブルー／ＰＢＳ中で調製し、そして細胞の数を、血球計算板を用いて決定する。典型的には、この方法は、８０〜９０％の生存度を生じる。

【0370】

実施例７−コロニー形成単位−線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイ
以下に記載する方法論を用いて、ｈＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ特性を評価した。４継代に渡って、非補充対照培地の１つにおいてｈＭＳＣを増殖させ、そして次いで、非補充対照培地、あるいはヘパリン（１．２５μｇ／ｍｌ）、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（１．２５μｇ／ｍｌ）、ＨＳ８−（１．２５μｇ／ｍｌ）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）（１．２５μｇ／ｍｌ）またはＨＳ８（ＨＳ８＋）（２．５μｇ／ｍｌ）の１つを加えた対照培地の１つにおいて増殖させた。

【0371】

材料
１． ｈＭＳＣ−（Ｌｏｎｚａより購入）
２． 維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌグルコース）、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン。

【0372】

３． １００％メタノール中、クリスタルバイオレット０．５％
方法
１． ＭＳＣを、１００ｘ１５ｍｍペトリ皿中、１５０細胞／ｃｍ^２で、１０ｍｌ／プレート維持培地を用い、３つ組でプレーティングする。

【0373】

２． 細胞を、第７日に培地交換しながら、１４日間培養する。
３． 第１４日、プレートを以下のようにクリスタルバイオレット（１００％メタノール中、０．５％）で染色した。

【0374】

ａ． 培地を取り除き、そしてＰＢＳで２回洗浄する。
ｂ． １０ｍｌ／プレートのクリスタルバイオレットを添加し、そして３０分間インキュベーションする。

【0375】

ｃ． ＰＢＳで１回、そしてＨ_２Ｏで１回洗浄し、そしてプレートを乾燥させる。
ｄ． 他のコロニーと接触していない、５０より多い細胞を含むコロニーを計数した。

【0376】

実施例８−ＭＳＣの多分化能特性
ＭＳＣが骨（骨形成）および脂肪（脂肪形成）に分化する能力に関して、以下に記載する方法論にしたがってアッセイすることによって、ＭＳＣの多分化能特性の維持を試験した。結果を図２５に示す。

【0377】

細胞
第４継代細胞（Ｐ４）−正常維持培地中で培養したｈＭＳＣ
第７継代細胞（Ｐ７）−以下の処理の１つを含有する正常維持培地中のＰ４〜Ｐ７まで培養したｈＭＳＣ
・ＨＳ８（ＨＳ８（＋）） ２．５μｇ／ｍＬ
・ＨＳ８（−） １．２５μｇ／ｍＬ
・Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ １．２５μｇ／ｍｌ
・ヘパリン １．２５μｇ／ｍｌ
・ＦＧＦ２ １．２５μｇ／ｍｌ
骨形成分化
材料
１． ｈＭＳＣ−（Ｌｏｎｚａより購入）
２． 維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌグルコース）、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
３． 処理維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌグルコース）、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭ β−グリセロール−リン酸および２５μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸
４． ＰＢＳ中のパラホルムアルデヒド４％
５． アリザリンレッド溶液：１００ｍＬ Ｈ_２Ｏ中、１．３７ｇ；ｐＨ４．１〜４．３
方法
１． 細胞を６ウェルプレート中に２４時間植え付けた（３，０００細胞／ｃｍ^２）
２． 対照ウェルの培地を維持培地に交換した
３． 処理ウェルの培地を、１０ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭ β−グリセロール−リン酸および２５μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸を含有する維持培地に交換した
４． 次いで、すべての細胞を３日ごとに培地交換しながら２８日間培養した。

【0378】

５． 次いで細胞をアリザリンレッドで染色した：
ａ． ＰＢＳで３回洗浄する
ｂ． ４％パラホルムアルデヒドで１０分間細胞を固定する
ｃ． ｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄する
ｄ． アリザリンレッド溶液を細胞に添加し、そしてゆっくりと振盪しながら３０分間インキュベーションする
ｅ． ｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄する
ｆ． 染色した細胞を風乾する
脂肪形成分化
材料
１． ｈＭＳＣ−（Ｌｏｎｚａより購入）
２． 脂肪細胞維持培地：ＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／Ｌグルコース）、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
３． 脂肪細胞処理培地：ＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／Ｌグルコース）、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１μＭデキサメタゾン、１０μＭインスリン、２０μＭインドメタジンおよび１１５μｇ／ｍＬ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン
４． ＰＢＳ中のパラホルムアルデヒド４％
５． オイルレッドＯ溶液：６０％イソプロパノール中、０．３６％
方法
１． 細胞を３つ組で、６ウェルプレート中に植え付けた（１８，０００細胞／ｃｍ^２）
２． 細胞を集密まで培養した
３． 対照ウェルの培地を、脂肪細胞維持培地に交換した（４５００ｍｇ／ｍＬグルコース）
４． 処理ウェルの培地を、１μＭデキサメタゾン、１０μＭインスリン、２０μＭインドメタジンおよび１１５μｇ／ｍＬ ３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含有する脂肪細胞処理培地に交換した
５． 続いて、３日ごとに培地交換しながら２８日間培養した。

【0379】

６． 次いで細胞をオイルレッドＯで染色した：
ａ． ＰＢＳで３回洗浄する
ｂ． ４％パラホルムアルデヒドで６０分間細胞を固定する
ｃ． ｄｄＨ_２Ｏで１回洗浄する
ｄ． オイルレッドＯ溶液を細胞に添加し、そしてゆっくりと振盪しながら１時間インキュベーションする
ｅ． ６０％イソプロパノールで２回洗浄する
ｆ． ｄｄＨ_２Ｏで３〜５回洗浄する
ｇ． プレート上のｄｄＨ_２Ｏを残すか、または染色した細胞を風乾する
実施例９
以下に記載する方法論を用いて、ＦＧＦ−２が仲介するｈＭＳＣ増殖に対するＨＳ８の影響を調べた。ＨＳ８は、ＦＧＦ−２が仲介するＭＳＣ増殖を増進させることが見出された（図２６）。

【0380】

細胞
第４継代細胞−以下の処理の１つを伴い、そして伴わずに、正常維持培地中で培養したｈＭＳＣ：
・ＦＧＦ２ ０．１５６ｎｇ／ｍＬのみ
・ＦＧＦ２ ０．１５６ｎｇ／ｍＬと、多様な用量のＨＳ８（＋）
細胞増殖プロトコル
材料
１． ｈＭＳＣ−（Ｌｏｎｚａより購入）
２． ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）。

【0381】

３． 維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ｌグルコース）、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
４． ＨＳ８（ＨＳ８（＋）），ＨＳ８（−）、ブタ粘膜ヘパラン硫酸（Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ３１４９）。

【0382】

５． Ｇｕａｖａ Ｆｌｅｘ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
方法
１． 細胞を２４ウェルプレート上、５００μｌ／ウェル培地中で３０００細胞／ｃｍ^２でプレーティングする（第０日）。

【0383】

２． 第１日−培地を、５００μＬの新鮮な培地中、ＦＧＦ２（０．１５６ｎｇ／ｍＬ）のみまたはＦＧＦ２（０．１５６ｎｇ／ｍＬ）と多様な濃度のＨＳ８（＋）：１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６（μｇ／ｍｌ）を加えた維持培地に交換する
３． 培地を２日ごとに交換する
４． 第４日に１００μｌのトリプシンで細胞を採取し、そして３００μｌの培地で中和する
５． ＧＵＡＶＡ装置中で細胞をカウントする（Ｇｕａｖａ ｆｌｅｘ試薬：細胞懸濁物は１：２００である）。

【0384】

実施例１０
以下に記載する方法論を用いて、ＥＲＫ経路を通じたＦＧＦ−２シグナル伝達に対するＨＳ８の影響を調べた。ＨＳ８は、ＥＲＫ１／２およびＦＲＳ２ａのリン酸化によって測定されるように、ＥＲＫ経路のＦＧＦ２が仲介するシグナル伝達を増進させる／維持することが見出された（図２７）。

【0385】

細胞
Ｐ４−以下の処理を伴い、そして伴わずに、正常維持培地中でｈＭＳＣを培養した：
・ＦＧＦ２ ０．３１２ｎｇ／ｍＬのみ
・ＨＳ８（ＨＳ８（＋）） ２．５μｇ／ｍＬ
ウェスタンブロット
材料
１． ｈＭＳＣ−（Ｌｏｎｚａより購入）
２． ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）。

【0386】

３． 維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌグルコース）、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
４． 血清不含培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌグルコース）、０．２％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
５． ホスホ−ＦＲＳ２ａに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ カタログ番号３８６１） ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中、１：１０００
６． ホスホ−ＥＲＫ１／２に対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ カタログ番号９１０６Ｌ） ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中、１：２０００
７． 総ＥＲＫ１／２に対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ カタログ番号９１０２Ｌ） ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中、１：１０００
８． アクチンに対する抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｈｅｍｉｃｏｎ カタログ番号ＭＡＢ１５０１Ｒ） ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中、１：８０００
方法
１． 細胞を６ウェルプレート上、維持培地中で１０，０００細胞／ｃｍ^２でプレーティングする
２． 第１日：培地を、２ｍＬ／ウェルの血清不含培地に交換する
３． 第３日：ウェルに処理を添加する。必要な量のＨＳ８（＋）および／またはＦＧＦ２を血清不含培地に投薬し、そして１０μＬ／ウェルで添加する
４． 異なる時点（３０分および２４時間）で、１．５Ｘ ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で１００μＬ／ウェルで細胞を採取する
５． 溶解物を９５℃で５分間加熱し、そして−２０℃で保存する
６． 試料を１回のみ凍結融解する
７． ２０μＬ／ウェルの試料を、Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル、１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３３５ＢＯＸ）の各レーンに装填する
８． １Ｘ ＭＯＰＳ緩衝液で、１８０Ｖで５０分間ゲルを泳動した
９． 次いで、分離されたタンパク質バンドを、１ｘトランスファー緩衝液中、１００Ｖで１時間３０分間、ニトロセルロース膜にトランスファーした。

【0387】

１０． ニトロセルロース膜をＰｏｎｃｅａｕ Ｓ溶液で染色し、そして関心対象のタンパク質のサイズにしたがって、ストリップにカットした
１１． ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡまたは５％脱脂乳のいずれかで、室温で３０分間〜１時間、ゆっくりと振盪しながら膜をブロッキングした
１２． 次いで、推奨される希釈の一次抗体を、ゆっくりと振盪しながら、４℃で一晩インキュベーションした
１３． 次いで、ブロットをＴＢＳＴで各５分間、３回洗浄した
１４． 次いで、推奨される希釈の二次抗体を、ゆっくりと振盪しながら、室温で１時間〜２時間インキュベーションした
１５． ブロットをＴＢＳＴで各５分間、３回洗浄した
１６． 化学発光試薬とブロットをインキュベーションし、そして暗室でバンド視覚化のため、Ｘ線フィルムの現像を進めた。

【0388】

実施例１１−ＨＳ８のＮＭＲ分析
ＨＳ８の試料を分析前に−２０℃で保存した。化学シフト比較および定量化に用いる内部標準ｔＢｕＯＨ（２００μＬ、δ１．２４ｐｐｍ）を含有するＤ２Ｏ（６００μＬ）に溶解することによって、ＮＭＲ分析を完了した。Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳを、〜１、４および７ｍｇ量に正確に重量測定し、作業Ｄ２Ｏ／ｔＢｕＯＨ溶液中で調製し、そしてＨＳ８と同じ実行で分析した。標準溶液の線適合（ｌｉｎｅ ｆｉｔｔｉｎｇ）は、内部標準に比較して、アセチルメチル領域、領域δ３．１５〜３．２５ｐｐｍおよびアノマー領域δ５．１５〜５．６５ｐｐｍの最低フィールド部分の統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のため、０．９９５またはそれより優れた回帰を生じた。

【0389】

試料サイズが小さく、低いシグナル対ノイズを生じるため、アセチル領域データのみを用いて、ＨＳ８の量を計算し、０．７ｍｇの値を得た。アセチルピークのノイズにシグナルを比較する第二の実験を完了し、そして０．５ｍｇの値を記録した。これは、内部標準に比較しない絶対値である。さらなる分析の前に、３回凍結乾燥工程を行い、ｔＢｕＯＨを取り除いた後、記録される質量は１．２ｍｇであった。注目に値するのは、ＳＥＣ ＨＰＬＣデータを統合して、およその純度値が得られうることであり、そしてこれはまた５８％を記録し、材料中に０．７ｍｇのＨＳ−ＧＡＧが存在することが示唆された。この重量不一致は少量のＧＡＧ試料において新規の現象ではなく、多様な湿度および塩の比率が、記録される質量に影響を及ぼすはずであると仮定される。

【0390】

ＨＳ８、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ３^＊の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３１に示す。示すプロット中、他のシグナル（Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳは、４．８〜４．９に最高のピークがあり、そしてＨＳ３は中間の高さのピークである）に比較した、ＨＳ８の強度の相違（４．８〜４．６ｐｐｍで最低のピーク）は、すべてのスペクトルをアセチルメチル共鳴の高さに対して規準化したためである：このＨＳ８試料の場合、より細い線では、わずかによりよいシミングが観察され、アセチル共鳴をわずかによりシャープにそしてより高くした。

【0391】

Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳに比較したＨＳ８の化学的組成変化は、２−Ｄ ＮＭＲによってようやく区別される。
ＨＳ８ １Ｈ ＮＭＲのメチンおよびメチレン領域のより緊密な検査によって、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ３に比較して、相違が示された（図３２）。

【0392】

［^＊ＨＳ３は、ＢＭＰ−２のヘパラン結合ドメインに特異的および高い結合アフィニティを有する単離ヘパラン硫酸である。ＨＳ３はＷＯ２０１０／０３０２４４に記載される］
実施例１２−ＨＳ８および他のＨＳ調製物のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩ
ヘパラン硫酸調製物（およそ１ｍｇ、正確に重量測定）を、水中、２ｍｇ／ｍＬで調製した。これらの調製物のヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ消化は、水中の２ｍｇ／ｍＬであった。溶液を遠心分離し（１４０００ｇ、２分間）、そして２００μＬアリコットを分析のために採取した。

【0393】

ＳＥＣ−ＲＩ系は、Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ Ａｌｌｉａｎｃｅ分離モジュールおよびＷａｔｅｒ ２４１０屈折率モニター（レンジ６４）からなる。ＲＩクロマトグラムからの定量化のためのｄｎ／ｄｃを０．１２９（参照）に設定した。試料を注入し（５０μＬ）、そして５０ｍＭ酢酸アンモニウム、流速０．５ｍＬ／分で、一連の２つのＳｕｐｅｒｄｅｘ^ＴＭペプチド１０／３００ＧＬカラム（３００ｘ１０ｍｍ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国バッキンガムシャー）から溶出した。データを収集し、そしてＡＳＴＲＡソフトウェア（バージョン４．７３．０４、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて分析した。

【0394】

全ＨＳ８調製物のサイズ排除クロマトグラフィは、別個のサイズ排除プロファイルを示した。Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ出発材料は、１５ｍＬでボイディングシグナルを示し、あるサイズ範囲のさらなる材料が溶出液およそ２３ｍＬまで溶出する。図３３に示すように、ＨＳ８材料（ＦＧＦ−２アフィニティカラムによって保持される）は、ＳＥＣカラムを空にするまでの、材料が濃縮されたサイズプロファイルを示す。

【0395】

これは再び、ＨＳ３調製物のサイズプロファイルとは異なっており、ＨＳ３はＨＳ８およびＣｅｌｓｕｓ ＨＳプロファイルの間の中間のサイズプロファイルを示す（図３４）。ＨＳ８クロマトグラムは、およそ３６ｍＬで大きな塩シグナルを示し、これはこの試料が、水ではなく、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７）中で調製されたためであった。

【0396】

図３５は、Ｃｅｌｓｕｓ由来のＨＳの２つの異なるバッチに関するＳＥＣクロマトグラムを示す。バッチ＃１０６９７をＨＳ３およびＨＳ８両方の調製のための出発材料として用いた。これらのバッチ両方の酵素での消化は、バッチ＃１０５９５がまったく消化されず、そしてカラムを空にするまでに、より多量の材料を有することを示す以外、同様である。

【0397】

ＨＳ８（図３６）のヘパリンリアーゼ消化のサイズプロファイルは、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ出発材料（図３５）またはＨＳ３（図３６）のものとはまったく異なる。ＨＳ３に関して得られるサイズプロファイルは、先の消化物で得られるものと非常に類似であった。ＨＳ８クロマトグラムは、ＨＳ３消化に関するものと同様、ボイド体積（１５ｍＬ）でほとんどシグナル強度を示さず、材料の大部分がある程度消化されていることが示唆される。しかし、２つのＨＳ３消化は、およそ１９ｍＬで有意なそして別個のシグナル強度を示す一方、ＨＳ８は、１８ｍＬ周囲で広いシグナルを示す。

【0398】

実施例１３−［３Ｈ］ヘパリンアッセイ
以下に記載するプロトコルを用いて、ＦＧＦ２のアミノ酸配列由来の配列番号１のヘパリン結合能を評価した。結果を図３７に示す。

【0399】

材料
（１）ペプチド：
Ｇａｎｄｈｉら（ＨＳ８）−Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって製造
ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ−Ａｈｘ−（Ｋ）ビオチン
（２）３Ｈヘパリン０．１μＣｉ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国ボストン）
（３）ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）
（４）ウシ血清アルブミン４％（ｗ／ｖ）、ＰＢＳ中
（５）真空オーブン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
（６）Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ ２８００ ＴＣＲ液体シンチレーション分析装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国ボストン）
方法
（１）ＰＢＳでＦＧＦ２−ＨＢＤ−ペプチドを望ましい濃度（４．６６ｘ１０−９、９．３２ｘ１０−９、１．８６ｘ１０−８、３．７３ｘ１０−８モル）に調製する
（２）既知の濃度のペプチドに、二連の同一のニトロセルロース膜を浸す
（３）膜を１時間風乾する
（４）真空オーブン中、８０℃で４５分間、さらに乾燥させる
（５）膜をＰＢＳで３回洗浄する
（６）３Ｈヘパリン０．１μＣｉを膜に添加し、そしてシンチレーション計測バイアル中で１６時間インキュベーションする
（７）膜をＰＢＳで４回洗浄する
（８）Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ ２８００ ＴＣＲ液体シンチレーション分析装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国ボストン）で放射活性を決定する
実施例１４
以下に記載するプロトコルを用いて、ヘパリン結合ドメインペプチド配列番号１が、固定されたヘパリンに結合する能力を評価した。結果を図３８に示す。

【0400】

材料
１． 標準アッセイ緩衝液（ＳＡＢ）−１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．２
２． ブロッキング緩衝液−０．４％魚類ゼラチン（Ｓｉｇｍａカタログ番号６７０４１）＋ＳＡＢ
３． ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ、英国）
４． ペプチド：
Ｇａｎｄｈｉら（ＨＳ８）−Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって製造
ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ−Ａｈｘ−（Ｋ）ビオチン
５． ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ２６３６）
６． Ｓｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｎ２７７０）
方法
１． ＳＡＢにヘパリンを溶解する（５μｇ／ｍｌ）
２． ２００μｌのヘパリン溶液／ウェルをＧＡＧ結合プレートに添加し、そして光から保護しながら、ＲＴで一晩インキュベーションする
３． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
４． ２５０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液とプレートを、光から保護しながら、３７℃で１時間インキュベーションする
５． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
６． ペプチドをブロッキング緩衝液に溶解し、そして連続希釈：０、５０、１００、２００ｎＭを行う
７． ２００μｌ／ウェルの希釈タンパク質を、ＧＡＧコーティングプレートに分配し、そして３７℃で２時間インキュベーションする
８． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
９． ２００μｌ／ウェルの２２０ｎｇ／ｍｌのブロッキング溶液中のＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰを添加し、そして３７℃で３０分間インキュベーションする
１０． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
１１． ２００μｌ／ウェルの現像試薬：ＤＩ水中のＳｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸を添加し、そしてＲＴで４０分間インキュベーションする
１２． ４０５ｎｍで吸光度を読み取る
実施例１５
ＨＳ８に結合する能力に関して、ＦＧＦ−２を評価した。これを、未精製出発ＨＳ（ＨＳ−ＰＭブタ粘膜）または糖不含との結合に比較した。結果を図３９に示す。

【0401】

材料
１． 標準アッセイ緩衝液（ＳＡＢ）−１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２
２． ブロッキング緩衝液−０．４％魚類ゼラチン（Ｓｉｇｍａカタログ番号６７０４１）＋ＳＡＢ
３． ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ、英国）
４． Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ由来のタンパク質：ＦＧＦ２−２３３ＦＢ
５． Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ由来の抗体：ＦＧＦ２−ＢＡＭ２３３
６． ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ２６３６）
７． Ｓｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｎ２７７０）
方法
１． ＳＡＢにＧＡＧを溶解する（５μｇ／ｍｌ）
２． ２００μｌのＧＡＧ溶液／ウェルをＧＡＧ結合プレートに添加し、そして光から保護しながら、ＲＴで一晩インキュベーションする
３． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
４． ２５０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液とプレートを、光から保護しながら、３７℃で１時間インキュベーションする
５． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
６． タンパク質をブロッキング緩衝液に溶解し、そして連続希釈：０、０．７８１、１．５６、３．１２５ｎＭを行う
７． ２００μｌ／ウェルの希釈タンパク質を、ＧＡＧコーティングプレートに分配し、そして３７℃で２時間インキュベーションする
８． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
９． ２００μｌ／ウェルの２５０ｎｇ／ｍｌのブロッキング溶液中のビオチン化一次抗体を添加し、そして３７℃で１時間インキュベーションする
１０． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
１１． ２００μｌ／ウェルの２２０ｎｇ／ｍｌのブロッキング溶液中のＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰを添加し、そして３７℃で３０分間インキュベーションする
１２． プレートを３ｘ、２５０μｌ／ウェルのＳＡＢで注意深く洗浄する
１３． ２００μｌ／ウェルの現像試薬：ＤＩ水中のＳｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸を添加し、そしてＲＴで４０分間インキュベーションする
１４． ４０５ｎｍで吸光度を読み取る
実施例１６
ＨＳ８の存在下で、６日間に渡って、プラスチック接着性間葉系幹細胞の増殖を分析した。結果を図４０に示す。

【0402】

細胞増殖プロトコル
材料
１． ＨＭ２０ ｈＭＳＣ−男性ヒスパニック系２０歳のドナー（Ｌｏｎｚａより購入）
２． ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）
３． 維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ｌグルコース）、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
４． ＨＳ８
５． Ｇｕａｖａ Ｆｌｅｘ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
方法
１． ＨＭ２０細胞を、２４ウェルプレート上、５００μｌ／ウェルの培地中、３０００細胞／ｃｍ２でプレーティングする（第０日）
２． 第１日−ＧＡＧ（μｇ／ｍｌ）−２．５および０．５で培地交換する
３． 培地を２日ごとに交換する
４． 指定した時点で細胞を採取する（第６日）−１００μｌのトリプシンを用い、そして３００μｌの培地で中和する
５． 細胞をＧｕａｖａ装置中でカウントした（Ｇｕａｖａ ｆｌｅｘ試薬：細胞懸濁物は１：２００である）
実施例１７
未精製Ｃｅｌｓｕｓ出発ＨＳ（ＨＳ−ＰＭ）、または非結合ＨＳフロースルー（ＨＳ８−）に比較した際の、単離ＨＳ８の存在下で３６時間に渡るＳＴＲＯ−１単離間葉系幹細胞の増殖を、以下に記載するように、ＢｒＤＵ取り込みによって測定した。結果を図４１に示す（図中、ＨＳ８Ｇ＝ＨＳ８）
プロトコル（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（比色）、Ｒｏｃｈｅ）
１． 細胞植え付け−１９０μｌの培地／ウェル中、５０００細胞（９６ウェルプレート）
２． 培地−アルファＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）＋１％ ２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１％ペニシリンおよびストレプトマイシン＋１００ｎＭ Ｌ−グルタミン酸
３． ３７℃および５％ＣＯ２で６時間インキュベーションする
４． ６時間インキュベーションした後、レイアウトにおけるように指定したウェルに関して１０μｌの培地中、異なる用量の処理を加える
５． ＧＡＧ（μｇ／ｍｌ）−１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５
６． 処理を伴い、３７℃および５％ＣＯ２で３６時間インキュベーションする
７． ＢｒｄＵを各ウェルに添加する
８． 細胞をＢｒｄＵで２時間、３７℃および５％ＣＯ２で標識する（２０μｌのＢｒｄＵ標識溶液／ウェルを添加する）
９． プレートを軽く叩くことによって、標識培地を除去する
１０． ２００μｌ／ウェルのＦｉｘＤｅｎａｔを細胞に添加し、そして１５〜２５℃で３０分間インキュベーションする
１１． 軽く振りそして叩くことによって、ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を完全に除去する
１２． １００μｌ／ウェルの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ作業溶液を添加し、そして１５〜２５℃で９０分間インキュベーションする
１３． 振り落とすことによって抗体コンジュゲートを除去し、そして２５０μｌ／ウェルの洗浄溶液（１ｘＰＢＳ）でウェルを３回リンスする
１４． 軽く叩くことによって、洗浄溶液を除去する
１５． １００μｌ／ウェルの基質溶液を添加し、そして１５〜２５℃で３０分間インキュベーションする。

【0403】

１６． ３７０ｎｍでの吸光度を測定する（参照波長：４９２ｎｍ）
実施例１８−二糖のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析
ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ由来であった（ＨＯ−０３１０３、ロット＃ＨＯ−１０６９７）。細菌ヘパリナーゼにより、高品質ブタヘパリンを消化して得られる二糖標準（ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓ； ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ、ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮ カタログ番号ＨＤ００１〜ＨＤ０１３、Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ、英国マンチェスター）を、Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ、英国マンチェスターより購入した。非天然存在二硫酸化二糖の合成誘導体（ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ，６Ｓ）もまた、内部標準として使用するために、Ｉｄｕｒｏｎから購入した。ヘパリンオリゴ糖（ｄｐ４、ｄｐ６、ｄｐ８、ｄｐ１０、ｄｐ１２（カタログ番号ＨＯ０４、ＨＯ０６、ＨＯ０８、ＨＯ１０、ＨＯ１２））および選択的脱硫酸化ヘパリン標準（２−Ｏ、６−ＯおよびＮ−脱硫酸化ヘパリン）（カタログ番号ＤＳＨ００１／２、ＤＳＨ００２／６、ＤＳＨ００３／Ｎ、Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ、英国マンチェスター）もまた、Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ、英国マンチェスターより購入した。

【0404】

ヘパリンリアーゼＩ（ヘパリチナーゼ、ＥＣ ４．２．２．８、ヘパリチナーゼＩとしてもまた知られる）、ヘパリンリアーゼＩＩ（ヘパリチナーゼＩＩ、ＥＣ番号割り当てなし）およびヘパリンリアーゼＩＩＩ（ヘパリナーゼ、ＥＣ ４．２．２．７、ヘパリチナーゼＩＩＩとしてもまた知られる）を、生化学工業株式会社、日本より得た。凍結乾燥粉末（０．１ Ｕ／バイアル）として供給される酵素を、０．１％ＢＳＡ中に溶解して、０．５ｍＵ／μＬを含有する溶液を得た。必要になるまでアリコット（５μＬ；２．５ｍＵ）を凍結した（−８０℃）。

【0405】

ヘパリンリアーゼ酵素でのＨＳ調製物の消化
ＨＳ調製物（１ｍｇ）を各々、５００μＬの酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ酢酸カルシウムを含有する１００ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解し、そして３つの酵素各２．５ｍＵを添加した。試験管を穏やかに反転しながら（９ｒｐｍ）、試料を３７℃で一晩（２４時間）インキュベーションした。３つの酵素をさらに各２．５ｍＵ、試料に添加して、試験管を穏やかに反転しながら（９ｒｐｍ）これを３７℃でさらに４８時間インキュベーションした。加熱（１００℃、５分間）によって消化を停止し、そして次いで凍結乾燥した。消化を５００μＬの水に再懸濁し、そしてＣＥによる分析のため、アリコット（５０μＬ）を採取した。

【0406】

キャピラリー電気泳動（ＣＥ）
２０ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４の水溶液を２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏの溶液に添加してｐＨ３．５を生じることによって、キャピラリー電気泳動操作緩衝液を作製した。カラム洗浄液は、１００ｍＭ ＮａＯＨ（５０％ｗ／ｗ ＮａＯＨから希釈）であった。０．２μｍ酢酸セルロース膜フィルター（４７ｍｍφ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｎｅｌｌ、ドイツ・ダッセル）を取り付けたＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター装置を用いて、操作緩衝液およびカラム洗浄液両方を濾過した。水に二糖を溶解することによって（１ｍｇ／ｍＬ）、１２の二糖標準のストック溶液を調製した。標準のための較正曲線を決定するため、すべての１２の標準を含有する混合物を調製した。１２の標準混合物のストック溶液は、１０μｇ／１００μＬの各二糖を含有し、そして１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５μｇ／１００μＬを含有する希釈シリーズを調製した；２．５μｇの内部標準（ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ，６Ｓ）を含む。ＨＳの消化を水で希釈し（５０μＬ／ｍＬ）、そして同じ内部標準を各試料に添加した（２．５μｇ）。溶液を凍結乾燥し、そして水に再懸濁した（１ｍＬ）。ＰＴＦＥ親水性使い捨てシリンジフィルター装置（０．２μｍ；１３ｍｍφ；Ａｄｖａｎｔｅｃ、東洋濾紙株式会社、日本）を用いて、試料を濾過した。

【0407】

キャピラリー電圧３０ｋＶで、２０ｍＭ操作緩衝液を用い、非コーティング石英ガラスキャピラリーチューブ（７５μｍＩＤ、６４．５ｃｍ全長および５６ｃｍ有効長、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アリゾナ州フェニックス、部品番号ＴＳＰ０７５３７５）上で、Ａｇｉｌｅｎｔ^３ＤＣＥ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ・ワルドブロン）装置を用いて、分析を行った。水圧注入（５０ｍｂａｒｘ１２秒）を用いて、カソード（逆極性）端で、キャピラリーチューブに試料を導入した。

【0408】

各実行前に、キャピラリーを１００ｍＭ ＮａＯＨ（２分間）、水（２分間）でフラッシュし、そして操作緩衝液（５分間）で前処理した。緩衝液再補充系は、入口および出口チューブ中の緩衝液を交換して、一定の体積、ｐＨおよびイオン強度が維持されることを確実にした。水のみのブランクを、試料配列の開始時、中間および終了時に流した。吸光度を２３２ｎｍで監視した。すべてのデータをＣｈｅｍＳｔｏｒｅデータベース中に保存し、そして続いて回収し、そしてＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて再プロセシングした。

【0409】

上に詳述する条件を用いて、標準混合物中の１２のヘパリン二糖のうち１１を分離した。１２番目の二糖、ΔＵＡ−ＧｌｃＮは、これらの実験に用いた条件下では移動しない。しかし、この二糖は、ヘパラン硫酸中に存在することが報告されていない。標準較正曲線のＲ２値は、０．９９４９〜１．０の範囲であった。

【0410】

ＨＳ調製物のヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ消化を、二連で行い、そして二連のそれぞれをＣＥに２回注射した。したがって、ＨＳ消化中の二糖の規準化パーセントは、分析結果の平均である。標準混合物中で分離される１１の二糖のうち、これらのうちの８つのみがＨＳ消化中で検出される。他の小さいシグナルが消化の電気泳動図のベースラインに見られ、そしてこれらは、＞２ｄｐのオリゴ糖に対応しうる。上述のように、より大きいオリゴ糖は、二糖に比較して、より少ないＵＶ吸光度を有するであろう。

【0411】

Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（ロット＃１０６９７）の試料に対して、二連の分析を完了し、そして同じ試料に対する以前の分析セットに比較し；これらの結果を図４２に示す。２つの分析セットの間には優れた相関が観察された。Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ消化中の８つの二糖の比率は、他の以前の分析のものと類似であり、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃおよびΔＵＡ−ＧｌｃＮＳが大量の構成要素であり、そしてΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６ＳおよびΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓがより少ない比率であった（図４２）。これは、一硫酸化および非硫酸化二糖が大きな割合であり、それより少ない割合が二硫酸化二糖であり、そして少ない割合が三硫酸化二糖である、ＨＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルと一致する。Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ出発材料と比較して、一硫酸化および非硫酸化二糖において、非保持ＨＳが濃縮される。非保持材料のこのパターンはまた、ＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラム中に非常に明瞭に見られた。ＨＳ８の分析の場合、試料サイズは、単一の分析のみを許容し、そしてしたがって、この調製物に関しては、誤差データは提供されない。ＨＳ８、ＨＳ３およびＣｅｌｓｕｓ ＨＳの比較を図４４に示す。

【0412】

ＨＳ８の二糖組成は、ＨＳ３（Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳからＢＭＰ２由来のヘパリン結合ドメインに対するアフィニティを通じて単離されるＨＳ、ＷＯ２０１０／０３０２４４に記載される通り）のものに匹敵し、この中で、より硫酸化された（荷電した）分画が、一般的に、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳから調製されてきている。しかし、ＨＳ３に比較して、ＨＳ８では、ＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６ｓのより大きな比率およびＵＳ−ＧｌｃＮＳのより少ない比率が存在するという顕著な相違がある。

【0413】

ＨＳ８が由来する未精製Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳは、（ヘパリンの〜１５ｋＤａと比較して）２０〜２５ｋＤａの平均分子量を有し、そしてアフィニティクロマトグラフィによるＨＳ８の同定プロセスは、ＨＳ鎖の観察される分子量に実質的な変化を生じなかった。各二糖単位は、〜４３０から〜６５０ｋＤａの範囲の分子量を有すると予期される。二糖あたり５００ダルトンの大まかな平均（例えば、ヘパリン中の平均二糖は、〜６５０ダルトンである）を用いると、平均（２２ｋＤａ）ＨＳ８あたり、ＨＳ８の鎖長が（基本的近似として）約４４環であることが示される。

【0414】

実施例１９
ＨＳ８がＦＧＦ２に優先的に結合し、そしてｈＭＳＣの増殖速度を増加させることが同定されたため、本発明者らはさらに、ＨＳ８活性の機構を調べた。

【0415】

ＦＧＦ２中和抗体またはＦＧＦＲ１阻害剤（キナーゼ阻害剤および中和抗体両方）いずれかは、ｈＭＳＣにおいて、ＨＳ８の増殖効果を減少させることが可能であり（図４７〜５０）、ｈＭＳＣにおけるＨＳ８のマイトジェン効果が、ＦＧＦ２／ＦＧＦＲとの相互作用を通じるが、他の分子との相互作用を介さないことが確認される。ＨＳ８の存在下で、ＦＧＦ２の迅速な分解が遅延され（図４６）、ＨＳ８がＦＧＦ２と相互作用して、培地中でＦＧＦ２が分解されることを保護することが立証される。

【0416】

本発明者らは（上記に）、ＨＳ８がｈＭＳＣ自己再生を増進する一方、多分化能を維持することを示した。ｈＭＳＣのルーチンの培養において、ＨＳ８補充が培養をより迅速に拡大可能であるかどうかを試験するため、本発明者らは、３人の個々のドナー由来のｈＭＳＣを、ＨＳ８補充培地中で別個に増殖させた。本発明者らは、ＨＳ８に曝露されたｈＭＳＣが、より多くのコロニーを形成可能であり（図５１）、そしてさらなる細胞二倍化にもかかわらず、３人のドナーに渡る、バイオマーカーＣＤ１４、１９、３４、４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７３、９０、１０５、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４およびＳＴＲＯ−１に関するＦＡＣＳによって（例えば図２２に提示するように）測定されるような幹細胞様表現型を維持することに注目した。「幹細胞性」を示すバイオマーカーは、ｈＭＳＣをＨＳ８補充培地中で拡大した際に維持された。

【0417】

本発明者らはまた、これらの細胞が、３つの間葉系幹細胞系譜すべて（アリザリンレッド、フォンコッサ、オイルレッドＯおよびアルシアンブルー染色によって測定されるように、骨を含む）に容易に分化可能であり、そして骨形成を増進させることも見出し、この戦略が整形外科的外傷療法に有効でありうることを示唆する。ＨＳ８は、ＭＳＣが骨に分化する能力に不都合に影響を及ぼさなかった。

【0418】

したがって、本発明者らは、ＨＳ８を、ラットにおける頭蓋冠欠損モデルに適用した（図５２）。骨治癒改善が明らかであり、ＨＳ８が外傷部位でＦＧＦ２と相互作用して、内因性幹細胞および骨前駆体細胞の活性をＦＧＦ−２依存性機構を通じて加速することを示唆し、したがって、頭蓋冠骨欠損を治療するためのこのアプローチの療法的可能性を強調する。

【0419】

実施例２０−ブタ切除創傷モデルに対するＨＳ８の影響
ブタ皮膚創傷治癒プロトコル
５匹の成体マイクロブタの背中に、全層切除創傷を生成した。麻酔したブタの背中の体毛を剃り、そしてポピドンヨード溶液で清浄化した。１日、３日、７日、９日、１３日および１５日の実験時点を提供するため、６および１０ｍｍ生検パンチを用いて、入子式の創傷を生成した。全実験時点には、３つの創傷セットが必要である。最初の３つの創傷を６ｍｍ生検パンチで作製した。第１日、３日および７日に、各創傷を１０ｍｍ生検パンチでくり抜いた。第１６日に、１０ｍｍ創傷は、９日、１３日、および１５日の時点を提供するであろう。

【0420】

治療の単純なランダム化を行い、そして１０ｍｇ／ｍｌカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（Ｓｉｇｍａ）ジェル（ｎ＝６）、またはＣＭＣジェル単独（未処置創傷）（ｎ＝６）を通じて、２５０μｇ／μＬ ＨＳ化合物の局所適用によって、治療を開始した。５６．５μＬおよび１５７μＬの化合物を、それぞれ第０日および１日に、６および１０ｍｍ創傷に適用した。創傷をＴｅｇａｄｅｒｍドレッシング剤（３Ｍ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）で覆った。術後、毎週、すべての創傷を調べ、そして写真撮影した。

【0421】

第１６日にブタを安楽死させ、そして創傷がない皮膚が取り巻く創傷の全層皮膚試料を切除し、そして半分に切った。一方の半分を、組織学的分析のため、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。別の半分を、ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に入れ、そして続く分子分析のため、−８０℃で凍結した。

【0422】

最初に６ｍｍパンチを用いて、創傷治癒の初期マーカー（例えば炎症反応および再上皮化）を調べてもよく、そして次いで、より大きな１０ｍｍパンチでくり抜いて、創傷治癒の後期マーカー（例えば血管再増殖、組織再構成）を探してもよい。

【0423】

図５３は、６ｍｍパンチ処置を経たミニブタの脇腹の巨視的外観を示す。これらの結果は、ＨＳ８が、切除皮膚外傷のｉｎ ｖｉｖｏミニブタモデルにおいて、創傷治癒を増進させることを示す。本発明者らはまた、ＨＳ８がＦＧＦ−２依存性経路を通じて、真皮線維芽細胞の増殖を誘発可能であることを実験的に決定した。

【0424】

作用機構は多価である。ＨＳ８に関するような皮膚／上皮創傷治癒の関心対象領域には、形成手術後の治癒、結腸直腸吻合手術／閉鎖縫合、火傷の治療、血管／動脈／褥瘡治療、皮膚切開／外傷創傷修復、上皮区画への血管復帰促進、および上皮幹細胞機能の刺激が含まれる。主な効果は、ＦＧＦ感受性細胞、特に幹細胞に対するものであり、他の効果は真皮線維芽細胞および血管形成（血管新生）に対する。

【0425】

ＨＳ８は、発癌性転帰の恐れを伴わずに、ＦＧＦ２の増進を可能にする。糖は、皮膚において、天然にすでに発現されるＦＧＦ−２を増進させる。本発明者らの実験結果によれば、ＨＳ８はそれ自体、大きな療法効果を有すると予期される。

【0426】

発明の態様
［１］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのヘパラン硫酸ＨＳ８。
［２］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するための薬剤製造におけるヘパラン硫酸ＨＳ８の使用。
［３］［１］の皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８あるいは［２］の使用であって、療法的方法が、場合によって皮膚火傷、潰瘍、切除創傷、切り傷、刺し傷または穿刺傷より選択される、皮膚創傷または瘢痕の治療を含む、前記ＨＳ８またはその使用。
［４］［１］の皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８あるいは［２］の使用であって、療法的方法が、皮膚移植治癒、皮膚再構築、または皮膚形成手術を含む、前記ＨＳ８またはその使用。
［５］ヘパラン硫酸ＨＳ８を含む薬学的組成物の有効量と、皮膚創傷を接触させる工程を含む、皮膚創傷を治癒させる方法。
［６］ヘパラン硫酸ＨＳ８の療法的有効量を被験体に投与し、創傷部位で皮膚の修復および／または再生を導く工程を含む、皮膚創傷を有する被験体を治療する方法。
［７］皮膚創傷が、皮膚火傷、潰瘍、切除創傷、切り傷、刺し傷または穿刺傷である、［５］または［６］の方法。
［８］皮膚移植、皮膚再構築、または皮膚形成手術の方法であって、ＨＳ８を含む薬学的組成物の有効量と、移植、再構築または形成手術の領域のまたは該領域に隣接した皮膚を接触させる工程を含む、前記方法。
［９］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８、先行する態様のいずれかの使用または方法であって、ＨＳ８、薬剤または薬学的組成物が、局所または経皮投与のために製剤化される、前記ＨＳ８、使用または方法。
［１０］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８、先行する態様のいずれかの使用または方法であって、ＨＳ８、薬剤または薬学的組成物が、ジェル、スプレー、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、膏薬（ｓａｌｖｅ）、オイル、水溶液、懸濁物、分散物、パッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング剤、デポ剤またはリザーバーとして製剤化される、前記ＨＳ８、使用または方法。
［１１］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８、先行する態様のいずれかの使用または方法であって、方法が、増殖因子、好ましくはＦＧＦ２、および／または間葉系幹細胞の投与をさらに含む、前記ＨＳ８、使用または方法。
［１２］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８、先行する態様のいずれかの使用または方法であって、ＨＳ８、薬剤または薬学的組成物が、増殖因子、好ましくはＦＧＦ２、および／または間葉系幹細胞との組み合わせ調製物として製剤化される、前記ＨＳ８、使用または方法。
［１３］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８、先行する態様のいずれかの使用または方法であって、ヘパラン硫酸ＨＳ８が単離型または実質的に精製された形態で提供される、前記ＨＳ８、使用または方法。
［１４］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８、先行する態様のいずれかの使用または方法であって、ヘパラン硫酸ＨＳ８がアミノ酸配列ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）またはＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）を有するかまたは該配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、前記ＨＳ８、使用または方法。
［１５］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８、先行する態様のいずれかの使用または方法であって、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩで消化し、そして次いで生じた二糖断片をキャピラリー電気泳動分析に供した後、ヘパラン硫酸ＨＳ８が：
［化１］

を含む二糖組成を有する、前記ＨＳ８、使用または方法。
［１６］皮膚の修復および／または再生の療法的方法において使用するためのＨＳ８、先行する態様のいずれかの使用または方法であって、ＨＳ８が：
（ｉ）固体支持体に付着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供すること、ここでポリペプチドは、アミノ酸配列ＹＣＫＮＧＧＦを有するヘパリン結合ドメインを含む；
（ｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体の形成が可能になるように、グリコサミノグリカンを含む混合物と、該ポリペプチド分子を接触させること；
（ｉｉｉ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を混合物の残りから分離すること；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること；
（ｖ）解離したグリコサミノグリカンを収集すること
を含む方法によって得られる、前記ＨＳ８、使用または方法。

参考文献

【0427】

【化9-1】

【0428】

【化9-2】

【0429】

【化9-3】

【0430】

【化9-4】

【0431】

【化9-5】

【0432】

【化9-6】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]