特許 6709731 チアクマイシンの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6709731

(24)【登録日】2020年5月27日

(45)【発行日】2020年6月17日

(54)【発明の名称】チアクマイシンの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 1/04 20060101AFI20200608BHJP

   A61P 31/04 20060101ALN20200608BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALN20200608BHJP

   C07H 17/08 20060101ALN20200608BHJP

【ＦＩ】

   C12P1/04 A

   !A61P31/04

   !A61K31/7048

   !C07H17/08 K

【請求項の数】5

【全頁数】7

(21)【出願番号】特願2016-541236(P2016-541236)

(86)(22)【出願日】2014年12月18日

(65)【公表番号】特表2017-501707(P2017-501707A)

(43)【公表日】2017年1月19日

(86)【国際出願番号】EP2014078552

(87)【国際公開番号】WO2015091851

(87)【国際公開日】20150625

【審査請求日】2017年11月29日

(31)【優先権主張番号】20131718

(32)【優先日】2013年12月20日

(33)【優先権主張国】NO

(73)【特許権者】

【識別番号】505371232

【氏名又は名称】クセリア ファーマシューティカルズ エーピーエス

【氏名又は名称原語表記】Ｘｅｌｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡｐＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(72)【発明者】

【氏名】ハンセン、エスペン フリチョフ

(72)【発明者】

【氏名】クレムスダル、ホーヴァル

【審査官】 高山 敏充

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０２６７６９２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０００−５０８８８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３４３３２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）チアクマイシンＢの産生菌株を発酵させる工程と、
ｂ）その発酵ブロスを乾燥する工程と、
ｃ）その乾燥物をメタノールで抽出する工程と
を含み、
工程ａ）の前記菌株は、ダクチロスポランギウムおよびアクチノプラーネスのうちから選択される、チアクマイシンＢの製造方法。

【請求項2】

前記ブロスは噴霧乾燥または凍結乾燥される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ブロスは噴霧乾燥される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ブロスは凍結乾燥される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

疎水性吸着樹脂を含んだカラムに抽出溶液を投入することと、溶出前にオプションで洗浄することとを含むクロマトグラフィーの工程をさらに含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、チアクマイシンＢ（Tiacumicin B）を製造および精製するための改良された方法に関する。具体的には、本発明は、乾燥した発酵ブロスからのチアクマイシンＢの精製と、それに続く抽出およびクロマトグラフィーの手法に関する。本発明の方法は、従来技術の方法よりも簡便であり、大規模に商業生産用で容易に用いることができる。

【背景技術】

【0002】

チアクマイシンＢは、米国特許第４９１８１７４号明細書または国際公開第２００４／０１４２９５号に開示されているように産生することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】米国特許第４９１８１７４号明細書

【特許文献2】国際公開第２００４／０１４２９５号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、適当な溶媒による抽出の前に発酵ブロスを乾燥させる工程を含んだチアクマイシンＢの製造方法に関する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

具体的には、本発明は、
ａ）チアクマイシンＢの産生菌株を発酵させる工程と、
ｂ）その発酵ブロスを乾燥する工程と、
ｃ）その乾燥物を溶媒で抽出する工程と
を含むチアクマイシンＢの製造方法を提供する。

【0006】

本発明による乾燥工程ｂ）は、噴霧乾燥または凍結乾燥によって実施されてもよい。
一実施形態によれば、本方法で用いられる溶媒は、Ｃ_１〜Ｃ_５アルコール、Ｃ_４〜Ｃ_６エーテル、Ｃ_２〜Ｃ_５ケトン、またはＣ_２〜Ｃ_５エステルのうちから選択される。

【0007】

さらに一実施形態によれば、前記溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトンのうちから選択される。
本方法で用いられる溶媒は水をさらに含有してもよく、例えば少なくとも１〜４０％ｖ／ｖの水、例えば少なくとも１０〜３０％ｖ／ｖの水、または例えば少なくとも１５〜２０％ｖ／ｖの水を含有してもよい。そのような溶媒を本開示では水性溶媒と称する。

【0008】

一実施形態によれば、
ａ）チアクマイシンＢの産生菌株を発酵させる工程と、
ｂ）その発酵ブロスを乾燥する工程と、
ｃ）その乾燥物を、５０〜９０％ｖ／ｖのメタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトンのうちから選択される有機溶媒を含有した水性溶媒で抽出する工程と
を含むチアクマイシンＢの製造方法が提供される。

【0009】

別の実施形態によれば、
ａ）チアクマイシンＢを産生することができるダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）菌株またはアクチノプラーネス（Actinoplanes）菌株を発酵させる工程と、
ｂ）その発酵ブロスを乾燥する工程と、
ｃ）その乾燥物を、６０〜９０％ｖ／ｖのメタノールおよびエタノールを含有した水性溶媒で抽出する工程と
を含む方法が提供される。

【0010】

前記抽出は、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトンのうちから選択される溶媒によって実施されてもよい。一実施形態によれば、前記溶媒は、５０〜９０％ｖ／ｖのメタノール、エタノール、イソプロパノールまたはアセトンを含有する水性溶媒である。

【0011】

本発明で用いられる溶媒は、一実施形態によれば、６０〜９０％ｖ／ｖ、好ましくは７０〜８０％ｖ／ｖ、より好ましくは７５％ｖ／ｖの有機溶媒を含有する水性溶媒であってもよい。前記溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトンのうちから選択されてもよい。

【0012】

さらに別の実施形態によれば、前記乾燥は噴霧乾燥によって実施され、かつ抽出工程中に用いられる水性溶媒は７０〜８０％ｖ／ｖのメタノールである。さらに別の実施形態によれば、前記乾燥は噴霧乾燥によって実施され、かつ抽出工程中に用いられる水性溶媒は７０〜８０％ｖ／ｖのエタノールである。

【0013】

さらに別の実施形態によれば、前記乾燥は凍結乾燥によって実施され、かつ抽出工程中に用いられる水性溶媒は７０〜８０％ｖ／ｖのメタノールである。さらに別の実施形態によれば、前記乾燥は凍結乾燥により実施され、かつ抽出工程中に用いられる水性溶媒は７０〜８０％ｖ／ｖのエタノールである。

【0014】

本方法によれば、乾燥した発酵ブロスの質量に対する溶媒の体積の割合は１〜６ｍＬ／ｇであってもよい。本発明の一実施形態によれば、乾燥した発酵ブロスの質量に対する溶媒の体積の割合は２〜４ｍＬ／ｇである。

【0015】

本発明によれば、発酵工程に用いられるチアクマイシンＢの産生菌株は、ダクチロスポランギウムおよびアクチノプラーネスのうちから選択されてもよい。
様々な実施形態を含む本発明の様々な態様等について、詳細な説明、実施例および添付図面を参照しながら、さらに詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】噴霧乾燥した発酵物の異なる溶媒濃度での抽出効率を示す図。

【図2】噴霧乾燥した発酵物の異なるメタノール濃度での抽出収量を示す図。

【図3】噴霧乾燥した発酵物を異なる量の７５％ｖ／ｖ水性メタノールで抽出したときの収量を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明によれば、本発明の発酵ブロスを提供するために、いかなるチアクマイシンＢ産生菌種を用いてもよい。一実施形態によれば、チアクマイシンＢは、ダクチロスポランギウム・オーランティアカム亜種ハムデネンシス（Dactylosporangium aurantiacum subspecies hamdenensi）ＮＲＲＬ１８０８５、またはアクチノプラネス・デカネンシス（Actinoplanes deccanensis）ＡＴＣＣ２１９８３の発酵によって産生され得る。

【0018】

発酵ブロスは、細菌バイオマスおよびチアクマイシン化合物を含有する培養液である。
発酵ブロスの乾燥は凍結乾燥によって実施され得る。好ましい凍結乾燥法は、温度を−４０℃に低下させて圧力を２００ミリトル（約２６．７Ｐａ）に減圧することと、次に−５℃〜５℃の範囲の温度で一次乾燥を行うことと、その後に約２０℃の温度で二次乾燥を行うこととを含む。

【0019】

本発明の発酵ブロスに好ましい乾燥法は噴霧乾燥である。噴霧乾燥プロセスにおける高い温度にもかかわらず、チアクマイシンＢを高収率で回収することができる。
好ましい噴霧乾燥法は、１８０〜２２０℃の入口温度と、８０〜１００℃の出口温度とを含む。乾燥は、０％〜１２％ｗ／ｗの水分含有量を達成するために実施され、１０％ｗ／ｗ未満、例えば２％〜８％ｗ／ｗの水分含有量がより好ましい。

【0020】

Ｃ_１〜Ｃ_５アルコールは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの炭素原子を有する脂肪族アルコールを包含することを意味する。
Ｃ_４〜Ｃ_６エーテルは、４つ、５つ、または６つの炭素原子を有する脂肪族エーテルを包含することを意味する。

【0021】

Ｃ_２〜Ｃ_５ケトンは、２つ、３つ、４つ、または５つの炭素原子を有する脂肪族ケトンを包含することを意味する。
Ｃ_２〜Ｃ_５エステルは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの炭素原子を有する脂肪族エステルを包含することを意味する。

【0022】

一実施形態によれば、乾燥した発酵ブロスは、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトンのうちから選択される溶媒で抽出される。
別の実施形態によれば、乾燥した発酵ブロスは、５０〜９０％ｖ／ｖのメタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトンのうちから選択される有機溶媒、好ましくは７０〜８０％ｖ／ｖ、より好ましくは７５％ｖ／ｖのメタノール、エタノール、イソプロパノールおよびアセトンのうちから選択される有機溶媒を含有する水性溶媒で抽出される。抽出中の好ましいｐＨは約５〜７であり、好ましくは６〜７、より好ましくは７である。抽出中の好ましい温度は２０〜２５℃である。

【0023】

抽出溶液中のメタノールまたはエタノールの濃度は、その後の蒸発または希釈によって、吸着樹脂へのチアクマイシンＢの結合に適した濃度、例えば水中に５０％の有機溶媒のような濃度に調節される。吸着樹脂に結合した後、樹脂は、未結合の不純物を除去するために、例えば５０％の有機溶媒のような水性溶媒溶液で洗浄される。結合したチアクマイシンＢは、６０〜１００％の有機溶媒と０〜４０ｖ／ｖの水とを含有する溶媒で溶出させることができる。

【0024】

実験データ：
実施例１
ダクチロスポランギウム・オーランティアカム亜種ハムデネンシスＮＲＲＬ１８０８５の発酵物を、二流体ノズルを備えたニロ・モバイル・マイナー（Niro Mobile Minor）噴霧乾燥機を用いて直接噴霧乾燥させた。気圧は１．２バール（１２０ｋＰａ）であった。入口温度は約２００℃であり、出口温度は９０〜９２℃であった。供給速度は０．５〜１．０リットル／時であった。噴霧乾燥した粉末を約１ｇずつ、８つの５ｍＬメスフラスコに分取した。次に溶媒を５ｍＬの標線まで添加した。異なる溶媒、すなわち、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシド、水を用いた。そのフラスコをオーバーヘッドスターラーで１時間にわたって振盪した。スラリーを取り出して遠心分離した。生じた上澄み液をＨＰＬＣによって分析した。ＤＭＳＯは抽出に最も有効な溶媒であった。しかしながら、ＤＭＳＯは沸点が高いために生産規模に適していない。驚くべきことに、メタノールが他の溶媒の中で最も高い収率を与えた。その収率は、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、アセトニトリルおよびアセトンに比較して５０〜１００％高かった。

【0025】

実施例２
噴霧乾燥したダクチロスポランギウム・オーランティアカム亜種ハムデネンシスＮＲＲＬ１８０８５の発酵物を異なる溶媒および異なる溶媒／水組成で抽出した。エタノール、メタノール、イソプロパノールおよびアセトンは、１００％、７５％、５０％および２５％の水中濃度で用いた。乾燥した発酵物の重量の５倍の量で用いた（すなわち溶液１ｍＬ当たり２００ｍｇの粉末）。そのスラリーをオーバーヘッド振盪器で４時間にわたって振盪した。そしてスラリーを遠心分離し、上澄み液をＨＰＬＣによって分析した。結果を図１に示す。

【0026】

実施例３
噴霧乾燥したダクチロスポランギウム・オーランティアカム亜種ハムデネンシスＮＲＲＬ１８０８５の発酵物を異なる水中濃度のメタノールで抽出した。１ｇの発酵物を５ｍＬのメスフラスコに移して、メタノール／水溶液を標線まで添加した。精製水（ＲＯ）中６５％、７０％、７５％、８０％および８５％のメタノールの濃度を試験した。そのスラリーをオーバーヘッド振盪器で１．５時間にわたって振盪した。そしてスラリーを遠心分離し、上澄み液をＨＰＬＣによって分析した。上澄み液の乾燥重量も測定した。結果を図２に示す。

【0027】

抽出収量のピークは７５〜８０％メタノールに存在した。乾燥重量はメタノール濃度が増大するにつれて減少した。ＨＰＬＣ純度はすべてのメタノール濃度において同一なままであった。

【0028】

実施例４
噴霧乾燥したダクチロスポランギウム・オーランティアカム亜種ハムデネンシスＮＲＲＬ１８０８５の発酵物を異なる量の７５％メタノール／水で抽出した。異なる試験管内において、１ｇの発酵物に、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、および１０ｍＬの７５％メタノールを添加した。そのスラリーをオーバーヘッド振盪器で１．５時間にわたって振盪した。そしてスラリーを遠心分離し、上澄み液をＨＰＬＣによって分析した。

【0029】

結果を図３に示す。その収率はすべての量について同様であった。
実施例５
噴霧乾燥したダクチロスポランギウム・オーランティアカム亜種ハムデネンシスＮＲＲＬ１８０８５の発酵物を２時間にわたって撹拌しながら７５％メタノール／水（重量の３倍の量）で抽出した。スラリーを遠心分離し、ロータリーエバポレータ内で２倍に濃縮して、溶液中のメタノールを５０％とした。そしてカラムに充填したＨＰ２０樹脂に濃縮物を直接投入した。そのカラムを５０％メタノールで洗浄し、５０％メタノールから１００％メタノールまでの勾配で溶出した。収率は９２％であった。

【0030】

実施例６
本発明の乾燥工程は、下記の実施例に示すように、小規模および大規模の双方において凍結乾燥によって実施してもよい。

【0031】

６．１ 小規模凍結乾燥
４Ｌのダクチロスポランギウム・オーランティアカム亜種ハムデネンシスＮＲＲＬ１８０８５の発酵物をスチールトレイに注いだ（液高：１．５〜２．０ｃｍ）。そのトレイをヴァーティス・ジェネシス１２ＥＳ凍結乾燥機内に載置して、−４０℃にまで冷凍した。この温度に達した後、トレイを２時間放置した。次に、凝縮器を約−５０°Ｃに冷却し、２００ミリトル（約２６．７Ｐａ）の真空を確立した。棚温度は６００分間にわたって−５°Ｃに調節した。次に、棚温度を速やかに０°Ｃに調節して、１２５０分間にわたって維持した。再び速やかに棚温度を＋５°Ｃに調節し、この温度で生成物を６００分間維持した。速やかに＋２０°Ｃに調節することによって二次乾燥を行い、その温度において生成物を１２５０分間にわたって真空（２００ミリトル（約２６．７Ｐａ））中に放置した。その後に凍結乾燥機からタンクを取り出すと、１７９ｇの乾燥物が得られた。

【0032】

６．２ 大規模凍結乾燥
約１１０Ｌのダクチロスポランギウム・オーランティアカム亜種ハムデネンシスＮＲＲＬ１８０８５の発酵物を４８枚のスチールトレイに注いだ（液高：１．５〜２．０ｃｍ）。そのトレイを２つの凍結乾燥機内に配置して、−２０℃にまで冷凍した。この温度に達した後、発酵物をしばらくの間放置した。凝縮器を約−４０°Ｃに冷却した。次に、約２００ミリトル（約２６．７Ｐａ）の真空を確立した。棚温度は約４４時間にわたって＋４０℃に調節した。その後にトレイを凍結乾燥機から取り出すと、６．６ｋｇの乾燥物が得られた。

【0033】

４００ｇの凍結乾燥したダクチロスポランギウム・オーランティアカム亜種ハムデネンシスＮＲＲＬ１８０８５の発酵物に２０００ｍＬの８０％ｖ／ｖメタノール−水を添加して、１時間にわたって撹拌した。次に、混合物を４５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄み液を静かに移した（１５５０ｍＬの量）。沈降物に１４００ｍＬの８０％ｖ／ｖメタノール−水を添加した。その混合物を一晩放置して、翌日に１時間撹拌した。その後、混合物を４５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄み液を静かに移した（１３８０ｍＬの量）。双方の上澄み液を合わせると２９３０ｍＬの総量であった。全収率は７９％。

【0034】

次に、この溶液を４０°Ｃの水浴上において減圧下で蒸発させた。最終体積は１２２０ｍＬであり、カール・フィッシャー滴定による測定で４０％の水を含有していた。この溶液をＨＰ２０樹脂が充填されたカラムに投入した。

【図1】

【図2】

【図3】