特許 6709733 内在化部分

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6709733

(24)【登録日】2020年5月27日

(45)【発行日】2020年6月17日

(54)【発明の名称】内在化部分

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20200608BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20200608BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20200608BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C07K16/00

   C12P21/08

【請求項の数】15

【全頁数】135

(21)【出願番号】特願2016-545971(P2016-545971)

(86)(22)【出願日】2015年1月13日

(65)【公表番号】特表2017-503511(P2017-503511A)

(43)【公表日】2017年2月2日

(86)【国際出願番号】US2015011269

(87)【国際公開番号】WO2015106290

(87)【国際公開日】20150716

【審査請求日】2017年12月27日

(31)【優先権主張番号】62/042,771

(32)【優先日】2014年8月27日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/926,863

(32)【優先日】2014年1月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/926,865

(32)【優先日】2014年1月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/042,755

(32)【優先日】2014年8月27日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515226124

【氏名又は名称】バレリオン セラピューティクス， エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アームストロング， ダスティン ディー．

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ， ジェフリー シー．

【審査官】 鈴木 優志

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５１６７０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５２９８９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０２６６５７０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１４５１２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１２−１２６７２６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＤＷＰＩ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；
該ＶＨドメインが、以下：
配列番号３８に記載のアミノ酸配列、または配列番号３８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３８と異なるアミノ酸配列、
配列番号３９に記載のアミノ酸配列、または配列番号３９と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３９と異なるアミノ酸配列、あるいは
配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または配列番号１０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号１０と異なるアミノ酸配列、
を含み、
該ＶＬドメインは、以下：
配列番号４０に記載のアミノ酸配列、または配列番号４０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号４０と異なるアミノ酸配列、あるいは
配列番号８に記載のアミノ酸配列、または配列番号８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号８と異なるアミノ酸配列、
を含み、
該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合する、抗体または抗原結合断片。

【請求項2】

前記Ｖ_Ｌドメインが、配列番号４０に記載のアミノ酸配列、または配列番号４０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号４０と異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項3】

前記Ｖ_Ｌドメインが、配列番号８に記載のアミノ酸配列、または配列番号８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号８と異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項4】

前記ＶＬドメインが配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項5】

前記ＶＬドメインが配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項6】

前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号３８に記載のアミノ酸配列、または配列番号３８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３８と異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項7】

前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号３９に記載のアミノ酸配列、または配列番号３９と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３９と異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項8】

前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または配列番号１０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換が存在することが配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項9】

前記ＶＨドメインが配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項10】

前記ＶＨドメインが配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項11】

前記ＶＨドメインが配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項12】

抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｌドメインがヒト化されており、且つ配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｈドメインが配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過し、該ＶＨドメインが、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合断片。

【請求項13】

抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｌドメインがヒト化されており、且つ配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｈドメインが配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過し、該ＶＨドメインが、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合断片。

【請求項14】

配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むマウス３Ｅ１０抗体と比較して、増大したＤＮＡ結合および／または細胞透過を有する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【請求項15】

１０ｎＭ未満のＫ_ＤでＤＮＡに結合することができる、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１４年１月１３日に出願された米国仮出願第６１／９２６，８６３号、２０１４年１月１３日に出願された米国仮出願第６１／９２６，８６５号、２０１４年８月２７日に出願された米国仮出願第６２／０４２，７５５号、２０１４年８月２７日に出願された米国仮出願第６２／０４２，７７１号に対して優先権の利益を主張する。前記出願のそれぞれの開示の全体が参考として本明細書に援用される。

【0002】

開示の背景
モノクローナル抗体は、疾患の防止、同定、および処置、ならびに生物学の理解のための科学者および医師による強力な予防、診断、治療、および研究のためのツールとして、ならびに試薬として頻繁に使用されてきた（Ｄｕｃａｎｃｅｌ，２０１２，Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４（４）：４４５−４５７）。多数のモノクローナル抗体は、齧歯類抗体に由来する。しかし、純粋に齧歯類の抗体または抗体断片の投与は不都合があり、いくつかの条件下で、特に慢性投与のためのヒトにおけるその適用が制限され得る。完全に齧歯類の抗体の免疫原性を減少させ、ヒト被験体での使用をより適切にするキメラ抗体またはヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を生成する技術が存在する。しかし、全てのヒト化抗体またはキメラ抗体がその齧歯類前駆体の性質を保持しているわけではない。さらに、ヒト化抗体の間でさえ、全てが研究薬、診断薬、および／または治療薬としての製造および使用を適切にする性質を共有しているわけではない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Ｄｕｃａｎｃｅｌ，２０１２，Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４（４）：４４５−４５７

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

開示の概要
本開示は、３Ｅ１０親抗体に基づいた抗体および抗原結合断片を提供する。一定の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載のように、ＣＤＲの新規の組み合わせおよび、任意選択的に、１つまたは複数の改良された特徴を有する新規の抗体および抗原結合断片を提供する。本開示の抗体および抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、そして／または１つまたは複数の細胞膜（例えば、原形質膜）を通過する。一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、親３Ｅ１０抗体に類似して、ＤＮＡに結合することができ、ＥＮＴ輸送体（例えば、ＥＮＴ２輸送体および／またはＥＮＴ３輸送体）を介して１つまたは複数の細胞膜（例えば、原形質膜）を通過することができる。いくつかの場合、開示の抗体および抗原結合断片は、本明細書中に記載の３Ｅ１０親抗体と比較して実質的に同一またはさらに改良されたＤＮＡ結合活性および／または細胞透過活性を有する。一定の実施形態では、本開示の抗体および抗原結合断片は、ヒト化重鎖（ヒト化重鎖可変ドメイン−ＶＨなど）および／またはヒト化軽鎖（ヒト化軽鎖可変ドメイン−ＶＬなど）を含む。全長抗体またはＦａｂとして存在する場合、かかるヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト重鎖定常ドメインおよび／またはヒト軽鎖定常ドメインを含む。しかし、開示の抗体をヒト化する場合、重鎖および／または軽鎖の定常ドメインはヒトまたは別の種に由来し得ると認識される。さらに、ヒト化抗体または抗原結合断片がヒト化ＶＨ、ヒト化ＶＬ、またはヒト化ＶＨとヒト化ＶＬとの両方を含み得ると認識される。最後に、下記のように、ヒト化という用語がマウス親抗体の全てのフレームワーク領域の残基が対応するヒト抗体由来の配列に置換されることを必要としないと認識される。むしろ、この用語には、マウス配列に対応する１つまたは複数のフレームワーク領域の残基が保持され、従って、その位置でより頻繁にヒト配列と異なるという実施形態が含まれる。換言すれば、ヒト化重鎖可変ドメインまたはヒト化軽鎖可変ドメインの全体または一部をヒト化することができる。本開示は、同様に、開示の抗体および抗原結合断片がキメラ抗体またはヒト化抗体であり得ることを意図する。本開示を通して、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片について記載の機能上および構造上の特徴、使用、または組成が本開示の任意の抗体または抗原結合断片に同様に適用されることが意図される。

【0005】

本出願を通して、本開示の抗体または抗原結合断片および本開示のヒト化抗体または抗原結合断片（または本開示の抗体および抗原結合断片）という用語を、本明細書中に記載の抗体軽鎖と抗体重鎖との任意の組み合わせをいうために使用するが、前駆体としておよび比較のために使用されるマウスの親抗体のＶＨおよびＶＬの両方を含む抗体は含まれない。一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片の一方または両方の鎖をヒト化する。一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片という用語は、実施例１に記載の第一世代のヒト化抗体を明確に排除する。一定の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載のように、ＣＤＲの新規の組み合わせおよび、任意選択的に、１つまたは複数の改良された特徴を有する新規の抗体および抗原結合断片を提供する。一定の実施形態では、Ｋａｂａｔによる本開示の抗体または抗原結合断片の６つのＣＤＲの組み合わせは、マウス３Ｅ１０親抗体および実施例１に記載のヒト化抗体のものと異なる。

【0006】

一定の実施形態では、本開示は、重鎖が本明細書中に記載の任意の重鎖可変ドメインを含む、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片を提供する。一定の実施形態では、本開示は、軽鎖が本明細書中に記載の任意の軽鎖可変ドメインを含む、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片を提供する。一定の実施形態では、本開示は、重鎖が本明細書中に記載の任意の重鎖可変ドメインを含み、軽鎖が本明細書中に記載の任意の軽鎖可変ドメインを含む、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片を提供する。例として、本開示は、重鎖が配列番号１０、３８、または３９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片を提供する。本開示はまた、軽鎖が配列番号８または４０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片を提供する。本開示はまた、配列番号１０、３８、または３９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む重鎖および配列番号８または４０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含む抗体または抗原結合断片を意図する。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片が本明細書中に記載のＶＬおよびＣＬを含む軽鎖を含むように軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片がＶＨおよび重鎖定常領域の一部（例えば、Ｆｃの一部；ＣＨ１、ヒンジ（またはヒンジ上部（ｕｐｐｅｒ ｈｉｎｇｅ））、ＣＨ２、およびＣＨ３の各ドメインのうちの１つまたは複数）を含む重鎖を含むようにＣＨ１、ヒンジ（ヒンジ上部など）、ＣＨ２、およびＣＨ３のうちの１つまたは複数を含む重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域および軽鎖定常領域の例を本明細書中に記載する。一定の実施形態（任意の前述の一定の実施形態など）では、抗体または抗原結合断片は、抗ＤＮＡ抗体または抗原結合断片（例えば、ＤＮＡに結合することができる）である。

【0007】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、その齧歯類の前駆体の有利な性質（例えば、親抗体（ＤＮＡに結合して細胞内に透過する能力など））を保持するだけでなく、親マウス前駆体抗体の一方もしくは両方および／または一定の１つまたは複数の他の抗体（例えば、同一の親に基づいた異なるヒト化抗体）と比較して、１つまたは複数の改良された性質を有する。具体的には、本開示は、細胞透過性マウス３Ｅ１０抗体（親抗体）に基づいた抗体および抗体断片を提供する。開示の抗体（およびその断片）は、そのマウス前駆体のＤＮＡ結合活性および細胞透過活性を少なくとも実質的に保持する。しかし、一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、そのマウス前駆体と比較して少なくとも１つの優れた生物学的性質または生理学的性質を有する。この抗体はまた、一定の実施形態では、一定の他のヒト化抗体（例えば、同一の親抗体に基づいた他のヒト化抗体）と比較して少なくとも１つの優れた生物学的性質または生理学的性質を有し得る。

【0008】

一定の実施形態では、本開示の抗体および抗原結合断片は、マウス３Ｅ１０抗体と比較して１つまたは複数のＣＤＲ（Ｋａｂａｔに従う）が異なる（例えば、６つのＣＤＲの組み合わせが前述の抗体と異なる）。一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、ＶＨおよびＶＬの一方または両方のＫａｂａｔ ＣＤＲ２が異なる。一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、ＶＬのＫａｂａｔ ＣＤＲ１が異なる。一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、本明細書中に記載のマウス３Ｅ１０抗体と比較して、Ｋａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ２、および、任意選択的に、ＶＬ ＣＤＲ１が異なる。

【0009】

抗体（およびその抗原結合断片）（本開示の抗体が含まれる）を、異種薬剤に会合したコンジュゲートまたは融合タンパク質として提供することができる。

【0010】

かかるコンジュゲート（例えば、化学的コンジュゲートおよび／または融合物）を同様に意図する。本開示の任意の抗体または抗原結合断片は、本開示の抗体または抗原結合断片に会合された異種薬剤（例えば、コンジュゲート化された異種薬剤；本開示の抗体または抗原結合断片および本開示の抗体または抗原結合断片に会合された異種薬剤を含むコンジュゲート）をさらに含むことができる。

【0011】

本開示は、抗体および抗原結合断片、ならびにかかる抗体またはその抗原結合断片の作製方法および使用方法を提供する。文脈上明らかに別の意味を示していない限り、本開示の抗体および抗原結合断片は、任意選択的に異種薬剤を含む。
１つの態様では、本開示は、抗体または抗原結合断片であって、抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインがヒト化されており、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み；これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムを使用して定義されており（例えば、ＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っている）；
ＶＬドメインがヒト化されており、以下：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み；これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムを使用して定義されており（例えば、ＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っている）、抗体または抗原結合断片のＤＮＡ結合および／または細胞透過は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むマウス３Ｅ１０抗体のＤＮＡ結合および／または細胞透過と比較して増加している、抗体または抗原結合断片を提供する。かかるマウス３Ｅ１０は、存在する場合、マウス定常領域を含む。
前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインが、以下：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、
ここで、ＣＤＲはＫａｂａｔシステムによって定義されており（例えば、ＣＤＲはＫａｂａｔに従っている）；
ＶＬは、以下：
配列番号３５または５０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
ここで、ＣＤＲはＫａｂａｔシステムによって定義されており（例えば、ＣＤＲはＫａｂａｔに従っている）；
抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合する。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインはヒト化されている。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインはヒト化されている。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方はヒト化されている。上述のように、ヒト化は、全体または一部であり得る（例えば、１つまたは複数（または全て）のフレームワーク領域の全てまたは一部をヒト化することができる）。

【0013】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片）は、マウス３Ｅ１０親抗体のものに少なくともほぼ匹敵するＤＮＡ結合活性および細胞透過活性を有し、任意選択的に、ＤＮＡ結合活性および細胞透過活性の一方または両方が同一であるかさらに改良されている。一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体および抗原結合断片）は、ＤＮＡに結合することが可能であり、１つまたは複数の細胞膜（例えば、原形質膜）を通過することが可能である。一定の実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片は、３Ｅ１０親抗体のものに少なくともほぼ匹敵するＤＮＡ結合活性および細胞透過活性を有し、任意選択的に、ＤＮＡ結合活性および細胞透過活性の一方または両方が同一であるかさらに改良されている。一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、ＤＮＡに結合することが可能であり、１つまたは複数の細胞膜（例えば、原形質膜；例えば、細胞質内への送達を容易にするため）を通過することが可能である。一定の実施形態では、親抗体との比較は、３Ｅ１０親のＶＨドメインおよびＶＬドメインならびにマウス定常領域を有する抗体との比較である。

【0014】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示の抗体および抗原結合断片は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメイン、または配列番号４０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号４０と異なるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列、または配列番号８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号８と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0015】

一定の実施形態では、本開示は、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片であって、軽鎖が、配列番号４０に記載のアミノ酸配列、または配列番号４０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号４０と異なるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片を提供する。一定の実施形態では、本開示は、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片であって、軽鎖が、配列番号８に記載のアミノ酸配列、または配列番号８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号８と異なるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0016】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示の抗体および抗原結合断片は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメイン、または配列番号３８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３８と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列、または配列番号３９と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３９と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または配列番号１０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0017】

一定の実施形態では、本開示は、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片であって、重鎖が、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメイン、または配列番号３８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３８と異なるアミノ酸配列を含む、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列、または配列番号３９と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３９と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または配列番号１０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0018】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｌドメインはヒト化されており、且つ配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、ＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む。

【0019】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｌドメインはヒト化されており、且つ配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、ＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む。

【0020】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインはヒト化されており、且つ配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、ＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む。

【0021】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインはヒト化されており、且つ配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、ＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む。

【0022】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、ＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む。
前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片のＶ_Ｈドメインは、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0023】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片のＶ_Ｌドメインは、以下：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。

【0024】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の任意の抗体または抗原結合断片のＶ_Ｈドメインは、配列番号９の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化：Ｖ５Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｖ１２Ｉ、Ｋ１３Ｑ、Ｒ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｖ３７Ｉ、Ｅ４２Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｔ６３Ｓ、Ａ７５Ｓ、Ｆ８０Ｙ、Ｔ８４Ｎ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｔ１１１Ｌ、またはＬ１１２Ｖを含む（例えば、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と比較して、対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸の変化を含む）。変化の例は、１つまたは複数のフレームワーク領域中に存在する。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、１つまたは複数の以下を含むＶＨドメインを含む：配列番号９の５位に対応する位置のＱ、配列番号９の６位に対応する位置のＱ、配列番号９の１１位に対応する位置のＶ、配列番号９の１２位に対応する位置のＩ、配列番号９の１３位に対応する位置のＱ、配列番号９の１８位に対応する位置のＬ、配列番号９の１９位に対応する位置のＲ、配列番号９の３７位に対応する位置のＩ、配列番号９の４２位に対応する位置のＧ、配列番号９の４９位に対応する位置のＳ、配列番号９の６３位に対応する位置のＳ、配列番号９の残基７５に対応する位置のＳ、配列番号９の８０位に対応する位置のＹ、配列番号９の８４位に対応する位置のＮ、配列番号９の８８位に対応する位置のＡ、配列番号９の位置９３に対応する位置のバリン、配列番号９の１１１位に対応する位置のＬ、または配列番号９の１１２位に対応する位置のＶ。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化：Ｖ５Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｋ１３Ｑ、Ｒ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｖ３７Ｉ、Ｅ４２Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｔ６３Ｓ、Ａ７５Ｓ、Ｆ８０Ｙ、Ｔ８４Ｎ、Ｍ９３Ｖ、Ｔ１１１Ｌ、またはＬ１１２Ｖを含む（例えば、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と比較して、対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸の変化を含む）。変化の例は、１つまたは複数のフレームワーク領域中に存在する。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の前記アミノ酸の変化を含む。一定の実施形態では、配列番号９の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化はＶ５Ｑ変化である。一定の実施形態では、配列番号９の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化はＥ６Ｑ変化である。一定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化はＬ１１Ｖ変化である。一定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化はＶ３７Ｉ変化である。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９のアミノ酸８８位に対応するアミノ酸の位置にセリンを保持している。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９のアミノ酸１２位に対応するアミノ酸の位置にバリンを保持している。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９のアミノ酸４７位に対応するアミノ酸の位置にトリプトファンを保持している。一定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸８８位に対応するアミノ酸の位置にセリンを含む。一定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸１２位（ｐｏｓｉｔｏｎ）に対応するアミノ酸の位置にバリンを含む。一定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸４７位（ｐｏｓｉｔｏｎ）に対応するアミノ酸の位置（ｐｏｓｉｔｏｎ）にトリプトファンを含む。

【0025】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の任意の抗体または抗原結合断片のＶ_Ｌドメインは、配列番号７の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化を含む：Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ａ９Ｓ、Ａ１２Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｌ１５Ｖ、Ｑ１７Ｄ、Ａ１９Ｖ、Ｓ２２Ｔ、Ｍ３７Ｌ、Ｈ３８Ａ、Ｇ４５Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｐ４７Ａ、Ｅ５９Ｑ、Ａ６４Ｓ、Ｈ７６Ｔ、Ｎ７８Ｔ、Ｈ８０Ｓ、Ｐ８１Ｓ、Ｖ８２Ｌ、Ｅ８３Ｑ、Ｅ８４Ｐ、Ａ８７Ｖ、Ａ８７Ｆ、またはＧ１０４Ａ（例えば、ＶＬドメインは、配列番号７のアミノ酸配列と比較して、対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸の変化を含む）。変化の例は、１つまたは複数のフレームワーク領域中に存在する。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、１つまたは複数の以下を含むＶＬドメインを含む：配列番号７の３位に対応する位置のＱ、配列番号７の４位に対応する位置のＭ、配列番号７の９位に対応する位置のＳ、配列番号７の１２位に対応する位置のＳ、配列番号７の１３位に対応する位置のＡ、配列番号７の１５位に対応する位置のＶ、配列番号７の１７位に対応する位置のＤ、配列番号７の１９位に対応する位置のＶ、配列番号７の２２位に対応する位置のＴ、配列番号７の３７位に対応する位置のＬ、配列番号７の３８位に対応する位置のＡ、配列番号７の４５位に対応する位置のＥ、配列番号７の４６位に対応する位置のＫ、配列番号７の４７位に対応する位置のＡ、配列番号７の５９位に対応する位置のＱ、配列番号７の６４位に対応する位置のＳ、配列番号７の７６位に対応する位置のＴ、配列番号７の７８位に対応する位置のＴ、配列番号７の８０位に対応する位置のＳ、配列番号７の８１位に対応する位置のＳ、配列番号７の８２位に対応する位置のＬ、配列番号７の８３位に対応する位置のＱ、配列番号７の８４位に対応する位置のＰ、配列番号７の８７位に対応する位置のＶ、配列番号７の８７位に対応する位置のＦ、または配列番号７の１０４位に対応する位置のＡ。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号７の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化を含む：Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ａ９Ｓ、Ａ１２Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｌ１５Ｖ、Ｑ１７Ｄ、Ａ１９Ｖ、Ｇ４５Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｐ４７Ａ、Ｅ５９Ｑ、Ａ６４Ｓ、Ｈ７６Ｔ、Ｎ７８Ｔ、Ｈ８０Ｓ、Ｐ８１Ｓ、Ｖ８２Ｌ、Ｅ８３Ｑ、Ｅ８４Ｐ、Ａ８７Ｖ、またはＧ１０４Ａ（例えば、ＶＬドメインは、配列番号７のアミノ酸配列と比較して、対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸の変化を含む）。変化の例は、１つまたは複数のフレームワーク領域中に存在する。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号７の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、または少なくとも１８の前記アミノ酸の変化を含む。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の各位置にセリンを含む。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号７のアミノ酸５３位に対応するアミノ酸の位置にリジンを保持している。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、１つまたは複数の以下のアミノ酸の組み合わせ：
ａ）それぞれ、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の位置のアスパラギンおよびセリン；
ｂ）それぞれ、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の位置のアスパラギンおよびグリシン；または
ｃ）それぞれ、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の位置のアスパラギンおよびプロリンのいずれも持たない。

【0026】

配列番号７または９に記載のアミノ酸配列と比較した特定の位置での任意の前述の変動について言及していると理解すべきである。本開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号７または９のアミノ酸配列と比較した対応する位置に１つまたは複数のかかるアミノ酸の変化を含むことができる。例として、一定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９の１１位に対応する位置のＬからＶへの変化（例えば、Ｌ１１Ｖ変化）を含む。これは、前述の全ての変化を説明することもできる方法の例であり、かかる説明が明確に意図される。別の例として、一定の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号７の３位に対応する位置にＶからＱへの変化（例えば、Ｖ３Ｑ変化）を含む。

【0027】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片はｓｃＦｖである。一定の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとを相互接続するリンカーを含む。一定の実施形態では、リンカーはグリシン−セリンリンカーである。一定の実施形態では、グリシン−セリンリンカーは（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーである。一定の実施形態では、ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメインは、Ｖ_ＬドメインのＮ末端である。一定の実施形態では、ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメインは、Ｖ_ＬドメインのＣ末端である。

【0028】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片はＦａｂまたはＦａｂ’である。一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片はＦ（ａｂ’）２断片である。

【0029】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片は、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３の各ドメインを含むＦｃ領域を含む重鎖定常ドメイン）を含む全長抗体である。全長未満の抗体も意図する。

【0030】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片はヒト化されており、マウス抗体と比較して、少なくとも１つの優れた生物学的性質または生理学的性質に関連し、マウス抗体は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインおよび配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含み、そして／またはオルタナティブ抗体またはその抗原結合断片と比較して、前記オルタナティブ抗体または抗原結合断片は、配列番号７に記載のアミノ酸配列のＣＤＲを含むＶ_Ｌドメインおよび配列番号９に記載のアミノ酸配列のＣＤＲを含むＶ_Ｈドメインを含み；前記オルタナティブ抗体または断片は配列番号８または４０のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインを含まず、そして／または前記オルタナティブ抗体または断片は配列番号１０、３８、または３９のいずれかのアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含まない。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、オルタナティブ抗体またはその断片は、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムによって定義されている。いくつかの実施形態では、オルタナティブ抗体またはその断片は、以下：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらのＣＤＲはＫａｂａｔにしたがって定義されている。

【0031】

前述または以下のいずれかの一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲはＩＭＧＴシステムにしたがって定義されており；および／または
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号３５または５０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されている。

【0032】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、マウス３Ｅ１０抗体またはオルタナティブ抗体と比較した本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片の優れた生物学的性質または生理学的性質は、生理学的に許容され得るキャリア中の抗体または断片の溶解性の増加である。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、宿主細胞中で作製された場合の抗体または断片の発現レベルがより高いことである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、細胞内の抗体または断片の毒性がより低いことである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、少なくとも２４時間後の生理学的に許容され得るキャリア中の抗体または断片の凝集が減少することである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、少なくとも２４時間後の生理学的に許容され得るキャリア中の抗体または断片の安定性が増加することである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、抗体または断片による細胞透過が改良されることである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、抗体または断片によるＤＮＡ結合が改良されることである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、ある細胞型における産生後の抗体または断片のグリコシル化が同一細胞型における産生後のマウス抗体またはオルタナティブ抗体のものと比較して減少することである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、ある細胞型における産生後の抗体または断片のグリコシル化が同一細胞型における産生後のマウス抗体またはオルタナティブ抗体のものと比較して増加することである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、生理学的に許容され得るキャリア中の抗体または断片の脱アミド化が減少することである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、生理学的に許容され得るキャリア中の抗体または断片の酸化が低下することである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、ある細胞型における産生後の抗体または断片のリピド化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）が同一細胞型における産生後のマウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して低下することである。一定の実施形態では、優れた生物学的性質または生理学的性質は、ＥＮＴ輸送体（例えば、ＥＮＴ２輸送体および／またはＥＮＴ３輸送体）を介した抗体または断片の内在化が増加すること、および／またはＳＰＲまたはＱＣＭによって測定するか、ＥＬＩＳＡによって測定した場合により低いＫ_Ｄによって示されるＤＮＡへのより高い親和性結合である。

【0033】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の任意の抗体または抗原結合断片が異種薬剤にコンジュゲート化されている（例えば、相互接続されているか；連結されているか、会合されている）（例えば、抗体または抗原結合断片に会合された異種薬剤をさらに含む）。一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、異種薬剤にコンジュゲート化されていない（例えば、抗体または抗原結合断片は異種薬剤をさらに含まない）。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は異種治療薬にコンジュゲート化していない。一定の実施形態では、異種薬剤は、ポリペプチドまたはペプチド（治療用ポリペプチドまたはペプチドなど）である。一定の実施形態では、異種薬剤は核酸または有機小分子である。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は異種薬剤のＮ末端である。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は異種薬剤のＣ末端である。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片および異種薬剤は、リンカーを介して相互接続している。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片および異種薬剤は、リンカーを使用しないで相互接続している。一定の実施形態では、異種薬剤は、エピトープタグ（ＨＡタグまたはｍｙｃタグなど）ではない。一定の実施形態では、エピトープタグ（ＨＡタグまたはｍｙｃタグなど）は存在するが、さらなる異種薬剤も存在する（例えば、抗体または抗原結合断片は、エピトープタグのみにコンジュゲート化するわけではない）。一定の実施形態では、異種薬剤は、放射性部分（ｍｏｉｅｔｙ）や蛍光性部分ではない。誤解を避けるために、シグナル配列は異種薬剤ではない。一定の実施形態では、異種薬剤は治療薬である。一定の実施形態では、抗体または断片および異種薬剤は、化学的にコンジュゲート化している。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片および異種薬剤は融合タンパク質である（例えば、相互接続の全てまたは一部が、抗体の一部と異種薬剤の一部との間の融合タンパク質を介している）。本明細書中に詳述するように、「コンジュゲート化された」は、本開示の任意の抗体または抗原結合部分が相互接続と無関係に異種薬剤と会合または相互接続するシナリオをいう（例えば、相互接続／会合は、化学的コンジュゲート化、共有結合、ジスルフィド結合などまたはその組み合わせを含み得る）。一定の実施形態では、相互接続の少なくとも一部は、共有結合を介する（開示の抗体の重鎖と異種薬剤（開示の抗体の軽鎖とさらに会合することができる）との間での融合タンパク質の形成など）。したがって、本開示は、かかるコンジュゲートおよびかかるコンジュゲートを含む薬学的組成物を提供する。コンジュゲートは、異種薬剤に会合した本開示の抗体または抗原結合部分を含む分子である。同様に、開示の抗体または抗原結合断片は、異種薬剤をさらに含むことができる。

【0034】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に開示の抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化した異種薬剤は、ヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害の処置に適切な薬剤である。一定の実施形態では、障害は筋緊張性ジストロフィである。一定の実施形態では、障害はハンチントン病である。一定の実施形態では、障害は神経線維腫症である。一定の実施形態では、薬剤は、ＣＵＧ反復に結合し（例えば、ＣＵＧ反復の存在下でＣＵＧに結合し）、そして／またはエクソンスプライシングを制御することが可能であるＭＢＮＬ１ポリペプチドまたはその断片である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＵＧ反復に結合し、ＹＧＣＹモチーフに結合し、そして／またはエクソンスプライシングを制御することが可能である、配列番号１２〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＭＢＮＬ１ポリペプチドまたはその断片である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＵＧ反復に結合し、そして／またはエクソンスプライシングを制御することが可能である配列番号１２〜１８または５５〜５９のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％（または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一のアミノ酸配列を含むＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片である。一定の実施形態では、その断片は、少なくとも４つの亜鉛フィンガーモチーフを含むＭＢＮＬの断片である。一定の実施形態では、その断片は、少なくとも２つの亜鉛フィンガーモチーフを含むＭＢＮＬの断片である。

【0035】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に開示の抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化した異種薬剤は酵素である。一定の実施形態では、酵素は、酵素補充療法としての使用に適切である。一定の実施形態では、酵素補充療法は、筋細管筋障害のための処置法である。一定の実施形態では、異種薬剤は、ＭＴＭ１タンパク質またはその機能的断片である。一定の実施形態では、ＭＴＭ１タンパク質は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％（または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一のアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。

【0036】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に開示の抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化した異種薬剤は、糖原貯蔵障害の処置に適切な薬剤である。一定の実施形態では、糖原貯蔵障害はポンペ病である。一定の実施形態では、糖原貯蔵障害はフォーブス・コリ病である。いくつかの実施形態では、異種薬剤は、成熟ＧＡＡポリペプチドを含む酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、異種薬剤は、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドであり、ＧＡＡポリペプチドはおよそ１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドではない。いくつかの実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドの分子量はおよそ７０〜７６キロダルトンである。一定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸残基１〜５６を含まない。一定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２の残基１２２〜７８２または配列番号２２の残基２０４〜７８２から選択されるアミノ酸配列からなる。一定の実施形態では、薬剤はアミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）ポリペプチドまたはその機能的断片であり、ＡＧＬポリペプチドまたは断片はアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する。一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、配列番号１９〜２１のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、コンジュゲートは、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する。

【0037】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片をコードする核酸を提供する。他の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示の任意のコンジュゲート（例えば、（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片および（ｉｉ）異種薬剤を含む任意のコンジュゲート）をコードする核酸を提供する。一定の実施形態では、核酸は、異なるベクター上で発現された核酸対である。

【0038】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示の任意の核酸を含むベクターを提供する。一定の実施形態では、本開示は、ベクター対を提供し、第１のベクターは本開示の抗体または抗原結合断片の重鎖（または重鎖の一部）をコードするヌクレオチド配列を含み、第２のベクターは本開示の抗体または抗原結合断片の軽鎖（または軽鎖の一部）をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0039】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示の任意のベクターを含む宿主細胞を提供する。一定の実施形態では、宿主細胞は、不死化細胞であるか、ベクターを発現するように安定にトランスフェクトされている。前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドの産生方法であって、宿主細胞を提供する工程および適切な条件下で宿主細胞を培養してポリペプチドを産生する、培養する工程を含む方法を提供する。

【0040】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、ヌクレオチド反復障害の処置を必要とする被験体におけるヌクレオチド反復障害を処置する方法であって、異種薬剤（ＣＵＧ反復に結合し、そして／またはエクソンスプライシングを制御することが可能であるＭＢＮＬ１ポリペプチドまたはその断片など）にコンジュゲート化した本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は筋緊張性ジストロフィである。一定の実施形態では、障害はハンチントン病である。

【0041】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、酵素補充処置を必要とする被験体に酵素補充処置を提供する方法であって、異種薬剤（ＭＴＭ１タンパク質、ＧＡＡポリペプチド、またはＡＧＬポリペプチドなど）にコンジュゲート化した本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

【0042】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、糖原貯蔵障害の処置を必要とする被験体における糖原貯蔵障害を処置する方法であって、ＧＡＡポリペプチドまたはＡＧＬポリペプチド（本明細書中に開示のＧＡＡポリペプチドまたはＡＧＬポリペプチドのいずれかなど）にコンジュゲート化した本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

【0043】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、筋細管筋障害の処置を必要とする被験体における筋細管筋障害を処置する方法であって、ＭＴＭ１タンパク質（本明細書中に開示の任意のＭＴＭタンパク質など）にコンジュゲート化した本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

【0044】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、ポンペ病の処置を必要とする被験体におけるポンペ病を処置する方法であって、ＧＡＡポリペプチド（本明細書中に開示の任意のＧＡＡポリペプチドなど）にコンジュゲート化した本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

【0045】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、フォーブス・コリ病の処置を必要とする被験体におけるフォーブス・コリ病を処置する方法であって、ＧＡＡポリペプチドまたはＡＧＬポリペプチド（本明細書中に開示のＧＡＡポリペプチドまたはＡＧＬポリペプチドのいずれかなど）にコンジュゲート化した本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

【0046】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、神経線維腫症１の処置を必要とする被験体における神経線維腫症１を処置する方法であって、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片（本明細書中に開示の任意のＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片など）にコンジュゲート化した本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

【0047】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞の成長の阻害および／または癌の処置を必要とする被験体における腫瘍細胞の成長の阻害および／または癌の処置方法であって、本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

【0048】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、生理学的に許容され得るキャリア中に製剤化された本明細書中に記載の任意の抗体または抗原結合断片を含む組成物を提供する。一定の実施形態では、組成物は発熱物質を含まない。

【0049】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本開示は、異種薬剤を細胞または組織内に（細胞質内などに）送達する方法であって、細胞を、本明細書中に記載の任意の抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む方法を提供する。一定の実施形態では、細胞または組織は被験体内に存在し、接触させる工程は、抗体または抗原結合断片を被験体に投与することを含む。一定の実施形態では、細胞または組織はｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する。一定の実施形態では、細胞は骨格筋細胞であり、組織は骨格筋を含む。一定の実施形態では、細胞は心筋細胞であり、組織は心筋を含む。一定の実施形態では、細胞は肝細胞であり、組織は肝組織を含む。一定の実施形態では、細胞はニューロンであり、組織は神経組織を含む。一定の実施形態では、細胞は腎臓細胞であり、組織は腎臓組織を含む。一定の実施形態では、被験体は、ヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害を有する被験体である。一定の実施形態では、被験体は、酵素欠乏障害を有し、且つ酵素補充療法を必要とする被験体である。一定の実施形態では、被験体は、糖原貯蔵障害を有する被験体である。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片を、被験体の細胞内に送達する。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片を細胞質内に送達する。

【0050】

本開示は、任意の前述の態様および実施形態の全ての組み合わせ、ならびに詳細な説明および実施例に記載の任意の実施形態との組み合わせを意図する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；該ＶＨドメインが、以下：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔシステムに従っており；
該ＶＬは、以下：
配列番号３５または５０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔシステムに従っており；
該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合する、抗体または抗原結合断片。
（項目２）
抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；該ＶＨドメインがヒト化されており、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っており；
該ＶＬドメインがヒト化されており、以下：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っており；
該抗体または抗原結合断片のＤＮＡ結合および／または細胞透過が、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むマウス３Ｅ１０抗体のＤＮＡ結合および／または細胞透過と比較して増加している、抗体または抗原結合断片。
（項目３）
前記ＶＨドメインがヒト化されている、項目１に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４）
前記ＶＬドメインがヒト化されている、項目１または項目３に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５）
前記Ｖ_Ｌドメインが、配列番号４０に記載のアミノ酸配列、または配列番号４０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号４０と異なるアミノ酸配列を含む、項目１〜項目４に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６）
前記Ｖ_Ｌドメインが、配列番号８に記載のアミノ酸配列、または配列番号８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号８と異なるアミノ酸配列を含む、項目１〜項目４に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７）
前記ＶＬが配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、項目４または項目５に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８）
前記ＶＬが配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、項目４に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９）
前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号３８に記載のアミノ酸配列、または配列番号３８と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３８と異なるアミノ酸配列を含む、項目１〜８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１０）
前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号３９に記載のアミノ酸配列、または配列番号３９と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号３９と異なるアミノ酸配列を含む、項目１〜８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１１）
前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または配列番号１０と比較してＩＭＧＴシステムによって定義した場合にフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸置換が存在することが配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含む、項目１〜８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１２）
前記ＶＨが配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む、項目９に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１３）
前記ＶＨが配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１４）
前記ＶＨが配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１５）
抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｌドメインがヒト化されており、且つ配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｈドメインが配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、抗体または抗原結合断片。
（項目１６）
抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｌドメインがヒト化されており、且つ配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｈドメインが配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、抗体または抗原結合断片。
（項目１７）
抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｈドメインがヒト化されており、且つ配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｌドメインが配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、抗体または抗原結合断片。
（項目１８）
抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｈドメインがヒト化されており、且つ配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｌドメインが配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、抗体または抗原結合断片。
（項目１９）
抗体または抗原結合断片であって、該抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｈドメインがヒト化されており、且つ配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｌドメインが配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、抗体または抗原結合断片。
（項目２０）
前記Ｖ_Ｈドメインがヒト化されており、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む、項目１５または項目１６に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２１）
前記Ｖ_Ｌドメインがヒト化されており、以下：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、項目１５〜１９のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２２）
前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号９のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化：Ｖ５Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｖ１２Ｉ、Ｋ１３Ｑ、Ｒ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｖ３７Ｉ、Ｅ４２Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｔ６３Ｓ、Ａ７５Ｓ、Ｆ８０Ｙ、Ｔ８４Ｎ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｔ１１１Ｌ、またはＬ１１２Ｖを含む、項目１〜８、１５または１６または２０のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２３）
前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号９のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化：Ｖ５Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｋ１３Ｑ、Ｒ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｖ３７Ｉ、Ｅ４２Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｔ６３Ｓ、Ａ７５Ｓ、Ｆ８０Ｙ、Ｔ８４Ｎ、Ｍ９３Ｖ、Ｔ１１１Ｌ、またはＬ１１２Ｖを含む、項目２２に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２４）
前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号９のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の前記アミノ酸の変化を含む、項目２２または項目２３に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２５）
配列番号９のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、前記Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化がＶ５Ｑ変化である、項目２２〜２４のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２６）
配列番号９のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、前記Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化がＥ６Ｑ変化である、項目２２〜２５のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２７）
配列番号９のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、前記Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化がＬ１１Ｖ変化である、項目２２〜２６のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２８）
配列番号９のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、前記Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化がＶ３７Ｉ変化である、項目２２〜２７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２９）
前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号９のアミノ酸８８位に対応するアミノ酸の位置にセリンを保持している、項目１〜８、１５、１６、２０、および２２〜２８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３０）
前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号９のアミノ酸１２位に対応するアミノ酸の位置にバリンを保持している、項目１〜８、１５、１６、２０、および２２〜２９のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３１）
前記Ｖ_Ｈドメインが、配列番号９のアミノ酸４７位に対応するアミノ酸の位置にトリプトファンを保持している、項目１〜８、１５、１６、２０、および２２〜３０のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３２）
前記Ｖ_Ｌドメインが、配列番号７のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化：Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ａ９Ｓ、Ａ１２Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｌ１５Ｖ、Ｑ１７Ｄ、Ａ１９Ｖ、Ｓ２２Ｔ、Ｍ３７Ｌ、Ｈ３８Ａ、Ｇ４５Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｐ４７Ａ、Ｅ５９Ｑ、Ａ６４Ｓ、Ｈ７６Ｔ、Ｎ７８Ｔ、Ｈ８０Ｓ、Ｐ８１Ｓ、Ｖ８２Ｌ、Ｅ８３Ｑ、Ｅ８４Ｐ、Ａ８７Ｖ、Ａ８７Ｆ、またはＧ１０４Ａを含む、項目１〜４、９〜１４、１７〜１９、および２２〜３１のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３３）
前記Ｖ_Ｌドメインが、配列番号７のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化：Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ａ９Ｓ、Ａ１２Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｌ１５Ｖ、Ｑ１７Ｄ、Ａ１９Ｖ、Ｇ４５Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｐ４７Ａ、Ｅ５９Ｑ、Ａ６４Ｓ、Ｈ７６Ｔ、Ｎ７８Ｔ、Ｈ８０Ｓ、Ｐ８１Ｓ、Ｖ８２Ｌ、Ｅ８３Ｑ、Ｅ８４Ｐ、Ａ８７Ｖ、またはＧ１０４Ａを含む、項目１〜４、９〜１４、１７〜１９、および２２〜３２に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３４）
前記Ｖ_Ｌドメインが、配列番号７のアミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合に、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、または少なくとも１８の前記アミノ酸の変化を含む、項目３２または項目３３に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３５）
前記Ｖ_Ｌドメインが、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の各位置にセリンを含む、項目３２、３３、または３４に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３６）
前記Ｖ_Ｌドメインが、配列番号７のアミノ酸５３位に対応するアミノ酸の位置にリジンを保持している、項目３２〜３５のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３７）
前記Ｖ_Ｌドメインが、以下のアミノ酸の組み合わせ：
ａ）それぞれ、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の位置のアスパラギンおよびセリン；または
ｂ）それぞれ、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の位置のアスパラギンおよびグリシン；または
ｃ）それぞれ、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の位置のアスパラギンおよびプロリン
のいずれも持たない、項目３２〜３６のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３８）
ｓｃＦｖである、項目１〜３７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３９）
Ｆａｂ’である、項目１〜３７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４０）
Ｆ（ａｂ’）２断片である、項目１〜３７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４１）
重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む全長抗体である、項目１〜３７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４２）
前記ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬとを相互接続するリンカーを含む、項目３８に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４３）
前記リンカーがグリシン−セリンリンカーである、項目４２に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４４）
前記グリシン−セリンリンカーが（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーである、項目４２に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４５）
前記Ｖ_Ｈドメインが前記Ｖ_ＬドメインのＮ末端である、項目４２〜４４のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４６）
前記Ｖ_Ｈドメインが前記Ｖ_ＬドメインのＣ末端である、項目４２〜４４のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４７）
前記抗体または抗原結合断片がヒト化されており、マウス抗体であって、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインおよび配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含むマウス抗体と比較した場合に、かつ／またはオルタナティブヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、該オルタナティブヒト化抗体または抗原結合断片が、配列番号７に記載のアミノ酸配列のＣＤＲを含むＶ_Ｌドメインおよび配列番号９に記載のアミノ酸配列のＣＤＲを含むＶ_Ｈドメインを含み；該オルタナティブヒト化抗体または断片が配列番号８または４０のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインを含まず、かつ／または該オルタナティブヒト化抗体または断片が配列番号１０、３８、または３９のいずれかのアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含まない、オルタナティブヒト化抗体またはその抗原結合断片と比較した場合に、少なくとも１つの優れた生物学的性質または生理学的性質に関連する、項目１〜４６のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４８）
前記ヒト化抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｌドメインが配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｈドメインが配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、項目４７に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４９）
前記ヒト化抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｌドメインが配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｈドメインが配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、項目４７に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５０）
前記ヒト化抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｈドメインが配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｌドメインが配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、項目４７に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５１）
前記ヒト化抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｈドメインが配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｌドメインが配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、項目４７に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５２）
前記ヒト化抗体または抗原結合断片が軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；該Ｖ_Ｈドメインが配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含み；該Ｖ_Ｌドメインが配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、該抗体または抗原結合断片がＤＮＡに結合し、細胞を透過する、項目４７に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５３）
前記オルタナティブヒト化抗体またはその断片が、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っている、項目４７〜５２のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５４）
前記オルタナティブヒト化抗体またはその断片が、以下：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔシステムに従っている、項目４７〜５２のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５５）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、生理学的に許容され得るキャリアにおける溶解度が増加することである、項目４７〜５４のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５６）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、宿主細胞中で作製された場合の発現レベルが高いことである、項目４７〜５５のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５７）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、細胞における毒性が低いことである、項目４７〜５６のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５８）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、少なくとも２４時間後の生理学的に許容され得るキャリア中の凝集が減少することである、項目４７〜５７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５９）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、少なくとも２４時間後の生理学的に許容され得るキャリアにおける安定性が増加することである、項目４７〜５８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６０）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、細胞透過が改良されることである、項目４７〜５９のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６１）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、ＤＮＡ結合が改良されることである、項目４７〜６０のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６２）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、ある細胞型における産生後のグリコシル化が同一細胞型における産生後の前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して減少することである、項目４７〜６１のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６３）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、ある細胞型における産生後のグリコシル化が同一細胞型における産生後の前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して増加することである、項目４７〜６２のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６４）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、生理学的に許容され得るキャリア中の脱アミド化が低下することである、項目４７〜６３のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６５）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、生理学的に許容され得るキャリア中の酸化が低下することである、項目４７〜６４のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６６）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、ある細胞型における産生後のリピド化が同一細胞型における産生後の前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して低下することである、項目４７〜６５のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６７）
前記優れた生物学的性質または生理学的性質が、前記マウス抗体またはオルタナティブ抗体と比較して、ＥＮＴ２輸送体を介した内在化が増加すること、および／またはＳＰＲまたはＱＣＭによって測定した場合により低いＫ_Ｄによって示されるＤＮＡへのより高い親和性結合である、項目４７〜６６のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６８）
前記抗体または抗原結合断片が異種薬剤にコンジュゲート化されている、項目１〜６７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６９）
前記抗体または抗原結合断片がコンジュゲート化された異種薬剤をさらに含む、項目１〜６７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７０）
前記異種薬剤がポリペプチドまたはペプチドである、項目６８または６９に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７１）
前記異種薬剤が核酸または有機小分子である、項目６８または項目６９に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７２）
前記抗体または抗原結合断片が前記異種薬剤のＮ末端である、項目６８〜７１のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７３）
前記抗体または抗原結合断片が前記異種薬剤のＣ末端である、項目６８〜７１のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７４）
前記抗体または抗原結合断片および前記異種薬剤がリンカーを介して相互接続している、項目７２または項目７３に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７５）
前記抗体または抗原結合断片および前記異種薬剤が、リンカーを使用しないで相互接続している、項目７２または項目７３に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７６）
前記抗体または断片および前記異種薬剤が化学的にコンジュゲート化している、項目７２〜７５のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７７）
前記抗体または抗原結合断片および前記異種薬剤が融合タンパク質を含む、項目７２〜７５のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７８）
前記異種薬剤がヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害の処置に適切な薬剤である、項目６８〜７７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目７９）
前記障害が筋緊張性ジストロフィである、項目７８に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８０）
前記障害がハンチントン病である、項目７８に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８１）
前記障害が神経線維腫症である、項目７８に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８２）
前記異種薬剤が、ＣＵＧ反復に結合し、そして／またはエクソンスプライシングを制御することができるＭＢＮＬ１ポリペプチドまたはその断片である、項目６８〜８１のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８３）
前記異種薬剤が、ＣＵＧ反復に結合し、そして／またはエクソンスプライシングを制御することができる、配列番号１２〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＭＢＮＬ１ポリペプチドまたはその断片である、項目８２に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８４）
前記異種薬剤が酵素である、項目６８〜７７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８５）
前記酵素が酵素補充療法としての使用に適切である、項目８４に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８６）
前記酵素補充療法が筋細管筋障害の処置のための治療法である、項目８５に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８７）
前記異種薬剤が、ＭＴＭ１タンパク質またはその機能的断片である、項目６８〜７７および８４〜８６のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８８）
前記ＭＴＭ１タンパク質が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、項目８７に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目８９）
前記異種薬剤が糖原貯蔵障害の処置に適切な薬剤である、項目６８〜７６のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９０）
前記糖原貯蔵障害がポンペ病である、項目８９に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９１）
前記糖原貯蔵障害がフォーブス・コリ病である、項目９０に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９２）
前記薬剤が、成熟ＧＡＡポリペプチドを含む酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドである、項目６８〜７７および８９〜９０のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９３）
前記ＧＡＡポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸残基１〜５６を含まない、項目９２に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９４）
前記ＧＡＡポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸残基１〜５７を含まない、項目９２に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９５）
前記成熟ＧＡＡポリペプチドの分子量がおよそ７０〜７６キロダルトンである、項目９２〜９４のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９６）
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、配列番号２２の残基１２２〜７８２または配列番号２２の残基２０４〜７８２から選択されるアミノ酸配列からなる、項目９２〜９５のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９７）
前記薬剤がアミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）ポリペプチドまたはその機能的断片であり、該ＡＧＬポリペプチドまたは断片がアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、項目６８〜７７、８９、および９１のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９８）
前記ＡＧＬポリペプチドが配列番号１９〜２１のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、コンジュゲートがアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、項目９７に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目９９）
（ｉ）項目１〜６７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片および（ｉｉ）該抗体または抗原結合断片に会合した異種薬剤を含むコンジュゲート。
（項目１００）
前記異種薬剤がポリペプチドまたはペプチドである、項目９９に記載のコンジュゲート。
（項目１０１）
前記異種薬剤が核酸または有機小分子である、項目９９に記載のコンジュゲート。
（項目１０２）
前記抗体または抗原結合断片が前記異種薬剤のＮ末端である、項目９９〜１０１のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１０３）
前記抗体または抗原結合断片が前記異種薬剤のＣ末端である、項目９９〜１０１のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１０４）
前記抗体または抗原結合断片および前記異種薬剤がリンカーを介して相互接続されている、項目１０２または１０３に記載のコンジュゲート。
（項目１０５）
前記抗体または抗原結合断片および前記異種薬剤が、リンカーを使用しないで相互接続している、項目１０２または項目１０３に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１０６）
前記抗体または抗原結合断片および前記異種薬剤が化学的にコンジュゲート化している、項目９９〜１０５のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
（項目１０７）
前記抗体または抗原結合断片および前記異種薬剤が融合タンパク質である、項目９９〜１０５のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１０８）
前記異種薬剤がヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害の処置に適切な薬剤である、項目９９〜１０７のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１０９）
前記障害が筋緊張性ジストロフィである、項目１０８に記載のコンジュゲート。
（項目１１０）
前記障害がハンチントン病である、項目１０８に記載のコンジュゲート。
（項目１１１）
前記障害が神経線維腫症である、項目１０８に記載のコンジュゲート。
（項目１１２）
前記異種薬剤が、ＣＵＧ反復に結合し、そして／またはエクソンスプライシングを制御することができるＭＢＮＬ１ポリペプチドまたはその断片である、項目１０８〜１１１のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１１３）
前記異種薬剤が、ＣＵＧ反復に結合し、そして／またはエクソンスプライシングを制御することができる、配列番号１２〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＭＢＮＬ１ポリペプチドまたはその断片である、項目１１２に記載のコンジュゲート。
（項目１１４）
前記異種薬剤が酵素である、項目９９〜１１１のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１１５）
前記酵素が酵素補充療法としての使用に適切である、項目１１４に記載のコンジュゲート。
（項目１１６）
前記酵素補充療法が筋細管筋障害の処置のための治療法である、項目１１５に記載のコンジュゲート。
（項目１１７）
前記異種薬剤がＭＴＭ１タンパク質またはその機能的断片である、項目９９〜１０７および１１４〜１１６のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１１８）
前記ＭＴＭ１タンパク質が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、項目１１７に記載のコンジュゲート。
（項目１１９）
前記異種薬剤が糖原貯蔵障害の処置に適切な薬剤である、項目９９〜１０７のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１２０）
前記糖原貯蔵障害がポンペ病である、項目１１９に記載のコンジュゲート。
（項目１２１）
前記糖原貯蔵障害がフォーブス・コリ病である、項目１１９に記載のコンジュゲート。
（項目１２２）
前記異種薬剤が、成熟ＧＡＡポリペプチドを含む酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドである、項目９９〜１０７および１１９〜１２１のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１２３）
前記ＧＡＡポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸残基１〜５６を含まない、項目１２２に記載のコンジュゲート。
（項目１２４）
前記ＧＡＡポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸残基１〜５７を含まない、項目１２２に記載のコンジュゲート。
（項目１２５）
前記薬剤がアミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）ポリペプチドまたはその機能的断片であり、該ＡＧＬポリペプチドまたは断片がアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、項目９９〜１０７、１１９、および１２１のいずれかに記載のコンジュゲート。
（項目１２６）
前記ＡＧＬポリペプチドが配列番号１９〜２１のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記コンジュゲートがアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、項目１２５に記載のコンジュゲート。
（項目１２７）
項目１〜９８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片をコードする核酸。
（項目１２８）
項目９９〜１２６のいずれかに記載のコンジュゲートをコードする核酸。
（項目１２９）
項目１２７または１２８に記載の核酸を含むベクター。
（項目１３０）
項目１２９に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目１３１）
前記宿主細胞が不死化細胞であるか、または前記ベクターを安定に発現する、項目１３０に記載の宿主細胞。
（項目１３２）
ポリペプチドを産生する方法であって、
項目１３０または１３１に記載の宿主細胞を提供する工程、および
適切な条件下で該宿主細胞を培養して該ポリペプチドを産生させる、培養する工程
を含む方法。
（項目１３３）
ヌクレオチド反復障害の処置を必要とする被験体におけるヌクレオチド反復障害を処置する方法であって、項目８２または８３に記載の抗体または抗原結合断片を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１３４）
前記障害が筋緊張性ジストロフィである、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記障害がハンチントン病である、項目１３３に記載の方法。
（項目１３６）
酵素補充処置を必要とする被験体に酵素補充処置を提供する方法であって、項目８４〜８８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１３７）
糖原貯蔵障害の処置を必要とする被験体における糖原貯蔵障害を処置する方法であって、項目８９〜９８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１３８）
筋細管筋障害の処置を必要とする被験体における筋細管筋障害を処置する方法であって、項目８７または８８に記載の抗体または抗原結合断片を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１３９）
ポンペ病の処置を必要とする被験体におけるポンペ病を処置する方法であって、項目９２〜９６のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１４０）
フォーブス・コリ病の処置を必要とする被験体におけるフォーブス・コリ病を処置する方法であって、項目９７または９８に記載の抗体または抗原結合断片を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１４１）
生理学的に許容され得るキャリア中に製剤化された、項目１〜９８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片あるいは項目９９〜１２６のいずれかに記載のコンジュゲートを含む組成物。
（項目１４２）
前記組成物が発熱物質を含まない、項目１４１に記載の組成物。
（項目１４３）
細胞または組織内に異種薬剤を送達する方法であって、細胞を、項目１〜９８のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片あるいは項目９９〜１２６のいずれかに記載のコンジュゲートと接触させる工程を含む、方法。
（項目１４４）
前記細胞または組織が被験体内に存在し、接触させる工程が、前記抗体または抗原結合断片または前記コンジュゲートを該被験体に投与する工程を含む、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記細胞または組織がｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する、項目１４３に記載の方法。
（項目１４６）
前記細胞は骨格筋細胞であり、前記組織は骨格筋を含む、項目１４３〜１４５のいずれかに記載の方法。
（項目１４７）
前記細胞は心筋細胞であり、前記組織は心筋を含む、項目１４３〜１４５のいずれかに記載の方法。
（項目１４８）
前記細胞は肝細胞であり、前記組織は肝組織を含む、項目１４３〜１４５のいずれかに記載の方法。
（項目１４９）
前記細胞はニューロンであり、前記組織は神経組織を含む、項目１４３〜１４５のいずれかに記載の方法。
（項目１５０）
前記被験体がヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害を有する被験体である、項目１４４または１４６〜１４９に記載の方法。
（項目１５１）
前記抗体または抗原結合断片を前記被験体の細胞内に送達する、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記被験体が、酵素欠乏障害を有し、かつ酵素補充療法を必要とする被験体である、項目１４４または１４６〜１４９に記載の方法。
（項目１５３）
前記抗体または抗原結合断片を前記被験体の細胞内に送達する、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記被験体が、糖原貯蔵障害を有する被験体である、項目１４４または１４６〜１４９に記載の方法。
（項目１５５）
前記抗体または抗原結合断片を前記被験体の細胞内に送達する、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記抗体または抗原結合断片を細胞質内に送達する、項目１５４に記載の方法。
（項目１５７）
ヌクレオチド反復障害の処置を必要とする被験体におけるヌクレオチド反復障害を処置する方法であって、項目１０８〜１１３のいずれかに記載のコンジュゲートを該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１５８）
前記障害が筋緊張性ジストロフィである、項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
前記障害がハンチントン病である、項目１５７に記載の方法。
（項目１６０）
酵素補充処置を必要とする被験体に酵素補充処置を提供する方法であって、項目１１４〜１２６のいずれかに記載のコンジュゲートを該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１６１）
糖原貯蔵障害の処置を必要とする被験体における糖原貯蔵障害を処置する方法であって、項目１１９〜１２６のいずれかに記載のコンジュゲートを該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１６２）
筋細管筋障害の処置を必要とする被験体における筋細管筋障害を処置する方法であって、項目１１７または１１８に記載のコンジュゲートを該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１６３）
ポンペ病の処置を必要とする被験体におけるポンペ病を処置する方法であって、項目１２２〜１２４のいずれかに記載のコンジュゲートを該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１６４）
フォーブス・コリ病の処置を必要とする被験体におけるフォーブス・コリ病を処置する方法であって、項目１２２〜１２６のいずれかに記載のコンジュゲートを該被験体に投与する工程を含む、方法。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】図１は、相互およびマウスの親３Ｅ１０重鎖可変ドメイン（ＭＨ１）（図１の上半分を参照のこと）と比較した第二世代の各ヒト化重鎖可変ドメイン（ＨＨ１、ＨＨ２、およびＨＨ３）の配列アラインメントを提供し、相互およびマウスの親３Ｅ１０軽鎖可変ドメイン（ＭＬ１）と比較した第二世代の各ヒト化軽鎖可変ドメイン（ＨＬ１およびＨＬ２）の配列アラインメントも提供する。Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）またはＩＭＧＴシステム（ＬｅＦｒａｎｃら，２００３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７：５５−７７およびＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴデータベース）に従って決定したＣＤＲに、黒色のバーで下線を引くか（Ｋａｂａｔ）、ダークグレーで強調し（ＩＭＧＴ；カラー図中に青色で示す）、一方、各マウス３Ｅ１０親鎖と比較したヒト化された重鎖または軽鎖の可変ドメイン配列の変化をライトグレーで強調している（カラー図中に黄色で示す）。ヒト化重鎖の折りたたみを改善するために導入されたアミノ酸の変化を太字の小文字で示している（カラー図中に緑色で示す）。示した異なる各抗体鎖のアミノ酸配列についての配列識別子を以下に示す：ＭＬ１＝配列番号７；ＭＨ１＝配列番号９；ＨＨ１＝配列番号３８；ＨＨ２＝配列番号３９；ＨＨ３＝配列番号１０；ＨＬ１＝配列番号４０；ＨＬ２＝配列番号８。

【図2A】図２Ａおよび２Ｂは、表示した重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む全長抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得た代表的なゲルを示す。図２Ａについて、サンプルを非還元条件下で調製し、ウェルあたり１マイクログラムのサンプルをロードした。各サンプルにおいて予想される抗体サイズの単一の主なバンドが認められ、試験したいかなるサンプルにおいてもゲル上部に明らかな凝集物のバンドは認められなかった。図２Ｂについて、サンプルを還元条件下で調製し、ウェルあたり１マイクログラムのサンプルをロードした。各サンプルにおいて重鎖および軽鎖と予想される２つのバンドが認められ、試験したいかなるサンプルにおいてもゲル上部に明らかな凝集物のバンドは認められなかった。図２Ａおよび２Ｂについて、試験したいかなる抗体においてもいかなるタンパク質分解物の明白な兆候を示すバンドは認められなかった。

【図2B】同上

【図3A】３Ａおよび３Ｂは、マウスの親重鎖可変ドメインおよびマウスの親軽鎖可変ドメイン（ＭＨ１／ＭＬ１−図３Ａ）またはヒト化重鎖可変ドメインおよびヒト化軽鎖可変ドメイン（ＨＨ１／ＨＬ１−図３Ｂ）を含む全長抗体の代表的なＳＥ−ＨＰＬＣチャートを示す。

【図3B】同上

【図4】図４は、表示の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの組み合わせを含む濃縮前および濃縮後の抗体サンプルの性質を分析する試験の結果のまとめを提供する。以下の略語を使用する：Ｏｐａｌ＝乳白光；ＶＰ＝視覚可能な粒子；ＮＣ＝変化なし；ＮＢＴＧ。

【発明を実施するための形態】

【0052】

開示の詳細な説明
本開示は、抗体および抗原結合断片を提供する。一定の実施形態では、これらの抗体および抗原結合断片をヒト化する（例えば、少なくとも１つのヒト化ＶＨまたはヒト化ＶＬを含む）。一定の実施形態では、これらの抗体および抗原結合断片は、ＤＮＡに結合し、そして／またはＥＮＴ輸送体（例えば、ＥＮＴ２輸送体および／またはＥＮＴ３輸送体）などを介して細胞膜を透過する。換言すれば、いくつかの実施形態では、本開示の抗体および抗原結合断片は、本明細書中に記載の３Ｅ１０親抗体と一致する性質を有する。一定の実施形態では、本開示の抗体および抗原結合断片は、現在の標準的プロトコールを使用したＳＰＲまたはＱＣＭによって測定した場合に１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、または３０ｎＭ未満のＫ_ＤでＤＮＡ（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ）に結合する。一定の実施形態では、本開示の抗体および抗原結合断片は、現在の標準的プロトコールを使用したＳＰＲまたはＱＣＭによって測定した場合に２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＫ_ＤでＤＮＡに結合する。一定の実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片は、米国特許第７，１８９，３９６号に開示のようにＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９を有するハイブリドーマによって産生された３Ｅ１０とＤＮＡへの結合を競合する。一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、マウス３Ｅ１０と比較して異なるＫａｂａｔ ＣＤＲを含む（例えば、マウス３Ｅ１０と比較して１つまたは複数のＣＤＲの変化（ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ１、および／またはＶＬ ＣＤＲ２のうちの１つまたは複数の相違など）を含む）。
Ｉ．内在化部分

【0053】

本明細書中で使用する場合、用語「内在化部分」は、ポリペプチド部分が標的組織または細胞型に内在化されるように標的組織または細胞型と相互作用することができる可能であるポリペプチド部分をいう。好ましい実施形態では、本開示で用いる内在化部分は、ヒト化ＶＨおよび／またはヒト化ＶＬ（例えば、ヒト化Ｖ_Ｈドメインおよび／またはヒト化Ｖ_Ｌドメイン）を含む抗体および抗原結合断片などの本開示の抗体および抗原結合断片である。

【0054】

本明細書中で使用する場合、「開示の抗体または抗原結合断片」は、本明細書中に提供した１つまたは複数の抗体および抗原結合断片のいずれか（例えば、親３Ｅ１０抗体に基づき、一定の実施形態では、少なくとも１つのヒト化Ｖ_Ｈドメインおよび／またはヒト化Ｖ_Ｌドメインを含む抗体および抗原結合断片）をいう。用語「開示の抗体」は、マウス重鎖およびマウス軽鎖の両方を含む親のマウス抗体が含まれることを意図しない。本開示の抗体および抗原結合断片は、重鎖可変ドメインを含む重鎖および軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含む。Ｖ_Ｈドメインは、３つのＣＤＲ（ＫａｂａｔシステムまたはＩＭＧＴシステムによって定義または同定された本明細書中に提供の任意のＣＤＲなど）を含む。これらのＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域（ＦＲ）と共に散在し、Ｖ_Ｈドメインを共有する。同様に、ＶＬは３つのＣＤＲ（ＫａｂａｔシステムまたはＩＭＧＴシステムによって定義された本明細書中に提供の任意のＣＤＲなど）を含む。これらのＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域（ＦＲ）と共に散在し、Ｖ_Ｌドメインを共有する。ＦＲ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４など）を、ＫａｂａｔシステムまたはＩＭＧＴシステムによって同様に定義または同定することができる。本出願を通して、ＣＤＲが存在し、ＫａｂａｔシステムまたはＩＭＧＴシステムによって同定または定義される場合、ＣＤＲがこれらのシステムに従うことを意味する（例えば、Ｋａｂａｔ ＣＤＲまたはＩＭＧＴ ＣＤＲ）。これらの用語のいずれかを、Ｋａｂａｔ ＣＤＲまたはＩＭＧＴ ＣＤＲのいずれについて言及しているかどうかを示すために使用することができる。

【0055】

本開示は、抗体または抗原結合断片が本明細書中に提供したＶ_Ｈドメインと本明細書中に提供したＶ_Ｌドメインとの任意の組み合わせを含み得ることを意図する。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインおよび／またはＶ_Ｌドメインの少なくとも１つがヒト化されている（集合的に、開示の抗体または抗原結合断片）。キメラ抗体も含まれる。本開示の任意の抗体または抗原結合断片を、単独、または、任意選択的に異種薬剤に会合したコンジュゲートとして提供することができる。異種薬剤の非限定的な例を本明細書中に提供し、この例には、ポリペプチド、ペプチド、小分子（例えば、化学療法薬小分子）、またはポリヌクレオチドが含まれ得る。コンジュゲートは、異種薬剤に会合した抗体または抗原結合断片をいうことができる。

【0056】

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、単離および／または精製されている。本明細書中に記載の任意の抗体または抗原結合断片（単離形態または精製形態で提供されるものが含まれる）を、１つまたは複数の薬学的および／または生理学的に許容され得るキャリアおよび／または賦形剤を使用して製剤化された抗体または抗原結合断片を含む組成物などの組成物として提供することができる。本明細書中に記載の任意の抗体または抗原結合断片（組成物（例えば、薬学的組成物）が含まれる）を、本明細書中に記載の任意の方法で使用することができ、任意選択的に異種薬剤とコンジュゲート化（例えば、相互接続；会合）することができる。かかるコンジュゲートを、組成物として同様に提供することができ、本明細書中に記載の任意の方法で使用することができる。
１つの実施形態では、本開示は、ヒト化抗体または抗原結合断片を含む抗体または抗原結合断片であって、ヒト化抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインはヒト化されており、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み；
ＶＬはヒト化されており、以下：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み；
これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っており、ヒト化抗体または抗原結合断片のＤＮＡ結合および／または細胞透過は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むマウス３Ｅ１０抗体のＤＮＡ結合および／または細胞透過と比較して増加している、抗体または抗原結合断片を提供する。一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片をマウス抗体または別のヒト化抗体と比較する場合、適切な比較は、同一の構造の２つのタンパク質間の比較である（例えば、ある全長抗体と別の全長抗体との比較またはあるＦａｂの別のＦａｂとの比較）。

【0057】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または抗体断片のＮ結合型グリコシル化を減少させるためにＶＨドメインまたはＶＬドメイン中のアスパラギンを別のアミノ酸残基に変異させる。このヒト化抗体または抗体断片は、マウス親抗体（具体的には、重鎖および軽鎖を含み、軽鎖が配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬを含み、重鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨを含むマウス３Ｅ１０抗体）に基づく。好ましい実施形態では、内在化部分および断片は、少なくともマウス３Ｅ１０抗体に関連する細胞透過性に関連する（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超えて保持される）。一定の実施形態では、ヒト化抗体または抗体断片は、１つまたは複数の好ましい細胞透過特性（改良された透過効率など）を有する。

【0058】

本明細書中で使用する場合、ヒト化抗体部分の「断片」もしくは「抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語には、少なくともマウス３Ｅ１０抗体に関連する細胞透過性および／またはＤＮＡ結合性を保持するヒト化内在化部分の任意の断片が含まれる。本出願では、用語「断片」および「抗原結合断片」を、互換的に使用する。例示的な抗体断片には、ｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片（例えば、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２）などが含まれる。

【0059】

いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分（例えば、開示のヒト化抗体および抗原結合断片）を、任意の異種薬剤に直接融合しない。しかし、かかる実施形態では、以下により詳細に記載するように、内在化部分を、さらに翻訳後に修飾し（例えば、グリコシル化し）、そして／または組成物の一部として提供することができる。

【0060】

他の実施形態では、ヒト化内在化部分（例えば、ヒト化抗体または抗体結合断片などの開示の抗体または抗原結合断片）を、異種薬剤に融合する。いくつかの実施形態では、内在化部分は、細胞内に異種薬剤を送達する（すなわち、所望の細胞を透過し；細胞膜を横切って輸送し；細胞膜を通過して少なくとも細胞質に送達する）。一定の実施形態では、本開示は、筋肉細胞（例えば、骨格筋）および一定の他の細胞型内への異種薬剤の送達を促進する内在化部分に関する。この部分は、細胞内へのコンジュゲートの侵入を促進する。マウスの親抗体と同様に、本開示のヒト化抗体および抗原結合断片は、ＥＮＴ輸送体（ＥＮＴ２輸送体および／またはＥＮＴ３輸送体など）を介した細胞内への侵入を測定する。理論に拘束されないが、ＥＮＴ２は、一定の細胞型（筋肉細胞（骨格筋細胞および心筋細胞）、神経細胞、肝臓細胞、および／または腫瘍細胞が含まれる）で優先的に発現される。したがって、コンジュゲート（例えば、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片が異種薬剤にコンジュゲート化されたコンジュゲート）は細胞内に送達されるが、一般に遍在性に送達されない。むしろ、コンジュゲートを、特定の組織（骨格筋、心筋、横隔膜、ならびにＥＮＴ２および／またはＥＮＴ３発現癌細胞が含まれる）でいくらか富化されるレベルで送達することができる。

【0061】

一定の実施形態では、内在化部分は、ポリヌクレオチドに結合することが可能である（例えば、本開示の抗体の標的／抗原はＤＮＡである）。これは、ＤＮＡに結合する（例えば、ＤＮＡに特異的に結合する）ことが公知の３Ｅ１０抗体の性質と一致する。一定の実施形態では、内在化部分はＤＮＡに結合することが可能である。一定の実施形態では、内在化部分は、１００ｎＭ未満のＫ_ＤでＤＮＡに結合することが可能である。一定の実施形態では、内在化部分は、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、またはさらに３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、またはさらに１ｎＭ未満のＫ_ＤでＤＮＡ（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは平滑末端二本鎖ＤＮＡ）に結合することが可能である。Ｋ_Ｄを、現在標準的な方法にしたがって表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を使用するか、ＥＬＩＳＡによって測定することができる。例として、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体または抗体断片は、１００ｎＭ未満のＫ_ＤでＤＮＡに特異的に結合し、これは抗ＤＮＡ抗体の一例である。一定の実施形態では、内在化部分は二本鎖平滑末端ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ結合活性を、ＥＬＩＳＡ、ＱＣＭ、またはＢｉａｃｏｒｅなどによる平滑末端ＤＮＡを使用した結合アッセイ（例えば、Ｘｕら（２００９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８：５６８−５７７；Ｈａｎｓｅｎら，（２０１２）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄ ４：ＤＯＩ １０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００４３８５を参照のこと）で証明するか、証明することができる。一定の実施形態では、前述の抗体または抗体断片（抗原結合断片を含む抗体断片など）のＫ_Ｄを、二本鎖平滑末端ＤＮＡ基質（Ｘｕらに記載のＤＮＡ基質（例えば、２本の鎖を含み、そのうちの１本が以下の配列からなるＤＮＡ：５’−ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＴＧＧ ＧＣＡ ＡＡＧ ＡＴＧ ＴＣＣ−３’（配列番号６３））など）に対して評価する。一定の実施形態では、内在化部分は抗ＤＮＡ抗体である。したがって、一定の実施形態では、単独または異種薬剤と会合させて使用するための内在化部分（例えば、抗体または抗原結合断片）は、細胞膜を通過して細胞質および／または核内に到達することができる抗体または抗体断片を含み、ＤＮＡに結合することが可能である。一定の実施形態では、本開示の抗体および抗原結合断片（ヒト化抗体および抗原結合断片など）は、上記のＶＨドメインおよびＶＬドメインを有するマウスの親３Ｅ１０抗体に基づく。

【0062】

好ましくは、ヒト化抗体は、マウスの親抗体（存在する場合にマウス定常ドメインを含むマウス親抗体が含まれる）と比較して同一の、実質的に同一の、またはさらに改良された細胞透過特性および／またはＤＮＡ結合特性を有する。

【0063】

一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、ＩＭＧＴシステムを使用して定義した場合に、マウスの親抗体（例えば、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨを含む重鎖および配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを含む軽鎖を含む抗体）と同一のＣＤＲを有する。一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、マウスの親抗体と異なる重鎖および／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを有する（例えば、Ｋａｂａｔに従うとＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ１が異なる）。いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片は、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含み、ＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っている。

【0064】

いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片は、以下：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３（ＣＤＲはＫａｂａｔに従っている）；ならびに
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３（ＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っている）を含むＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片は、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３（ＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っている）、ならびに
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３（ＣＤＲはＫａｂａｔに従っている）を含むＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含む。
一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３（ＣＤＲはＫａｂａｔシステムに従っている）を含むＶ_Ｈドメイン、ならびに以下：
配列番号３５または５０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３（ＣＤＲはＫａｂａｔに従っている）を含むＶ_Ｌドメインを含む。

【0066】

本出願を通して詳述するように、本開示の抗体または抗原結合断片（ヒト化抗体または抗原結合断片など）を、マウスの親抗体と比較することができる。さらにまたはあるいは、本開示の抗体（またはその抗原結合断片）を、代理抗体および断片（例えば、同一のマウス親に基づいた他のヒト化抗体）と比較することができる。かかるシナリオでは、比較すると、代理抗体または抗原結合断片は、前述の６つのＩＭＧＴ ＣＤＲまたはＫａｂａｔ ＣＤＲを有するが、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片と比較して１つまたは複数のフレームワーク領域が変化しているであろう。活性を比較した場合、ＥＮＴ２および／またはＥＮＴ３を介して骨格筋細胞などの細胞を透過する能力および効率を評価することができる。活性は、活性がマウスの親抗体のおよそ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約９５％を超える場合、同等または実質的に同一であると見なされるであろう。マウスの親抗体と比較して、特徴が少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％向上する場合、活性が改良されたと見なす（例えば、マウスの親抗体または代理ヒト化抗体の活性のおよそ１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１５０％、または１５０％超）。一定の実施形態では、別の抗体と比較して、特徴が少なくとも２倍向上した場合、活性が改良されたと見なす。他の実施形態では、特徴が少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、または１０倍向上した場合、活性が改良されたと見なす。

【0067】

理論に拘束されないが、本明細書中に記載の内在化部分は、一定の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数のいずれかが可能である：ａ）内在化部分（例えば、本明細書中に記載の任意の異種薬剤）にコンジュゲート化した薬剤の筋肉細胞（例えば、心筋細胞または骨格筋細胞）、肝臓細胞、ニューロン、膠細胞、および／または腫瘍細胞もしくは癌性細胞へのターゲティング（例えば、送達）、ｂ）ターゲティングされた腫瘍細胞または癌細胞の成長、増殖、サイズ、生存、または移動の死滅および／または減少、ｃ）腫瘍細胞または癌細胞に対する内在化部分にコンジュゲート化した任意の薬剤（例えば、本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬポリペプチドまたはＭＢＮＬポリペプチドに付着した化学療法薬）の効果を増加させること、および／またはｄ）腫瘍細胞または癌細胞に対する任意の個別に施した薬剤または治療（例えば、化学療法薬または放射線療法）の効果を増加せること。一定の実施形態では、内在化部分を、異種治療薬の非存在下で（例えば、異種薬剤に相互接続していない；治療薬に相互接続していない）細胞に投与／送達する。例えば、一定の実施形態では、内在化部分を、異種治療薬の非存在下で（例えば、癌を処置するために）腫瘍内へ送達するために細胞に投与する。

【0068】

一部の実施形態において、抗体またはヒト化抗体は、高原結合断片を含む抗体断片、例えば、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、シングルドメイン抗体、ならびに前述のものの多価バージョンを限定ではないが含む、抗体断片、それらの誘導体または類似体；Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、シングルドメイン抗体、ラクダ化抗体および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、ヒト抗体および抗体断片、ならびに前述のものの多価バージョンを限定ではないが含む、多価内在化部分；単一特異性または二重特異性抗体、例えばジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ）２断片）、典型的に共有結合で連結されたまたは別様に安定化された（すなわち、ロイシンジッパーもしくはヘリックス安定化された）ｓｃＦｖ断片であるダイアボディー、トリボディーまたはテトラボディーを限定ではないが含む、多価内在化部分；所望の標的分子と自然に相互作用する受容体分子を含むことがある。一定の実施形態では、抗原結合断片はｓｃＦｖであり、ペプチドリンカーはＶＨドメインとＶＬドメインとを相互接続する。一部の実施形態において、抗体またはそれらの変異体は、いくつかの異なる抗体サブクラス定常ドメインのハイブリッド（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の任意の組み合わせ）である定常領域を含むこともある。

【0069】

一定の実施形態では、内在化部分は、抗原結合断片を含む抗体断片である。換言すれば、一定の実施形態では、内在化部分は、全長抗体ではないが、抗原結合断片を含むその断片である。一定の実施形態では、内在化部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦａｂ２’である。一定の実施形態では、内在化部分は、本明細書中に記載のように、任意選択的にヒンジドメインおよび／またはＣＨ２ドメインなどにおけるエフェクター機能を低下させるように置換されたＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３の各ドメインを含む重鎖を含む全長抗体である。一定の実施形態では、重鎖は、ＶＨドメイン、ならびにＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３の各ドメインを含む定常ドメインを含む。一定の実施形態では、重鎖は、ＶＨドメイン、ならびにＣＨ１ドメインおよび任意選択的にヒンジ上部を含む定常ドメインを含む。ヒンジ上部は、例えば、ヒンジ領域の１、２、３、または４個のアミノ酸残基を含み得る。一定の実施形態では、ヒンジ上部は、システイン残基を含まない。一定の実施形態では、ヒンジ上部は、未変性のヒンジ配列中に存在するシステインのＮ末端側に１つまたは複数の保存的残基を含む。一定の実施形態では、重鎖は、ＣＨ領域ならびにＣＨ１ドメインおよびヒンジを含む定常ドメインを含む。一定の実施形態では、ヒンジ（全長抗体または抗体断片のいずれかの一部として存在する）は、Ｋａｂａｔ２２２位に対応する位置でのＣからＳへの置換を含む（例えば、変異がＫａｂａｔ２２２位に対応する位置に存在するヒンジ中のＣ２２２Ｓ）。換言すれば、一定の実施形態では、内在化部分は、ヒンジドメイン中のＫａｂａｔ２２２に対応する位置にシステイン残基よりもむしろセリン残基を含む。一定の実施形態では、重鎖は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および、任意選択的にＣＨ３ドメインを含む定常ドメインを含む。一定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ２９７位に対応する位置にＮからＱへの置換を含む（例えば、変異がＫａｂａｔ２９７位に対応する位置に存在するＣＨ２ドメイン中のＮ２９７Ｑ）。換言すれば、一定の実施形態では、内在化部分は、Ｋａｂａｔ２９７位に対応する位置にアスパラギンよりもむしろグルタミンを含む。

【0070】

一定の実施形態では、本明細書中に開示の抗体または抗原結合断片は、重鎖定常ドメインのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ならびに軽鎖定常ドメインを含む全長抗体である。一定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の各ドメインのうちの１つまたは複数を、任意選択的にヒンジと共に含む。

【0071】

モノクローナル抗体３Ｅ１０は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９で永久寄託されているハイブリドーマ３Ｅ１０によって生産することができ、米国特許第７，１８９，３９６号明細書に開示されている。この抗体はＤＮＡに結合することが示されている。加えて、またはあるいは、前記３Ｅ１０抗体は、その３Ｅ１０抗体の重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞において発現させることによって生産することができる。用語「３Ｅ１０抗体」または「モノクローナル抗体３Ｅ１０」はまた、抗体を産生するために使用した方法と無関係に、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含むマウス抗体（または抗原結合断片）をいうために本明細書中で使用する。したがって、本出願に関連して、そうではないと述べない限り、３Ｅ１０抗体は、ハイブリドーマの配列を有する抗体、または配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン（これは、本明細書に記載され、そして以前に細胞侵入およびＤＮＡ結合活性を保持するとして実証されたＡＴＣＣに寄託されている３Ｅ１０抗体のものに比べて１つのアミノ酸置換を有する）と、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗体を指すことになる。しかし、本開示の文脈では、ヒト化の基礎として使用した親マウス抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む抗体であった。本開示は、一定の実施形態では、マウス３Ｅ１０に基づいたヒト化抗体を提供する。

【0072】

同様に、３Ｅ１０の変異体または抗原結合断片に言及するとき、かかる用語は、当該抗体が生産される様式に関係なく用いている。現在のところ、３Ｅ１０は一般に組換えによって産生される。

【0073】

前記ヒト化内在化部分は、ｍＡｂ ３Ｅ１０の変異体、例えば、ｍＡｂ ３Ｅ１０と同じ細胞透過特性を保持する３Ｅ１０の変異体、ならびにその有用性を改善するような突然変異によって修飾された変異体（例えば、特異的細胞タイプに対する改善された標的化能力、細胞膜に対する改善された透過能力、細胞ＤＮＡに対する改善された局在化能力、適便なコンジュゲート化した部位など）から誘導されることもある。かかる変異体は、１つ以上の保存的置換が抗体の重鎖、軽鎖および／または定常領域（単数または複数）に導入されている変異体を含む。一部の実施形態において、前記軽鎖または重鎖は、Ｎ末端またはＣ末端が修飾されていることがある。さらに、抗体または抗体断片を、異種薬剤へのコンジュゲート化を容易にするように改変することができる。同様に、変異体についての上述の説明は、抗原結合断片にもあてはまる。これらのいずれの抗体、変異体または断片も、宿主細胞でのヌクレオチド配列（単数または複数）の発現によって組換えにより作製され得る。かかる内在化部分は、ＥＮＴ２および／またはＥＮＴ３などのＥＮＴ輸送体を介して細胞を通過し、そして／または３Ｅ１０と同一のエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの標的）に結合することができる。

【0074】

モノクローナル抗体３Ｅ１０は、細胞を透過して、タンパク質および核酸を標的組織の細胞質または核空間に送達することが証明されている（Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９９８ Ｏｃｔ；１１（５）：５３９−４６；Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｍａｒ；３９（１３）：７８３−９；Ｚａｃｋ ＤＪら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６ Ｓｅｐ １；１５７（５）：２０８２−８）。３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ断片は、原モノクローナル抗体の細胞透過能すべてを有し、タンパク質、例えばカタラーゼ、ジストロフィン、ＨＳＰ７０およびｐ５３は、Ｆｖ３Ｅ１０とコンジュゲート化した後にそれらの活性を保持する（Ｈａｎｓｅｎ ＪＥら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２００６ Ｍａｙ ９；１０８８（１）：１８７−９６；Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００３ Ｊｕｎ １０；１９５（２）：２１１−９；Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．２００５ Ｆｅｂ；１３（２）：８１−７；Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｊｕｎ １；１６４（１１）：６０２０−６；Ｈａｎｓｅｎ ＪＥら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７ Ｊｕｌ ２０；２８２（２９）：２０７９０−３）。さらに、上述のように、本明細書中の３Ｅ１０親抗体の一部として使用されるＶＨ中の１つのアミノ酸置換は、以前と同様に、ＤＮＡに結合して細胞を透過することを示している。３Ｅ１０は、すべての哺乳動物に存在する抗体足場；マウス可変重鎖および可変κ軽鎖に基づき構築される。３Ｅ１０は、特に骨格筋および癌細胞に多く含まれているＥＮＴ２ヌクレオチドトランスポーターによって細胞に入り、またインビボ研究により３Ｅ１０は非毒性であることが証明されている（Ｗｅｉｓｂａｒｔ ＲＨら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｍａｒ；３９（１３）：７８３−９；Ｐｅｎｎｙｃｏｏｋｅ Ｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００１ Ｊａｎ ２６；２８０（３）：９５１−９）。３Ｅ１０は、ＥＮＴ３を介して膜を通過することもできる。

【0075】

前記ヒト化内在化部分は、ｍＡｂ ３Ｅ１０の突然変異体、例えば、ｍＡｂ ３Ｅ１０と同じまたは実質的に同じ細胞透過特性を保持する３Ｅ１０の変異体、ならびにその有用性を改善するような突然変異によって修飾された変異体（例えば、特異的細胞タイプに対する改善された標的化能力、細胞膜に対する改善された透過能力、細胞ＤＮＡに対する改善された局在化能力、改善された結合親和性など）から誘導されることもある。かかる突然変異体は、１つ以上の保存的置換が重鎖または軽鎖に導入される変異体を含む。ｍＡｂ ３Ｅ１０の非常に多くの変異体が、例えば、米国特許第７，１８９，３９６号明細書および国際公開第２００８／０９１９１１号パンフレットにおいて特性評価されており、前記特許文献の教示は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。本明細書中に提供した例では、親のマウス３Ｅ１０は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0076】

一定の実施形態では、内在化部分は、抗原結合断片（ヒト化単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）など）である。他の実施形態では、ヒト化抗体はＦａｂ’断片である。

【0077】

いくつかの実施形態では、内在化部分は、免疫グロブリン重鎖定常領域またはその断片を含む抗体または抗体断片である。公知であるように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４または５つのドメインを含む。これらのドメインは、次のように順次名づけられる：Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３（−Ｃ_Ｈ４）。前記重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラス間で交差相同性を有し、例えば、ＩｇＧのＣ_Ｈ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣ_Ｈ２ドメインと相同であり、かつＩｇＭおよびＩｇＥのＣ_Ｈ３ドメインと相同である。本明細書中で使用する場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域の組み合わせを含むことがある。１つの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも１つの免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠く。１つの実施形態において、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。免疫グロブリンの他のクラス、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を用いてもよい。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号明細書において詳細に論じられている。特定の結果を達成するための、ある一定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当該技術分野における技術レベルの範囲内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部は、ヒンジドメインの少なくとも一部、および好ましくはＦｃγのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのいずれかの相同ドメインの少なくとも一部を含み得る。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が本開示の実施で有用であり得ることが意図される。一定の実施形態では、定常領域ドメインはヒトである。

【0078】

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ハイブリッド重鎖定常領域を含む（すなわち、抗体または抗原結合断片は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびＣＨ４ドメインから選択される複数の重鎖定常領域ドメインを含み；抗体または抗原結合断片中の定常領域ドメインの少なくとも１つは抗体または抗原結合断片中の別のドメインのクラスまたはサブクラスと異なる免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスの定常領域ドメインである）。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片中の定常領域ドメインの少なくとも１つはＩｇＧ定常領域ドメインであり、抗体または抗原結合断片中の定常領域ドメインの少なくとも１つは異なる免疫グロブリンクラスの定常領域ドメイン（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの各定常領域ドメイン）である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片中の定常領域ドメインの少なくとも１つはＩｇＧ１定常領域ドメインであり、抗体または抗原結合断片中の定常領域ドメインの少なくとも１つは、異なるＩｇＧサブクラス（すなわち、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）の定常領域ドメインである。適切な定常領域は、ヒト定常領域であり得るか、別の種（例えば、マウス）に由来し得る。本開示のヒト化抗体および抗原結合断片は、定常領域の配列（重鎖または軽鎖）が、存在する場合、ヒト免疫グロブリンの定常領域の配列に対応するか、別の種の定常領域の配列に対応するかと無関係にヒト化されたと見なされる。

【0079】

ヒト化内在化部分または断片またはバリアントの細胞透過能を、異種薬剤の送達を促進するために利用することができる。３Ｅ１０由来のヒト化部分は、筋肉細胞（骨格筋細胞および心筋細胞が含まれる）および横隔膜への送達を有効に促進する能力が証明されているので、この用途のために特に十分に適合する。したがって、ヒト化内在化部分は、被験体（ヒト患者またはモデル生物など）の細胞内への有効な送達の促進に特に有用である。一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、異種薬剤（異種タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子など）へのさらなるコンジュゲート化のための中間体として有用である。

【0080】

抗体またはその断片（例えば、Ｖ_Ｈ−リンカー−Ｖ_ＬもしくはＶ_Ｌ−リンカー−Ｖ_Ｈによってコードされた一本鎖Ｆｖ断片）の調製は、当該技術分野において周知である。特に、ｍＡｂ ３Ｅ１０抗体断片の組換え生産方法は、国際公開第２００８／０９１９１１号に記載されている。さらに、抗体またはＦａｂのｓｃＦｖ断片の生成方法は、当該技術分野において周知である。抗体または抗体断片を組換え生産する場合、リンカーを使用することがある。例えば、柔軟なタンパク質領域における典型的な表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒが挙げられる。１つの例示的リンカーを配列番号３０または３１に提供する。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の並べ替えは、リンカー配列の基準（例えば、柔軟性で最小の疎水性または荷電性）を満たすと予想される。もう１つの例示的リンカーは、式（Ｇ_４Ｓ）ｎ（この式中のｎは、１〜１０の整数、例えば２、３または４である）のものである。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもリンカー配列に使用することができる。

【0081】

例えば、ｓｃＦｖの一部を相互接続するリンカーに加えて、本開示は、例えば、異種薬剤をコンジュゲートの抗体部分に相互接続するか、異種薬剤部分をコンジュゲートの抗体部分に相互接続するためのさらなるリンカーの使用を意図する。

【0082】

モノクローナル抗体を産生するための任意の数の周知の方法によって抗体の調製を遂行してもよい。これらの方法は、典型的に、動物、典型的にはマウスを所望の免疫原（例えば、所望の標的分子またはその断片）で免疫するステップを含む。マウスを免疫し、好ましくは所望の免疫原（単数または複数）で１回以上追加免疫したら、周知の方法に従ってモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマを調製し、スクリーニングしてよい（例えば、モノクローナル抗体生産の総括（この部分は参照により本明細書に援用されている）については、Ｋｕｂｙ、Ｊａｎｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、ｐｐ．１３１−１３９、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．（１９９７）を参照されたい）。過去数十年の間に、抗体生産は極めて堅固なものになってきた。抗体認識法とファージディスプレイ技術を併用するインビトロ法は、極めて特異的な結合能を有する抗体の増幅および選択を可能にする。例えば、参照により本明細書に援用されているＨｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．ら、「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１１：４４５−４４９を参照されたい。これらの方法は、典型的に、旧来のモノクローナル抗体調製方法によるハイブリドーマの調製よりはるかに扱いやすい。１つの実施形態では、ファージディスプレイ技術を用いて、所望の標的分子に対して特異的な内在化部分を産生することがある。選択された免疫原に対する免疫応答を動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギまたは他の動物）において惹起し、その応答を追加刺激して免疫原特異的Ｂ細胞集団を増やす。メッセンジャーＲＮＡをそれらのＢ細胞から、または場合によりモノクローナルもしくはポリクローナルハイブリドーマ集団から単離する。ポリ−Ａプライマーを使用するか、または典型的には所望のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖に隣接した配列に特異的な、マウス免疫グロブリン特異的プライマー（単数もしくは複数）を使用して、公知の方法によりｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得る。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ特異的プライマーセットを典型的に使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって所望のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖を増幅し、リンカーによって隔てて互いにライゲートする。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ特異的プライマーセットは、例えばカリフォルニア州ラホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．から、市販されている。（ｓｃＦｖ断片をコードする）組み立てられたＶ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ産物をＰＣＲによって選択し、増幅する。制限部位を含むプライマーを用いるＰＣＲによってそのＶ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ産物の末端に制限部位を導入し、ファージディスプレイに適する発現ベクター（典型的にはプラスミド）にそのｓｃＦｖ断片を挿入する。Ｆａｂ’断片などの他の断片をファージ粒子上での表面発現のためにファージディスプレイベクターにクローニングしてもよい。前記ファージは、ラムダなどの任意のファージであってよいが、典型的には糸状ファージ、例えば、ｆｄおよびＭ１３、典型的にはＭ１３である。

【0083】

ある一定の実施形態では、抗体または抗体断片を宿主細胞において組換えにより作製する。言い換えると、抗体の配列が（例えば、上で説明した方法を用いて）判ったら、標準的な技術を用いてその抗体を組換えにより作製することができる。

【0084】

ある一定の実施形態では、前記ヒト化内在化部分を、プロテアーゼによる切断に対してより耐性にするように修飾することがある。例えば、（Ｌ）立体配置の天然に存在するアミノ酸の１つ以上をＤ−アミノ酸で置換することによって、ポリペプチドを含む内在化部分の安定性を増加させてもよい。様々な実施形態において、内在化部分のアミノ酸残基の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、５０％、８０％、９０％または１００％は、Ｄ立体配置のものであってよい。Ｌアミノ酸からＤアミノ酸への切り換えは、消化管内で見いだされる多くの遍在ペプチダーゼの消化能を中和する。あるいは、ペプチド結合を含む内在化部分の向上した安定性を、旧来のペプチド結合の修飾の導入によって実現してもよい。例えば、ポリペプチド主鎖内へのシクロ環の導入は、胃または他の消化器官内および血清中のポリペプチドを消化することが公知の多くのタンパク質分解酵素の影響を回避するために向上した安定性をもたらすことがある。さらに他の実施形態では、内在化部分のアミノ酸間に１つ以上の右旋性アミノ酸（例えば、右旋性フェニルアラニンまたは右旋性トリプトファン）を挿入することによって内在化部分の向上した安定性を実現することもある。例示的実施形態において、かかる修飾は、所望の標的分子との相互作用の活性または特異性に影響を及ぼすことなく、内在化部分のプロテアーゼ耐性を増加させる。

【0085】

「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣ_Ｈ１および可変領域から構成される。一般に、Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆａｂは、任意選択的に、ヒンジ上部などのヒンジの一部を含み得る。

【0086】

「Ｆａｂ’断片」は、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間により多くの定常領域を含む１つの軽鎖および１つの重鎖を含み、その結果、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成してＦ（ａｂ’）_２分子を形成することができる。

【0087】

「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に定常領域の一部を含む２つの軽鎖および２つの重鎖を含み、その結果、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。

【0088】

未変性抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合性のジスルフィド結合によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。それぞれの重鎖および軽鎖はまた、間隔が規則的な鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメイン（ＣＨ）が続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他方の端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと並列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列する。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてλ鎖またはκ鎖のいずれかに分類される。κ軽鎖の可変ドメインを、本明細書中でＶＫと表示することもできる。

【0089】

本開示の抗体には、全長抗体またはインタクトな抗体、抗体断片、未変性配列の抗体またはアミノ酸バリアント、ヒト抗体、ヒト化抗体（キメラ抗体の形態）、翻訳後修飾された抗体、キメラ抗体、免疫コンジュゲート、およびその機能的断片が含まれる。所望のエフェクター機能または血清半減期を得るために、抗体のＦｃ領域を改変することができる。
抗体の調製

【0090】

天然に存在する抗体の構造単位は、典型的には、四量体を含む。かかる各四量体は、典型的には、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの全長「軽」鎖（典型的には、分子量約２５ｋＤａ）および１つの全長「重」鎖（典型的には分子量約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、典型的には、典型的に抗原認識を担う約１００〜１１０個または複数のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能を担う定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、典型的には、κ鎖およびλ軽鎖に分類される。重鎖は、典型的には、μ、δ、γ、α、またはεに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、いくつかのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれるが、これらに限定されない）を有する。ＩｇＭは、サブクラス（ＩｇＭ１およびＩｇＭ２が含まれるが、これらに限定されない）を有する。ＩｇＡも同様にサブクラス（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２が含まれるが、これらに限定されない）に分類される。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．，（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．），１９８９，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（全ての目的のためにその全体が参考として組み込まれる）を参照のこと。典型的には、各軽鎖／重鎖対の可変領域を組み合わせて抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片は、以下の定常ドメインスキームを含む：ＩｇＧ２ａ ＣＨ１−ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３。他の適切な組み合わせも意図される。他の実施形態では、抗体は、全長抗体を含み、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３は、同一の定常ドメインサブクラス（例えば、ＩｇＧ１）に由来する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、免疫グロブリンの定常ドメインの一部を含む抗原結合断片を含む（例えば、以下の定常ドメインスキーム：ＩｇＧ２ａ ＣＨ１−ＩｇＧ１ヒンジ上部）。いくつかの実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片は、κ定常ドメイン（例えば、配列番号６０）を含む。

【0091】

重鎖および軽鎖の各々の可変領域は、典型的には、同一の一般的構造を示し、この構造は、３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲと呼ばれる）によって接合された４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。各対の２本の鎖由来のＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列され、この整列によって特異的標的（例えば、抗原、本開示の文脈におけるＤＮＡ）に結合することが可能である。Ｎ末端からＣ末端の方向で、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、典型的には、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の各ドメインを含む。アミノ酸の各ドメイン（ＦＲまたはＣＤＲ）への割り当ては、典型的には、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）の定義に従う。一定の実施形態では、特定の抗体（本明細書中に提供した抗体など）のＣＤＲは、このＫａｂａｔシステムによって定義されたＣＤＲである（例えば、抗体または抗原結合断片について言及したＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して同定される）。同様に、一定の実施形態では、特にＣＤＲがＫａｂａｔシステムによって定義または同定される場合、ＦＲ領域も、Ｋａｂａｔシステムを使用して定義および／または同定される。しかし、ＣＤＲ領域およびＦＲ領域の代替的な同定システム（ＩＭＧＴシステム（本明細書中に記載）が含まれる）も利用可能である。一定の実施形態では、特定の抗体（本明細書中に提供した抗体など）のＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムによって定義されたＣＤＲである（例えば、抗体または抗原結合断片のＣＤＲを、ＩＭＧＴシステムを使用して同定する）。

【0092】

モノクローナル抗体の開発を機に、抗体は有用且つ医薬品として関心が持たれるようになった。モノクローナル抗体は、継代細胞株の培養によって抗体分子を産生する任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体の適切な調製方法の例には、Ｋｏｈｌｅｒらのハイブリドーマ法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；およびＢｒｏｄｅｕｒら，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．５１−６３）が含まれる。多くの場合、ハイブリドーマを、マウスまたは齧歯類起源の最初の抗体を生成するために使用する。次いで、この最初の抗体を、組換え技術などを使用して改変して齧歯類のバリアント、キメラ抗体、およびヒト化抗体などを産生することができる。最初の抗体を産生するための他の方法が存在し、かかる方法は当該分野で公知である。しかし、次いで、最初の抗体またはさらに最初の抗体のバリアントを生成するに使用される方法と無関係に、非ヒト起源の任意の所与の抗体を、そのヒトらしさを増大させるように改変することができる。

【0093】

診断、治療、または研究のために、ヒト被験体およびヒト細胞での使用にさらに適切になるように非ヒト抗体のヒトらしさを増大させることが有利であり得る。抗体を、治療薬として使用するために改変することができる。かかる抗体（抗体断片が含まれる）の例には、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体が含まれる。キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体の生成方法は、当該分野で多数存在する。本開示の文脈では、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのうちの少なくとも１つがヒト化されている場合、抗体はヒト化されたと見なされる。さらに、親マウス抗体と比較して、少なくとも１つのＦＲ領域の少なくとも一部のアミノ酸配列が、そのアミノ酸配列がヒト抗体またはヒトコンセンサス配列のアミノ酸配列に対応するように改変されている場合、ＶＨドメインまたはＶＬドメインはヒト化されている。一定の実施形態では、ＶＨドメインの少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのＦＲ領域および／またはＶＬドメインの少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのＦＲ領域は、その配列がヒト配列とより密接に関係するように（全体または一部が）改変されている。前述のいずれかについて、一定の実施形態では、ヒトまたは非ヒトの軽鎖定常領域および／または重鎖定常領域（例えば、１つのＣＬならびにＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３の各ドメインのうちの１つまたは複数を含む）の文脈においてヒト化抗体断片を提供することができる。一定の実施形態では、存在する場合、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片を、ヒトの軽鎖定常ドメインおよび／または重鎖定常ドメインの文脈において提供する。３Ｅ１０親抗体に基づいたヒト化された軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの多数の例を本明細書中に提供する。本明細書中に記載の任意のヒト化された軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインを含む抗体および抗体結合断片は、開示の抗体および抗原結合断片の例である。

【0094】

一旦かかる抗体をコードするヌクレオチド配列が決定されると、キメラ抗体またはヒト化抗体を、組換え法によって産生することができる。当該分野で一般に公知の材料および手順を使用して、抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、発現させる。

【0095】

一定の実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４の各アイソタイプに由来する。本開示の一定の実施形態では、抗体は、ヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４の各重鎖を含む。一定の実施形態では、本開示の抗体を、哺乳動物細胞内で発現させるためにクローン化した。

【0096】

本開示の抗体が全長抗体または抗原結合断片である場合と無関係に、開示の抗体および抗原結合断片を、細胞株中で組換え発現させることができる。これらの実施形態では、特定の抗体をコードする配列を、適切な宿主細胞（哺乳動物宿主細胞または酵母宿主細胞など）の形質転換のために使用することができる。これらの実施形態によれば、任意の公知の宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入方法（例えば、ウイルス（またはウイルスベクター内）へのポリヌクレオチドのパッケージングおよびウイルス（またはベクター）を使用するか当該分野で公知のトランスフェクション手順による宿主細胞への形質導入が含まれる）を使用して形質転換を行うことができる。一般に、使用される形質転換手順は、形質転換されるべき宿主に依存し得る。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法は当該分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、硫酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接微量注入が含まれるが、これらに限定されない。

【0097】

本開示の一定の実施形態によれば、重鎖定常領域（全てまたは一部）、本開示の重鎖可変領域、軽鎖定常領域、または本開示の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的なライゲーション技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。１つの好ましい実施形態では、重鎖定常領域または軽鎖定常領域を適切な可変領域のＣ末端に付加し、発現ベクターにライゲーションする。ベクターを、典型的には、使用される特定の宿主細胞中で機能的である（すなわち、遺伝子の増幅および／または遺伝子発現が起こり得るように宿主細胞機構にベクターが適合する）ように選択する。発現ベクターの概説については、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．），１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｎ．Ｙ．を参照のこと。抗体発現の文脈において、重鎖および軽鎖の両方を同一のベクターから（例えば、同一のベクター上の同一または異なるプロモーターから）発現させることができるか、重鎖および軽鎖を、異なるベクターから発現させることができる。一定の実施形態では、重鎖および軽鎖を、同一の宿主細胞にトランスフェクトして同時発現する異なるベクターから発現させる。重鎖および軽鎖が同一の宿主細胞中の同一または異なるベクターから発現される場合と無関係に、次いで、鎖を、抗体（または抗体断片、発現される重鎖および軽鎖部分に依存する）が形成されるように会合することができる。

【0098】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片を、異種薬剤にコンジュゲート化する。一定の実施形態では、異種薬剤はタンパク質またはペプチドである。このタンパク質またはペプチドを、インフレームの、例えば重鎖との同時翻訳融合タンパク質として発現させ、本明細書中に記載のように発現させることができる。化学的コンジュゲート化も可能である。他で規定しない限り、本明細書中に詳述のコンジュゲート化は、相互接続と無関係に、本開示の任意の抗体または抗原結合部分を異種薬剤と会合するか相互接続するシナリオをいう（例えば、相互接続および／または会合は、化学的コンジュゲート化、共有結合、ジスルフィド結合など、またはその組み合わせを含み得る）。一定の実施形態では、相互接続の少なくとも一部は、本開示の抗体の重鎖と異種薬剤との間の融合タンパク質の形成などの共有結合を介する（本開示の抗体の軽鎖とさらに会合することができる）。したがって、本開示は、かかるコンジュゲートおよびかかるコンジュゲートを含む薬学的組成物を提供する。コンジュゲートは、異種薬剤と会合した本開示の抗体または抗原結合部分を含む分子である。同様に、開示の抗体または抗原結合断片は、異種薬剤をさらに含み得る。コンジュゲートは、分子の２つの部分が会合または相互接続されている（例えば、相互接続は、化学的コンジュゲート化、共有結合、ジスルフィド結合など、またはその組み合わせを含み得る）。一定の実施形態では、相互接続の少なくとも一部は、本開示の抗体の重鎖と異種薬剤との間の融合タンパク質の形成などの共有結合を介する（本開示の抗体の軽鎖または抗体断片とさらに会合することができる）。

【0099】

典型的には、任意の宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミドの維持ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含むであろう。かかる配列は、一定の実施形態において集合的に「隣接配列」と呼ばれ、典型的には、１つまたは複数の以下のヌクレオチド配列を含むであろう：プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナースプライス部位およびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現すべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカーエレメント。これらのベクター部分は周知であり、タンパク質発現のために選択および使用することができる一般的に利用可能なベクターが多数存在する。所望の宿主細胞および適用に基づいてベクターを容易に選択することができる。

【0100】

複製起点は、典型的には、市販の真核生物発現ベクターの一部であり、複製起点は、宿主細胞中のベクターの増幅に役立つ。最適なベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学合成し、ベクターにライゲーションすることができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）はほとんどのグラム陰性菌に適切であり、種々のウイルスの複製起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｕｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）、またはパピローマウイルス（ＨＰＶまたはＢＰＶなど））は哺乳動物細胞中のベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０複製起点は、ウイルス初期プロモーターも含むことのみを理由としてしばしば使用される）。

【0101】

開示の発現ベクターおよびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、重鎖および／または軽鎖をコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むであろう。プロモーターは、構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち、５’側）に存在し、構造遺伝子の転写を調節する非転写配列である。プロモーターは、慣習的に以下の２つのクラスのうちの１つに分類される：誘導性プロモーターおよび構成性プロモーター。誘導性プロモーターは、栄養素の有無または温度変化などの培養条件のいくらかの変化に応答してこのプロモーターの調節下でＤＮＡからの転写レベルの増加を惹起する。他方では、構成性プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を惹起する；すなわち、遺伝子発現をほとんどまたは全く調節しない。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、本開示の抗体または抗原結合断片を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。一定の実施形態では、同一のプロモーターを、重鎖および軽鎖の両方のために使用する。他の実施形態では、異なるプロモーター（同一または異なるベクター上に存在する）をそれぞれのために使用する。

【0102】

酵母宿主との使用に適切なプロモーターも当該分野で周知である。酵母エンハンサーを、酵母プロモーターと共に使用することが有利である。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターが周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉種ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノムから得たプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が含まれる。

【0103】

関心が持たれ得るさらなるプロモーターには、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター（ベータ−ラクタマーゼプロモーターなど）（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）。組織特異性を示し、且つトランスジェニック動物で利用されている以下の動物転写調節領域も興味深い：膵腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵β細胞で活性なインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）；リンパ球系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；肝臓で活性なアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓で活性なα−フェトタンパク質遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓で活性なα１−抗トリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞で活性なβ−グロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳内の乏突起膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）；および視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）。

【0104】

ベクターはまた、軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させるためのエンハンサー配列を含むことができる。

【0105】

本開示の発現ベクターを、市販のベクターなどの出発ベクターから構築することができる。かかるベクターは、全ての所望の隣接配列を含んでいても含んでいなくても良い。本明細書中に記載の１つまたは複数の隣接配列がベクター中に事前に存在しない場合、隣接配列を個別に入手し、ベクターにライゲーションすることができる。各隣接配列を得るために使用される方法は、当業者に周知である。

【0106】

ベクターを構築し、本開示の抗体または抗原結合断片を含む軽鎖もしくは重鎖または軽鎖および重鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完全なベクターを増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入することができる。選択された宿主細胞への発現ベクターの形質転換を、周知の方法（トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、または他の公知の技術が含まれる）によって行うことができる。選択された方法は、その一部が、使用すべき宿主細胞型の機能であろう。これらの方法および他の適切な方法は当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載されている。

【0107】

宿主細胞は、適切な条件下で培養した場合、本開示の抗体または抗原結合断片を合成し、その後に培養培地から回収することができるか（宿主細胞が培地中に分泌する場合）、産生宿主細胞から直接回収することができる（分泌しない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性を得るためい望ましいか必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）、および生物学的に活性な分子への折りたたみの容易さなどの種々の要因に依存するであろう。

【0108】

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から利用可能な多数の不死化細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、および多数の他の細胞株が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、Ｂ細胞系譜自体の抗体を作製しないが、異種抗体（例えば、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０およびＳＰ２／０）を作製および分泌する能力を有するＢ細胞系譜由来の細胞株を選択することができる。他の実施形態では、哺乳動物細胞以外の細胞（酵母細胞株（例えば、Ｐｉｃｈｉａ）など）が使用される。

【0109】

一定の実施形態では、細胞株は、本開示の抗体または抗原結合断片を安定に発現する。他の実施形態では、細胞は、本開示の抗体または抗原結合断片を一過性に発現する。

【0110】

一定の実施形態では、実質的に精製／単離された本開示の抗体（抗原結合断片が含まれる）を提供する。組換え細胞培養で成長した抗体を実質的に精製するための多数の方法、フィルター、およびデバイスが利用可能である。

【0111】

抗体断片を、全長抗体の酵素消化によって作製することもできる。

【0112】

一定の実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片を、単独または異種薬剤とのコンジュゲートとして提供されるかどうかにかかわらず、検出可能に標識する。一定の実施形態では、検出可能な標識自体が異種薬剤の例である。検出可能な標識などの物質へのコンジュゲート化方法は、当該分野で周知である。１つの実施形態では、付着した物質は、検出可能な標識である（本明細書中でレポーター分子とも呼ばれる）。付着に適切な物質には、フルオロフォア、発色団、色素、放射性同位体、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。抗体に別の物質をコンジュゲート化または共有結合する方法は、当該分野で周知である。

【0113】

用語「標識」または「標識された」は、例えば放射性標識アミノ酸の組み込みによる検出可能なマーカーの組み込み、またはマーキングしたアビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出することができる蛍光マーカー、化学発光マーカー、または酵素活性などの検出可能なマーカーを含むことが好ましいストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの付着をいう。ポリペプチドおよび糖タンパク質の種々の標識方法が当該分野で公知であり、本明細書中に開示の方法で有利に使用することができる。ポリペプチド標識の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）。一定の実施形態では、標識は放射性同位体である。適切な放射性物質の例には、ヨウ素（^１２１Ｉ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１１Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１３ｍＩｎ、^１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３５Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３ＳＭ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、および^９７Ｒｕ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0114】

標識のさらなる例には、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアナート（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）、ローダミン、またはランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ビオチニル基などのハプテン標識、および二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープが含まれる。一定の実施形態では、標識を、立体障害の可能性を軽減するための種々の長さのスペーサーアームによって付着させる。

【0115】

存在する場合、特定の標識と無関係に、当業者は、精製、診断、または研究を容易にするための適切な標識を選択することができる。他の実施形態では、異種薬剤は治療分子であり、検出可能な標識および／またはエピトープタグを含まないか、検出可能な標識および／またはエピトープタグに加えて治療分子を含む。

【0116】

「ヒト化」は、重鎖および軽鎖の抗原結合に直接関与するアミノ酸（いわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ））が必ずしもヒト起源ではない一方で、免疫グロブリン分子の一方または両方の鎖の残りの可変ドメインの少なくとも一部（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４のうちの１つまたは複数）（いわゆる可変重鎖および／または可変軽鎖のフレームワーク領域）、および、存在する場合、任意選択的に重鎖および軽鎖の定常領域を、そのアミノ酸配列がヒト配列により密接に対応するように改変された抗体などの免疫グロブリンをいう。

【0117】

本明細書中で使用する場合、「ヒト化抗体」は、２つまたはそれを超える鎖の場合、抗体は、少なくとも１つの鎖がヒト化された抗体である。ヒト化抗体鎖は、マウス親と比較して１つまたは複数のフレームワーク領域がマウス親よりもヒトであるように１つまたは複数のフレームワーク領域がヒトであるか変化している可変領域を有する。単鎖であるヒト化抗体は、鎖が、マウス親と比較して１つまたは複数のフレームワーク領域がよりヒトであるように１つまたは複数のフレームワーク領域がヒトであるか変化している可変領域を有する鎖である抗体である。ヒト化抗体鎖または抗原結合断片の可変領域の非ヒト部分は、非ヒト、特に非ヒト抗体起源、典型的には齧歯類起源である。非ヒト部分は、典型的には、１つ（または複数の）ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域中に散在する少なくとも１つのＣＤＲ領域の形態でヒト化抗体に寄与する。さらに、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するように変更することができる。したがって、当該分野で理解されるように、抗体がヒト化されたと見なすためにフレームワーク領域全体または特定の鎖上の全フレームワーク領域がヒト抗体に対応する残基を含む必要はない。

【0118】

「ヒト化抗体」は、定常領域（例えば、軽鎖の場合、少なくとも１つの定常領域またはその一部、いくつかの実施形態では、重鎖の場合、３つの定常領域）をさらに含むことができる。ヒト化抗体の定常領域は、存在する場合、典型的には、ヒト起源である。

【0119】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗体を、配列類似性において上位にある密接なヒト免疫グロブリンのκ鎖ホモログまたは重鎖ホモログ（例えば、上位１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０番目に密接な免疫グロブリンのκ鎖ホモログまたは重鎖ホモログ）を同定するためにマウス３Ｅ１０の軽鎖または重鎖の抗体配列（例えば、それぞれ配列番号７および９のマウス３Ｅ１０抗体の軽鎖および重鎖アミノ酸配列）を配列データベース検索（例えば、ＢＬＡＳＴ）に最初に供することによって生成する。上位にある最も密接なヒト免疫グロブリンのκ鎖ホモログまたは重鎖ホモログを、κ鎖または重鎖のＣＤＲグラフティングの候補と見なす。いくつかの実施形態では、次いで、配列アラインメントツール（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴｉ配列アラインメントツールなど）を使用して、上位のヒト免疫グロブリンのκ鎖ホモログまたは重鎖ホモログのうちのいずれか１つの３Ｅ１０のκ鎖または重鎖およびフレームワーク領域由来のＣＤＲからなるキメラアミノ酸配列を分析する。

【0120】

一般に、本明細書中で使用する場合、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部または一部が非ヒト親配列由来の部分に対応し、ＦＲ領域の全部または一部がヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたは２つの可変ドメインを含む。次いで、ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも１つの部分（Ｆｃ）、特に選択された基準ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも１つの部分を含むことができる。

【0121】

いくつかの実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片（例えば、ヒト化抗体または抗原結合断片などの抗体または抗原結合断片）は、３Ｅ１０抗体の１つまたは複数のＣＤＲを含む。一定の実施形態では、抗体および抗原結合断片は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインおよび配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインを含む３Ｅ１０抗体の１つまたは複数のＣＤＲを含む。Ｋａｂａｔ ＣＤＲまたはＩＭＧＴ ＣＤＲのいずれかまたは両方を、抗体をいうか記載するために使用することができる。３Ｅ１０抗体または開示の抗体のＣＤＲを、当該分野で利用可能な任意のＣＤＲ同定スキームを使用して決定することができ、かかるスキームを、抗体を記載するために使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＫａｂａｔ定義に従って定義する。他の実施形態では、ＣＤＲを、Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８７，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７およびＣｈｏｔｈｉａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ．３４２：８７７−８８３に従って定義する。他の実施形態では、ＣＤＲを、ＬｅＦｒａｎｃら，２００３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７：５５−７７に記載の国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）に従って定義する。他の実施形態では、３Ｅ１０抗体のＣＤＲを、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．，２００１，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７−６７０に従って定義する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲを、Ｋｕｎｉｋら，２０１２，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．８（２）：ｅ１００２３８８で考察された任意のＣＤＲ同定スキームに従って定義する。一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、マウスの親抗体と比較してＫａｂａｔ ＣＤＲ中に１つまたは複数の相違を含む。例えば、一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、マウスの親抗体と比較してＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ２が異なり、任意選択的に、ＶＬ ＣＤＲ１が異なる。しかし、一定の実施形態では、かかる抗体は、マウスの親抗体のＩＭＧＴ ＣＤＲを共有する。

【0122】

本明細書中で、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン中の残基のアミノ酸の位置を、例えば、配列番号７または９と比較した直鎖配列によって言及する。したがって、本開示の抗体または抗原結合断片のＶＨおよび／またはＶＬの配列を、配列番号７または９の対応するアミノ酸の位置と比較して記載することができる。例えば、ＶＨドメインまたはＶＬドメインは特定のアミノ酸の位置に変化を含むことができ、この位置は、配列番号７または９中の特定の位置に対応し得る。

【0123】

しかし、ＣＤＲ同定スキームはまた、抗体間の比較を容易にするために使用することができるナンバリングシステムを提供する。本明細書中で具体的に使用されないが、当業者は、直鎖配列の言及によるよりもむしろ、一定のナンバリングシステムを使用した本明細書中に記載のＣＤＲに言及するために利用可能なナンバリングスキームを容易に使用することができる。一定の実施形態では、当該分野で公知の任意のＣＤＲ同定スキームにしたがってＣＤＲを同定するために抗体の残基をナンバリングするために、抗体を、抗体の配列の相同領域で、選出されたＣＤＲ同定スキームのための当該分野で公知の「標準的な」ナンバリング配列とアラインメントすることができる。フレームワーク残基の最大アラインメントは、Ｆｖ領域に用いられるような、番号付け体系への「スペーサー」残基の挿入を必要とすることが多い。加えて、任意の所与の部位番号におけるある一定の個々の残基の同一性は、種間または対立遺伝子多様性のため抗体鎖ごとに変わることがある。これらの一定の残基ナンバリングスキームを本明細書中に明確に使用しないが、開示の配列および同定されたＣＤＲに基づいて容易に使用することができる。

【0124】

一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片）は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合断片は、配列番号９のアミノ酸残基３１〜３５に対応するＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸残基５０〜６６に対応するＶ_ＨＣＤＲ２、および／または配列番号９のアミノ酸残基９９〜１０５に対応するＶ_ＨＣＤＲ３を含む。本発明者らは、このアミノ酸残基のナンバリングが配列番号９の直鎖アミノ酸配列を参照することに留意している。当業者は、Ｋａｂａｔナンバリングを使用してこれらの残基を同定するためにＫａｂａｔシステムを容易に使用することができる。一定の実施形態では、抗体および抗原結合断片は、配列番号７のアミノ酸残基２４〜３８に対応するＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸残基５４〜６０に対応するＶ_ＬＣＤＲ２、および／または配列番号７のアミノ酸残基９３〜１０１に対応するＶ_ＬＣＤＲ３を含む。本発明者らは、このアミノ酸残基のナンバリングが配列番号７の直鎖アミノ酸配列を参照することに留意している。当業者は、Ｋａｂａｔナンバリングを使用してこれらの残基を同定するためにＫａｂａｔシステムを容易に使用することができる。

【0125】

一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、ＩＭＧＴシステムを使用して定義されるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合断片は、配列番号９のアミノ酸残基２６〜３３に対応するＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸残基５１〜５８に対応するＶ_ＨＣＤＲ２、および／または配列番号９のアミノ酸残基９７〜１０５に対応するＶ_ＨＣＤＲ３を含む。本発明者らは、このアミノ酸残基のナンバリングが配列番号９の直鎖アミノ酸配列を参照することに留意している。一定の実施形態では、抗体および抗原結合断片は、配列番号７のアミノ酸残基２７〜３６に対応するＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸残基５４〜５６に対応するＶ_ＬＣＤＲ２、および／または配列番号７のアミノ酸残基９３〜１０１に対応するＶ_ＬＣＤＲ３を含む。本発明者らは、このアミノ酸残基のナンバリングが配列番号７の直鎖アミノ酸配列を参照することに留意している。一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、前述のＣＤＲの６つ全てを含む。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、前述のＣＤＲのうちの４つ、ならびに配列番号４９に記載のＶＨ ＣＤＲ２および配列番号５１に記載のＶＬ ＣＤＲ２を含む。

【0126】

一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ同定スキームを使用して決定した３Ｅ１０のＣＤＲ（例えば、配列番号３２〜３７に記載のＣＤＲ）のうちの少なくとも１、２、３、４、または５つを含む。一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号４９に記載のＶＨ ＣＤＲ２および／または配列番号５１に記載のＶＬ ＣＤＲ２および／または配列番号５０に記載のＶＬ ＣＤＲ１をさらに含む。一定の実施形態では、抗体および抗原結合断片は、ＩＭＧＴ同定スキームを使用して決定した３Ｅ１０のＣＤＲ（例えば、配列番号１〜６に記載のＣＤＲ）のうちの少なくとも１、２、３、４、または５つを含む。一定の実施形態では、抗体および抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ同定スキームを使用して決定した３Ｅ１０の６つ全てのＣＤＲを含む（例えば、配列番号３２〜３７を含む）。他の実施形態では、抗体および抗原結合断片は、ＩＭＧＴ同定スキームを使用して決定した３Ｅ１０の６つ全てのＣＤＲ（例えば、配列番号１〜６に記載）を含む。前述のうちのいずれかについて、一定の実施形態では、抗体および抗原結合断片は３Ｅ１０と同一のエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの同一の標的）に結合する抗体であり、そして／または内在化部分は３Ｅ１０と抗原（例えば、ＤＮＡ）への結合を競合する。例示的な抗体および抗原結合断片は、ＥＮＴ２および／またはＥＮＴ３を介して細胞を通過することができる。

【0127】

一定の実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片）は、ＩＭＧＴナンバリングを使用した１つまたは複数のＣＤＲ中の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸が変化したアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲ中、１〜２、１〜３、１〜４、または１〜５つなどの変化を有する）またはＫａｂａｔナンバリングを使用した１つまたは複数のＣＤＲ中の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸が変化したアミノ酸配列（例えば、配列番号３２〜３７のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲ中、１〜２、１〜３、１〜４、または１〜５つなどの変化を有する）を含む。一定の実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片）は、Ｋａｂａｔナンバリングを使用した１つまたは複数のＣＤＲ中の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸が変化したアミノ酸配列（例えば、配列番号３２〜３７のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲ中、２、３、４、または５つなどの変化を有する）を含む。いくつかの実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片は、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化を含むＶ_Ｌドメインを含む：配列番号７の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合のＭ３７Ｌ、Ｈ３８Ａ、またはＥ５９Ｑ。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片は、配列番号９の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合にＴ６３Ｓ変化を含むＶ_Ｈドメインを含む。いくつかの実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号７の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合にＥ５９Ｑ変化を含むＶ_Ｌドメイン、および配列番号９の直鎖アミノ酸配列に関して比較し、ナンバリングした場合にＴ６３Ｓ変化を含むＶ_Ｈドメインを含む。

【0128】

理論に拘束されることを望まないが、本開示の驚くべき発見の１つは、マウス３Ｅ１０と比較して改良されたＤＮＡ結合活性を有し、一定のＫａｂａｔ ＣＤＲ中にアミノ酸の変化（ここでは、置換）をさらに含む抗体および抗原結合断片を生成することができることである。さらに、一定の実施形態では、ＣＤＲ置換を有するこれらの改良された抗体も、一定の実施形態では、ヒト化する。

【0129】

一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ同定スキームを使用して決定した場合に配列番号９に記載の対応するＣＤＲと異なる少なくとも１つのＣＤＲを含む可変重鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なるＣＤＲは、配列番号４９に記載のＶ_Ｈ ＣＤＲ２である。

【0130】

一定の実施形態では、開示の抗体および抗原結合断片は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ同定スキームを使用して決定した場合に配列番号７に記載の対応するＣＤＲと異なる少なくとも１つのＣＤＲを含む可変軽鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なるＣＤＲは、配列番号５０に記載のＶ_Ｌ ＣＤＲ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なるＣＤＲは、配列番号５１に記載のＶ_Ｌ ＣＤＲ２である。

【0131】

アクセプターがヒト免疫グロブリンに由来する場合、ドナーフレームワーク配列をヒトフレームワーク配列群中の種々のヒトフレームワーク配列とアラインメントすることによってドナーフレームワーク配列に対する相同性に基づいて選択したヒトフレームワーク配列を任意選択的に選択し、最も相同性の高いフレームワーク配列をアクセプターとして選択することができる。アクセプターヒトフレームワークは、公的なデータベースで利用可能なヒト抗体生殖系列配列に由来するか、この系列配列から誘導され得る。

【0132】

ヒト化抗体または抗体断片を生成するために使用される特定の方法と無関係に、抗体を、（ｉ）親のマウス抗体の所望の機能を保持し（または任意選択的に増強された機能を有し）；（ｉｉ）作製または使用を困難にする有害な性質を持たず；好ましくは、（ｉｉｉ）マウスの親抗体と比較して１つまたは複数の有利な性質を保有することを確認するために評価しなければならない。これらのいずれかまたは全てが任意の特異的ヒト化抗体で起こるかどうかおよびその範囲は予測不可能であり、不確実である。置換がまたＣＤＲ内に導入された場合、これは特に当てはまる。さらに、ヒト化抗体または抗体断片の抗体パネルのうちで、いくつかは必要な活性を持たなくてもよく、必要な活性を持つ１つまたは複数の抗体は、他のヒト化抗体と比較して有利な性質を有し得る。これについても予測不可能であり、不確実である。
一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＬドメインはヒト化されており、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み；これらのＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っており、
ＶＨドメインはヒト化されており、以下：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および

【0133】

配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み；ＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従っており、抗体または抗原結合断片のＤＮＡ結合および／または細胞透過は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むマウス３Ｅ１０抗体のＤＮＡ結合および／または細胞透過と比較して増加している。
一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインは、以下：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔシステムに従っており；
ＶＬは、以下：
配列番号５０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔシステムに従っており；
抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合する。
一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインは、以下：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔに従っており；
ＶＬは、以下：
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
これらのＣＤＲはＫａｂａｔに従っており；
抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合する。

【0134】

一定の実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片は、細胞を透過する（例えば、原形質膜を通過し、細胞（ＥＮＴ２を発現する細胞など）に侵入することができる）。

【0135】

いくつかの実施形態では、ＶＨドメインはヒト化されている。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインはヒト化されている。

【0136】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列、またはＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号４０と比較してフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失が存在することが配列番号４０と異なるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインを含む。他の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列、またはＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号８と比較してフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失が存在することが配列番号８と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0137】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列、またはＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号３８と比較してフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失が存在することが配列番号３８と異なるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列、またはＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号３９と比較してフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失が存在することが配列番号３９と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、またはＩＭＧＴシステムによって定義した場合に配列番号１０と比較してフレームワーク領域中に全部で１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失が存在することが配列番号１０と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0138】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｌドメインはヒト化されており、且つ配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。

【0139】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｌドメインはヒト化されており、且つ配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。

【0140】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインはヒト化されており、且つ配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。

【0141】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインはヒト化されており、且つ配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。

【0142】

一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。

【0143】

一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片のＶ_Ｈドメインは、以下：
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；および
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0144】

一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片のＶ_Ｌドメインは、以下：
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号９に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の抗体または抗原結合断片は軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含み；Ｖ_Ｈドメインは配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含み；Ｖ_Ｌドメインは配列番号７に記載のアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含み、抗体または抗原結合断片はＤＮＡに結合し、細胞を透過する。

【0146】

いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｌドメイン。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、以下を含む：ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメイン、およびｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むヒト化Ｖ_Ｌドメイン。

【0147】

いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列を、本明細書中に開示の任意のＶ_Ｌ配列（例えば、配列番号８）のＮ末端部分にコンジュゲート化する。いくつかの実施形態では、軽鎖にコンジュゲート化したシグナル配列は配列番号６１である。いくつかの実施形態では、シグナル配列を、本明細書中に開示の任意のＶ_Ｈ配列（例えば、配列番号１０）のＮ末端部分にコンジュゲート化する。いくつかの実施形態では、重鎖にコンジュゲート化したシグナル配列は配列番号６２である。抗体または抗体断片の発現のためにシグナル配列を含める場合、そのシグナル配列は一般に切断され、完成したポリペプチド中に存在しない（例えば、シグナル配列は一般に切断され、タンパク質産生中に一過性にのみ存在する）と理解される。

【0148】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の本開示の任意の抗体または抗原結合断片のＶ_Ｈドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化を含む：Ｖ５Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｖ１２Ｉ、Ｋ１３Ｑ、Ｒ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｖ３７Ｉ、Ｅ４２Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｔ６３Ｓ、Ａ７５Ｓ、Ｆ８０Ｙ、Ｔ８４Ｎ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｔ１１１Ｌ、またはＬ１１２Ｖ。換言すれば、一定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、対応する位置を配列番号９と比較した場合に、上述に対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸の変化を含む。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化を含む：Ｖ５Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｋ１３Ｑ、Ｒ１８Ｌ、Ｋ１９Ｒ、Ｖ３７Ｉ、Ｅ４２Ｇ、Ａ４９Ｓ、Ｔ６３Ｓ、Ａ７５Ｓ、Ｆ８０Ｙ、Ｔ８４Ｎ、Ｍ９３Ｖ、Ｔ１１１Ｌ、またはＬ１１２Ｖ。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合に、前記変化の少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、または少なくとも１７個を含む。一定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合に、Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化はＶ５Ｑ変化である。一定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合に、Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化はＥ６Ｑ変化である。一定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合に、Ｖ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化はＬ１１Ｖ変化である。一定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合にＶ_Ｈドメイン中の少なくとも１つの変化はＶ３７Ｉ変化である。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９のアミノ酸８８位に対応するアミノ酸の位置にセリンを保持している。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９のアミノ酸１２位に対応するアミノ酸の位置にバリンを保持している。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈドメインは、配列番号９のアミノ酸４７位に対応するアミノ酸の位置にトリプトファンを保持している。ＶＬについて本明細書中で提供した任意の態様および実施形態との組み合わせと同様に、上記の全ての操作可能な組み合わせを意図する。前述のアミノ酸残基のナンバリングは、所与のＶＨの直鎖アミノ酸配列を参照し、本開示は、マウスの親ＶＨまたはＶＬ中の列挙した位置に対応する位置に１つまたは複数の列挙した置換を有するヒト化抗体および抗原結合断片を意図する。

【0149】

前述のいずれかまたは本明細書中に開示の態様および実施形態のいずれかの一定の実施形態では、本明細書中に記載の任意のヒト化抗体または抗原結合断片のＶ_Ｌドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化を含む：Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ａ９Ｓ、Ａ１２Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｌ１５Ｖ、Ｑ１７Ｄ、Ａ１９Ｖ、Ｓ２２Ｔ、Ｍ３７Ｌ、Ｈ３８Ａ、Ｇ４５Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｐ４７Ａ、Ｅ５９Ｑ、Ａ６４Ｓ、Ｈ７６Ｔ、Ｎ７８Ｔ、Ｈ８０Ｓ、Ｐ８１Ｓ、Ｖ８２Ｌ、Ｅ８３Ｑ、Ｅ８４Ｐ、Ａ８７Ｖ、Ａ８７Ｆ、またはＧ１０４Ａ。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合に、１つまたは複数の以下のアミノ酸の変化を含む：Ｖ３Ｑ、Ｌ４Ｍ、Ａ９Ｓ、Ａ１２Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｌ１５Ｖ、Ｑ１７Ｄ、Ａ１９Ｖ、Ｇ４５Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｐ４７Ａ、Ｅ５９Ｑ、Ａ６４Ｓ、Ｈ７６Ｔ、Ｎ７８Ｔ、Ｈ８０Ｓ、Ｐ８１Ｓ、Ｖ８２Ｌ、Ｅ８３Ｑ、Ｅ８４Ｐ、Ａ８７Ｖ、またはＧ１０４Ａ。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を参照して比較し、ナンバリングした場合に、前記アミノ酸変化の少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、または少なくとも２２個を含む。

【0150】

配列番号７または９に記載のアミノ酸配列と比較した特定の位置での任意の上述の変動について言及していると理解すべきである。本開示の抗体または抗原結合断片は、配列番号７または９のアミノ酸配列と比較した対応する位置の１つまたは複数のかかるアミノ酸の変化を含むことができる。例として、一定の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９の１１位に対応する位置のＬからＶへの変化（例えば、Ｌ１１Ｖ変化）を含む。これは、前述の全ての変化を説明することもできる方法の例であり、かかる説明が明確に意図される。別の例として、一定の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号７の３位に対応する位置にＶからＱへの変化（例えば、Ｖ３Ｑ変化）を含む。

【0151】

一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の各位置にセリンを含む。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、配列番号７のアミノ酸５３位に対応するアミノ酸の位置にリジンを保持している。一定の実施形態では、Ｖ_Ｌドメインは、１つまたは複数の以下のアミノ酸の組み合わせ：
ａ）それぞれ、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の位置のアスパラギンおよびセリン；
ｂ）それぞれ、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の位置のアスパラギンおよびグリシン；
ｃ）それぞれ、配列番号７のアミノ酸８０位および８１位に対応するアミノ酸の位置のアスパラギンおよびプロリンのいずれも持たない。ＶＨについて本明細書中で提供した任意の態様および実施形態との組み合わせと同様に、前述の全ての操作可能な組み合わせを意図する。前述のアミノ酸残基のナンバリングは、所与のＶＨの直鎖アミノ酸配列を参照し、本開示は、マウスの親ＶＨまたはＶＬ中の列挙した位置に対応する位置に１つまたは複数の列挙した置換を有するヒト化抗体および抗原結合断片を意図する。

【0152】

いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分（例えば、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含むヒト化抗体または抗原結合断片）は、基準非ヒト化内在化部分（例えば、マウスの親３Ｅ１０抗体）と比較して、少なくとも１つの優れた生物学的性質または生理学的性質に関連する。他の実施形態では、ヒト化内在化部分は、基準非ヒト化内在化部分と比較して、少なくとも２つの優れた生物学的性質または生理学的性質に関連する。他の実施形態では、ヒト化内在化部分は、基準非ヒト化内在化部分（例えば、マウスの親３Ｅ１０抗体）と比較して、少なくとも３つの優れた生物学的性質または生理学的性質に関連する。いくつかの実施形態では、基準非ヒト化内在化部分は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬを含むマウス親抗体を含む。いくつかの実施形態では、基準ヒト化内在化部分は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施形態では、基準内在化部分は、配列番号４２のＶ_Ｈアミノ酸配列および配列番号４１のＶ_Ｌアミノ酸配列を含むヒト化抗体または抗原結合断片である。

【0153】

一定の実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片はヒト化されており、マウス抗体と比較して、少なくとも１つの優れた生物学的性質または生理学的性質に関連し、マウス抗体は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインおよび配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含み、そして／またはオルタナティブ抗体またはその抗原結合断片と比較して、前記オルタナティブ抗体または抗原結合断片は、配列番号７に記載のアミノ酸配列のＣＤＲを含むＶ_Ｌドメインおよび配列番号９に記載のアミノ酸配列のＣＤＲを含むＶ_Ｈドメインを含み；前記オルタナティブ抗体または断片は配列番号８または４０のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインを含まず、そして／または前記オルタナティブ抗体または断片は配列番号１０、３８、または３９のいずれかのアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含まず；または、いくつかの実施形態では、前記オルタナティブ抗体または断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインを含まず、そして／または前記オルタナティブ抗体または断片は、任意の配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含まない。

【0154】

いくつかの実施形態では、本開示のヒト化内在化部分（例えば、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含む）は、オルタナティブ内在化部分またはその断片（例えば、同一の親のマウス抗体に基づき、任意選択的に、同一のＣＤＲを有する異なるヒト化抗体）と比較して、少なくとも１つの優れた生物学的性質または生理学的性質に関連する。他の実施形態では、本開示のヒト化内在化部分は、オルタナティブ内在化部分（例えば、同一の親のマウス抗体に基づき、任意選択的に、同一のＣＤＲを有する異なるヒト化抗体）と比較して、少なくとも２つの優れた生物学的性質または生理学的性質に関連する。他の実施形態では、本開示のヒト化内在化部分は、オルタナティブ内在化部分（例えば、同一の親のマウス抗体に基づき、任意選択的に、同一のＣＤＲを有する異なるヒト化抗体）と比較して、少なくとも３つの優れた生物学的性質または生理学的性質に関連する。いくつかの実施形態では、オルタナティブ抗体は、ヒト化抗体が由来する親抗体（例えば、親のマウス抗体）である。いくつかの実施形態では、オルタナティブ抗体は、３Ｅ１０抗体に由来するが、本開示のヒト化内在化部分またはその抗原結合断片と異なるアミノ酸配列を有する別のヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、マウス親抗体および／またはオルタナティブヒト化抗体と比較して１つまたは複数の改良された特徴を有する。いくつかの実施形態では、オルタナティブヒト化抗体は、開示の抗体と比較してＫａｂａｔ ＣＤＲ中に１、２、または３つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、オルタナティブ内在化部分またはその断片は、以下：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、ＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義されるが、本開示のヒト化内在化部分またはその断片（例えば、配列番号８、１０、または３８〜４０のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むヒト化内在化部分またはその断片）中に同一の足場アミノ酸配列を含まない。

【0155】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のヒト患者における免疫原性が非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片のヒト患者における免疫原性と比較して減少することに関連する。当業者は、抗体の免疫原性を決定するための多数のアッセイに精通している。好ましい実施形態では、本開示のヒト化抗体は、ヒト患者における免疫原性の減少に関連するが、マウス３Ｅ１０抗体に関連する細胞透過性を保持している。

【0156】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ある生理学的に許容され得るキャリア中のヒト化内在化部分または抗原結合断片の溶解性が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片の溶解性と比較して高いことに関連する。本明細書中で使用する場合、生理学的に許容され得るキャリアには、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、植物油（オリーブ油など）、ならびに注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｉｎｃｌｕｄｅ）。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分または断片は、生理学的に許容され得るキャリア中の溶解性が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または３００％高いことに関連する。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片の溶解性の試験のために利用することができる日常的試験を承知している。溶解性アッセイの例には、標準的な混濁度アッセイまたは光散乱アッセイ、市販の溶解性アッセイ（ＯｐｔｉＳｏｌ（商標）溶解性アッセイキット（ＤｉＬｙｘ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）など）が含まれるか、Ｂｏｎｄｏｓら，２００３，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１６：２２３−２３１に記載のタンパク質溶解性アッセイスクリーニングを利用することができる。

【0157】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある細胞型における発現レベルが同型細胞における非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片の発現レベルと比較して高いことに関連する。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分または断片は、ある細胞中の発現レベルが同型細胞中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片の発現レベルと比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または３００％高いことに関連する。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片の発現レベルの試験のために利用することができる日常的試験を承知している。

【0158】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある細胞型における毒性（例えば、細胞傷害性および／または遺伝毒性）が非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片に関連する同型細胞における毒性と比較して低いことに関連する。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分または断片の毒性は、同型細胞中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片の毒性と比較して、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または３００％低いことに関連する。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物などの生物内に存在する。いくつかの実施形態では、細胞は、人体中のヒト細胞である。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片の毒性の試験のために利用することができる日常的試験を承知している。例えば、本開示のヒト化内在化部分またはその断片および非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分またはその断片の毒性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞または細胞培養物（ヒト細胞由来の細胞または細胞培養物など）中で試験することができるか、マウスまたはラットなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ動物モデル中で試験することができる。

【0159】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ある生理学的に許容され得るキャリア中のヒト化内在化部分または抗原結合断片の凝集が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片の凝集と比較して減少することに関連する。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分または断片は、ある生理学的に許容され得るキャリア中の凝集が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または３００％低いことに関連する。いくつかの実施形態では、ある薬学的に許容され得るキャリア中のヒト化抗体または抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、少なくとも１時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、２日後、５日後、１週間後、２週間後、４週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、または１年後の凝集の減少に関連する。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片の凝集の試験のために利用することができる日常的試験を承知している。凝集アッセイの例には、標準的な混濁度アッセイまたは光散乱アッセイ（例えば、Ａ６００ｎｍアッセイ）、目視検査、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、市販の凝集アッセイ（ＯｐｔｉＳｏｌ（商標）凝集アッセイキット（ＤｉＬｙｘ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）など）、ＨＰ−ＳＥＣ分析が含まれるか、Ｂｏｎｄｏｓら，２００３，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１６：２２３−２３１に記載のタンパク質凝集アッセイスクリーニングを利用することができる。

【0160】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または抗原結合断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある生理学的に許容され得るキャリア中の安定性が同型の生理学的に許容され得るキャリア中での非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片の安定性と比較して増加することに関連する。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分または断片は、ある生理学的に許容され得るキャリア中の安定性が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または３００％高いことに関連する。いくつかの実施形態では、ある薬学的に許容され得るキャリア中のヒト化抗体または抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して、少なくとも１時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、２日後、５日後、１週間後、２週間後、４週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、または１年後の安定性の増加に関連する。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片の安定性の試験のために利用することができる日常的試験を承知している。例えば、当業者は、生理学的に許容され得るキャリア中での種々の期間の保存後のヒト化内在化部分および非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分またはその断片の安定性を試験することができる。ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（商標）熱シフト安定性アッセイ（Ｅｎｚｏ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）などの市販のアッセイを、部分またはその断片の安定性の評価で利用することができる。あるいは、部分またはその断片の安定性を、ＨＰ−ＳＥＣ分析またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定することができる。

【0161】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または抗原結合断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片の細胞透過が非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片の細胞透過と比較して改良されることに関連する。いくつかの実施形態では、透過性の改良は、ＥＮＴ輸送体（例えば、ＥＮＴ２および／またはＥＮＴ３輸送体）によるヒト化内在化部分または抗原結合断片の内在化効率の増加に起因する。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分または断片は、細胞透過が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または３００％高いことに関連する。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片の細胞透過の試験のために利用することができる日常的試験を承知している。例えば、ヒト化内在化部分またはその断片の細胞透過を決定するために、ヒト化内在化部分またはその断片を（例えば、蛍光または放射性に）標識し、細胞または細胞培養物に投与することができる。あるいは、ヒト化内在化部分またはその断片の細胞透過を決定するために、ヒト化内在化部分またはその断片を、細胞または細胞培養物に投与し、次いで、二次因子（例えば、蛍光標識されたか放射性標識された二次抗体）を使用して検出することができる。

【0162】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある細胞型におけるグリコシル化が同一細胞型における非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片のグリコシル化と比較して減少することに関連する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または抗体断片のＮ連結グリコシル化を減少させるために、ＶＨまたはＶＬドメイン中のアスパラギンを別のアミノ酸残基に変異する。他の実施形態では、本明細書中に記載のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある細胞型中のグリコシル化が同一細胞型中の非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片のグリコシル化と比較して増加することに関連する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある細胞型中の特定のグリコシル化パターンが同一細胞型中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片のグリコシル化パターンと異なることに関連する。例えば、ヒト化内在化部分または抗原結合断片をある細胞型中でヘミグリコシル化（ｈｅｍｉ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）することができる一方で、非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片は、同型細胞中でヘミグリコシル化されない。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片がある細胞型中で特異的グリコシル化基にて翻訳後修飾され、これが、同型細胞中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片の翻訳後修飾と異なることである。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片のグリコシル化パターンの試験のために利用することができる日常的試験を承知している。内在化部分およびその断片のグリコシル化レベルおよびグリコシル化パターンの試験のための実験例には、Ｍｏｈａｍｍａｄ，２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐａｇｅｓ ７９５−８０２に記載のプロトコール；質量分析および／またはＨＰＬＣを含む標準的な手順；ＧＬＹＣＯ−ＰＲＯＴＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ならびにＱｐｒｏｔｅｏｍｅ総糖タンパク質キット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）が含まれる。タンパク質配列中の正確なグリコシル化部位を同定するために、Ｚａｕｎｅｒ Ｇら，２０１０，Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ．，３３：９０３−１０に記載のプロトコールと同様に、標準的なエンドプロテイナーゼ切断（例えば、トリプシン消化）を行い、その後にＬＣ／ＭＳまたはＨＩＬＩＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析を行うことができる。

【0163】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある生理学的に許容され得るキャリア中の脱アミド化が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片の脱アミドと比較して減少することに関連する。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分または断片は、ある生理学的に許容され得るキャリア中の脱アミドが同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または３００％低いことに関連する。いくつかの実施形態では、ある薬学的に許容され得るキャリア中のヒト化抗体または抗原結合断片は、同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して少なくとも１時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、２日後、５日後、１週間後、２週間後、４週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、または１年後の脱アミド化が減少することに関連する。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片の脱アミド化の試験のために利用することができる日常的試験を承知している。タンパク質脱アミド化の試験のためのアッセイの例には、市販の脱アミド化アッセイ（ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）イソアスパラギン酸検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）またはＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００チタンシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）など）が含まれる。他のアッセイには、ペプチドマッピングが含まれ得る。一般に、Ｋａｌｇａｈｔｇｉ，Ｋ．，＆ Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｃ．“Ｒａｐｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４４３，３４３−３５４（１９８８）を参照のこと。

【0164】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある生理学的に許容され得るキャリア中の酸化が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片の酸化と比較して減少することに関連する。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分または断片は、ある生理学的に許容され得るキャリア中の酸化が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または３００％低いことに関連する。いくつかの実施形態では、ある薬学的に許容され得るキャリア中のヒト化抗体または抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して少なくとも１時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、２日後、５日後、１週間後、２週間後、４週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、または１年後の酸化が減少することに関連する。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片の酸化の試験のために利用することができる日常的試験を承知している。例えば、酸化レベルを、いくつかの市販の酸化アッセイのうちのいずれか１つ（メチオニンスルホキシド免疫ブロッティングキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）など）を使用して評価することができる。他のアッセイにはペプチドマッピングが含まれ得る。一般に、Ｋａｌｇａｈｔｇｉ，Ｋ．，＆ Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｃ．“Ｒａｐｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４４３，３４３−３５４（１９８８）を参照のこと。

【0165】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある細胞型で産生された場合のリピド化が同型の細胞中で産生された場合の非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または断片のリピド化と比較して減少することに関連する。他の実施形態では、本明細書中に記載のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある細胞型で産生された場合のリピド化が同型の細胞中で産生された場合の非ヒト化抗体もしくはオルタナティブ抗体または抗原結合断片のリピド化と比較して増加することに関連する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片のある細胞型中で産生された場合の特定のリピド化パターンが同型細胞中で産生された場合の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片のリピド化パターンと異なることに関連する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片がある細胞型で産生された場合に特異的リピド化基にて翻訳後修飾され、これが、同型の細胞中で産生された場合の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片の翻訳後修飾と異なることである。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片のリピド化パターンの試験のために利用することができる日常的試験を承知している。例えば、内在化部分またはその断片を、Ｇｅｌｂら，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ １−２５６に記載のプロトコールによって評価することができる。

【0166】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の開示のヒト化内在化部分または断片に関連する優れた生物学的性質または生理学的性質は、ヒト化内在化部分または抗原結合断片が、非ヒト化抗体、親抗体、もしくはオルタナティブ抗体、または断片（異なるヒト化抗体など）の結合親和性と比較して、高い親和性（低Ｋ_Ｄ）でポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）に結合することができることである。いくつかの実施形態では、ヒト化内在化部分または断片は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ；二本鎖平滑末端ＤＮＡ）に対する結合親和性が同型の生理学的に許容され得るキャリア中の非ヒト化内在化部分もしくはオルタナティブ内在化部分または抗原結合断片と比較して少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、または３００％強いことに関連する。当業者は、ヒト化内在化部分またはその断片の結合親和性（Ｋ_Ｄ）の試験のために利用することができる日常的試験を承知している。結合親和性を、現在標準的な方法および製造者のプロトコールにしたがって表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を使用して測定することができる。
ＩＩＩ．異種薬剤

【0167】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体またはその抗原結合断片）を、異種薬剤にコンジュゲート化することができる。したがって、本開示は、異種薬剤に会合した本開示の抗体または抗原結合断片を含むコンジュゲートを提供する。異種とは、薬剤自体が抗体または抗原結合断片の一部ではなく、そして／または、抗体または抗原結合断片の天然の内因性の標的ではないことを意味する。一定の実施形態では、異種薬剤を、抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化する（例えば、２つの部分を、共有結合（同時翻訳融合または化学的コンジュゲート化など）によって接合する。

【0168】

いくつかの実施形態では、異種薬剤はポリペプチドまたはペプチドである。他の実施形態では、異種薬剤はポリヌクレオチドである（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸（アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる）を含む）。他の実施形態では、異種薬剤は有機小分子である。一定の実施形態では、ポリペプチド、ペプチド、またはポリヌクレオチドは治療薬である。一定の実施形態では、有機小分子は治療薬である。他の実施形態では、異種薬剤は毒素である。他の実施形態では、異種薬剤は、放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｉｄｅ）または他の検出可能な標識である。例示的な放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｉｄｅ）および検出可能な標識は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのコンジュゲートの視覚化または局在化を容易にし、したがって、本開示のコンジュゲートの診断での使用およびこれを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を容易にする。

【0169】

いくつかの実施形態では、異種薬剤はポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、遺伝子療法の形態として細胞に投与する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞中で既に発現した遺伝子の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは遺伝子の野生型コピーであり、細胞は遺伝子の変異体コピーを発現する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子の変異体コピーである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは遺伝子の変異体コピーであり、細胞は遺伝子の野生型コピーを発現する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは遺伝子の変異体コピーであり、細胞は遺伝子の変異体コピーを発現する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはアンチセンス分子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡｉ分子である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲテクノロジーで用いるｔｒＲＮＡおよび／またはｃｒＲＮＡの一方または両方である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。例えば、Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１を参照のこと。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、および／またはｓｇＲＮＡを、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドと組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、本明細書中に記載の任意の内在化部分によって細胞に投与する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ変異および／またはＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｄ１０Ａ変異および／またはＨ８４０Ａ変異を有するＣａｓ９タンパク質をコードする。例えば、Ｃｏｎｇ Ｌ．ら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９，８１９−８２３；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１；Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．ら（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ，１０９，Ｅ２５７９−２５８６；およびＭａｌｉ，Ｐ．ら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９，８２３−８２６（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の任意の内在化部分を、Ｄ１０Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異の両方を有するＣａｓ９タンパク質にコンジュゲート化し、いくつかの実施形態では、この変異Ｃａｓ９タンパク質を使用して、転写制御（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ら（２０１３）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０，２３９−２４２．，Ｍａｌｉ，Ｐ．ら（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，８３３−８３８；Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｗ．ら（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３，１１６３−１１７１）、後成的修飾（Ｈｕ，Ｊ．ら（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ１０９）、および特定のゲノム遺伝子座の微視的視覚化（Ｃｈｅｎ，Ｂ．ら（２０１３）Ｃｅｌｌ，１５５，１４７９−１４９１）のためにタンパク質ドメインをターゲティングすることができる。

【0170】

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片（例えば、本開示のヒト化抗体またはその抗原結合断片）と異種薬剤との間のコンジュゲート化を、１つの連続ポリペプチド鎖として発現する異種薬剤ポリペプチドおよび内在化部分を含む融合タンパク質の生成によって行う。全長抗体またはＦａｂのコンジュゲート化の場合、最終産物が１つを超えるポリペプチド鎖を含むが、異種薬剤を重鎖などの鎖の１つに共有結合性に会合させる（例えば、インフレームの同時翻訳融合物として産生する）ことができると認識される。いずれにしても、かかるポリペプチドを、本明細書中で組換えによってコンジュゲート化したか融合タンパク質を含むという。これは、抗体または抗原結合断片と異種薬剤との間のコンジュゲート化（例えば、相互接続；会合）の一例である。かかる融合タンパク質の調製では、異種薬剤ポリペプチドおよび内在化部分、ならびに、任意選択的に、異種薬剤ポリペプチドと内在化部分とを繋ぐためのペプチドリンカー配列をコードする核酸を含む融合遺伝子を構築する。本開示は、適切な複合体（融合タンパク質など）はいずれの方向でもよいことが意図される。換言すれば、ヒト化抗体またはその抗原結合断片部分は、異種薬剤のＮ末端側またはＣ末端側に存在し得る。最終産物が１つのポリペプチド鎖、例えば、宿主細胞中での発現後に重鎖および軽鎖が会合する抗体を含む場合、本開示は、重鎖および軽鎖（任意選択的に、例えば重鎖との融合タンパク質として発現する異種薬剤を有する）を同一の宿主細胞中で発現する単一のベクターまたはベクター組から発現させることができることを意図する。

【0171】

一定の特定の実施形態では、本開示の方法で用いるコンジュゲートを、ユニバーサルキャリアシステムの使用によって産生することができる。例えば、異種薬剤ポリペプチドを、プロテインＡ、ポリ−Ｌ−リジン、およびｈｅｘ−ヒスチジンなどの一般的なキャリアにコンジュゲート化することができる。次いで、コンジュゲート化されたキャリアは、内在化部分として作用する抗体（例えば、本開示のヒト化抗体またはその抗原結合断片）と複合体を形成するであろう。免疫グロブリン結合を担うキャリア分子のほんの一部をキャリアとして使用することができる。

【0172】

いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗体または抗原結合断片を、異種薬剤に化学的にコンジュゲート化する。一定の実施形態では、ヒト化抗体またはその抗原結合断片を、周知の架橋試薬およびプロトコールを使用して化学的にコンジュゲート化する。例えば、当業者に公知であり、異種薬剤のヒト化抗体またはその抗原結合断片との架橋に有用な化学的架橋剤が多数存在する。例えば、架橋剤は、段階的様式で分子を連結させるために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤であり得る。代表的な架橋剤（代表的なヘテロ二官能性架橋剤が含まれる）の例を本明細書中に提供する。

【0173】

前述は例である。異種薬剤がタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子（例えば、化学療法薬小分子）のいずれであるかと無関係に、本開示の抗体または抗原結合断片を異種薬剤にコンジュゲート化するか、そうでなければ接合する方法は多数存在する。当業者は、本開示の抗体または抗原結合断片を異種薬剤と会合するための適切なスキーム（直接またはリンカー（例えば、ポリペプチドまたは他のリンカー）を介した会合が含まれる）を選択することができる。

【0174】

上記のように、本開示は、本開示の抗体または抗原結合断片へのコンジュゲート化に適切な異種薬剤がポリペプチド、ペプチド、小分子（例えば、有機小分子または無機小分子）（例えば、化学療法薬小分子）、またはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸）であり得ることを意図する。さらに、以下の異種薬剤のカテゴリーを意図する。それぞれの例を提供する。例示的な異種薬剤を、以下に簡潔に記載する。これらは、本テクノロジーを使用して細胞内に送達することができる異種薬剤および特異的薬剤のカテゴリーの例にすぎない。しかし、ペプチド、ポリペプチド（酵素が含まれる）、ポリヌクレオチド、および小分子を含むコンジュゲートおよびこれらの送達方法を意図し、提供する。
Ａ．ヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害

【0175】

異種薬剤の１つのカテゴリーは、ヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害の処置または研究に適切な薬剤である。適切な異種薬剤には、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、および小分子が含まれる。ヌクレオチド反復障害およびエクソンスプライシング障害（筋緊張性ジストロフィ、ハンチントン病、および神経線維腫症など）の分野に多数の例が存在する。多数のヌクレオチド反復障害およびエクソンスプライシング障害について、疾患の病理に関与する１つまたは複数のタンパク質が公知であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ（細胞もしくは動物内で疾患を研究するためまたは治療目的のいずれか）での送達のために本開示の抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化することができる異種薬剤を示す。一定の実施形態では、コンジュゲートは、異種薬剤がｉｎ ｖｉｔｒｏ系またはｉｎ ｖｉｖｏ系で結合することができる標的を同定するのに適切である。ヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害の処置または研究に適切な異種薬剤のいくつかの具体例を以下に提供する。これらは、異種薬剤およびこの異種薬剤のカテゴリーの例にすぎない。

【0176】

いくつかの実施形態では、異種薬剤は、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくはバリアントである。したがって、本開示は、（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片および（ｉｉ）ＭＢＮＬポリペプチド（例えば、ＭＢＮＬポリペプチドにコンジュゲート化したか、そうでなければ会合した本開示の抗体）を含むコンジュゲートを提供する。異種薬剤として使用することができるＭＢＮＬポリペプチド、ならびにその断片、変異体、およびバリアントの詳細な説明を、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／０４４８９４号（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドを、ユニバーサルキャリアシステムにおいてかまたは化学的コンジュゲート化によって融合タンパク質として本開示の抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化する。

【0177】

本明細書中で使用する場合、用語「ＭＢＮＬポリペプチド」または「ＭＢＮＬタンパク質」には、明確に別記しない限り、野生型ＭＢＮＬポリペプチド（例えば、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２、またはＭＢＮＬ３）の種々のスプライシングイソ型、断片、バリアント、融合タンパク質、および修飾形態が含まれる。かかるＭＢＮＬポリペプチドのイソ型、断片、バリアント、融合タンパク質、および修飾形態は、未変性のＭＢＮＬタンパク質と実質的に配列が同一のアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、少なくとも２つの亜鉛フィンガーモチーフを保持する。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片、バリアント、または融合タンパク質は、ＭＢＮＬ１ポリペプチド（例えば、配列番号１２〜１８）、ＭＢＮＬ２ポリペプチド（例えば、配列番号５５〜５６）、またはＭＢＮＬ３ポリペプチド（例えば、配列番号５７−５８）、またはその断片（例えば、配列番号５９）のうちのいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。任意の前述の一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片はＮ末端メチオニンを欠く。

【0178】

一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチド（ＭＢＮＬの断片など）は、少なくとも２つの亜鉛フィンガーモチーフを含むが、４つを超えない亜鉛フィンガーモチーフを含む。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドは、全長ＭＢＮＬポリペプチドの少なくとも１つの天然の機能の活性が低く、この活性の減少を、例えば、ＭＢＮＬ断片に最も密接に連関する全長ＭＢＮＬポリペプチドとの比較（同一アッセイにおける）によって評価する。例えば、ＭＢＮＬポリペプチドがＭＢＮＬ１ポリペプチドの断片である場合、全長ＭＢＮＬ１ポリペプチド（断片に最も密接に連関する全長ＭＢＮＬポリペプチドなど）と比較することができる。

【0179】

ここおよび本明細書中の他の場所において、配列同一性は、配列をアラインメントし、配列全体について同一率を最大にすることが必要な場合は配列同一性の一部としていかなる保存的置換を考慮せずにギャップを導入した後に候補配列中の残基が比較される対応配列の残基と同一である比率をいう。一定の実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端の伸長や挿入による同一性または相同性の低下を考慮しないであろう。

【0180】

配列のアラインメントおよび同一率の計算のための方法およびコンピュータプログラムは当該分野で周知であり、容易に利用可能である。配列同一性を、配列解析ソフトウェアを使用して測定することができる。例えば、ＥｘＰａｓｙバイオインフォマティクスリソースポータルから利用可能なアラインメントおよび解析ツール（ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム）のパラメータをデフォルトに設定する。ペアワイズアラインメントまたは大域アラインメントに基づいた適切な配列アラインメントおよび比較を容易に選択することができる。配列同一率および配列類似率の決定に適切なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析用ソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に利用可能である。一定の実施形態では、特定のプログラム用の現在のデフォルト設定を、配列のアラインメントおよび同一率の計算のために使用する。

【0181】

ＭＢＮＬポリペプチドの構造および種々のモチーフは、当該分野で公知である（例えば、Ｋｉｎｏら，２００４，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３：４９５−５０７を参照のこと）。一定の実施形態では、本明細書中に記載のポリペプチドは、ＭＢＮＬポリペプチドの断片を含む。一定の特定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、Ｃ末端の一部を欠く。任意選択的に、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、４つ全ての亜鉛フィンガーモチーフを含む。他の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、４つ未満の亜鉛フィンガーモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬ１ポリペプチドの断片は、１、２、または３つの亜鉛フィンガーモチーフを含み、任意選択的に、４つの亜鉛フィンガーモチーフを含まない。特定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、２つの亜鉛フィンガーモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、第２の亜鉛フィンガーモチーフと第３の亜鉛フィンガーモチーフとの間のアミノ酸配列の少なくとも一部を欠く。特定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、配列番号１２のアミノ酸７３〜１７８に対応するアミノ酸の少なくとも一部を欠く。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、少なくとも２つの亜鉛フィンガーモチーフを含むが、４つ全てより少ない亜鉛フィンガーモチーフを含む。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、全長ＭＢＮＬポリペプチドと比較した場合および比較して、および／または４つ全ての亜鉛フィンガーモチーフを含むＭＢＮＬポリペプチドと比較して少なくとも１つの機能活性が減少している。かかる機能活性の比較は、同一のアッセイで行われるであろう。一定の実施形態では、ＭＢＮＬの断片は、その機能活性に関して、ドミナントネガティブとして機能する。

【0182】

一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、天然に存在するＭＢＮＬポリペプチドが短縮されている。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、Ｅｄｇｅら，２０１３，ＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（２９）：１−１６およびＧｒａｍｍａｔｉｋａｋｉｓら，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（７）：２７６９−２７８０に記載の任意のＭＢＮＬ断片（例えば、配列番号１２のアミノ酸残基４１〜３８２、８１〜３８２、１２１〜３８２、１６１〜３８２、２０１〜３８２、２４１〜３８２、１〜３４２、１〜３０２、１〜２６２、１〜２２２、１〜１８２、１〜１４２、１〜１０２、２〜１８３、２〜１１６、２〜１０２、２〜９１、２〜７２、７３〜１８３、７３〜２５３、１１６〜２５３、または１８４〜２５３のうちのいずれかを含むＭＢＮＬポリペプチドの断片）（それぞれ本明細書中で参考として組み込まれる）を含む。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、配列番号１２〜１８または５５〜５８のいずれかの残基１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、１〜１００、１〜１１０、１〜１２０、１〜１３０、１〜１４０、１〜１５０、１〜１６０、１〜１７０、１〜１８０、１〜１９０、１〜２００、１〜２１０、１〜２２０、１〜２３０、もしくは１〜２４０、または前述の任意の断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一のバリアントを含む（または含まない）。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、配列番号１２または１３の残基１〜１１６を含む。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９に記載のアミノ酸配列と比較して対応する位置に１、２、３、または４つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、配列番号１２〜１８または５５〜５８のいずれかの残基７５〜２４０、８０〜２４０、９０〜２４０、１００〜２４０、１１０〜２４０、１２０〜２４０、１３０〜２４０、１４０〜２４０、もしくは１５０〜２４０、または前述の任意の断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一のそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬ断片は、本明細書中に記載の任意の断片のＮ末端またはＣ末端の少なくとも１、２、３、４、または５つのアミノ酸残基を欠く。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬ断片は、配列番号１２または１３の残基２〜１１６、３〜１１６、４〜１１６、５〜１１６、１〜１１５、１〜１１４、１〜１１３、１〜１１２、１〜１１１、２〜１１５、３〜１１５、２〜１１４、もしくは３〜１１４に対応するアミノ酸配列、または前述の任意の断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一のそのバリアントを含む。

【0183】

一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたは断片は、ＣＵＧ反復に結合する（例えば、ＣＵＧ反復に結合することが可能であり；ＣＵＧ反復に結合することができ；ＣＵＧがＣＵＧ反復として存在する場合にＣＵＧに結合することができる）。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片はＣＵＧ反復に結合する。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片を含む本開示のポリペプチドは、エクソンスプライシングを制御し、および／または異常なスプライシングを救出する。

【0184】

いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、４つ全ての亜鉛フィンガーモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、配列番号１２〜１８または５５〜５８のいずれかの残基１〜２５０、１〜２６０、１〜２７０、１〜２８０、１〜２９０、１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３５０、または１〜３６０を含む。特定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、配列番号１２または１３の残基１〜２５２または１〜２５３を含む。特定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、配列番号１３の残基１〜２５３を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬ断片は、本明細書中に記載の任意の断片のＮ末端および／またはＣ末端の少なくとも１、２、３、４、または５個のアミノ酸を欠く。一定の実施形態では、他のＭＢＮＬポリペプチド（例えば、ＭＢＮＬ２または３）由来の類似の機能的断片を使用することができる。一定の実施形態では、分子量が約４０ｋＤである他のＭＢＮＬポリペプチド由来の類似の機能的断片を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬペプチドまたはその断片の分子量を、当該分野で日常的に使用される任意の方法（例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を使用して決定することができる。

【0185】

一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、少なくとも２つの亜鉛フィンガーモチーフを含むが、４つ全てより少ない亜鉛フィンガーモチーフを含む。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、全長ＭＢＮＬポリペプチドと比較した場合および比較して、および／または４つ全ての亜鉛フィンガーモチーフを含むＭＢＮＬポリペプチドと比較して少なくとも１つの機能活性が減少している。かかる機能活性の比較は、同一のアッセイで行われるであろう。一定の実施形態では、ＭＢＮＬの断片は、その機能活性に関して、ドミナントネガティブとして機能する。一定の実施形態では、機能活性はスプライシング活性であり、ＭＢＮＬの断片のスプライシング活性は、全長ＭＢＮＬポリペプチドの未変性のスプライシング活性より低い。一定の実施形態では、コンジュゲート中に存在する断片に最も密接に連関する全長ＭＢＮＬポリペプチドと比較する（例えば、ＭＢＮＬポリペプチドがＭＢＮＬ１ポリペプチドの断片である場合、未変性の全長ＭＢＮＬ１ポリペプチドを使用する）。

【0186】

一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片（本明細書中に記載の任意の断片など）は、配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかに記載のＭＢＮＬポリペプチドの対応部分と比較して１、２、３、４、または５つのアミノ酸の変化（置換、欠失、付加）を含む。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片（本明細書中に記載の任意の断片など）は、配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかに記載のＭＢＮＬポリペプチドの対応部分と比較して１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換（独立して保存的なまたは非保存的な置換）を含む。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片（本明細書中に記載の任意の断片など）は、１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換（独立して保存的なまたは非保存的な置換）を含み、少なくとも１つの置換が配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかに記載のＭＢＮＬポリペプチドの対応部分と比較して保存的置換である。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片は、１つの置換（配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかに記載のＭＢＮＬポリペプチドの対応部分と比較した保存的置換など）を含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片は、野生型ＭＢＮＬポリペプチド（例えば、配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するＭＢＮＬポリペプチド（ＭＢＮＬ１ポリペプチド（配列番号１２〜１８のうちのいずれかのアミノ酸配列を有する（配列番号１３のアミノ酸配列を有するなど）全長ＭＢＮＬポリペプチドなど）など）の少なくとも１つの同一の生物学的活性を有する。用語「生物学的活性」、「生物活性」、または「機能的」は、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片が野生型ＭＢＮＬタンパク質に関連する少なくとも１つの機能（例えば、細胞中でのエクソンスプライシングの制御）を実施する能力、および／またはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列中のＹＧＣＹモチーフに結合する能力を意味する。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたは断片は、ＣＵＧ反復に結合する（例えば、ＣＵＧ反復に結合することが可能である；ＣＵＧ反復に結合することができる）。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片は、ＣＵＧ反復に結合する。用語「生物学的活性」、「生物活性」、および「機能的」を、本明細書中で互換的に使用する。

【0188】

用語「能力を有する」または「可能である」は、列挙したポリペプチドが適切な条件下で（例えば、生理学的条件下または標準的な実験条件下で）記載の生物活性を実行することを意味する。一定の実施形態では、用語「できる」を、この能力を説明するために使用することができる（例えば、所与の配列に「結合できる」または「結合する」）。例えば、ＭＢＮＬポリペプチドがＣＵＧモチーフを結合する能力を有するか、結合することが可能である場合、ＭＢＮＬポリペプチドは、ＣＵＧモチーフを有するポリヌクレオチドの存在下および通常の生理学的条件下でＣＵＧモチーフに結合するであろう。当業者は、ポリペプチドが列挙した生物活性を実施する能力を有するか実施することが可能であるかどうかを試験するためにどの条件が必要であるかを理解するであろう。

【0189】

一定の実施形態では、本明細書中に記載されるように、ＭＢＮＬタンパク質または生物学的活性を有するその断片は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中のコンセンサス結合部位に結合する能力を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のコンセンサス結合部位は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列中のＣＵＧモチーフ（Ｗａｒｆ、２００７、ＲＮＡ、１２：２２３８−５１）および／またはＹＧＣＹモチーフ（例えば、ＵＧＣＵモチーフ）である。他の実施形態では、ＭＢＮＬタンパク質または生物学的活性を有するその断片は、ＣＡＧモチーフに結合する能力を有する（Ｈｏ、２００５、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１８：２９２３−２９３３）。他の実施形態では、ＭＢＮＬタンパク質または生物学的活性を有するその断片は、ＣＵＧ、ＣＡＧ、ＣＣＵＧ、ＣＣＧ、ＣＧＧ、および／またはＵＧＣＵＧＵモチーフのうちの１つまたは複数に結合する能力を有する。本明細書において用いる場合、「断片」は、本明細書に記載するような「生物活性」を示す生物活性断片（機能性断片とも呼ばれる）または生物活性変異体を含むと解される。すなわち、ＭＢＮＬの生物活性断片またはバリアントは、測定および試験することができる生物活性を示す。いくつかの実施形態では、生物活性断片／機能的断片またはバリアントは、未変性の（すなわち、野生型または通常の）ＭＢＮＬタンパク質と同一または実質的に同一の生物活性を示し、かかる生物活性を、断片またはバリアントが、（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで評価した場合に）ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列中のＹＧＣＹモチーフ（例えば、ＵＧＣＵモチーフ）に結合する能力によって評価することができる。本明細書において用いる場合、「実質的に同じ」は、対照（これに対してパラメータを測定する）の少なくとも７０％である任意のパラメータ（例えば、活性）を指す。ある一定の実施形態において、「実質的に同じ」は、同じまたは実質的に同じ条件下で評定したとき、対照（これに対してパラメータを測定する）の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０２％、１０５％または１１０％である任意のパラメータ（例えば、活性）も指す。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片またはバリアントは、未変性ＭＢＮＬポリペプチドに関連する少なくとも１つのＭＢＮＬ生物学的活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を保持する。

【0190】

一定の実施形態では、本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬポリペプチドの任意の断片またはバリアントは、全長未変性（すなわち、野生型または通常の）ＭＢＮＬポリペプチド（例えば、配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するＭＢＮＬポリペプチド）の１つの生物学的活性を保持し得るが、野生型または通常のＭＢＮＬポリペプチド（例えば、配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するＭＢＮＬポリペプチド）と比較して別の生物学的活性を欠くかそのレベルが減少している。一定の実施形態では、全長ＭＢＮＬ１ポリペプチド（配列番号１２〜１８のうちのいずれかのアミノ酸配列（配列番号１３のアミノ酸配列など）を有する全長ＭＢＮＬポリペプチドなど）と比較する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片は、（例えば、ＹＧＣＹモチーフへの結合によって）ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドに結合することが可能であるが、全長未変性（すなわち、野生型または通常の）ＭＢＮＬポリペプチド（例えば、配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するＭＢＮＬポリペプチド）と比較してｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングの制御効率が低い（例えば、活性が低い）。一定の実施形態では、全長ＭＢＮＬ１ポリペプチド（配列番号１２〜１８のうちのいずれかのアミノ酸配列（配列番号１３のアミノ酸配列など）を有する全長ＭＢＮＬポリペプチドなど）と比較する。いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片は、野生型または通常のＭＢＮＬポリペプチドと比較してｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングの制御効率が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低い。いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片は、全長ＭＢＮＬポリペプチドと比較してｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングの制御が不可能である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のいずれかのＭＢＮＬポリペプチドは、「ドミナントネガティブ」ＭＢＮＬポリペプチドとして作用し得る（例えば、ＭＢＮＬポリペプチドは、野生型または通常のＭＢＮＬポリペプチド（例えば、配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するＭＢＮＬポリペプチド）とＲＮＡ結合部位（例えば、ＹＧＣＹモチーフ）への結合を競合することが可能であるが、野生型または通常のＭＢＮＬポリペプチドと比較して、ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングの制御が不可能であるか効率が低い）。一定の実施形態では、全長ＭＢＮＬ１ポリペプチド（配列番号１２〜１８のうちのいずれかのアミノ酸配列（配列番号１３のアミノ酸配列など）を有する全長ＭＢＮＬポリペプチドなど）と比較する。

【0191】

一定の実施形態では、本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬポリペプチドの断片またはバリアントの半減期（ｔ_１／２）は、未変性タンパク質の半減期と比較して高い。好ましくは、ＭＢＮＬ断片またはバリアントの半減期は、未変性ＭＢＮＬタンパク質の半減期と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、もしくは５００％、またはさらに１０００％増加している。。一部の実施形態では、前記タンパク質半減期をインビトロで、例えば、緩衝食塩溶液中または血清中で判定する。他の実施形態において、前記タンパク質半減期は、インビボ半減期、例えば、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減期である。加えて、断片または変異体を当該技術分野において公知の技術、例えば、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃケミストリーを用いて化学合成することができる。前記断片または変異体を（組換えによりまたは化学合成によって）生産し、試験して、ネイティブＭＢＮＬタンパク質と同程度にまたは実質的に同様に機能することができる断片または変異体を同定することができる。

【0192】

本明細書中に記載の任意のポリペプチドの投与または本明細書中に記載の任意のポリペプチドとの細胞の接触に基づいた記載の方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞中または培養物中）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、患者中または動物モデル中）で行うことができる。一定の実施形態では、方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。一定の実施形態では、方法はｉｎ ｖｉｖｏ法である。

【0193】

一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドの断片またはバリアントを、ＭＢＮＬポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えによって産生されたポリペプチドのスクリーニングによって得ることができる。加えて、当該技術分野において公知の技術、例えば、従来のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃケミストリーを用いて、断片または変異体を化学合成することができる。断片または変異体を（組換えによりまたは化学合成によって）生産し、試験して、例えば、グリコーゲンを加水分解する、および／またはポンペ病の症状を処置するそれらの能力を試験することにより、所望の機能を有する断片または変異体を同定することができる。機能活性の減少を、所与のアッセイにおいて全長未変性ＭＢＮＬポリペプチド（配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかに記載のポリペプチドなど）と比較して測定することができる。一定の実施形態では、ＭＢＮＬ１ポリペプチドの断片を評価する場合、（例えば、ＭＢＮＬ３ポリペプチドに対するよりもむしろ）全長未変性ＭＢＮＬ１ポリペプチドに対するその機能を評価する。一定の実施形態では、全長ＭＢＮＬ１ポリペプチド（配列番号１２〜１８のうちのいずれかのアミノ酸配列（配列番号１３のアミノ酸配列など）を有する全長ＭＢＮＬポリペプチドなど）と比較する。

【0194】

一定の実施形態では、本開示は、治療有効性もしくは予防有効性または安定性（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ貯蔵期間およびｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解耐性）の向上などの目的のためのＭＢＮＬポリペプチドの構造の改変を意図する。かかる改変されたＭＢＮＬポリペプチドは、天然に存在するＭＢＮＬポリペプチドの機能的等価物と見なされる。修飾ポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加によって生産することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、トレオニンのセリンでの孤立した置換、またはアミノ酸の構造的関連性のあるアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的突然変異）が、結果として得られる分子のＭＢＮＬ生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないことを、例えば予想することは、理に適っている。保存的置換は、それらの側鎖において関連性のあるアミノ酸のファミリー内で起こるものである。

【0195】

一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたは断片（例えば、上記の任意のポリペプチドまたは断片）は、野生型または通常のＭＢＮＬポリペプチドのバリアントまたはその断片であり、ＭＢＮＬポリペプチドバリアントは、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸残基７３〜１７８に対応するアミノ酸残基中に少なくとも１つのアミノ酸の変化（例えば、欠失、挿入、置換）を有する。一定の実施形態では、バリアントは、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸残基７３〜１７８に対応するアミノ酸残基中に１、２、３、４、または５つのアミノ酸の変化（例えば、欠失、挿入、置換）を有する。一定の実施形態では、バリアントは、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸残基７３〜１７８に対応するアミノ酸残基中に１つのアミノ酸置換を有する。別の実施形態では、バリアントは、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸残基７３〜１７８に対応するアミノ酸残基中に１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する。一定の実施形態では、バリアントは、配列番号１２または配列番号１３の残基１２７に対応するアミノ酸残基中にアミノ置換を有する。一定の実施形態では、変化は置換である。一定の実施形態では、置換は、保存的置換および非保存的置換から独立して選択される。一定の実施形態では、少なくとも１つの置換は保存的置換である。一定の実施形態では、全ての置換は保存的置換である。一定の実施形態では、１２７位の置換は保存的置換である。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたは断片は、配列番号１２または１３の１２７位に対応する位置にＮからセリンへの置換を含む。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたは断片は、配列番号１２または１３の１２７位に対応する位置にセリンを含む。

【0196】

いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドまたはＭＢＮＬポリペプチドのバリアントは、ＲＮＡ（例えば、ＹＧＣＹモチーフへの結合によって）に結合することが可能であるが、野生型または通常のＭＢＮＬポリペプチド（例えば、配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するＭＢＮＬポリペプチド）と比較してｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングの制御効率が低い。いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドは異常スプライシングを救済する。

【0197】

いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチド（例えば、断片）は、減少したか、喪失したか、不適切なニューロフィブロミン活性を置換、修復、または増強することができる。

【0198】

本開示は、ＭＢＮＬポリペプチドの組み合わせ変異体組および短縮変異体の生成をさらに意図し、本開示は、機能的バリアント配列の同定に特に有用である。天然に存在するＭＢＮＬポリペプチドと比較して選択的な効力を有する組み合わせ由来バリアントを生成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドを、配列番号１２〜１８または５５〜５８のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するＭＢＮＬポリペプチドよりも高い親和性でポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列中のＹＧＣＹに結合するように変異させることができる。同様に、変異誘発により、対応する野生型ＭＢＮＬポリペプチドと劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じ得る。例えば、タンパク質の変化により、目的のタンパク質（例えば、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２、もしくはＭＢＮＬ３、またはその断片）を破壊するか不活化させるタンパク質分解または他の細胞過程に対してより安定にするか不安定にすることができる。かかるバリアントを、半減期の調整によってＭＢＮＬポリペプチドレベルを変化させるために利用することができる。可能性のあるＭＢＮＬ変異体配列のライブラリーを、例えば縮重オリゴヌクレオチド配列から、生成することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成装置で行い、その後、合成遺伝子を発現のために適切な遺伝子にライゲートすることができる。縮重遺伝子セットの目的は、可能性のあるポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列すべてを１つの混合物で提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ．２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。かかる技術は、他のタンパク質の定向進化に活用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号明細書を参照されたい）。

【0199】

あるいは、他の変異誘発形態を、組み合わせライブラリーの生成のために利用することができる。例えば、ＭＢＮＬポリペプチドバリアントを生成し、例えば、アラニンスキャニング変異誘発など（Ｒｕｆら，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら，（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら，（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）、リンカースキャニング変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎら，（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら，（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）；飽和変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓら，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）；ＰＣＲ変異誘発（Ｌｅｕｎｇら，（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１−１９）；またはランダム変異誘発（化学的変異誘発などが含まれる）（Ｍｉｌｌｅｒら，（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら，（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３４）を使用したスクリーニングによってライブラリーから単離することができる。特に組み合わせにおけるリンカースキャニング変異誘発は、ＭＢＮＬポリペプチド（例えば、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２、またはＭＢＮＬ３）の短縮形態の魅力的な同定方法である。ＭＢＮＬポリペプチドの特異的変異誘発実験の例を、Ｅｄｇｅら，２０１３，ＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（２９）：１−１６およびＧｒａｍｍａｔｉｋａｋｉｓら，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（７）：２７６９−２７８０（それぞれ、本明細書中で参考として組み込まれる）に見出すことができる。

【0200】

点突然変異およびトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ついでに言えば、ある一定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が当該技術分野において公知である。かかる技術は、一般に、ＭＢＮＬポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応させることができるであろう。最も広範に使用されている巨大遺伝子ライブラリーのスクリーニング技術は、典型的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターライブラリーを使用した適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出により遺伝子産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が比較的容易な条件下での組み合わせ遺伝子の発現を含む。下記のそれぞれのアッセイの例を、組み合わせ変異誘発技術によって作製された多数の縮重配列をスクリーニングすることが必要な高処理分析に利用可能である。

【0201】

ある一定の実施形態において、ＭＢＮＬポリペプチドは、ペプチドおよびペプチドミメティックを含むことがある。本明細書において用いる場合、用語「ペプチドミメティック」は、天然に存在しないアミノ酸、ペプトイドなどを含有する化学修飾ペプチドおよびペプチド様分子を含む。ペプチドミメティックは、被験体に投与されたとき、向上された安定性をはじめとするペプチドに対する様々な利点を提供する。ペプチドミメティックを同定するための方法は当該技術分野において周知であり、可能性のあるペプチドミメティックのライブラリーを収録しているデータベースのスクリーニングを含む。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅは、結晶構造が判っている３００，０００を超える化合物のコレクションを収録している（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｂ、３５：２３３１（１９７９））。標的分子の結晶構造を入手できない場合、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を使用して構造を作成することができる。もう１つのデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ Ｃａｌｉｆ．）は、市販されている約１００，０００の化合物を収録しており、このデータベースを検索して、ＭＢＮＬポリペプチドについての可能性のあるペプチドミメティックを同定することもできる。

【0202】

一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含むことができる。例示的な翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が含まれる。結果として、修飾されたＭＢＮＬポリペプチドは、非アミノ酸エレメント（脂質、ポリサッカリドまたはモノサッカリド、およびリン酸塩など）を含み得る。ＭＢＮＬポリペプチドの機能に及ぼすかかる非アミノ酸エレメントの影響を、その生物学的活性について試験することができる。一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、および／または精製のうちの１つまたは複数を向上させる１つまたは複数のポリペプチド部分をさらに含み得る。他の実施形態では、ターゲティング部分は、抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0203】

本開示の１つの特定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドを、非タンパク質性ポリマーで改変することができる。１つの特定の実施形態において、前記ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号明細書に示されているように、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。ＰＥＧは周知の水溶性ポリマーであり、このポリマーは、市販されており、または当該技術分野において周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第３巻、１３８−１６１頁）。

【0204】

いくつかの態様では、本開示はまた、本明細書中に記載のように、前述の任意のポリペプチド（例えば、本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬポリペプチドまたはＭＢＮＬコンジュゲート）の産生方法を提供する。さらに、本開示は、前述の方法および組成物の多くの組み合わせを意図する。

【0205】

一定の態様では、ＭＢＮＬポリペプチドは、１つまたは複数の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であり得る。かかる融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるがこれらに限定されず、これらはアフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティー精製を目的として、アフィニティークロマトグラフィーのための適切なマトリックス、例えば、グルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、およびニッケル結合樹脂またはコバルト結合樹脂を使用する。融合ドメインは「エピトープタグ」も含み、エピトープタグは、通常、特異的抗体が利用可能である短鎖ペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能である周知エピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、Ｈｉｓ、およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。例示的なＨｉｓタグは配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号４７）を有し、例示的なｃ−ｍｙｃタグは配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４８）を有する。場合によっては、前記融合ドメインは、適切なプロテアーゼに融合タンパク質を部分的に消化させ、それによってそれらから組換えタンパク質を遊離させるプロテアーゼ切断部位、例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンについてのプロテアーゼ切断部位を有する。その後、遊離されたタンパク質を後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる。ある一定の実施形態において、前記ＭＢＮＬポリペプチドは、それらのポリペプチドを安定化することが可能である１つ以上の修飾を含むことがある。例えば、かかる修飾は、前記ポリペプチドのインビトロ半減期を向上させるか、前記ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、または前記ポリペプチドのタンパク質分解を低減させる。

【0206】

一定の実施形態では、ＭＢＮＬポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを含んでも含まなくても良い。

【0207】

本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬポリペプチドおよびその断片を、本開示のコンジュゲートで使用することができる。本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬポリペプチドおよび断片を、上記または下記の任意の構造および／または機能的特徴を使用して説明することができる。例えば、本開示は、本明細書中に記載のように、上記または本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬポリペプチドおよびその断片を内在化部分とコンジュゲート化することができる（相互接続する；会合する；化学的コンジュゲート化によるか融合タンパク質の一部として）ことを意図する。任意のかかるコンジュゲートを、本明細書中に記載の任意の方法で使用することができ、薬学的組成物などの組成物として製剤化することができる。一定の実施形態では、本開示のコンジュゲートをＭＢＮＬ部分または内在化部分の一部の一方または両方の機能的特徴に基づいて説明することもでき、したがって、上記の任意の機能的特徴を使用することができる。

【0208】

本開示は、適切な複合体または融合タンパク質がいずれかの方向で存在し得ることを意図する。換言すれば、内在化部分の一部は、ＭＢＮＬポリペプチドまたは生物活性断片のＮ末端側またはＣ末端側に存在し得る。非限定的な具体例を本明細書中に提供する。
Ｂ．タンパク質補充療法に適切なタンパク質欠乏症またはタンパク質障害

【0209】

異種薬剤の第２のカテゴリーは、タンパク質欠乏症の処置または研究に適切な薬剤（タンパク質補充療法の提供に適切な薬剤など）である。いくつかの実施形態では、タンパク質は酵素である。一般に、このカテゴリーにおける異種薬剤は、欠乏タンパク質（例えば、酵素）を補充するためのタンパク質である。当該分野でタンパク質（例えば、酵素）欠乏症の例は多数存在する（ポンペ病、ゴーシェ病、および筋細管筋障害が含まれる）。タンパク質（例えば、酵素）欠乏症の場合、欠損しているか活性が不十分なタンパク質（例えば、酵素）は典型的には公知であり、このタンパク質を有効に補充ことを可能にすることが最大の難関である。有効量のタンパク質を適切な細胞型内に送達することが困難であるので、これは多くの例で困難であることが証明されている。これらのタンパク質（例えば、酵素）は、細胞または動物中の疾患の研究または治療のためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの送達のために本開示の抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化することができる異種薬剤を意味する。タンパク質（例えば、酵素）欠乏症の処置または研究に適切な異種薬剤の少数の具体例を以下に提供する。これらは例示のみを目的とし、他のタンパク質（酵素など）を同様に提供することができる。さらなる酵素の例には、キナーゼ、ホスファターゼ、およびリコンビナーゼなどが含まれる。

【0210】

いくつかの実施形態では、異種薬剤は、ＭＴＭ１ポリペプチドまたはその機能的断片である。異種薬剤として使用することができるＭＴＭ１ポリペプチド、ならびにその断片、変異体、およびバリアントの詳細な説明を、ＰＣＴ出願ＷＯ ２０１０／１４８０１０号（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、ＭＴＭポリペプチドを、ユニバーサルキャリアシステムにおいてかまたは化学的コンジュゲート化によって融合タンパク質として本開示のヒト化抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化する。

【0211】

本明細書中で使用する場合、本明細書中に記載の方法および組成物で用いるＭＴＭ１ポリペプチドには、野生型ＭＴＭ１ポリペプチドの種々のスプライシングイソ型、融合タンパク質、および修飾形態が含まれる。一定の実施形態では、ＭＴＭ１ポリペプチドの生物活性断片、バリアント、または融合タンパク質は、ＭＴＭ１ポリペプチド（配列番号１１に記載のＭＴＭ１ポリペプチドなど）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。本明細書中で使用する場合、「断片」は、本明細書中に記載の「生物活性」を示す生物活性断片または生物活性バリアントが含まれると理解される。すなわち、ＭＴＭ１の生物活性断片またはバリアントは、測定および試験することができる生物活性を示す。例えば、生物活性断片またはバリアントは、未変性の（すなわち、野生型、すなわち通常の）ＭＴＭ１タンパク質と同一または実質的に同一の生物活性を示し、かかる生物活性を、断片またはバリアントが、例えば、当該分野で公知の内因性ホスホイノシチド基質（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（すなわち、ホスホイノシチドホスファターゼ活性）のための人工ホスホイノシチド基質）を切断または加水分解し、他のタンパク質（例えば、ＧＴＰアーゼＲａｂ５、ＰＩ３−キナーゼＶｐｓ３４またはＶｐｓ１５（すなわち、適切な局在化）など）を動員し、そして／またはこれらのタンパク質に会合するか、筋細管筋障害を処置する能力によって評価することができる。これらの基準のいずれかを評価する方法を本明細書中に記載する。

【0212】

ＭＴＭ１ポリペプチドの構造および種々のモチーフは、当該分野で十分に特徴づけられている（例えば、Ｌａｐｏｒｔｅら，２００３，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２（２）：Ｒ２８５−Ｒ２９２；Ｌａｐｏｒｔｅら，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：３１０５−３１１７；Ｌｏｒｅｎｚｏら，２００６，１１９：２９５３−２９５９を参照のこと）。そのようなものとして、一定の実施形態では、ＭＴＭ１ポリペプチドの種々の生物活性断片またはバリアントをデザインし、例えば、ＭＴＭ１ポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えによって作製されたポリペプチドのスクリーニングによって同定することができる。例えば、ＭＴＭ１のいくつかのドメインは、そのホスファターゼの活性または局在化に重要であることが示されている。例示のために、これらのドメインには、以下が含まれる：グルコシルトランスフェラーゼ、Ｒａｂ様ＧＴＰアーゼアクチベーターおよびミオチューブラリン（Ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ）（ＧＲＡＭ；配列番号１１のアミノ酸２９〜９７位または１６０位まで）、Ｒａｃ誘導性動員ドメイン（ＲＩＤ；配列番号１１のアミノ酸１６１〜２７２位）、ＰＴＰ／ＤＳＰ相同性（配列番号１１のアミノ酸２７３〜４７１位；触媒性システインは、配列番号１１のアミノ酸３７５である）、およびＳＥＴ相互作用ドメイン（ＳＩＤ；配列番号１１のアミノ酸４３５〜４８６位）。したがって、未変性ＭＴＭ１と同一または実質的に同一の生物活性を示すＭＴＭ１の断片またはバリアントを同定するために、かかるドメインの任意の組み合わせを構築することができる。適切な生物活性断片をコンジュゲート作製のために使用することができ、かかるコンジュゲートを、本明細書中に記載の任意の方法で使用することができ、そして／または本開示の抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化することができる。

【0213】

コンジュゲート（例えば、（ｉｉ）異種薬剤に会合した（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片を含むコンジュゲート）の一部として使用することができる例示的な断片には、例えば、配列番号１１の約残基２９〜４８６が含まれる。したがって、一定の実施形態では、コンジュゲートは、配列番号１１の残基２９〜４８６を含む（例えば、本開示の抗体または抗原結合断片を、配列番号１１の残基２９〜４８６を含むかこれらの残基からなるポリペプチドに会合する）。

【0214】

一定の実施形態では、コンジュゲートのＭＴＭ１部分は、ヒトＭＴＭ１配列に対応する。例えば、コンジュゲートのＭＴＭ１部分は、配列番号１１と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0215】

さらに、断片またはバリアントを、当該分野で公知の技術（従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学など）を使用して化学合成することができる。断片またはバリアントを、（組換えまたは化学合成によって）産生し、例えば、内因性ホスホイノシチド基質または合成ホスホイノシチド基質を切断または加水分解するか（すなわち、ホスホイノシチドホスファターゼ活性）、他のタンパク質（例えば、ＧＴＰアーゼＲａｂ５、ＰＩ３−キナーゼｈＶｐｓ３４、またはｈＶｐｓ１５など）を動員し、そして／または会合するか（すなわち、適切な局在化）、筋細管筋障害を処置する能力を試験することによって、未変性のＭＴＭ１タンパク質のように機能するか、実質的に同様に機能することができる断片またはバリアントを同定するために試験することができる。

【0216】

一定の実施形態では、ＭＴＭ１ポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含むことができる。例示的な翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が含まれる。結果として、修飾されたＭＴＭ１ポリペプチドは、非アミノ酸エレメント（脂質、ポリサッカリドまたはモノサッカリド、およびリン酸塩など）を含み得る。ＭＴＭ１ポリペプチドの機能に及ぼすかかる非アミノ酸エレメントの影響を、その生物学的活性（例えば、筋細管筋障害を処置する能力またはホスホイノシチド（例えば、ＰＩＰ３）を切断する能力）について試験することができる。未変性ＭＴＭ１ポリペプチドがグリコシル化されることを考慮すると、一定の実施形態では、本開示のコンジュゲートで使用されるＭＴＭ１ポリペプチドをグリコシル化する。一定の実施形態では、グリコシル化のレベルおよびパターンは、未変性ＭＴＭ１ポリペプチドと同一であるか、実質的に同一である。他の実施形態では、グリコシル化のレベルおよび／またはパターンは、未変性ＭＴＭ１ポリペプチドと異なる（例えば、不十分にグリコシル化されているか、過剰にグリコシル化されている、グリコシル化されていない）。

【0217】

本開示の１つの特定の実施形態では、ＭＴＭ１ポリペプチドを、非タンパク質性ポリマーで改変することができる。１つの特定の実施形態では、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に記載の様式で、ポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。ＰＥＧは、周知の水溶性ポリマーであり、市販されているか、当該分野で周知の方法に従ったエチレングリコールの開環重合（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ １３８−１６１）によって調製することができる。

【0218】

一定の実施形態では、ＭＴＭ１ポリペプチドの断片またはバリアントは、好ましくは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の未変性ＭＴＭ１ポリペプチドに関連する生物学的活性を保持するであろう。一定の実施形態では、ＭＴＭ１ポリペプチドの断片またはバリアントの半減期（ｔ１／２）は、未変性タンパク質の半減期と比較して高い。半減期が高い実施形態について、ＭＴＭ１断片またはバリアントの半減期は、未変性ＭＴＭ１タンパク質の半減期と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または５００％、またはさらに１０００％高い。いくつかの実施形態では、タンパク質半減期を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（緩衝化生理食塩水中または血清中などで）決定する。他の実施形態では、タンパク質半減期は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期（血清中または他の動物の体液中のタンパク質の半減期など）である。同様に、任意の上記特徴を、コンジュゲートの文脈でＭＴＭ１について評価し、未変性ＭＴＭ１の特徴と比較することができる。

【0219】

一定の実施形態では、ＭＴＭ１ポリペプチドは、ポリペプチドを安定化することが可能である１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、かかる修飾は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期を向上させるか、ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。

【0220】

本開示は、（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片および（ｉｉ）ＭＴＭ１部分を含むコンジュゲートを意図し、ここで、ＭＴＭ１部分は、本明細書中に記載されるか、当該分野で公知の任意のＭＴＭ１ポリペプチド、断片、またはバリアントを含む。例示的なＭＢＮＬ１ポリペプチドを配列番号１１に記載し、本開示は、本明細書で用いる異種薬剤が、一定の実施形態では、上記の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または任意の断片もしくはバリアントであることを意図する。さらに、一定の実施形態では、任意の前述のコンジュゲートのＭＴＭ１部分は、一定の実施形態では、融合タンパク質であり得る。本明細書中に開示の任意のＭＴＭ１ポリペプチドを、異種薬剤として使用し、本開示の抗体または抗原結合断片と会合することができる（同時翻訳融合を介して化学的にコンジュゲート化または融合するなど）。

【0221】

本開示のコンジュゲートの任意の部分をエピトープタグおよびＰＥＧ部分などで同様に修飾することができることに留意すべきである。換言すれば、エピトープタグは、ＭＴＭ１および／または内在化部分に対するタグであり得る。さらに、コンジュゲートは、１つを超えるエピトープタグ（２つのエピトープタグなど）を含むことができるか、エピトープタグが０個であり得る。

【0222】

一定の態様では、ＭＴＭ１ポリペプチドは、１つまたは複数の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であり得、ここで、１つまたは複数の融合ドメインはＭＴＭ１ポリペプチドの精製を容易にする。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が含まれるが、これらに限定されず、これらはアフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製のために、アフィニティクロマトグラフィ用の連関マトリックス（グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケル、またはコバルトにコンジュゲート化した樹脂など）を使用する。融合ドメインは「エピトープタグ」も含み、これは、特異的抗体が利用可能な通常は短いペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。いくつかの場合、融合ドメインは、連関プロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それにより、融合タンパク質から組換えタンパク質が遊離する第Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位を有する。次いで、遊離したタンパク質を、その後のクロマトグラフィ分離によって融合ドメインから単離することができる。

【0223】

いくつかの実施形態では、ＭＴＭ１タンパク質は、ＭＴＭ１タンパク質の精製ための免疫グロブリンのＦｃ領域の全てまたは一部との融合タンパク質であり得る。

【0224】

一定の実施形態では、ＭＴＭ１ポリペプチドは、ポリペプチドを安定化することが可能である１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、かかる修飾は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期を向上させるか、ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。

【0225】

本開示は、適切な複合体（融合タンパク質など）がいずれかの方向で存在し得ることを意図する。換言すれば、内在化部分の一部は、ＭＴＭポリペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に存在し得る。

【0226】

ここでの、および本明細書中の他の箇所での、配列同一性は、候補配列を比較する対応配列の残基と同一である候補配列中の残基であって、配列全体について最大同一性パーセントを達成するために必要な場合には配列をアラインし、ギャップを導入した後の、そして一切の保存的置換を配列同一性の一部と見なさない、残基の百分率を指す。ＮまたはＣ末端伸長も挿入も、同一性または相同性を低下させるとみなさないものとする。

【0227】

配列のアラインメントおよび同一性パーセントの計算のための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知であり、容易に利用できる。配列解析ソフトウェアを使用して配列同一性を測定してもよい。例えば、デフォルトパラメータに設定された、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムなどの、ＥｘＰａｓｙバイオインフォマティクスリソースポータルを通して利用できるアラインメントおよび解析ツール。ペアワイズまたはグローバルアラインメントに基づく適切な配列アラインメントおよび比較を容易に選択することができる。配列同一性および配列類似性パーセントの決定に適しているアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手できる。ある一定の実施形態では、特定のプログラムの今の最新のデフォルト設定を配列のアラインメントおよび同一性パーセントの計算に使用する。
Ｃ．糖原貯蔵障害

【0228】

異種薬剤の第３のカテゴリーは、糖原貯蔵障害の処置または研究に適切な薬剤である。適切な異種薬剤には、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、および小分子が含まれる。糖原貯蔵障害分野に多数の例が存在する。多数のこれらの障害について、喪失もしくは欠失した酵素または疾患の他の原因は公知であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ（細胞もしくは動物内で疾患を研究するためまたは治療目的のいずれか）での送達のために本開示の抗体または抗原結合断片にコンジュゲート化することができる異種薬剤を示す。糖原貯蔵障害の処置または研究に適切な異種薬剤のいくつかの具体例を以下に提供する。
１．ＡＧＬポリペプチド

【0229】

いくつかの実施形態では、異種薬剤は、ＡＧＬポリペプチドまたはその機能的断片である。本明細書中で使用する場合、ＡＧＬポリペプチドには、野生型ＡＧＬポリペプチドの種々の機能的断片およびバリアント、融合タンパク質、ならびに修飾形態が含まれる。かかるＡＧＬポリペプチドの機能的断片またはバリアント、融合タンパク質、および修飾形態は、未変性ＡＧＬタンパク質と実質的に配列が同一のアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、未変性ＡＧＬタンパク質の機能を保持する（例えば、未変性ＡＧＬの２つの酵素活性を保持する）。「機能を保持する」は、いくつかの実施形態ではそうかもしれないが、特定の断片の活性が未変性タンパク質の活性と同一または実質的に同一でなければならないことを意味していないことに留意すべきである。しかし、元の活性を保持するために、元の活性は、同一または類似の条件下でかかる活性が比較される未変性タンパク質の活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるべきである。いくつかの実施形態では、元の活性の残存は、断片またはバリアントが、活性が比較される未変性タンパク質より改善された活性（例えば、同一または類似の条件下で比較して、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、または少なくとも１２５％）を有するシナリオであり得る。

【0230】

一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドの機能的断片、バリアント、または融合タンパク質は、ＡＧＬポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一（例えば、配列番号１９〜２１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）のアミノ酸配列を含む。

【0231】

一定の実施形態では、本開示のコンジュゲートおよび方法で用いるＡＧＬポリペプチドは、全長または実質的に全長のＡＧＬポリペプチドである。一定の実施形態では、本開示のコンジュゲートおよび方法で用いるＡＧＬポリペプチドは、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する機能的断片である。

【0232】

一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドの断片またはバリアントを、ＡＧＬポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えによって産生されたポリペプチドのスクリーニングによって得ることができる。さらに、断片またはバリアントを、当該分野で公知の技術（従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学など）を使用して化学合成することができる。断片またはバリアントを、（組換えまたは化学合成によって）産生し、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでフォーブス・コリ病を処置する能力の試験によって、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、無細胞アッセイまたは細胞ベースのアッセイで）で断片またはバリアントがアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有することを確認することによって、未変性ＡＧＬタンパク質として機能することができる断片またはバリアントを同定するために試験することができる。本明細書中に開示のＡＧＬポリペプチド活性を試験するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、ＡＧＬ含有コンジュゲートを使用するか使用しないでＦｏｒｂｅｓ−Ｃｏｒｉ細胞を処置し、次いで、インキュベーション後、例えば、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）色素の使用によってグリコーゲンの存在について細胞を染色することであろう。

【0233】

一定の実施形態では、本開示は、治療有効性もしくは予防有効性または安定性（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ貯蔵期間およびｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解耐性）の向上などの目的のためのＡＧＬポリペプチドの構造の改変を意図する。改変されたポリペプチドを、例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加によって産生することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単独置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単独置換、トレオニンのセリンとの単独置換、またはあるアミノ酸の構造的に連関するアミノ酸との類似の置換（例えば、保存的変異）が得られた分子のＡＧＬ生物学的活性に大きな影響を及ぼさないと予想することが妥当である。保存的置換は、その側鎖が連関するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。

【0234】

本開示は、ＡＧＬポリペプチドの組み合わせ変異体組および短縮変異体の生成をさらに意図し、本開示は、機能的バリアント配列の同定に特に有用である。天然に存在するＡＧＬポリペプチドと比較して選択的な効力を有する組み合わせ由来バリアントを生成することができる。同様に、変異誘発により、対応する野生型ＡＧＬポリペプチドと劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じ得る。例えば、タンパク質の変化により、ＡＧＬを破壊するか不活化させるタンパク質分解または他の細胞過程に対してより安定にするか不安定にすることができる。かかるバリアントを、半減期の調整によってＡＧＬポリペプチドレベルを変化させるために利用することができる。潜在的なＡＧＬバリアント配列のライブラリーを、例えば、縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することができる方法が多数存在する。縮重遺伝子配列を自動化ＤＮＡ合成機で化学合成し、次いで、合成遺伝子を発現用の適切な遺伝子にライゲーションすることができる。縮重遺伝子組の目的は、１つの混合物中に所望の潜在的なポリペプチド配列組をコードする全配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら，（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら，（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら，（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。かかる技術は、他のタンパク質の定向進化で使用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔら，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら，（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら，（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。

【0235】

あるいは、他の変異誘発形態を、組み合わせライブラリーの生成のために利用することができる。例えば、ＡＧＬポリペプチド変異体を生成し、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発などを用いるスクリーニング（Ｒｕｆら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）によって、リンカースキャニング突然変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎら、（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）によって、飽和突然変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）によって、ＰＣＲ突然変異誘発（Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１−１９）によって、または化学的突然変異誘発などを含むランダム突然変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら、（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３４）によって、ライブラリーから単離することができる。特にコンビナトリアル設定での、リンカースキャニング突然変異誘発は、トランケート（生物活性）形態のＡＧＬポリペプチドの魅力的な同定方法である。

【0236】

点変異および短縮によって作製された組み合わせライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング、および、さらには、一定の性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための広範な技術が当該分野で公知である。かかる技術は、一般に、ＡＧＬポリペプチドの組み合わせ変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応可能であろう。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広範に用いられている技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクターにクローニングするステップ、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換させるステップ、および所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を助長する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させるステップを典型的に含む。下で説明する実例となるアッセイの各々は、コンビナトリアル突然変異誘発技術によって作り出された多数の縮重配列をスクリーニングするために必要に応じて高スループット解析に適用できる。

【0237】

一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、ペプチド模倣物が含まれ得る。本明細書中で使用する場合、用語「ペプチド模倣物」には、天然に存在しないアミノ酸およびペプトイドなどを含む化学修飾されたペプチドおよびペプチド様分子が含まれる。ペプチド模倣物は、被験体に投与した場合にペプチドを超える種々の利点（安定性の向上が含まれる）を示す。ペプチド模倣物の同定方法は当該分野で周知であり、潜在的なペプチド模倣物のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングが含まれる。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅは、既知の結晶構造が知られている３００，０００種を超える化合物のコレクションを含む（Ａｌｌｅｎら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｂ，３５：２３３１（１９７９））。標的分子の結晶構造が利用できない場合、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を使用して構造を作成することができる。別のデータベースであるＡｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ Ｃａｌｉｆ．）は、有料で利用可能であり、ＡＧＬポリペプチドの潜在的なペプチド模倣物を同定するために検索することもできる約１００，０００種の化合物を含む。

【0238】

一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含むことができる。例示的な翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が含まれる。結果として、修飾されたＡＧＬポリペプチドは、非アミノ酸エレメント（脂質、ポリサッカリドまたはモノサッカリド、およびリン酸塩など）を含み得る。ＡＧＬポリペプチドの機能に及ぼすかかる非アミノ酸エレメントの影響を、その生物学的活性（例えば、グリコーゲンを加水分解するかフォーブス・コリ病を処置する能力）について試験することができる。一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、および／または精製のうちの１つまたは複数を向上させる１つまたは複数のポリペプチド部分をさらに含み得る。他の実施形態では、内在化部分は、抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0239】

いくつかの実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されていないか、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つまたは複数のＮ−グリコシル化基を欠く。例えば、本開示で用いるＡＧＬポリペプチドは、未変性ＡＧＬと比較して全てのＮ−グリコシル化部位を欠いていてよいか、本開示で用いるＡＧＬポリペプチドは、未変性ＡＧＬと比較して不十分にグリコシル化され得る。いくつかの実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位でＮ−グリコシル化が不可能な修飾アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＧＬポリペプチド中の少なくとも１つの予測されるＮ−グリコシル化部位（すなわち、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒによって示されるコンセンサス配列）のアスパラギン（Ａｓｎ）を、別のアミノ酸に置換する。ＡＧＬアミノ酸配列中のＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ配列ストレッチの例には、配列番号１９のアミノ酸８１３〜８１５、８３９〜８４１、９２７〜９２９、および１０３２〜１０３４位に対応するアミノ酸が含まれる。ＡＧＬアミノ酸配列中のＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ配列ストレッチの例には、配列番号１９のアミノ酸６９〜７１、２１９〜２２１、７９７〜７９９、１２３６〜１２３８、および１３８０〜１３８２位に対応するアミノ酸が含まれる。いくつかの実施形態では、配列番号１９のアミノ酸６９、２１９、７９７、８１３、８３９、９２７、１０３２、１２３６、および１３８０位に対応するアミノ酸位のうちのいずれか１つまたは組み合わせにおけるアスパラギンを、置換するか欠失させる。いくつかの実施形態では、配列番号１９のアミノ酸８１５、８４１、９２９、および１０３４位に対応するアミノ酸位のうちのいずれか１つまたは組み合わせにおけるセリンを、置換するか欠失させる。いくつかの実施形態では、配列番号１９のアミノ酸７１、２２１、７９９、１２３８、および１３８２位に対応するアミノ酸位のうちのいずれか１つまたは組み合わせにおけるトレオニンを、置換するか欠失させる。いくつかの実施形態では、配列番号１９のアミノ酸２２０、７９８、８１４、８４０、９２８、１０３３、１２３７、および１３８１位のうちのいずれか１つまたは組み合わせに対応するＸａａアミノ酸を、欠失させるか、プロリンに置換する。本開示は、本開示のＡＧＬポリペプチドが１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位を欠き、したがって、未変性ＡＧＬと比較してグリコシル化されないか、不十分にグリコシル化されるように任意の１つまたは複数の前述の例を組み合わせることができることを意図する。

【0240】

いくつかの実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化されていないか、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つまたは複数のＯ−グリコシル化基を欠く。いくつかの実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、１つまたは複数のＯ−グリコシル化部位でＯ−グリコシル化が不可能な修飾アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＧＬポリペプチド配列中の任意の１つまたは複数の予測されるＯ−グリコシル化部位のセリンまたはトレオニンを、置換するか欠失させる。本開示は、本開示のＡＧＬポリペプチドが１つまたは複数のＮ−グリコシル化および／またはＯ−グリコシル化部位を欠き、したがって、未変性ＡＧＬと比較してグリコシル化されないか、不十分にグリコシル化されるように任意の１つまたは複数の前述の例を組み合わせることができることを意図する。

【0241】

本開示の１つの特定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドを、非タンパク質性ポリマーで改変することができる。１つの特定の実施形態では、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に記載の様式で、ポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。ＰＥＧは、周知の水溶性ポリマーであり、市販されているか、当該分野で周知の方法に従ったエチレングリコールの開環重合（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ １３８−１６１）によって調製することができる。

【0242】

用語「生物学的活性」、「生物活性」、または「機能的」は、ＡＧＬタンパク質が、例えば、オリゴ−１，４−１，４−グルコトランスフェラーゼ活性および／またはアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性を有する野生型ＡＧＬタンパク質に関連する機能を果たす能力を意味する。用語「生物学的活性」、「生物活性」、および「機能的」を、本明細書中で互換的に使用する。本明細書中で使用する場合、「断片」には、本明細書中に記載の「生物活性」を示す生物活性断片（機能的断片ともいう）または生物活性バリアントが含まれると理解される。すなわち、ＡＧＬの生物活性断片またはバリアントは、測定および試験することができる生物活性を示す。例えば、生物活性断片／機能的断片またはバリアントは、未変性（すなわち、野生型、すなわち、通常の）ＡＧＬタンパク質と同一または実質的に同一の生物活性を示し、かかる生物活性を、断片またはバリアントが、例えば、ＡＧＬ断片のまたはバリアントの４−α−グルコトランスフェラーゼ活性および／またはアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性を介してグリコーゲンを脱分枝する能力によって評価することができる。本明細書中で使用する場合、「実質的に同一」は、任意のパラメータ（例えば、活性）が、コントロールで測定されたパラメータの少なくとも７０％であることをいう。一定の実施形態では、「実質的に同一」はまた、任意のパラメータ（例えば、活性）が、コントロールで測定されるパラメータの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０２％、１０５％、または１１０％であることをいう。一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドの断片またはバリアントは、好ましくは、同一または実質的に同一の条件下で評価した場合、未変性ＡＧＬポリペプチドに関連するＡＧＬ生物学的活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を保持するであろう。

【0243】

一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドの断片またはバリアントの半減期（_ｔ１／２）は、未変性タンパク質の半減期と比較して高い。好ましくは、ＡＧＬ断片またはバリアントの半減期は、未変性ＡＧＬタンパク質の半減期と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または５００％、またはさらに１０００％高い。いくつかの実施形態では、タンパク質半減期を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（緩衝化生理食塩水中または血清中などで）決定する。他の実施形態では、タンパク質半減期は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期（血清中または他の動物の体液中のタンパク質の半減期など）である。さらに、断片またはバリアントを、当該分野で公知の技術（従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学など）を使用して化学合成することができる。断片またはバリアントを、（組換えまたは化学合成によって）産生し、未変性ＡＧＬタンパク質のように機能するか、実質的に同様に機能することができる断片またはバリアントを同定するために試験することができる。

【0244】

細胞中のＡＧＬ生物活性を増加させる方法に関して、本開示は、任意の前述の態様および実施形態の全ての組み合わせ、ならびに詳細な説明および実施例に記載の任意の実施形態との組み合わせを意図する。コンジュゲートの投与または細胞のコンジュゲートとの接触に基づいた記載の方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞中または培養物中）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、患者中または動物モデル中）で行うことができる。一定の実施形態では、方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。一定の実施形態では、方法はｉｎ ｖｉｖｏ法である。

【0245】

いくつかの態様では、本開示はまた、本明細書中に記載の前述の任意のコンジュゲートを産生する方法を提供する。さらに、本開示は、前述の方法および組成物の多数の組み合わせを意図する。

【0246】

一定の態様では、ＡＧＬポリペプチドは、１つまたは複数の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であり得る。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が含まれるが、これらに限定されず、これらはアフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製のために、アフィニティクロマトグラフィ用の連関マトリックス（グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケル、またはコバルトにコンジュゲート化した樹脂など）を使用する。融合ドメインはまた、特異的抗体が利用可能な通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」を含む。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、Ｈｉｓ、およびｃ−ｍｙｃの各タグが含まれる。例示的なＨｉｓタグは配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号４７）を有し、例示的なｃ−ｍｙｃタグは配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４８）を有する。いくつかの場合、融合ドメインは、連関プロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それにより、融合タンパク質から組換えタンパク質が遊離する第Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位を有する。次いで、遊離したタンパク質を、その後のクロマトグラフィ分離によって融合ドメインから単離することができる。一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、ポリペプチドを安定化することが可能である１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、かかる修飾は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期を向上させるか、ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。

【0247】

いくつかの実施形態では、ＡＧＬタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質であり得る。

【0248】

任意の前述の一定の実施形態では、本開示のコンジュゲートのＡＧＬ部分は、ＡＧＬポリペプチドを含み、一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、ＡＧＬポリペプチドの機能的断片であり得るか、実質的に全長のＡＧＬポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＧＬポリペプチドは、最もＮ末端側のアミノ酸位置にメチオニンを欠く（すなわち、配列番号１９〜２１のうちのいずれか１つの第１のアミノ酸にメチオニンを欠く）。本開示のコンジュゲートおよび方法での使用に適切なＡＧＬポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで評価した場合、オリゴ−１，４−１，４−グルコトランスフェラーゼ活性およびアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性を有する。例示的な機能的断片は、全長ＡＧＬポリペプチド（例えば、配列番号１９〜２１）の少なくとも５００、少なくとも５２５、少なくとも５５０、少なくとも５７５、少なくとも６００、少なくとも６２５、少なくとも６５０、少なくとも６７５、少なくとも７００、少なくとも７２５、少なくとも７５０、少なくとも７７５、少なくとも８００、少なくとも８２５、少なくとも８５０、少なくとも８７５、少なくとも９００、少なくとも９２５、少なくとも９２５、少なくとも９５０、少なくとも９７５、少なくとも１０００、少なくとも１０２５、少なくとも１０５０、少なくとも１０７５、少なくとも１１００、少なくとも１１２５、少なくとも１１５０、少なくとも１１７５、少なくとも１２００、少なくとも１２２５、少なくとも１２５０、少なくとも１２７５、少なくとも１３００、少なくとも１３２５、少なくとも１３５０、少なくとも１３７５、少なくとも１４００、少なくとも１４２５、少なくとも１４５０、少なくとも１４７５、少なくとも１５００、少なくとも１５２５、または少なくとも１５３２個のアミノ連続アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、機能的断片は、全長ＡＧＬポリペプチド（例えば、配列番号１９〜２１）の５００〜７５０、５００〜１０００、５００〜１２００、５００〜１３００、５００〜１５００、１０００〜１１００、１０００〜１２００、１０００〜１３００、１０００〜１４００、１０００〜１５００、１０００〜１５３２個の連続するアミノ酸を含む。同様に、一定の実施形態では、本開示は、ＡＧＬ部分が任意の前述のＡＧＬポリペプチドまたは生物活性断片のバリアントであるコンジュゲートを意図する。例示的なバリアントは、未変性ＡＧＬポリペプチドまたはその機能的断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有し、かかるバリアントは、ＡＧＬバリアントのオリゴ−１，４−１，４−グルコトランスフェラーゼ活性およびアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性を介してグリコーゲンを脱分枝する能力を保持する。本開示は、コンジュゲートおよびかかるポリペプチドの使用を意図し、ここで、ＡＧＬ部分は本明細書中に記載の任意の内在化部分と組み合わせた明細書中に記載のＡＧＬポリペプチド、断片、またはバリアントのうちのいずれかを含む。さらに、一定の実施形態では、任意の前述のコンジュゲートのＡＧＬ部分は、一定の実施形態では、融合タンパク質であり得る。ＡＧＬ部分と内在化部分の一部との任意の組み合わせを含み、任意選択的に、１つまたは複数のリンカー、１つまたは複数のタグなどを含む任意のかかるコンジュゲートを、本開示の任意の方法で使用することができる。
２．ＧＡＡポリペプチド

【0249】

いくつかの実施形態では、異種薬剤は、ＧＡＡポリペプチド（例えば、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチド）である。成熟ＧＡＡポリペプチドが、低ｐＨ（すなわち、リソソームまたは自己貪食空胞のｐＨ）条件においてであろうと、中性ｐＨ（すなわち、細胞質のｐＨ）条件においてであろうと、完全長前駆体ＧＡＡと比較して向上されたグリコーゲンクリアランスを有することは立証されている（Ｂｉｊｖｏｅｔら、１９９８、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、７（１１）：１８１５−２４）。加えて、成熟ＧＡＡは、より低いｐＨで最適な活性を有するリソソームタンパク質でありながら、成熟ＧＡＡは、中性ｐＨ（すなわち、細胞質のｐＨ）で約４０％活性を保持する（Ｍａｒｔｉｎ−Ｔｏｕａｕｘら、２００２、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１１（１４）：１６３７−４５）。したがって、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドは、細胞質送達に適しており、それ故、ポンペ病の未対処問題点、すなわち細胞質グリコーゲン蓄積、に対処するのに適している。

【0250】

本明細書において用いる場合、成熟ＧＡＡポリペプチドは、当該タンパク質の変異体、および特に、成熟、活性形態（活性約７６ｋＤａもしくは約７０ｋＤａ形態または代替開始残基および／もしくは終了残基を有する類似の形態、総称して「成熟ＧＡＡ」）を含む。用語「成熟ＧＡＡ」は、内因的にプロセッシングされたとき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約７０ｋＤａから約７６ｋＤａの見かけの分子量を有する未成熟ＧＡＡタンパク質の部分に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記の代替開始残基および／または終了残基を有する類似のポリペプチドも指す。開示のコンジュゲートは、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含み、一定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、シグナル配列（配列番号２２または２３のアミノ酸１〜２７または配列番号２２または２３のアミノ酸１〜５６によって示される配列）を欠く。例示的な成熟ＧＡＡポリペプチドには、配列番号２２または２３の残基１２２〜７８２；配列番号２２または２３の残基１２３〜７８２；または配列番号２２または２３の残基２０４〜７８２を有するポリペプチドが含まれる。用語「成熟ＧＡＡ」は、内因性成熟タンパク質と同じまたは実質的に同じ方法でグリコシル化される、およびそれ故、予測分子量と同じまたは同様である分子量を有する、ポリペプチドを含む。この用語は、グリコシル化されていないまたは過剰グリコシル化されているので同じ一次アミノ酸配列を含むにもかかわらず見かけの分子量が異なるポリペプチドも含む。成熟ＧＡＡポリペプチドのいずれのかかる変異体またはアイソフォーム、機能性断片または変異体、融合タンパク質および修飾形も、ネイティブ成熟ＧＡＡタンパク質と実質的配列同一性のアミノ酸配列の少なくとも一部分を有し、酵素活性を保持する。一定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドの機能的断片、バリアント、または融合タンパク質は、配列番号２４および２５の一方または両方に記載の成熟ＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、配列番号２２または２３の残基１２２〜７８２；配列番号２２または２３の残基１２３〜７８２；または配列番号２２または２３の残基２０４〜７８２のうちの１つまたは複数に対応する成熟ＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドの機能的断片、バリアント、または融合タンパク質は、配列番号２６、２７、および４４のうちのいずれか１つに記載のＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、非ヒト種（例えば、マウス、ラット、イヌ、ゼブラフィッシュ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、サル、または類人猿）由来のＧＡＡポリペプチドである。一部の実施形態において、前記ＧＡＡタンパク質は、配列番号５２のアミノ酸配列を有する、完全長形態ではないが、成熟形態のウシＧＡＡタンパク質を含む。

【0251】

一定の特定の実施形態では、コンジュゲートは、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含む（例えば、異種薬剤は、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドである）。成熟ＧＡＡポリペプチドは、７６ｋＤａもしくは７０ｋＤａのＧＡＡ形態、または代替の出発残基および／または終結残基を使用する類似の形態であり得る。Ｍｏｒｅｌａｎｄら（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ａｃｉｄ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８０（８）：６７８０−６７９１，２００５）に記述のように、ＧＡＡのプロセシング形態のために使用した命名法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した見かけ上の分子量に基づく。いくつかの実施形態では、成熟ＧＡＡは、通常は小胞体中でグリコシル化されるＮ末端部位を欠き得る。例示的な成熟ＧＡＡポリペプチドは配列番号２４または配列番号２５を含む。さらに例示的な成熟ＧＡＡポリペプチドは、およそ以下に対応するアミノ酸配列を含み得るか、これらからなり得る：配列番号２２または２３の残基１２２〜７８２；配列番号２２または２３の残基１２３〜７８２（配列番号２４などに示される）；配列番号２２または２３の残基２０４〜７８２；配列番号２２または２３の残基２０６〜７８２；配列番号２２または２３の残基２８８〜７８２（配列番号２５などに示される）。成熟ＧＡＡポリペプチドはまた、上記のＮ末端残基および／またはＣ末端残基を有し得る。

【0252】

一定の実施形態では、コンジュゲートは、全長ＧＡＡポリペプチドを含まないが、成熟ＧＡＡポリペプチドおよび全長ＧＡＡポリペプチドの少なくとも一部を含む。一定の実施形態では、コンジュゲートは、ＧＡＡポリペプチドを含むが、配列番号２２または２３の残基１〜５６を含まない。一定の実施形態では、コンジュゲートは、ＧＡＡポリペプチドを含むが、配列番号２２または２３の残基１〜５６を含まない。一定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体を含まない。これらの全ては、開示の異種薬剤の例、具体的には、異種薬剤が成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドである実施形態の例である。

【0253】

一定の実施形態では、本明細書中に記載のコンジュゲートのＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号２２のＧＡＡ翻訳産物を含まないＧＡＡの成熟形態を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチドおよびコンジュゲートのいずれも配列番号２２または２３のアミノ酸１〜２７または１〜５６に対応する連続アミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ全リンカー領域（配列番号４６）の少なくとも一部を欠き、全リンカー領域は、配列番号２２または２３のアミノ酸５７〜７８に対応する。特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む）。他の実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む）。他の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドを、グリコシル化してもグリコシル化しなくてもよい。グリコシル化されるＧＡＡポリペプチドについて、グリコシル化パターンは、天然に存在するヒトＧＡＡのグリコシル化パターンと同一であり得るか、異なり得る。前駆体ＧＡＡタンパク質上の１つまたは複数のグリコシル化部位を、最終成熟ＧＡＡ構築物中で除去することができる。さらに例示的な成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２６、２７、および４４のうちのいずれか１つに対応するアミノ酸配列を含み得るか、これらからなり得る。

【0254】

一定の実施形態では、成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドはヒトである。

【0255】

用語「生物学的活性」、「生物活性」または「機能的」は、ＧＡＡポリペプチドを含むコンジュゲートが野生型ＧＡＡタンパク質に関連する機能（例えば、グリコーゲン（例えば、リソソームグリコーゲン）のα−１，４−グリコシド結合およびα−１，６−グリコシド結合の加水分解）を果たす能力を意味する。用語「生物学的活性」、「生物活性」、および「機能的」を、本明細書中で互換的に使用する。一定の実施形態では、生物学的活性は、グリコーゲンを加水分解する能力を含む。他の実施形態では、生物学的活性は、リソソームグリコーゲンおよび／または細胞質グリコーゲンの濃度を低下させる能力である。さらなる他の実施形態では、コンジュゲートは、ポンペ病に関連する症状を処置する能力を有する。本明細書中で使用する場合、「断片」には、本明細書中に記載の「生物活性」を示す生物活性断片（機能的断片ともいう）または生物活性バリアントが含まれると理解される。すなわち、成熟ＧＡＡの生物活性断片またはバリアントは、測定および試験することができる生物活性を示す。例えば、生物活性断片／機能的断片またはバリアントは、未変性（すなわち、野生型、すなわち、通常の）ＧＡＡタンパク質と同一または実質的に同一の生物活性を示し、かかる生物活性を、断片またはバリアントが、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでグリコーゲンを加水分解する能力によって評価することができる。本明細書中で使用する場合、「実質的に同一」は、任意のパラメータ（例えば、活性）が、コントロールで測定されたパラメータの少なくとも７０％であることをいう。一定の実施形態では、「実質的に同一」はまた、同一または実質的に同一の条件下で評価した場合、任意のパラメータ（例えば、活性）が、コントロールで測定されるパラメータの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０２％、１０５％、または１１０％であることをいう。一定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドの断片またはバリアントは、好ましくは、同一または実質的に同一の条件下で評価した場合、未変性ＧＡＡポリペプチドに関連するＧＡＡ生物学的活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を保持するであろう。一定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドの断片またはバリアントの半減期（ｔ_１／２）は、未変性タンパク質の半減期と比較して高い。好ましくは、成熟ＧＡＡ断片またはバリアントの半減期は、同一または実質的に同一の条件下で評価した場合、未変性ＧＡＡタンパク質の半減期と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または５００％、またはさらに１０００％高い。いくつかの実施形態では、タンパク質半減期を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（緩衝化生理食塩水中または血清中などで）決定する。他の実施形態では、タンパク質半減期は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期（血清中または他の動物の体液中のタンパク質の半減期など）である。さらに、断片またはバリアントを、当該分野で公知の技術（従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学など）を使用して化学合成することができる。断片またはバリアントを、（組換えまたは化学合成によって）産生し、未変性ＧＡＡタンパク質のように機能するか、実質的に同様に機能することができる断片またはバリアントを同定するために試験することができる。

【0256】

一定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドおよび内在化部分を含むコンジュゲートは、マンノース−６−リン酸受容体（ＭＰＲ）をブロックする薬剤の存在下で細胞内（細胞質内など）に侵入することができる。

【0257】

細胞におけるＧＡＡ生物活性を増加させる方法に関して、本開示は、任意の上述の態様および実施形態のすべての組み合わせ、ならびに「発明を実施するための形態」および「実施例」で述べる任意の実施形態との組み合わせも企図している。コンジュゲートの投与または細胞のコンジュゲートとの接触に基づいた記載の方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞中または培養物中）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、患者中または動物モデル中）で行うことができる。一定の実施形態では、方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。一定の実施形態では、方法はｉｎ ｖｉｖｏ法である。

【0258】

いくつかの態様では、本開示はまた、本明細書中に記載の前述の任意のコンジュゲートを産生する方法を提供する。さらに、本開示は、前述の方法および組成物の多数の組み合わせを意図する。

【0259】

一定の態様では、成熟ＧＡＡポリペプチドは、１つまたは複数の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であり得る。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が含まれるが、これらに限定されず、これらはアフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製のために、アフィニティクロマトグラフィ用の連関マトリックス（グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケル、またはコバルトにコンジュゲート化した樹脂など）を使用する。融合ドメインはまた、特異的抗体が利用可能な通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」を含む。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、Ｈｉｓ、およびｃ−ｍｙｃの各タグが含まれる。例示的なＨｉｓタグは配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号４７）を有し、例示的なｃ−ｍｙｃタグは配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４８）を有する。任意のかかるタグまたは融合物をコンジュゲートの成熟ＧＡＡ部分に付加することができるか、コンジュゲートの内在化部分の一部に付加することができるか、その両方であると認識される。一定の実施形態では、コンジュゲートは、コンジュゲートのＮ末端上（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内）に「ＡＧＩＨ」部分（配列番号２８）を含み、かかるコンジュゲートを、１つまたは複数のエピトープタグの存在下または非存在下で提供することができる。さらなる実施形態では、コンジュゲートは、ポリペプチドの最もＮ末端側の位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ポリペプチドのＮ末端（またはＮ末端の１０アミノ酸残基以内）に「ＳＡＧＩＨ」（配列番号２９）部分を含み、かかるコンジュゲートを、１つまたは複数のエピトープタグの存在下または非存在下で提供することができる。

【0260】

いくつかの場合、融合ドメインは、連関プロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それにより、融合タンパク質から組換えタンパク質が遊離する第Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位を有する。次いで、遊離したタンパク質を、その後のクロマトグラフィ分離によって融合ドメインから単離することができる。一定の実施形態では、成熟ＧＡＡポリペプチドは、ポリペプチドを安定化することが可能である１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、かかる修飾は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期を向上させるか、ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。

【0261】

いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質であり得る。

【0262】

任意の前述の一定の実施形態では、コンジュゲートのＧＡＡ部分は、ＧＡＡの成熟形態（例えば、７６ｋＤａ断片、７０ｋＤａ断片）、代替の開始部位および／または終結部位を使用する類似の形態、またはその機能的断片のうちの１つを含む。一定の実施形態では、かかる成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能的断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで評価した場合にグリコーゲンの加水分解能力を保持する。さらに、ある一定の実施形態において、かかる成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能性断片を含むコンジュゲート化体は、グリコーゲンを加水分解することができる。例示的生物活性断片は、完全長成熟ＧＡＡポリペプチドの連続した少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７５、または少なくとも３００のアミノ酸残基を含む。

【0263】

一定の実施形態では、本明細書中に記載のコンジュゲートのＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号２２に記載のＧＡＡポリペプチドを含まないＧＡＡの成熟形態を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡ全リンカー領域（配列番号４６）の少なくとも一部を欠き、全リンカー領域は、配列番号２２または２３のアミノ酸５７〜７８に対応する。特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない。他の実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない。

【0264】

特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、コンジュゲートは配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６０を含まない）。他の実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、コンジュゲートは配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６０または１〜６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない）。いくつかの実施形態では、ＧＡＡ部分は、配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない（例えば、コンジュゲートは配列番号２２または２３のアミノ酸１〜６０または１〜６６または１〜６９に対応する連続アミノ酸配列を含まない）。本明細書中に記載の適切な組み合わせを特に意図する。

【0265】

一定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸６１〜９５２に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、配列番号２２のアミノ酸６１〜９５２を含み、配列番号２２のアミノ酸１〜６０に対応する連続アミノ酸配列を含まない。一定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸６７〜９５２に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、配列番号２２のアミノ酸６７〜９５２を含み、配列番号２２のアミノ酸１〜６０または、一定の実施形態では、１〜６６に対応する連続アミノ酸配列を含まない）。一定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸７０〜９５２に対応するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、配列番号２２のアミノ酸７０〜９５２を含み、配列番号２２のアミノ酸１〜６０または、一定の実施形態では、１〜６６または、一定の実施形態では、１〜７０に対応する連続アミノ酸配列を含まない。成熟ＧＡＡを含む任意のかかるＧＡＡポリペプチドを含むコンジュゲートを、細胞内にＧＡＡ活性を送達するために使用することができる。

【0266】

ある一定の実施形態において、本開示は、成熟ＧＡＡ部分が任意の上述の成熟ＧＡＡポリペプチドまたは機能性断片の変異体である、コンジュゲート化体を企図している。例示的変異体は、ネイティブＧＡＡポリペプチドまたはその生物活性断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有し、かかる変異体は、インビトロまたはインビボで評価してグリコーゲンを加水分解するネイティブＧＡＡの能力を保持する。本開示は、コンジュゲートおよびかかるタンパク質の使用を意図し、ここで、ＧＡＡ部分は本明細書中に記載の任意の内在化部分と組み合わせた本明細書中に記載の成熟ＧＡＡポリペプチド、形態、またはバリアントのうちのいずれかを含む。さらに、一定の実施形態では、任意の前述のコンジュゲートの成熟ＧＡＡ部分は、一定の実施形態では、融合タンパク質であり得る。ＧＡＡ部分と内在化部分の一部との任意の組み合わせを含み、任意選択的に、１つまたは複数のリンカー、１つまたは複数のタグなどを含む任意のかかるコンジュゲートを、本開示の任意の方法で使用することができる。
ＩＶ．コンジュゲート

【0267】

一定の実施形態では、本開示は、開示のコンジュゲートを提供する。本開示のコンジュゲートは、（ｉｉ）異種薬剤に会合した（融合した、またはそうでなければコンジュゲート化した）（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片を含む。本開示のコンジュゲートおよび本開示で用いるコンジュゲートを、種々の様式で作製することができる。一定の実施形態では、異種薬剤はポリペプチドであり、異種薬剤のＣ末端をヒト化内在化部分のＮ末端に連結することができる。あるいは、ヒト化内在化部分のＣ末端を異種薬剤のＮ末端に連結することができる。例えば、コンジュゲートを、抗体（または抗体断片）の重鎖または軽鎖のいずれかのアミノ末端またはカルボキシ末端に異種薬剤が配置されるようにデザインすることができる。ある一定の実施形態において、可能性のある構成は、付着異種薬剤の機能的完全性を維持するために必要に応じて抗体の重鎖および軽鎖配列（例えば、３Ｅ１０）のトランケート部分の使用を含む。さらになお、前記ヒト化内在化部分を異種薬剤の露出された内部（非末端）残基に連結させることができる。さらなる実施形態では、異種薬剤−内在化部分構成の任意の組み合わせを用いることができ、それによって、１：１より大きい異種薬剤：内在化部分比（例えば、２異種薬剤分子対１内在化部分）が得られる。

【0268】

一定の実施形態では、コンジュゲートは、ポリペプチドのＮ末端上に「ＡＧＩＨ」部分（配列番号２８）を含み、かかるコンジュゲートを、１つまたは複数のエピトープタグの存在下または非存在下で提供することができる。さらなる実施形態では、キメラポリペプチドは、ポリペプチドの最もＮ末端側の位置にセリンを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ポリペプチドのＮ末端に「ＳＡＧＩＨ」（配列番号２９）部分を含み、かかるコンジュゲートを、１つまたは複数のエピトープタグの存在下または非存在下で提供することができる。

【0269】

異種薬剤および内在化部分を、相互に直接コンジュゲート化することができる。あるいは、前記異種薬剤および前記内在化部分を、各ドメインが適正にその二次および三次構造に確実にフォールディングするのに十分な距離だけ離隔するリンカー配列を介して、互いに連結させてもよい。好ましいリンカー配列は、（１）柔軟な伸長された高次構造をとるべきであり、（２）異種薬剤ポリペプチドまたは内在化部分の機能性ドメインと相互作用することができる規則二次構造を発生させる傾向を示してはならず、そして（３）機能性タンパク質ドメインとの相互作用を促進することができる最小の疎水性または荷電性を有するべきである。柔軟なタンパク質領域の典型的な表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒが挙げられる。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の並べ替えは、リンカー配列についての上記基準を満たすと予想される。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもリンカー配列に使用することができる。特定の実施形態では、約１５アミノ酸のリンカー配列長を使用して、機能性タンパク質ドメインの適する離隔をもたらすことができるが、より長いまたはより短いリンカー配列を使用してもよい。異種薬剤と内在化部分を離隔するリンカー配列の長さは、長さ５から５００アミノ酸、またはさらに好ましくは長さ５から１００アミノ酸であることができる。好ましくは、前記リンカー配列は、長さ約５〜３０アミノ酸である。好ましい実施形態において、前記リンカー配列は、約５から約２０アミノ酸であり、有利には約１０から約２０アミノ酸である。他の実施形態において、異種薬剤を内在化部分に連結させるリンカーは、抗体の定常ドメイン（例えば、Ａｂ ３Ｅ１０の定常ドメイン、または別の抗体のＦｃ領域のすべてもしくは一部分）であることができる。例として、異種薬剤を内在化部分と接合させるリンカーは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（例えば、配列番号３１を参照のこと）であり得る。一定の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。上述のように、コンジュゲートは、１つを超えるリンカー（内在化部分を異種薬剤に接合させるリンカーおよび内在化部分の一部を相互に接合させるリンカー（例えば、単鎖Ｆｖ断片のＶＨとＶＬドメインとを接合させるリンカー）など）を含み得る。コンジュゲートが１つを超えるリンカー（２つのリンカーなど）を含む場合、リンカーを独立して選択し、リンカーは、同一でも異なっていてもよい。

【0270】

ある一定の実施形態において、本開示の方法において使用するためのコンジュゲート化体は、周知の架橋試薬または架橋プロトコルを用いて生成することができる。例えば、当業者に公知であり、異種薬剤と内在化部分（例えば、抗体）を架橋させるのに有用である、多数の化学的架橋剤がある。例えば、前記架橋剤は、段階的に分子を連結させるために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。タンパク質をコンジュゲート化させるより特異的なカップリング方法が、ヘテロ二官能性架橋剤によって設計できるようになり、それによりホモタンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を低減させることができる。多種多様なヘテロ二官能性架橋剤が当該技術分野において公知であり、それらとしては、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤を、より大きい水溶性を一般に有するＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。加えて、連結する鎖内にジスルフィドブリッジを有する架橋剤をアルキル誘導体としてその代りに合成して、インビボリンカー切断量を低減させることができる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性および光反応性架橋剤をはじめとする多数の他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｃｒａｔｅ）（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）およびジメチルピメルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＰ）は、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ならびにビス［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、本開示における使用のために有用な光反応性架橋剤の例である。タンパク質カップリング技術の最近の概説については、参照により本明細書に援用されているＭｅａｎｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１：２−１２を参照されたい。

【0271】

上に含めたヘテロ二官能性架橋剤の１つの特に有用なクラスは、第一級アミン反応性基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、またはその水溶性類似体Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含む。アルカリｐＨでの第一級アミン（リジンε基）は、プロトン化されず、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに対する求核攻撃によって反応する。この反応は、アミド結合の形成、そしてＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの副生成物としての遊離をもたらす。ヘテロ二官能性架橋剤の一部として有用なもう１つの反応性基は、チオール反応性基である。一般的なチオール反応性基としては、マレイミド、ハロゲン、およびピリジルジスルフィドが挙げられる。マレイミドは、弱酸性から中性（ｐＨ６．５〜７．５）条件下で数分で遊離スルフヒドリル（システイン残基）と特異的に反応する。ハロゲン（ヨードアセチル官能基）は、生理ｐＨで−−ＳＨ基と反応する。これら両方の反応性基は、安定したチオエーテル結合の形成をもたらす。ヘテロ二官能性架橋剤の第三の構成要素は、スペーサーアームまたはブリッジである。ブリッジは、２つの反応性末端を接続する構造である。ブリッジの最も明白な特質は、立体障害に対するその効果である。場合によっては、長いブリッジほど、２つの複雑な生体分子を連結させるために必要な距離に容易に架かることができる。

【0272】

ヘテロ二官能性試薬を使用するタンパク質コンジュゲート化体の調製は、アミン反応とスルフヒドリル反応を含む二工程プロセスである。第一の工程、アミン反応のために選択されるタンパク質は、第一級アミンを含有すべきである。これは、リジンεアミンまたは殆どのタンパク質のＮ末端に見いだされる第一級αアミンであることができる。前記タンパク質は、遊離スルフヒドリル基を含有してはならない。コンジュゲート化される両方のタンパク質が遊離スルフヒドリル基を含有する場合、例えばＮ−エチルマレイミドを使用してすべてのスルフヒドリルをブロックするように一方のタンパク質を修飾することができる（参照により本明細書に援用されているＰａｒｔｉｓら（１９８３）Ｊ．Ｐｒｏ．Ｃｈｅｍ．２：２６３を参照されたい）。エルマン試薬を使用して、特定のタンパク質中のスルフヒドリルの量を計算することができる（例えば、参照により本明細書に援用されているＥｌｌｍａｎら（１９５８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４：４４３およびＲｉｄｄｌｅｓら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：７５を参照されたい）。

【0273】

ある一定の特定の実施形態では、ユニバーサル担体系を使用して本開示の方法において使用するためのコンジュゲート化体を生産することができる。例えば、異種薬剤ポリペプチドを一般的な担体、例えば、プロテインＡ、ポリ−Ｌ−リジン、ｈｅｘ−ヒスチジンなどにコンジュゲート化させることができる。その場合、そのコンジュゲート化された担体は、内在化部分として作用する抗体と複合体を形成することになる。免疫グロブリンと結合する役割を担う担体分子の小部分を担体として使用することもできよう。

【0274】

ある一定の実施形態では、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）およびＧｒａｎｔ Ｇ． Ａ．（編集）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を用いることにより、本開示の方法において使用するためのコンジュゲート化体を生産することができる。加えて、自動ペプチド合成装置が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００）。異種薬剤の内在化部分への化学的コンジュゲート化のための上述のいずれの架橋方法においても、切断可能ドメインまたは切断可能リンカーを使用することができる。切断は、内在化部分と異種薬剤の分離を可能にする。例えば、コンジュゲート化体が細胞を透過した後に、切断可能リンカーの切断によって異種薬剤の内在化部分から分離することが可能になる。

【0275】

一定の実施形態では、本開示の方法で用いるコンジュゲートを、１つの連続ポリペプチド鎖として発現する異種薬剤ポリペプチドおよび内在化部分を含む融合タンパク質として生成する。かかるコンジュゲートを、本明細書中で組換えコンジュゲート化したという。かかる融合タンパク質の調製では、異種薬剤ポリペプチドおよび内在化部分、ならびに、任意選択的に、異種薬剤ポリペプチドと内在化部分とを繋ぐためのペプチドリンカー配列をコードする核酸を含む融合遺伝子を構築する。あるいは、１つまたは複数のコンジュゲートの一部を、個別に組換え産生し、一部をその後に化学的または組換えによって組み合わせることができる。翻訳産物が所望の融合タンパク質である、融合遺伝子を生じさせるための組換えＤＮＡ技術の使用は、当該技術分野において周知である。遺伝子のコード配列とその調節領域の両方を設計しなおして、タンパク質産物の機能特性、作製されるタンパク質の量、またはそのタンパク質が生産される細胞タイプを変えることができる。遺伝子のコード配列を−−例えば、その一部を異なる遺伝子のコード配列に融合させることによって−−大幅に変更して、融合タンパク質をコードする新規ハイブリッド遺伝子を生産することができる。融合タンパク質の生産方法の例は、参照により本明細書に援用されているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２９６８号、同第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３５８７号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７３３５号パンフレット、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８に記載されている。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端またはジグザグ端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）末端、適切な末端を生じさせるための制限酵素消化、適宜の付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いる、従来の技術に従って行う。あるいは、自動ＤＮＡ合成装置をはじめとする従来の技術によって融合遺伝子を合成することができる。別の方法では、連続した２つの遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後、それらのオーバーハングをアニールしてキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｍ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。融合遺伝子によってコードされたコンジュゲート化体を、当該技術分野において周知であるような様々な発現系を使用して組換え生産してもよい（下記も参照されたい）。

【0276】

組換えコンジュゲート化したコンジュゲートは、異種薬剤ポリペプチドを内在化部分のＮ末端またはＣ末端にコンジュゲート化する実施形態を含む。

【0277】

一部の実施形態では、米国特許出願公開第２００３／０１６６８７７号明細書に記載されているように、コンジュゲート化体に架かる連結領域内の候補Ｔ細胞エピトープを同定し、その連結領域内のアミノ酸を変えることによって、コンジュゲート化体の免疫原性を低減させることがある。
Ｖ．核酸および発現

【0278】

一定の実施形態では、本開示は、本開示の任意の抗体または抗原結合断片（例えば、ヒト化内在化部分またはその断片）または本明細書中に開示の任意のコンジュゲートを産生するために核酸を使用する。

【0279】

核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。さらなる実施形態では、ヒト化内在化部分またはその断片の核酸配列は、単離核酸配列、組換え核酸配列、および／または異種ヌクレオチド配列と融合された核酸配列、またはＤＮＡライブラリー中の核酸配列であり得る。

【0280】

一定の実施形態では、ヒト化内在化部分またはその断片の核酸はまた、高ストリンジェンシー条件下で上記ヒト化内在化部分またはその断片のヌクレオチド配列、またはその相補配列のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件を変えることができることは、通常の当業者には容易に理解されるであろう。例えば、約４５℃で６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、続いて５０℃で２．０ｘＳＳＣの洗浄を行うことができよう。例えば、洗浄工程での塩濃度を５０℃で約２．０ｘＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２ｘＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄工程の温度を室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件に上昇させることができる。温度と塩の両方を変えてもよく、または他の変数を変化させつつ温度もしくは塩濃度を一定に保ってもよい。１つの実施形態において、本開示は、室温で６ｘＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供し、ハイブリダイズ後、室温で２ｘＳＳＣで洗浄する。

【0281】

遺伝コードの縮重のためにヒト化内在化部分またはその断片の核酸とは異なっている単離された核酸も本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が複数のトリプレットによって表される。同じアミノ酸を指定するコドン、すなわちシノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンのシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異をもたらすことがある。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞間に存在すると予想される。特定のタンパク質をコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％またはそれ未満）のこれらの変異が、天然対立遺伝子変異のため所与の種の個体間に存在することがあることは、当業者には理解されるであろう。任意のおよびすべてのかかるヌクレオチド変異および結果として生ずるアミノ酸多型が本開示の範囲内である。

【0282】

ある一定の実施形態では、前記組換えヒト化内在化部分またはその断片の核酸を発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結させることがある。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に用いられる宿主細胞に適切であるだろう。非常に多くのタイプの適切な発現ベクターおよび適する調節配列が当該技術分野において様々な宿主細胞について公知である。典型的に、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げることができるが、これらに限定されない。当該技術分野において公知であるような構成的または誘導性プロモーターを本開示は企図している。前記プロモーターは、天然に存在するプロモーターであってもよく、または１つより多くのプロモーターの要素を兼備するハイブリッドプロモーターであってもよい。発現構築物は、細胞内のプラスミドなどのエピソーム上に存在することもあり、または発現構築物は、染色体に挿入されることもある。好ましい実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は、当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって異なることになる。ある一定の態様において、本開示は、ヒト化内在化部分またはその断片をコードし、かつ少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。調節配列は当該技術分野において認知されており、そしてコードされたポリペプチドの発現を命じるために選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素を含む。例示的調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。発現ベクターの設計が、形質転換させる宿主細胞の選択、および／または発現させることを所望するタンパク質タイプなどの因子に依存し得ることは、理解されるはずである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされた任意の他のタンパク質の発現も考慮すべきである。

【0283】

本開示はまた、本開示の方法で用いるヒト化内在化部分もしくはその断片またはコンジュゲートをコードする組換え遺伝子でトランスフェクトした宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ヒト化内在化部分もしくはその断片またはコンジュゲートを、細菌細胞（大腸菌など）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。他の適切な宿主細胞が当業者に公知である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、不死化細胞であるか、ベクターを発現するように安定にトランスフェクトされている。本開示はまた、ポリペプチド（例えば、本明細書中に記載の任意の抗体または抗原結合断片）の産生方法であって、宿主細胞を提供する工程および適切な条件下で宿主細胞を培養してポリペプチドを産生する、培養する工程を含む方法を提供する。

【0284】

本開示は、さらに、本開示の方法において使用するためのヒト化内在化部分もしくはその断片、内在化部分、および／またはコンジュゲート化体を生産する方法に関する。例えば、ヒト化内在化部分もしくはその断片またはコンジュゲート化体をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、そのポリペプチドの発現を起こさせるような適切な条件下で培養することができる。そのポリペプチドを含有する細胞と培地の混合物からそのポリペプチドを分泌させ、単離してもよい。あるいは、そのポリペプチドを細胞質にまたは膜画分中に保持し、細胞を回収し、溶解し、タンパク質を単離してもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適する培地は、当該技術分野において周知である。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、および前記ポリペプチド（例えば、ＭＴＭ１ポリペプチド）の特定のエピトープに対して特異的な抗体を用いるイムノアフィニティー精製をはじめとする、当該技術分野において公知のタンパク質精製技術を用いて、前記ポリペプチドを細胞培養培地、宿主細胞または両方から単離することができる。好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、融合タンパク質であり、任意選択でその精製を助長するドメインを含有してもよい。

【0285】

組換えヒト化内在化部分またはその断片の核酸（または本開示の他の抗体もしくは抗原結合断片）は、クローン遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫もしくは哺乳動物）または両方のいずれかにおける発現に適するベクターにライゲートすることによって生産することができる。組換えポリペプチドの生産のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適するベクターとしては、次のタイプのプラスミドが挙げられる：大腸菌などの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるそのベクターの増殖を助長するための原核性配列と、真核細胞において発現される１つ以上の真核性転写ユニットの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターが、真核細胞のトランスフェクションに適している哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部をｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列で修飾して、原核細胞および真核細胞両方における複製および薬剤耐性選択を助長する。あるいは、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バー・ウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用することができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法が当該技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞両方のための他の適する発現系、ならびに一般組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）第１６および１７章を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいこともある。かかるバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が挙げられる。

【0286】

融合遺伝子の作製技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端またはジグザグ端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）末端、適切な末端を生じさせるための制限酵素消化、適宜の付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いる、従来の技術に従って行う。別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成装置をはじめとする従来の技術によって融合遺伝子を合成することができる。あるいは、連続した２つの遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後、それらのオーバーハングをアニールしてキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｍ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。

【0287】

多数の方法でコンジュゲートを作製することができることを理解すべきである。例えば、ヒト化内在化部分（またはその断片）および異種薬剤を個別に作製することができる（２つの個別の細胞培養物中でその各タンパク質をコードする核酸構築物からの組換え産生など）。一旦作製されると、タンパク質を、直接またはリンカーを介して化学的にコンジュゲート化することができる。別の例として、コンジュゲートを、任意選択的に１つまたは複数のリンカー、および任意選択的に１つまたは複数のエピトープタグを含む全コンジュゲートを、異種薬剤および内在化部分の両方をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物から作製するインフレーム融合物として作製することができる。別の例として、コンジュゲートは、以下を含む：ａ）インフレーム融合物によって重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメイン（例えば、配列番号１０）に融合した軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメイン（例えば、配列番号８）を含むヒト化内在化部分（またはその断片）；およびｂ）異種薬剤（ヒト化内在化部分および異種薬剤がユニバーサルキャリアシステムまたは化学的コンジュゲート化によって相互にコンジュゲート化している）。

【0288】

単独または異種薬剤とのコンジュゲートとして提供した本開示の抗体は、多数の使用方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用およびｉｎ ｖｉｖｏでの使用が含まれる）を有する。ｉｎ ｖｉｖｏでの使用には、治療上の使用だけでなく、診断および研究での使用（例えば、特定の疾患の動物モデルでの使用）も含まれる。例として、本開示のコンジュゲートを、研究試薬として使用し、健康な動物または罹患動物における生物活性、局在化および輸送、タンパク質間相互作用、酵素活性、ならびに動物生理学に及ぼす異種薬剤の影響を理解するために動物に送達することができる。

【0289】

コンジュゲートを、例えば、培養細胞（培養物中の健康な細胞および罹患細胞（例えば、ＭＴＭ、ＧＡＡ、および／またはＡＧＬを欠く細胞）が含まれる）における異種薬剤の生物活性、局在化および輸送、タンパク質間相互作用、ならびに酵素活性を評価するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することもできる。本開示は、（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片および（ｉｉ）異種薬剤を含むコンジュゲート（例えば、本開示の抗体または抗原結合断片および異種タンパク質またはペプチドを含むコンジュゲートなど）を、細胞質、リソソーム、および／または細胞（培養細胞が含まれる）の自己貪食小胞に異種薬剤を送達するために使用することができることを意図する。
ＶＩ．投与方法

【0290】

種々の送達系が公知であり、本開示の抗体または抗原結合断片（単独で提供されるか、別の薬剤とのコンジュゲートとして提供される）（その１つまたは複数のいずれかを、「本開示の組成物」または「本開示のヒト化組成物」ということができる）を、例えば、種々の製剤、化合物を発現することができるリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞中のカプセル化、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）によって投与するために使用することができる。導入方法は、経腸または非経口経路（皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、肺内、鼻腔内、眼内、硬膜外が含まれるが、これらに限定されない）、および経口経路であり得る。特定の実施形態では、非経口導入には、筋肉内、皮下、静脈内、血管内、および心膜内の各投与が含まれる。

【0291】

本開示は、１回または複数回用量の本開示の抗体または抗原結合断片（単独で提供されるか、別の薬剤とのコンジュゲートとして提供される）（その１つまたは複数のいずれかを、「本開示の組成物」または「本開示のヒト化組成物」ということができる）の全身送達を提供する。全身送達には、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内が含まれる。実際に、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１３／１７７４２８号に記載の結果は、３Ｅ１０内在化抗体またはその断片またはコンジュゲートの筋肉内送達後、治療有効性が他の筋肉内（例えば、注射した筋肉に限定されない）で認められることを証明している。これは、全ての薬剤の筋肉内送達後に当てはまらず、ヒト化内在化抗体またはその断片またはコンジュゲートが筋肉内投与後に全身で利用可能であることを示す。

【0292】

開示の抗体または抗原結合断片（異種薬剤にコンジュゲート化された内在化部分またはその断片が含まれる）を、任意の従来の経路によって（例えば、注入またはボーラス注射によって）投与することができる。

【0293】

一定の実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片（異種薬剤にコンジュゲート化されたものが含まれる）を、静脈内注入によって投与する。一定の実施形態では、コンジュゲートを、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、または少なくとも３０分間にわたって注入する。他の実施形態では、開示の抗体または抗原結合断片（単独または異種薬剤とのコンジュゲートとして提供される）を、少なくとも６０分間、９０分間、または１２０分間にわたって注入する。注入期間と無関係に、本開示は、各注入が本開示の組成物を規則的なスケジュール（例えば、週間、月間など）に従って投与する全処置計画の一部であることを意図する。

【0294】

組成物および投与経路を、テクノロジーの特定の用途に応じて選択する。例えば、ヒト患者における診断目的または治療目的のために使用する場合と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデルなどの研究目的で開示の組成物を使用する場合に異なる組成物および／または投与経路が適切であり得る。当業者は、テクノロジーの特定の適用に応じて適切な投与経路を選択することができる。
ＶＩＩ．薬学的組成物

【0295】

本開示の一定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片（単独で提供されるか、別の薬剤とのコンジュゲートとして提供される）（その１つまたは複数のいずれかを、「本開示の組成物」または「本開示のヒト化組成物」という）を、薬学的に許容され得るキャリアを使用して製剤化する。例えば、本開示は、１つまたは複数の薬学的に許容され得るキャリアおよび／または賦形剤を使用して製剤化した本開示の抗体または抗原結合断片（任意選択的に、別の薬剤とコンジュゲート化される）を含む組成物を提供する。１つまたは複数のかかる開示の組成物（単独で提供されるか、別の薬剤とのコンジュゲートとして提供される）を、単独か薬学的製剤（組成物）の成分として投与することができる。ヒトまたは獣医学での使用のための任意の適便な方法で投与するために本開示の組成物（単独で提供されていようが、または他の薬剤とのコンジュゲート化体として提供されていようが）を製剤化してよい。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、保存剤および酸化防止剤も前記組成物中に存在することができる。

【0296】

本開示の組成物の製剤は、経口、鼻、局所、非経口、直腸および／または膣内投与に適しているものを含む。前記製剤を単位剤形で適便に提供してよく、および薬学技術分野において周知の任意の方法によって調製してよい。単一剤形を製造するために担体材料と併せることができる活性成分の量は、処置される宿主、および特定の投与方式に依存して変わることになる。単一剤形を製造するために担体材料と併せることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じさせる化合物の量であろう。

【0297】

ある一定の実施形態において、これらの製剤または組成物を調製する方法は、治療剤および担体、ならびに場合により１つ以上の補助成分を併せる工程を含む。一般に、液体担体、または微粉固体担体、または両方を用いて製剤を調製し、その後、必要に応じて生成物を成形する。

【0298】

非経口投与に適する医薬組成物は、酸化防止剤、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝剤）、静菌剤、その製剤を所期のレシピエントの血液と等張にさせる溶質、または懸濁化もしくは増粘剤を含有し得る１つ以上の薬学的に許容され得る滅菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末との組み合わせで、１つ以上の本開示の組成物を含むこともある。本開示の医薬組成物において用いてもよい、適する水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適する混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合は必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。

【0299】

これらの組成物は、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤も含有することがある。微生物の作用の予防を、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確実なものにしてもよい。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが望ましいこともある。加えて、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、注射用医薬剤形の持続性吸収をもたらしてもよい。

【0300】

本開示のある一定の実施形態において、本開示の組成物を、日常的手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化する。必要な場合には、前記組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬も含むことがある。前記組成物を注入によって投与すべき場合、医薬品グレードの滅菌水または食塩水が入っている輸液ボトルでそれを投薬することができる。前記組成物を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合してもよいように注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。

【0301】

本開示の方法で用いる本開示の組成物の量を、標準的な臨床技術によって決定することができ、この量は、特定の適応症または使用に応じて変動し得る。有効用量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から誘導された用量応答曲線から外挿することができる。

【0302】

ある一定の実施形態において、医薬調製物を含めて、本開示の組成物は、非発熱性である。言い換えると、ある一定の実施形態において、前記組成物は、実質的に発熱物質不含である。１つの実施形態において、本開示の製剤は、エンドトキシンおよび／または関連発熱物質が実質的にない発熱物質不含製剤である。エンドドキシンは、微生物内に閉じ込められている毒素であり、微生物が破壊されるか、死滅したときにのみ放出される毒素を含む。発熱物質は、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘起性、熱安定性物質（糖タンパク質）も含む。これら両方の物質は、ヒトに投与されると発熱、低血圧およびショックを惹き起こす場合がある。潜在的有害作用のため、少ないエンドトキシン量であっても静脈内投与される医薬薬物溶液から除去しなければならない。米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静注薬物適用について１回１時間で体重１キログラムにつき５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｆｏｒｕｍ ２６（１）：２２３（２０００））。治療用タンパク質を比較的多い投薬量でおよび／または長期間にわたって（例えば、患者の全生涯の間など）投与する場合、たとえ少ない有害かつ危険な内毒素量でも危険であり得る。ある一定の特定の実施形態において、前記組成物中のエンドドキシンおよび発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または５ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または１ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満（ｌｅｓｓ ｔｈｅｎ）である。

【0303】

上述は、本明細書に記載する組成物および方法のいずれにも当てはまる。本開示は、本開示の組成物の（単独でのまたは組み合わせでの）特徴と、この節に記載する様々な医薬組成物および投与経路について記載する特徴との任意の組み合わせを具体的に企図している。
ＶＩＩ．処置方法

【0304】

本明細書中に記載の方法のために、本開示は、本開示の任意の組成物（本出願を通して記載のように、単独で適用するか、異種薬剤にコンジュゲート化する）の使用を意図する。加えて、本明細書に記載するいずれの方法についても、本開示は、１つの方法の任意のステップ（単数もしくは複数）と別の方法からの任意のステップ（単数もしくは複数）の組み合わせを企図している。一定の実施形態では、異種薬剤にコンジュゲート化した抗体または抗原結合断片を、処置方法でおよび／または異種薬剤をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、ヒト被験体への送達など）で細胞内に送達する方法で使用することができる。これらの方法は、有効量の特定の疾患または容態に適切な本開示の化合物を必要とする個体に投与する工程を含む。特定の実施形態では、これらの方法は、本明細書中に開示の任意の抗体または抗原結合断片を必要とする被験体の細胞に送達する工程を含む。

【0305】

用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などを、本明細書中で、一般に所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用する。効果は、疾患、容態、またはその症状の発生または再発の完全なまたは部分的な遅延の観点からは予防的であり得、そして／または疾患または容態ならびに／または疾患もしくは容態に寄与する有害作用の部分的または完全な治癒の観点からは治療的であり得る。「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書中で使用する場合、哺乳動物（特に、ヒト）の疾患または容態の任意の処置を対象とし、以下を含む：（ａ）疾患または容態にかかりやすいかもしれないが依然として罹患していると診断されていない被験体において疾患または容態の発症を防止すること；（ｂ）疾患または容態の抑制（例えば、その発症の停止）；または（ｃ）疾患または容態の緩和（例えば、疾患または容態の後退、１つまたは複数の症状の改善）。

【0306】

一定の実施形態では、本開示は、ヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害を処置する方法を提供する。他の実施形態では、本開示は、異種薬剤に会合した本開示の抗体または抗原結合断片を含むコンジュゲートを必要とする被験体に送達する方法であって、必要とする被験体がヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害を有する、方法を提供する。一定の実施形態では、コンジュゲートを、被験体の細胞内に送達する。一定の実施形態では、異種薬剤は、ヌクレオチド反復障害またはエクソンスプライシング障害の処置、診断、または評価に適切な薬剤である。

【0307】

一定の実施形態では、本開示は、異常なマイクロサテライト拡大に関連する障害（筋緊張性ジストロフィなど）を処置する方法を提供する。他の実施形態では、本開示は、異種薬剤に会合した本開示の抗体または抗原結合断片を含むコンジュゲートを必要とする被験体に送達する方法であって、必要とする被験体が異常なマイクロサテライト拡大に関連する障害（筋緊張性ジストロフィなど）を有する、方法を提供する。一定の実施形態では、コンジュゲートを被験体の細胞内に送達する。

【0308】

筋緊張性ジストロフィ１型（ＤＭ１）は、筋強直性ジストロフィ−プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’−非翻訳領域（３’ＵＴＲ）中のトリヌクレオチド（ＣＴＧ）_ｎ拡大（ｎ＝５０〜＞３０００）に原因する。筋緊張性ジストロフィ２型（ＤＭ２）は、亜鉛フィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）遺伝子の第１のイントロン中のテトラヌクレオチド（ＣＣＴＧ）_ｎ拡大（ｎ＝７５〜約１１，０００）に原因する（Ｒａｎｕｍら，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．ａｎｄ Ｄｅｖ．１２：２６６−２７１）。ＤＭ１およびＤＭ２の病理発生は、マイクロサテライト拡大を有するＲＮＡ上のＭＢＮＬ１隔離による骨格筋細胞中のＭＢＮＬ１の機能喪失に一部起因すると考えられている（Ｍｉｌｌｅｒら，２０００，ＥＭＢＯ Ｊ １９：４４３９−４４４８）。骨格筋細胞をターゲティングする内在化部分（例えば、本明細書中に開示のヒト化抗体およびその抗体断片）は、本明細書中に開示のＭＢＮＬ１タンパク質またはアンチセンスオリゴヌクレオチドをＤＭ１患者およびＤＭ２患者の骨格筋細胞に送達するのに有用であろう。ＤＭ１およびＤＭ２の「処置」には、ＤＭ１、ＤＭ２、またはその組み合わせに関連する任意の以下の効果の改良が含まれる：筋力低下、筋消耗、握力、白内障、握力弛緩困難（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ ｒｅｌａｘｉｎｇ ｇｒａｓｐ）、不整脈（ｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｈｅａｒｔｂｅａｔ）、便秘、および他の消化器系の問題、網膜変性、低ＩＱ、認知障害、前頭部脱毛、皮膚障害、精巣萎縮症、インスリン抵抗性、ならびに睡眠時無呼吸。これらの容態のいずれかの改善を、当該分野で公知の標準的な方法および技術にしたがって容易に評価することができる。例えば、筋緊張性ジストロフィの処置について、この処置を必要とする被験体に、配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能的断片にコンジュゲート化した本開示の抗体または抗原結合断片を投与することができる。一定の実施形態では、これらの方法は、動物、より具体的にはヒトの治療的処置および予防的処置を目的とする。筋緊張性ジストロフィの処置方法に関して、本開示は、任意の前述の態様および実施形態の全ての組み合わせならびに詳細な説明および実施例に記載の任意の実施形態の組み合わせを意図する。筋緊張性ジストロフィの処置における本明細書中に記載の任意の異種薬剤にコンジュゲート化した任意のヒト化内在化部分／断片の有効性の試験に適切な動物モデルは当業者に周知であり、ＭＢＮＬ１^−／−マウス、ＭＢＮＬ２^−／−マウス、ＤＭＰＫ−ＣＴＧマウス、およびｈａｓ１ｒ４１が含まれる。例えば、公開ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／０４４８９４号を参照のこと。

【0309】

一定の実施形態では、本開示は、神経線維腫症（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒａｍｏｔｏｓｉｓ）１型（ＮＦ１）遺伝子ＲＮＡ転写物の異常なスプライシングに関連する障害を処置する方法を提供する。これは、エクソンスプライシング障害または異常なエクソンスプライシングによって特徴づけられる障害の例である。ＭＢＮＬタンパク質がＮＦ１遺伝子ＲＮＡ転写物の適切なスプライシングに関与することが最近証明された。Ｆｌｅｍｉｎｇ，２０１２，ＢＭＣ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３：３５を参照のこと。そのようなものとして、本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬポリペプチドまたはその断片（例えば、配列番号５９）にコンジュゲート化した本明細書中に記載の本開示の任意の抗体または抗原結合断片は、異常なエクソンスプライシングに関連する障害を有する被験体の処置に治療的に有用であり得る。いくつかの実施形態では、障害は神経線維腫症（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒａｍｏｔｏｓｉｓ）である。

【0310】

一定の実施形態では、本開示は、異常なマイクロサテライト拡大に関連する障害（ハンチントン病など）を処置する方法を提供する。ハンチントン病は、筋肉の協調に影響を及ぼし、認知低下および精神医学上の問題を引き起こす遺伝性神経変性障害である。この疾患は、典型的には、中年期に顕著となり、舞踏病と呼ばれる異常な不随意性の身悶えするような動きに関連する。ハンチンチン遺伝子は、「ハンチンチン」タンパク質をコードする。ハンチンチン遺伝子内のＣＡＧトリプレットリピートストレッチの拡大によって異なる（変異）形態のタンパク質が生じ、脳内の細胞を徐々にに損傷する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書中に記載の任意のＭＢＮＬポリペプチドまたはその機能的断片にコンジュゲート化した任意の本明細書中に記載のヒト化内在化部分またはその断片を必要とする被験体に投与することによるハンチントン病を処置する方法を提供する。ハンチントン病の「処置」には、認知および／または精神医学上の欠損症および／または舞踏病の症状の改善、またはハンチントン病のさらなる進行の遅延もしくは停止が含まれる。これらの方法は、動物、より詳細にはヒトの治療的処置および予防的処置を特に目的とする。ハンチントン病の処置方法に関して、本開示は、任意の前述の態様および実施形態の全ての組み合わせならびに詳細な説明および実施例に記載の任意の実施形態の組み合わせを意図する。ハンチントン病の処置における本明細書中に記載の任意の異種薬剤（例えば、ＭＢＮＬポリペプチドまたはその機能的断片）にコンジュゲート化した任意のヒト化内在化部分／断片の有効性の試験に適切な動物モデルは当業者に周知であり、例えば、Ｐｏｕｌａｄｉら，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１４：７０８−７２１で考察した任意の動物モデルが含まれる。

【0311】

任意の前述の一定の実施形態では、本開示は、（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片および（ｉｉ）ＭＢＮＬポリペプチドを含むコンジュゲートの投与による、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは被験体において細胞中のＭＢＮＬ活性を増加させる方法を提供する。

【0312】

一定の実施形態では、本開示は、酵素補充療法（例えば、酵素欠乏症の処置または研究）としての使用に適切な酵素を提供する方法を提供する。同様に、本開示は、タンパク質補充療法（例えば、タンパク質欠乏症の処置または研究）としての使用に適切なタンパク質を提供する方法を提供する。任意の適切な酵素または他のタンパク質を異種薬剤として使用することができ、開示の抗体および抗原結合断片は、かかるタンパク質および酵素の細胞内への送達に有用である。

【0313】

いくつかの実施形態では、酵素は、ＭＴＭ１、ＧＡＡ、またはＡＧＬである。他の適切な酵素および他のタンパク質を同様に意図する。他の実施形態では、本開示は、異種薬剤に会合した本開示の抗体または抗原結合断片を含むコンジュゲートを必要とする被験体に送達する方法であって、必要とする被験体は、酵素欠乏症を有し、そして／または酵素補充療法を必要とする、方法を提供する。一定の実施形態では、コンジュゲートを被験体の細胞内に送達する。一定の実施形態では、異種薬剤は、酵素欠乏症の処置、診断、または評価に適切な薬剤である。一定の実施形態では、本開示は、（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片および（ｉｉ）酵素（酵素補充療法としての使用に適切な酵素など）を含むコンジュゲートの投与によるｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは被験体において細胞中の酵素活性を増加させる方法を提供する。

【0314】

いくつかの実施形態では、本開示は、筋細管筋障害に関連する容態を処置する方法を提供する。筋細管筋障害（ＭＴＭ）は、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）タンパク質であるホスホイノシチドホスファターゼの欠乏に原因する（Ｂｅｌｌｏ ＡＢら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１４）。ＭＴＭ１は遍在性に発現されるが、骨格筋内のＭＴＭ１の不在はＭＴＭの病態生理を唯一説明し（Ｔａｙｌｏｒ ＧＳら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０００ Ａｕｇ １；９７（１６）：８９１０−５；Ｂｅｌｌｏ ＡＢら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００２ Ｎｏｖ １２；９９（２３）：１５０６０−５）、ＭＴＭ１のホスホイノシチドホスファターゼ活性が正常な骨格筋機能に特に不可欠な固有の細胞内機能を保有することを示唆する。骨格筋細胞をターゲティングする内在化部分（例えば、本明細書中に開示のヒト化抗体およびその抗体断片は、ＭＴＭ１タンパク質の筋細管筋障害患者中の骨格筋細胞への送達に有用であろう。ＭＴＭの「処置」には、ＭＴＭに関連する任意の以下の効果またはその組み合わせの改善が含まれる：短命、呼吸機能不全（部分的または完全）、筋緊張の低下、眼瞼下垂、近位筋力の低下、遠位筋力の低下、眼の筋力低下を伴うか伴わない顔面脱力、脊椎の異常な弯曲、関節変形、および眼球運動を制御する筋肉の脱力（眼筋麻痺）。これらの容態のいずれかの改善を、当該分野で公知の標準的な方法および技術にしたがって容易に評価することができる。これらの方法は、治療有効量の筋細管筋障害（ｍｙｏｔｕｂｌａｒ ｍｙｏｐａｔｈｙ）の処置に適切な本開示の組成物を必要とする個体に投与する工程を含む。これらの方法は、特に、動物、より具体的にはヒトの治療的処置および予防的処置を目的とする。筋細管筋障害を処置する方法に関して、本開示は、任意の前述の態様および実施形態の全ての組み合わせならびに詳細な説明および実施例に記載の任意の実施形態の組み合わせを意図する。筋細管筋障害の処置における有効性の試験に適切な動物モデルは当業者に周知であり、筋細管筋障害のＭＴＭ^−／−マウス、Ｍｔｍ１ｐ．Ｒ６９Ｃマウス、およびゼブラフィッシュの各モデルが含まれる。例えば、ＷＯ２０１０／１４８０１０号；Ｐｉｅｒｓｅｎら，２０１２，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２１：８１１−８２５；Ｄｏｗｌｉｎｇら，２００９，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５（２）：ｅ１０００３７２を参照のこと。

【0315】

一定の実施形態では、本開示は、糖原貯蔵障害を処置する方法を提供する。他の実施形態では、本開示は、異種薬剤に会合した本開示の抗体または抗原結合断片を含むコンジュゲートを必要とする被験体に送達する方法であって、必要とする被験体は、糖原貯蔵障害を有する、方法を提供する。一定の実施形態では、コンジュゲートを被験体の細胞内に送達する。一定の実施形態では、異種薬剤は、糖原貯蔵障害の処置、診断、または評価に適切な薬剤である。

【0316】

一定の実施形態では、本開示は、ポンペ病を処置する方法を提供する。ポンペ病は、リソソーム酵素酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠乏を特徴とする常染色体劣性代謝障害である。この障害に罹患している患者は、グリコーゲンのリソソーム貯蔵をグルコースに変換することができず、その結果、最初はリソソームにグリコーゲンが蓄積することになり、そして後に細胞の細胞質および自己貪食小胞にグリコーゲンが蓄積することになる。最終的には、毒性レベルのグリコーゲンの集積が細胞を損傷させ、適正な機能を損なわせる。リソソーム酵素酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）は、グリコーゲン加水分解を媒介する酵素の１つである。これらの方法は、治療有効量のポンペ病の処置に適切な本開示の組成物を必要とする個体に投与する工程を含む。一定の態様では、（ｉ）成熟形態のＧＡＡの送達、（ｉｉ）ＧＡＡポリペプチド（成熟形態より長いが１１０ｋＤａの前駆体形態より短い）の送達、および／または（ｉｉｉ）細胞内、さらには適切な細胞内区画内へのポリペプチドの送達を容易にするための内在化部分に接続したコンジュゲートとしての任意のサイズの活性を有するＧＡＡポリペプチドの送達のいずれかに有利であり得る。理論により拘束されないが、たとえ本開示のポリペプチドが前駆体ＧＡＡポリペプチドと実質的に同じ活性を有しても、細胞質への送達を促進する内在化部分によって場合により助長される適正な細胞位置への送達は、細胞に送達される有効なＧＡＡ活性を増加させることになる。

【0317】

ポンペ病の「処置」には、ＧＡＡ（またはその組み合わせ）の機能障害に関連する以下の影響のうちのいずれかの改善が含まれる：ＧＡＡ活性の減少（例えば、処置によりＧＡＡ活性が増加する）、細胞中のグリコーゲン蓄積（例えば、処置によりグリコーゲン蓄積が減少する）、クレアチンキナーゼレベルの増加、尿中グルコーステトラサッカリドの上昇、心臓サイズの減少、肥大型心筋症、呼吸器合併症、人工呼吸器の依存、筋肉の機能不全および／または衰弱、運動機能の喪失、車椅子または他の運動補助具形態の依存、直立のための頸部または腹部の支持装具の依存、筋線維の超微細構造の損傷、筋肉の緊張および機能の喪失。これらの症状のうちのいずれかの改善を、当該分野で公知の標準的な方法および技術にしたがって容易に評価することができる。ポンペ病処置の有効性を決定するために、上記で列挙していない他の症状もモニタリングすることができる。これらの方法は、動物、より具体的にはヒトの治療的処置および予防的処置を特に目的とする。ポンペ病を処置する方法に関して、本開示は、任意の前述の態様および実施形態の全ての組み合わせならびに詳細な説明および実施例に記載の任意の実施形態の組み合わせを意図する。ポンペ病の処置における有効性の試験に適切な動物モデルは当業者に周知であり、ブラーマンおよびショートホーン、ラップランド犬、ネコ、ヒツジ、ならびにウズラの一系統などの動物が含まれる（Ｋｉｋｕｃｈｉら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｃｉｄ Ｍａｌｔａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｑｕａｉｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０１（４）：８２７−８３３，１９９８）。さらに，ＧＡＡ遺伝子の標的破壊によるマウスモデルが開発されている（Ｇｅｅｌら，Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，９２：２９９−３０７，２００７にまとめられている）。

【0318】

一定の実施形態では、本開示は、フォーブス・コリ病を処置する方法を提供する。糖原貯蔵障害ＩＩＩ型またはグリコーゲン脱分枝酵素欠損症としても公知のフォーブス・コリ病は、推定頻度が出生数１００，０００人に対して１人の常染色体劣性神経筋疾患／肝疾患である。フォーブス・コリ病の臨床像はある程度確立されているが、非常に変動する。一般に肝腫大および硬変を伴う肝臓疾患と考えられているが、フォーブス・コリ病は、種々の他の系の異常によっても特徴づけられる。筋力低下、筋消耗、低血糖、異常脂質血症、および精神遅滞（稀に）も本疾患で認められ得る。一部の患者で顔面異常が認められる。一部の患者は、骨粗鬆症リスクの増加も認められ得る。フォーブス・コリ病は、ＡＧＬ遺伝子の変異に原因する。ＡＧＬ遺伝子はアミロ−１，６−グルコシダーゼ（ＡＧＬ）タンパク質をコードし、このタンパク質は、グリコーゲンおよび類似の分子中の末端α−１，６−グルコシド結合の切断の触媒を担う細胞質酵素である。ＡＧＬタンパク質は、以下の２つの個別の酵素活性を有する：４−α−グルコトランスフェラーゼ活性およびアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性。両触媒活性は、正常なグリコーゲン脱分枝活性に必要である。本明細書中に提供した方法および組成物を、機能的ＡＧＬを置換し、そして／またはそうでなければ肝細胞および筋細胞などの細胞の細胞質中の有害なグリコーゲン構築を減少させるために使用することができる。これらの方法は、治療有効量のフォーブス・コリ病の処置に適切な本開示の組成物（例えば、ＧＡＡまたはＡＧＬポリペプチドにコンジュゲート化した本明細書中に記載の任意のヒト化内在化部分またはその断片を含む組成物）を必要とする個体に投与する工程を含む。フォーブス・コリ病の「処置」には、フォーブス・コリ病に関連する以下の影響またはその組み合わせのいずれかの改善が含まれる：骨格筋障害、心筋症、肝硬変、肝腫大、低血糖、低身長、異常脂質血症、発育不全、精神遅滞、顔面異常、骨粗鬆症、筋力低下、疲労、および筋萎縮。処置には、異常なレベルの細胞質グリコーゲンの低下、高レベルのアラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、またはクレアチンホスホキナーゼのうちの１つまたは複数の低下（血清中のかかるレベルの低下など）のうちの１つまたは複数も含まれ得る。これらの容態のいずれかの改善を、当該分野で公知の標準的な方法および技術にしたがって容易に評価することができる。フォーブス・コリ病処置の有効性を決定するために、上記で列挙していない他の症状もモニタリングすることができる。筋細管筋障害の処置における有効性の試験に適切な動物モデルは当業者に周知であり、ヒトにおけるフォーブス・コリ病に類似の疾患を示すＡＧＬ遺伝子がフレームシフト変異したカーリーコーテッドレトリヴァー（Ｙｉら，２０１２，Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，５：８０４−８１１）およびマウスがＡＧＬ遺伝子内に単一のＥＮＵ誘導性塩基対変異を保有するＦｏｒｂｅｓ−Ｃｏｒｉのマウスモデルが含まれる。Ａｎｓｔｅｅら，２０１１，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，５４（Ｓｕｐｐ １−Ａｂｓｔｒａｃｔ ８８７）：Ｓ３５３。

【0319】

任意の前述の一定の実施形態では、本開示は、（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片および（ｉｉ）成熟ＧＡＡを含むＧＡＡポリペプチドを含むコンジュゲートの投与による、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは被験体において細胞中のＧＡＡ活性を増加させる方法を提供する。任意の前述の一定の実施形態では、本開示は、（ｉ）本開示の抗体または抗原結合断片および（ｉｉ）ＡＧＬポリペプチドを含むコンジュゲートの投与による、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは被験体において細胞中のＡＧＬ活性を増加させる方法を提供する。

【0320】

任意の前述の一定の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載の任意の内在化部分を使用して腫瘍細胞または癌細胞を処置する方法を提供する。理論に拘束されないが、本明細書中に記載の内在化部分は、一定の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数のいずれかが可能である：ａ）内在化部分（例えば、本明細書中に記載の任意の異種薬剤）にコンジュゲート化した薬剤の腫瘍細胞または癌性細胞へのターゲティング（例えば、送達）、ｂ）ターゲティングされた腫瘍細胞または癌細胞の成長、増殖、サイズ、生存、または移動の死滅および／または減少、ｃ）腫瘍細胞または癌細胞に対する内在化部分にコンジュゲート化した任意の薬剤（例えば、化学療法薬）の効果を増加させること、および／またはｄ）腫瘍細胞または癌細胞に対する任意の個別に施した薬剤または治療（例えば、化学療法薬または放射線療法）の効果を増加せること。一定の実施形態では、内在化部分を、異種薬剤の非存在下で（例えば、異種薬剤に相互接続していない）または異種薬剤の非存在下で細胞に投与／送達する。例えば、一定の実施形態では、内在化部分を、異種薬剤の非存在下で腫瘍内へ送達するために細胞に投与する。
ＶＩＩＩ．他の用途

【0321】

本開示の組成物には種々の用途がある。例えば、単独または異種薬剤にコンジュゲート化したヒト化抗体および抗原結合断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞および組織中の優先的な細胞および組織の分布の研究に有用である。同様に、単独または異種薬剤にコンジュゲート化したヒト化抗体および抗原結合断片は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの診断での適用などのための造影剤として有用である。例えば、放射性部分にコンジュゲート化したヒト化抗体または抗原結合断片は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ画像化研究に有用である。かかる研究は、癌ならびに骨格筋および心筋の欠損または傷害（かかる組織への抗体部分の局在化に起因する）の画像化に特に有用である。ＷＯ２０１２／１４５１２５号を参照のこと。同様に、任意の開示の抗体または抗原結合断片が同様に有用である。

【0322】

さらに、本開示の抗体および抗原結合断片（ヒト化抗体および抗原結合断片など）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでの細胞および組織内への異種薬剤の送達に有用である。例として、本開示は、異種薬剤を含むコンジュゲートまたは他のコンジュゲートを細胞内へ送達する方法を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合、本開示のコンジュゲートは、送達される異種薬剤の結合パートナーの同定（例えば、異種薬剤に結合するタンパク質またはペプチドの同定）、ならびに局在化および輸送の評価に適切である。同様に、ｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、本開示のコンジュゲートは、送達される異種薬剤の結合パートナーの同定（例えば、異種薬剤に結合するタンパク質またはペプチドの同定）、局在化および輸送の評価、生体内分布および半減期の評価、ならびに免疫原性の評価に適切である。

【0323】

さらに、本開示の抗体および抗原結合断片（本開示のヒト化抗体または抗原結合断片など）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ（ヒト被験体中など）での診断薬として有用である。例えば、本開示の抗体または抗原結合断片を、画像化に適切な検出可能な標識などを使用して標識することができる。標識された抗体または抗原結合断片を、細胞に投与することができるか、ｅｘ ｖｉｖｏで投与することができるか、被験体に投与することができ、細胞および組織内の抗体の局在化を評価し、そして／またはクリアランスを評価するために使用することができる。３Ｅ１０抗体がＥＮＴ２発現癌に局在することを考慮すると、一定の実施形態では、標識した抗体は、ＥＮＴ２発現癌の画像化および／または診断のための診断試薬として有用である。

【0324】

一定の実施形態では、ヒト化抗体および抗原結合断片は、マウス抗体と比較して免疫原性が低いので、ヒト被験体での使用に好ましい。最後に、単独または異種薬剤にコンジュゲート化したヒト化抗体および抗原結合断片は、マウス親抗体と比較したこのヒト化抗体の相対的な性質の解明に有用であり、他のヒト化抗体も同様である。かかる比較は、有効性の見込みおよび製造能力を改良する特徴の両方の観点からの送達剤の最適化に有用である。同様に、任意の開示の抗体または抗原結合断片が同様に有用である。

【実施例】

【0325】

実施例
本開示をここに一般的に説明し、以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろう。実施例は、本開示の一定の態様および実施形態の例示のみを目的として含まれ、本開示を制限することを意図しない。
実施例１：第一世代ヒト化３Ｅ１０抗体の調製

【0326】

第一世代ヒト化３Ｅ１０抗体を、ヒト化抗体フレームワークの選択およびデザインプロトコールを使用して生成した。親のマウス抗体は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインおよび配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインを含むマウス３Ｅ１０抗体であった。本発明者らは、この重鎖可変ドメインはＡＴＣＣに寄託された元の３Ｅ１０抗体の重鎖可変ドメインではなく、むしろ、単一のアミノ酸置換（例えば、Ｖ_Ｈ中のＤからＮへの置換）を含むことに留意している。しかし、このバリアントＶ_Ｈを事前に生成し、細胞透過およびＤＮＡ結合活性を保持することを示していた。前述のＶ_ＬおよびＶ_Ｈを含むマウス抗体を、親のマウス３Ｅ１０抗体として使用した。

【0327】

マウス抗体Ｖ_Ｌアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号５３）をＢＬＡＳＴデータベース検索に供し、上位５つの最も密接なヒト免疫グロブリン軽鎖ホモログを同定し、軽鎖ＣＤＲグラフティングの候補と見なした。同様に、マウス抗体Ｖ_Ｈアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号５４）をＢＬＡＳＴデータベース検索に供し、上位５つの最も密接なヒト免疫グロブリン重鎖ホモログを同定し、重鎖ＣＤＲグラフティングの候補と見なした。この分析では、Ｋａｂａｔに従って決定したＣＤＲを同定し、連関ＣＤＲと見なした。Ｋａｂａｔ ＣＤＲを配列番号３２〜３７に記載する。

【0328】

次いで、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴｉ配列アラインメントツールを利用して、前述のマウス３Ｅ１０の軽鎖および重鎖由来のＫａｂａｔ ＣＤＲならびに５つのヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖ホモログのうちのいずれか１つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなるキメラアミノ酸配列を分析した。次いで、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴｉ分析に基づいて、ヒト化軽鎖アミノ酸配列の上位３つの候補のアミノ酸配列およびヒト化重鎖アミノ酸配列の上位３つの候補のアミノ酸配列を、種々の組み合わせで組み合わせてヒト化ｓｃＦｖアミノ酸配列群を生成した。このヒト化ｓｃＦｖ群の分析に基づいて、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインおよび配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインを含むヒト化ｓｃＦｖを、第一世代のリードヒト化抗体断片として選択した。したがって、このアプローチに基づいて、リード候補ヒト化抗体（または断片）は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈドメインおよび配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌドメインを含む。上述のように、第一世代ヒト化抗体を、Ｋａｂａｔスキームによって定義したＣＤＲを使用して生成した（Ｋａｂａｔら Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。本実施例では、親抗体のＫａｂａｔ ＣＤＲをこのヒト化抗体中に維持する（例えば、この第一世代ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬは配列番号３２〜３７に記載の６つのＣＤＲを含む）。

【0329】

第一世代リードヒト化抗体を、哺乳動物細胞中に断片（ｓｃＦｖ）として最初に産生した。具体的には、１×２００ｍｌのＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈｉｓタグ化ヒト化ｓｃＦｖ抗体断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターで一過性にトランスフェクトした。配列番号４３は、そのベクターによって産生されたｓｃＦｖの配列を提供する（シグナル配列を示さない）。トランスフェクトした細胞培養物を、１０％ＣＯ_２にて振盪しながら３７℃でインキュベートした。トランスフェクションから６日後、回収時に認められた細胞生存率は９７％であり、培養上清を回収し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）によって明澄化した。明澄化した上清を、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＦＦニッケル−アフィニティカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および５００ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）に向かう直線溶離勾配を使用して精製した。溶離中に１つの大きなピークが認められ、３つのピークの３ｍｌ画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗Ｈｉｓ_６ウェスタンブロット、およびＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。

【0330】

３つの溶離ピーク画分は全て抗Ｈｉｓ−タグ検出の正の結果を示し、Ｈｉｓタグ化ｓｃＦｖ産物の存在が確認された。非還元条件下にて抗Ｈｉｓ_６ウェスタンブロットを実施した画分サンプルは、単量体、二量体、およびより大きなオリゴマーのバンドの存在を示し、ｓｃＦｖ産物が二量体化または三量体化することが示唆された。
実施例２：第二世代抗体の生成

【0331】

実施例１に記載の抗原結合断片の精製が困難であり、且つ優れたヒト化抗体を開発するために、本発明者らはオルタナティブヒト化抗体の開発を試みた。第二世代のヒト化軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをデザインする場合、実施例１に記載のマウス３Ｅ１０可変ドメインを親ＶＨおよびＶＬとして再度使用した。このアプローチのために、潜在的なＦＲの変化がＩＭＧＴスキームと比較して評価されるようにＩＭＧＴスキーム（ＬｅＦｒａｎｃら，２００３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７：５５−７７）に従ったＣＤＲを一定に保持した一方で、Ｋａｂａｔスキームに従ってＣＤＲ中にいくつかの置換を導入した。このアプローチを使用して、産生された第二世代のヒト化軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、第一世代のヒト化抗体およびマウスの親抗体と比較していくつかの配列が異なる。ＩＭＧＴスキームを使用して決定したＣＤＲを配列番号１〜６に記載し、Ｋａｂａｔスキームを使用して決定したＣＤＲを以下に示す：配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号３５または５０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３。

【0332】

オルタナティブな第二世代の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを、配列番号４１の第一世代リードＶＬアミノ酸配列および配列番号４２の第一世代リードＶＨアミノ酸配列と比較していくつかのアミノ酸配列が変化するようにデザインした。さらに、第一世代ヒト化抗体（それぞれ配列番号４１および４２を含む）で改変された配列番号７のマウス３Ｅ１０のＶＬのアミノ酸配列および配列番号９のマウス３Ｅ１０のＶＨのアミノ酸配列のいくつかの特異的アミノ酸残基が、第二世代のヒト化軽鎖配列および重鎖配列のそれぞれに特異的に保持されていた。例えば、配列番号９のアミノ酸４７位のトリプトファンを、第二世代ヒト化重鎖のいずれにおいても変化させなかった。これは、この位置が適切な重鎖の折りたたみに関与する可能性があることが後に認識されたからである。また、配列番号７の５３位のリジンを第二世代ヒト化軽鎖のいずれにおいても変化させなかった。これは、この位置が適切なＤＮＡ標的結合に関与すると考えられたからである。さらに、実施例１に記載の配列番号４１の第一世代リード軽鎖可変ドメインがそれぞれアミノ酸８０位および８１位にアスパラギンおよびプロリンを有していた一方で、これら２つのアミノ酸により、大量産生中に非酵素自己切断が起こり得る。そのようなものとして、第二世代ヒト化軽鎖配列は、配列番号４１のアミノ酸８０位および８１位にそれぞれ対応する（配列番号７の８０位および８１位にも対応する）アミノ酸位にアスパラギンおよびプロリンの組み合わせを含まなかった。また、実施例１で生成した全てのヒト化軽鎖配列がＶ−ｌｉｇｈｔ７−３軽鎖配列に由来していた一方で、第二世代ヒト化軽鎖配列は、軽鎖のＶ−ｌｉｇｈｔ１ファミリーに由来していた。本発明者らは、ここで、本発明者らが、配列番号７もしくは９（マウス）または配列番号４１もしくは４２（第一世代ヒト化）に記載の直鎖配列と比較したアミノ酸の位置によってＶＨまたはＶＬに導入した変化を記載したことに留意している（例えば、直鎖アミノ酸配列を参照して変化を記載し、他の分子中の変化が直鎖配列中の引用した位置に対応する位置にあると理解される）。配列番号７、９、４１、または４２と長さが異なる分子などの他の分子と比較するために、配列番号７、９、４１、４２中の引用した位置に対応する位置の変化を理解することができる。対応する位置を、容易に利用可能な配列アラインメントツールおよびデフォルトパラメータなどを使用した配列アラインメントによって容易に決定することができる。さらに、配列番号７、９、４１、または４２の直鎖アミノ酸配列と比較して記載したアミノ酸の位置を、ＫａｂａｔのナンバリングスキームまたはＩＭＧＴのナンバリングスキームを使用して記載することもできる。いずれかのシステムは、異なる可変ドメインを比較する場合にＣＤＲ領域またはＦＲ領域中の対応するアミノ酸を同定するためのスキームを提供する。当業者は、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．ｉｔ／ｄｉｇｉｔ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐを参照のこと）またはＩＭＧＴナンバリングスキーム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｍｏｕｓｅＩｇを参照のこと）を参照して本明細書中に開示の可変ドメイン中のアミノ酸残基を容易に同定することができ、このナンバリングスキームを使用して開示のＶＨドメインおよびＶＬドメインを他の抗体と比較することができる。

【0333】

２つの配列番号７のマウス配列由来の第二世代のヒト化軽鎖可変ドメイン（例えば、配列番号７は親Ｖ_Ｌであった）および３つの配列番号９のマウス配列由来の第二世代のヒト化重鎖可変ドメイン（例えば、配列番号９は親Ｖ_Ｈであった）をデザインした。本発明者らは、３つの第二世代のヒト化Ｖ_ＨドメインをＨＨ１、ＨＨ２、およびＨＨ３と呼ぶ。本発明者らは、２つの第二世代のヒト化Ｖ_ＬドメインをＨＬ１およびＨＬ２と呼ぶ。

【0334】

マウスの配列番号７または配列番号９の親配列と比較したそれぞれのデザインした第二世代のヒト化配列の配列アラインメントを、図１に示す。作製および試験したマウス親ＶＨおよびＶＬならびにそれぞれの異なる第二世代の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの説明を、表１に提供する。マウスの親ＶＨは配列番号１〜３に記載のＩＭＧＴ ＣＤＲを含み、各ヒト化ＶＨはこれらのＩＭＧＴ ＣＤＲも含む。さらに、マウスの親ＶＬは配列番号４〜６に記載のＩＭＧＴ ＣＤＲを含み、各ヒト化ＶＬはこれらのＩＭＧＴ ＣＤＲも含む。しかし、Ｋａｂａｔ ＣＤＲは、ヒト化ＶＨおよびＶＬとマウスＶＨおよびＶＬの間で異なる。

【表1】

【0335】

マウス３Ｅ１０の重鎖可変ドメイン（ＭＨ１−配列番号９）ならびにＨＨ１、ＨＨ２、およびＨＨ３の各重鎖可変ドメインを、以下から選択される軽鎖可変ドメインとの種々の対の組み合わせで示した：（ｉ）マウス３Ｅ１０（ＭＬ１−配列番号７）、（ｉｉ）ＨＬ１、および（ｉｉｉ）ＨＬ２。簡潔にするために、各対の組み合わせを、これらの実施形態において各抗体中に存在する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインに関して言及するであろう（例えば、ＨＨ１／ＨＬ１は、ＨＨ１重鎖可変ドメインおよびＨＬ１軽鎖可変ドメインを含む抗体である）。これらの実験のために、全長抗体を作製し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ上に組換え発現されたＶＨおよびＶＬの各対の組み合わせを使用して試験したことに留意のこと。抗体断片（重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの組み合わせを含むＦａｂまたはｓｃＦｖなど）を同様に意図し、本明細書中に記載のように作製および評価することができる。さらに、抗体を、他の免疫グロブリン骨格（非ヒト骨格が含まれる）上に容易に作製することができるが、好ましくは、他のヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常骨格（ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の各骨格など）上に作製することができる。

【0336】

各対の重鎖／軽鎖組み合わせ（全部で１２種−表２を参照のこと）をコードするＤＮＡを、ＧＳ Ｘｃｅｅｄ遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ）を使用して単一のベクターに挿入し、得られたベクターを安定にトランスフェクトし、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ細胞中で発現させた。

【表2-1】

【表2-2】

【0337】

１２種の各構築物のための１つのトランスフェクションを、１２５ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中に確立した。培養物を、その生存細胞密度が０．６×１０^６細胞／ｍＬを超えた場合に、１００ｍＬ培養物に継代した。細胞をさらに継代して、各バリアントについて１Ｌの曝気エルレンマイヤーフラスコ中に２×４００ｍＬの培養物（全部で８００ｍＬ）を産生した。培養４〜６日後に、上記の全ての抗体について、安定にトランスフェクトした培養物において良好な生存度および抗体発現が認められた。培養６日後に細胞を回収し、明澄化した上清をプールし、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡカラムで精製した。溶離された産物を、１Ｍ Ｔｒｉｓ（体積比１：４０）で中和し、０．２２μｍフィルターでろ過した。全産物の最終ｐＨ値は、７．２〜７．６の範囲であった。

【0338】

図２Ａに示すように、明確な凝集が認められない推定抗体サイズ（１５０ｋＤａ）の単一の主なバンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して非還元条件下で作製および試験した全ての抗体で認められた。同様に、図２Ｂに示すように、明確なタンパク質分解物が認められない推定された抗体重鎖および軽鎖のサイズ（それぞれ、５０ｋＤａおよび２８ｋＤａ）の２つのバンドが、還元条件下で作製および試験した全ての抗体で認められた。

【0339】

Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０（内径９．４ｍｍ×２５ｃｍ）カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）でのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は、全ての第二世代ヒト化抗体が精製後に高純度であることを示す。図３Ａおよび３Ｂ中の各抗体について示すように、ＳＥ−ＨＰＬＣは、試験した全ての抗体産物が高純度であることが証明され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と一致していた。試験した抗体について保持時間約８．７分にメインピークが検出され、ほとんどの抗体産物（＞９９％）が単量体として存在することが示唆された。しかし、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析は低レベル（＜０．５％）の高分子量の夾雑物の存在を示し、ＭＨ１／ＭＬ１抗体およびＨＨ３／ＭＬ１抗体の精製組成物中の低レベルの可溶性凝集物と一致した。
実施例３：ＱＣＭ結合アッセイ

【0340】

配列番号７に記載のＶＬおよび配列番号９に記載のＶＨを含む特異的３Ｅ１０を含むマウス３Ｅ１０は、そのＤＮＡ結合能が知られている（例えば、ＤＮＡは、３Ｅ１０によって認識される抗原／エピトープ（例えば、標的）である）。したがって、実施例２で生成した異なる各抗体のＤＮＡ結合性を、ＱＣＭを使用して評価した。使用したＤＮＡ基質は、一方の鎖が配列番号６３に記載のヌクレオチド配列からなる短い平滑末端ＤＮＡであった。１つまたは複数のヒト化ＶＨおよび／またはＶＬドメインの任意の組み合わせを有する実施例２に記載の全ての抗体を試験し、これらはＤＮＡ結合活性を有していた。ネガティブコントロールとして、マウスの親重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含むが、ＶＬ中にＲ９２Ｎ変異（ＤＮＡ結合活性を破壊することが公知の変異）を有する抗体を生成し、使用した。

【0341】

さらに、予め生成したヒトＦｃ骨格上のＭＨ１／ＭＬ１抗体サンプル（３Ｅ１０ ＨｕＩｇＧ１）を、これらの実験において、経時的に（すなわち、ＱＣＭ試験の開始から終了まで）ＱＣＭアッセイの感度をモニタリングするためのコントロールとして利用した。３Ｅ１０ ＨｕＩｇＧ１について実験の開始から終了までＫ_Ｄの有意な増加が認められ、この増加は、一連の実験にわたるアッセイ対象の分解を示す。これは、特定の実験中の後半に得られたデータが親和性を過小評価する可能性がある（例えば、実際よりも高いＫ_Ｄを示すかもしれない）ことを示す。したがって、実験中の後半に評価したヒト化抗体が本発明者らのヒト化抗体を使用して得られたＫ_Ｄの改善を過小評価する可能性がある（例えば、ヒト化抗体サンプルが特定のＱＣＭ実験中の早期に試験されていたならば、実験の終了前に試験したヒト化抗体サンプルはさらに低いＫ_Ｄ（より改善された親和性）に関連していたであろうということが示唆される）。キメラ抗体（ヒト定常領域上のマウス可変ドメイン）のこのサンプルを、ヒト化抗体と同時に作製および精製しなかったので、本明細書中で第二世代ヒト化抗体との特異的比較のために使用しなかった。むしろ、ＭＨ１／ＭＬ１に関して比較する。

【0342】

ＱＣＭ結合アッセイの結果を、表３に示す。

【表3】

【0343】

実施例４：ヒト化抗体濃度の研究
各抗体重鎖／軽鎖の組み合わせを、３０Ｋ ＭＷＣＯ遠心濾過器、５ｍＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。抗体を約３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した製剤中の各ヒト化抗体の安定性を評価した。それぞれの濃縮前および濃縮後の抗体サンプルの安定性および性質を、多数のアッセイ（目視検査、Ａ２８０、Ａ６００−混濁度、ｐＨ、ＨＰ−ＳＥＣ、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下および非還元条件下）が含まれる）によって評価した。

【0344】

目視検査のために、それぞれの出発抗体材料および濃縮抗体材料をタイプ−Ｉガラスバイアルをライトボックス（非ＵＳＰ）中に入れて、透明性、乳白光、および任意の目視可能な粒子の存在を決定した。

【0345】

抗体濃縮過程後の各抗体の回収率を決定するために、Ａ２８０ｎｍ分析を行った。Ａ２８０ｎｍ分析のために、濃縮材料を４０倍希釈し、Ａ２８０ｎｍ分析によって分析した。濃縮サンプルの回収率を、濃縮前に回収した総タンパク質（負荷８ｍｇ）と濃縮後に回収したタンパク質（体積×Ａ２８０濃度）との比較によって決定した。

【0346】

Ａ６００ｎｍ混濁度分析のために、各抗体組成物中の濃縮前Ａ６００ｎｍレベルと濃縮後Ａ６００ｎｍレベルとの間の相違の測定によって混濁度を決定した。

【0347】

ｐＨ分析のために、濃縮前および濃縮後の抗体サンプルを、マイクロプローブを使用して適切に分析した。

【0348】

ＨＰ−ＳＥＣ分析のために、約６０μｇの出発抗体サンプルおよび濃縮抗体サンプルをＨＰ−ＳＥＣに適切にロードし、２８０ｎｍでモニタリングした。使用カラムは、Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ−Ｃ３００であり、以下の条件を使用した：ＭＰ＝０．２Ｍ ＫＰＯ_４、０．２５Ｍ ＫＣｌ（ｐＨ６．０）。ＨＰＬＣプロフィールを、濃縮前および濃縮後の比較のために標準化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、濃縮前および濃縮後の抗体サンプルを、非還元条件下および還元条件下で分析した。

【0349】

ヒト化抗体濃縮研究の結果を、図４に提供する。
実施例５：Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ

【0350】

実施例２で調製した異なる各抗体の結合特性をさらに評価するために、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイを行った（ＳＰＲによる結合親和性）。Ｘａｎｔｅｃ ＣＭＤ５００ｍセンサチップを備え、ランニング緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で平衡化した３つのＢｉａｃｏｒｅ２０００光学バイオセンサーを使用して２５℃で結合研究を行った。各ＤＮＡ結合サイクルの終了時に、３Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０の１４秒間の注入によって抗体表面を再生させた。固定化のために、抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）でそれぞれ５０倍希釈し、標準的なアミンカップリングを使用して約１５，０００〜２７，０００ＲＵの密度に固定化した。鎖の一方が配列番号６３の配列からなる２本の鎖を含む短い平滑末端ＤＮＡを、６７ｎＭから出発する３倍連続希釈物において結合について２連で試験した。

【0351】

１つまたは複数のヒト化ＶＨおよび／またはＶＬドメインの任意の組み合わせを有する実施例２に記載の全ての抗体を試験し、これらの抗体はＤＮＡ結合活性を有していた。
実施例６：細胞透過アッセイ

【0352】

マウス３Ｅ１０抗体は、細胞質膜および核膜の両方を透過することができる。生成したヒト化抗体の細胞透過活性を評価するために細胞透過アッセイを行った。ＣＯＳ７細胞を、９６ウェルプレート中に１０，０００細胞／ウェル／１００μｌでプレートし、ウェルあたり１００μｌの各実施例２抗体を含む１０％ＰＢＳを添加した。ウェルあたりの最終抗体濃度は５０μｇ／ｍｌであった。抗体を細胞と共にインキュベーター中で１時間インキュベートし、その後に吸引し、１００μｌＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を、ＥｔＯＨで１０分間透過処理し、２回のＰＢＳ洗浄によって再水和した。次いで、ウェルを、１００μｌの２％血清を含むＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロッキングした。次いで、サンプルを希釈した二次抗体とインキュベートした。このインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、アルカリホスファターゼ色素原（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）とインキュベートした。５９５ｎｍの吸光度を測定し、次いで、各ウェルを顕微鏡で観察し、沈殿強度スコア（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）を記録した。この実験を２回行った。研究Ａでは、評価者は盲検法で評価せず、沈殿物の強度を１（最小強度）から５（最大強度）までのスケールで点数化した。研究Ｂでは、評価者は盲検法で評価し、沈殿強度を１（最小強度）から１０（最大強度）までのスケールで点数化した。強度スコアが高いほど観察された細胞透過レベルが高い。

【0353】

１つまたは複数のヒト化ＶＨおよび／またはＶＬドメインの任意の組み合わせを有する実施例２に記載の全ての抗体を試験し、これらの抗体は原形質膜および核膜を透過することが可能であった。換言すれば、これらの抗体はＣＯＳ細胞を透過した。
実施例７：遺伝毒性および細胞傷害性の評価

【0354】

１つのヒト化抗体の遺伝毒性（すなわち、薬剤が核酸を損傷させる能力）および細胞傷害性を、ＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ ＨＣアッセイで評価した。本試験の実施において、ヒト化抗体の連続希釈物を、底が光学的に透明な９６ウェルの黒色マイクロプレート中で生成した。標準的な遺伝毒性化合物（メチルメタンスルホン酸、ＭＭＳ）も、プレート内の品質管理チェックとして添加した。２系統の培養ヒトリンパ芽球様ＴＫ６細胞を使用した。これらは試験株（ＧｅｎＭ−Ｔ０１）および非蛍光コントロール株（ＧｅｎＭ−Ｃ０１）であり、後者は試験化合物からの任意の自己蛍光の補正のために使用した。遺伝毒性ストレスに対する適応応答を媒介するＧＡＤＤ４５ａ遺伝子の適切な制御を活用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター系を試験株に組み込んだ。遺伝毒性化合物への曝露によりＧＦＰ発現が増加し、それ故、試験株中の細胞蛍光が誘導される。各抗体希釈物を、等体積のＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ ＨＣ細胞を含む特化した成長培地と合わせた。マイクロプレートを通気性膜で被覆し、５％ＣＯ_２および湿度９５％にて３７℃で４８時間インキュベートした。プレートを、マイクロプレートリーダーを使用して２４時間後および４８時間後に分析し、マイクロプレートウェル中の細胞および溶液についての吸光度および蛍光を測定する。吸光度は、細胞増殖に比例し、細胞増殖は有毒分析物によって低下する。蛍光は細胞のＤＮＡ修復系の活性に比例し、この活性は遺伝毒性分析物によって増加する。蛍光を、細胞傷害性に原因する細胞収率の変動を補正するために吸光度のシグナルに標準化した。ＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎ ＨＣアッセイは、非蛍光コントロール株、試験株の蛍光データから差し引いた蛍光データ（細胞あたり）を使用した試験化合物の自己蛍光の自動補正機能を有する。次いで、被験物質の自己蛍光（データ分析テンプレート中で自動的に合図される）がより強い場合、蛍光偏光（ＦＰ）データ収集プロトコールを使用する。本質的に、これは、ＧＦＰ蛍光を試験化合物の自己蛍光と区別するためにＧＦＰの高蛍光異方性を活用する。ＦＰデータを、各マイクロプレートウェルに平行偏光を照射し、励起光に対して平行（Ｉｐａｒａ）および垂直（Ｉｐｅｒｐ）の両方の蛍光強度を測定することによって収集した。データ分析のために使用した蛍光強度は、これらの測定値の間の差であり（Ｉｐａｒａ−Ｉｐｅｒｐ）、この差はＧＦＰで大きく、一般にサイズが遥かに小さく、蛍光異方性が低い自己蛍光試験分子では不釣り合いに小さい。Ｃｙｐｒｏｔｅｘ ＧｒｅｅｎＳｃｒｅｅｎアッセイによって判断したところ、健康なヒト細胞中のヒト化抗体に関連する遺伝毒性や細胞毒性は認められなかった。
実施例８：ヒト化抗体の安定性、脱アミド化、および酸化の評価

【0355】

任意の実施例２のヒト化抗体のさらなる性質（親のマウス抗体と比較して改善され得る任意の１つまたは複数の性質）は、安定性、脱アミド化、および酸化である。さらにまたはあるいは、任意の１つまたは複数のこれらの性質はまた、独立して、任意のヒト化抗体について、実施例１のヒト化抗体などのこの同一のマウス親から生成した他のヒト化抗体と比較してより良好であり得る。研究、診断、または治療での使用に適切なヒト化抗体がそのマウス親抗体および／または別のヒト化抗体と比較して１つまたは複数の改善された性質を有し得るにもかかわらず、そうでなくてもよいことに留意のこと。例えば、適切なヒト化抗体は、マウス親抗体と比較して、特定のパラメータが単に同等であり得るか最小または有意でない減少のみ示して良い。さらに、いくつかの性質が改善され得る一方で、抗体の使用を有意に害する方法で他の性質が単に同等であるか減少しない。

【0356】

任意の実施例２のヒト化抗体がマウス親３Ｅ１０抗体および１つまたは複数の他のヒト化抗体（実施例１のヒト化抗体など）のいずれかまたは両方と比較した場合に安定性、脱アミド化特性、および／または酸化特性の改善に関連するのかという疑問に取り組むために、以下のアッセイを行うことができる。これらのアッセイは例であり、他の利用可能なアッセイも利用することができる。本発明者らはまた、全長抗体に加えて、ヒト化された重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのこれらの種々の組み合わせを含む抗体断片も意図し、本明細書中に教示することに留意している。ヒトＩｇ骨格上にないが、かかる抗体断片をヒト化ということもできる。適切な断片には、例えば、リンカーを介して相互接続されたＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖまたはＦａｂが含まれる。抗体および抗体断片の性質を、本明細書中に記載の任意の方法または他の利用可能な方法を使用して容易に評価することができる。

【0357】

所与の溶液（例えば、生理食塩水）中の所与の温度（例えば、０℃、４℃、２５℃）でのインキュベーション後（例えば、６時間後、２４時間後、１週間後）、実施例２のヒト化抗体またはその抗体断片、マウスの親抗体、および、任意選択的に、１つまたは複数のさらなる同一のマウス親抗体から生成したヒト化抗体（実施例１のヒト化抗体など）のうちの任意の１つまたは複数の安定性、脱アミド化レベルおよび酸化レベルを評価することができる。

【0358】

ヒト化抗体およびマウス抗体の安定性を試験するために、市販のＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（商標）熱シフト安定性アッセイ（Ｅｎｚｏ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を利用することができる。ヒト化抗体またはマウス３Ｅ１０抗体が適切に折り畳まれるか、所与の溶液中で経時的に分解するかどうかを評価するための他の市販のアッセイまたは日常的に行われるアッセイは、当業者に周知である。任意の実施例２のヒト化抗体がマウス抗体および／または１つまたは複数のこの同一の親から生成された他のヒト化抗体（実施例１のヒト化抗体など）と比較して分解または非折りたたみの減少を示す場合、これは、実施例２のヒト化抗体が安定性の増加に関連することを示す。一定の実施形態では、ヒト化抗体は、安定性が減少しなかったかもしれないが、わずかに低下したとしても、類似の安定性を有し得る。

【0359】

脱アミド化はアミド官能基が有機分子から除去される化学反応であり、アミノ酸脱アミド化は、タンパク質の安定性および活性に影響を及ぼすことが公知である。脱アミド化することができるアミノ酸の例には、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。実施例２のヒト化抗体およびマウスキメラコントロール抗体のグルタミン脱アミド化レベルの試験手段には、Ｌｉｕら，２００８，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（２４）：４０８１−８に記載のアッセイが含まれ得る。実施例２のヒト化抗体およびマウスキメラコントロール抗体のアスパラギン脱アミド化レベルの試験手段には、いくつかの市販の脱アミド化アッセイ（ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）イソアスパラギン酸検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）またはＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００チタンシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）など）のうちのいずれか１つが含まれ得る。ヒト化抗体またはマウスキメラコントロール３Ｅ１０抗体が所与の溶液中で経時的に脱アミド化されるかどうかを評価するための他の市販のアッセイまたは日常的に行われるアッセイは、当業者に周知である。ヒト化抗体の脱アミド化レベルがマウスコントロール抗体および／または１つまたは複数のこの親から生成された他のヒト化抗体（実施例１のヒト化抗体など）より低い場合、これは、ヒト化抗体がマウス抗体と比較して脱アミド化が低下することに関連することを示す。

【0360】

アミノ酸酸化は、タンパク質の構造、活性、および分解速度に影響を及ぼすことが公知である。酸化することができるアミノ酸の例には、メチオニン、システイン、およびトリプトファンが含まれる。実施例２のヒト化抗体およびマウスキメラ抗体のうちのいずれかのトリプトファン酸化レベルの試験手段には、Ｈｅｎｓｅｌら，２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６（３）：ｅ１７７０８で考察されたアッセイが含まれ得る。実施例２のヒト化抗体およびマウス抗体のメチオニン酸化レベルの試験手段には、いくつかの市販の酸化アッセイ（メチオニンスルホキシド免疫ブロッティングキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）などのうちのいずれか１つが含まれ得る。ヒト化抗体またはマウスキメラ３Ｅ１０抗体が所与の溶液中で経時的に酸化されるかどうかを評価するための他の市販のアッセイまたは日常的に行われるアッセイは、当業者に周知である。ヒト化抗体の酸化レベルがマウスキメラコントロール抗体よりも低い場合、これは、ヒト化抗体がマウスキメラコントロール抗体および／または１つまたは複数の他のヒト化抗体と比較して酸化が低下することに関連することを示す。

【0361】

アミノ酸酸化、脱アミド化、および他の可能な化学的変化も、ペプチドマッピングによってモニタリングすることができる。具体的には、ヒト化抗体およびマウス抗体を、ジチオトレイトールの存在下でエンドプロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）など）で消化し、得られたペプチド断片を、逆相ＨＰＬＣによって分離する。一般に、Ｋａｌｇａｈｔｇｉ，Ｋ．，＆ Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｃ．”Ｒａｐｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４４３，３４３−３５４（１９８８）を参照のこと。
実施例９：ヒト化抗体のグリコシル化およびリピド化の評価

【0362】

タンパク質の相違により、タンパク質は、その一次アミノ酸配列およびその対応する構造に応じて、しばしば細胞中で異なる翻訳後修飾を受ける。特定の翻訳後修飾の有無により、親のマウス抗体および／または１つまたは複数の同一のマウスの親抗体から生成された他のヒト抗体（実施例１のヒト化抗体など）と比較して１つまたは複数の改善された性質を有する実施例２のヒト化抗体のいずれかを得ることができる。ヒト化抗体のさらなる性質（親のマウス抗体と比較して改善され得る任意の１つまたは複数の性質）は、グリコシル化状態およびリピド化状態である。さらにまたはあるいは、これらの性質のうちの任意の１つまたは複数はまた、独立して、このヒト化抗体について、この同一のマウス親に基づいた他のヒト化抗体（実施例１のヒト化抗体など）と比較してより良好であり得る。任意の実施例２のヒト化抗体がマウスの親３Ｅ１０抗体および／またはこの同一の親に基づいた１つまたは複数の他のヒト化抗体（実施例１のヒト化抗体など）と比較して異なるグリコシル化パターンまたはリピド化パターンに関連するのかという疑問に取り組むために、いくつかの標準的なアッセイを使用することができる。これらのアッセイは例であり、他の利用可能なアッセイも利用することができる。

【0363】

グリコシル化パターンおよびグリコシル化レベルは、患者における抗体のクリアランスおよび活性に影響を及ぼし得る（Ｗｒｉｇｈｔら，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（１）：２６−３２）。実際、グリコシル化が低下した抗体は、半減期および生物活性の低下に関連することが示されている（Ｎａｏｋｏ，２００９，ＭＡｂｓ．２００９，１（３）：２３０−２３６）。さらに、グリコシル化はまた、モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ安全性および有効性プロフィールに有意に影響を及ぼし得る。グリコシル化レベルまたはグリコシル化パターンの評価のために、ヒト化抗体およびマウス抗体を、実施例２に記載の様式に類似の様式で、所与の細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生することができる。実験制御のために、ヒト化抗体およびマウス抗体を同一の細胞型中で産生する。細胞によって産生されたヒト化抗体およびマウス抗体の精製後、抗体を、日常的に使用されるか市販のグリコシル化分析プロトコール（Ｍｏｈａｍｍａｄ，２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐａｇｅｓ ７９５−８０２のプロトコール；質量分析および／またはＨＰＬＣプロトコールを含む標準的な手順；ＧＬＹＣＯ−ＰＲＯ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎキット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）など）のうちのいずれか１つに供する。タンパク質配列中の正確なグリコシル化部位を同定するために、標準的なエンドプロテイナーゼ切断を行い（例えば、トリプシン消化）、その後にＺａｕｎｅｒ Ｇら，２０１０，Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ．，３３：９０３−１０に記載のプロトコールに類似のＬＣ／ＭＳまたはＨＩＬＩＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析を行うことができる。他の市販のグリコシル化パターンを評価するためのアッセイが当業者に周知である。

【0364】

任意の実施例２のヒト化抗体がマウスの親抗体および／またはこの親から生成された他のヒト化抗体（実施例１のヒト化抗体など）よりグリコシル化事象が少ない場合、これは、ヒト化抗体がグリコシル化の低下に関連することを示す。ヒト化抗体がマウスの親抗体および／またはこの親から生成された他のヒト化抗体より多数のグリコシル化事象を示す場合、これは、ヒト化抗体がグリコシル化の増加に関連することを示す。上記で考察したアッセイを使用して、ヒト化抗体が、マウス抗体で認められるグリコシル化パターンと比較して異なるグリコシル化基または異なるパターンでグリコシル化されるかどうかを決定することもできる。グリコシル化のパターンおよび特徴が、タンパク質が産生される細胞株に応じて変動し得ることに留意のこと。したがって、１つの細胞株（例えば、タンパク質製造を意図する細胞型）においてか、異なる細胞型中での産生後のグリコシル化の特徴についての情報を得るために複数の異なる細胞型にわたってこの評価を行うことができる。

【0365】

タンパク質のリピド化レベルは、タンパク質の半減期および／または生物活性に影響を及ぼし得る。そのようなものとして、ヒト化抗体（または断片）にコンジュゲート化した特異的リピド化基を有することが有利であり得る。リピド化レベルまたはリピド化パターンの評価のために、ヒト化抗体およびマウス抗体を、実施例２に記載の様式に類似の様式で、所与の細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生することができる。実験制御のために、ヒト化抗体およびマウス抗体を同一の細胞型中で産生する。細胞によって産生されたヒト化抗体およびマウス３Ｅ１０抗体の精製後、抗体を、多数の市販のリピド化分析プロトコール（Ｇｅｌｂら，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ １−２５６に記載のプロトコールなど）のうちのいずれか１つに供する。他の市販のヒト化抗体またはマウス抗体のリピド化パターンを評価するためのアッセイが当業者に周知である。リードヒト化抗体がマウスの親抗体および／または１つまたは複数の同一の親から生成された他のヒト化抗体よりリピド化事象が少ない場合、これは、実施例２のヒト化抗体がリピド化の低下に関連することを示す。ヒト化抗体がマウスの親抗体および／または他のヒト化抗体より多数のリピド化事象を示す場合、これは、ヒト化抗体がリピド化の増加に関連することを示す。上記で考察したアッセイを使用して、ヒト化抗体が、マウスの親抗体または他のヒト化抗体で認められるリピド化パターンと比較して異なるリピド化基または異なるリピド化パターンでリピド化されるかどうかを決定することもできる。リピド化ならびにリピド化のパターンおよび特徴が、タンパク質が産生される細胞株に応じて変動し得ることに留意のこと。したがって、１つの細胞株（例えば、タンパク質製造を意図する細胞型）においてか、異なる細胞型中での産生後のリピド化の特徴についての情報を得るために複数の異なる細胞型にわたってこの評価を行うことができる。
実施例１０：ＭＢＮＬポリペプチドにコンジュゲート化した開示の抗体

【0366】

ＭＢＮＬポリペプチドの２つの異なる断片に相互接続した（例えば、会合した；相互接続した）開示の抗体を含むコンジュゲートを生成した。具体的には、ヒト化重鎖（配列番号３８、配列番号３９、または配列番号１０のうちの１つのアミノ酸配列を含む；ＩｇＧ１定常ドメインに会合する）のＣ末端を、ＭＢＮＬ断片（配列番号１２のアミノ酸１〜２５３またはアミノ酸１〜１１６のいずれかを含む）のＮ末端にリンカー（配列番号４５）を介して組換え的に連結した（例えば、融合物を生成するように遺伝的に連結した）。このヒト化重鎖−ＭＢＮＬ融合物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターおよびヒト化軽鎖（配列番号８または配列番号４０のうちの１つを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを共にＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、結果として得られる一過性にトランスフェクトした細胞によって産生されたコンジュゲートを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムを使用して培養細胞の細胞ペレット画分から精製した。ヒト化ｍＡｂ−ＭＢＮＬポリペプチド（ＭＢＮＬ１−２５３またはＭＢＮＬ１−１１６のいずれかを含む）が、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって精製サンプル中に検出された。簡潔に述べれば、ＨＥＫ２９３細胞を、ｆｅｃｔｉｎ２９３を使用して前述の各ベクターで一過性にトランスフェクトし、回収するまで培養した。キメラポリペプチドを、Ｍ−ＰＥＲまたは０．１Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ４のいずれか＋２０％グリセロール＋０．１ｍＭ ＺｎＳＯ_４＋ヌクレアーゼ＋（ｉ）１Ｍアルギニン、（ｉｉ）１Ｍアルギニン＋０．８％ＣＨＡＰＳ、または（ｉｉｉ）１Ｍアルギニン＋０．５Ｍ ＮａＣｌのいずれかで溶解した細胞ペレットから回収した。可溶化後、５０ｍＬ細胞培養物由来の細胞ペレットを、０．５ｍＬ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムで精製した。０．１Ｍ酢酸＋２０％グリセロール＋１Ｍアルギニン＋０．８％ＣＨＡＰＳ（ｐＨ３．６）でのｐＨ勾配を使用してカラムから溶離した。０．１Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４＋２０％グリセロール＋１Ｍアルギニン＋０．８％ＣＨＡＰＳ（ｐＨ７．４）を使用して、プール画分の透析および濃縮を行った。

【0367】

同様に、ＭＢＮＬポリペプチドにコンジュゲート化した（例えば、会合した；相互接続した）本開示のＦａｂを含むコンジュゲートを生成した。具体的には、ヒト化重鎖（配列番号３８、配列番号３９、または配列番号１０のうちの１つおよびＩｇＧ２ａ ＣＨ１−ＩｇＧ１ヒンジ上部ドメインを含む定常ドメインのアミノ酸配列を含む）のＣ末端を、ＭＢＮＬ断片（配列番号１２のアミノ酸１〜２５３またはアミノ酸１〜１１６のいずれかを含む）のＮ末端にリンカー（配列番号４５）を介して組換え的に連結した（例えば、融合物を生成するように遺伝的に連結した）。このヒト化重鎖−ＭＢＮＬ融合物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターおよびヒト化３Ｅ１０軽鎖（配列番号８または配列番号４０のうちの１つを含む）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを共にＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。
実施例１１：ＧＡＡポリペプチドにコンジュゲート化した開示の抗体断片

【0368】

ＧＡＡポリペプチドに会合した（例えば、コンジュゲート化した；相互接続した）本開示の抗体断片を含むコンジュゲートを生成した。具体的には、ヒト化重鎖（配列番号３８、配列番号３９、または配列番号１０のうちの１つおよびＧ１ｍ１７アロタイプのＩｇＧ１定常ドメインのアミノ酸配列を含む）のＣ末端を、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端にリンカー（配列番号４５）を介して組換え的に連結した。ヒト化重鎖−ＧＡＡ融合物およびヒト化軽鎖（配列番号８または配列番号４０のうちの１つを含むＶＬを含む）を共に細胞中で発現させ、結果として得られるトランスジェニック細胞によって産生されたキメラポリペプチドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００精製によって精製した。ヒト化Ｆａｂ−ＧＡＡポリペプチドを、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって精製サンプル中で検出した。シグナル配列は、軽鎖（シグナル配列＝配列番号６１）またはヒト化重鎖−ＧＡＡ融合物（シグナル配列＝配列番号６２）のＮ末端部分に存在したが、これらのシグナル配列は、最終キメラポリペプチド産物中に存在しない。

【0369】

本開示の抗原結合断片およびＧＡＡポリペプチドを含むこのコンジュゲートの活性を、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコシダーゼ（ＭＵ−α−Ｇｌｕ）基質の触媒作用を測定するプレートベースの蛍光定量アッセイを利用して試験した。このアッセイを使用して、ＧＡＡポリペプチドにコンジュゲート化した本開示のこの抗原結合断片が酵素活性を有すると判断された。

【0370】

さらなるアッセイでは、このＦａｂ−ＧＡＡポリペプチドがグリコーゲンを加水分解する能力を、比色アッセイで試験した。このアッセイのために、Ｆａｂ−ＧＡＡを、ｐＨ４．３の緩衝液で１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、または０．２５ｍｇ／ｍＬに希釈した。次いで、５マイクロリットルの前述の各希釈Ｆａｂ−ＧＡＡを、３０μＬの０．２ｍｇ／ｍＬグリコーゲンに添加し（すなわち、５μｇ、２．５μｇ、および１．２５μｇのＦａｂ−ＧＡＡを連続サンプルに添加した）、サンプルを３７℃で２時間インキュベートした。１０マイクロリットルのサンプルを、１０μＬの０．３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で反応停止させた。Ａｂｃａｍアッセイキット（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ６５６２０）のグリコーゲン標準を、ポジティブコントロールとして使用し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．３）緩衝液で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、水でさらに希釈して、１ｍＭ〜０．０３１ｍＭの範囲のグルコース濃度を有する標準を調製した。次いで、２０マイクロリットルの各サンプルまたは標準を、９６ウェルプレートに添加した。８０マイクロリットルのグルコースアッセイ試薬（Ｇｌｕｃｏｓｅアッセイキット；Ｓｉｇｍａカタログ番号ＧＡＧＯ２０−１ＫＴ）を、マルチチャネルピペットを使用して各ウェルに添加し、プレートを覆い、３７℃で３０分間インキュベートした。

【0371】

次いで、１００μＬの１２Ｎ硫酸で反応停止させ、サンプルを５４０ｎｍで読み取った。５４０ｎｍで読み取った桃色の強度は、グルコース濃度に比例する。ＧＡＡの機能がグリコーゲンのグルコースへの加水分解であることを考慮すると、グルコース濃度の測定は、ＧＡＡ機能活性を示す（Ｆａｂ−ＧＡＡコンジュゲートとして存在する場合）。Ｆａｂ−ＧＡＡコンジュゲートポリペプチドは、試験した全ての濃度のＦａｂ−ＧＡＡでグリコーゲンをグルコースに加水分解することが可能であった。さらに、本実験における比活性の計算値は、およそ３３０マイクロモル／分／ｍｇであった（例えば、５ｕｇの反応混合物中にＦａｂＧＡＡが存在する場合、３０６マイクロモル／分／ｍｇ；２．５ｕｇの反応混合物中にＦａｂＧＡＡが存在する場合、３２８マイクロモル／分／ｍｇ；１．２５ｕｇの反応混合物（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｃｔｕｒｅ）中にＦａｂＧＡＡが存在する場合、３６０マイクロモル／分／ｍｇの範囲）。

【0372】

配列情報
配列番号１−例示的な３Ｅ１０分子の重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインＣＤＲ１（ＩＭＧＴシステムによって定義されたＣＤＲに従う）
ＧＦＴＦＳＮＹＧ
配列番号２−例示的な３Ｅ１０分子の重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインＣＤＲ２（ＩＭＧＴシステムによって定義されたＣＤＲに従う）
ＩＳＳＧＳＳＴＩ
配列番号３−例示的な３Ｅ１０分子の重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインＣＤＲ３（ＩＭＧＴシステムによって定義されたＣＤＲに従う）
ＡＲＲＧＬＬＬＤＹ
配列番号４−例示的な３Ｅ１０分子の軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインＣＤＲ１（ＩＭＧＴシステムによって定義されたＣＤＲに従う）
ＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹ
配列番号５−例示的な３Ｅ１０分子の軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインＣＤＲ２（ＩＭＧＴシステムによって定義されたＣＤＲに従う）
ＹＡＳ
配列番号６−例示的な３Ｅ１０分子の軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインＣＤＲ３（ＩＭＧＴシステムによって定義されたＣＤＲに従う）
ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ
配列番号７−親ＶＬとして使用したマウス３Ｅ１０軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）のアミノ酸配列
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＫＹＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＨＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＡＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号８−ヒト化３Ｅ１０軽鎖可変ドメイン（ｈＶＬ２）のアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＹＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号９−親ＶＨとして使用したマウス３Ｅ１０重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＲＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＥＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号１０−ヒト化３Ｅ１０重鎖可変ドメイン（ｈＶＨ３）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１１−ヒトＭＴＭ１タンパク質のアミノ酸配列（ＮＰ＿０００２４３．１）

【化1】

配列番号１２−ヒトＭＢＮＬ１タンパク質イソ型ａのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６６３６８．２）．

【化2】

【0373】

配列番号１３−ヒトＭＢＮＬ１タンパク質イソ型ｂのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿９９７１７５．１）．

【化3】

【0374】

配列番号１４−ヒトＭＢＮＬ１タンパク質イソ型ｃのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿９９７１７６．１）．

【化4】

【0375】

配列番号１５−ヒトＭＢＮＬ１タンパク質イソ型ｄのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿９９７１７７．１）．

【化5】

【0376】

配列番号１６−ヒトＭＢＮＬ１タンパク質イソ型ｅのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿９９７１７８．１）．

【化6】

【0377】

配列番号１７−ヒトＭＢＮＬ１タンパク質イソ型ｆのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿９９７１７９．１）．

【化7】

【0378】

配列番号１８−ヒトＭＢＮＬ１タンパク質イソ型ｇのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿９９７１８０．１）．

【化8】

配列番号１９−ヒトＡＧＬタンパク質イソ型１のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００００１９．２）

【化9】

配列番号２０−ヒトＡＧＬタンパク質イソ型２のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００６４５．２）

【化10】

配列番号２１−ヒトＡＧＬタンパク質イソ型３のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００６４６．２）

【化11】

【0379】

配列番号２２＝全長未成熟ＧＡＡアミノ酸配列（９５２アミノ酸；シグナル配列を太字／下線で示した）

【化12】

配列番号２３＝全長未成熟ＧＡＡアミノ酸配列（９５７アミノ酸；シグナル配列を太字／下線で示した）
（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＡＷ８９５８３．１）

【化13】

配列番号２４＝例示的な成熟ＧＡＡアミノ酸配列（配列番号２２の残基１２３〜７８２に対応；成熟ＧＡＡポリペプチドの１つの実施形態）

【化14】

配列番号２５＝例示的な成熟ＧＡＡアミノ酸配列（配列番号２２の残基２８８〜７８２に対応；成熟ＧＡＡポリペプチドの１つの実施形態）

【化15】

配列番号２６−成熟ＧＡＡを含む例示的なＧＡＡポリペプチド（残基６１〜９５２；ＧＡＡポリペプチドの１つの実施形態）

【化16】

配列番号２７−成熟ＧＡＡを含む例示的なＧＡＡポリペプチド（残基６７〜９５２；ＧＡＡポリペプチドの１つの実施形態）

【化17】

配列番号２８−“ＡＧＩＨ”
ＡＧＩＨ
配列番号２９−“ＳＡＧＩＨ”
ＳＡＧＩＨ
配列番号３０−リンカー配列”ＧＳ３”
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号３１−リンカー配列”ＧＳＴＳ”
ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ
配列番号３２−ＶＨの重鎖可変ドメインＣＤＲ１（ＶＨは配列番号９を参照して定義される）（Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲに従う）
ＮＹＧＭＨ
配列番号３３−ＶＨの重鎖可変ドメインＣＤＲ２（ＶＨは配列番号９を参照して定義される）（Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲに従う）
ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧ
配列番号３４−ＶＨの重鎖可変ドメインＣＤＲ３（ＶＨは配列番号９を参照して定義される）（Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲに従う）
ＲＧＬＬＬＤＹ
配列番号３５−ＶＬの軽鎖可変ドメインＣＤＲ１（ＶＬは配列番号７を参照して定義される）（Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲに従う）
ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨ
配列番号３６−ＶＬの軽鎖可変ドメインＣＤＲ２（ＶＬは配列番号７を参照して定義される）（Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲに従う）
ＹＡＳＹＬＥＳ
配列番号３７−ＶＬの軽鎖可変ドメインＣＤＲ３（ＶＬは配列番号７を参照して定義される）（Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲに従う）
ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ
配列番号３８−ヒト化３Ｅ１０重鎖（ｈＶＨ１）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧ ＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

【0380】

配列番号３９−ヒト化３Ｅ１０重鎖（ｈＶＨ２）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＴＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧ ＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号４０−ヒト化３Ｅ１０軽鎖（ｈＶＬ１）のアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＹＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号４１−ヒト化３Ｅ１０軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＹＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＮＤＴＡＮＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号４２−ヒト化３Ｅ１０重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫＲＧＬＬＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４３−ヒト化Ｆｖ３Ｅ１０

【化18】

配列番号４４−成熟ＧＡＡを含む例示的なＧＡＡポリペプチド（残基７０〜９５２；ＧＡＡポリペプチドの１つの実施形態）

【化19】

配列番号４５−リンカー配列
ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ
配列番号４６−全リンカー領域（ＧＡＡの残基５７〜７８）
ＨＩＬＬＨＤＦＬＬＶＰＲＥＬＳＧＳＳＰＶＬＥＥＴＨＰＡＨ
配列番号４７−Ｈｉｓタグ
ＨＨＨＨＨＨ
配列番号４８−例示的なｃ−ｍｙｃタグ
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２４）
配列番号４９−本開示の一定の抗体の重鎖可変ドメインＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲに従う）
ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号５０−本開示の一定の抗体の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲに従う）
ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＬＡ
配列番号５１−本開示の一定の抗体の軽鎖可変ドメインＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによって定義されたＣＤＲに従う）
ＹＡＳＹＬＱＳ
配列番号５２−ウシＧＡＡ前駆体タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿７７６３３８．１）

【化20】

配列番号５３ マウス３Ｅ１０軽鎖をコードするヌクレオチド配列 Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 Ｌ３４０５１

【化21】

配列番号５４ マウス重鎖配列をコードするヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 Ｌ１６９８２）

【化22】

配列番号５５＝ヒトＭＢＮＬ２タンパク質イソ型１のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿６５９００２．１）

【化23】

配列番号５６＝ヒトＭＢＮＬ２タンパク質イソ型３のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿９９７１８７．１）

【化24】

【0381】

配列番号５７＝ヒトＭＢＮＬ３タンパク質イソ型Ｇのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６０８５８．２）

【化25】

配列番号５８＝ヒトＭＢＮＬ３タンパク質イソ型Ｒのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿５９７８４６．１）

【化26】

配列番号５９＝ヒトＭＢＮＬ１タンパク質イソ型ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６６３６８．２）またはイソ型ｂのアミノ酸１〜１１６
ＭＡＶＳＶＴＰＩＲＤＴＫＷＬＴＬＥＶＣＲＥＦＱＲＧＴＣＳＲＰＤＴＥＣＫＦＡＨＰＳＫＳＣＱＶＥＮＧＲＶＩＡＣＦＤＳＬＫＧＲＣＳＲＥＮＣＫＹＬＨＰＰＰＨＬＫＴＱＬＥＩＮＧＲＮＮＬＩＱＱＫＮＭＡＭＬＡＱＱＭＱＬＡＮＡＭＭＰＧＡＰＬＱＰＶＰ
配列番号６０−ヒトκ軽鎖
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号６１−例示的なシグナル配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ
配列番号６２−例示的なシグナル配列
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ
配列番号６３−例示的な平滑末端ＤＮＡ基質
５’−ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＴＧＧ ＧＣＡ ＡＡＧ ＡＴＧ ＴＣＣ−３’

【0382】

参照による援用
本明細書の中で言及するすべての出版物および特許は、個々の出版物または特許各々が具体的にかつ個々に参照により援用されていると示されているがごとく、それら全体が参照により本明細書に援用されている。

【0383】

本開示の特定の実施形態を論じたが、上記明細書は説明的なものであり、制限的なものではない。本明細書および下記請求項の再考により当業者には本開示の多くの変形形態が明らかになるであろう。本開示の全範囲は、本請求項をそれらの全範囲の均等物とともに、および本明細書をかかる変形形態ともに参照することにより決定されるべきものである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]