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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6709999
(24)【登録日】2020年5月28日
(45)【発行日】2020年6月17日
(54)【発明の名称】化合物、プローブ、縮合物及びシトシンの検出方法
(51)【国際特許分類】
C07H 19/23 20060101AFI20200608BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20200608BHJP
C07H 21/04 20060101ALI20200608BHJP
C07F 5/02 20060101ALI20200608BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20200608BHJP
G01N 21/80 20060101ALI20200608BHJP
【ＦＩ】
C07H19/23CSP
C12Q1/6876ZNA
C07H21/04 B
C07F5/02 C
G01N21/78 C
G01N21/80
【請求項の数】16
【全頁数】62
(21)【出願番号】特願2016-22811(P2016-22811)
(22)【出願日】2016年2月9日
(65)【公開番号】特開2017-141181(P2017-141181A)
(43)【公開日】2017年8月17日
【審査請求日】2019年1月31日
(73)【特許権者】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(74)【代理人】
【識別番号】100064908
【弁理士】
【氏名又は名称】志賀 正武
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 義雄
(72)【発明者】
【氏名】白岩 昭吾
【審査官】
東 裕子
(56)【参考文献】
【文献】
特開２０１５−２２１７６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１１−０３７７９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
SAITO,Yoshio，TETRAHEDRON LETTERS，２０１５年，56，3034-3038
【文献】
SUZUKI,Azusa，CHEMBIOCHEM，２０１４年，15，1638-1644
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（１）で表される化合物。
（式中、Ｒ１は水素原子又は水酸基であり；Ｚは下記一般式（１）−１１で表される基である。）
（式中、Ｘ１１は水素原子、シアノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であり；Ｒ１１はアルキル基又はハロゲン原子であり；ｎ１１は０〜５の整数であり、ｎ１１が２以上の整数である場合、複数個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよく；符号＊を付した結合は、Ｚの結合先との間で形成されている。）
【化1】
【化2】
【請求項2】
前記Ｘ１１がシアノ基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
前記Ｒ１が水素原子である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
前記Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
下記一般式（２）で表される化合物。
（式中、Ｒ１は水素原子又は水酸基であり；Ｚは下記一般式（１）−１１で表される基であり；ｍは１〜３の整数である。）
（式中、Ｘ１１は水素原子、シアノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であり；Ｒ１１はアルキル基又はハロゲン原子であり；ｎ１１は０〜５の整数であり、ｎ１１が２以上の整数である場合、複数個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよく；符号＊を付した結合は、Ｚの結合先との間で形成されている。）
【化3】
【化4】
【請求項6】
前記Ｘ１１がシアノ基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項7】
前記Ｒ１が水素原子である、請求項５又は６に記載の化合物。
【請求項8】
前記Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項9】
下記一般式（１１ｂ）で表される化合物。
（式中、Ｘ１１は水素原子、シアノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であり；Ｒ１１はアルキル基又はハロゲン原子であり；ｎ１１は０〜５の整数であり、ｎ１１が２以上の整数である場合、複数個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。）
【化5】
【請求項10】
下記一般式（１ａ）で表される化合物。
（式中、Ｒ１０は水素原子、水酸基、トリアルキルシリルオキシ基又はアルキルジアリールシリルオキシ基であり；Ｚは下記一般式（１）−１１で表される基であり；Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立にトリアルキルシリル基又はアルキルジアリールシリル基である。）
（式中、Ｘ１１は水素原子、シアノ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であり；Ｒ１１はアルキル基又はハロゲン原子であり；ｎ１１は０〜５の整数であり、ｎ１１が２以上の整数である場合、複数個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよく；符号＊を付した結合は、Ｚの結合先との間で形成されている。）
【化6】
【化7】
【請求項11】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物からなるプローブ。
【請求項12】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の化合物と、前記化合物又は前記化合物以外のその他の化合物と、の縮合物。
【請求項13】
前記その他の化合物がヌクレオチドであり、前記縮合物がポリヌクレオチドである、請求項１２に記載の縮合物。
【請求項14】
請求項１２又は１３に記載の縮合物からなるプローブ。
【請求項15】
シトシンを有するポリヌクレオチドと、請求項１４に記載のプローブとを、酸性条件下でハイブリダイズさせて、ハイブリダイズ産物を得る工程と、
酸性条件下での前記ハイブリダイズ産物及び前記プローブの蛍光を測定する工程と、
シトシンの有無に基づく、前記蛍光の発光波長の変化を検出することで、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出する工程と、
を備える、シトシンの検出方法。
酸性条件下での前記ハイブリダイズ産物及び前記プローブの蛍光を測定する工程と、
シトシンの有無に基づく、前記蛍光の発光波長の変化を検出することで、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出する工程と、
を備える、シトシンの検出方法。
【請求項16】
シトシンを有するポリヌクレオチドと、請求項１４に記載のプローブとを、異なる複数種のｐＨ条件下でハイブリダイズさせて、ハイブリダイズ産物を得る工程と、
異なる複数種のｐＨ条件下での前記ハイブリダイズ産物及び前記プローブの蛍光を測定する工程と、
前記ｐＨの違いに基づく、前記蛍光の発光波長の変化を検出することで、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出する工程と、
を備える、シトシンの検出方法。
異なる複数種のｐＨ条件下での前記ハイブリダイズ産物及び前記プローブの蛍光を測定する工程と、
前記ｐＨの違いに基づく、前記蛍光の発光波長の変化を検出することで、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出する工程と、
を備える、シトシンの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化合物、プローブ、縮合物及びシトシンの検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
周囲の極性環境の違いによって、蛍光発光波長が変化する蛍光性化合物は、極性環境の違いを色の変化によって検出できるため、各種のプローブとして有用である。このような化合物の一例として、蛍光性ヌクレオシド誘導体が知られており、遺伝子検出用プローブや、タンパク質又は細胞内での局所的な極性環境の調査用プローブとしての利用が期待されている。
【0003】
例えば、蛍光性ヌクレオシド誘導体が導入され、この誘導体由来の塩基部位を有する蛍光性ポリヌクレオチドは、標的遺伝子の塩基配列を認識したときに、その中の識別対象の核酸塩基と、前記塩基部位とが塩基対を形成し、極性環境が変化することに伴って、蛍光発光波長が変化する。このような蛍光性ポリヌクレオチドは、遺伝子検出用プローブとして有用である。
【0004】
一方、本発明者らは、周辺領域のｐＨの変化に伴って、蛍光発光波長や蛍光発光強度が変化する蛍光性ヌクレオシド誘導体として、塩基がウラシルであるもの（すなわち、蛍光性ウリジン誘導体）を開発しており、ｐＨの変化を検出するプローブとして有用であることを確認している（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１５−２２１７６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、特許文献１では、蛍光性ヌクレオシド誘導体を用いて、蛍光発光波長の変化を利用することで、ポリヌクレオチド中の特定の核酸塩基を検出することまでは、具体的に開示されていない。このような、周辺領域のｐＨに依存した蛍光発光波長の変化によって、特定の核酸塩基を検出できる蛍光性ヌクレオシド誘導体は、プローブの作製に極めて有用である。
【0007】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、周辺領域のｐＨの変化に伴う蛍光発光波長の変化を利用して、特定の核酸塩基を検出可能なポリヌクレオチドからなるプローブ、前記プローブを製造するための新規の化合物、前記化合物を用いた縮合物、並びに前記プローブを用いた核酸塩基の検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決するため、本発明は、以下の構成を採用する。［１］．下記一般式（１）で表される化合物。
【0009】
【化1】
【0010】
【化2】
【0011】
［２］．前記Ｘ１１及びＸ１２がシアノ基である、［１］に記載の化合物。［３］．前記Ｒ１が水素原子である、［１］又は［２］に記載の化合物。
［４］．前記Ｚが前記一般式（１）−１１で表される基であり、前記Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の化合物。
［５］．下記一般式（２）で表される化合物。
【0012】
【化3】
【0013】
【化4】
【0014】
［６］．前記Ｘ１１及びＸ１２がシアノ基である、［５］に記載の化合物。［７］．前記Ｒ１が水素原子である、［５］又は［６］に記載の化合物。
［８］．前記Ｚが前記一般式（１）−１１で表される基であり、前記Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数である、［５］〜［７］のいずれか一項に記載の化合物。
［９］．下記一般式（１１ｂ）で表される化合物。
【0015】
【化5】
【0016】
［１０］．下記一般式（１２ｂ）で表される化合物。
【0017】
【化6】
【0018】
［１１］．下記一般式（１ａ）で表される化合物。
【0019】
【化7】
【0020】
【化8】
【0021】
［１２］．［１］〜［４］のいずれか一項に記載の化合物からなるプローブ。［１３］．［５］〜［８］のいずれか一項に記載の化合物と、前記化合物又は前記化合物以外のその他の化合物と、の縮合物。
［１４］．前記その他の化合物がヌクレオチドであり、前記縮合物がポリヌクレオチドである、［１３］に記載の縮合物。
［１５］．［１３］又は［１４］に記載の縮合物からなるプローブ。
【0022】
［１６］．シトシンを有するポリヌクレオチドと、［１５］に記載のプローブとを、酸性条件下でハイブリダイズさせて、ハイブリダイズ産物を得る工程と、酸性条件下での前記ハイブリダイズ産物及び前記プローブの蛍光を測定する工程と、シトシンの有無に基づく、前記蛍光の発光波長の変化を検出することで、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出する工程と、を備える、シトシンの検出方法。［１７］．シトシンを有するポリヌクレオチドと、［１５］に記載のプローブとを、異なる複数種のｐＨ条件下でハイブリダイズさせて、ハイブリダイズ産物を得る工程と、異なる複数種のｐＨ条件下での前記ハイブリダイズ産物及び前記プローブの蛍光を測定する工程と、前記ｐＨの違いに基づく、前記蛍光の発光波長の変化を検出することで、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出する工程と、を備える、シトシンの検出方法。
【発明の効果】
【0023】
本発明によれば、周辺領域のｐＨの変化に伴う蛍光発光波長の変化を利用して、特定の核酸塩基を検出可能なポリヌクレオチドからなるプローブ、前記プローブを製造するための新規の化合物、前記化合物を用いた縮合物、並びに前記プローブを用いた核酸塩基の検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】試験例１における（ａ）紫外線吸収スペクトル、（ｂ）蛍光スペクトル及び（ｃ）励起スペクトルの測定結果を示すグラフである。
【図2】試験例２における（ａ）紫外線吸収スペクトル及び（ｂ）蛍光スペクトルの測定結果を示すグラフである。
【図3】試験例３における（ａ）紫外線吸収スペクトル、（ｂ）蛍光スペクトル及び（ｃ）励起スペクトルの測定結果を示すグラフである。
【図4】実施例５における（ａ）紫外線吸収スペクトル、（ｂ）蛍光スペクトル及び（ｃ）励起スペクトルの測定結果、並びに（ｄ）熱融解曲線を示すグラフである。
【図5】比較例１における（ａ）紫外線吸収スペクトル、（ｂ）蛍光スペクトル及び（ｃ）励起スペクトルの測定結果、並びに（ｄ）熱融解曲線を示すグラフである。
【図6】比較例２における（ａ）紫外線吸収スペクトル、（ｂ）蛍光スペクトル及び（ｃ）励起スペクトルの測定結果、並びに（ｄ）熱融解曲線を示すグラフである。
【図7】参考例１における（ａ）紫外線吸収スペクトル、（ｂ）蛍光スペクトル及び（ｃ）励起スペクトルの測定結果、並びに（ｄ）熱融解曲線を示すグラフである。
【図8】試験例４における（ａ）紫外線吸収スペクトル及び（ｂ）蛍光スペクトルの測定結果を示すグラフである。
【図9】実施例７における（ａ）紫外線吸収スペクトル及び（ｂ）蛍光スペクトルの測定結果、並びに（ｃ）熱融解曲線を示すグラフである。
【図10】参考例２における（ａ）紫外線吸収スペクトル及び（ｂ）蛍光スペクトルの測定結果、並びに（ｃ）熱融解曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本発明について、詳細に説明する。なお、本明細書において、濃度の単位「Ｍ」は「モル／Ｌ」を意味する。
また、化学式中で使用されている各略号は、それぞれ以下の意味を有する。
Ｅｔ：エチル基（ＣＨ３ＣＨ２）
Ｐｈ：フェニル基（Ｃ６Ｈ５）
Ａｃ：アセチル基（ＣＨ３ＣＯ）
【0026】
＜＜化合物（１）＞＞本発明の一実施形態の化合物は、下記一般式（１）で表される（本明細書においては、「化合物（１）」と称することがある）。
【0027】
【化9】
【0028】
【化10】
【0029】
化合物（１）はヌクレオシド誘導体であり、塩基として、３−デアザアデニンがその２位及び３位の炭素原子において、ナフタレン環骨格と縮環した環骨格、すなわちベンゾイミダゾキノリン骨格（以下「ＢＩＱ骨格」と略記することがある）を有するヌクレオシドである。また、化合物（１）は、蛍光性化合物である。
【0030】
なお、本明細書において「誘導体」とは、元の化合物の１個以上の水素原子が水素原子以外の基（置換基）で置換されてなるもの、又は元の化合物の１個以上の炭素原子が単独で、若しくはこの炭素原子に結合している水素原子とともに、他の基（置換基）で置換されてなるもの、を意味する。
【0031】
一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は水酸基である。すなわち、化合物（１）は、Ｒ１が水素原子（−Ｈ）である場合にはデオキシリボヌクレオシド誘導体であり、Ｒ１が水酸基（−ＯＨ）である場合にはリボヌクレオシド誘導体である。Ｒ１は水素原子であることが好ましい。
【0032】
一般式（１）中、Ｚは、塩基に相当し、前記一般式（１）−１１又は（１）−１２で表される基である。すなわち、化合物（１）は、下記一般式（１）−１で表される化合物（以下、「化合物（１）−１」と略記することがある）、及び下記一般式（１）−２で表される化合物（以下、「化合物（１）−２」と略記することがある）に分類される。化合物（１）−１及び化合物（１）−２は、構造異性体である。
【0033】
【化11】
【0034】
前記一般式（１）−１１で表される基、及び前記一般式（１）−１２で表される基において、符号＊を付した結合は、塩基であるＺ中のイミダゾール環骨格を構成する１個の窒素原子と、Ｚの結合先である糖のうち、Ｒ１が結合している炭素原子に隣り合う炭素原子と、の間で形成されている。
【0035】
一般式（１）−１１及び（１）−１２中、Ｒ１１及びＲ１２はアルキル基又はハロゲン原子である。Ｒ１１及びＲ１２における前記アルキル基は、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれでもよく、環状である場合、単環状及び多環状のいずれでもよい。そして、前記アルキル基は、炭素数が１〜１２であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましく、１〜８であることがさらに好ましく、１〜５であることが特に好ましく、１〜３であることが最も好ましい。
【0036】
直鎖状又は分岐鎖状の前記アルキル基は、炭素数が１〜１２であることが好ましく、前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、ｎ−ヘキシル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、ｎ−ヘプチル基、２−メチルヘキシル基、３−メチルヘキシル基、２，２−ジメチルペンチル基、２，３−ジメチルペンチル基、２，４−ジメチルペンチル基、３，３−ジメチルペンチル基、３−エチルペンチル基、２，２，３−トリメチルブチル基、ｎ−オクチル基、イソオクチル基、２−エチルヘキシル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。直鎖状又は分岐鎖状の前記アルキル基は、炭素数が１〜１０であることがより好ましく、１〜８であることがさらに好ましく、１〜５であることが特に好ましく、１〜３であることが最も好ましい。
【0037】
環状の前記アルキル基は、炭素数が３〜１２であることが好ましく、前記アルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、ノルボルニル基、イソボルニル基、１−アダマンチル基、２−アダマンチル基、トリシクロデシル基等が挙げられ、さらに、これら環状のアルキル基の１個以上の水素原子が、直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基で置換されたものが挙げられる。ここで、水素原子を置換する直鎖状、分岐鎖状及び環状のアルキル基としては、Ｒ１１及びＲ１２におけるアルキル基として例示した上記のものが挙げられる。環状の前記アルキル基は、炭素数が３〜１０であることがより好ましく、３〜８であることがさらに好ましく、５〜７であることが特に好ましい。
環状の前記アルキル基は、単環状であることが好ましい。
【0038】
Ｒ１１及びＲ１２における前記アルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であることが好ましい。
【0039】
Ｒ１１及びＲ１２における前記ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、前記ハロゲン原子は塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子であることが好ましい。
【0040】
Ｒ１１及びＲ１２は、炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であることが好ましい。
【0041】
一般式（１）−１１及び（１）−１２中、ｎ１１及びｎ１２は０〜５の整数である。ｎ１１は、化合物（１）−１（より具体的にはＢＩＱ骨格）におけるＲ１１の結合数であり、ｎ１２は、化合物（１）−２（より具体的にはＢＩＱ骨格）におけるＲ１２の結合数である。
ｎ１１が１〜５の整数である場合、化合物（１）（より具体的には化合物（１）−１）において、Ｒ１１は、ＢＩＱ骨格のうち、Ｘ１１が結合しているナフタレン骨格を構成している５個の炭素原子のいずれかに結合している。
同様に、ｎ１２が１〜５の整数である場合、化合物（１）（より具体的には化合物（１）−２）において、Ｒ１２は、ＢＩＱ骨格のうち、Ｘ１２が結合しているナフタレン骨格を構成している５個の炭素原子のいずれかに結合している。
【0042】
化合物（１）において、ｎ１１が２以上の整数である場合、複数個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。すなわち、Ｒ１１はすべて同一であってもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみ同一であってもよい。そして、これら複数個のＲ１１の組み合わせは、特に限定されない。同様に、化合物（１）において、ｎ１２が２以上の整数である場合、複数個のＲ１２は互いに同一でも異なっていてもよい。すなわち、Ｒ１２はすべて同一であってもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみ同一であってもよい。そして、これら複数個のＲ１２の組み合わせは、特に限定されない。
【0043】
ｎ１１及びｎ１２は、０〜３の整数であることが好ましく、０〜２の整数であることがより好ましく、０又は１であることが特に好ましい。
【0044】
一般式（１）−１１及び（１）−１２中、Ｘ１１及びＸ１２は水素原子、シアノ基（−ＣＮ）、アミノ基（−ＮＨ２）、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基である。Ｘ１１及びＸ１２における前記モノアルキルアミノ基の、窒素原子に結合している１個のアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれでもよく、このようなアルキル基としては、Ｒ１１及びＲ１２における前記アルキル基と同様のものが挙げられる。
【0045】
Ｘ１１及びＸ１２における前記ジアルキルアミノ基の、窒素原子に結合している２個のアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれでもよく、このようなアルキル基としては、Ｒ１１及びＲ１２における前記アルキル基と同様のものが挙げられる。前記ジアルキルアミノ基中の２個のアルキル基は、互いに同一でも、異なっていてもよい。
【0046】
Ｘ１１及びＸ１２は、水素原子又はシアノ基であることが好ましく、シアノ基であることがより好ましい。
【0047】
Ｚが前記一般式（１）−１１で表される基である場合の化合物（１）、すなわち化合物（１）−１で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。化合物（１）−１でより好ましいものとしては、例えば、Ｘ１１がシアノ基であり、Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。
化合物（１）−１でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数であるもの等も挙げられる。
化合物（１）−１でさらに好ましいものとしては、例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｘ１１がシアノ基であり、Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。
【0048】
Ｚが前記一般式（１）−１２で表される基である場合の化合物（１）、すなわち化合物（１）−２で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１２が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１２が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。化合物（１）−２でより好ましいものとしては、例えば、Ｘ１２がシアノ基であり、Ｒ１２が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１２が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。
化合物（１）−２でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ１２が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１２が０〜２の整数であるもの等も挙げられる。
化合物（１）−２でさらに好ましいものとしては、例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｘ１２がシアノ基であり、Ｒ１２が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１２が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。
【0049】
化合物（１）のうち、化合物（１）−１で好ましいものとしては、例えば、下記式（１Ａ）−１０１で表される化合物（以下、「化合物（１Ａ）−１０１」と略記することがある）、下記式（１Ｂ）−１０１で表される化合物（以下、「化合物（１Ｂ）−１０１」と略記することがある）等が挙げられる。化合物（１）のうち、化合物（１）−２で好ましいものとしては、例えば、下記式（１Ａ）−２０１で表される化合物（以下、「化合物（１Ａ）−２０１」と略記することがある）、下記式（１Ｂ）−２０１で表される化合物（以下、「化合物（１Ｂ）−２０１」と略記することがある）等が挙げられる。
化合物（１Ａ）−１０１及び化合物（１Ａ）−２０１はいずれも、デオキシリボヌクレオシド誘導体であり、本明細書においては、デオキシリボヌクレオシド誘導体である化合物（１）を「化合物（１Ａ）」と称することがある。また、化合物（１Ｂ）−１０１及び化合物（１Ｂ）−２０１はいずれも、リボヌクレオシド誘導体であり、本明細書においては、リボヌクレオシド誘導体である化合物（１）を「化合物（１Ｂ）」と称することがある。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（１）の一例に過ぎず、好ましい化合物（１）はこれらに限定されない。
【0050】
【化12】
【0051】
化合物（１）は、Ｚが前記一般式（１）−１１で表される基であるもの、すなわち化合物（１）−１であることが好ましい。
【0052】
化合物（１）は、上述のように、蛍光性化合物であり、そのＢＩＱ骨格の種類に対応して、適切な範囲の波長の光（励起光）を照射することにより、蛍光を発生する。さらに、化合物（１）は、蛍光性化合物であるだけでなく、化合物（１）の周辺領域のｐＨの変化に伴って蛍光発光波長が変化するという特性を有する。なお、本明細書において、「蛍光発光波長が変化する」とは、特に断りのない限り、「蛍光スペクトルにおいて蛍光発光強度が大きい主たるピークの蛍光発光波長が変化する」ことを意味し、「蛍光発光強度が最大となるときの蛍光発光波長が変化する」ことが好ましい。
【0053】
化合物（１）は、下記式（Ｉ−１）及び下記式（Ｉ−２）で示すように、ＢＩＱ骨格のうち、キノリン骨格を構成している窒素原子、換言すると、３−デアザアデニン骨格に着目した場合の、この骨格を構成しているＮ１位の窒素原子に、プロトン（水素イオン、Ｈ＋）が結合してプロトン化されると推測される。そして、このようにプロトン化された化合物（１）と、プロトン化されていない化合物（１）とでは、蛍光発光波長が異なるため、化合物（１）はその周辺領域のｐＨの変化に伴って蛍光発光波長が変化すると推測される。
【0054】
【化13】
【0055】
周知のように、ヌクレオシド中のアデニン塩基は、下記式（ＩＩ）で示すように、通常は、ヌクレオシド中のチミン塩基と水素結合によって塩基対を形成する。これに対して、下記式（ＩＩＩ−１）及び下記式（ＩＩＩ−２）で示すように、化合物（１）の塩基部位に相当するＢＩＱ骨格も、プロトン化されていない状態では、ヌクレオシド中のチミン塩基と水素結合によって塩基対を形成可能であると推測される。しかし、ＢＩＱ骨格は、プロトン化された状態では、ヌクレオシド中のチミン塩基ではなく、シトシン塩基と高選択的に塩基対を形成する。このときの塩基対は、下記式（ＩＶ−１）及び下記式（ＩＶ−２）で示すように形成されると推測される。
このように、化合物（１）は、その周辺領域のｐＨに依存して、ＢＩＱ骨格のシトシン塩基との塩基対の形成の有無が変化する。
【0056】
【化14】
【0057】
すなわち、化合物（１）は、周辺領域のｐＨの変化によって、ＢＩＱ骨格のプロトン化の有無が変化し、さらにこのプロトン化の有無によって、ＢＩＱ骨格のシトシン塩基との塩基対の形成の有無が変化し、このとき蛍光発光波長が変化する。このような特性を有する化合物（１）は、後述するように、プローブとして利用するのに好適である。
【0058】
また、化合物（１）は、例えば、ＢＩＱ骨格の構造を調節するなど、その分子構造を調節することにより、周辺領域のｐＨの変化によって、蛍光発光波長だけでなく、蛍光発光強度も変化するものとなる。通常は、ＢＩＱ骨格の構造の調節によって、化合物（１）の蛍光発光強度を容易に調節できる。なお、本明細書において、「蛍光発光強度が変化する」とは、特に断りのない限り、「蛍光発光強度の最大値が変化する」ことを意味する。このように、周辺領域のｐＨの変化によって、蛍光発光波長及び蛍光発光強度が変化する化合物（１）は、プローブとして利用するのに特に好適である。
【0059】
なお、化合物（１）は、周辺領域のｐＨの変化以外にも、例えば、溶解されている溶媒種によって、蛍光発光波長が変化することもある。
【0060】
＜＜化合物（１）の製造方法＞＞化合物（１）は、例えば、Ｚの種類に応じて、原料となるヌクレオシド誘導体に対して、公知の反応を行ってＢＩＱ骨格を形成することで製造できる。より具体的には以下のとおりである。
【0061】
＜化合物（１）−１の製造方法＞化合物（１）のうち、化合物（１）−１は、例えば、下記一般式（１ｃ）で表される化合物（以下、「化合物（１ｃ）」と略記することがある）と、下記一般式（１１ｂ）で表される化合物（以下、「化合物（１１ｂ）」と略記することがある）と、を反応させて、下記一般式（１１ａ）で表される化合物（以下、「化合物（１１ａ）」と略記することがある）を得る工程（以下、「化合物（１１ａ）製造工程」と略記することがある）、及び化合物（１１ａ）から化合物（１）−１を得る工程（以下、「化合物（１）−１製造工程」と略記することがある）を有する製造方法により、製造できる。
以下、各工程について、詳細に説明する。
【0062】
【化15】
【0063】
［化合物（１１ａ）製造工程］前記化合物（１１ａ）製造工程においては、化合物（１ｃ）と化合物（１１ｂ）とを反応させて、化合物（１１ａ）を得る。
化合物（１１ａ）を得る前記反応は、公知のクロスカップリング反応である。
【0064】
（化合物（１ｃ））化合物（１ｃ）は公知化合物である。
化合物（１ｃ）において、Ｒ１０は水素原子、水酸基、トリアルキルシリルオキシ基又はアルキルジアリールシリルオキシ基である。
Ｒ１０におけるトリアルキルシリルオキシ基としては、例えば、トリメチルシリルオキシ基（（ＣＨ３）３ＳｉＯ−）、トリエチルシリルオキシ基（（ＣＨ３ＣＨ２）３ＳｉＯ−）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ基（（ＣＨ３）３Ｃ（ＣＨ３）２ＳｉＯ−）、トリイソプロピルシリルオキシ基（（（ＣＨ３）２ＣＨ）３ＳｉＯ−）等が挙げられる。
Ｒ１０におけるアルキルジアリールシリルオキシ基としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ基（（ＣＨ３）３Ｃ（Ｃ６Ｈ５）２ＳｉＯ−）等が挙げられる。
【0065】
化合物（１ｃ）において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立にトリアルキルシリル基又はアルキルジアリールシリル基である。Ｒ２及びＲ３におけるトリアルキルシリル基としては、例えば、トリメチルシリル基（（ＣＨ３）３Ｓｉ−）、トリエチルシリル基（（ＣＨ３ＣＨ２）３Ｓｉ−）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（（ＣＨ３）３Ｃ（ＣＨ３）２Ｓｉ−）、トリイソプロピルシリル基（（（ＣＨ３）２ＣＨ）３Ｓｉ−）等が挙げられる。
Ｒ２及びＲ３におけるアルキルジアリールシリル基としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基（（ＣＨ３）３Ｃ（Ｃ６Ｈ５）２Ｓｉ−）等が挙げられる。
【0066】
化合物（１ｃ）において、Ｇ１はヨウ素原子（−Ｉ）、臭素原子（−Ｂｒ）、塩素原子（−Ｃｌ）又はパーフルオロアルカンスルホニルオキシ基である。Ｇ１におけるパーフルオロアルカンスルホニルオキシ基としては、例えば、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基（ＣＦ３−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｏ−）、ノナフルオロブタンスルホニルオキシ基（Ｃ４Ｆ９−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｏ−）等が挙げられる。
【0067】
（化合物（１１ｂ））化合物（１１ｂ）は新規化合物である。化合物（１１ｂ）の製造方法については、後ほど説明する。
化合物（１１ｂ）において、Ｘ１１、Ｒ１１及びｎ１１は、前記一般式（１）−１１におけるＸ１１、Ｒ１１及びｎ１１と同じである。
【0068】
（化合物（１１ａ））化合物（１１ａ）は新規化合物である。
化合物（１１ａ）において、Ｒ１０、Ｒ２及びＲ３は、化合物（１ｃ）におけるＲ１０、Ｒ２及びＲ３と同じであり、Ｘ１１、Ｒ１１及びｎ１１は、化合物（１１ｂ）におけるＸ１１、Ｒ１１及びｎ１１と同じである。
化合物（１１ａ）は、目的物である化合物（１）−１の水酸基が保護基で保護された化合物である。
【0069】
化合物（１１ａ）製造工程においては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」と略記することがある）等の有機溶媒や、ＤＭＦ及び水の混合溶媒等の水性溶媒を反応溶媒として用いることが好ましい。前記溶媒は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0070】
化合物（１１ａ）製造工程においては、例えば、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（Ｐ（Ｃ６Ｈ５）３）４）、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（ＰｄＣｌ２（Ｐ（Ｃ６Ｈ５）３）２）、ビス（トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（Ｐ（（ＣＨ３）３Ｃ）３）２）等の、パラジウム触媒を用いて反応を行うことが好ましい。パラジウム触媒は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。ただし、通常、パラジウム触媒は、１種を単独で用いれば十分である。
化合物（１１ａ）製造工程において、パラジウム触媒の使用量は、例えば、化合物（１ｃ）の使用量の０．０１〜０．３倍モル量であることが好ましく、０．０１〜０．１倍モル量であることがより好ましい。
【0071】
化合物（１１ａ）製造工程において、化合物（１１ｂ）の使用量は、例えば、化合物（１ｃ）の使用量の１〜３倍モル量であることが好ましく、１〜２倍モル量であることがより好ましい。
【0072】
化合物（１１ａ）製造工程においては、さらに塩基を用いて反応を行うことが好ましい。前記塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基が挙げられる。
前記塩基は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
化合物（１１ａ）製造工程において、塩基の使用量は、例えば、化合物（１ｃ）の使用量の１〜６倍モル量であることが好ましく、１〜４倍モル量であることがより好ましい。
【0073】
化合物（１１ａ）製造工程において、反応温度は、例えば、７０〜１１０℃であることが好ましく、８０〜１００℃であることがより好ましい。化合物（１１ａ）製造工程において、反応時間は、例えば、１〜１２時間であることが好ましく、３〜９時間であることがより好ましい。
【0074】
化合物（１１ａ）製造工程においては、不活性ガスの雰囲気下で反応を行うことが好ましい。前記不活性ガスとしては、例えば、アルゴンガス、ヘリウムガス、窒素ガス等が挙げられる。
【0075】
化合物（１１ａ）製造工程において、反応終了後は、公知の手法によって、必要に応じて後処理を行い、化合物（１１ａ）を取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、化合物（１１ａ）を取り出せばよい。また、取り出した化合物（１１ａ）は、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて１回以上行うことで、精製してもよい。化合物（１１ａ）製造工程においては、反応終了後、化合物（１１ａ）を取り出さずに、次工程で用いてもよいが、目的物である化合物（１）−１の収率が向上する点から、化合物（１１ａ）を上述の方法で取り出すことが好ましい。
【0076】
［化合物（１）−１製造工程］前記化合物（１）−１製造工程においては、化合物（１１ａ）から化合物（１）−１を得る。
化合物（１）−１を得る反応は、公知の脱保護反応である。すなわち、本工程では、Ｒ２及びＲ３（トリアルキルシリル基又はアルキルジアリールシリル基）が除去されて、水酸基が形成される。また、Ｒ１０がトリアルキルシリルオキシ基又はアルキルジアリールシリルオキシ基である場合にも、同様にトリアルキルシリル基又はアルキルジアリールシリル基）が除去されて、水酸基が形成される。
前記脱保護反応は、例えば、酸性条件下で、又はフッ素原子含有化合物を添加して、行うことができる。
なお、本工程では、Ｒ１０が水素原子である場合には、Ｒ１が水素原子である化合物（１）−１が得られ、Ｒ１０が水酸基、トリアルキルシリルオキシ基又はアルキルジアリールシリルオキシ基である場合には、Ｒ１が水酸基である化合物（１）−１が得られる。
【0077】
酸性条件とするために用いる前記酸としては、例えば、塩酸等の無機酸；酢酸、パラトルエンスルホン酸等の有機酸等が挙げられる。脱保護反応時において、例えば、酸の使用量は、化合物（１１ａ）の使用量の１〜２倍モル量であることが好ましく、反応温度は１０〜２５℃であることが好ましく、反応時間は１〜２時間であることが好ましい。
【0078】
前記フッ素原子含有化合物としては、例えば、フッ化水素酸（ＨＦ）、フッ化セシウム（ＣｓＦ）等の無機フッ素原子含有化合物；テトラブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）等の有機フッ素原子含有化合物等が挙げられる。前記フッ素原子含有化合物は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。ただし、通常、前記フッ素原子含有化合物は、１種を単独で用いれば十分である。
脱保護反応時において、フッ素原子含有化合物の使用量は、例えば、化合物（１１ａ）の使用量の２〜６倍モル量であることが好ましく、２〜４倍モル量であることがより好ましい。
脱保護反応時において、反応温度は、例えば、１５〜３５℃であることが好ましく、１８〜３０℃であることがより好ましい。
脱保護反応時において、反応時間は、例えば、１０分〜５時間であることが好ましく、３０分〜３時間であることがより好ましい。
【0079】
化合物（１）−１製造工程においては、不活性ガスの雰囲気下で反応を行うことが好ましい。前記不活性ガスとしては、例えば、化合物（１１ａ）製造工程におけるものと同様のものが挙げられる。
【0080】
化合物（１）−１製造工程において、反応終了後は、化合物（１１ａ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（１）−１を取り出すことができ、取り出した化合物（１）−１をさらに同様の方法で精製してもよい。
【0081】
（化合物（１１ｂ）の製造方法）上述の新規化合物である化合物（１１ｂ）は、クロスカップリング反応の原料となる有機ホウ素化合物であり、同じ目的で用いる有機ホウ素化合物は、他に多数知られており、これら有機ホウ素化合物と同様の方法で製造できる。
例えば、化合物（１１ｂ）は、下記一般式（１１ｂ１）で表される化合物（以下、「化合物（１１ｂ１）」と略記することがある）から化合物（１１ｂ）を得る工程（以下、「化合物（１１ｂ）製造工程」と略記することがある）を有する製造方法により、製造できる。
化合物（１１ｂ）製造工程においては、例えば、以下に示すように、化合物（１１ｂ１）を、パラジウム触媒の存在下で、４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロランと反応させることにより、化合物（１１ｂ）が得られる。
【0082】
【化16】
【0083】
化合物（１１ｂ）製造工程においては、例えば、１，４−ジオキサン等の有機溶媒を反応溶媒として用いることが好ましい。
【0084】
化合物（１１ｂ１）製造工程において、４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロランの使用量は、例えば、化合物（１１ｂ１）の使用量の１〜６倍モル量であることが好ましく、１〜４倍モル量であることがより好ましい。
【0085】
化合物（１１ｂ）製造工程における前記パラジウム触媒として、ここでは、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（以下、「Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２」と略記することがある）を示しているが、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２以外のものを用いてもよい。
【0086】
化合物（１１ｂ１）製造工程において、前記パラジウム触媒の使用量は、例えば、化合物（１１ｂ１）の使用量の０．０１〜０．３倍モル量であることが好ましく、０．０１〜０．１倍モル量であることがより好ましい。
【0087】
化合物（１１ｂ１）製造工程においては、さらに塩基を用いて反応を行うことが好ましい。前記塩基のうち、有機塩基としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン等のトリアルキルアミン等が挙げられる。
前記塩基は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
化合物（１１ｂ１）製造工程において、塩基の使用量は、例えば、化合物（１ｃ）の使用量の１〜８倍モル量であることが好ましく、１〜６倍モル量であることがより好ましい。
【0088】
化合物（１１ｂ）製造工程において、反応温度は、例えば、７０〜１１０℃であることが好ましく、８０〜１００℃であることがより好ましい。化合物（１１ｂ）製造工程において、反応時間は、例えば、１〜１２時間であることが好ましく、３〜９時間であることがより好ましい。
【0089】
化合物（１１ｂ）製造工程においては、不活性ガスの雰囲気下で反応を行うことが好ましい。前記不活性ガスとしては、例えば、化合物（１１ａ）製造工程におけるものと同様のものが挙げられる。
【0090】
得られた化合物（１１ｂ）は、上述の化合物（１１ａ）製造工程の場合と同様の方法で取り出すことができ、取り出した化合物（１１ｂ）をさらに同様の方法で精製してもよい。また、得られた化合物（１１ｂ）は、反応終了後、取り出さずに次工程で用いてもよいが、目的物である化合物（１１ａ）の収率が向上する点から、取り出すことが好ましい。
【0091】
化合物（１）−１、化合物（１１ａ）、化合物（１１ｂ）等の各化合物は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
【0092】
＜化合物（１）−２の製造方法＞化合物（１）のうち、化合物（１）−２は、例えば、化合物（１ｃ）と、下記一般式（１２ｂ）で表される化合物（以下、「化合物（１２ｂ）」と略記することがある）と、を反応させて、下記一般式（１２ａ）で表される化合物（以下、「化合物（１２ａ）」と略記することがある）を得る工程（以下、「化合物（１２ａ）製造工程」と略記することがある）、及び化合物（１２ａ）から化合物（１）−２を得る工程（以下、「化合物（１）−２製造工程」と略記することがある）を有する製造方法により、製造できる。
【0093】
【化17】
【0094】
［化合物（１２ａ）製造工程］前記化合物（１２ａ）製造工程においては、化合物（１ｃ）と化合物（１２ｂ）とを反応させて、化合物（１２ａ）を得る。
化合物（１２ａ）を得る前記反応は、公知のクロスカップリング反応である。
【0095】
（化合物（１ｃ））化合物（１ｃ）は、上述の化合物（１１ａ）製造工程で用いる化合物（１ｃ）と同じものである。
【0096】
（化合物（１２ｂ））化合物（１２ｂ）は新規化合物である。化合物（１２ｂ）の製造方法については、後ほど説明する。
化合物（１２ｂ）において、Ｘ１２、Ｒ１２及びｎ１２は、前記一般式（１）−１２におけるＸ１２、Ｒ１２及びｎ１２と同じである。
【0097】
（化合物（１２ａ））化合物（１２ａ）は新規化合物である。
化合物（１２ａ）において、Ｒ１０、Ｒ２及びＲ３は、化合物（１ｃ）におけるＲ１０、Ｒ２及びＲ３と同じであり、Ｘ１２、Ｒ１２及びｎ１２は、化合物（１２ｂ）におけるＸ１２、Ｒ１２及びｎ１２と同じである。
化合物（１２ａ）は、目的物である化合物（１）−２の水酸基が保護基で保護された化合物である。
【0098】
化合物（１２ａ）製造工程は、化合物（１１ｂ）に代えて化合物（１２ｂ）を用いる点以外は、上述の化合物（１１ａ）製造工程と同じ方法で行うことができる。
【0099】
［化合物（１）−２製造工程］前記化合物（１）−２製造工程においては、化合物（１２ａ）から化合物（１）−２を得る。
化合物（１）−２を得る反応は、公知の脱保護反応である。すなわち、本工程では、Ｒ２及びＲ３（トリアルキルシリル基又はアルキルジアリールシリル基）が除去されて、水酸基が形成される。また、Ｒ１０がトリアルキルシリルオキシ基又はアルキルジアリールシリルオキシ基である場合にも、同様にトリアルキルシリル基又はアルキルジアリールシリル基）が除去されて、水酸基が形成される。
前記脱保護反応は、例えば、酸性条件下で、又はフッ素原子含有化合物を添加して、行うことができる。
なお、本工程では、Ｒ１０が水素原子である場合には、Ｒ１が水素原子である化合物（１）−２が得られ、Ｒ１０が水酸基、トリアルキルシリルオキシ基又はアルキルジアリールシリルオキシ基である場合には、Ｒ１が水酸基である化合物（１）−２が得られる。
【0100】
化合物（１）−２製造工程は、化合物（１１ａ）に代えて化合物（１２ａ）を用いる点以外は、上述の化合物（１）−１製造工程と同じ方法で行うことができる。例えば、反応終了後は、上述の化合物（１１ａ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（１）−２を取り出すことができ、取り出した化合物（１）−２をさらに同様の方法で精製してもよい。
【0101】
（化合物（１２ｂ）の製造方法）上述の新規化合物である化合物（１２ｂ）は、化合物（１１ｂ１）に代えて、下記一般式（１２ｂ１）で表される化合物（以下、「化合物（１２ｂ１）」と略記することがある）を用いる点以外は、上述の化合物（１１ｂ）の製造方法と同様の方法で製造できる。
すなわち、化合物（１２ｂ）は、化合物（１２ｂ１）から化合物（１２ｂ）を得る工程（以下、「化合物（１２ｂ）製造工程」と略記することがある）を有する製造方法により、製造できる。化合物（１２ｂ）製造工程における反応、取り出し、精製等の各条件は、いずれも化合物（１１ｂ）製造工程の場合と同様とすることができる。
【0102】
【化18】
【0103】
得られた化合物（１２ｂ）は、反応終了後、取り出さずに次工程で用いてもよいが、目的物である化合物（１２ａ）の収率が向上する点から、取り出すことが好ましい。
【0104】
化合物（１）−２、化合物（１２ａ）、化合物（１２ｂ）等の各化合物は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
【0105】
（化合物（１ａ））上述の説明のように、化合物（１１ａ）及び化合物（１２ａ）は、新規化合物である。これら化合物は包括して、例えば、下記一般式（１ａ）で表すことができる（本明細書においては、下記一般式（１ａ）で表される化合物を「化合物（１ａ）」と称することがある）。
【0106】
【化19】
【0107】
【化20】
【0108】
＜＜化合物（２）＞＞本発明の一実施形態の化合物は、下記一般式（２）で表される（本明細書においては、「化合物（２）」と称することがある）。
【0109】
【化21】
【0110】
【化22】
【0111】
化合物（２）は、ＢＩＱ骨格を含む塩基を有するヌクレオチド誘導体であり、化合物（１）の５’−一リン酸体、５’−二リン酸体及び５’−三リン酸体である。また、化合物（２）は、蛍光性化合物である。
【0112】
化合物（２）は、符号ｍを付した構成単位として、式「−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）−Ｏ−」で表される基を有するが、この構成単位は、酸性条件下においては、プロトン（Ｈ＋）の付加によって、式「−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−Ｏ−」で表されるものとなっていることもある。
【0113】
化合物（２）は、５’位の水酸基（−ＯＨ）とメチレン基（−ＣＨ２−）との間に、上述の符号ｍを付した構成単位を有する点以外は、化合物（１）と同じものである。すなわち、化合物（２）におけるＲ１及びＺ（換言するとＸ１１、Ｘ１２、Ｒ１１、Ｒ１２、ｎ１１、ｎ１２及び符号＊）は、化合物（１）におけるＲ１及びＺ（換言するとＸ１１、Ｘ１２、Ｒ１１、Ｒ１２、ｎ１１、ｎ１２及び符号＊）と同じである。
【0114】
一般式（２）中、ｍは１〜３の整数である。すなわち、化合物（２）は、下記一般式（２）−１−１で表される化合物（以下、「化合物（２）−１−１」と略記することがある）、下記一般式（２）−１−２で表される化合物（以下、「化合物（２）−１−２」と略記することがある）、下記一般式（２）−１−３で表される化合物（以下、「化合物（２）−１−３」と略記することがある）、下記一般式（２）−２−１で表される化合物（以下、「化合物（２）−２−１」と略記することがある）、下記一般式（２）−２−２で表される化合物（以下、「化合物（２）−２−２」と略記することがある）、及び下記一般式（２）−２−３で表される化合物（以下、「化合物（２）−２−３」と略記することがある）に分類される。化合物（２）−１−１及び化合物（２）−２−１は、構造異性体である。同様に、化合物（２）−１−２及び化合物（２）−２−２は、構造異性体であり、化合物（２）−１−３及び化合物（２）−２−３は、構造異性体である。
【0115】
【化23】
【0116】
【化24】
【0117】
Ｚが前記一般式（１）−１１で表される基である場合の化合物（２）、すなわち化合物（２）−１−１、化合物（２）−１−２及び化合物（２）−１−３（以下、これら化合物を包括して「化合物（２）−１」と称することがある）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。化合物（２）−１でより好ましいものとしては、例えば、Ｘ１１がシアノ基であり、Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。
化合物（２）−１でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数であるもの等も挙げられる。
化合物（２）−１でさらに好ましいものとしては、例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｘ１１がシアノ基であり、Ｒ１１が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１１が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。
【0118】
Ｚが前記一般式（１）−１２で表される基である場合の化合物（２）、すなわち化合物（２）−２−１、化合物（２）−２−２及び化合物（２）−２−３（以下、これら化合物を包括して「化合物（２）−２」と称することがある）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１２が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１２が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。化合物（２）−２でより好ましいものとしては、例えば、Ｘ１２がシアノ基であり、Ｒ１２が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１２が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。
化合物（２）−２でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ１２が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１２が０〜２の整数であるもの等も挙げられる。
化合物（２）−２でさらに好ましいものとしては、例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｘ１２がシアノ基であり、Ｒ１２が炭素数１〜５のアルキル基又はハロゲン原子であり、前記ｎ１２が０〜２の整数であるもの等が挙げられる。
【0119】
化合物（２）のうち、化合物（２）−１で好ましいものとしては、例えば、下記式（２Ａ）−１０１−１で表される化合物、下記式（２Ａ）−１０１−２で表される化合物、下記式（２Ａ）−１０１−３で表される化合物（以下、これら化合物をそれぞれ「化合物（２Ａ）−１０１−１」、「化合物（２Ａ）−１０１−２」、「化合物（２Ａ）−１０１−３」と略記することがある）、下記式（２Ｂ）−１０１−１で表される化合物、下記式（２Ｂ）−１０１−２で表される化合物、下記式（２Ｂ）−１０１−３で表される化合物（以下、これら化合物をそれぞれ「化合物（２Ｂ）−１０１−１」、「化合物（２Ｂ）−１０１−２」、「化合物（２Ｂ）−１０１−３」と略記することがある）等が挙げられる。
【0120】
【化25】
【0121】
化合物（２）のうち、化合物（２）−２で好ましいものとしては、例えば、下記式（２Ａ）−２０１−１で表される化合物、下記式（２Ａ）−２０１−２で表される化合物、下記式（２Ａ）−２０１−３で表される化合物（以下、これら化合物をそれぞれ「化合物（２Ａ）−２０１−１」、「化合物（２Ａ）−２０１−２」、「化合物（２Ａ）−２０１−３」と略記することがある）、下記式（２Ｂ）−２０１−１で表される化合物、下記式（２Ｂ）−２０１−２で表される化合物、下記式（２Ｂ）−２０１−３で表される化合物（以下、これら化合物をそれぞれ「化合物（２Ｂ）−２０１−１」、「化合物（２Ｂ）−２０１−２」、「化合物（２Ｂ）−２０１−３」と略記することがある）等が挙げられる。
【0122】
【化26】
【0123】
化合物（２Ａ）−１０１−１、化合物（２Ａ）−１０１−２、化合物（２Ａ）−１０１−３、化合物（２Ａ）−２０１−１、化合物（２Ａ）−２０１−２、化合物（２Ａ）−２０１−３はいずれも、デオキシリボヌクレオチド誘導体である。本明細書においては、デオキシリボヌクレオチド誘導体である化合物（２）を「化合物（２Ａ）」と称することがある。また、化合物（２Ｂ）−１０１−１、化合物（２Ｂ）−１０１−２、化合物（２Ｂ）−１０１−３、化合物（２Ｂ）−２０１−１、化合物（２Ｂ）−２０１−２、化合物（２Ｂ）−２０１−３はいずれも、リボヌクレオチド誘導体である。本明細書においては、リボヌクレオチド誘導体である化合物（２）を「化合物（２Ｂ）」と称することがある。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（２）の一例に過ぎず、好ましい化合物（２）はこれらに限定されない。
【0124】
化合物（２）は、Ｚが前記一般式（１）−１１で表される基であるもの、すなわち化合物（２）−１であることが好ましい。
【0125】
化合物（２）は、化合物（１）と同じＢＩＱ骨格を有するため、化合物（１）と同様の蛍光特性を有する。すなわち、化合物（２）は、蛍光性化合物であるだけでなく、化合物（２）の周辺領域のｐＨの変化に伴って蛍光発光波長が変化するという特性を有する。
また、化合物（２）の塩基部位に相当するＢＩＱ骨格は、プロトン化されていない状態では通常、ヌクレオシド中のチミン塩基と塩基対を形成すると推測される。しかし、ＢＩＱ骨格は、プロトン化された状態では、ヌクレオシド中のチミン塩基ではなく、シトシン塩基と高選択的に塩基対を形成する。
【0126】
このように、化合物（２）は、その周辺領域のｐＨの変化によって、ＢＩＱ骨格のプロトン化の有無が変化し、さらにこのプロトン化の有無によって、ＢＩＱ骨格のシトシン塩基との塩基対の形成の有無が変化し、このとき蛍光発光波長が変化する。このような特性を有する化合物（２）は、後述するように、プローブとして利用するのに好適である。また、化合物（２）は、周辺領域のｐＨの変化によって、蛍光発光波長だけでなく、蛍光発光強度も変化するものとなる。このような特性を有する化合物（２）は、プローブとして利用するのに特に好適である。
【0127】
なお、化合物（２）は、周辺領域のｐＨの変化以外にも、例えば、溶解されている溶媒種によって、蛍光発光波長が変化することもある。
【0128】
化合物（２）は、各種のプローブとして使用可能である。すなわち、新規のプローブとして、化合物（２）からなるプローブが挙げられる。また、化合物（２）は、後述する縮合物の製造原料として有用であり、得られた縮合物も各種のプローブとして使用可能である。縮合物については、後ほど詳しく説明する。
【0129】
＜＜化合物（２）の製造方法＞＞化合物（２）は、例えば、ｍの数に応じて公知のリン酸化方法を利用することで製造できる。より具体的には、以下のとおりである。
【0130】
＜５’−一リン酸体の製造方法＞化合物（２）のうち、ｍが１である場合の５’−一リン酸体（本明細書においては、単に「５’−一リン酸体」と称することがある）は、例えば、化合物（１）の５’−水酸基を一リン酸化する工程（以下、「５’−一リン酸体製造工程」と略記することがある）を有する製造方法により、製造できる。ここで、５’−一リン酸体としては、化合物（２）−１−１及び化合物（２）−２−１が挙げられる。
【0131】
５’−一リン酸体製造工程においては、例えば、トリメチルホスファイト（別名：亜リン酸トリメチル、Ｐ（ＯＣＨ３）３）等の溶媒に化合物（１）を溶解させ、好ましくは−５〜５℃の冷却条件下において、この溶液中の化合物（１）に対して、塩化ホスホリル（別名：オキシ塩化リン、ＰＯＣｌ３）を作用させた後、水を作用させることで、化合物（１）の５’−水酸基を一リン酸化できる。
【0132】
得られた５’−一リン酸体は、上述の化合物（１１ａ）製造工程の場合と同様の方法で取り出すことができ、取り出した５’−一リン酸体をさらに同様の方法で精製してもよい。
【0133】
＜５’−二リン酸体の製造方法＞化合物（２）のうち、ｍが２である場合の５’−二リン酸体（本明細書においては、単に「５’−二リン酸体」と称することがある）としては、化合物（２）−１−２及び化合物（２）−２−２が挙げられる。
【0134】
５’−二リン酸体の製造では、各種のヌクレオシド５’−二リン酸の公知の製造方法を利用できる。例えば、ｐＨ７．６のトリス−塩酸緩衝液等の溶媒に、化合物（１）の５’−一リン酸体を溶解させ、塩化マグネシウムの存在下、好ましくは５〜２５℃で、ヌクレオシド一リン酸キナーゼを作用させることによって、５’−二リン酸体が得られる。得られた５’−二リン酸体は、上述の化合物（１１ａ）製造工程の場合と同様の方法で取り出すことができ、取り出した５’−二リン酸体をさらに同様の方法で精製してもよい。
【0135】
＜５’−三リン酸体の製造方法＞化合物（２）のうち、ｍが３である場合の５’−三リン酸体（本明細書においては、単に「５’−三リン酸体」と称することがある）は、例えば、化合物（１）の５’−水酸基を三リン酸化する工程（以下、「５’−三リン酸体製造工程」と略記することがある）を有する製造方法により、製造できる。ここで、５’−三リン酸体としては、化合物（２）−１−３及び化合物（２）−２−３挙げられる。
【0136】
５’−三リン酸体は、例えば、塩化ホスホリルを作用させた後、水を作用させる前に、トリブチルアンモニウムピロリン酸を前記溶液に添加する点以外は、上述の５’−一リン酸体製造工程の場合と同じ方法で、５’−三リン酸体製造工程を行うことにより、製造できる。
【0137】
化合物（２）は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
【0138】
＜＜縮合物＞＞本発明の縮合物は、上述の化合物（２）と、化合物（２）又は化合物（２）以外のその他の化合物と、の縮合物である。
本発明の縮合物は、後述するように、各種のプローブとして用いるのに有用である。
【0139】
本発明の縮合物は、化合物（２）同士の、又は化合物（２）及び前記その他の化合物の、水の脱離（すなわち脱水）を伴う反応によって形成された構造と同じ構造を有するものであれば、特に限定されない。なかでも本発明の縮合物としては、化合物（２）のリン酸基又は３’位の水酸基が、エステル結合を形成しているものが好ましい。
【0140】
前記その他の化合物は、化合物（２）以外のものであれば、特に限定されない。好ましい前記その他の化合物としては、例えば、１分子中に水酸基（ＯＨ−）及びリン酸基（Ｈ２ＰＯ４−）を合計で１個以上有するもの、すなわち、１分子中に水酸基を有さず、リン酸基を１個以上有するもの、１分子中に水酸基を１個以上有し、リン酸基を有しないもの、並びに１分子中に水酸基及びリン酸基をともに１個以上有するもの、等が挙げられる。前記その他の化合物において、リン酸基はアニオン（ＨＰＯ４−−）を形成していてもよい。
【0141】
なかでも、より好ましい前記その他の化合物としては、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオシド誘導体、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。そして、前記その他の化合物がヌクレオチドであり、前記縮合物がポリヌクレオチドであることが特に好ましい。
【0142】
なお、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数個のヌクレオシドがリン酸等の連結部を介して相互に結合した構成を有するものを意味し、通常は、複数個のヌクレオチドが相互に結合した構成を有するものを意味し、構成しているヌクレオシドの数は特に限定されない。したがって、例えば、１０個以下のヌクレオシド又はヌクレオチドが結合した構成を有するもののように、通常「オリゴヌクレオチド」と称されるものも、本明細書においては「ポリヌクレオチド」と称する。
【0143】
前記縮合物としてのポリヌクレオチドを構成しているヌクレオシドの数は、３〜２５であることが好ましく、５〜２０であることがより好ましく、７〜１７であることが特に好ましい。
【0144】
前記縮合物の、化合物（２）から誘導された構成単位の含有量は特に限定されず、例えば、すべての構成単位が化合物（２）から誘導された構成単位であってもよい（すなわち、前記縮合物が化合物（２）のみの縮合物であってもよい）し、化合物（２）から誘導された構成単位の数が１であってもよい（すなわち、前記縮合物が分子数１の化合物（２）と分子数１以上の前記その他の化合物との縮合物であってもよい）。通常、前記縮合物においては、すべての構成単位の合計量（モル数）に対する、化合物（２）から誘導された構成単位の含有量（モル数）の割合は、３〜１００モル％であることが好ましく、５〜１００モル％であることがより好ましい。
例えば、前記縮合物がポリヌクレオチドである場合には、これを構成している化合物（２）から誘導された構成単位の数は、１〜３であることが好ましく、１又は２であることがより好ましく、１であることが特に好ましい。そして、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオシドの数が、上述のように３〜２５である場合に、化合物（２）から誘導された構成単位がこのような数の条件を満たすことが好ましい。
【0145】
上記の本発明のポリヌクレオチドは、その周辺領域のｐＨの変化によって、蛍光発光強度が変化する。このような本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、ｐＨが低くなるほど、上記のプロトン化の程度が増大し、蛍光発光強度が小さくなる傾向にある。
【0146】
また、本発明のポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドと二重鎖を形成し、他のポリヌクレオチド中のシトシンが、本発明のポリヌクレオチド中のＢＩＱ骨格に対面すると、他の塩基が対面した場合よりも、非酸性条件下であっても、ＢＩＱ骨格のプロトン化が誘導される。そして、ＢＩＱ骨格のプロトン化に伴って、本発明のポリヌクレオチドは、蛍光発光波長が明りょうに変化する。
【0147】
例えば、このような本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、以下のような蛍光発光特性を示す傾向にある。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを含有し、さらに、シトシンを有し、かつこのポリヌクレオチドと二重鎖を形成可能な他のポリヌクレオチドを含有する弱塩基性の溶液（ｉ）と、本発明のポリヌクレオチドを含有し、前記他のポリヌクレオチドを含有せず、ｐＨと本発明のポリヌクレオチドの濃度とがいずれも前記溶液（ｉ）の場合と同じである溶液（ｉｉ）とで、蛍光発光強度を比較すると、溶液（ｉ）の方が、蛍光発光強度が小さくなる。ここで、溶液（ｉ）及び（ｉｉ）は、好ましくは水溶液であり、そのｐＨは好ましくは７．０〜９．０である。これは、弱塩基性であるにも関わらず、溶液（ｉ）においては、本発明のポリヌクレオチド中のＢＩＱ骨格がプロトン化されているのに対し、溶液（ｉｉ）においては、本発明のポリヌクレオチド中のＢＩＱ骨格がプロトン化されていないか、又はプロトン化の程度が著しく低いためであると推測される。
【0148】
また、本発明のポリヌクレオチドは、さらに、以下のような蛍光発光特性を示す傾向にある。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを含有する酸性の溶液（ｉｉｉ）と、本発明の化合物（１）を含有し、ｐＨとＢＩＱ骨格の濃度とがいずれも前記溶液（ｉｉｉ）の場合と同じである溶液（ｉｖ）とで、蛍光発光強度を比較すると、溶液（ｉｉｉ）の方が、蛍光発光強度が小さくなる。ここで、溶液（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、好ましくは水溶液であり、そのｐＨは好ましくは４．０〜５．０である。
【0149】
＜縮合物の製造方法＞前記縮合物は、原料化合物である化合物（２）と、化合物（２）又は化合物（２）以外のその他の化合物と、を縮合する工程を有する製造方法により、製造できる。
原料化合物同士の縮合は、原料化合物の種類に応じて、公知の方法に従って行えばよい。
【0150】
例えば、前記縮合物がポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体である場合、これら縮合物は、酵素を用いない公知の化学合成法を適用して原料化合物同士を縮合することによって、製造できる。
【0151】
また、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体である前記縮合物は、酵素を用いない公知の化学合成法以外に、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（以下、「ＰＣＲ法」と略記する）を適用することによっても製造できる。このようにＰＣＲ法を適用する場合には、例えば、上述の５’−三リン酸体である化合物（２）を用いてＰＣＲ法を行えばよい。
また、５’−三リン酸体である化合物（２）に代えて、化合物（１）の誘導体を用いてＰＣＲ法を行ってもよい。以下、化合物（１）の誘導体を用いて、前記縮合物を製造する方法について、説明する。
【0152】
化合物（１）の前記誘導体としては、例えば、下記一般式（５）で表される化合物（以下、「化合物（５）」と略記することがある）が挙げられる。
【0153】
【化27】
【0154】
【化28】
【0155】
化合物（５）は、例えば、化合物（１）から下記一般式（３）で表される化合物（以下、「化合物（３）」と略記することがある）を得る工程（以下、「化合物（３）製造工程」と略記することがある）、化合物（３）から下記一般式（４）で表される化合物（以下、「化合物（４）」と略記することがある）を得る工程（以下、「化合物（４）製造工程」と略記することがある）、及び化合物（４）から化合物（５）を得る工程（以下、「化合物（５）製造工程」と略記することがある）を有する製造方法で製造できる。以下、各工程について説明する。
【0156】
【化29】
【0157】
［化合物（３）製造工程］化合物（３）製造工程においては、例えば、化合物（１）とＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタールとを反応させることにより、化合物（３）が得られる。
化合物（３）製造工程における反応条件は、反応が良好に進行する限り特に限定されない。
【0158】
ただし、本工程においては、化合物（１）を溶媒に溶解させて反応を行うことが好ましい。前記溶媒は特に限定されないが、好ましいものとしては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の炭化水素；テトラヒドロフラン（以下、「ＴＨＦ」と略記することがある）、ジエチルエーテル等のエーテル；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド（アミド結合を有する化合物）；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド；塩化メチレン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素等が挙げられる。
前記溶媒は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0159】
化合物（３）製造工程における反応条件のうち、例えば、反応温度は５０〜９０℃であることが好ましく、反応時間は０．５〜１０時間であることが好ましい。Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタールの使用量は、化合物（１）の使用量の２〜５倍モル量であることが好ましい。
【0160】
化合物（３）製造工程においては、不活性ガスの雰囲気下で反応を行うことが好ましい。前記不活性ガスとしては、例えば、上述の化合物（１１ａ）製造工程におけるものと同様のものが挙げられる。
【0161】
化合物（３）製造工程においては、例えば、反応終了後は、上述の化合物（１１ａ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（３）を取り出すことができ、取り出した化合物（３）をさらに同様の方法で精製してもよい。また、得られた化合物（３）は、反応終了後、取り出さずに次工程で用いてもよいが、目的物である化合物（５）の収率が向上する点から、取り出すことが好ましい。
【0162】
［化合物（４）製造工程］化合物（４）製造工程においては、例えば、化合物（３）と４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（（ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４）２Ｃ（Ｃ６Ｈ５）Ｃｌ）とを反応させることにより、化合物（４）が得られる。
化合物（４）製造工程における反応条件は、反応が良好に進行する限り特に限定されない。
【0163】
ただし、本工程においては、化合物（３）を溶媒に溶解させて反応を行うことが好ましい。前記溶媒は特に限定されないが、好ましいものとしては、例えば、ピリジン等の有機塩基が挙げられる。また、前記溶媒は、含有している水分を除去する操作を行った無水溶媒であることが好ましい。
前記溶媒は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0164】
化合物（４）製造工程における反応条件のうち、例えば、反応温度は１５〜３５℃であることが好ましく、反応時間は０．５〜８時間であることが好ましい。４，４’−ジメトキシトリチルクロリドの使用量は、化合物（３）の使用量の１〜１．５倍モル量であることが好ましい。
【0165】
化合物（４）製造工程においては、不活性ガスの雰囲気下で反応を行うことが好ましい。前記不活性ガスとしては、例えば、上述の化合物（１１ａ）製造工程におけるものと同様のものが挙げられる。
【0166】
化合物（４）製造工程においては、例えば、反応終了後は、上述の化合物（１１ａ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（４）を取り出すことができ、取り出した化合物（４）をさらに同様の方法で精製してもよい。また、得られた化合物（４）は、反応終了後、取り出さずに次工程で用いてもよいが、目的物である化合物（５）の収率が向上する点から、取り出すことが好ましい。
【0167】
［化合物（５）製造工程］化合物（５）製造工程においては、例えば、化合物（４）と２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（（（ＣＨ３）２ＣＨ）２Ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）Ｃｌ）とを反応させることにより、化合物（５）が得られる。
化合物（５）製造工程における反応条件は、反応が良好に進行する限り特に限定されない。
【0168】
ただし、本工程においては、化合物（４）を溶媒に溶解させて反応を行うことが好ましい。前記溶媒は特に限定されないが、好ましいものとしては、例えば、アセトニトリル等のニトリルが挙げられる。
前記溶媒は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【0169】
化合物（５）製造工程における反応条件のうち、例えば、反応温度は１５〜３５℃であることが好ましく、反応時間は２０分〜４時間であることが好ましい。２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイトの使用量は、化合物（４）の使用量の１〜１２倍モル量であることが好ましい。
【0170】
また、本工程においては、塩基を用いて反応を行うことが好ましい。前記塩基は特に限定されないが、好ましいものとしては有機塩基が挙げられ、前記有機塩基としては、例えば、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等のトリアルキルアミン等が挙げられる。
前記塩基は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
前記塩基の使用量は、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイトの使用量の３〜１２倍モル量であることが好ましい。
【0171】
化合物（５）製造工程においては、不活性ガスの雰囲気下で反応を行うことが好ましい。前記不活性ガスとしては、例えば、上述の化合物（１１ａ）製造工程におけるものと同様のものが挙げられる。
【0172】
化合物（５）製造工程においては、例えば、反応終了後は、上述の化合物（１１ａ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（５）を取り出すことができ、取り出した化合物（５）をさらに同様の方法で精製してもよい。
【0173】
化合物（５）、化合物（４）、化合物（３）等の各化合物は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
【0174】
＜＜プローブ＞＞上述の化合物（１）及び縮合物は、それぞれ各種のプローブとして用いるのに有用である。
すなわち、本発明のプローブとしては、化合物（１）からなるもの、及び前記縮合物からなるものが挙げられる。
以下、前記縮合物のうち、特にポリヌクレオチドからなるプローブについて、より詳細に説明する。
【0175】
本発明のプローブは、１本鎖の状態においても蛍光を発し、ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせた場合において、上述の化合物（１）に対合するヌクレオチドがアデニル酸、チミジル酸又はグアニル酸であるときには、発光波長の明りょうな変化は認められない。しかしながら、後述の「シトシンの検出方法」に示すとおり、上述の化合物（１）に対合するヌクレオチドがシチジル酸であり、酸性条件の場合には、１本鎖の場合とは異なり、発光波長が明りょうに変化する。
【0176】
本発明のプローブのヌクレオチドの数は、標的ポリヌクレオチドの種類又は長さによって異なるが、３〜２５であることが好ましく、５〜２０であることがより好ましく、７〜１７であることが特に好ましい。
【0177】
本発明のプローブを構成するヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドを含む試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートＤＮＡ又はＲＮＡ、Ｈ−ホスホネートＤＮＡ又はＲＮＡ等の修飾ヌクレオチドであってもよい。
【0178】
本発明のプローブと標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイズに際しては、標的ポリヌクレオチドを含む試料に対して本発明のプローブを１ｎＭ〜１ｍＭ程度、特に１μＭ〜５ ０μＭ程度添加することが好ましい。また、ハイブリダイズの条件はポリヌクレオチドの長さによっても異なるが、例えば０〜６０℃程度の温度で、例えば５〜６０分程度でハイブリダイズを行うことができる。また、ハイブリダイズさせる試料は、例えばｐＨ４．０〜９．０程度に調整すればよい。
【0179】
本明細書において、「ハイブリダイズ」とは、相補的な塩基配列を持つ２本の核酸同士が水素結合を介してハイブリッド二本鎖を形成することを意味する。この様な組み合わせとしては、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＲＮＡ／ＰＮＡまたはＰＮＡ／ＰＮＡ等を挙げることができる。
【0180】
本発明のプローブは以下の用途に使用できる。（ｉ）標的ポリヌクレオチドと相補的なプローブを用いることにより、標的ポリヌクレオチドの特定位置のシトシンの有無を決定できる。同様の方法で１塩基多型の検出に利用できる。
（ｉｉ）ＤＮＡチップにおいて、本発明のプローブを基材上に固定又は吸着させることにより、特定の塩基配列を有するか否かを確認できる。特に、標的ポリヌクレオチドの特定位置のシトシンの有無を決定できる。
（ｉｉｉ）アンチセンスポリヌクレオチドに代えて本発明のプローブを使用する場合には、通常のポリヌクレオチドとは異なるため、核酸分解酵素（例えば、制限酵素等）や核酸結合タンパク質（例えば、転写因子等） 等の標的核酸への結合を阻害できる。このことから、これらの作用を利用した実験用試薬として利用できる。
（ｉｖ）本発明のプローブ自体蛍光を発するため、ポリヌクレオチドの蛍光ラベルに使用できる。
（ｖ）ＤＮＡ複製において、複製されるＤＮＡと相補的なプローブとして使用することによりＤＮＡ複製のリアルタイム検出ができる。同様に、ＲＮＡへの転写において、転写されるＲＮＡと相補的なプローブとして使用することによりＲＮＡ転写のリアルタイム検出ができる。
（ｖｉ）本発明のプローブは、シトシンを有する相補的配列とハイブリダイズすることにより蛍光発光波長が変化するため、この波長の変化により、本発明のプローブの酸化還元電位が変化する。このため、電極上に本発明のプローブを固定しておき、被験ポリヌクレオチドをこの電極に作用させて酸化還元電位を測定する方法で、核酸配列応答性のバイオセンサーとして利用できる。
（ｖｉｉ）本発明のポリヌクレオチドは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に供される蛍光性プローブとして利用できる。
【0181】
上記（ｉｉ）に記載のＤＮＡチップ（又はＤＮＡアレイ）は、本発明のプローブを基材上に固定又は吸着させることにより、得ることができる。固定には共有結合などによる結合も含まれる。
【0182】
基材上の本発明のプローブのスポット径は特に限定されないが、例えば５０〜２００μｍ程度とすることができる。またスポットピッチは特に限定されないが、例えば１００〜５００μｍ程度とすることができる。
【0183】
基材の材料は特に限定されず、例えばガラス、シリカ、金等を用いることができる。また、基材の形状は、板状（基板状）、球体状等のどのような形状のものであってもよい。
【0184】
基材上に本発明のプローブを結合する場合には、本発明のプローブの一端を、例えば金属−硫黄結合などの方法を使用して、基材に結合させることができる。
【0185】
ＤＮＡチップに固定等される本発明のプローブのヌクレオチドの数は、試料の種類によって異なるが、例えば１０〜２００個程度であればよく、例えば５０〜１００個程度であればよい。
【0186】
＜＜シトシンの検出方法＞＞上述のプローブは、例えば、解析対象であるポリヌクレオチド中のシトシンを検出するのに有用である。
すなわち、本発明のシトシンの検出方法は、シトシンを有するポリヌクレオチドと、上述のプローブとを、酸性条件下でハイブリダイズさせて、ハイブリダイズ産物を得る工程と、酸性条件下での前記ハイブリダイズ産物及び前記プローブの蛍光を測定する工程と、シトシンの有無に基づく、前記蛍光の発光波長の変化を検出することで、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出する工程と、を備えるものである（以下、「検出方法１」と略記することがある）。
また、本発明のシトシンの検出方法は、シトシンを有するポリヌクレオチドと、上述のプローブとを、異なる複数種のｐＨ条件下でハイブリダイズさせて、ハイブリダイズ産物を得る工程と、異なる複数種のｐＨ条件下での前記ハイブリダイズ産物及び前記プローブの蛍光を測定する工程と、前記ｐＨの違いに基づく、前記蛍光の発光波長の変化を検出することで、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出する工程と、を備えるものである（以下、「検出方法２」と略記することがある）。
以下、各検出方法について、説明する。
【0187】
＜検出方法１＞［ハイブリダイズ工程］
検出方法１では、シトシンを有するポリヌクレオチドを含有せず、前記プローブを含有する酸性溶液（以下、「酸性溶液１−１」と略記することがある）、及びシトシンを有するポリヌクレオチドと、前記プローブと、を含有する酸性溶液（以下、「酸性溶液１−２」と略記することがある）を用いる。
【0188】
酸性溶液１−２における、シトシンを有するポリヌクレオチドとは、解析対象のポリヌクレオチドであり、塩基として１個又は２個以上の検出対象であるシトシンを有する。酸性溶液１−２中において、前記プローブ中のＢＩＱ骨格は、この溶液のｐＨが特定の範囲内である場合に、プロトン化された状態で、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを識別し、このシトシンと塩基対を形成する。そして、前記プローブ及びポリヌクレオチドがハイブリダイズすることにより、安定した二重鎖が形成される。一方、この溶液のｐＨが上記とは異なる範囲内である場合には、前記プローブ中のＢＩＱ骨格は、プロトン化された状態か又はされていない状態で、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを識別せず、塩基対を形成しない。
【0189】
一方、酸性溶液１−１における、シトシンを有するポリヌクレオチドとは、酸性溶液１−２における解析対象のポリヌクレオチドだけでなく、シトシンを有するすべてのポリヌクレオチドのことを意味する。酸性溶液１−１はこのようなポリヌクレオチドを含有していないため、酸性溶液１−１中における前記プローブも、ＢＩＱ骨格がポリヌクレオチド中のシトシンと塩基対を形成しない。
【0190】
酸性溶液１−１及び１−２における、シトシンを有するポリヌクレオチドは、細胞抽出液、血液等の体液等のように不純物を含むものであってもよく、ＰＣＲ産物、合成ポリヌクレオチド等の純度の高いものであってよい。
【0191】
酸性溶液１−１及び１−２のｐＨは、酸性であって、シトシンを有するポリヌクレオチド及び前記プローブが分解せず安定的に溶解可能であるｐＨであればよく、例えば、ｐＨ４．０以上ｐＨ７．０未満であればよく、例えば、ｐＨ４．０以上ｐＨ６．０以下であればよい。酸性溶液１−１及び１−２に用いる酸性溶液としては、例えば、クエン酸、乳酸、リン酸、酢酸、グルコン酸、コハク酸、又はそれらの水和物等の酸を用いて、上記ｐＨに調製した緩衝液であればよい。酸性溶液１−１及び１−２に用いる酸性溶液は、同じ種類の酸性溶液であってもよく、異なる種類の酸性溶液であってよい。中でも、後に続く蛍光測定工程でそのまま測定を行えることから、同じ種類の酸性溶液であることが好ましい。
【0192】
ハイブリダイズ条件は、上述の「プローブ」において説明したとおりである。
【0193】
［蛍光測定工程］蛍光は常法に従い、照射波長２５０〜６００ｎｍ程度で測定すればよい。酸性溶液１−１中の前記プローブの蛍光測定と、酸性溶液１−２中のハイブリダイズ産物の蛍光測定とは、同じ種類の酸性溶液に溶解又は懸濁させた状態で行うことが好ましい。通常はハイブリダイズさせた際の酸性溶液に溶解又は懸濁させた状態で測定すればよい。
【0194】
［シトシン検出工程］酸性溶液１−２中の前記プローブは、ＢＩＱ骨格がプロトン化された状態でシトシンと塩基対を形成している場合と、塩基対を形成していない場合とでは、蛍光発光波長が明りょうに異なり、蛍光発光強度が異なることもある。
また、酸性溶液１−１中の前記プローブは、シトシンと塩基対を形成しておらず、シトシンと塩基対を形成している場合とは、蛍光発光波長が異なり、蛍光発光強度が異なることもある。
したがって、酸性溶液１−１及び酸性溶液１−２について、前記測定工程において、前記プローブの蛍光を測定した場合、これら酸性溶液中でのシトシンの有無に基づいて、蛍光発光波長の変化を検出することによって、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出できる。
【0195】
＜検出方法２＞［ハイブリダイズ工程］
検出方法２では、シトシンを有するポリヌクレオチドと、前記プローブと、を含有し、ｐＨが異なる複数種の溶液（以下、「溶液２群」と略記することがある）を用いる。
溶液２群とは、前記ポリヌクレオチド及びプローブ以外の含有成分について、その種類及び含有量のいずれか一方又は両方が調節され、ｐＨが互いに異なるように調節された２種以上の溶液群である。溶液２群には、通常、１種以上の酸性溶液が必須溶液として含まれる。
【0196】
検出方法２における、シトシンを有するポリヌクレオチドは、解析対象のポリヌクレオチドであり、上述の酸性溶液１−２における、シトシンを有するポリヌクレオチドと同様のものである。溶液２群のうち、酸性溶液中において、前記プローブ中のＢＩＱ骨格は、この溶液のｐＨが特定の範囲内である場合に、プロトン化された状態で、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを識別し、このシトシンと塩基対を形成する。そして、前記プローブ及びポリヌクレオチドがハイブリダイズすることにより、安定した二重鎖が形成される。一方、溶液２群の他の溶液のｐＨが上記とは異なる範囲内である場合には、前記プローブ中のＢＩＱ骨格は、プロトン化された状態か又はされていない状態で、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを識別せず、塩基対を形成しない。
【0197】
溶液２群における、シトシンを有するポリヌクレオチドは、上述の検出方法１におけるシトシンを有するポリヌクレオチドと同様のものである。
【0198】
ｐＨが異なる複数種の溶液のｐＨは、シトシンを有するポリヌクレオチド及び前記プローブが分解せず安定的に溶解可能であるｐＨであればよく、例えば、ｐＨ４．０以上ｐＨ９．０以下であればよい。ｐＨが異なる複数種の溶液としては、例えば、クエン酸、乳酸、リン酸、酢酸、グルコン酸、コハク酸又はそれらの水和物等の酸、あるいは酢酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素一ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二カリウム、塩化アンモニウム等の１価若しくは２価の塩又はそれらの水和物等のアルカリを用いて、ｐＨを目的の値に調節して得られた緩衝液が挙げられる。必須溶液である酸性溶液のｐＨ及び組成は、上述の検出方法１における酸性溶液１−１及び１−２の場合と同様である。
【0199】
ハイブリダイズ条件は、上述の「プローブ」において説明したとおりである。
【0200】
［蛍光測定工程］検出方法２における蛍光測定工程は、上述の検出方法１における蛍光測定工程と同様である。
【0201】
［シトシン検出工程］前記プローブは、ＢＩＱ骨格がプロトン化された状態でシトシンと塩基対を形成している場合と、塩基対を形成していない場合とでは、蛍光発光波長が明りょうに異なり、蛍光発光強度が異なることもある。
したがって、溶液２群のｐＨが互いに異なる複数種の溶液について、前記測定工程において、前記プローブの蛍光を測定した場合、これら溶液のｐＨの違いに基づいて、蛍光発光波長の変化を検出することによって、前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出できる。
【0202】
＜＜遺伝子変異の検出方法＞＞上述のシトシンの検出方法は、例えば、遺伝子変異を検出するのに有用である。
すなわち、本発明の遺伝子変異の検出方法は、上述のシトシンの検出方法を用いるものである。
以下、遺伝子変異の検出方法について、説明する。
【0203】
遺伝子変異の検出方法では、上述の検出方法１又は検出方法２を用いて、シトシンの有無又はｐＨの違いに基づく蛍光発光波長の変化を検出することにより、遺伝子の変異の有無を判断できる。
【0204】
本発明の遺伝子変異の検出方法において、検出対象となる遺伝子としては、少なくとも１塩基のアデニン、グアニン若しくはチミンがシトシンに置換されている変異、又は、少なくとも１塩基のシトシンが挿入されている変異を有する遺伝子であればよく、例えば、癌遺伝子、癌抑制遺伝子等の癌関連遺伝子、その他疾患関連遺伝子等が挙げられる。より具体的には、後述の実施例で示す、癌抑制遺伝子であるＢＲＣＡ１（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ Ｉ）等が挙げられる。
【0205】
ＢＲＣＡ１遺伝子とは、乳癌感受性遺伝子であって、ＢＲＣＡ１遺伝子の変異により、遺伝子不安定性を生じ、最終的に乳癌や卵巣癌を引き起こすことが知られている。さらに、ＢＲＣＡ１遺伝子のｃＤＮＡにおいて、５３８２番目にシトシンが挿入された変異は、乳癌の発症リスクを高めることが知られている。よって、本発明の遺伝子変異の検出方法によれば、ＢＲＣＡ１遺伝子の５３８２番目にシトシンが挿入された変異を簡便に感度良く検出できる。
【実施例】
【0206】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下においては、例えば、「一般式（１Ａ）−１０１で表される化合物」を「化合物（１Ａ）−１０１」と称するなど、各化合物に付している符号を用いて、その化合物の名称を確定した。
【0207】
［実施例１］＜化合物（１１ｂ）の製造＞
以下に示す経路で、化合物（１１ｂ）として化合物（１１ｂ）−１０１を製造した。
【0208】
【化30】
【0209】
［化合物（１１ｂ３）−１０１の製造］アルゴン雰囲気下で化合物（１１ｂ４）−１０１（１．６ｇ、 ７．９５ｍｍｏｌ）を酢酸（２５ｍＬ）に溶解させた。得られた酢酸溶液に、臭素（２０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加え、さらに酢酸ナトリウム（１．３ｇ、１６ｍｍｏｌ）を加えた後、５０℃のオイルバス中で２．５時間撹拌した。その後、臭素（１０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加え、さらに酢酸ナトリウム（０．７ｇ、７ｍｍｏｌ）を加えて、１．５時間撹拌した。その後、酢酸（５０ｍＬ）、４８％臭化水素酸（５０ｍＬ）、亜硫酸ナトリウム（１２ｇ、９５ｍｍｏｌ）を加え、１３０℃で一晩還流させながら撹拌した。得られた反応液を室温まで冷却した後、１０％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを５に調整して、黒色結晶を析出させ、吸引ろ過を行い、水で洗浄して析出物を取り出した。ろ液にも反応生成物が含まれていたため、クロロホルム及び純水の２層系でろ液に対して分液操作を行い、有機層に硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮することで白色結晶を得た。この白色結晶と、吸引ろ過で取り出した前記析出物とを合わせて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／クロロホルム／酢酸（１０／１００／１、体積比））により精製し、化合物（１１ｂ３）−１０１を白色粉末として得た（収量１ｇ、収率１００％）。
【0210】
［化合物（１１ｂ２）−１０１の製造］アルゴン雰囲気下で、化合物（１１ｂ３）−１０１（１ｇ）、トルエン（１５ｍＬ）、塩化チオニル（１．５ｍＬ）を混合し、１２０℃で２時間還流させながら撹拌した。得られた反応液を減圧濃縮し、濃縮物を氷水で冷やしながら、この濃縮物に飽和アンモニア水を加えて約３０分撹拌した。反応液中で析出した茶褐色結晶を吸引ろ過で取り出した。得られた茶褐色結晶を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／クロロホルム（１／１００、体積比））により精製し、化合物（１１ｂ２）−１０１を肌色粉末として得た（収量７５０ｍｇ、収率３６％）。
【0211】
得られた化合物（１１ｂ２）−１０１の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz)σ5.77(br s, 2H), 7.11(s, 1H), 7.27(br s, 1H), 7.58(d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.79(dd, J = 1.4 Hz, 1H), 7.92(br s, 1H), 8.11(s, 1H), 8.23(d, J = 1.4 Hz, 1H).
13C-NMR(DMSO-d6, 100MHz)σ107.3, 112.4, 124.8, 124.9, 125.7, 127.2, 127.6, 132.2, 135.2, 145.1, 167.9.
【0212】
［化合物（１１ｂ１）−１０１の製造］アルゴン雰囲気下で、化合物（１１ｂ２）−１０１（７００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍＬ）に懸濁させた。得られた懸濁液に、塩化ホスホリル（５０μＬ、０．５ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、８０℃のオイルバス中で２．５時間撹拌した。得られた反応液を、氷水（約５０ｍＬ）中にゆっくりと注いだ後、約３０分撹拌した。次いで、得られた反応液に対して、酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液の２層系で分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウムによって脱水した後、減圧濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル（５／１〜３／１、体積比）により精製し、化合物（１１ｂ１）−１０１を白色粉末として得た（収量３００ｍｇ、収率４４％）。
【0213】
得られた化合物（１１ｂ１）−１０１の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。1H-NMR(CDCl3, 400MHz)σ4.56(br s, 2H), 7.06(s, 1H), 7.47(dd, J = 1.4, 8.2 Hz,1H), 7.59(d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.96(d, J = 1.4 Hz, 1H), 8.00(s, 1H).
13C-NMR(CDCl3, 100MHz)σ105.9, 108.5, 114.0, 119.6, 126.7, 127.1, 132.2, 133.0, 135.5, 144.5.
【0214】
［化合物（１１ｂ）−１０１の製造］アルゴン雰囲気下で、化合物（１１ｂ１）−１０１（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）及び［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１７ｍｇ、２０μｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（２ｍＬ）に溶解させた。得られた１，４−ジオキサン溶液に、トリメチルアミン（２３０μＬ、１．７ｍｍｏｌ）を加え、さらに４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（３００μＬ、１．３ｍｍｏｌ）を滴下し、フラスコ内の反応液が泡立ちながら黄色溶液から赤紫溶液に変化するのを確認した後、この溶液を９０℃のオイルバス中で一晩撹拌した。得られた反応液を室温まで冷却した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル（１０／１、体積比）により精製し、化合物（１１ｂ）−１０１を黄色粉末として得た（収量７０ｍｇ、収率５８％）。
【0215】
得られた化合物（１１ｂ）−１０１の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。1H-NMR(CDCl3, 400MHz)σ1.40(s, 12H), 5.12(br s, 2H), 6.83(s, 1H), 7.42(dd, J = 1.4, 8.7 Hz,1H), 7.51(d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.03(d, J = 1.4 Hz, 1H), 8.22(s, 1H).
13C-NMR(CDCl3, 100MHz)σ24.9,84.3, 104.2, 106.9, 120.2, 125.3, 126.2, 127.9, 135.0, 138.4, 139.8, 152.3.
【0216】
［実施例２］＜化合物（１１ａ）の製造＞
以下に示す手順により、化合物（１ａ）のうち、化合物（１１ａ）として化合物（１１Ａａ）−１０１を製造した。
アルゴン雰囲気下で、化合物（１Ａｃ）−１０１（１２５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、化合物（１１ｂ）−１０１（７０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（８０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１１ｍｇ、１０μｍｏｌ）の混合物に、ＤＭＦ（３ｍＬ）及び水（６００μＬ）の混合溶媒を加え、懸濁液を得た。この懸濁液を９０℃のオイルバス中で一晩撹拌した後、室温まで冷却し、減圧濃縮した。得られた濃縮物に対して、酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液の２層系で分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウムによって脱水した後、減圧濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル（１／１〜１／３、体積比）により精製し、化合物（１１Ａａ）−１０１を黄色粉末として得た（収量１２５ｍｇ、収率９４％）。
【0217】
得られた化合物（１１Ａａ）−１０１の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz)σ1.12(m, 42H), 2.71(m, 2H), 3.95(m, 2H), 4.33(m, 1H), 4.87(m, 1H), 5.82(br s, 2H), 6.88(dd, J = 1.8, 8.7 Hz, 1H), 7.55(dd, J = 1.8, 8.7 Hz, 1H), 7.97(d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.25(s, 1H), 8.30(complex, 2H), 8.59(s, 1H).
13C-NMR(DMSO-d6, 100MHz)σ11.9, 12.2, 17.9, 18.1, 42.3, 63.4, 72.8, 77.2, 86.6, 89.2, 107.4, 117.8, 119.7, 120.8, 123.4, 125.3, 127.4, 128.9, 129.6, 131.7, 133.3, 134.9, 138.3, 145.1, 153.0.
【0218】
［実施例３］＜化合物（１）−１の製造＞
以下に示す手順により、化合物（１）のうち、化合物（１）−１として化合物（１Ａ）−１０１を製造した。
アルゴン雰囲気下で、化合物（１１Ａａ）−１０１（１２５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解させた。得られたＴＨＦ黄色溶液を室温下で撹拌しながら、ここへテトラブチルアンモニウムフルオライド（３６０μＬ、０．４ｍｍｏｌ）を滴下し、さらに１時間撹拌した。反応液中で黄色結晶が析出したのを確認した後、この反応液に酢酸（３６０μＬ）を加えて中和を行い、さらに約１０分撹拌した。反応液中で黄色沈殿物が多くなったのを確認した後、吸引ろ過を行い、０℃のアセトン／エタノール（５／１、体積比）混合溶媒で黄色沈殿物を洗浄して、化合物（１Ａ）−１０１を黄色粉末として得た（収量５４ｍｇ、収率８０％）。
【0219】
得られた化合物（１Ａ）−１０１の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz)σ2.71(m, 2H), 3.61(m, 1H), 3.66(m, 1H), 4.05(m, 1H), 4.49(m, 1H),5.07(dd, J = 5.0, 5.5 Hz, 1H), 5.47(d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.87(dd, J = 5.5, 6.0 Hz, 1H), 7.18(br s, 2H), 7.64(dd, J = 1.8, 8.7 Hz, 1H), 8.10(d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.67(s, 1H), 8.73(s, 1H), 8.80(s, 1H).
13C-NMR(DMSO-d6, 100MHz)σ60.6, 69.1, 78.0, 85.8, 87.8, 105.3, 117.4, 119.7, 121.6, 124.8, 126.4, 128.4, 129.5, 130.7, 132.8, 135.4, 139.7, 145.6, 153.7.
【0220】
【化31】
【0221】
［試験例１］＜化合物（１）−１の光学特性の評価＞
［紫外線吸収スペクトルの測定］
上記で得られた化合物（１Ａ）−１０１を、（Ｓ１）１，４−ジオキサン、（Ｓ２）ＴＨＦ、（Ｓ３）酢酸エチル、（Ｓ４）ＤＭＦ、（Ｓ５）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、（Ｓ６）アセトニトリル、（Ｓ７）２−プロパノール、（Ｓ８）エタノール、（Ｓ９）メタノール、（Ｓ１０）エチレングリコール、（Ｓ１１）グリセロールの１１種の溶媒に、それぞれ濃度が１０μＭとなるように溶解させ、１１種の溶液を調製した。
次いで、得られたこれら溶液について、紫外可視分光光度計（島津製作所社製「ＵＶ−２５５０」）を用いて、紫外線吸収スペクトルを測定した。結果を図１（ａ）に示す。図１（ａ）のグラフにおける縦軸は吸光度を表し、横軸は光の波長（ｎｍ）を表す。
【0222】
［蛍光スペクトルの測定］上記で得られた化合物（１Ａ）−１０１の１１種の溶液について、蛍光光度計（島津製作所社製「ＲＦ−５３００ＰＣ」）を用いて、蛍光スペクトルを測定した。結果を図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）のグラフにおける縦軸は光の強度を表し、横軸は光の波長（ｎｍ）を表す。
【0223】
［励起スペクトルの測定］上記で得られた化合物（１Ａ）−１０１の１１種の溶液について、蛍光光度計（島津製作所社製「ＲＦ−５３００ＰＣ」）を用いて、励起スペクトルを測定した。結果を図１（ｃ）に示す。図１（ｃ）のグラフにおける縦軸は光の強度を表し、横軸は光の波長（ｎｍ）を表す。
【0224】
図１に示すように、化合物（１Ａ）−１０１の溶液は、紫外線吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び励起スペクトルのいずれにおいても、類似のスペクトルを示したものもあるが、溶媒の種類によっては、異なるスペクトルを示した。例えば、溶媒の種類によっては、蛍光発光波長が大きく変化しており、蛍光発光波長が変化している場合には、蛍光発光強度の変化が大きい傾向が見られた。
【0225】
［試験例２］＜化合物（１）−１における光学特性のｐＨ依存性の評価＞
［各ｐＨ条件下での紫外線吸収スペクトルの測定］
下記（ｂ１）〜（ｂ４）の４タイプの緩衝液を用い、ｐＨ４．０〜９．０に調節された、緩衝液／エタノール（９／１、体積比）の各種水溶液を調製し、これら水溶液にそれぞれ濃度が１０μＭとなるように、上記で得られた化合物（１Ａ）−１０１を溶解させ、ｐＨが異なる各種溶液を調製した。
（ｂ１）：グリシン塩酸塩及び塩化ナトリウムの合計濃度が１０ｍＭである、ｐＨ４．０の緩衝液。
（ｂ２）：酢酸及び酢酸ナトリウムの合計濃度が１０ｍＭであり、これら成分の比率を調節することで、ｐＨ４．３〜６．０のいずれかに調節された緩衝液。
（ｂ３）：リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムの合計濃度が１０ｍＭであり、これら成分の比率を調節することで、ｐＨ６．３〜８．０のいずれかに調節された緩衝液。
（ｂ４）：塩化アンモニウム及びアンモニアの合計濃度が１０ｍＭであり、これら成分の比率を調節することで、ｐＨ８．３〜９．０のいずれかに調節された緩衝液。
【0226】
次いで、これらのｐＨが異なる各種溶液について、紫外可視分光光度計（島津製作所社製「ＵＶ−２５５０」）を用いて、紫外線吸収スペクトルを測定した。結果を図２（ａ）に示す。
【0227】
［各ｐＨ条件下での蛍光スペクトルの測定］上記で得られた、ｐＨが異なる化合物（１Ａ）−１０１の各種溶液について、蛍光光度計（島津製作所社製「ＲＦ−５３００ＰＣ」）を用いて、蛍光スペクトルを測定した。結果を図２（ｂ）に示す。
【0228】
図２に示すように、化合物（１Ａ）−１０１の溶液は、紫外線吸収スペクトル及び蛍光スペクトルのいずれにおいても、ｐＨに依存して異なるスペクトルを示した。特に蛍光スペクトルの変化が大きく、ｐＨに依存して蛍光発光波長及び蛍光発光強度がともに大きく変化していた。このことから、化合物（１Ａ）−１０１中のＢＩＱ骨格に含まれる窒素原子においては、プロトン化及び脱プロトン化の変化が生じていると推測された。
【0229】
なお、上記の紫外線吸収スペクトルの測定結果のうち、波長３９４ｎｍでの測定値を用いて、化合物（１Ａ）−１０１のｐＫａを算出した結果、その値は６．１６であった。また、上記の蛍光スペクトルの測定結果のうち、波長３７９ｎｍでの測定値を用いて、化合物（１Ａ）−１０１のｐＫａを算出した結果、その値は６．０８であった。
これらの結果から、化合物（１Ａ）−１０１のｐＫａは、６．１〜６．２であると考えられた。
【0230】
化合物（１Ａ）−１０１において、ｐＨ４．５の酸系における、励起光の波長が３７０ｎｍである場合の絶対量子収率は０．８５６であり、蛍光寿命は９．６ナノ秒であった。また、化合物（１Ａ）−１０１において、ｐＨ８．５の塩基系における、励起光の波長が３７０ｎｍである場合の絶対量子収率は０．８５２であり、蛍光寿命は５．２ナノ秒であった。
【0231】
［実施例４］＜縮合物（ポリヌクレオチド）の製造＞
以下に示す手順により、化合物（１Ａ）−１０１をモノマーとして用いた縮合物として、ポリヌクレオチドを製造した。
【0232】
［化合物（３Ａ）−１０１の製造］アルゴン雰囲気下で、化合物（１Ａ）−１０１（４２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させた。得られたＤＭＦ黄色溶液に、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタール（１００μＬ）を加え、８０℃のオイルバス中で２時間撹拌した。得られた反応液を室温まで冷却した後、減圧濃縮し、得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン（３００／１０／３〜１００／５／１）により精製し、化合物（３Ａ）−１０１を黄色粉末として得た（収量４２ｍｇ、収率７２％）。
【0233】
得られた化合物（３Ａ）−１０１の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz)σ0.95(m, 6H), 1.36(m, 4H), 1.65(m, 4H), 2.71(m, 2H), 3.46(m, 2H), 3.61-3.67(complex, 4H), 4.05(m, 1H), 4.49(m, 1H),5.07(m, 1H), 5.49(d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.93(t, J = 5.7, 6.0 Hz, 1H), 7.69(m, 1H), 8.20(d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.48(s, 1H), 8.68(s, 1H), 8.82(s, 1H), 8.90(s, 1H), 8.93(s, 1H).
13C-NMR(DMSO-d6, 100MHz)σ13.6, 13.7, 19.1, 19.6, 28.7, 30.5, 40.1, 44.3, 50.7,60.4, 68.9, 85.6, 87.6, 106.2, 118.0, 119.5, 121.5, 124.3, 124.6, 127.3, 128.8, 131.9, 132.2, 133.9, 135.4, 139.9, 144.2, 156.7, 157.7.
【0234】
［化合物（４Ａ）−１０１の製造］アルゴン雰囲気下で、化合物（３Ａ）−１０１（５０ｍｇ、９．７２×１０−２ｍｍｏｌ）をピリジン（１．５ｍＬ）に溶解させた。得られたピリジン黄色溶液に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温下で一晩撹拌した。得られた反応液を減圧濃縮し、得られた濃縮物に対して、酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液の２層系で分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウムによって脱水した後、減圧濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン（２００／１／２、体積比）により精製し、化合物（４Ａ）−１０１を黄色粉末として得た（収量３８ｍｇ、収率５３％）。
【0235】
得られた化合物（４Ａ）−１０１の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz)σ0.98(m, 6H), 1.44(m, 4H), 1.74(m, 4H), 2.88(m, 1H), 3.09(dd, J = 10.5 Hz, 1H), 3.21(m, 1H), 3.33(m, J = 4.6, 10.5 Hz, 1H), 3.52(m, 2H), 3.53(s, 3H), 3.59(s, 3H), 3.75(m, 2H), 4.30(m, 1H), 4.89(m, 1H), 6.41(m, 2H), 6.50(m, 2H), 6.90(m, 1H), 7.02-7.15(complex, 9H), 7.56(dd, J = 1.4, 8.7 Hz, 1H), 8.39(s, 1H), 8.45(s, 1H), 8.57(s, 1H), 9.00(s, 1H), 9.11.
13C-NMR(DMSO-d6, 100MHz)σ14.1, 14.3, 20.5, 20.9, 30.1, 32.0, 40.3, 45.9, 52.3, 55.3, 55.3, 63.6, 70.7, 86.2, 86.5, 87.2, 108.0, 113.6(2C), 113.6(2C), 113.9, 119.5, 120.2, 123.0, 125.4, 125.5, 128.4(2C), 128.7(2C), 128.8, 129.8, 130.5(2C), 130.8(2C), 133.6, 134.0, 135.7, 136.1, 136.4, 136.6, 139.6, 145.8, 146.1, 158.1, 158.9, 159.2, 159.3.
【0236】
［化合物（５Ａ）−１０１の製造］アルゴン雰囲気下で、化合物（４Ａ）−１０１（３７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解させた。得られたアセトニトリル溶液に、トリエチルアミン（０．５ｍＬ）加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１００μＬ）を滴下して、室温下で１時間撹拌した。得られた反応液に対して、酢酸エチル及び炭酸水素ナトリウム水溶液の２層系で分液操作を行い、得られた有機層に対して、さらに酢酸エチル及び塩化ナトリウム水溶液の２層系で分液操作を行った。次いで、得られた有機層を硫酸ナトリウムによって脱水した後、減圧濃縮することで、化合物（５Ａ）−１０１を得た。
【0237】
［ポリヌクレオチドの製造］化合物（５Ａ）−１０１をアセトニトリル（６００μＬ）に溶解させ、得られた溶液と、ＤＮＡ自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製「ＤＮＡシンセサイザー３４００」）とを用いて、ＤＮＡ鎖の自動合成を行い、配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド（５’−ＣＧＣＡＡＴＮＴＡＡＣＧＣ−３’（Ｎは化合物（５Ａ）−１０１中のＢＩＱ骨格を有する塩基部位を表す）、以下、「ＯＤＮ１」と略記することがある）を得た。
【0238】
得られたＯＤＮ１は、さらに、下記の条件で高速液体クロマトグラフィーでの分取による精製を行った。移動相：ＡＦ緩衝液／アセトニトリル（アセトニトリルの濃度を４５分で３体積％から２０体積％まで上昇させた。）
流量：２．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：ケムコプラス社製「ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ ５−ＯＤＳ−Ｈ」（１０ｍｍ×１５０ｍｍ）
【0239】
得られたＯＤＮ１について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により分析した結果、プロトン付加体イオン［Ｍ＋Ｈ］＋の質量の測定値が４０５２．０２であり、理論値４０５２．８とほぼ一致した。これにより、ＯＤＮ１は目的物であることが確認された。
【0240】
【化32】
【0241】
［試験例３］＜ポリヌクレオチドにおける光学特性のｐＨ依存性の評価＞
［各ｐＨ条件下での紫外線吸収スペクトルの測定］
ｐＨ４．０〜８．０に調節された、下記（ｂ５）〜（ｂ７）の３タイプの緩衝液を調製し、これら緩衝液にそれぞれ濃度が５μＭとなるように、上記で得られたＯＤＮ１を溶解させ、ｐＨが異なる各種溶液を調製した。
（ｂ５）：酢酸及び酢酸ナトリウムの合計濃度が１０ｍＭであり、これら成分の比率を調節することで、ｐＨ４．０〜６．０のいずれかに調節された緩衝液。
（ｂ６）：リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムの合計濃度が１０ｍＭであり、これら成分の比率を調節することで、ｐＨ６．３〜８．０のいずれかに調節された緩衝液。
（ｂ７）：塩化アンモニウム及びアンモニアの合計濃度が１０ｍＭであり、これら成分の比率を調節することで、ｐＨ８．３〜９．０のいずれかに調節された緩衝液。
【0242】
次いで、これらのｐＨが異なる各種溶液について、紫外可視分光光度計（島津製作所社製「ＵＶ−２５５０」）を用いて、紫外線吸収スペクトルを測定した。結果を図３（ａ）に示す。
【0243】
［各ｐＨ条件下での蛍光スペクトルの測定］上記で得られた、ｐＨが異なるＯＤＮ１の各種溶液について、蛍光光度計（島津製作所社製「ＲＦ−５３００ＰＣ」）を用いて、蛍光スペクトルを測定した。結果を図３（ｂ）に示す。
【0244】
［各ｐＨ条件下での励起スペクトルの測定］上記で得られた、ｐＨが異なるＯＤＮ１の各種溶液について、蛍光光度計（島津製作所社製「ＲＦ−５３００ＰＣ」）を用いて、励起スペクトルを測定した。結果を図３（ｃ）に示す。
【0245】
図３（ｂ）に示すように、ＯＤＮ１の溶液は、例えば、波長４３０〜４８０ｎｍの領域内においては、ｐＨが低くなるほど蛍光発光強度が小さくなる傾向を示し、ｐＨに依存して蛍光発光強度が変化した。これは、ＯＤＮ１が二重鎖を形成していない状態で、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格は、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大する（換言すると、前記溶液のｐＨが高くなるに従って脱プロトン化の程度が増大する）ことを示していた。しかし、蛍光スペクトルにおいて蛍光発光強度が大きい主たるピークの蛍光発光波長に変化がなく、蛍光発光波長に明りょうな変化はなかった。
【0246】
なお、図３（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、濃度が５μＭのＯＤＮ１の溶液のものであり、先の図２（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、濃度が１０μＭの化合物（１Ａ）−１０１の溶液のものであって、これら溶液では、目的物の濃度が異なる。しかし、これら蛍光スペクトルのうち、例えば、ｐＨ４．５等の酸性条件下で、同じｐＨでの蛍光スペクトルを比較すると、蛍光発光強度は、いずれも波長が４１０ｎｍ又はその近傍の場合に最大となるが、その最大値（蛍光発光強度の最大値）は、目的物の濃度の相違を考慮しても、図３（ｂ）に示す蛍光スペクトルでは、図２（ｂ）に示す蛍光スペクトルから想定される値よりも明らかに小さくなっていた。すなわち、化合物（１）の溶液と、本発明のポリヌクレオチドの溶液とで、ＢＩＱ骨格の濃度が同じであるもの同士の蛍光発光強度を比較すると、ポリヌクレオチドの溶液の方が、蛍光発光強度が低くなることが確認された。
【0247】
＜ポリヌクレオチド中のシトシンの検出＞［実施例５］
ｐＨ４．０〜８．０に調節された、前記（ｂ５）〜（ｂ７）の３タイプの緩衝液を調製し、これら緩衝液に、上記で得られたＯＤＮ１と、配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド（３’−ＧＣＧＴＴＡＣＡＴＴＧＣＧ−５’、以下、「ＴｒｉｃｈＣ」と略記することがある）と、を溶解させた。次いで、９０℃で５分加熱した後、ゆっくりと室温まで冷却することでハイブリダイゼーションさせて、これらポリヌクレオチドの二重鎖を含む、ｐＨが異なる各種溶液を調製した。ＯＤＮ１とＴｒｉｃｈＣの使用量は、前記溶液におけるこれらポリヌクレオチドの二重鎖の濃度が５μＭとなるように調節した。
【0248】
次いで、これらのｐＨが異なる各種溶液について、試験例３の場合と同じ方法で紫外線吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを測定した。紫外線吸収スペクトルの測定結果を図４（ａ）に、蛍光スペクトルの測定結果を図４（ｂ）に、励起スペクトルの測定結果を図４（ｃ）に、それぞれ示す。
【0249】
さらに、これらのｐＨが異なる各種溶液について、加熱しながら吸光度を測定し、熱融解曲線を作成して、前記二重鎖の融解温度（以下、「Ｔｍ」と略記することがある）を測定した。このとき得られた熱融解曲線を図４（ｄ）に示す。図４（ｄ）のグラフにおける縦軸は標準化吸光度を表し、横軸は加熱温度（℃）を表す。また、Ｔｍの測定値を表１に示す。
【0250】
図４（ｂ）に示すように、前記溶液の蛍光スペクトルでは、ｐＨが低くなるに従って、蛍光発光強度が小さくなっており、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大していることを示していた。また、図４（ｂ）と図３（ｂ）とで、ｐＨ７．０〜８．０等の領域における同じｐＨでの蛍光スペクトルを比較すると、ＯＤＮ１の濃度が同じであるにもかかわらず、図４（ｂ）の蛍光スペクトルの方が、全体的に蛍光発光強度が小さかった。これは、弱塩基性の溶液中において、ＯＤＮ１がＴｒｉｃｈＣと共存している場合には、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格がすでにプロトン化されているのに対し、ＯＤＮ１が単独で存在している場合には、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格がプロトン化されていないか、又はプロトン化の程度が著しく低いことを示していた。さらに、前記溶液の蛍光スペクトルでは、ｐＨが低くなるに従って、蛍光発光強度が大きい主たるピークの蛍光発光波長が変化していた。特に、蛍光発光強度が最大となるときの蛍光発光波長は、ｐＨが６．５以上の場合には４４０ｎｍ又はその近傍であるのに対し、ｐＨが６．０以下の場合には４１５ｎｍ又はその近傍であり、明りょうな変化が見られた。
さらに、このような短波長側へ変化した蛍光発光は、周辺に存在する核酸塩基の影響により、強く消光されることが判った。すなわち、ｐＨの変化によって、発光波長が変化した蛍光発光の強度は、消光によって小さくなっていた。
これらの結果は、例えば、前記溶液のｐＨが６．０以下のような酸性条件下の場合、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格が、プロトン化されるとともに、ＴｒｉｃｈＣ中の対面するシトシンを識別し、このシトシンと安定して塩基対を形成していることを示していた。
【0251】
一方、表１に示すように、ＴｍはｐＨ５．５で最高値となっており、ｐＨ６．０でもかなり高く、ｐＨが５．５〜６．０の場合に、前記二重鎖が最も安定して形成されていると推測された。
【0252】
試験例３及び実施例５の結果から、シトシンを有するポリヌクレオチドを含有せず、本発明のポリヌクレオチドからなるプローブを含有する酸性溶液、及びシトシンを有するポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチドからなるプローブと、を含有する酸性溶液について、前記プローブの蛍光を測定し、その測定結果から、前記ポリヌクレオチドの含有の有無に基づく、蛍光発光波長の変化を検出することで、解析対象の前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出できることが確認された。また、実施例５の結果から、シトシンを有するポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチドからなるプローブと、を含有し、ｐＨが異なる複数種の溶液について、前記プローブの蛍光を測定し、その測定結果から、前記溶液のｐＨの違いに基づく蛍光発光波長の変化を検出することで、解析対象の前記ポリヌクレオチド中のシトシンを検出できることが確認された。
【0253】
また、本発明のポリヌクレオチドからなるプローブを含有し、前記プローブと二重鎖を形成し得るポリヌクレオチドを含有しない弱塩基性溶液、好ましくはポリヌクレオチドとして、本発明のポリヌクレオチドからなるプローブのみを含有する弱塩基性溶液、及び本発明のポリヌクレオチドからなるプローブと、前記プローブと二重鎖を形成し得るポリヌクレオチドと、を含有する弱塩基性溶液、の２種の弱塩基性溶液として、前記プローブの濃度が同じであるものを用い、これら２種の弱塩基性溶液について、前記プローブの蛍光を測定し、その測定結果から、蛍光発光強度の違いを検出することで、前記プローブ中のＢＩＱ骨格のプロトン化の有無を検出できることが確認された。ここで、弱塩基性溶液とは、例えば、ｐＨ７．５〜８．０の溶液である。
【0254】
［比較例１］ＴｒｉｃｈＣに代えて、配列番号３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド（３’−ＧＣＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＧ−５’、以下、「ＴｒｉｃｈＡ」と略記することがある）を用いた点以外は、実施例５と同じ方法で、二重鎖の形成を試み、紫外線吸収スペクトル、蛍光スペクトル、励起スペクトル及びＴｍを測定した。ＴｒｉｃｈＡの塩基配列は、中央の塩基がシトシンではなくアデニンである点以外は、上述のＴｒｉｃｈＣの塩基配列と同じである。紫外線吸収スペクトルの測定結果を図５（ａ）に、蛍光スペクトルの測定結果を図５（ｂ）に、励起スペクトルの測定結果を図５（ｃ）に、熱融解曲線を図５（ｄ）に、それぞれ示す。また、Ｔｍの測定値を表１に示す。
【0255】
図５（ｂ）に示すように、ＴｒｉｃｈＡを用いた場合には、前記溶液のｐＨが低くなるに従って、蛍光発光強度が小さくなっており、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大していることを示していた。また、図５（ｂ）と図４（ｂ）とで、ｐＨ７．０〜８．０等の領域における同じｐＨでの蛍光スペクトルを比較すると、ＯＤＮ１の濃度が同じであるにもかかわらず、図４（ｂ）の蛍光スペクトルの方が、全体的に蛍光発光強度が小さかった。これは、弱塩基性の溶液中において、ＯＤＮ１がＴｒｉｃｈＣと共存している場合には、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格がすでにプロトン化されているのに対し、ＯＤＮ１がＴｒｉｃｈＡと共存している場合には、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格がプロトン化されていないか、又はプロトン化の程度が著しく低いことを示していた。さらに、ＴｒｉｃｈＡを用いた場合には、前記溶液の蛍光スペクトルでは、ｐＨが変化しても、蛍光発光強度が大きい主たるピークの蛍光発光波長に明りょうな変化が見られなかった。より具体的には、蛍光発光強度が最大となるときの蛍光発光波長は、概ねｐＨによらず４４０ｎｍ又はその近傍であった。この結果には、実施例５の場合と同様に、短波長側での蛍光発光の強い消光作用も関与している可能性がある。
これらの結果は、ＴｒｉｃｈＡの共存下において、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格は、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大したものの、前記溶液のｐＨによらず、ＴｒｉｃｈＡ中の対面するアデニンを識別せず、このアデニンとは塩基対を形成していないことを示していた。
【0256】
また、表１に示すように、ＴｍはｐＨ６．５で最高値となっており、ｐＨ７．０及び７．５でもかなり高いが、いずれも実施例５でのＴｍの最高値よりも顕著に低かった。このことから、ＴｒｉｃｈＡを用いた場合の二重鎖は、実施例５での二重鎖よりも顕著に不安定であると推測された。
【0257】
［比較例２］ＴｒｉｃｈＣに代えて、配列番号４に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド（３’−ＧＣＧＴＴＡＧＡＴＴＧＣＧ−５’、以下、「ＴｒｉｃｈＧ」と略記することがある）を用いた点以外は、実施例５と同じ方法で、二重鎖の形成を試み、紫外線吸収スペクトル、蛍光スペクトル、励起スペクトル及びＴｍを測定した。ＴｒｉｃｈＧの塩基配列は、中央の塩基がシトシンではなくグアニンである点以外は、上述のＴｒｉｃｈＣの塩基配列と同じである。紫外線吸収スペクトルの測定結果を図６（ａ）に、蛍光スペクトルの測定結果を図６（ｂ）に、励起スペクトルの測定結果を図６（ｃ）に、熱融解曲線を図６（ｄ）に、それぞれ示す。また、Ｔｍの測定値を表１に示す。
【0258】
図６（ｂ）に示すように、ＴｒｉｃｈＧを用いた場合には、前記溶液のｐＨが低くなるに従って、蛍光発光強度が小さくなっており、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大していることを示していた。また、図６（ｂ）と図４（ｂ）とで、ｐＨ７．０〜８．０等の領域における同じｐＨでの蛍光スペクトルを比較すると、ＯＤＮ１の濃度が同じであるにもかかわらず、図４（ｂ）の蛍光スペクトルの方が、全体的に蛍光発光強度が小さかった。これは、弱塩基性の溶液中において、ＯＤＮ１がＴｒｉｃｈＣと共存している場合には、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格がすでにプロトン化されているのに対し、ＯＤＮ１がＴｒｉｃｈＧと共存している場合には、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格がプロトン化されていないか、又はプロトン化の程度が著しく低いことを示していた。さらに、ＴｒｉｃｈＧを用いた場合には、前記溶液の蛍光スペクトルでは、ｐＨが変化しても、蛍光発光強度が大きい主たるピークの蛍光発光波長に明りょうな変化が見られなかった。より具体的には、蛍光発光強度が最大となるときの蛍光発光波長は、概ねｐＨによらず４４０ｎｍ又はその近傍であった。この結果にも、実施例５の場合と同様に、短波長側での蛍光発光の強い消光作用も関与している可能性がある。
これらの結果は、ＴｒｉｃｈＧの共存下において、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格は、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大したものの、前記溶液のｐＨによらず、ＴｒｉｃｈＧ中の対面するグアニンを識別せず、このグアニンとは塩基対を形成していないことを示していた。
【0259】
また、表１に示すように、ＴｍはｐＨ７．０で最高値となっており、ｐＨ６．５でもかなり高いが、いずれも実施例５でのＴｍの最高値よりも顕著に低かった。このことから、ＴｒｉｃｈＧを用いた場合の二重鎖は、実施例５での二重鎖よりも顕著に不安定であると推測された。
【0260】
［参考例１］ＴｒｉｃｈＣに代えて、配列番号５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド（３’−ＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＧＣＧ−５’、以下、「ＴｒｉｃｈＴ」と略記することがある）を用いた点以外は、実施例５と同じ方法で、二重鎖の形成を試み、紫外線吸収スペクトル、蛍光スペクトル、励起スペクトル及びＴｍを測定した。ＴｒｉｃｈＴの塩基配列は、中央の塩基がシトシンではなくチミンである点以外は、上述のＴｒｉｃｈＣの塩基配列と同じである。紫外線吸収スペクトルの測定結果を図７（ａ）に、蛍光スペクトルの測定結果を図７（ｂ）に、励起スペクトルの測定結果を図７（ｃ）に、熱融解曲線を図７（ｄ）に、それぞれ示す。また、Ｔｍの測定値を表１に示す。
【0261】
図７（ｂ）に示すように、ＴｒｉｃｈＴを用いた場合には、前記溶液のｐＨが低くなるに従って、蛍光発光強度が小さくなっており、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大していることを示していた。また、図７（ｂ）と図４（ｂ）とで、ｐＨ７．０〜８．０等の領域における同じｐＨでの蛍光スペクトルを比較すると、ＯＤＮ１の濃度が同じであるにもかかわらず、図４（ｂ）の蛍光スペクトルの方が、全体的に蛍光発光強度が小さかった。これは、弱塩基性の溶液中において、ＯＤＮ１がＴｒｉｃｈＣと共存している場合には、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格がすでにプロトン化されているのに対し、ＯＤＮ１がＴｒｉｃｈＴと共存している場合には、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格がプロトン化されていないか、又はプロトン化の程度が著しく低いことを示していた。さらに、ＴｒｉｃｈＴを用いた場合には、前記溶液の蛍光スペクトルでは、ｐＨが変化しても、蛍光発光強度が大きい主たるピークの蛍光発光波長に明りょうな変化が見られなかった。より具体的には、蛍光発光強度が最大となるときの蛍光発光波長は、概ねｐＨによらず４４０ｎｍ又はその近傍であった。この結果にも、実施例５の場合と同様に、短波長側での蛍光発光の強い消光作用も関与している可能性がある。
【0262】
また、表１に示すように、ＴｍはｐＨ７．５で最高値となっているが、実施例５でのＴｍの最高値よりも明らかに低かった。このことから、ＴｒｉｃｈＴを用いた場合の二重鎖は、実施例５での二重鎖よりも不安定であると推測された。ただし、本参考例でのＴｍの前記最高値は、比較例１及び比較例２でのＴｍの最高値よりも明らかに高かった。これは、ＯＤＮ１中のＢＩＱ骨格がプロトン化されていない状態で、アデニンの場合と同様に、ＴｒｉｃｈＴ中の対面するチミンを識別して、塩基対を形成しているためであると推測された。
【0263】
【表1】
【0264】
［実施例６］＜縮合物（ポリヌクレオチド）の製造＞
ＤＮＡ鎖の自動合成時における各モノマーの反応順序を変更した点以外は、実施例４と同様の方法で、配列番号６に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド（５’−ＧＧＴＡＣＣＡＮＴＧＡＡＡＴＡ−３’（Ｎは化合物（５Ａ）−１０１中のＢＩＱ骨格を有する塩基部位を表す）、以下、「ＯＤＮ２」と略記することがある）を得た。
【0265】
得られたＯＤＮ２について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により分析した結果、プロトン付加体イオン［Ｍ＋Ｈ］＋の質量の測定値が４７３４．１３であり、理論値４７３４．２６とほぼ一致した。これにより、ＯＤＮ２は目的物であることが確認された。
【0266】
［試験例４］＜ポリヌクレオチドにおける光学特性のｐＨ依存性の評価＞
［各ｐＨ条件下での紫外線吸収スペクトルの測定］
ｐＨ４．５〜８．０に調節された、前記（ｂ５）〜（ｂ６）の２タイプの緩衝液、及びｐＨ８．５〜９．０に調節された、前記（ｂ７）のタイプの緩衝液を調製し、これら緩衝液にそれぞれ濃度が５μＭとなるように、上記で得られたＯＤＮ２を溶解させ、ｐＨが異なる各種溶液を調製した。
【0267】
次いで、これらのｐＨが異なる各種溶液について、紫外可視分光光度計（島津製作所社製「ＵＶ−２５５０」）を用いて、紫外線吸収スペクトルを測定した。結果を図８（ａ）に示す。
【0268】
［各ｐＨ条件下での蛍光スペクトルの測定］上記で得られた、ｐＨが異なるＯＤＮ２の各種溶液について、蛍光光度計（島津製作所社製「ＲＦ−５３００ＰＣ」）を用いて、蛍光スペクトルを測定した。結果を図８（ｂ）に示す。
【0269】
図８（ｂ）に示すように、ＯＤＮ２の溶液は、例えば、波長４２０〜５００ｎｍの領域内においては、ｐＨが低くなるほど蛍光発光強度が小さくなる傾向を示し、ｐＨに依存して蛍光発光強度が変化した。これは、ＯＤＮ２が二重鎖を形成していない状態で、ＯＤＮ２中のＢＩＱ骨格は、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大する（換言すると、前記溶液のｐＨが高くなるに従って脱プロトン化の程度が増大する）ことを示していた。しかし、蛍光スペクトルにおいて蛍光発光強度が大きい主たるピークの蛍光発光波長に変化がなく、蛍光発光波長に明りょうな変化はなかった。
【0270】
なお、図８（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、濃度が５μＭのＯＤＮ２の溶液のものであり、先の図２（ｂ）に示す蛍光スペクトルは、濃度が１０μＭの化合物（１Ａ）−１０１の溶液のものであって、これら溶液では、目的物の濃度が異なる。しかし、これら蛍光スペクトルのうち、例えば、ｐＨ４．５等の酸性条件下で、同じｐＨでの蛍光スペクトルを比較すると、蛍光発光強度は、図８（ｂ）では波長が４４０ｎｍ又はその近傍の場合に最大となり、図２（ｂ）では波長が４１０ｎｍ又はその近傍の場合に最大となるが、その最大値（蛍光発光強度の最大値）は、目的物の濃度の相違を考慮しても、図８（ｂ）に示す蛍光スペクトルでは、図２（ｂ）に示す蛍光スペクトルから想定される値よりも明らかに小さくなっていた。すなわち、先に説明したＯＤＮ１の場合と同様に、化合物（１）の溶液と、本発明のポリヌクレオチドの溶液とで、ＢＩＱ骨格の濃度が同じであるもの同士の蛍光発光強度を比較すると、ポリヌクレオチドの溶液の方が、蛍光発光強度が低くなることが確認された。
【0271】
＜ポリヌクレオチド中のシトシンの検出＞［実施例７］
ｐＨ４．５〜８．０に調節された、前記（ｂ５）〜（ｂ６）の２タイプの緩衝液、及びｐＨ８．５〜９．０に調節された、前記（ｂ７）のタイプの緩衝液を調製し、これら緩衝液に、上記で得られたＯＤＮ２と、配列番号７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド（３’−ＣＣＡＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＡＴ−５’、以下、「ＢＲＣＡ１−Ｃ」と略記することがある）と、を溶解させた。次いで、９０℃で５分加熱した後、ゆっくりと室温まで冷却することでハイブリダイゼーションさせて、これらポリヌクレオチドの二重鎖を含む、ｐＨが異なる各種溶液を調製した。ＯＤＮ２とＢＲＣＡ１−Ｃの使用量は、前記溶液におけるこれらポリヌクレオチドの二重鎖の濃度が５μＭとなるように調節した。
【0272】
次いで、これらのｐＨが異なる各種溶液について、試験例３の場合と同じ方法で、紫外線吸収スペクトル、蛍光スペクトル及びＴｍを測定した。紫外線吸収スペクトルの測定結果を図９（ａ）に、蛍光スペクトルの測定結果を図９（ｂ）に、熱融解曲線を図９（ｃ）に、それぞれ示す。
【0273】
図９（ｂ）に示すように、前記溶液の蛍光スペクトルでは、ｐＨが低くなるに従って、概ね蛍光発光強度が小さくなっており、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大していることを示していた。また、図９（ｂ）と図８（ｂ）とで、ｐＨ７．０〜９．０等の領域における同じｐＨでの蛍光スペクトルを比較すると、ＯＤＮ２の濃度が同じであるにもかかわらず、図９（ｂ）の蛍光スペクトルの方が、全体的に蛍光発光強度が小さかった。これは、上述のＯＤＮ１の場合と同様の結果であった。すなわち、弱塩基性の溶液中において、ＯＤＮ２がＢＲＣＡ１−Ｃと共存している場合には、ＯＤＮ２中のＢＩＱ骨格がすでにプロトン化されているのに対し、ＯＤＮ２が単独で存在している場合には、ＯＤＮ２中のＢＩＱ骨格がプロトン化されていないか、又はプロトン化の程度が著しく低いことを示していた。さらに、前記溶液の蛍光スペクトルでは、ｐＨが低くなるに従って、蛍光発光強度が大きい主たるピークの蛍光発光波長が変化していた。より具体的には、ｐＨが７．０以上の場合には概ね４４０ｎｍ又はその近傍のみに主たるピークが存在していた。これに対して、ｐＨが６．５以下の場合には、４４０ｎｍ又はその近傍以外に、３９０ｎｍ又はその近傍にも主たるピークが存在していた。そして、ｐＨが４．５及び５．０の場合には、４４０ｎｍ又はその近傍、及び３９０ｎｍ又はその近傍以外にも、４１０ｎｍ又はその近傍にも主たるピークが存在していた。このように、前記溶液のｐＨに依存して、蛍光発光波長の明りょうな変化が見られた
さらに、上述のＯＤＮ１の場合と同様に、このような短波長側へ変化した蛍光発光は、周辺に存在する核酸塩基の影響により、強く消光されることが判った。すなわち、ｐＨの変化によって、発光波長が変化した蛍光発光の強度は、消光によって小さくなっていた。
これらの結果は、例えば、前記溶液のｐＨが６．５以下のような酸性条件下の場合、ＯＤＮ２中のＢＩＱ骨格が、プロトン化されるとともに、ＢＲＣＡ１−Ｃ中の対面するシトシンを識別し、このシトシンと安定して塩基対を形成していることを示していた。
【0274】
また、図９（ｃ）に示すように、いずれの溶液でも熱融解曲線はシグモイド曲線となっており、前記二重鎖が形成され、ＯＤＮ２中のＢＩＱ骨格は、前記溶液のｐＨが６．５以下の酸性条件の場合にプロトン化されるとともに、ＢＲＣＡ１−Ｃ中において対面するシトシンを識別し、このシトシンと安定して塩基対を形成していると判断できた。
【0275】
［参考例２］ＢＲＣＡ１−Ｃに代えて、配列番号８に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド（３’−ＣＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＴＴＡＴ−５’、以下、「ＢＲＣＡ１−Ｔ」と略記することがある）を用いた点以外は、実施例７と同じ方法で、二重鎖の形成を試み、紫外線吸収スペクトル、蛍光スペクトル及びＴｍを測定した。ＢＲＣＡ１−Ｔの塩基配列は、中央の塩基がシトシンではなくチミンである点以外は、上述のＢＲＣＡ１−Ｃの塩基配列と同じである。紫外線吸収スペクトルの測定結果を図１０（ａ）に、蛍光スペクトルの測定結果を図１０（ｂ）に、熱融解曲線を図１０（ｃ）に、それぞれ示す。
【0276】
図１０（ｂ）に示すように、ＢＲＣＡ１−Ｔを用いた場合には、前記溶液のｐＨが低くなるに従って、蛍光発光強度が小さくなっており、前記溶液のｐＨが低くなるに従ってプロトン化の程度が増大していることを示していた。また、図１０（ｂ）と図９（ｂ）とで、ｐＨ７．０〜９．０等の領域における同じｐＨでの蛍光スペクトルを比較すると、ＯＤＮ２の濃度が同じであるにもかかわらず、図９（ｂ）の蛍光スペクトルの方が、全体的に蛍光発光強度が小さかった。これは、弱塩基性の溶液中において、ＯＤＮ２がＢＲＣＡ１−Ｃと共存している場合には、ＯＤＮ２中のＢＩＱ骨格がすでにプロトン化されているのに対し、ＯＤＮ１がＢＲＣＡ１−Ｔと共存している場合には、ＯＤＮ２中のＢＩＱ骨格がプロトン化されていないか、又はプロトン化の程度が著しく低いことを示していた。さらに、ＢＲＣＡ１−Ｔを用いた場合には、前記溶液の蛍光スペクトルでは、ｐＨが変化しても、蛍光発光強度が大きい主たるピークの蛍光発光波長に明りょうな変化が見られなかった。より具体的には、蛍光発光強度が最大となるときの蛍光発光波長は、概ねｐＨによらず４４０ｎｍ又はその近傍であった。この結果にも、実施例７の場合と同様に、短波長側での蛍光発光の強い消光作用も関与している可能性がある。
【0277】
なお、ｐＨが７．５である場合のＴｍは、本参考例では４７．９℃であり、実施例７では４９．３℃であった。このように、前記Ｔｍが、実施例７よりも本参考例の方が明らかに低かったことから、ＢＲＣＡ１−Ｔを用いた場合の二重鎖は、ＢＲＣＡ１−Ｃを用いた場合の二重鎖よりも、不安定であると推測された。
【産業上の利用可能性】
【0278】
本発明は、ｐＨセンサー、遺伝子検出試薬、遺伝子検査用キット等に利用可能である。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]