特許 6711488 慢性閉塞性気道疾患の治療のための６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6711488

(24)【登録日】2020年6月1日

(45)【発行日】2020年6月17日

(54)【発明の名称】慢性閉塞性気道疾患の治療のための６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−化合物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/353 20060101AFI20200608BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20200608BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20200608BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20200608BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20200608BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200608BHJP

   A61K 31/557 20060101ALI20200608BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20200608BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20200608BHJP

   A61K 31/453 20060101ALI20200608BHJP

   A61K 31/4025 20060101ALI20200608BHJP

   A61M 15/00 20060101ALI20200608BHJP

   C07D 311/66 20060101ALN20200608BHJP

   C07D 405/06 20060101ALN20200608BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/353

   A61K31/496

   A61K45/00

   A61P11/00

   A61P11/06

   A61P43/00 121

   A61K31/557

   A61K31/573

   A61K31/5377

   A61K31/453

   A61K31/4025

   A61M15/00 Z

   !C07D311/66

   !C07D405/06

【請求項の数】14

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2016-573765(P2016-573765)

(86)(22)【出願日】2015年6月17日

(65)【公表番号】特表2017-524674(P2017-524674A)

(43)【公表日】2017年8月31日

(86)【国際出願番号】EP2015063579

(87)【国際公開番号】WO2015193365

(87)【国際公開日】20151223

【審査請求日】2018年6月15日

(31)【優先権主張番号】2013012

(32)【優先日】2014年6月17日

(33)【優先権主張国】NL

(73)【特許権者】

【識別番号】515169186

【氏名又は名称】スルファテック・ベスローテン・フェンノートシャップ

【氏名又は名称原語表記】Ｓｕｌｆａｔｅｑ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100144048

【弁理士】

【氏名又は名称】坂本 智弘

(74)【代理人】

【識別番号】100173978

【弁理士】

【氏名又は名称】朴 志恩

(74)【代理人】

【識別番号】100189186

【弁理士】

【氏名又は名称】大石 敏弘

(74)【代理人】

【識別番号】100186679

【弁理士】

【氏名又は名称】矢田 歩

(72)【発明者】

【氏名】ファン デル フラーフ，アドリアヌス コルネリス

(72)【発明者】

【氏名】シュミット，マルティナ

(72)【発明者】

【氏名】ウーヴリンク，ヘリット ヤン ウィレム

(72)【発明者】

【氏名】メールス，ヘルマヌス

(72)【発明者】

【氏名】ヘニング，ロバート ヘンク

【審査官】 水島 英一郎

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０２−５０３１９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／００６５０９９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０４５５５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／０７９３００（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ，Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

慢性閉塞性気道疾患の治療に使用するための下記式（ＩＩ）で表される（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノンもしくは下記式（ＩＩＩ）で表されるＮ，６−ジヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩もしくは塩基を含有する医薬製剤。

【化1】

【化2】

【請求項2】

前記化合物が（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノンである、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項3】

前記治療が、前記化合物の経口投与を含む、請求項１または２に記載の医薬製剤。

【請求項4】

前記経口投与が、吸入を含む、請求項３に記載の医薬製剤。

【請求項5】

前記治療が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療のためのものである、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬製剤。

【請求項6】

慢性閉塞性気道疾患の治療に使用するための下記式（Ｉ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含有する医薬製剤。

【化3】

（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであって、メチルまたはイソプロピルを表し、
Ｒ３は、水素またはニコチネート基を表し、
ｎは１であり、
Ｒ４は、ＣＯ−ＮＨ−Ｒ５であり、ここで、Ｃ＝Ｏはトロロックス部分に結合し、Ｒ５は窒素および／または酸素で置換されていてもよいアルキル基であり、該アルキル基は、１〜１２個の炭素原子を含み、前記窒素は、アミン、第四級アミン、グアニジンおよびイミンからなる群から選択され、前記酸素はヒドロキシルおよびカルボニルからなる群から選択され、前記酸素および前記窒素が、一緒になって、アミド、尿素またはカルバメート基を形成してもよく、
Ｒ５におけるアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状であってもよく、
Ｒ５におけるアルキル基が１つの環状構造を含み、
Ｒ４の分子量が３００Ｄａ以下である。）

【請求項7】

前記化合物が固体形態であり、そして、前記化合物の空気力学的直径が０．５〜８μｍである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項8】

前記治療が気管支拡張効果および抗炎症効果を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬製剤。

【請求項9】

喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の他の療法と組み合わせられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項10】

他の治療がコルチコステロイドおよび／または長時間作用型若しくは短時間作用型のβ−アドレナリン作動薬および／またはロイコトリエンを含む、請求項９に記載の医薬製剤。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬製剤を含む、吸入器としての薬物送達装置。

【請求項12】

前記化合物が、喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の他の療法と組み合わせられ、この併用療法は、同じ吸入器または複数の吸入器で行われる、請求項１１に記載の薬物送達装置。

【請求項13】

気管支拡張のための下記式（ＩＩ）で表される（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノンもしくは下記式（ＩＩＩ）で表されるＮ，６−ジヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩もしくは塩基を含有する医薬製剤。

【化4】

【化5】

【請求項14】

気管支拡張のための下記式（Ｉ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含有する医薬製剤。

【化6】

（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであって、メチルまたはイソプロピルを表し、
Ｒ３は、水素またはニコチネート基を表し、
ｎは１であり、
Ｒ４は、ＣＯ−ＮＨ−Ｒ５であり、ここで、Ｃ＝Ｏはトロロックス部分に結合し、Ｒ５は窒素および／または酸素で置換されていてもよいアルキル基であり、該アルキル基は、１〜１２個の炭素原子を含み、前記窒素は、アミン、第四級アミン、グアニジンおよびイミンからなる群から選択され、前記酸素はヒドロキシルおよびカルボニルからなる群から選択され、前記酸素および前記窒素が、一緒になって、アミド、尿素またはカルバメート基を形成してもよく、
Ｒ５におけるアルキル基は直鎖、分岐鎖または環状であってもよく、
Ｒ５におけるアルキル基が１つの環状構造を含み、
Ｒ４の分子量が３００Ｄａ以下である。）

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、または気管支拡張症等の慢性閉塞性気道疾患の治療のための化合物に関する。また、本発明は、本発明の化合物を含むネブライザーなどの慢性閉塞性気道疾患の治療に使用するのに適した薬物送達装置に関する。

【背景技術】

【0002】

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＬＤ）または慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＡＤ）とも呼ばれる慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、肺における気流の慢性閉塞を特徴とする閉塞性肺疾患の一種である。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の主な症状としては、息切れ、咳、および喀痰の生成がある。

【0003】

タバコ喫煙は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の最も一般的な原因であるが、大気汚染や遺伝などの他の因子も知られている。

【0004】

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、既知の原因への暴露を減らすことで予防することができる。これには、喫煙率を低下させ、屋内外の空気質を改善する努力が含まれる。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療には、禁煙、予防接種、リハビリ、並びに時々吸入する気管支拡張薬およびステロイドが含まれる。長期酸素療法や肺移植の恩恵を受ける人もいる。

【0005】

世界的に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、３億２９００万人、即ち人口の５％近くに及んでいる。２０１１年には、３００万人以上の命が奪われ、死亡原因の第４位にランクインした。死亡者数は、多くの国において喫煙率の上昇と高齢化により増加するとみられる。

【0006】

喘息は、変動性・再発性の症状、可逆的気流閉塞および気管支痙攣を特徴とする気道の一般的な慢性炎症性疾患である。一般的な症状としては、喘鳴、咳、胸部圧迫、息切れなどがある。

【0007】

喘息は、遺伝的要因と環境的因子との組み合わせによって引き起こされると考えられている。その診断は、通常、症状のパターン、経時的な（時間による）治療への反応、および肺活量測定に基づく。喘息は、症状の頻度、１秒間の強制呼気量（ＦＥＶ１）、およびピーク呼気流量に基づいて臨床的に分類される。喘息は、アトピー性（外因性）または非アトピー性（内因性）に分類することができるが、ここでアトピーとは、１型過敏反応を発症しやすい体質を指す。

【0008】

急性症状の治療には、通常、吸入短時間作用型β−２作動薬（例えば、サルブタモール）と経口コルチコステロイドを用いる。非常に重度の症例では、静注用コルチコステロイド、硫酸マグネシウム、入院が必要になる場合もある。症状は、アレルゲンや刺激物などのトリガー（ｔｒｉｇｇｅｒ）を避け、吸入コルチコステロイドを使用することにより、防止することができる。喘息症状が依然として制御できない場合には、長時間作用型β作動薬（ＬＡＢＡ）またはロイコトリエン拮抗薬を、吸入コルチコステロイドに加えて使用してもよい。

【0009】

喘息の発生は１９７０年代から大幅に増加した。２０１１年には、世界中で２億３５００万〜３億の人々が喘息と診断され、喘息を原因とする死亡者数は年間２５万人と推定されている。

【0010】

気管支拡張症は、筋肉および弾性組織の破壊によって引き起こされる、気管支樹の一部の局所的、不可逆的な拡張を特徴とする疾患である。それは、肺気腫、気管支炎および喘息と共に閉塞性肺疾患に分類される。

【0011】

関連気管支が、拡張され、炎症を起こし、容易に折り畳まれるようになると、気道閉塞や分泌物のクリアランス障害をもたらす。気管支拡張症は、重度の再発性肺炎、結核および嚢胞性線維症を含む、様々な感染および後天的な原因に起因し得る。気管支拡張症は先天性および後天性の両方の原因を有し、後者はより頻繁に起こる。

【0012】

結核、肺炎、吸入異物、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症および気管支腫瘍は、気管支拡張症の主な後天的原因である。気管支拡張症に関連する感染性の獲得経路としては、ブドウ球菌、クレブシエラまたは百日咳菌によって引き起こされる感染がある。さらに、アンモニアおよび他の有毒ガスの吸引、肺吸引、アルコール依存症、ヘロイン（薬物使用）および様々なアレルギーが、気管支拡張症の発症と関連しているようである。

【0013】

気管支拡張症はまた、繊毛の運動性またはイオン輸送に影響する先天性の原因に起因し得る。カルタゲナー症候群（Ｋａｒｔａｇｅｎｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、気管支拡張症の発症に関連する繊毛運動障害の１つである。別の一般的な原因は、塩素イオン輸送に影響する嚢胞性線維症である。若年性症候群は、嚢胞性線維症と臨床的に類似しており、気管支拡張症の発症に有意に寄与すると考えられている。これは、副鼻腔および気管支樹の慢性感染の発症によるものである。その他、あまり一般的ではない先天性の原因として、肺に一般に影響を及ぼす重度の再発性感染に対する免疫系の弱い応答または無応答に起因する原発性免疫不全が含まれる。

【0014】

喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および気管支拡張症などの慢性閉塞性気道疾患は、気道閉塞および呼吸困難を引き起こす慢性炎症および気管支収縮を特徴とする。現在の治療としては、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）作動薬およびコルチコステロイドのような抗炎症薬を含む気管支拡張薬による治療がある。β２−作動薬は、インビボでは抗炎症薬として有効ではない。理想的な薬剤は、脱感作のリスクを伴わずに、気管支拡張作用および抗炎症作用の両方を有するものである。特定の作用様式に関係なく、薬物が、収縮を低減させるか、または、炎症を低減させることが好ましいが、これは、肺の有効性に正の効果を有する。

【発明の概要】

【0015】

他の目的の中でも本発明の目的は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および気管支拡張症などの慢性閉塞性気道疾患、とりわけ慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息の治療のための化合物を提供することである。このような化合物を提供する際に、化合物は、好ましくは、慢性閉塞性気道疾患の治療のための薬剤の１以上の作用様式を満たす。即ち、化合物は、気管支拡張効果および抗炎症効果を有する。好ましくは、化合物は長期にわたる治療において活性を維持する（即ち、化合物はほとんど脱感作を示さない）。

【0016】

他の目的の中でも上記の目的は、添付の特許請求の範囲にて示すように、本発明によって達成される。

【0017】

上記の目的は、慢性閉塞性気道疾患の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは塩基によって達成される。

【0018】

【化1】

【0019】

（式中、
−Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよく、Ｃ１〜Ｃ４直鎖または分枝鎖アルキル基を表す。
−Ｒ３は、生体組織中で除去され得るプロドラッグ部分または水素を表し、好ましくは、Ｒ３は、６−酸素と一緒になってエステル基を形成する。Ｒ３は１〜１２個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有していてもよく、１個以上のアミンまたは酸素原子を含んでいてもよい。
−ｎは０または１であってもよく、好ましくは１である。
−Ｒ４は、１〜２０個の炭素原子と少なくとも１個の窒素原子を含む基であり、Ｒ４はさらなる窒素原子、１個以上の酸素原子、ハロゲン、硫黄または燐原子をさらに含んでいてもよく、そして、Ｒ４は芳香族基を含んでいてもよい。Ｒ４の分子量は３００Ｄａ未満であることが好ましい。）
上記化合物は吸入に適した製剤中に存在する。

【0020】

式（Ｉ）の化合物は、ビタミンＥの水溶性類似体であるトロロックス（ｔｒｏｌｏｘ）に由来する。トロロックスにおいて、Ｒ１およびＲ２はメチルであり、Ｒ３は水素であり、Ｒ４はカルボン酸である。

【0021】

具体的には、他の目的の中でも上記目的は、慢性閉塞性気道疾患、好ましくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息または気管支拡張症、より好ましくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療に使用するための式（ＩＩ）の化合物（（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノン）またはその薬学的に許容される塩もしくは塩基によって達成される。

【0022】

【化2】

【0023】

本発明のさらなる態様によれば、他の目的の中でも上記の目的は、慢性閉塞性気道疾患、好ましくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息または気管支拡張症、より好ましくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療に使用するための式（ＩＩＩ）の化合物（Ｎ，６−ジヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド）、またはその薬学的に許容される塩もしくは塩基によって達成される。

【0024】

【化3】

【0025】

本発明の更なる態様によれば、他の目的の中でも上記の目的は、慢性閉塞性気道疾患、好ましくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息または気管支拡張症、より好ましくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療に使用するための２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−オール；（Ｓ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；（Ｒ）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；Ｎ−ブチル−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；６−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；（Ｅ）−Ｎ−（３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−イル）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（モルホリノ）メタノン；Ｎ−（４−フルオロベンジル）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；６−ヒドロキシ−Ｎ−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−フェニルエチル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−Ｎ−（２−（メチルアミノ）エチル）クロマン−２−カルボキサミド；６−ヒドロキシ−Ｎ，２，５，７，８−ペンタメチル−Ｎ−（２−（メチルアミノ）エチル）クロマン−２−カルボキサミド；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−Ｎ−（３−（ピペリジン−１−イル）プロピル）クロマン−２−カルボキサミド；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−Ｎ−（３−ニトロフェニル）クロマン−２−カルボキサミド；Ｎ−（４−フルオロフェニル）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；メチル４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド）ベンゾエート；（４−ブチルピペラジン−１−イル）（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）メタノン；（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル）メタノン；（（２Ｓ、５Ｒ）−４−アリル−２，５−ジメチルピペラジン−１−イル）（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）メタノン；Ｎ−（（Ｒ）−２−アミノ−２−オキソ−１−フェニルエチル）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル）メタノン；Ｎ−（２−ブロモエチル）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；Ｎ’−（２−シアノエチル）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボヒドラジド；２−（（（４−フルオロベンジル）アミノ）メチル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；２−（（ブチルアミノ）メチル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボン酸；２−（ヒドロキシメチル）−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−６−オール；６−ヒドロキシ−Ｎ−（（Ｒ）−１−ヒドロキシプロパン−２−イル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（４−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）メタノン；Ｎ−（２−シアノエチル）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−（（２−ヒドロキシエチル）（メチル）アミノ）エチル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；（Ｒ）−Ｎ，６−ジヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；（Ｓ）−Ｎ、６−ジヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミド；２−（（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル）メチル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；２−（（（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−フェニルエチル）アミノ）メチル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；２，５，７，８−テトラメチル−２−（ピペリジン−１−イルメチル）クロマン−６−オール；Ｎ、６−ジヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボキサミド；（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル）メタノン；（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−イル）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル）メタノン；２−（（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル）メチル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；２−（（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル）メチル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；２−（４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）酢酸；（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノン；（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル）メタノン；２−（４−（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）酢酸；エチル２−（４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）アセテート；（Ｓ）−２−（４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）酢酸；（Ｒ）−２−（４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）酢酸；（２Ｓ）−１−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸；（２Ｓ）−１−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸；（２Ｓ）−１−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸およびその薬学的に許容される塩もしくは塩基からなる群（「グループＡ」）から選択される化合物によって達成される

【0026】

驚くべきことに、本発明者らは、本発明の式（Ｉ）の化合物、最も好ましくは（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノンまたはＮ，６−ジヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミドが、閉塞性気道疾患、特に慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および喘息の治療に適した気管支拡張効果および抗炎症効果を有することを見出した。

【0027】

本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の慢性閉塞性気道疾患の治療は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）またはグループＡの化合物等の本化合物の吸入投与を含む。本明細書で使用される吸入は、本化合物が口または鼻を介して吸入されて肺に到達する投与経路を指す。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】ＳＵＬ−化合物が細胞生存率を変化させないことを示す。１５％ＣＳＥの存在下または非存在下で、ｈＴＥＲＴ細胞を、指示濃度のＳＵＬ９０、ＳＵＬ１２１、ＳＵＬ１２７およびＳＵＬ１３６と共に２４時間インキュベートし、インキュベートした。Ｈ２ＳドナーＮａＳＨ（５００μＭ）を対照群として用いた。データは、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝４−５）。一元配置ＡＮＯＶＡに続くベンフェロニポストホック検定における対照に対する^＊ｐ＜０．０５。

【図2】Ｓｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１が、ＣＳＥによって誘発された、ｈＴＥＲＴ細胞からのＩＬ−８放出を阻害することを示す。１５％ＣＳＥの存在下または非存在下で、ｈＴＥＲＴ細胞を、指示濃度のＳｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１と共に２４時間インキュベートした。β２−作動薬フェノテロール（Ｆｅｎｏ、１μＭ）およびＨ_２ＳドナーＮａＳＨ（５００μＭ）を対照群として用いた。データは、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝４−５）。一元配置ＡＮＯＶＡに続くベンフェロニポストホック検定における対照に対する^＊ｐ＜０．０５。

【図3】Ｓｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１が、メタコリン前収縮（メタコリンで予め収縮させた）ＢＴＳＭ片の弛緩を誘発することを示す。上のパネルは、等尺性張力測定のプロトコルを示す。ＢＴＳＭ片を１×１０^−３．５μＭのメタコリンで予め収縮させた後に、指示濃度のＳｕｌ−化合物を添加した。ＤＭＳＯ（０．５％）を対照群として用いた。グラフは、６回の実験の平均±ＳＥＭを表す。二元配置ＡＮＯＶＡにおける対照に対する^＊ｐ＜０．０５。

【図4】β２−アドレナリン受容体アンタゴニストであるプロプラノロールは、Ｓｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１によって誘発されたＢＴＳＭ片の弛緩を変化させないことを示す。ＢＴＳＭ片を１×１０^−３．５μＭのメタコリンで予め収縮させた後に、１μＭのプロプラノロールの存在下および非存在下でＳｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１（各３０μＭ）を添加した。グラフは、３回の実験の平均±ＳＥＭを表す。二元配置ＡＮＯＶＡにおける対照に対する^＊ｐ＜０．０５。

【図5】Ｓｕｌ−１２１は、Ｓｕｌ−９０と違って、イソプレナリンの用量反応曲線を右にシフトさせることを示す。ＢＴＳＭ片を１×１０^−３．５μＭのメタコリンで予め収縮させた後に、Ｓｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１（各３０μＭ）を添加して、イソプレナリンの用量応答曲線を得た。ＤＭＳＯ（０．０３％）を対照として用いた。グラフは、３回の実験の平均±ＳＥＭを表す。二元配置ＡＮＯＶＡにおける対照に対する^＊ｐ＜０．０５。

【図6】Ｓｕｌ−１２１およびＳｕｌ−９０が、メタコリンによって誘発される収縮を減少させることを示す。ＢＴＳＭ片を、Ｓｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１（各３０μＭ）と共に予めインキュベートした後に、メタコリンの用量反応曲線を得た。ＤＭＳＯ（０．０３％）を対照として用いた。グラフは、３回の実験の平均±ＳＥＭを表す。二元配置ＡＮＯＶＡにおける対照に対する^＊ｐ＜０．０５

【図7】モルモットにおける実験を実施例３の記載通り実施したことを示す。図７は、ＬＰＳ投与後の気道過敏症に対するＳｕｌ−１２１の効果を示す。

【図8】ＬＰＳ投与後のモルモットモデルにおける炎症細胞に対するＳｕｌ−１２１の効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

下記式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、以下の特徴を有する。

【0030】

【化4】

【0031】

Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよく、Ｃ１〜Ｃ４直鎖または分枝鎖アルキル基を表す。好ましくは、Ｒ１およびＲ２はメチル、エチルまたはイソプロピルであり、最も好ましくはＲ１およびＲ３は同じであり、メチルまたはイソプロピルである。他の適切な基として、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチルがある。
Ｒ３は、生体組織中で除去され得るプロドラッグ部分または水素を表す。好ましくは、Ｒ３は、６−酸素と一緒になってエステル基を形成する。Ｒ３は１〜１２個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有していてもよく、１以上のアミンまたは酸素原子を含んでいてもよい。６−酸素と一緒になる適切な基は、エチル−エステル、ブチル−エステル、ベンゾイル−エステル、または１以上のアミノ酸のエステル（ここで、アミノ基は炭素数１〜４のアルキルカルボン酸でアミド化されている）を含む。好ましい１つの実施形態では、Ｒ３は水素である。
ｎは０または１であってもよく、好ましくは１である。
Ｒ４は１〜２０個の炭素原子と少なくとも１個の窒素原子を含む基である。Ｒ４はさらなる窒素原子、１個以上の酸素原子、ハロゲン、硫黄または燐原子を含んでいてもよく、そして、Ｒ４は芳香族基を含んでいてもよい。
Ｒ４の分子量は、好ましくは３００Ｄａ未満である。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、５００Ｄａ未満の分子量を有する。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、芳香族複素環を含まない。
好ましくは、Ｒ４はカルボニル基を含み、最も好ましくは、トロロックス部分に結合したカルボニル基を含む。
１つの好ましい実施形態では、Ｒ４は−ＣＯ−Ｎ−Ｒ５であり、ここでＣ＝Ｏはトロロックス（ｔｒｏｌｏｘ）部分に結合し、Ｒ５は窒素または酸素で置換されていてもよいアルキル基であり、アルキル基は、１〜１２個の炭素原子を含み、窒素はアミン、第四級アミン、グアニジンまたはイミンであってもよく、酸素はヒドロキシル、カルボニルまたはカルボン酸であってもよい。酸素および窒素は、一緒になって、アミド、尿素またはカルバメート基を形成し得る。
Ｒ５におけるアルキル基は、直鎖状、分岐状または環状であってもよく、好ましくは少なくとも１つの環状構造を含む。

【0032】

式（Ｉ）によって表される化合物は、既知の化学合成に従って製造することができる。
例えば、グアニジン基を有する化合物、またはアルキル基を介してトロロックス部分に結合したピペラジン基は、欧州公報第２０２５８０号に記載されている。６−酸素が保護され、合成後に遊離されるか、またはプロドラッグ部分で保護される、同様の合成方法を使用することができる。
例えば、置換基としてニコチネート基を有する化合物は、米国特許第４６１８９０号に記載されている。トロロックス部分の６−酸素に結合したニコチネートは、プロドラッグ部分として作用することができ、インビボで加水分解されて遊離ヒドロキシル基となる。
例えば、適切な化合物は、国際公開ＷＯ８８／０８４２４、実施例１８−２３および７８−１６４に記載されている。
例えば、適切な化合物は、ベンゾイル基が除去されるか、またはプロドラッグ部分として作用し得る、国際公開ＷＯ９７／４１１２１の製剤１，６，７，１２〜１５，２１，２４および２７に記載されている。
更なる化合物が、例えば、国際公開ＷＯ０３／０２４９４３（化合物９−１１，２５−２８，１０９−１１２，１１９−１２２など）に記載されている。
例えば、第四級アンモニウム基を有する化合物は、実施例に合成の説明を含めて、国際公開ＷＯ２０１４／０１１０４７に記載されている。

【0033】

本発明の化合物は、予想外に、ＣＯＰＤまたは喘息などの慢性閉塞性気道疾患に対して活性である。

【0034】

本発明の化合物は、好ましくはトロロックスと同程度またはそれ以下のトロロックス酸化当量を有するが、細胞損傷を防止するそれらの活性は実質的に改善されている。

【0035】

本化合物が肺を標的とすることを考慮すると、吸入は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息または気管支拡張症のような慢性閉塞性気道疾患、特に慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の現在の治療に使用される最も好ましい投与経路である。吸入された化合物は迅速に吸収され、局所的および全身的に作用することができる。正しい用量を得るためには、吸入装置を用いた適切な技術が必要となるので、別の態様によれば、本発明は、本化合物、または吸入に適した製剤の中に活性成分もしくはその薬学的に許容される塩もしくは塩基を含むネブライザーのような吸入器としての薬物送達装置に関する。

【0036】

吸入器または呼吸器は、肺を介して薬物を身体に送達するために使用される医療装置である。吸入器は、一般に、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療に使用されている。口腔および咽喉の沈着を低減し、吸入開始を装置の作動に正確に同期させる必要性を低減するために、ＭＤＩは相補的なスペーサまたは保持チャンバ装置とともに使用されることがある。吸入器のタイプとして、定量吸入器、乾燥粉末吸入器および噴霧器がある。

【0037】

最も一般的なタイプの吸入器は、加圧式定量吸入器（ＭＤＩ）である。ＭＤＩにおいて、薬物は、推進薬を含む加圧キャニスター内に溶液として保存されている（懸濁液として保存されている場合もある）のが最も一般的である。ＭＤＩキャニスターは、プラスチックの手動操作式アクチュエータに取り付けられている。活性化されると、定量吸入器は、エアロゾル形態の一定量の投薬を放出する。エアロゾル化された薬物は、肺の気管支および他の気道の壁にエアロゾルが付着するように、深く吸入し続けた後に息を約１０秒間止めることで肺に吸い込まれる。

【0038】

乾燥粉末吸入器またはＤＰＩは、ＤＰＩ装置を介して吸入される粉剤（薬物）の定量または装置測定量（装置によって測定された容量）を放出する。ネブライザーは、水性製剤から生成されたエアロゾルとして薬剤を供給する。

【0039】

本発明の化合物は、吸入に適した形態に製剤化される。好ましい実施形態によれば、薬物の空気力学的直径範囲は、０．５〜８μｍ、より好ましくは１〜５μｍである。この範囲において、薬剤は粒子の動的挙動に関係し、エアロゾルデポジションの主なメカニズムを示すので、最も効率的に吸収される。重力沈降と慣性衝突の両方は空気力学的直径に依存する。製剤は、必ずではないが、賦形剤をさらに含んでいてもよい。適切な賦形剤には、ラクトース、グルコースおよびマンニトールが挙げられ、その中ではラクトースが好ましい。

【0040】

吸入用の薬剤の調製は、例えば、文献［Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃａｒｅ（２００５）５０：１２０９−１２２７］に記載されているように、公知である。ＭＤＩの場合、噴射剤を有し、界面活性剤を有していてもよい。

【0041】

吸入器を作動させるたびに投与される本発明に係る化合物の量は、約１ｍｍｏｌ以下、好ましくは約０．３ｍｍｏｌ以下である。この化合物の分子量は、概して４００ｇ／ｍｏｌ未満であり、これは、作動させるたびに投与される量が約２００ｍｇ以下、好ましくは約１００ｍｇ以下であることを意味する。一般に、本発明の化合物の量は、１μｍｏｌ以上、好ましくは約１０μｍｏｌ以上である。一般に、化合物の量は約１００μｇ以上であろう。

【0042】

本発明の化合物は、上記のような喘息またはＣＯＰＤの他の既知の療法と組み合わせる（併用する）ことができる。特に、本発明の化合物は、コルチコステロイドおよび／または長時間作用型または短時間作用型のβ−作動薬および／またはロイコトリエンと併用することができる。この併用療法は、同じ吸入器または複数の吸入器で行うことができる。

【0043】

以下の実施例を用いて本発明をさらに説明する。実施例では、図面を参照する。

【0044】

実施例１
化合物の合成
本発明の化合物は、当業者に周知の標準的な合成方法に従って合成することができる。ＳＵＬ−００８３、ＳＵＬ−００８４およびＳＵＬ−００８５は市販されている。以下の表１（本発明の一部の化合物）は、本明細書で使用される本化合物の互換的な任意の標識（コード）として本化合物の概要を提供する。

【0045】

【表1】

【0046】

ＳＵＬ０８９−１１２、１１４−１１７、１２０−１２６、１２８−１３０、１３２、１３４−１３５、１３８および１４０の合成
アミド形成のための標準的なカップリング試薬、例えばＨＡＴＵおよびＣＤＩの存在下での適切なアミンとの反応によって、トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）のアミド化を行った。形成されたアミドをＢＨ_３で還元して、対応するアミンを調剤した。ヒドロキサム酸誘導体は、ヒドロキシルアミン／ＣＤＩとの反応によって調製した。トロロックスのカルボヒドラジド類似体の合成は、（置換）ヒドラジンとの反応によって行われた。エナンチオマー／ジアステレオマー化合物は、エナンチオマー的に純粋な（Ｒ）−または（Ｓ）−トロロックスから出発して調剤するか、またはキラルクロマトグラフィーによって調製した。

【0047】

【化5】

【0048】

ＳＵＬ−１１８、ＳＵＬ−１１９およびＳＵＬ−１４６の合成
サルコミン（ｓａｌｃｏｍｉｎｅ）、サレン（ｓａｌｅｎ）配位子とコバルトとの配位錯体を用いて市販のプロポフォール（ｐｒｏｐｏｆｏｌ）を酸化した後に、ＮａＢＨ_４で還元することで２，６−ジイソプロピルベンゼン−１，４−ジオールを得た。その後、ＨＣＯ／ＳｎＣｌ_２／ＨＣｌを用いたメチル化およびメタクリル酸メチルとの反応により、ＳＵＬ−１４６（メチル６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボキシレート）を得た。ＬｉＯＨで加水分解して、カルボン酸ＳＵＬ−１１８（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボン酸）を得た。アルコールＳＵＬ−１１９（２−（ヒドロキシメチル）−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−６−オール）は、ＳＵＬ−１４６をＬｉＡｌＨ_４で還元することで得た。

【0049】

【化6】

【0050】

ＳＵＬ−１３１、ＳＵＬ−１３３、ＳＵＬ１３７およびＳＵＬ−１４６の合成
カルボン酸ＳＵＬ−１１８（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボン酸）から出発し、カップリング試薬としてＣＤＩを用いてヒドロキシルアミンと反応させて、そのヒドロキシルアミンを得た。化合物ＳＵＬ１３３（（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−イル）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル）メタノン）およびＳＵＬ１３７（（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノン）を、ＳＵＬ−１１８と適切なピペラジン誘導体との反応により調製した。カップリング試薬ＨＡＴＵおよびＣＤＩの両方は満足のいく収率をもたらした。ＳＵＬ１３９（２−（４−（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）酢酸は、グリオキサル酸を用いたＳＵＬ１３７（（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノン）の還元的アミド化によって調製した。

【0051】

【化7】

【0052】

ＳＵＬ−１３６、ＳＵＬ−１４１およびＳＵＬ−１４２の合成
Ｎ_２雰囲気下でのＳＵＬ−１４０（エチル２−（４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）酢酸の加水分解により、ＳＵＬ−１３６（２−（４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）酢酸）を高収率で得た。エナンチオマー、ＳＵＬ−１４１およびＳＵＬ−１４２は、上記の条件に従って調製した。

【0053】

【化8】

【0054】

ＳＵＬ１４３，１４４および１４５の合成
カラムクロマトグラフィー後に、（Ｓ）−メチルピロリジン−２−カルボキシラート（Ｌ−プロリンメチルエステル）でトロロックスをアミド化し、カラムクロマトグラフィーの後に２つのジアステレオ異性体を得た。続いて個々のジアステレオ異性体を加水分解して、ＳＵＬ−１４４（（２Ｓ）−１−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸、ジアステレオマー１）およびＳＵＬ−１４５（（２Ｓ）−１−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸、ジアステレオマー２）を得た。ラセミ類似体、ＳＵＬ−１４３（（２Ｓ）−１−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸）は、個々のジアステレオ異性体のエステルを混合した後に、ＬｉＯＨを用いてエステル部分を加水分解することにより得られた。

【0055】

【化9】

【0056】

トロロックスのアミド化（一般的な例）
ＳＵＬ−１０８（（４−ブチルピペラジン−１−イル）（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）メタノン）ＨＣｌ
トロロックス（１１ｇ、０．０４４ｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（１００−１５０ｍｌ）に懸濁させた。ＣＤＩ（８．６ｇ、０．０５３ｍｏｌ、１．２当量）を少しずつ加えた。反応混合物を室温で０．５〜１時間攪拌した。１−ブチルピペラジン（６．９ｇ、０．０４８ｍｏｌ、１．１当量）を添加した後に、反応混合物を２５−３０℃で週末にかけて撹拌した。反応混合物を濃縮し、Ｈ_２Ｏ（２００ｍｌ）を加え、水層をＥｔＯＡｃで抽出した（４×）。合わせた有機層を乾燥させ、濾過し、濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／１０％ＭｅＯＨ）により精製して、目的とした化合物（９ｇの生成物、純度８２％）を得た。ＥｔＯＡｃ／ヘプタンから結晶化して、ＳＵＬ−１０８（６ｇ、０．０１６ｍｏｌ、収率３６％、純度９０％）を白色固体として得た。得られた物質をＤＣＭ（５０−１００ｍｌ）に溶解した。ＨＣｌ（ジオキサン中４Ｍ、８．８ｍｌ、０．００３５ｍｏｌ、２．２当量）を加え、反応混合物を室温で週末にかけて撹拌した。混合物を濾過し、ＤＣＭですすぎ、乾燥させて、ＳＵＬ−１０８のＨＣｌ塩（６．３ｇ、純度９７−９８％）を白色固体として得た。
¹H-NMR (CDCl₃, ppm): 0.93 (t, 3H), 1.38 (m, 2H), 1.58 (s, 3H), 1.67 (m, 2H), 2.09 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 2.50-3.20 (m, 14H). M⁺ = 375.3

【0057】

トロロックスアミドの還元（一般例）
ＳＵＬ−１２８（２−（（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル）メチル）−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール）ＨＣｌ
ＴＨＦ中のＢＨ_３．ＴＨＦ（１６ｍｌ、０．０１５６ｍｏｌ、２当量）をＴ＝０℃に冷却した。ＴＨＦ（５０ｍｌ）中ＳＵＬ−１１２（（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル）メタノン；２．６ｇ、０．００７８ｍｏｌ、１当量）の溶液を滴下し、反応混合物を１時間還流し、室温に一晩冷却した。反応混合物を氷浴上で冷却し、ＨＣｌ（６Ｍ、２５ｍｌ）を滴下した。ＤＣＭ（１００ｍｌ）を加え、層を分離した。水層をＤＣＭで抽出した（３×）。合わせた有機層を、ガス形成がもはや確認されなくなるまで、Ｋ_２ＣＯ_３上で乾燥させた。有機相を濾過し、濃縮した。粗生成物を氷浴上で冷却し、ＮａＯＨ（６Ｍ、５０ｍｌ）を滴下した。添加後、反応混合物を１時間撹拌し、ＤＣＭで抽出した（４×）。合わせたＤＣＭ層を乾燥させ、濾過し、濃縮して１．６ｇの粗生成物（２０−４０％純度）を得た。該物質をカラムクロマトグラフィーで精製して、ＳＵＬ−１２８（３００ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ、収率１２％、純度９０％）を得た。これをＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶解し、Ｔ＝０℃（氷浴）に冷却した。ＨＣｌ（ジオキサン中４Ｍ、０．３ｍｌ、０．９４ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。形成された固体を濾過し、Ｅｔ_２Ｏで洗浄し、乾燥させて、ＳＵＬ−１２８のＨＣｌ塩（３００ｍｇ、純度９０％）を白色固体（ジアステレオマーの混合物）として得た。
¹H-NMR (CDCl₃, ppm): 1.20-1.90 (m, 7H), 2.12 (s, 6H), 2.17 (s, 3H), 2.20-2.90 (m, 9H), 3.4-3.65 (m, 2H). M⁺ = 320.1

【0058】

ＳＵＬ−１１８（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボン酸）の合成
２，６−ジイソプロピルシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオンの合成
プロポフォール（１００ｇ、５６１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５０ｍＬ）に溶解した。溶液を攪拌しながら０℃に冷却した。サルコミン（１６．６ｇ、５１ｍｍｏｌ；９ｍｏｌ％）を加え、得られた反応混合物を室温に加温しながら１１２時間連続して撹拌した。反応混合物を水（７Ｌ）の中に注いだ。得られたスラリーをヘプタン（５×１Ｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。この溶液を真空下で濃縮して粗２，６−ジイソプロピルシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（６２．５ｇ、３２５ｍｍｏｌ、５８％収率）を油状物として得た。生成物をさらに精製することなく次の工程で使用した。

【0059】

２，６−ジイソプロピルベンゼン−１，４−ジオールの合成
粗２，６−ジイソプロピルシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（６２．５ｇ、３２５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）およびメタノール（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を氷浴で０℃に冷却した。水素化ホウ素ナトリウム（４．５ｇ、１８２ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。その添加が完了した後に、反応混合物を室温で一晩撹拌した。アセトン（１５０ｍＬ）を加えて過剰量の水素化ホウ素ナトリウムを急冷した。３０分間撹拌した後に、２ＮのＨＣｌ水溶液（２００ｍＬ）を添加した。４５分間攪拌した後に、混合物を酢酸エチルで抽出した（４×４００ｍＬ）。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶液を真空下で濃縮して、定量的収率の粗２，６−ジイソプロピルベンゼン−１，４−ジオール（６４ｇ、３３０ｍｍｏｌ）を赤色油状物として得た。生成物をさらに精製することなく次の工程で使用した。

【0060】

３，５−ジイソプロピル−２−メチルベンゼン−１，４−ジオールの合成
２，６−ジイソプロピルベンゼン−１，４−ジオール（６４ｇ、０．３３ｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（９．８ｇ、０．３２７ｍｏｌ）、ＳｎＣｌ_２（２１７．９ｇ、１．１５ｍｏｌ）、３７％のＨＣｌ濃縮水溶液（０．６Ｌ）およびジイソプロピルエーテル（２．５Ｌ）の混合物を４時間加熱還流した。一晩室温に冷却した後に、二相混合物を分離した。水層をＴＢＭＥ（２０００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機画分を１ＮのＨＣｌ水溶液（１０００ｍＬ）、水（１０００ｍＬ）および塩水（１０００ｍＬ）で洗浄した。有機画分をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、真空下で濃縮して、３，５−ジイソプロピル−２−メチルベンゼン−１，４−ジオールと、２，６−ジイソプロピル−３，５−ジメチルベンゼン−１，４‐ジオールとの５０：３５混合物（６１ｇの油状物）を得た（ＧＣＭＳ分析に基づく）。酢酸エチル／ヘプタン＝９７．５：２．５（４０００ｍＬ）、９５：５（４０００ｍＬ）で溶離するシリカゲル（１２００ｍＬ）のクロマトグラフィーにより精製して、３，５−ジイソプロピル−２−メチルベンゼン−１，４−ジオール６（１６．６ｇ、７９．８ｍｍｏｌ、２４％、純度８３％）を油状物として得た。

【0061】

メチル６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボキシレートの合成
メチルメタクリレート（２０ｍＬ、１８６ｍｍｏｌ）に３，５−ジイソプロピル−２−メチルベンゼン−１，４−ジオール（１０．６ｇ、５０．９ｍｍｏｌ、純度８３％）を溶解した。その溶液をＢｅｒｇｈｏｆ反応器内のテフロン（登録商標）管に移した。ホルムアルデヒド水溶液（１０ｍＬ；１０−１５％のＭｅＯＨで安定化した３７重量％の溶液）を添加し、密閉反応器中で反応混合物を攪拌しながら１８０℃（内部温度）に５時間加熱した。約４０℃まで冷却した後に、反応混合物をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）に注ぎ、混合物を真空下で濃縮した。酢酸エチル／ヘプタン＝９５：５（５０００ｍＬ；ＴＬＣ：Ｒ〜０．２；ヨウ素蒸気でスポット染色）で溶離するシリカゲル（６００ｍＬ）のクロマトグラフィーにより精製して、所望の純粋な生成物、６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボキシラート（１０．０ｇ、３１．３ｍｍｏｌ、６１％）を得た。

【0062】

６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボン酸（ＳＵＬ−１１８）の合成
ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）、ＴＨＦ（１００ｍＬ）および水（２５ｍＬ）中精製メチル６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボキシラート（８．３ｇ、２５．９ｍｍｏｌ）および水酸化リチウム一水和物（４．３ｇ、１０２．５ｍｍｏｌ、４当量）の混合物を、６０℃の温水浴中で、回転蒸発器で回転させながら、周囲圧力で３０分間加熱した。有機溶媒を真空下で蒸発させた。水（１５０ｍＬ）を残渣に加えた後に、酢酸（１０ｍＬ）を加えた。淡い橙色の混合物が得られた。酢酸エチルで抽出し（３×１００ｍＬ）、合わせた有機画分をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮して、粗生成物を橙色の固体として得た。固体をｔＢＭＥ（１５０ｍＬ）と共に撹拌した。ベージュ色の固体が沈殿し、橙色の溶液が得られた。ヘプタン（２５０ｍＬ）を加え、混合物を１５分間撹拌した。混合物をガラスフィルターで濾過した。残留固体をフィルター上で、ヘプタン（２×５０ｍＬ）で吸引洗浄した。６０℃、真空下で固体を乾燥して、純粋な６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボン酸（ＳＵＬ−１１８）を灰白色の固体として得た（３．１ｇ、１０．１３ｍｍｏｌ；３９％、１００％純度）。
¹H-NMR (CDCl₃, ppm): 1.38 (t, 12 H), 1.52 (s, 3H), 1.87 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (m, 1H), 3.20 (m, 1H), 3.38 (m, 1H). M+ = 307.10

【0063】

ＳＵＬ１１９（２−（ヒドロキシメチル）−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−６−オール）の合成
ＴＨＦ（１２ｍＬ）中メチル６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボキシラート（５００ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）の溶液を、ゴム隔膜を介してシリンジで５分間かけてＬｉＡｌＨ_４（２３８ｍｇ、６．２６ｍｍｏｌ、４当量）に加え、室温で撹拌しながら、不活性窒素雰囲気下で、乾燥した３つ口丸底フラスコの中で予め秤量した。エステルの発熱的添加はガス発生を伴った。添加が完了した後に、得られた灰色の懸濁液を加熱還流した。３時間後に、加熱を停止し、ＥｔＯＡｃ（６ｍＬ；発熱性）を滴下して反応を急冷させた。水（５ｍＬ）を少量ずつ加え、続いて２ＮのＨＣｌ（２ｍＬ）を、続いてＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）を加えた。混合物をＮａ_２ＳＯ_４（約５０ｇ）に注ぎ、やや黄色の有機層を二相混合物から分離した。水相をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で洗浄し、合わせた有機画分を減圧下で濃縮して、粗アルコール（５３０ｍｇ）を透明油状物として得た。ヘプタン（１００ｍＬ）を加え、真空下で濃縮した後に、２−（ヒドロキシメチル）−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−６−オール（２４８ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、５４％、ＬＣＭＳ：９５．５％純度）を得た。
M+ = 293.2

【0064】

ＳＵＬ１３９（２−（４−（６−ヒドロキシ−５，７−ジイソプロピル−２，８−ジメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）酢酸の合成
ＳＵＬ−１３７（４４０ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、１当量）をＭｅＯＨ（５０ｍｌ）に溶解し、グリオキサル酸（２１６ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、続いてＮａＢＨ_３ＣＮ（１８３ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。酢酸（数ｍｌ）を加え、室温で０．５〜１時間撹拌した後に、反応混合物を濃縮した。得られた残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、Ｈ_２Ｏで洗浄し（２×）、乾燥し、濾過し、濃縮して、ＳＵＬ−１３９（５００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ、９８％、９１−９２％純度）を淡黄色固体として得た。
¹H-NMR (CD₃OD, ppm): 1.33 (dd, 12H), 1.59 (s, 3H), 1.62 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 2-5-3.0 (m, 7H), 3.1-3.6 (m, 4H), 3.81 (bs, 2H), 4.28 (bs, 2H). M⁺ = 433.2.

【0065】

ＳＵＬ１３６（２−（４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル）酢酸）
２つの隔膜（左および右）および栓を備えた２５０ｍｌの三ツ口フラスコに、ＳＵＬ−１３６（１５．５ｇ、３８．４ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ／水（２４０ｍｌのＴＨＦ＋８０ｍｌの水）を入れた。透明な溶液を、左隔膜を介して長いシリンジ針を設けた入口チューブ（短い針を設けた右隔膜は出口として機能した）を用いたアルゴンバブリング（ａｒｇｏｎ−ｂｕｂｂｌｉｎｇ）により少なくとも３０分間撹拌、脱気した。（アルゴン下で維持した）脱気した溶液を氷浴中で０℃に冷却し、固体無水ＬｉＯＨ（２．３ｇ、９６ｍｍｏｌ、２．５当量）を一度に加えた。得られた反応混合物を０℃で２時間撹拌した後に、Ｄｏｗｅｘ−５０ＷＸ８−２００イオン交換樹脂のＭｅＯＨ／水（３／１、ｖ／ｖ）スラリーを加えることで中和した。最終ｐＨは約６であった。Ｄｏｗｅｘ樹脂を吸引濾過し、ＭｅＯＨ／水（３／１、ｖ／ｖ）で３回すすいだ。濾液を減圧下で除去し、ぬれた生成物に約１００ｍｌの水を加えた。得られた白色の水性懸濁液を一晩凍結乾燥して、ＳＵＬ−１３６（１３．４８ｇ、９３％、ＬＣＭＳ：９９．６％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CD3OD, ppm)): 1.60 (s, 3H), 1.65 (m, 1H), 2.05 (s, 3H), 2.10 (s, 6H), 2.55 (m, 2H), 2.62 (m, 1H), 3.0, (bs, 4H), 3.40 (bs, 2H), 3.65 (bs, 2H), 4.25 (bs, 2H). M+ = 377.1

【0066】

ＳＵＬ１４４（（２Ｓ）−１−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸）の合成
（２Ｓ）−メチル１−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボキシレート（ジアステレオマー１、３．５ｇ、９．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ（６０／２０ｍＬ）に溶解した。溶液にＮ_２を１時間吹き込んだ。混合物を氷浴で冷却し、ＬｉＯＨ．Ｈ_２Ｏ（１．０１ｇ、２４．２ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加した。反応混合物を室温、Ｎ_２下で一晩撹拌した。ｐＨ＝６になるまでＤｏｗｅｘ−５０ＷＸ８−２００（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（３：１）で４回洗浄したもの）をＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（３：１）中のスラリーとして加えた。混合物を濾過し、ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（３：１）で洗浄し、真空下で濃縮した。この濃縮物に半分のＨ_２Ｏ（５０ｍＬ）を加え、溶液を凍結乾燥して、ＳＵＬ−１４４（３．４ｇ、９．７ｍｍｏｌ、定量分析、９９．７％純度）を灰白色の泡状物として得た。
1H-NMR (CDCl3): 1.60 (s, 3H), 1.65-2.30 (m, 14H), 2.60 (m, 2H), 2.81 (m, 1H), 3.49 (m, 1H), 4.01 (t, 1H), 4.50 (d, 1H). M+ = 348.1

【0067】

実施例２
導入
Ｈ_２Ｓは、いくつかの異なるシグナル伝達機構の相互作用によって生物学的機能を変化させる。ＣＴＨノックアウトマウスを用いて、喘息マウスの炎症および気道過敏性（ＡＨＲ）におけるＨ_２Ｓの役割を研究した。ＣＴＨ欠損マウスの肺では、野生型マウスと比較して、内因性Ｈ_２Ｓ産生およびＣＴＨの発現が減少したことが報告された。急性喘息を誘発するオボアルブミンの投与は、野生型マウスにおけるＣＴＨ発現およびＨ_２Ｓ産生を減少させた。ＣＴＨの枯渇は、オボアルブミン投与後の気管支肺胞液中のＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびエオタキシン−１レベルの上昇、ＡＨＲの増加、並びに気道炎症をもたらすが、それらは、Ｈ_２ＳドナーであるＮａＨＳで処置することで逆転される。これらは、ＣＴＨ／Ｈ_２Ｓシステムが喘息の発症において重要な保護的役割を果たすことは明確に示す。

【0068】

興味深いことに、重度の喘息患者の喀痰とＨ_２Ｓ濃度との間に強い関係がある。喀痰中Ｈ_２Ｓのレベルは、喘息、好中球性炎症、慢性気流閉塞などの閉塞性肺疾患のための有望な新規バイオマーカーであり、β−アドレナリン性気管支拡張薬応答性をも反映する。β−作動薬であるフェノテロールとＨ_２Ｓ測定を併用することで、閉塞性肺疾患の表現型についてより包括的な説明ができるという提案がされている。

【0069】

低酸素誘発肺血管構造変化のラットモデルにおいて、Ｈ_２ＳドナーであるＮａＨＳは、リモデリングパラメータコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩおよび形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）の発現を低下させ、肺動脈平滑筋細胞の増殖を阻害した。現在の研究はまだヒトの喘息とは直接関係しないが、気道平滑筋量の増加により喘息の重篤度が悪化することは十分に立証されており、ＴＧＦ−βが気道平滑筋量の増加をさらに促進すると推測されている。Ｈ_２ＳによるＴＧＦ−βレベルの減少は、気道リモデリングの根底にあるプロセスを効果的に防ぐことができる。

【0070】

火傷と煙の吸入による急性肺傷害のマウスモデルは、Ｈ_２ＳドナーＮａＨＳの治療後の投与が死亡率を減少させ、マウスの平均生存期間を増加させることを示した。また、Ｈ_２ＳはＩＬ−１βのレベルを阻害したが、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のレベルを高めた。一般に、炎症性転写因子ＮＦ−ｋＢの阻害に関与する可能性が最も高いマクロファージおよび好中球のレベルを低下させるだけでなく、接着分子の発現を抑制することによって、ＩＬ−１０が保護的な生物学的機能を発揮すると仮定した。さらに、ＩＬ−１βが気道粘膜組織に対して炎症促進効果を発揮することが証明されている。したがって、Ｈ_２Ｓは、炎症誘発性ＩＬ−１βおよび抗炎症性ＩＬ−１０のバランスの変化を介して急性肺傷害に保護効果を発揮すると提案することは合理的である。

【0071】

上に概説したように、いくつかの最近の文献は、Ｈ_２Ｓが人体全体の生物学的機能の調節において中心的な役割をすることを示している。喘息およびＣＯＰＤなどの慢性閉塞性肺疾患の病態生理学的状況下でのＨ_２Ｓ機能不全は、動物モデルおよび患者の両方において疾患症状の進行に寄与する。

【0072】

この実施例では、以下の点について、４種のＨ_２Ｓ化合物、即ち、ＳＵＬ９０、ＳＵＬ１２１の効果を研究した：
１）ヒト（不死化）気道平滑筋細胞（ｈＴＥＲＴ細胞）の細胞生存率
２）ｈＴＥＲＴ細胞からの炎症メディエーターＩＬ−８の放出
３）ウシ気管平滑筋片の気道平滑筋収縮性。

【0073】

以下のサンプルを使用した：
‐２つのＳＵＬ−化合物：ＳＵＬ９０、ＳＵＬ１２１；
‐以前の報告（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇｅｒら、２０１２）に基づいて培養されたヒトテロメラーゼ逆転写酵素不死化気道平滑筋（ｈＴＥＲＴ）細胞。実験に先立って、細胞を１日間無血清状態にし、続いて１５％タバコ煙抽出物（ＣＳＥ）の非存在下および存在下で、指示濃度のＳＵＬ−化合物でさらに２４時間（該細胞を）処理した。対照として、１μＭのフェノテロールおよび５００μＭのＨ_２ＳドナーＮａＨＳを使用した。
‐２つの研究用タバコ（ケンタッキー大学２Ｒ４Ｆ）の煙を２５ｍＬのＤＭＥＭ（ＦＢＳなし）を通しておおよそ１本／５分の速度で燃焼させて（オランダ、ロッテルダムのＷａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ ３２３ Ｅ／Ｄ）新たに作った１００％タバコ煙エキス（ＣＳＥ）。その後、ＣＳＥを１５％に希釈した（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇｅｒら、２０１２）。

【0074】

細胞ベースの研究においては、ＳＵＬ−化合物を１ｍＭ原液として０．９％ＮａＣｌに溶解した。等尺性張力測定のために、ＳＵＬ−化合物を１００ｍＭ原液として１００％ＤＭＳＯに溶解した。

【0075】

アッセイ１：トリパンブルー細胞計数
細胞生存率測定のために、以前の報告（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇｅｒら、２０１２）に基づいてトリパンブルー細胞計数を行った。対照として、５００μＭのＨ_２ＳドナーＮａＨＳを使用した。あるいは、ほとんど以前の報告（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇｅｒら、２０１２）に基づいてアラマーブルー測定を行い、細胞生存率を決定した。

【0076】

つまり、ｈＴＥＲＴ細胞を、２４ウェルプレート上に１０，０００細胞／ウェルの細胞密度で播種した。再び細胞を１日間無血清状態にし、続いて１５％タバコ煙抽出物（ＣＳＥ）の非存在下および存在下で、指示濃度のＳＵＬ−化合物でさらに２４時間（該細胞を）処理した。

【0077】

アッセイ２：ｈＴＥＲＴ細胞からのインターロイキン−８（ＩＬ−８）の放出
このアッセイを使用して、ｈＴＥＲＴ細胞、フェノテロール（１μＭ）および対照としてのＨ_２Ｓドナー（５００μＭ）からインターロイキン−８の放出を測定した。１５％ＣＳＥの非存在下および存在下で指示濃度のＳＵＬ−化合物で細胞を刺激してから２４時間後に培地を収集し、以前の報告（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇｅｒら、２０１２）に基づいて、製造者（オランダ、サンクイン社のＰｅｌｉＫｉｎｅ Ｃｏｍｐａｃｔ ＥＬＩＳＡキット）の指示に従って細胞上清中のＩＬ−８濃度を測定した。

【0078】

アッセイ３：ウシ気管平滑筋（ＢＴＳＭ）片および等尺性張力測定
等尺性張力測定は、以前の報告（Ｒｏｓｃｉｏｎｉら、２０１１；Ｒｏｓｃｉｏｎｉ、Ｐｒｉｎｓら、２０１１）に基づいて行った。１１７．５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、５．５ｍＭのグルコース、５．６ｍＭのＫＣｌ、１．１８ｍＭのＭｇＳＯ_４、２．５０ｍＭのＣａＣｌ_２、１．２８ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、５％ＣＯ_２および９５％Ｏ_２のプレガス（ｐｒｅ−ｇａｓ）を含有するｐＨ７．４のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液を含有するオルガンバス（ｏｒｇａｎ−ｂａｔｈ）に等浸透圧記録のためにＢＴＳＭ片を設けた。平滑筋層を切開し、結合組織を注意深く除去した後、長さ約１ｃｍ、幅約２ｍｍのＢＴＳＭ片を用意した。非必須アミノ酸混合物（１：１００）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ゲンタマイシン（４５μｇ^＊ｍｌ−１）、ペニシリン（１００Ｕ^＊ｍｌ−１）、ストレプトマイシン（１００μｇ^＊ｍｌ−１）、アムホテリシンＢ（１．５μｇ^＊ｍｌ−１）、アポトランスフェリン（５μｇ^＊ｍｌ−１）およびアスコルビン酸（１００μＭ）を補充したＤＭＥＭ中で組織片を培養した。ＢＴＳＭ片を１〜３日間培養した後に、Ｉｎｎｏｖａ４０００インキュベーターシェーカー（３７℃、５５ｒｐｍ）で等張力測定を行った。

【0079】

等張力測定（Ｒｏｓｃｉｏｎｉら、２０１１；Ｒｏｓｃｉｏｎｉ、Ｐｒｉｎｓら、２０１１）を行うために、ＢＴＳＭ片の内径を測定し、トランスデューサに取り付け、オルガンバス内のプレガス化ＫＨ緩衝液の中に入れた。各片を３グラムの基礎張力に調整した。次に、片を洗浄し、再び６０分間平衡化させ、続いて１×１０^−３．５μＭのメタコリンによって前収縮（ｐｒｅ−ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）を誘発した。等長張力に対するＳＵＬ−化合物の急性効果を分析するために、片を累積用量のＳＵＬ−化合物（１〜３００μＭ）と共にインキュベートし、その後０．０１μＭのイソプレナリンを添加した。

【0080】

ＳＵＬ−化合物によって誘発された効果におけるβ２−ＡＲの潜在的役割を分析するために、片を１μＭのプロプラノロールとともに３０分間インキュベートしてから、ＳＵＬ−化合物を添加した。イソプレナリンによって誘発された弛緩に対するＳＵＬ−化合物の潜在的効果を分析するために、先ず片をＳＵＬ−化合物（各３０μＭ）と共にインキュベートしてから、累積用量のイソプレナリン（１×１０^−５−１μＭ）を添加した。最後に、メタコリンによって誘発された収縮に対するＳＵＬ−化合物の潜在的な効果を分析するために、片をＳＵＬ−化合物（各３０μＭ）と共にインキュベートしてから、、メタコリンの累積用量（０．０００１〜３０μＭ）を添加し、その後０．０１μＭのイソプレナリンを添加した。

【0081】

データは、平均±標準誤差として表す。適切な場合、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）に続くベンフェロニポストホック（Ｂｅｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ ｈｏｃ）検定、対応のある両側ｔ検定（２−ｔａｉｌｅｄ ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を使用して、平均間の統計学的差異を同定した。統計学的差異はｐ＜０．０５で有意であると定義した。

【0082】

結果
細胞生存率に対するＳＵＬ−化合物
図１に示すように、ＳＵＬ−化合物は、細胞生存率に有意な効果を示さない。しかしながら、ＳＵＬ−化合物の濃度を増加させることは、細胞生存率に対するＣＳＥの深遠な効果をさらに増加させるようである。ここに示すものは、トリパンブルー計数に基づく細胞生存率の研究結果である。アラマーブルー測定でも同様の結果が得られた（データは示せず）。したがって、ＳＵＬ−９０およびＳＵＬ−１２１は、ｈＴＥＲＴ細胞の細胞生存率を大きく変化させないようである。

【0083】

ＣＳＥに曝露されたｈＴＥＲＴからのＩＬ−８の放出に対するＳｕｌ−９０、Ｓｕｌ−１２１の効果
図２に示すように、ＳＵＬ−化合物は、ＣＳＥによって誘発されたＩＬ−８の細胞放出に対して差異のある効果を示さない。Ｓｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１は、炎症メディエーター、ＩＬ−８の放出を有意に減少させる（図５）。

【0084】

ＢＴＳＭ片の急性弛緩に対するＳｕｌ−９０、Ｓｕｌ−１２１、Ｓｕｌ−１２７およびＳｕｌ−１３６の効果
図３に示すように、Ｓｕｌ−９０は、１００μＭよりも高い濃度でＢＴＳＭ片の弛緩を誘発する傾向を示す。Ｓｕｌ−１２１は、さらに顕著な弛緩を誘発して、統計的有意性に達する。対照的に、Ｓｕｌ−１２７およびＳｕｌ−１３６はＢＴＳＭ片の収縮トーンを変化させない（図３）。

【0085】

Ｓｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１による弛緩
β２−アドレナリン受容体が弛緩特性に関与する可能性を分析するために、ＢＴＳＭ片をβ２−アドレナリン受容体拮抗薬プロプラノロールと共に予めインキュベートした。図４に示すように、プロプラノロールは、イソプレナリンの用量応答曲線の右シフトを誘発した。対照的に、Ｓｕｌ９０およびＳｕｌ−１２１によって誘発された弛緩は、プロプラノロールの影響を受けなかった（図４）。プロプラノロールの存在下で、Ｓｕｌ−９０は弛緩特性の左シフト傾向をも示した。統計分析（表２参照）は、プロプラノロールがイソプレナリンによる弛緩を有意に変化させたが、Ｓｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１によって誘発された弛緩は影響を受けなかったことを明らかにした。したがって、Ｓｕｌ９０およびＳｕｌ−１２１は、β２−アドレナリン受容体に関係なく、ＢＴＳＭの急性弛緩を誘発する。

【0086】

【表2】

【0087】

イソプレナリンによって誘発された弛緩に対するＳｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１の影響
ＢＴＳＭ片を、上記した３０μＭの濃度のＳｕｌ９０およびＳｕｌ−１２１と共に予めインキュベートして、等長張力は影響を受けないようにした。図５に示すように、Ｓｕｌ−１２１は、Ｓｕｌ−９０とは違って、イソプレナリンの用量応答曲線の有意な右シフトを誘発した。

【0088】

メタコリンによって誘発された収縮に対するＳｕｌ−９０およびＳｕｌ−１２１の影響
ＢＴＳＭス片を、上記した３０μＭの濃度のＳｕｌ９０およびＳｕｌ−１２１と共に予めインキュベートして、等長張力は影響を受けないようにした。図６に示すように、Ｓｕｌ−９０およびＳｕｌ１２１は、メタコリンによって誘発された収縮を減少させた。

【0089】

結論
１）ＳＵＬ９０およびＳＵＬ１２１は、ｈＴＥＲＴ細胞の細胞生存率を大きく変化させない。
２）ＳＵＬ９０およびＳＵＬ１２１は、ＣＳＥによって誘発された細胞のＩＬ−８放出を阻害する。
３）ＳＵＬ９０およびＳＵＬ１２１は、β２−アドレナリン受容体に依存することなく、メタコリンで予め収縮させたウシ気管片の弛緩を誘発する。
４）ＳＵＬ２１２は、イソプレナリンの用量応答曲線の右シフトを誘発するが、これは、ＳＵＬ１２１がイソプレナリンの細胞内シグナル伝達成分について競合し得ることを示す。
５）ＳＵＬ９０およびＳＵＬ１２は、メタコリンによって誘発される収縮を有意に減少させる。

【0090】

実施例３
モルモットに、胸腔内圧のオンライン測定のために胸腔内バルーンカテーテルを埋め込んだ。ＬＰＳ点滴の２４時間前に（ｔ＝−２４ｈ）、ヒスタミンに対する基礎気道反応性を測定する（ＰＣ１００：胸腔内圧の倍加を誘発するヒスタミン濃度）。鼻腔内ＬＰＳ点滴の３０分前に（ｔ＝−０．５ｈ）、動物を生理食塩水、（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノンまたはＮ、６−ジヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミドまたはフェノテロールで処理し、陽性対照として用いた。

【0091】

時点０（ｔ＝０ｈ）で、ＬＰＳを鼻腔内に注入し、その後、ＰＣ１００測定を行うことで、異なる時点（ｔ＝１、２、３、６および２４ｈ）で気道過敏性を測定した。ｔ＝２５ｈにおいて、気道炎症に対する異なる処理（処置）の効果を測定するために気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ＬＰＳによって誘発された効果の対照として、ｔ＝−０．５ｈで生理食塩水処理後、生理食塩水を鼻腔内に投与した。

【0092】

有効量を評価するために、（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イル）（ピペラジン−１−イル）メタノンまたはＮ，６−ジヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボキサミドのいずれかで処理する３０分前、そして、処理後の様々な時点（３０分、１ｈ、２ｈ、３ｈ、６ｈおよび２４ｈ）でヒスタミンＰＣ１００測定を実施した。両方の化合物について３、３０および３００ｍＭのエアロゾル濃度を用いた。

【0093】

完全麻酔下で、自由に動く動物の胸腔内圧のオンライン測定のために、胸腔内に胸腔内バルーンカテーテルを外科的に埋め込んだ。１週間の回復後、動物を測定方法に適合するように訓練した。

【0094】

図７は、気道反応性に対する本発明の化合物の効果を示しており、結果は、化合物が明らかな拡張効果を有することを示している。

【0095】

図８は、ＢＡＬ測定の結果を示しており、対照における誤差範囲は比較的大きいものの、好酸球、リンパ球、好中球および上皮細胞がすべて減少したことを示している。したがって、この実験は、本発明の化合物がインビボで炎症に対して低減効果を有することを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】