特許 6711761 ペプチド及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6711761

(24)【登録日】2020年6月1日

(45)【発行日】2020年6月17日

(54)【発明の名称】ペプチド及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20200608BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20200608BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20200608BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200608BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/08ZNA

   A61K38/10

   A61P7/04

   A61P43/00 111

【請求項の数】20

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2016-552533(P2016-552533)

(86)(22)【出願日】2015年2月27日

(65)【公表番号】特表2017-509602(P2017-509602A)

(43)【公表日】2017年4月6日

(86)【国際出願番号】US2015018041

(87)【国際公開番号】WO2015131061

(87)【国際公開日】20150903

【審査請求日】2018年1月16日

(31)【優先権主張番号】61/946,103

(32)【優先日】2014年2月28日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】315010787

【氏名又は名称】バクスアルタ インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】515351758

【氏名又は名称】バクスアルタ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ドチカル，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ポラコウスキー，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】オステルカンプ，フランク

(72)【発明者】

【氏名】ハルトマン，ルドルフ

(72)【発明者】

【氏名】パシュケ，マティアス

(72)【発明者】

【氏名】ハルトリーブ，ベッティーナ

(72)【発明者】

【氏名】シャイフリンガー，フリードリヒ

【審査官】 星 功介

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５０４９３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第０１７８０２１９（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５１０５１６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列ＥＹＹＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦＥ（配列番号２９２４）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
Ｘ１００１−Ｘ１００２−Ｘ１００３−Ｘ１００４−Ｘ１００５−Ｘ１００６−Ｘ１００７−Ｘ１００８−Ｘ１００９−Ｘ１０１０−Ｘ１０１１−Ｘ１０１２−Ｘ１０１３−Ｘ１０１４−Ｘ１０１５−Ｘ１０１６−Ｘ１０１７−Ｘ１０１８−Ｘ１０１９−Ｘ１０２０の構造を有する、プロテインＳに結合するペプチドであって、
Ｘ１００１はＡ、Ｂｐａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、p、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１００２はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｙであり；
Ｘ１００３はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｙであり；
Ｘ１００４はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１００５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１００６はＡ、Ｉ、Ｓ、またはＴｌｅであり；
Ｘ１００７はＡ、またはＧであり；
Ｘ１００８は１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｂｔａ、Ｇ、またはＷであり；
Ｘ１００９はＨ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１０はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、またはＹであり；
Ｘ１０１１はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｗであり；
Ｘ１０１２はＥ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、またはＹであり；
Ｘ１０１３はＡ、ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１４はＣ、Ｄ、またはＦであり；
Ｘ１０１５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１６はＨ、またはＹであり；
Ｘ１０１７はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｙであり；
Ｘ１０１８はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１９はＥ、Ｆ、またはＰであり；及び
Ｘ１０２０はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹである、ペプチド。

【請求項2】

Ｘ１００４がＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１００５がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１００７がＧであり；
Ｘ１００８が１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ｂｔａ、またはＷであり；
Ｘ１００９がＹであり；
Ｘ１０１１がＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１３がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１４がＤであり；
Ｘ１０１５がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１７がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１８がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；及び
Ｘ１０１９がＥ、またはＦである、請求項１記載のペプチド。

【請求項3】

Ｘ１００４がＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１００５がＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１００６がＡ、Ｉ、またはＴｌｅであり；
Ｘ１０１０がＤ、Ｅ、Ｎ、またはＹであり；
Ｘ１０１１がＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；及び
Ｘ１０１９がＦである、請求項２記載のペプチド。

【請求項4】

Ｘ１００４がＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｔｌｅ、Ｖ、またはＷであり；
Ｘ１００５がＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１１がＦ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；
Ｘ１０１２がＥ、Ｉ、Ｎ、またはＹであり；
Ｘ１０１３がＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり；
Ｘ１０１５がＤ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり；
Ｘ１０１７がＤ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｔ、Ｗ、またはＹであり；及び
Ｘ１０１８がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷである、請求項３記載のペプチド。

【請求項5】

Ｘ１００４がＶであり、Ｘ１００５がＳであり、Ｘ１００６がＡであり、Ｘ１００７がＧであり、Ｘ１００８がＷであり、Ｘ１００９がＹである、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド。

【請求項6】

前記アミノ酸配列がアミノ酸配列ＥＹＹＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦＥ（配列番号２９２４）と少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を備える、請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチド。

【請求項7】

前記アミノ酸配列がアミノ酸配列ＥＹＹＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦＥ（配列番号２９２４）を含む、請求項６記載のペプチド。

【請求項8】

Ｘ１００３がＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｙ、またはＹであり；
Ｘ１００２がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｙ、またはＹである、請求項１記載のペプチド。

【請求項9】

配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドをトレーサーとして用いた競合ＬＡＮＣＥアッセイにおいて、ヒトプロテインＳに２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＩＣ５０で結合する、請求項１〜８のいずれか一項記載のペプチド。

【請求項10】

ＥＹＹＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦＥ（配列番号２９２４）と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロテインＳに結合するペプチド。

【請求項11】

配列番号１〜２９１６、２９２０、及び２９２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のペプチド。

【請求項12】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、抗体若しくはそのフラグメント、ヒドロキシエチルデンプン、プロリン−アラニン−セリン若しくはその組み合わせを含む多量体（ＰＡＳ化）、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸、またはポリシアル酸にコンジュゲートする、請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチド。

【請求項13】

Ｂｐａ、Ｂｐａ−Ｋ（Ｂｉｏ）−Ｃ、Ｃ（Ａｔｆ−Ｂｉｏ）、Ｃ（Ａｔｆ−ＬＣ−Ｂｉｏ）、Ｃ（ＦｅＢＡＢＥ）、Ｃ（ＭａｌＣｙ５）、Ｃ（ＮＥＭ）、Ｃ（ＰＥＧ）、Ｋ、Ｋ（Ａｃ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−γＧｌｕ）、Ｋ（Ｇｌｕｔａｒ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｍａｌ）、Ｔ、Ｔｔｄｓ、またはＴｔｄｓ−Ｋ（Ｂｉｏ）からなる群から選択される部分にコンジュゲートまたは付着している、請求項１〜１２のいずれか一項記載のペプチド。

【請求項14】

プロテインＳ活性を阻害する、請求項１〜１３のいずれか一項記載のペプチド。

【請求項15】

請求項１〜１４のいずれか一項記載のペプチド及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項16】

疾患の治療のために使用される、請求項１〜１４のいずれか一項記載のペプチド。

【請求項17】

前記疾患が血液凝固異常である、請求項１６記載のペプチド。

【請求項18】

薬剤の製造のための、請求項１〜１４のいずれか一項記載のペプチドの使用。

【請求項19】

前記薬剤が血液凝固疾患の治療用である、請求項１８記載の使用。

【請求項20】

細胞におけるプロテインＳ活性のインビトロでの阻害方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項記載のペプチドをプロテインＳ活性阻害に有効な量でインビトロで前記細胞に投与することを含む、阻害方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、プロテインＳに結合するペプチド及びその使用に関する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１４年２月２８日出願の米国仮特許出願第６１／９４６，１０３号の優先権を主張する。

【0003】

参照による引用
本明細書と同時に提出されるコンピュータで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれ、以下のものとして同定される：「４６３８０Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称で、１，３９０，４６６バイト、２０１５年２月２７日作成のＡＳＣＩＩ形式テキストファイル。

【背景技術】

【0004】

止血は複雑な凝固カスケードに依存しており、血液凝固因子が媒介する一連の現象によってプロトロンビンからトロンビンへの変換が導かれる。第Ｘ因子（ＦＸ）活性化は、凝固カスケードの内因性経路と外因性経路との双方における中心的な現象である。外因性経路は、凝固カスケードの主要なアクティベーターとして提唱されてきた（Ｍａｃｋｍａｎら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｃａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２７，１６８７−１６９３（２００７））。循環している組織因子（ＴＦ）及び活性化された第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）が相互作用して、ＦＸの活性化を媒介する「外因性複合体」を形成する。凝固カスケードは内因性経路によって増幅され、その間第ＸＩＩ、第ＸＩ、第ＩＸ、及び第ＶＩＩＩ因子の連続的な活性化により、同様にＦＸ活性化を媒介する「内因性の」ＦＩＸａ−ＦＶＩＩＩａ複合体が形成される。活性化されたＦＸは、身体がフィブリンを作り出して効果的に出血を抑えるために必要なトロンビン形成を促進する。凝固は、プロテインＣが媒介する抗凝固経路によって下方制御される。トロンボモジュリンと複合したトロンビンは、プロテインＣを活性化させる。活性化されたプロテインＣはその補因子のプロテインＳと共に、活性化された血液因子の第Ｖ因子（ＦＶａ）及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）を分解し、失活させる。

【0005】

血友病のような重度の出血系疾患は、血液凝固カスケードの中断に起因する。因子補充療法は、血液凝固疾患に対する最も一般的な治療法である。しかし、概して血液凝固因子は投与後短時間で血流から除去される。有効であるためには、患者は血漿由来または遺伝子組み換えの因子濃縮物の静脈内注入を高頻度で受けなければならず、苦痛であり、高価であり、時間がかかるものである。加えて、因子補充療法の治療有効性は、阻害的な抗体の形成によって大きく減少しうる。抗因子抗体を持つ患者への治療上の選択肢はわずかにしか存在しない。

【発明の概要】

【0006】

本発明には、例えば、アミノ酸配列ＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦ（配列番号２９２０）に少なくとも５０％同一なアミノ酸を含み、式Ｉ：Ｘ１００４−Ｘ１００５−Ｘ１００６−Ｘ１００７−Ｘ１００８−Ｘ１００９−Ｘ１０１０−Ｘ１０１１−Ｘ１０１２−Ｘ１０１３−Ｘ１０１４−Ｘ１０１５−Ｘ１０１６−Ｘ１０１７−Ｘ１０１８−Ｘ１０１９の構造を含むペプチドが含まれる（式中、Ｘ１００４はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００６はＡ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００７はＡ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００８は１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ａ、Ｂｔａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｗ、またはＹであり；Ｘ１００９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｗであり；Ｘ１０１０はＡ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１１はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｗであり；Ｘ１０１２はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１３はＡ、ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１４はＡ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１６はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１７はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｙであり；Ｘ１０１８はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹである（配列番号２９２１））。様々な実施形態において、ペプチドは、Ｘ１００４に直接連結している１つまたは複数のＮ末端アミノ酸をさらに含み、前記Ｎ末端アミノ酸は、Ｘ１００３、Ｘ１００２−Ｘ１００３、及びＸ１００１−Ｘ１００２−Ｘ１００３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。このとき、Ｘ１００３はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｙであり；Ｘ１００２はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｙであり；Ｘ１００１はＡ、Ｂｐａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹである（配列番号２９２２）。あるいは、または加えて、本ペプチドは、Ｘ１０１９に直接連結しＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるＣ末端アミノ酸を含んでも良い（配列番号２９２３）。例えば、様々な実施形態において、本ペプチドはＥＹＹＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦＥ（配列番号２９２４）に少なくとも約８０％同一なアミノ酸配列を含む。本発明には、配列番号１〜２９１６、２９２０、及び２９２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）ペプチドが含まれる。

【0007】

加えて、本発明は、本発明のペプチドの使用方法を提供する。例えば、本発明は対象におけるプロテインＳ活性の阻害方法を提供する。ある疾患にかかっている、またはある疾患にかかる危険性のある対象を治療する方法も提供される。本発明はまた、トロンビン形成の強化方法、対象の血餅形成の増加方法、及び血液凝固障害のような疾患または障害の治療方法を提供する。当該方法はまた、全体として、本明細書中で例えば「本発明の方法」とも称される。当該方法は、対象に対して、本明細書に記載のペプチドを、所望の効果達成に有効な量で、例えば、対象におけるプロテインＳの活性の阻害、トロンビン形成の強化、血餅形成の強化、または血液凝固疾患の治療に有効な量で、投与することを含む。本発明のさらなる態様には、本発明のペプチドの、医薬におけるまたは薬剤製造のための使用が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A】トレーサーペプチドとしてＪＢＳ０６８４を用いてＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイにより測定した、本明細書に記載の様々なペプチドの結合親和性（平均ＩＣ５０［ｎＭ］）を提供する図表である。

【図1B】トレーサーペプチドとしてＪＢＳ０６８４を用いてＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイにより測定した、本明細書に記載の様々なペプチドの結合親和性（平均ＩＣ５０［ｎＭ］）を提供する図表である。

【図1C】トレーサーペプチドとしてＪＢＳ０６８４を用いてＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイにより測定した、本明細書に記載の様々なペプチドの結合親和性（平均ＩＣ５０［ｎＭ］）を提供する図表である。

【図2A】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2B】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2C】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2D】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2E】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2F】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2G】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2H】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2I】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2J】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2K】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2L】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2M】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2N】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2O】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2P】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2Q】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2R】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2S】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2T】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2U】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2V】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2W】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2X】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2Y】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2Z】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2AA】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2BB】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2CC】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2DD】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2EE】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2FF】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2GG】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2HH】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2II】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【図2JJ】本明細書に記載の様々なペプチドのアミノ酸配列を提供する図表である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明は、プロテインＳに結合し、またある場合に血液凝固カスケード内のプロテインＳの阻害的な（つまり抗凝固性の）活性をブロックするペプチドを提供する。プロテインＳは活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）の補因子として機能し、第Ｖａ因子（ＦＶａ）及び第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）を分解する。プロテインＳを阻害すれば、プロテインＣが媒介するＦＶａとＦＶＩＩＩａの分解が低下し、血液諸因子が血液凝固カスケードで機能してトロンビンの生成、最終的にはフィブリンの生成が可能となる。プロテインＳは７０ｋＤのビタミンＫ依存性糖タンパク質であり、６３５アミノ酸長であり、γ−カルボキシ−グルタミン酸ドメイン（Ｇｌａドメイン）、トロンビン感受性モジュール、上皮成長因子様ドメイン（ＥＧＦドメイン）、及び性ホルモン結合グロブリンに類似性を有する領域を含む。当該タンパク質は血漿内で遊離して見出され、また補体タンパクであるＣ４ｂ結合タンパク（Ｃ４ＢＰ）と複合体を形成している。遊離プロテインＳはＡＰＣ補因子として働き、複合体型は補因子の活性を持たない。プロテインＳはリン脂質含有膜に対するＡＰＣの親和性を増加させ、ＡＰＣが媒介するＦＶａにおけるＲ３０６での切断を強化し、ＡＰＣが媒介するＦＶＩＩＩａの失活を強化する。Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６（２１），１１１２８−１１１３１（１９８１）；Ｒｏｓｉｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（４６），２７８５２−２７８５８（１９９５）。プロテインＳはまた、例えばＦＸａおよびＦＶａと結合することで、ＡＰＣと独立に凝固を妨げる。Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（３３），２１０５１−２１０５８（１９９４）。ヒトプロテインＳの配列は、配列番号２９１７（配列番号２９１８として提供される核酸配列）として提供されている。本発明は、一態様において、１つまたは複数のプロテインＳの活性を任意選択でブロックし、それによりトロンビン形成を任意選択で強化するプロテインＳ結合ペプチドを提供する。本開示の文脈において、本明細書に記載の式Ｉによって含まれる任意のペプチド及び本明細書に記載の任意のプロテインＳ結合ペプチドは、「本発明のペプチド」及び「本明細書に記載のペプチド」とも称される。「ペプチド」には、従来的なペプチド（すなわち、従来的なペプチド骨格を有する）だけではなくペプチドミメティック（すなわち、修飾された骨格を有し、アミノ酸に見出される側鎖を任意選択で有するタンパク質様ポリマー）も含まれることが意図されている。

【0010】

いくつかのペプチドのアミノ酸配列が本明細書中で提供される。従来型のアミノ酸は、標準に従って１文字または３文字のコードで同定される。非従来型のアミノ酸及び追加のペプチドの構成単位を、例えば３つまたは４つの文字／数字コード（一般的な４文字の略称であるＴｔｄｓ及びＤｏｐａを例外とする）で表した例は、表１及び本明細書中の他の箇所に記載されている。非従来型のアミノ酸及び構成単位の化学的構造は当技術分野において公知であり、例えば米国特許出願公開第２０１３／０２５２８９６号に記載されており、表１〜３を含めその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0011】

本明細書で提供するペプチドのアミノ酸配列は、典型的なペプチド配列フォーマットで表現されている。例えば、あるアミノ酸の３文字のコードまたは１文字のコードは、ペプチド配列内の特定の位置に当該アミノ酸が存在することを示す。各々の非従来型のアミノ酸または構成単位のコードは、多くの場合において配列内でハイフンによって次の及び／または前のアミノ酸または構成単位のコードに接続している。隣接するアミノ酸は、化学結合（概してアミド結合）によって接続している。化学結合の形成により、アミノ酸の１−カルボキシル基は隣接するアミノ酸の左側に位置するときヒドロキシル基を除去され（例えば、Ｈｌｅ−隣接アミノ酸）、アミノ酸のアミノ基は隣接するアミノ酸の右側に位置するとき水素を除去される（例えば、隣接アミノ酸−Ｈｌｅ）。両方の修飾は、明示的に説明するハイフンがなくても、同一のアミノ酸に適用可能であり、アミノ酸配列に存在する従来型の隣接アミノ酸に適用可能であることが理解されている。アミノ酸がアミノ酸側鎖において２つ以上のアミノ基及び／またはカルボキシ基を含む場合、２−または３−アミノ基及び／または１−カルボキシ基は一般的にペプチド結合形成に使用される。一部の非従来型のアミノ酸について、最初の文字がＣα原子という立体化学を示す場合、３文字のコードが使用される。例えば、最初の文字が大文字であることは、アミノ酸のＬ型がペプチド配列に存在することを示し、一方最初の文字が小文字であることは、対応するアミノ酸のＤ型がペプチド配列に存在することを示す。１文字のコードが使用されるとき、小文字はＤ−アミノ酸を表し、一方大文字はＬ−アミノ酸を表す。反対のことが示されない限り、本明細書中で提示されるアミノ酸配列はＮからＣ末端の方向で提示される。

【0012】

本明細書中に記載のいくつかのペプチド配列のＣ末端は、ＯＨ、ＮＨ_２、またはＣ末端アミノ酸コードにハイフンによって連結している特定の末端アミンの略称の包含によって、しばしば明示的に説明される。本明細書中に記載のいくつかのペプチドのＮ末端は、水素（遊離Ｎ末端の）、またはＮ末端アミノ酸コードにハイフンによって連結している特定の末端カルボン酸若しくは他の化学基の略称の包含によって、明示的に説明される。

【0013】

本発明は、式（Ｉ）：Ｘ１００４−Ｘ１００５−Ｘ１００６−Ｘ１００７−Ｘ１００８−Ｘ１００９−Ｘ１０１０−Ｘ１０１１−Ｘ１０１２−Ｘ１０１３−Ｘ１０１４−Ｘ１０１５−Ｘ１０１６−Ｘ１０１７−Ｘ１０１８−Ｘ１０１９の構造を含むペプチドを提供する（式中、Ｘ１００４はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００６はＡ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００７はＡ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００８は１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ａ、Ｂｔａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｗ、またはＹであり；Ｘ１００９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｗであり；Ｘ１０１０はＡ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１１はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｗであり；Ｘ１０１２はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１３はＡ、ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１４はＡ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１６はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１７はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｙであり；Ｘ１０１８はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹである（配列番号２９２１））。

【0014】

様々な実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦ（配列番号２９２０）に対して少なくとも５０％同一な（例えば、少なくとも５５％同一な、少なくとも６０％同一な、少なくとも６５％同一な、少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、または少なくとも９０％同一な）アミノ酸配列であって、式Ｉの構造を有する前記アミノ酸配列を含む（またはそれからなる）ペプチドを提供する（式中、Ｘ１００４はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｄａｐ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００６はＡ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００７はＡ、ａ、Ａｉｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｍｇ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００８は１Ｎｉ、２Ｎｉ、Ａ、Ｂｔａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｗ、またはＹであり；Ｘ１００９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｗであり；Ｘ１０１０はＡ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１１はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｗであり；Ｘ１０１２はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１３はＡ、ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１４はＡ、Ｃ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１６はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１７はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｎｌｅ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｙであり；Ｘ１０１８はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹである（配列番号２９２１））。

【0015】

本発明の様々な実施形態において、Ｘ１００４はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００５はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００６はＡ、ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００７はＧまたはａであり；Ｘ１００８はＦ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１００９はＦまたはＹであり；Ｘ１０１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１１はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１２はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１３はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１４はＡ、Ｄ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、またはＳであり；Ｘ１０１５はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１６はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１７はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１９はＥ、Ｆ、ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ、またはＹである。

【0016】

一態様において、本発明のペプチドは式（Ｉ）の構造を含む（式中、Ｘ１００４はＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり（例えば、Ｘ１００４はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、及びＷからなる群から選択され）；Ｘ１００５はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり（例えば、Ｘ１００５はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択され）；Ｘ１００６はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり（例えば、Ｘ１００６はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択され）；Ｘ１００７はＧであり；Ｘ１００８はＦ、Ｌ、Ｗ、またはＹであり（例えば、ＦまたはＹ）；Ｘ１０１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり（例えば、Ｘ１０１０はＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択され）；Ｘ１０１１はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり（例えば、Ｘ１０１１はＦ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択され）；Ｘ１０１２はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり（例えば、Ｘ１０１２はＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され）；Ｘ１０１３はＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり；Ｘ１０１４はＤ、ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、またはＮであり（例えば、Ｘ１０１４はＤ、Ｅ、及びＨからなる群から選択され）；Ｘ１０１５はＤ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり；Ｘ１０１６はＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｓ、Ｗ、またはＹであり（例えば、Ｘ１０１６はＦ、Ｈ、Ｗ、及びＹからなる群から選択され）；Ｘ１０１７はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｔ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ１０１８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり；Ｘ１０１９はＦ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、またはＹである（例えば、Ｘ１０１９はＦ、Ｉ、Ｍ、及びＷからなる群から選択される））。一態様または複数の態様において、Ｘ１００４はＶであり、Ｘ１００５はＳであり、Ｘ１００６はＡであり、Ｘ１００７はＧであり、Ｘ１００８はＷであり、Ｘ１００９はＹである。ペプチドは、ＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦ（配列番号２９２０）に対して少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を任意選択で含む。

【0017】

一部の実施形態において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に付着する１つまたは複数の追加のアミノ酸残基を含む。例えば、式Ｉの構造を含むペプチドは、一部の実施形態において、Ｘ１００４に直接連結しているＮ末端アミノ酸を１つまたは複数さらに含み、前記Ｎ末端アミノ酸はＸ１００３、Ｘ１００２−Ｘ１００３、及びＸ１００１−Ｘ１００２−Ｘ１００３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。Ｘ１００３及びＸ１００２は独立にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｔｌｅ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはｙから選択される（例えば、Ｘ１００３及びＸ１００２は独立にＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｙ、またはＹから選択される）。例えば、一部の態様において、Ｘ１００３はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｙ、またはＹであり、Ｘ１００２はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、ｙ、またはＹである。Ｘ１００１はＡ、Ｂｐａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹである（例えば、Ｘ１００１はＡ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択される）。

【0018】

式Ｉで示されるコア構造に加え、具体的に検討されている他の構造は、Ｘ１０１９に直接連結しているコア構造のＣ末端に１つまたは複数の追加のアミノ酸が付着している構造である。例えばＣ末端への追加は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群、例えばＡ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸配列を任意選択で含む。本発明は、アミノ酸配列ＥＹＹＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦＥ（配列番号２９２４）に対して少なくとも５０％の同一性を備え、各々のアミノ酸の位置が上記で定義されている式Ｘ１００１−Ｘ１００２−Ｘ１００３−Ｘ１００４−Ｘ１００５−Ｘ１００６−Ｘ１００７−Ｘ１００８−Ｘ１００９−Ｘ１０１０−Ｘ１０１１−Ｘ１０１２−Ｘ１０１３−Ｘ１０１４−Ｘ１０１５−Ｘ１０１６−Ｘ１０１７−Ｘ１０１８−Ｘ１０１９−Ｘ１０２０（配列番号２９２３）を含むペプチドをさらに提供する。

【0019】

本発明には、（ｉ）アミノ酸配列ＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦ（配列番号２９２０）、（ｉｉ）アミノ酸配列ＥＹＹＶＳＡＧＷＹＤＹＮＴＤＴＹＹＥＦＥ（配列番号２９２４）、または（ｉｉｉ）配列番号１〜２９１６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなるペプチドが含まれる。本明細書において、「少なくとも６０％の同一性」及び類似した表現は、例えば６０％から１００％の任意の整数、例えば６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などを含む。また、「少なくとも［百分率］の同一性」という表現は、同一のアミノ酸（またはペプチド構成単位）の数を本発明のペプチドのアミノ酸（または構成単位）の総数で割ったものと等しいかそれ以上の任意の百分率（［少なくとも百分率の同一性］≧［同一アミノ酸または構成単位の数］／［本発明のペプチドのアミノ酸または構成単位の総数］）を含む。アラインされた２つ以上の配列のアミノ酸（またはヌクレオチド）のパーセント同一性算定は当技術分野でよく理解されており、従来から公知のコンピュータープログラムを用いて判定されている。例えば、パーセント配列同一性を判定するために２つ以上の配列をアラインするには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−４０２（１９９７））によって記述され国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトで入手可能なＢＬＡＳＴ（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）プログラムに組み込まれているアルゴリズムを用いて、任意選択で実施される。ペプチドは、好ましくはプロテインＳと結合し、プロテインＳ活性を任意選択で阻害する。

【0020】

本発明には、環状構造を含むペプチドが含まれる。このとき、本発明には、内部に環状構造を含むペプチド（例えば、アミノ酸間の連結により形成される１つまたは複数のループ）、末端のアミノ酸とペプチド配列内のアミノ酸との相互作用により形成される環状構造を含むペプチド、および頭−尾環化ペプチドが含まれる。本発明のペプチドは、ある場合において、分子内ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態において、分子内ジスルフィド結合はシステイン残基によって形成される。また、非システイン残基、または非システイン残基及びシステイン残基によって形成される環状構造を含むペプチドも提供される。環化に適切な非従来型のアミノ酸または化学的部分としては、以下に限定されないが、３−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸（ＦＡ１９２０５）、３−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸（ＦＡ１９２０４）、３−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸（ＦＡ１９２０３）、［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−酢酸（ＦＡ０３２０２）、（Ｓ）−ホモ−システイン（Ｈｃｙ）、Ｄ−ホモ−システイン（ｈｃｙ）、アミノエチルチオール（Ｃｅａ）、及びｃなどがある。

【0021】

本明細書に記載のペプチドは、一部の実施形態において、Ｎ末端及び／またはＣ末端で、またはペプチド内部の残基で、１つまたは複数の部分にコンジュゲートまたは付着している。例示的な部分は、以下に限定されないが、カルボキシフルオレセイン−Ｔｔｄｓ（ＦＡＭ−Ｔｔｄｓ）、プロリン−グルタミン酸塩タグ（「ＰＥ」）、パルミトイル（Ｐａｌｍ）、２−フェニルアセチル、３−フェニルプロピオニル、２−（ナフタ−２−イル）アセチル、ヘキサノイル、２−メチルプロピオニル、３−メチルブタノイル、２−ナフチルスルホニル、アセチル、アミノオキシ酢酸（ＡＯＡ）、レブリン酸（Ｌｅｖ）、ペンチン酸（Ｐｙｎ）、１−ナフチルスルホニル、Ｃ、ｃ、Ｎ−エチルマレイミド エチルマレイミド システイン（Ｃ（ＮＥＭ））、３−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸（ＦＡ１９２０５）、３−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸（ＦＡ１９２０４）、３−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸（ＦＡ１９２０３）、［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−酢酸（ＦＡ０３２０２）、Ｋ（Ｔｄｔｓ−マレイミド）、２−アミノ−６−ε− （２−アミノオキシアミノオキシ−アセチルアミノ）−ヘキサン酸Ｌ−リシン（Ｋ（ＡＯＡ））、アミノエチルチオール（Ｃｅａ）、Ｅａｇ、（Ｓ）−ホモ−リシン（Ｈｌｙ）、Ｋ、（Ｓ）−オルニチン（Ｏｒｎ）、（Ｓ）−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、（Ｓ）−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、（Ｓ）−ジアミノプロピオン酸（Ｈｃｙ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、ε−（ミリスチル）−Ｌ−リシン（Ｋ（Ｍｙｒ））、ε−（ミリスチル−Ｔｔｄｓ）−Ｌ−リシン （Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｍｙｒ））、ε−（パルミチル−Ｔｔｄｓ）−Ｌ−リシン（Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｐａｌｍ））、ε−（ミリスチル−γ−グルタミル−Ｔｔｄｓ）−Ｌ−リシン（Ｋ（Ｔｔｄｓ−γＧｌｕ−Ｍｙｒ））、ε−（４−（ｐ−ヨードフェニル）ブチリル））−Ｌ−リシン（Ｋ（ＡｌｂｕＴａｇ））、ε−（４−（ペンチル）−ベンゾスルホンアミジル）−Ｌ−リシン（Ｋ（４ＰＢＳＡ））、（Ｓ）−４−ベンゾイルフェニルアラニン（Ｂｐａ）、Ｂｐａ−Ｋ（Ｂｉｏ）−Ｃ、Ｃ（Ａｔｆ−Ｂｉｏ）、Ｃ（Ａｔｆ−ＬＣ−Ｂｉｏ）、Ｃ（ＦｅＢＡＢＥ）、Ｃ（ＭａｌＣｙ５）、Ｃ（ＰＥＧ）、ε−（アセチル）−Ｌ−リシン（Ｋ（Ａｃ））、Ｋ（Ｔｔｄｓ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−γＧｌｕ）、Ｋ（Ｇｌｕｔａｒ）、Ｋ（Ｔｔｄｓ−Ｍａｌ）、Ｔ、Ｔｔｄｓ、またはＴｔｄｓ−Ｋ（Ｂｉｏ）が含まれる。Ｋ（Ｂｉｏ）は、ε−（ビオチニル）−Ｌ−リシンである。Ｃ（Ａｔｆ−Ｂｉｏ）は、２−アミノ−３−［２−（２−（４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ−ベンゾイルアミノ）−６−｛６−［５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ヘキサノイルアミノ｝−ヘキサノイルアミノ）−エチルジスルファニル］−プロピオン酸である。Ｃ（Ａｔｆ−ＬＣ−Ｂｉｏ）は、２−アミノ−３−［２−（２−［６−（４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ−ベンゾイルアミノ）−ヘキサノイルアミノ］−６−｛６−［５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ヘキサノイルアミノ｝−ヘキサノイルアミノ）−エチルジスルファニル］−プロピオン酸である。Ｃ（ＦｅＢＡＢＥ）は、２−アミノ−３−（｛４−［２，３−ビス−（ビス−カルボキシメチル−アミノ）−プロピル］−フェニルカルバモイル｝−メチルスルファニル）−プロピオン酸のＦｅ（ＩＩＩ）錯体である。これは、チオエーテル結合及び芳香族スペーサーによってシステイン側鎖の硫黄に連結しているＦｅ（ＩＩＩ）のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）錯体である。Ｃ（ＭａｌＣｙ５）は、２−｛５−［１−（５−｛２−［３−（２−アミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル］−エチルカルバモイル｝−ペンチル）−３，３−ジメチル−１，３−ジヒドロ−インドール−２−イリデン］−ペンタ−１，３−ジエニル｝−１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムである。これは、マレイミド系チオエーテル結合によってシステインの硫黄にコンジュゲートする色素Ｃｙ５である。

【0022】

一態様において、ペプチドのアミノ酸配列は保存的置換を含み、アミノ酸残基は類似した側鎖を有するアミノ酸残基と入れ替えられる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されており、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、極性無電荷側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、及びシステイン）、無極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、及びトリプトファン）、ベータ分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、及びイソロイシン）、及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びヒスチジン）が含まれる。しかし、実施者は保存的置換に限定されず、結果として得られるペプチドがプロテインＳに対する結合能を保持し、全体または部分においてプロテインＳの活性を任意選択で下方制御することが好ましいと理解されるだろう。例えば、図１はアミノ酸配列ＪＢＳ２５１２（配列番号２）の置換型変異体でありプロテインＳ結合特性を保持するペプチドを記載している。

【0023】

一態様において、本発明のペプチドは６０アミノ酸以下、５５アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３５アミノ酸以下、または３０アミノ酸以下からなる。任意選択で、本発明のペプチドは２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、または１０アミノ酸以下からなる。様々な実施形態において、ペプチドは１５〜３５アミノ酸残基（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５アミノ酸残基）を含む。一部の態様において、アミノ酸は、アミノ酸配列内で本明細書中に記載のペプチドからＮ末端及び／またはＣ末端で除去される。かかるペプチドフラグメントは３〜１４アミノ酸残基（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４アミノ酸残基）を含む。本発明のペプチドは、様々な実施形態において、例えば、別の標的（例えば、プロテインＳの異なる領域または異なるプロテイン）と結合している第２のペプチドドメイン、または本発明のペプチドの半減期または安定性を増加させる第２のペプチドドメインに対して、融合または複合体化されている。このような融合物または複合体において、本発明のペプチドの大きさは、第２のペプチドまたは異種ペプチドのドメインから除外される。

【0024】

一態様において、ペプチドは、以下に限定されないが、ペプチドの溶解度を増加させるためのＮ末端及び／またはＣ末端の１つまたは２つのリシンを含めたペプチドの合成、操作、または使用を促進する１つまたは複数のアミノ酸をさらに含む。適切な融合タンパク質としては、以下に限定されないが、１つまたは複数のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、またはタンパク質配列の一部として一般に認識されないアミノ酸に連結している本発明のペプチドを含むタンパク質（例えば、プロテインＳ結合ペプチド）などがある。一態様において、融合ペプチドは、２つ以上のペプチドのアミノ酸配列全体、または代替的に、２つ以上のペプチドの部分（フラグメント）を含む。一部の態様において、ペプチド（例えば、プロテインＳ結合ペプチド）は、例えば以下のうち１つまたは複数のものに対して機能的に連結している：マーカータンパク質、精製を促進するペプチド、多量体たんぱく質形成を促進するペプチド配列、または前述のうちいずれかのフラグメント。適切な融合パートナーとしては、以下に限定されないが、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｓｔｒｅｐタグ、及びｍｙｃタグなどがある。

【0025】

任意選択で、本発明のペプチドは、ペプチドの半減期を強化する１つまたは複数の物質と融合する。半減期は、例えば、プロテインＳ結合ペプチドの分子量を増加させて腎クリアランスを回避することによって、及び／またはｎＦｃ受容体が媒介するリサイクル経路のためにリガンドを組み込むことによって、増加させることができる。一実施形態において、本発明のペプチドは、アルブミンポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に融合、または化学的にコンジュゲートしている。アルブミンフラグメントは、アルブミンタンパク質の完全長の１０％、２５％、５０％、または７５％を含む。例示的なペプチド−アルブミンコンジュゲートは、ＪＢＳ３２１６（配列番号４６２）がアルブミンにコンジュゲートしたＪＢＳ３７５４（配列番号９９９）である。ＪＢＳ３７６１も同様に、アルブミン融合物の例である（配列番号１００５）。あるいは、または加えて、本発明のペプチドは、アルブミン結合ドメインとまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与したときにアルブミンと結合する脂肪酸と融合し、または複合体を形成する。アルブミン結合ドメインの一例は４−（ｐ−ヨードフェニル）−ブタン酸から誘導される部分である「ａｌｂｕタグ」である（Ｄｕｍｅｌｉｎら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４７：３１９６−３２０１（２００８））。他の適切な融合パートナーとしては、以下に限定されないが、プロリン−アラニン−セリン多量体（ＰＡＳ化）及びその抗体またはフラグメント（例えば、抗体のＦｃ部分）などがある。

【0026】

一実施形態において、本発明の２つ以上のペプチドは、共に融合して、多量体化ドメインによって連結して、または化学結合によって付着して、ペプチド複合体を生成する。当該多量体のペプチドは、同一であっても異なっていても良い。従って、本発明は、本明細書に記載のいずれかのペプチドを含み、またはそれからなり、１つまたは複数のリンカーが任意選択で付着する、ホモ二量体（すなわち、２つの同一ペプチドを含む二量体）、ホモ多量体（すなわち、３つ以上の同一ペプチドを含む複合体）、ヘテロ二量体（すなわち、２つの異なるペプチドを含む二量体）、及びヘテロ多量体（すなわち、３つ以上のペプチドを含み、ペプチドのうち少なくとも２つが異なる複合体）を提供する。代表的な多量体は、ＪＢＳ２５７２（配列番号６２）単量体の四量体であり、４０ｋＤで４本のアームのＰＥＧ部分によって共役している、ＪＢＳ３１７９（配列番号４３３）である。

【0027】

このとき、本発明は、第１のペプチド及び第２のペプチドを含むペプチド複合体を提供する。本明細書に記載のいずれのペプチドも、ペプチド複合体に適切なサブユニット（例えば、第１のペプチドまたは第２のペプチド）である。一部の実施形態において、ペプチド複合体は、２５〜１００アミノ酸を含み、例えば、３０〜８０アミノ酸、３０〜６０アミノ酸、または３０〜５０アミノ酸を含む。ペプチド複合体が媒介する少なくとも１つのプロテインＳ活性の阻害レベル（例えば、プロテインＳとＦＶａの結合、リン脂質結合、またはＡＰＣ補因子活性）は、本発明の様々な実施形態において、第１のペプチドまたは第２のペプチド（単独で、または任意選択で一緒に）によって達成される阻害レベルより任意選択で高い。本明細書に記載の単量体プロテインＳ結合ペプチドにおける機能的特性、治療上及び診断上の応用はまた、本明細書に記載のペプチド複合体に対しても適用可能である。同様に、単量体プロテインＳ結合ペプチドの修飾についての記述はまた、ペプチド複合体に関連する。

【0028】

本開示の様々な態様において、ペプチド複合体のペプチドサブユニット（例えば第１のペプチド及び第２のペプチド）は、直接共に融合しているか、またはリンカー部分によって結合している。任意のリンカー部分は、ペプチド複合体の文脈における使用に適切である。本発明の一部の態様において、リンカー部分は、その立体構造の１つにおいて約１Å〜約１００Å、例えば約５Å〜約８０Å（約５Å〜約５０Å）、約１０Å〜約７０Å（約１０Å〜約６０Å、約１０Å〜約５０Å、約１０Å〜約４０Å、または約１０Å〜約３０Å）の距離を架橋する。従って、リンカーはその立体構造の１つにおいて、任意選択で約１Å〜約１００Åの長さであり、例えば約５Å〜約５０Åまたは約１０Å〜約３０Åの長さである。より長い長さの（約１００Åより長い）リンカーも検討されている。例えば、約２ｋＤａ〜約６０ｋＤａの分子量を任意選択で有する生体適合性高分子も、ペプチド複合体における使用を検討されている。生体適合性高分子の例としては、以下に限定されないが、ＰＥＧ、ＰＳＡ、プロリン−アラニン−セリン多量体、及びヒドロキシエチルデンプンなどがある。リンカー部分及び反応性基についてのさらなる記述は、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１４３２０９号にて提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0029】

一態様において、リンカー部分は構造Ｚ_１−２０を含み、Ｚはオリゴマー構成単位である。オリゴマー構成単位の例としては、以下に限定されないが、アミノ酸、ヒドロキシ酸、エチレングリコール、プロピレングリコール、または前述のうちいずれかの組み合わせがある。例えば、リンカー部分は任意選択で、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、または４〜２０のアミノ酸を含むポリペプチドである。一部の実施形態において、ＺはＧ、ｓ、Ｓ、ａ、Ａ、Ｂａｌ、Ｇａｂａ、Ａｈｘ、Ｔｔｄｓ、または前述のうちいずれかの組み合わせ（例えば、Ａ、Ｓ、またはＡとＳの組み合わせを含む１０ｍｅｒペプチド）である。所望に応じて、連結部分はアミン、エーテル、チオエーテル、マレイミド、ジスルフィド、アミド、エステル、アルケン、シクロアルケン、アルキン、トリゾイル（ｔｒｉｚｏｙｌ）、カルバメート、カルボネート、またはヒドラゾンを含む。

【0030】

用語「第１のペプチド」及び「第２のペプチド」は、ペプチドの特定の物理的順序を意味することは意図されておらず、単にペプチド複合体の異なるサブユニットを区別することが意図されている。ペプチド複合体のサブユニットは、第１のペプチド及び第２のペプチドが標的（例えば、プロテインＳ）と相互作用する限り、任意の数の構成で連結していても良い。例えば、第１のペプチドのＣ末端が第２のペプチドのＮ末端に接続している、第１のペプチドのＮ末端が第２のペプチドのＣ末端に接続している、第１（または第２）のペプチドのＮ末端またはＣ末端が第２（または第１）のペプチドの内側の付着点に接続している、または第１及び第２のペプチドが内側の付着点（すなわち、いずれもがペプチドのアミノ酸配列内に位置し、Ｎ末端またはＣ末端には位置しない付着点）によって接続している。２つ以上のリンカーが使用されても良く、例えば、第１の連結部分が第１のペプチドのＮ末端及び第２のペプチドのＣ末端で付着し、第２の連結部分（同じタイプの部分であっても良く、異なるタイプの部分であっても良い）が第１のペプチドのＣ末端及び第２のペプチドのＮ末端で付着している。可能な構成についての議論は第１及び第２のペプチドに言及しているが、さらなるペプチドが本明細書に記載のように第１及び／または第２のペプチドに連結していても良いことが理解されるだろう。

【0031】

誘導体が本発明に含まれる。誘導体には、アミノ酸の付加、欠失、または置換とは別の何らかの方法で化学的に修飾されたペプチドが含まれる。このとき、本明細書で提供されるペプチドは、ポリマー、脂質、他の有機的部分、及び／または無機的部分に化学的に結合している。ペプチド及びタンパク質の修飾の例は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９６）に示されている。本明細書に記載のペプチドは、他の部分（例えば、ペプチド部分）とのコンジュゲートを促進する官能基を任意選択で含む。例示的な官能基としては、以下に限定されないが、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、スルホニルクロリド、アルデヒド、エポキシド、オキシラン、カルボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ハロゲン化アルキル誘導体（例えば、ハロアセチル誘導体）、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、チオール−ジスルフィド交換試薬（例えば、ピリジルジスルフィドまたはＴＮＢチオール）、ジアゾアルカン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’−ジスクシニルカルボネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、及びヒドラジン誘導体などがある。マレイミドは、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでアルブミンと結合するプロテインＳ結合ペプチドを生成するのに有用である。

【0032】

一態様において、本発明には、共有結合的に修飾されて１つ以上の水溶性高分子の付着を含む本明細書に記載のペプチドが含まれる。水溶性高分子（または他の化学的部分）は任意のアミノ酸残基に付着するが、一部の実施形態ではＮ末端またはＣ末端への付着が好ましい。有用な高分子としては、以下に限定されないが、ＰＥＧ（例えば、大きさがおよそ４０ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋＤ、５ｋＤ、または１ｋＤのＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、セルロース、ポリー（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール、さらに前述のうちいずれかの混合物などがある。一態様において、本発明のペプチドは、ＰＥＧ化ペプチドである。ＰＥＧ部分は種々の形をとることが可能で、例えば、直鎖状も分枝状も可能である。例示的なＰＥＧ化ペプチドとして、Ａｈｘ（６−アミノヘキサン酸）によってＮ末端にて及びＬｙｓのεアミノ基によってＣ末端終端にて２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ部分に付着しているＪＢＳ３２１６（配列番号４６２）のアミノ酸配列を含むＪＢＳ３７５５（配列番号１０００）、ならびに２０ｋＤのＰＥＧ部分が分岐しているＪＢＳ３７５７（配列番号１００２）などがある。水溶性高分子の付着のさらなる議論については、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；及び第４，１７９，３３７号を参照されたい。ペプチドの半減期または安定性を向上させる有用な他の部分が本明細書に記載されており、例えば、アルブミン（本発明のペプチドとコンジュゲート可能なように任意選択で修飾される）、脂肪酸鎖（例えば、Ｃ１４脂肪酸のようなＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸、またはオクタデカンジカルボン酸（ｏｄｄｃ）のようなジカルボン酸）、抗体またはそのフラグメント（例えば、抗体のＦｃ部分）、及びプロリン−アラニン−セリン多量体などがある。

【0033】

別の態様において、ペプチド誘導体には特定の細胞型、組織、及び／または器官に特異的な標的部分が含まれる。あるいは、ペプチドは、精製、検出、多量体化、相互作用パートナーとの結合、及びペプチド活性のキャラクタリゼーションを促進する１つまたは複数の化学的部分に結合している。例示的な化学的部分は、ビオチンである。本発明のペプチドへのコンジュゲートに適切な他の部分としては、以下に限定されないが、光増感剤、色素、蛍光色素、放射性核種、放射性核種含有複合体、酵素、毒素、及び細胞毒などがある。光増感剤としては、例えば、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ、Ｌｅｖｕｌａｎ、Ｆｏｓｃａｎ、Ｍｅｔｖｉｘ、Ｈｅｘｖｉｘ（登録商標）、Ｃｙｓｖｉｅｗ^（商標）、Ｌａｓｅｒｐｈｙｒｉｎ、Ａｎｔｒｉｎ、Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ、Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓ、Ｐｈｏｔｒｅｘ、Ｌｕｍａｃａｎ、Ｃｅｖｉｒａ、Ｖｉｓｏｎａｃ、ＢＦ−２００ ＡＬＡ、及びＡｍｐｈｉｎｅｘなどがある。所望に応じて、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｓｔｒｅｐタグ、またはｍｙｃタグがペプチドに結合している。

【0034】

加えて、一態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＮ末端アミノ酸でアシル化されている。別の態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＣ末端アミノ酸でアミド化されている。なおさらなる態様において、本発明のペプチドは、ペプチドのＮ末端アミノ酸でアシル化され、ペプチドのＣ末端アミノ酸でアミド化されている。

【0035】

誘導体にもまた、修飾若しくは非タンパク質構成アミノ酸、または修飾リンカー基を含むペプチドが含まれる（例えば、Ｇｒａｎｔ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）を参照されたい）。修飾アミノ酸としては、例えば、アミノ基及び／またはカルボキシル基が別の基に置き換えられているアミノ酸などがある。非限定的な例としては、チオアミド、尿素、チオ尿素、アシルヒドラジド、エステル、オレフィン、スルホンアミド、リン酸アミド、ケトン、アルコール、ボロン酸アミド、ベンゾジアゼピン、及び他の芳香族または非芳香族のヘテロ環を組み込んだ修飾アミノ酸などがある（Ｅｓｔｉａｒｔｅら，Ｂｕｒｇｅｒｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第６版，Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｐａｒｔ ４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００２））。非タンパク質構成アミノ酸としては、以下に限定されないが、β−アラニン（Ｂａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、タウリン、サルコシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、システイン酸（Ｃｏｈ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、メチオニンスルホキシド（Ｍｅｏ）、メチオニンスルホン（Ｍｏｏ）、ホモセリンメチルエステル（Ｈｓｍ）、プロパルギルグリシン（Ｅａｇ）、５−フルオロトリプトファン（５Ｆｗ）、６−フルオロトリプトファン（６Ｆｗ）、３´，４´−ジメトキシフェニル−アラニン（Ｅａｒ）、３´，４´−ジフルオロフェニルアラニン（Ｄｆｆ）、４´−フルオロフェニル−アラニン（Ｐｆｆ）、１−ナフチル−アラニン（１Ｎｉ）、２−ナフチルアラニン（２Ｎｉ）、１−メチルトリプトファン（１Ｍｗ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ベンゾチエニルアラニン（Ｂｔａ）、Ｌ−ホモ−システイン（Ｈｃｙ）、Ｎ−メチル−フェニルアラニン（Ｎｍｆ）、２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、３，３−ジフェニルアラニン（Ｅｂｗ）、Ｌ−アルファ−ｔ−ブチルグリシン（Ｔｌｅ）、Ｂｐａ、ホモフェニルアラニン（Ｈｆｅ）、及びＳ−ベンジル−Ｌ−システイン（Ｅｃｅ）などがある。これら及び他の非タンパク質構成アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−異性体として存在しうる。修飾リンカーの例としては、以下に限定されないが、可動性リンカーである４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（Ｔｔｄｓ）、グリシン、６−アミノヘキサン酸、ベータ−アラニン（Ｂａｌ）、ペンチン酸（Ｐｙｎ）、ならびにＴｔｄｓ、グリシン、６−アミノヘキサン酸及びＢａｌの組み合わせなどがある。

【0036】

本発明のペプチドを構成するアミノ酸のホモログは、表１に示される通りになりうる。任意の実施形態において、本発明のペプチドの１つまたは複数のアミノ酸は、表１に示されるアミノ酸または構成単位に置換される。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0037】

一部の実施形態において、本発明のペプチド内でアミノ酸をつなぐペプチド（ＣＯ−ＮＨ）結合は反転され、「レトロ修飾（ｒｅｔｒｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」ペプチド、すなわち参照ペプチドと比較して逆方向に構築（ＮＨ−ＣＯ結合）されたアミノ酸残基を含むペプチドを作る。レトロ修飾ペプチドは、参照ペプチドと同じアミノ酸キラリティーを含む。「インベルソ修飾（ｉｎｖｅｒｓｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」ペプチドは、参照ペプチドと同方向に構築されたアミノ酸残基を含む本発明のペプチドだが、アミノ酸のキラリティーが反転している。従って、参照ペプチドがＬ−アミノ酸を含む場合、「インベルソ修飾」ペプチドはＤ−アミノ酸等を含み、逆も同様である。インベルソ修飾ペプチドは、ＣＯ−ＮＨペプチド結合を含む。「レトロ−インベルソ修飾」ペプチドは、逆方向に構築されキラリティーを反転させたアミノ酸残基を含むペプチドを指す。レトロ−インベルソアナログは、ペプチド結合（すなわち、ＮＨ−ＣＯ）と逆の末端と方向を有するが、参照ペプチドに見出される側鎖のトポロジーはほぼ保っている。レトロ−インベルソペプチドミメティックは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｚｉｅｒｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９，３２３０−３２３７（１９９７）に記載の方法を含む標準的な方法を用いて作られる。部分レトロ−インベルソペプチドは、アミノ酸配列部分のみが逆転しエナンチオマーのアミノ酸残基に置き換えられているペプチドである。

【0038】

本発明のペプチドは、様々な方法で作られる。一態様において、ペプチドは、以下の文献に記載された内容を含む固相合成技術によって合成される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９（１９６３）；Ｄａｖｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．，１０，３９４−４１４（１９８５）；Ｌａｒｓｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５，６２４７（１９９３）；Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４４，１８３（１９９４）；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，６０７０（１９９６）；Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ（１９６９）；Ｆｉｎｎら，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第３版，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１０５−２５３（１９７６）；及びＥｒｉｃｋｓｏｎら，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第３版，ｖｏｌ．２，ｐｐ．２５７−５２７（１９７６）。本発明は、合成ペプチドについて検討する。あるいは、ペプチドは、ペプチド発現のために培養する宿主細胞に本発明のペプチドをコードする核酸を導入することによって、組換えで発現される。このようなペプチドは、培地または細胞ペレットから精製される。

【0039】

本発明にはまた、本発明のペプチドをコードする核酸配列を含む核酸が含まれる。ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ分子の調製方法は、当技術分野において公知である。所望に応じて、ペプチドコード配列は、発現ベクターに組み込まれる。当業者は、以下に限定されないが、プラスミド、プラスミド−リポソーム複合体、ウイルスベクターのような、当技術分野において公知の複数の発現ベクターのいずれであっても、本発明の文脈において適切であることを理解するだろう。これらの発現ベクターのいずれも、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製される。任意選択で、核酸は、例えばプロモーター、アクティベーター、エンハンサー、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、または転写若しくは翻訳の制御に関わる他のシグナルのような、１つまたは複数の制御配列に機能的に連結している。

【0040】

また、本発明のペプチド（若しくはペプチド複合体）または当該ペプチドをコードする核酸のいずれも、組成物（例えば、医薬組成物）にて提供される。このとき、ペプチド（またはペプチド複合体）は、本明細書でさらに記載される、生理的に許容される（すなわち、薬理的に許容される）担体、緩衝液、賦形剤、または希釈剤を用いて処方される。任意選択で、ペプチドは、本発明に含まれる、生理的に許容される塩の形をとる。「生理的に許容される塩」は、医薬的に許容される任意の塩を意味する。適した塩の例の一部としては、酢酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、及びシュウ酸塩などがある。所望に応じて、組成物は１つまたは複数のさらなる医薬的に有効な薬剤を含む。

【0041】

本明細書で提供されるペプチドは、好ましくはプロテインＳに結合し、以下に限定されないが、例えば血液凝固カスケードを下方制御する活性、といったプロテインＳ活性を少なくとも１つ、任意選択で阻害する。ペプチドは、いかなる特定の作用メカニズムに制約されることなく、プロテインＳが活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）、第Ｖ因子、または脂質表面と（競合的またはアロステリックに）結合することを阻害しても良く、それによってプロテインＳによる自然発生の凝固阻害を制限する。プロテインＳ活性が減弱すると、ＦＶａ及びＦＶＩＩＩａが容易に分解されず、阻害されるＦＸａが少なくなり、結果的にプロトロンビンからトロンビンへの変換が強化される。

【0042】

一態様において、本発明のペプチドは、モデル系及び／または血漿系においてプロテインＳアンタゴニスト活性を示す。例示的な血漿ベースのアッセイは、外因性凝固経路によって開始するプロテインＳ／ＡＰＣ依存のトロンビン生成を調べる（Ｎｉｃｏｌａｅｓ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，８：２８（１９９７））。プロテインＳは、血漿内ＡＰＣの抗凝固効果を強化する。トロンビン形成は、候補ペプチドの存在下においてＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ活性が大きく欠乏している（例えば、残存する凝固因子活性が１％未満）血漿で誘発される。トロンビン形成は、例えば、蛍光発生基質または発色基質を用いて検出される。トロンビン活性の計測システムは、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって提供される。プロトロンビン変換は、例えばＴｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈ^（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって計測され、得られたデータはＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶから入手可能なＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ^（商標）ソフトウェアが生成する校正自動トロンボグラム（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）（ＣＡＴ）にコンパイルされる。様々な実施形態において、ペプチドは、プロテインＳ／ＡＰＣ依存トロンビン生成アッセイにおいて、約２０ｎＭ〜約１００μＭ（例えば、約４０ｎＭ〜約５０μＭ）のＥＣ５０を示す。

【0043】

特定の実施形態において、プロテインＳ阻害ペプチドは、アッセイの間ピークトロンビン生成量を増加させ、及び／またはピークトロンビン形成の達成に必要な時間を減少させる。例えば、ペプチドは、ＦＶＩＩＩ非存在下での（例えば、ＦＶＩＩＩが枯渇した血漿内での）プロテインＳ制御トロンビン生成を、正常な血漿におけるプロテインＳ依存トロンビン生成レベルの少なくとも１％まで向上させる。一般的には、正常な（罹患していない）血漿は、約０．５Ｕ／ｍＬ〜約２Ｕ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子を含有する。従って、ある場合において、プロテインＳ結合ペプチド（例えば、プロテインＳ阻害ペプチド）は、ＦＶＩＩＩ非存在下でのトロンビン形成を、０．５Ｕ／ｍＬ〜２Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩＩ存在下で観測されるトロンビン形成の少なくとも約１％強化することになるだろう。

【0044】

様々な態様において、ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでのプロテインＳ阻害活性の特性を決定するために、トロンビン欠乏症または血友病の動物モデルに投与される。このようなｉｎ ｖｉｖｏのモデルは当技術分野において公知であり、例としては、血友病Ａを引き起こすために抗ＦＶＩＩＩ抗体を投与されたマウス（Ｔｒａｎｈｏｌｍら，Ｂｌｏｏｄ，１０２，３６１５−３６２０（２００３））；凝固因子ノックアウトモデル、例えば以下に限定されないが、ＦＶＩＩＩノックアウトマウス（Ｂｉら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１０（１），１１９−１２１（１９９５））及びＦＩＸノックアウトマウス（Ｗａｎｇら，ＰＮＡＳ，９４（２１），１１５６３−６６（１９９７））；ウサギにおいて引き起こされた血友病Ａ（Ｓｈｅｎら，Ｂｌｏｏｄ，４２（４），５０９−５２１（１９７３））；及びチャペルヒルのＨＡイヌ（Ｌｏｚｉｅｒら，ＰＮＡＳ，９９，１２９９１−１２９９６（２００２））などがある。

【0045】

様々なペプチドが、以下に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、モルモット、及び霊長類を含む任意のソースからのプロテインＳと結合する。一実施形態において、ペプチドはヒトプロテインＳと結合する。任意選択で、本発明のペプチドは、２つ以上の種からのプロテインＳと結合する（すなわち、ペプチドは複数の種間で交差反応性がある）。特定の態様において、ペプチドは、解離定数（Ｋ_Ｄ）が１×１０^−４Ｍ以下、１×１０^−５Ｍ以下、１×１０^−６Ｍ以下、または１×１０^−７Ｍ以下、または１×１０^−８Ｍ以下、または１×１０^−９Ｍ以下、または１×１０^−１０Ｍ以下で、プロテインＳと結合する。

【0046】

親和性は、例として、以下に限定されないが、様々な技術、例えば親和性ＥＬＩＳＡ（ＥＣ５０）アッセイ、競合ＥＬＩＳＡ（ＩＣ５０）アッセイ、競合ＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイ（例えば、本明細書に記載の同種のユーロピウムベースのＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ）及び／または表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ^（商標））など、の中から任意の１つ、２つ、またはそれ以上を用いて判定されうる。ＥＬＩＳＡベースの親和性（ＥＣ５０）アッセイ（例えば、実施例１に記載のアッセイ）を用いるとき、任意選択で、ペプチドは、１×１０^−４Ｍ、１×１０^−５Ｍ以下、１×１０^−６Ｍ以下、１×１０^−７Ｍ以下、１×１０^−８以下、または１×１０^−９Ｍ以下のＥＣ５０を示す。競合（ＩＣ５０）ＥＬＩＳＡアッセイまたはＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイを用いて特性決定するとき、本発明のペプチドは約１０，０００ｎＭ以下のＩＣ５０を任意選択で示す。例えば、ペプチドは、約５，０００ｎＭ以下、約１，０００ｎＭ以下、約５００ｎＭ以下のＩＣ５０を示す。一態様において、ペプチドは、約２５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下（例えば、約９ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約７ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下）のＩＣ５０を示す。任意選択で、競合アッセイはＪＢＳ０６８４（配列番号１）を「トレーサー」（すなわち、競合ペプチド）として利用する。従って、様々な実施形態において、ペプチドは、配列番号１（ＪＢＳ０６８４）のアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）ペプチドをトレーサーとして用いる競合ＬＡＮＣＥアッセイにおいて、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトプロテインＳと結合する。例示的なペプチド及びそのＩＣ５０値は、図１にて提供されている。

【0047】

本発明のペプチドを特性決定するための適切な他のアッセイとして、ペプチドのプロテインＳからの解放を試験するｋ_ｏｆｆアッセイがある。ｋ_ｏｆｆアッセイの結果は解離速度定数ではなく、プロテインＳとのインキュベート期間後にテストペプチドによってプロテインＳ結合からブロックされた競合ペプチドの百分率である。例示的なｋ_ｏｆｆアッセイとしては、以下のステップが含まれる：１）プロテインＳが結果としておよそ９０％を占めるようなテストペプチド量を用いたプロテインＳ被覆マイクロタイタープレートのインキュベーション；２）非結合テストペプチドの除去；３）プロテインＳへの結合でテストペプチドと競合するビオチン化されたトレーサー（すなわち、競合）ペプチド（例えばＪＢＳ０６８４）の添加；４）テストペプチドが解放した結合部位をトレーサーが占有する一定時間のインキュベーション；５）非結合トレーサー及びテストペプチドの除去；及び６）ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを用いた発色反応による結合トレーサーの検出。結果として得られたシグナルは、テストペプチドが解放した結合部位を示す。インキュベーション期間内にプロテインＳから解離しないテストペプチドは、完全に解離する分析物と比較して弱いシグナルをもたらす。任意選択で、ペプチドは、１×１０^−３ｓ^−１以下、１×１０^−４ｓ^−１以下、１×１０^−５ｓ^−１以下、１×１０^−６ｓ^−１以下、または１×１０^−７ｓ^−１以下のｋ_ｏｆｆを示す。

【0048】

全ての結合剤及び結合アッセイと同様に、当業者は、生体的に（例えば、治療的に）有効であるためには結合剤が検出可能な程度に結合すべきでない様々な部分について、列挙するのは消耗的であり非実用的となるだろうことを認識する。従って、用語「ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ（特異的に結合する）」は、ペプチドがプロテインＳに対して、プロテインＳではない無関連な対照タンパク質に対してよりも、より高い親和性で結合する能力を意味する。例えば、ペプチドはプロテインＳに対して、対照タンパク質に対してよりも、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２５倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、または１０，０００倍高い親和性で結合しうる。一部の実施形態において、ペプチドは、結合すると逆の効果がもたらされうる、タンパク質またはヒト内に天然で存在する他の物質「抗標的」に対してよりも高い親和性で、プロテインＳに結合する。プロテインＳ阻害ペプチドは、血流及び／または内皮において活性を発揮するので、血漿タンパク質は潜在的な抗標的となる。プロテインＳはまた、凝固系タンパク質における、Ｇｌａドメイン含有の（例えば、ＧＡＳ６、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＺ、及びプロトロンビン）、ＥＧＦ様ドメイン含有の（例えば、ＧＡＳ６、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＺ、及びトロンボモジュリン）、及びラミニンＧ様ドメイン含有の（例えば、ＧＡＳ６）他のタンパク質に対し、相同性の高いドメインを持つ多ドメインタンパク質である。これらのドメインを有するタンパク質もまた、潜在的な抗標的である。様々な実施形態において、ヒトＧＡＳ６は、プロテインＳに対する相同性（４２％同一、５７％共通配列）のため、抗標的である。従って、一態様において、本発明のペプチドはプロテインＳに対して、ヒトＧＡＳ６のような抗標的に対する親和性よりも、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２５倍、５０倍、または１００倍高い親和性で結合する（例えば表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）のような、任意の適切な方法を用いて試験される）。

【0049】

任意選択で、本発明のペプチドは、本明細書に記載の１つまたは複数の所望の特性を示し、ペプチドのアミノ酸配列は、所望に応じて、結合、安定性、及び／または活性を最適化するよう修飾されうる。例示的なペプチドは、１０μＭ以下のＫ_ＤでプロテインＳと結合し、及び／または、プロテインＳへの結合親和性を抗標的への結合親和性より少なくとも１０倍高く示す。あるいはまたは加えて、前記ペプチドは、プロテインＳが欠乏しプロテインＳ及びＡＰＣを補充した血漿またはＦＶＩＩＩが阻害された／欠乏した血漿におけるトロンビン生成を、１０μＭ以下のＥＣ５０（本明細書に記載のアッセイのような任意の適切なアッセイを用いて測定）で強化し、及び／または、第ＶＩＩＩ因子活性非存在下でのプロテインＳ依存トロンビン生成を、正常な第ＶＩＩＩ因子活性を含有する血漿におけるトロンビン形成レベルの少なくとも２０％（例えば、４０％）向上させる。あるいはまたは加えて、前記ペプチドは所望レベルの血漿安定性を達成し（例えば、投与量の５０％以上がヒト血漿内に６時間後または１２時間後残存する、または投与量の５０％以上がマウス血漿内に４時間後または８時間後残存する）、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで所望の半減期を示し（例えば、少なくとも２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、または１０時間）、及び／または所望レベルの溶解性を示す。あるいはまたは加えて、本発明のペプチドは、例えば静脈または皮下投与後のバイオアベイラビリティ所望レベルのような、バイオアベイラビリティ所望レベルを示し（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、または５０％以上）、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏでの所定の投与で所望レベルのプロテインＳ阻害活性を示す。

【0050】

本発明には、プロテインＳを阻害する方法がさらに含まれる。当該方法は、プロテインＳを本明細書に記載のペプチドと接触させることを含む。任意選択で、当該方法は、対象におけるプロテインＳを阻害することを含み、当該方法は、ペプチドをプロテインＳ活性阻害に有効な量で対象に投与することを含む。プロテインＳ活性阻害の任意の程度が検討されている。例えば、本発明のペプチドは、凝固カスケードのプロテインＳ阻害を少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％）低下させる。一部の実施形態において、ペプチドは、ペプチド非存在下でのプロテインＳ活性と比較して、プロテインＳ活性を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％低下させる。

【0051】

本発明の一態様において、本発明のペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテインＳを検出及び／または定量化するために使用される。プロテインＳを試料内で検出及び／または定量化する例示的な方法は、（ａ）試料を本発明のペプチドと接触させること、及び（ｂ）プロテインＳに対するペプチドの結合を検出することを含む。前記方法は、プロテインＳが適切な診断マーカーである場合における疾患の治療及び診断に有用である。ペプチド−プロテインＳ複合体は、直接的にまたは間接的に検出される。検出部分は、生体物質の同定に当技術分野で広く使用されており、例えば、色素（例えば、蛍光色素）、放射性核種及び放射性核種含有複合体、及び酵素などがある。検出を可能にする部分は、ペプチドに任意選択で付着またはコンジュゲートしている。一部の態様において、ペプチド−プロテインＳ結合は、間接的に検出される。このとき、ペプチドは、ペプチド−プロテインＳ結合に著しく干渉することなく本発明のペプチドと結合する相互作用パートナーと任意選択で接触され、相互作用パートナーが検出される。例示的な相互作用パートナーとしては、以下に限定されないが、抗体、抗原結合抗体フラグメント、アンチカリン及び抗体模倣物、アプタマー、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、及びシュピーゲルマーなどがある。任意選択で、相互作用パートナーは、相互作用パートナー−ペプチド複合体の検出を促進する検出部分を含む。ペプチドは、一部の実施形態において、相互作用パートナーの結合を促進するよう修飾される。例えば、一態様において、本発明のペプチドは、ストレプトアビジンを含む相互作用パートナーに結合しているビオチンにコンジュゲートしている。例示的な相互作用パートナーは、例えばＥＬＩＳＡに類似したアッセイで検出されるセイヨウワサビペルオキシダーゼと融合しているストレプトアビジンを含む。あるいは、本発明のペプチドは、抗体エピトープを含むよう修飾され、対応する抗体のペプチド−プロテインＳ複合体に対する結合が検出される。

【0052】

ペプチド−プロテインＳ複合体及び相互作用パートナー−ペプチド複合体は、例えば、以下に限定されないが、生化学的アッセイ（例えば、酵素アッセイ）、分光法（例えば、光学濃度、蛍光、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、蛍光偏光、電気化学発光、またはＮＭＲに基づいた検出）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、及び単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のような、多数の方法のいずれかを用いて同定される。ペプチド−プロテインＳ複合体または相互作用パートナー−ペプチド複合体の蛍光検出を促進する検出可能部分としては、以下に限定されないが、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ^（商標）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ^（商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ^（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ^（商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、テトラメチルローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ローダミンＢ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ^（商標）−Ｘ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、及び蛍光タンパク質（ＧＦＰ及びその誘導体）などがある。

【0053】

本発明はまた、異常なプロテインＳ活性に関連するまたはそれに起因する疾患若しくは障害にかかっている、または疾患若しくは障害にかかる危険性のある対象の診断方法を提供する。当該方法は、本発明のペプチドの対象への投与及びプロテインＳ−ペプチド複合体の検出を含む。複合体の検出は、上述されている。複合体の存在はプロテインＳの存在を意味し、それによってプロテインＳに関連する疾患または障害の診断が可能になる（例えば、（ｉ）プロテインＳ阻害によって治療されうる疾患または障害、または（ｉｉ）プロテインＳを阻害することによって回復または予防されうる症状を含む疾患または障害）。もし対象に対するペプチド投与が所望されなければ、対象から生体試料を取得し、本明細書に記載のペプチドと接触させ、プロテインＳ−ペプチド複合体を検出する。本明細書に記載のペプチドの使用方法はまた、本明細書に記載のペプチド複合体の使用のいずれかを含むことが理解されるだろう。

【0054】

例えば血栓形成傾向、静脈血栓症、及び肺塞栓症のような、一部の疾患及び障害は、プロテインＳレベルの低下と関連している。プロテインＳ欠乏は遺伝性、または、例えばビタミンＫ欠乏、ワルファリン治療、妊娠、感染症、及び肝疾患の結果でありうる。欠乏を検出するために、方法はプロテインＳの定量化を任意選択で伴う。もし生体試料におけるプロテインＳが所望の閾値を下回る場合、疾患または障害の治療が開始される。ある場合において、治療は抗凝固療法（例えば、ヘパリンまたはワルファリン治療）を含む。

【0055】

本明細書に記載のペプチドは好ましくはプロテインＳに結合し、従って、生体試料（例えば、血清のような生体液）、発酵抽出物、組織標本、培地などからのプロテインＳ（例えば、組換え型のプロテインＳ）精製に有用である。ペプチドはまた、以下に限定されないが、例えばＣ４ＢＰのような、プロテインＳと相互作用するタンパク質の精製に有用である。本発明には、プロテインＳの商業生産における、またはプロテインＳの特性決定方法における、本発明のペプチドの使用方法が含まれる。例えば、本発明には、プロテインＳの精製方法が含まれる。当該方法は、プロテインＳとペプチド間の複合体形成に適した条件下で、プロテインＳを含有する試料を本明細書で規定されたペプチドと接触させること、試料から複合体を除去すること、及び、任意選択で、複合体を分離してプロテインＳを解放することを含む。プロテインＳとペプチド間の複合体形成に適した例示的な条件が実施例に開示されている。一部の実施形態において、ペプチドは、プロテインＳの回収を促進するために、例えば固体支持体のような支持体に固定する。例えば、一実施形態において、ペプチドをクロマトグラフィーの固定相（例えば、シリカ、アフィニティークロマトグラフィービーズ、またはクロマトグラフィー樹脂）に固定し、プロテインＳを含む試料をプロテインＳ−ペプチド複合体が形成されるように固定相に適用し、試料の残部を固定相から除去し、プロテインＳを固定相から溶出する。このとき、本発明のペプチドは、一態様において、アフィニティークロマトグラフィー手法での使用に適切である。

【0056】

また、対象におけるトロンビン形成の強化方法が提供される。方法は、プロテインＳ阻害に有効な条件下において本明細書で提供されるペプチドを対象に投与することを含む。このとき、ペプチドは、対象におけるトロンビン形成強化に有効な量及び条件の下で投与される。本発明の様々な態様において、対象は「凝血因子欠乏」であり、つまり対象は、例えばＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、またはＦＸＩのような、トロンビン形成に必要な１つまたは複数の血液因子が欠乏している。実際に、一実施形態において、対象はＦＶＩＩＩが欠乏している。凝血因子欠乏は、臨床試料における因子の量を調べることによって同定される。実施者は、凝血因子欠乏の規模に従って血友病を分類する。軽度の血友病にかかっている対象は、正常量（１Ｕ／ｍｌ）のおよそ５％〜３０％の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を有する。中度の血友病は、正常な第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第ＸＩ因子のレベルのおよそ１％〜５％であることによって特徴づけられ、一方重度の血友病にかかっている対象は、正常量の１％未満の第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第ＸＩ因子を有する。欠乏は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験によって間接的に同定されうる。本発明は、凝血因子欠乏にかかっていない対象におけるトロンビン形成強化をさらに含む。方法は、トロンビン形成強化に有効な条件下で、本明細書で提供されるペプチドを対象（例えば、凝血因子が正常な生理的レベルを備える対象）に投与することを含む。

【0057】

一態様において、ペプチドは、対象における血餅形成の増加に使用される。血餅形成の増加方法は、血餅形成増加に有効な量及び条件下で、本明細書に記載のペプチドを対象に投与することを含む。方法が有益な（例えば、治療的な）効果を達成するには、凝固カスケードを完全には回復させなくても良いことが理解されるだろう。凝血因子欠乏に関連する症状の発症または重症度を低下させるトロンビンまたは血餅形成における任意の強化または増加が検討されている。トロンビン形成及び凝血の促進における方法の有効性を判定する方法は、当技術分野で公知であり本明細書に記載されている。

【0058】

本発明には、対象における血液凝固障害の治療方法、すなわち対象における血液凝固障害の治療に有効な量及び条件の下で、対象に１つまたは複数の本発明のペプチド（または、ペプチド複合体）（すなわち、本明細書に記載のペプチドのいずれか１つまたは複数）を投与することを含む方法がさらに含まれる。「凝固障害」には、血液凝固因子活性の欠乏及び血小板活性の欠乏によって引き起こされる出血系障害（例えば、凝血能低下）が含まれる。血液凝固因子には、以下に限定されないが、第Ｖ因子（ＦＶ）、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩＩ（低プロトロンビン血症の原因となる）及びｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子が含まれる。因子欠乏は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの因子の半減期短縮、因子の結合特性変化、因子の遺伝子的欠陥、及び因子の血漿濃度低下によって引き起こされる。凝固障害は、先天的または後天的でありうる。凝固障害はまた、凝血因子に対するインヒビターまたは自己免疫（例えば、抗体）の発達に由来する。一例において、凝固障害は、血友病Ａである。あるいは、凝固障害は、血友病Ｂまたは血友病Ｃである。

【0059】

血小板障害は、血小板の機能不全または異常な循環血小板数減少によって引き起こされる。血小板数減少は、例えば、産生不足、血小板隔離、または抑制されない開存性破壊（ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐａｔｅｎｔ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によって引き起こされうる。血小板減少症（血小板欠乏症）は、化学療法及び他の薬物療法、放射線療法、手術、偶発的失血、及び他の病態を含めた様々な原因で存在しうる。血小板減少症を含めた例示的な病態として、以下のものがある：再生不良性貧血、乳がんに関連した特発性血小板減少性紫斑病を含む特発性または免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）；ＨＩＶ随伴性ＩＴＰ及びＨＩＶに関連した血栓性血小板減少性紫斑病；血小板減少症の原因となる転移性腫瘍；新生児ループス症候群脾腫を含む全身性エリテマトーデス；Ｆａｎｃｏｎｉ症候群；ビタミンＢ１２欠乏症；葉酸欠乏症；Ｍａｙ−Ｈｅｇｇｌｉｎ異常；Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群；慢性肝疾患；血小板減少症に関連した骨髄異形成症候群；発作性夜間ヘモグロビン尿症；Ｃ７Ｅ３ Ｆａｂ（アブシキシマブ）療法後の急性深在性血小板減少症；母性同種免疫性血小板減少症を含む同種免疫性血小板減少症；抗リン脂質抗体及び血栓症に随伴する血小板減少症；自己免疫性血小板減少症；カルボプラチン誘発血小板減少症及びヘパリン誘発血小板減少症を含む薬剤性免疫性血小板減少症；胎児血小板減少症；妊娠性血小板減少症；Ｈｕｇｈｅｓ症候群；ルポイド血小板減少症；偶発性及び／または大量失血；骨髄増殖性障害；悪性腫瘍患者における血小板減少症；がん患者に血栓性血小板減少性紫斑病／溶血性尿毒症候群として現れる血栓性微小血管症を含む血栓性血小板減少性紫斑病；輸血後紫斑病（ＰＴＰ）；自己免疫性溶血性貧血；潜在性空腸憩室穿孔；赤芽球ろう；自己免疫性血小板減少症；流行性腎症；リファンピシンに随伴する急性腎不全；Ｐａｒｉｓ−Ｔｒｏｕｓｓｅａｕ血小板減少症；新生児同種免疫性血小板減少症；発作性夜間ヘモグロビン尿症；胃がんにおける血液変化；溶血性尿毒症候群（例えば、小児期における尿毒状態）；及びＡ型肝炎ウイルス及びＣＭＶ随伴性血小板減少症を含むウイルス感染に関連した血液所見。また血小板障害としては、以下に限定されないが、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ病、腫瘍随伴性血小板機能異常症、Ｇｌａｎｚｍａｎ血小板無力症、及びＢｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ病などがある。さらなる出血系障害としては、以下に限定されないが、外傷によって誘発される出血状態、１つまたは複数の接触因子（例えばＦＸＩ、ＦＸＩＩ、プレカリクレイン及び高分子キニノーゲン（ＨＭＷＫ））の欠乏、ビタミンＫ欠乏症、フィブリノーゲン障害（無フィブリノーゲン症、低フィブリノーゲン症、及び異常フィブリノーゲン血症を含む）、及びアルファ２−アンチプラスミン欠乏症などがある。一実施形態において、本発明のペプチドは、例えば、手術、外傷、脳内出血、肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能異常症、血腫、内出血、関節血症、低体温症、月経、妊娠、及びデング出血熱によって引き起こされる過度の出血のような、過度の出血の治療に使用される。上記全ては、本開示の文脈において「血液凝固障害」と考えられる。

【0060】

一態様において、本発明のペプチドは、対象における１つまたは複数の抗凝固薬の効果を（全体的または部分的に）反転させるのに使用される。多数の抗凝固薬が当技術分野において公知であり、例えば、ヘパリン；例えばワルファリンまたはジクマロールのようなクマリン誘導体；ＴＦＰＩ；ＡＴＩＩＩ；ループス抗凝固薬；線虫抗凝固薬ペプチド（ＮＡＰｃ２）；ＦＶＩＩａインヒビター；活性部位ブロックＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａｉ）；活性部位ブロックＦＩＸａ（ＦＩＸａｉ）；ＦＩＸａインヒビター；フォンダパリナックス（ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ）、イドラパリナックス（ｉｄｒａｐａｒｉｎｕｘ）、ＤＸ−９０６５ａ、及びラザキサバン（ｒａｚａｘａｂａｎ）（ＤＰＣ９０６）を含むＦＸａインヒビター；活性部位ブロックＦＸａ（ＦＸａｉ）；活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）及び水溶性トロンボモジュリンを含むＦＶａまたはＦＶＩＩＩａインヒビター；ヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、及びキシメラガトランを含むトロンビンインヒビター；及び凝血因子と結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩＩ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、プレカリクレイン、または高分子キニノーゲン（ＨＭＷＫ））などがある。

【0061】

本明細書において、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療）」及び「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」は、疾患または障害（例えば、血液凝固障害）に随伴する症状の重症度及び／または発症の任意の低減を意味する。当業者は、障害またはそれに随伴する症状からの保護または改善は、任意の程度において、例えばヒト患者のような対象に有益であることを理解するだろう。患者の生活の質は、対象における症状の重症度を任意の程度で低下させる及び／または症状の出現を遅らせることによって、改善される。従って、一態様における方法は、対象が血液凝固障害にかかる危険性があると判定（例えば、凝固因子の欠乏（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、またはＦＸＩ）が検出される、または抑制的な抗体が検出される）された後可能な限り速やかに、または血液凝固障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、または血友病Ｃ）が検出された後可能な限り速やかに、実施される。さらなる一態様において、ペプチドは、傷害時または手術時の過度な失血から全体的または部分的に保護するために、投与される。

【0062】

上記を考慮して、本発明は、医薬で使用するための、すなわち、例えばプロテインＳの阻害が有益な場合における疾病の治療方法のような、対象の治療方法で使用するためのペプチド（またはペプチド複合体）を提供する。一態様において、疾病または障害は、血液凝固障害である。対象は、疾病若しくは障害にかかっており、または疾病若しくは障害（または、例えば過度の失血のような、不利な生体現象）にかかる危険性がある。方法は、疾病または障害を、全体的または部分的に治療または予防するために有効な量及び条件において、対象にペプチド（またはペプチド複合体）を投与することを含む。本発明は、薬剤の製造で使用するためのペプチド（またはペプチド複合体）をさらに提供する。例えば、ペプチド（またはペプチド複合体）は、本明細書で詳細に記載のように、血液凝固障害の治療用薬剤の製造で使用されうる。

【0063】

一部の実施形態において、本発明のペプチド複合体またはペプチドをコードする核酸配列を含む核酸を対象に投与することは有利である。このような核酸は、一態様において、ペプチド複合体またはペプチドに、代えてまたは加えて、提供される。発現ベクター、核酸制御配列、投与方法などは、本明細書及び米国特許公開第２００３００４５４９８号にさらに記載されている。

【0064】

対象（例えば、ヒトのような哺乳類）に投与するペプチドの量及び投与条件（例えば、投与タイミング、投与経路、投薬レジメン）は、合理的な期間を通して所望の生体反応に影響を与えるのに充分である。単に実例として、一態様において、方法は、例えば約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれを超えて投与することを含む。多くの血液凝固障害の慢性的特性を考えれば、対象は何週間、何ヶ月、または何年か続く治療過程を通して本発明のペプチドを受けることになり、一日または一週間に１回以上の適用が必要になりうると想像される。他の実施形態において、本発明のペプチドは、急性の状態（例えば、手術または外傷に起因する出血、または凝固置換療法を受けている対象の因子インヒビター／自己免疫性エピソード）を治療するために、相対的に短い治療期間、例えば１〜１４日間、投与される。

【0065】

例えば本明細書に記載のペプチドを含む医薬組成物のような、生理的に許容できる組成物を投与する適切な方法は、当技術分野において公知である。状況に応じて、医薬組成物は、体腔に適用または滴下注入され、皮膚または粘膜を通して吸収され、経口摂取され、吸入され、及び／または血液循環に導入される。一態様において、本発明のペプチドを含む組成物は、静脈内に、動脈内に、または腹腔内に投与され、本発明のペプチドが血液循環に導入される。非静脈内投与も、特に低分子治療薬に関しては適している。特定の状況において、本発明のペプチドを含む医薬組成物を、経口に、局所に、舌下に、経膣に、直腸に、肺に；大脳内の（実質内の）、脳室内の、筋肉内の、眼内の、門脈内の、病巣内の、髄内の、髄腔内の、心室内の、経皮的な、皮下の、鼻腔内の、尿道の、または腸内の手段による注入を通して；徐放系によって；または植え込み装置によって、送達することが望ましい。所望に応じて、ペプチドは、例えば脚への送達のために大腿動脈経由でというように、対象部分への供給を行う動脈内または静脈内投与によって局所的に投与される。一実施形態において、ペプチドは、例えば米国特許５，４３９，６８６及び５，４９８，４２１、ならびに米国特許公開２００３／００５９４７４、２００３／００６４０３３、２００４／００４３０７７、２００５／００４８１２７、２００５／０１７０００５、２００５／０１４２２０５、２００５／１４２２０１、２００５／０２３３９４５、２００５／０１４７６８９。２００５／０１４２２０６、２００６／００２４３７９、２００６／０２６０７７７、２００７／０２０７２１０、２００７／００９２４５２、２００７／０２８１０３１、及び２００８／００２６０６８に記載のように、微粒子に組み込まれる。あるいは、組成物は、膜、スポンジ、または所望の分子の吸収若しくは被包に適した他の素材の植え込みによって投与される。植え込み装置が使用される場合、一態様における装置は、任意の適切な組織に植え込みされ、所望の分子の送達は、様々な態様において、拡散、徐放性巨丸剤、または継続投与によって行われる。他の態様において、ペプチドは、外科的処置または傷害の治療の間に露出している組織に直接投与されるか、または輸血処置によって投与される。治療的送達アプローチは当業者に公知であり、その一部が、例えば米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載されている。

【0066】

投与を促進するために、一実施形態におけるペプチドまたはペプチド複合体は、担体（すなわち、賦形剤、アジュバント、緩衝剤、または希釈剤）を含む生理的に許容される組成物に処方される。生理的に許容される無菌担体は、当技術分野において公知である。注射可能な使用に適切な実例的剤形としては、限定なしで、無菌の水溶液または分散物、及び無菌の注射可能な溶液または分散物の即時調製用無菌粉末などがある（例えば、米国特許第５，４６６，４６８を参照されたい）。本明細書で提供されるペプチドを含む医薬組成物は、このような医薬組成物の使用に関する指示を提供する包装材料と共に、容器内に任意選択で配置される。一般的に、このような指示には、試薬濃度を記述する具体的表現に加え、特定の実施形態において、医薬組成物の再構成に必要となりうる賦形剤成分または希釈剤の相対的量を記述する具体的表現が含まれる。

【0067】

適時、本発明のペプチド及びペプチド複合体は、追加的または増強的な生体効果を達成するために、他の物質及び／または他の治療モダリティーと組み合わせて投与される。併用治療には、以下に限定されないが、血漿由来のまたは組み換えの凝固因子、血友病予防治療、免疫抑制剤、血漿因子阻害抗体アンタゴニスト（すなわち、抗インヒビター）、抗線維素溶解薬、抗生物質、ホルモン療法、抗炎症剤（例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）またはステロイド性抗炎症物質）、凝血促進剤、及び鎮痛剤が含まれる。一態様において、方法は、例えば以下のものを対象に投与することを伴う、従来の補充因子治療レジメンに対する補助療法である。ＦＸＩＩＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩ（例えば、ＨＥＭＯＬＥＶＥＮ（登録商標）（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＦＸＩ濃縮物（ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｌｓｔｒｅｅ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ））、ＦＸ、ＦＩＸ（例えば、ＢＥＮＥＦＩＸ^{（登録商標）}Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）；ＡＬＰＨＡＮＩＮＥ（登録商標）ＳＤ（Ｇｒｉｆｏｌｓ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）；ＭＯＮＯＮＩＮＥ（登録商標）（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ， Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）；ＢＥＢＵＬＩＮ−ＶＨ^（商標）（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）；ＰＲＯＦＩＬＮＩＮＥ（登録商標）ＳＤ（Ｇｒｉｆｏｌｓ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）；またはＰＲＯＰＬＥＸ Ｔ^（商標）（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ））、ＦＶＩＩＩ（例えば、ＡＤＶＡＴＥ^（商標）（Ｂａｘｔｅｒ， Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）；ＨＥＬＩＸＡＴＥ（登録商標）ＦＳ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）；ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、ＸＹＮＴＨＡ^（商標）（Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ（登録商標）及びＫＯＧＥＮＡＴＥ（登録商標）ＦＳ（Ｂａｙｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）；ＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（登録商標）（Ｇｒｉｆｏｌｓ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）；ＨＥＭＯＰＨＩＬ Ｍ^（商標）（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）；ＫＯＡＴＥ（登録商標）−ＤＶＩ（Ｔａｌｅｃｒｉｓ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−ＵＳＡ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）；またはＭＯＮＡＲＣ−Ｍ^（商標）（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ））、ＦＶＩＩａ（例えば、ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標）ＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）及びＦＶＩＩ濃縮物（Ｂａｘｔｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，ＡｕｓｔｒｉａまたはＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｌｓｔｒｅｅ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ））、ＦＶ、ＦＶａ、ＦＩＩ、及び／またはＦＩＩＩ。ある場合において、対象はまた、第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性を持つ凍結乾燥された無菌ヒト血漿画分であるＦＥＩＢＡ ＶＨ Ｉｍｍｕｎｏ^（商標）（Ｂａｘｔｅｒ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を受ける。ＦＥＩＢＡ ＶＨ Ｉｍｍｕｎｏ^（商標）は、第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性及びプロトロンビン複合体因子（第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、及びＸ因子ならびにプロテインＣ）とほぼ同等の単位を含有する。他の例示的な併用治療としては、以下に限定されないが、プレカリクレイン、高分子キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、組織因子、及びトロンビンなどがある。あるいはまたは加えて、ペプチドは、１つまたは複数の異なるプロテインＳ結合ペプチド、例えば１つまたは複数の異なる本発明のペプチド、と同時に処方される。一態様において、ペプチドの投与により、所望の生体反応の達成に必要な並行治療薬の投与量を低減することが可能である。また、任意選択で、ペプチド（またはペプチド複合体）は、例えば国際特許公開第ＷＯ２０１３/１４１９６５に記載のＴＦＰＩ結合ペプチドのような、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）結合ペプチドの投与を含む治療レジメンの一部となる。

【0068】

従って本発明には、本発明のペプチド（または複数種類のペプチド、またはペプチド複合体）を、１つまたは複数の追加的に適切な物質と組み合わせて対象に投与することが含まれ、各々が薬剤に適切なレジメンに従って投与される。投与戦略には、ペプチド（またはペプチド複合体）及び１つまたは複数の追加的に適切な薬剤の同時投与（すなわち、実質的に同時の投与）及び非同時投与（すなわち、異なる時間で、任意の順序で、重複しているかしていないかを問わない投与）が含まれる。異なる構成成分は、任意選択で、同じまたは別々の組成物で、及び同じまたは異なる投与経路によって、投与されることが理解されるだろう。

【0069】

本発明は、例えばプロテインＳ結合ペプチドのような、プロテインＳ結合化合物の同定方法をさらに提供する。一態様において、方法は、（ａ）プロテインＳを、プロテインＳ−ペプチド複合体の形成が可能な条件下で、本発明に記載のペプチド及びテスト化合物（第二のペプチドであっても良い）と接触させることを含む。当該方法は、（ｂ）ステップ（ａ）で形成されるプロテインＳ−ペプチド複合体の測定、及び（ｃ）テスト化合物の存在下で形成されたプロテインＳ−ペプチド複合体の数を、テスト化合物の非存在下で形成されたプロテインＳ−ペプチド複合体の数と比較すること、をさらに含む。テスト化合物の存在下で形成されたプロテインＳ−ペプチド複合体の数の、テスト化合物の非存在下で形成されたプロテインＳ−ペプチド複合体の数と比較しての減少は、テスト化合物がプロテインＳ結合化合物であることを示す。一態様において、方法は、ステップ（ｃ）において、比較のためテスト化合物の非存在下でプロテインＳ−ペプチド複合体を形成することをさらに含むが、情報が別々に（例えば、あらかじめ用意された標準品から）取得されうる限り、このことは要求されない。

【0070】

プロテインＳ、ペプチド、及びテスト化合物を、同時にまたは経時的に、ペプチド及び／またはテスト化合物を添加する前及び／または後に任意選択で洗浄ステップを伴って、混合する。一実施形態において、プロテインＳ−ペプチド複合体の形成が可能な条件下で、プロテインＳと本明細書中に記載のペプチドを接触させ、非結合ペプチドを除去し、残存するプロテインＳ−ペプチド複合体とテスト化合物を接触させる。プロテインＳ−ペプチド複合体からのペプチドの置き換えが検出されると、テスト化合物がプロテインＳ結合化合物であることを示す。置き換えは、例えば、テスト化合物を曝露する前及び後のプロテインＳ−ペプチド複合体の数を測定することによって検出される。

【0071】

プロテインＳ−ペプチド複合体は、試料内のペプチドを検出するための当技術分野で公知の検出手段を含む、任意の適切な検出手段を用いて、検出及び／または測定（定量化）される。例えば、本発明の一実施形態において、本発明のペプチドは、シグナルを生成する標識を含む。例示的な標識は本明細書に記載され、例えば、放射性核種、蛍光色素、同位体、酵素基質、及び酵素などがある。方法は、プロテインＳ−ペプチド複合体によって生成されたシグナルの測定、及びテスト化合物の存在下で生成されたプロテインＳ−ペプチド複合体のシグナルを、テスト化合物の非存在下で生成されたプロテインＳ−ペプチド複合体のシグナルと比較することを含む。テスト化合物の曝露を受けたプロテインＳ−ペプチド複合体を含む試料からのシグナルの（テスト化合物の曝露を受けないプロテインＳ−ペプチド複合体の類似した試料から生成されるシグナルと比較しての）減少は、複合体形成が阻害または中断されたこと及び、テスト化合物がプロテインＳ結合化合物であることを示す。

【0072】

プロテインＳ結合化合物を同定する本発明の方法は、当技術分野で公知の様々なハイスループットスクリーニング技術を特に受け入れられる。任意の「テスト化合物」（例えば、小分子、ペプチド、タンパク質（例えば、抗体またはそのフラグメント）、ペプチドミメティック、またはポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ））が、本明細書に記載の方法を用いたスクリーニングに適切である。所望に応じて、テスト化合物の収集物、母集団、またはライブラリーが、本明細書に記載の方法を用いて、プロテインＳ結合（及び、任意選択で抗プロテインＳ活性）のスクリーニングを受ける。本発明書に包含されるハイスループットスクリーニング方法には、数十〜数十万のテスト化合物のスクリーニングが可能な自動化された手順が含まれている。

【0073】

本文書全体は、一体化した開示として関連づけられることを意図され、本文書の同一の文、段落、節の中に見出されない場合であっても、本明細書に記載の特徴の全ての組み合わせが検討されているものと理解されるべきである。例えば、タンパク質療法が記述されている場合、（タンパク質をコードするポリヌクレオチド／ベクターを用いた）ポリヌクレオチド療法を伴う実施形態は明確に検討されており、その逆もまた当てはまる。明示的に反対のことが示されない限り、本発明の一ペプチドまたは一方法に関して本明細書で提供される記述は、本発明のペプチド及び方法の各々及び全てに、それぞれ適用される。また、明示的に反対のことが示されない限り、本発明のペプチドまたはその使用に関して本明細書で提供される記述は、本発明のペプチド複合体に適用される。

【0074】

本発明にはまた、例えば、明確に上述されているバリエーションよりも任意の点で範囲が狭い本発明の全ての実施形態が含まれる。ある属として記述されている本発明の態様に関して、全ての個々の種は、本発明の別々の態様と考えられる。「ａ」または「ａｎ」と共に記述または請求されている本発明の態様に関して、文脈上より限定的な意味が明白に要求されない限り、これらの用語は「１つまたは複数」を意味するものと理解されるべきである。本発明の態様が特徴を「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」と記述されている場合、実施形態はまた、特徴「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的に〜からなる）」ものとも考えられる。

【0075】

本明細書において引用された全ての出版物、特許及び特許出願は、個々の出版物または特許出願が、明確に及び個々に参照により組み込まれていると示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0076】

本発明は、以下の実施例の参照によってより容易に理解されるだろう。以下の実施例は実例を介して提供されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。

【0077】

実施例１
以下の実施例は、本明細書に記載のペプチドの生成及び選択、ならびにプロテインＳ結合の特性決定について記述する。

【0078】

ペプチドは、主にアセチル化Ｎ末端及びアミド化Ｃ末端を用いてのＦｍｏｃ固相合成によって合成された。未加工の生成物は、ＨＰＬＣによって９０％超に精製され、ＴＦＡ塩として凍結乾燥された。凍結乾燥されたペプチドは−１５℃未満で保管された。プロテインＳ結合ペプチド配列は、ｍＲＮＡディスプレイライブラリー及び選択アッセイのパネルを使用して同定された。ｍＲＮＡのディスプレイ方法は、例えば国際特許公開第ＷＯ２００５／０５１９８５号及びＬｉｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３１８，２６８−２９３（２０００）に記載されている。簡潔に述べると、ｍＲＮＡはピューロマイシン分子を通して自身のコードされたペプチドに直接連結している。ペプチドＲＮＡ複合体は、一連の選択過程で完全長のプロテインＳに曝露され、その間プロテインＳ結合候補となるペプチドＲＮＡ複合体は単離され濃縮された。所望の性質を持つＲＮＡコードペプチドは、逆転写されコードＤＮＡを得た。

【0079】

選択過程では、適度かつ高度に厳密な選択ステップだけではなく、阻害性抗プロテインＳ抗体に基づく競合的な条件も含まれた。選択プロセスは、進行的に厳密な５つの選択過程から開始した。約１０^１３のランダムな２０ｍｅｒのペプチド−ｍＲＮＡ複合体からなるライブラリーを、常磁性のストレプアビジンビーズ上に固定した１００ｎＭのビオチン化されたヒトプロテインＳと共に１時間インキュベートした。プロテインＳビーズ及び対照用非被覆ストレプアビジンビーズに対するペプチド／ｍＲＮＡ融合物の結合を、放射線標識ペプチド−ｍＲＮＡ複合体のシンチレーション測定によってモニターした。非結合ペプチド−ｍＲＮＡ複合体を、４つの洗浄ステップによって除去した。次に、プロテインＳ被覆ビーズに結合しているペプチド／ｍＲＮＡ複合体を増幅し、次の選択過程に供した。プロテインＳ結合ペプチド−ｍＲＮＡ複合体の進行的濃縮が５つの選択過程を通じて観測された。例えば、過程２におけるペプチドの高度に厳密な選択は母集団の約９９％を除外し、高い親和性バインダーの亜集団を残した。

【0080】

親和性試験を促進するため、ｍＲＮＡディスプレイ（２９６ペプチド）によって同定されるユニークなペプチド配列を、Ｎ末端でビオチン化されたバリアントとして合成した。上述の様々なスクリーニングアッセイにおいてプロテインＳに検出可能な親和性を持つペプチドを、ＥＬＩＳＡに基づくＥＣ５０結合アッセイにおいてさらに特性決定した。簡潔に述べると、Ｎｕｎｃ Ｐｏｌｙｓｏｒｂ ＭＴＰウェルを５０μｌのプロテインＳ（３μｇ／ｍｌ）で被覆し、２％の酵母抽出物及び０．１％のＴｗｅｅｎ８０でブロックした。ビオチン化したペプチドをプロテインＳ被覆ウェル及びブロックした対照用ウェル（プロテインＳなし）でインキュベートした。いくつかの洗浄ステップの後、発色基質としてＴＭＢを用いたストレプアビジン−ＨＲＰによって結合ペプチドが検出された。ＥＣ５０値は、バックグラウンド補正し正規化した結合シグナルの非線形回帰によるペプチド滴定曲線から得られた。ペプチドの親和性は二桁マイクロモルからナノモル以下に及んだ（ＥＣ５０）。ｍＲＮＡディスプレイ及びスクリーニングアッセイによって同定した例示的なペプチドとしては、ＪＢＳ０６８４（配列番号１）及びＪＢＳ２５１２（配列番号２）などがある。

【0081】

実施例２
本実施例では、追加プロテインＳ結合ペプチドの生成及びプロテインＳ結合の特性決定について記述する。本実施例は、血漿系血友病モデルについてさらに記述し、本明細書に記載のペプチドのプロテインＳ阻害活性について実証する。

【0082】

実施例１で同定されたペプチドは、プロテインＳ結合をさらに精査するため、そして改善された活性を持つペプチドを同定するため、置換解析にかけた。例えば、親ペプチドＪＢＳ２５１２の各アミノ酸位置を、８つの代表的なアミノ酸セット（Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ）によって別々に置換した。従って、１つの親ペプチドからおよそ１６０の新規ペプチド候補を作成した。これらの新規ペプチド候補の各々が、親ペプチドと比較して１つのアミノ酸が交換されている。

【0083】

新規ペプチド候補を合成し（純度＞６０％）、競合的結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ ＩＣ５０）で親和性を、トロンビン生成アッセイ（ＣＡＴ）で活性をスクリーニングした。競合（ＩＣ５０）ＥＬＩＳＡを実施し、ビオチン化されたトレーサーペプチドＪＢＳ０６８４を用いて候補ペプチドとプロテインＳ結合において競合させた。トレーサーと競合するペプチドは、トレーサー（及び互い）と同じプロテインＳの領域に結合する。９６ウェルＰｏｌｙＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）をコーティング緩衝液（１５ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）内で３μｇ／ｍＬのプロテインＳで一晩コーティングした。プレートを洗浄緩衝液（ＨＮａＴ：１７５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．３５）で３回洗浄し、ＨＮａＴ中１００μｌの２％酵母抽出物で少なくとも１時間ブロックした。次にプレートをＨＮａＴで３回洗浄した。ＪＢＳ０６８４を結合ＥＬＩＳＡで判定したＥＣ９０値に対応した濃度で適用した。競合物のペプチド保存液（１０ｍＭ）をＨＳＡのないＨＮａＴにて１／３３．３に希釈し、連続の１／３希釈物をＨＮａＴと共に３％のＤＭＳＯで調製した。希釈物をビオチン化トレーサーペプチドで１：６の比（２０μｌの競合希釈物及び１００μｌのトレーサーペプチド）でさらに希釈した。競合及びトレーサーペプチドの混合物をプロテインＳでコーティングされたマイクロタイタープレートに適用し、１．５時間インキュベートした。プレートをＨＮａＴで３回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンをマイクロタイタープレートに適用し、混合物を１時間インキュベートし、プレートをＨＮａＴで３回洗浄し、ＴＭＢ（３，３‘５，５’−テトラメチルベンジジン）を適用し、次に起こるＨＲＰによるＴＭＢの発色性変換を検出することによって、ペプチド−プロテインＳ結合を検出した。ペプチドのＩＣ５０測定値が本明細書で提供される（例えば、表３を参照されたい）。

【0084】

またペプチドに対し、血友病血漿におけるプロテインＳ／ＡＰＣ依存トロンビン生成向上の試験を、ＣＡＴアッセイを用いて行った。プロテインＳは、血漿内ＡＰＣの抗凝固を強化する。ＣＡＴアッセイは、外因性凝固経路によって開始されるＡＰＣを介したトロンビン生成に対するプロテインＳの影響を定量化する（Ｎｉｃｏｌａｅｓ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，８：２８（１９９７））。ＡＰＣ（３５ｎＭ）及びプロテインＳ（２５ｎＭ）をプロテインＳが枯渇した血漿に加え、血漿試料を、ヤギで産生した高力価の熱失活抗ヒトＦＶＩＩＩ血漿（４４９０ＢＵ／ｍｌ；Ｂａｘｔｅｒ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｔｒｉａ；５０ＢＵ／ｍｌ最終血漿濃度）と共にインキュベートした。血漿中のトロンビン形成は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）リーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）の校正自動トロンボグラフィー（ＣＡＴ）が追跡し、トロンビンピークの高さによって定量化した。トロンビン形成は、ＡＰＣ非存在時及びピークの高さを約２０％まで低下させる濃度でのＡＰＣ存在時において、高い組織因子（ＴＦ）濃度で判定した。本明細書に記載のペプチドの、血漿中プロテインＳ（ＰＳ）のＡＰＣ補因子活性に対する阻害的効果は、ＡＰＣを追加したＦＶＩＩＩ阻害の貯留正常血漿にて測定された。完全な（１００％）プロテインＳ／ＡＰＣ阻害は、ＡＰＣの追加がない場合のトロンビンピークの高さである。ＰＳ／ＡＰＣ阻害の欠如（０％）は、一定の量のＡＰＣを用いた場合のトロンビンピークの高さの値と相関がある。ペプチドの順位付けは、２つの規定されたペプチド濃度（ＥＣ５０及びＥＣ９０）におけるＳＤを含めて野生型対照群の平均値と比較して正規化した値によって行った。

【0085】

例示的なＣＡＴアッセイ条件は、以下の通りである。プロテインＳが枯渇した血漿に３５ｎＭのＡＰＣ及び３５ｎＭのプロテインＳを補充した。保存ＡＰＣを１０ｐＭのＴＦ及び１５μＭのＰＬで希釈した。凍結乾燥したペプチドを１００％のＤＭＳＯに溶解させ５ｍＭ保存濃度にして、ＨＮＡＢＳＡ５緩衝液＋０．１％のＴｗｅｅｎ８０でさらに希釈した。最終的なペプチド血漿濃度は１４０ｎＭ（ＥＣ９０野生型）及び９０ｎＭ（ＥＣ５０野生型）だった。９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ（透明）Ｕ底（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）プレートに、８０μｌ血漿（＋ＣＴＩ＋Ｚ９９４−５）、１０μｌペプチド希釈物、及び１０μｌのＡＰＣ−ＴＦ−ＰＬ混合物またはキャリブレーターを混合した。蛍光発生基質及びＨＥＰＥＳ緩衝ＣａＣｌ_２（１００ｍＭ）を含有する２０μＬのＦｌｕＣａ試薬を各ウェルに分注することによってトロンビン生成を開始した。Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）リーダー（３９０ｎｍ励起及び４６０ｎｍ発光をフィルター）を用いて蛍光強度を３７℃で記録した。得られたトロンビン生成曲線のパラメーターをＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ^（商標）ソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）及びトロンビンキャリブレーターを用いて算出し、内部フィルター及び基質消費効果を補正した（Ｈｅｍｋｅｒ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ，３３：４１５（２００３））。

【0086】

競合結合アッセイ及びＣＡＴアッセイの両方について、ペプチド候補を、親ペプチドよりすぐれた、類似した、または劣った活性を有するものとして特性決定した。分析によって、３つのＮ末端位及び１３位、１５位、及び１７位のうちに位置する６つの異なる位置で強化的置換が明らかになった。許容的置換（活性に負の影響を与えなかった置換）を、１〜３位、１１位、１３位、１５位、１７位、１８位、及び２０位を含むいくつかの位置で同定した。強化的置換を持つ選定ペプチドを再合成して（純度＞９０％）ＥＬＩＳＡ ＩＣ５０アッセイにかけた。結果を表２に示す。

【表2】

【0087】

ｍＲＮＡディスプレイによる選定及び置換解析を経た多くのペプチドが、低ペプチド濃度の血漿系において、非常に良好なプロテインＳ／ＡＰＣ補因子活性阻害を示した。例えば、ＪＢＳ２５１２は、ＣＡＴアッセイにおいてプロテインＳに対する非常に良好な結合親和性及び低いＥＣ５０値を示した。ＪＢＳ２５７２は、ＨｉｓからＬｅｕへの非相同的置換を３位に有し、これはＣＡＴアッセイにおける親和性及び活性をＪＢＳ２５１２と比較して１．６倍増加させる。競合結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ ＩＣ５０）において、ＪＢＳ２５７２は２．５±０．３ｎＭのＩＣ５０を示した。ＪＢＳ２５７２は、血友病血漿中のＰＳ／ＡＰＣ依存トロンビン生成を向上させた。

【0088】

また、競合、相同的なユーロピウムベースのＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ（ＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイ）においてＪＢＳ０６８４をトレーサー（すなわち、プロテインＳ結合の競合物）として用いてペプチドを特性決定した。以下の試薬をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ ＭＴＰウェルで混合した（表示濃度は最終濃度である）：Ｅｕ標識プロテインＳ（１０ｎＭ）、Ｕｌｉｇｈｔ^（商標）標識ストレプトアビジン（１００ｎＭ）、トレーサー（ＪＢＳ０６８４（３００ｎＭ））、及びペプチド（３倍希釈ステップで滴定）。最終量は、５０μｌ／ウェルだった。反応混合物を１時間室温でインキュベートし、次に以下の機器設定を用いて６６５ｎｍの蛍光発光をマルチモードリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に記録した：Ｅｘ ３４０ｎｍ、Ｅｍ ６６５ｎｍ、ｄｅｌａｙ ５０μｓｅｃ、ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ １００μｓｅｃ、ｒｅａｄｓ １００。水溶性ユーロピウム標識プロテインＳに対するトレーサーペプチドの結合が、アクセプターフルオロフォア（ＵＬｉｇｈｔ^（商標））で標識されたストレプトアビジンによって検出された。非ビオチン化されたペプチドによるトレーサーのプロテインＳ結合阻害は、Ｅｕ標識プロテインＳとＵＬｉｇｈｔ^（商標）標識ストレプトアビジン間でＴＲ−ＦＲＥＴが減少する結果をもたらす。６６５ｎｍ蛍光発光シグナルの非線形回帰を用いて、一定のトレーサー濃度におけるペプチド滴定曲線からＩＣ５０値を取得した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍ５リーダーを用いて、ＪＢＳ２５７２は４９±６ｎＭのＩＣ５０値を示した。より低いプロテインＳ（２ｎＭ）及びトレーサー濃度（６０ｎＭ）が使用可能なＴｅｃａｎ Ｆ５００リーダーを用いて追加的な測定を行った；ＪＢＳ２５７２のＬＡＮＣＥ ＩＣ５０値は１０ｎＭの範囲内だった。

【0089】

またプロテインＳ親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００またはＢｉａｃｏｒｅＴ２００）によって、ヒト完全長プロテインＳ及びヒトＧＡＳ６を用いて判定した。簡潔に述べると、プロテインＳまたはＧＡＳ６の１０００ＲＵをＣＭ５チップ上に固定した。プロテインＳ結合ペプチドのプロテインＳに対する動態を探るため、３ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＤＭＳＯを含有するＨＢＳ緩衝液中にある様々な濃度のペプチドをフローセルに注入し、センサーチップに固定したタンパク質と相互作用させた。チップは、ＨＢＳ緩衝液中４ＭのＭｇＣｌ_２で再生できた。センサーグラムをｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆの決定及びＫ_Ｄの算出についてＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。抗標的ＧＡＳ６に関するペプチド結合の研究を用いて、ペプチドのプロテインＳへの特異性について試験した。ＪＢＳ２５７２がプロテインＳへの結合について６ｎＭのＫ_Ｄ（ｋ_ｏｎ＝２．４８×１０^５ １／Ｍｓ，ｋ_ｏｆｆ＝１．４８×１０^−３ １／ｓ）を２５℃で示した。３７℃では、Ｋ_Ｄは３．８×１０^−９（４ｎＭ）だった（ｋ_ｏｎ＝１．１４×１０^６ １／Ｍｓ，ｋ_ｏｆｆ：４．３１×１０^−３ １／ｓ）。

【0090】

実施例１及び２では、プロテインＳ結合ペプチドを生成及び特性決定する例示的な方法が提供される（例えば、プロテインＳ−阻害ペプチド）。ヒトプロテインＳに結合する数百個のペプチドを同定した。例示的なペプチドの置換解析でさらなるプロテインＳ結合ペプチドが生成され、プロテインＳ結合ペプチド内における置換が許容的だった（すなわち、プロテインＳへの親和性を保持した）こと及び、ある場合においては親和性が向上したことが実証された。多くのペプチドが、１０μＭ未満の解離定数またはＩＣ５０でヒトプロテインＳに結合していた。実施例は、ＥＣ５０が１０μＭ未満の血漿アッセイ系における本発明のペプチドのプロテインＳ補因子活性阻害をさらに実証する。生理的プロテインＳ濃度の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性が実証された。

【0091】

実施例３
本実施例は、本発明のペプチドが非プロテインＳタンパク質（「抗標的」）に低減された親和性を示すことを実証する。

【0092】

プロテインＳは、Ｇｌａドメイン（例えば、ＧＡＳ６（Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−６遺伝子にコードされたタンパク質）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＺ、及びプロトロンビンのような）、ＥＧＦ様ドメイン（例えば、ＧＡＳ６、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＺ、及びトロンボモジュリンのような）、及びラミニンＧ様ドメイン（例えば、ＧＡＳ６）を含有する他の凝固系タンパク質の領域に高度に類似したドメインを含む。これらの他の凝固系タンパク質は、従って、潜在的な抗標的である。ヒトＧＡＳ６は、最もプロテインＳに類似しているため（４２％同一性、５７％共通配列）、抗標的結合の判定に使用した。

【0093】

Ｂｉａｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴）によって抗標的ＧＡＳ６との相互作用を測定した（実施例２を参照）。ペプチドのヒトＧＡＳ６との相互作用からの最大シグナルは、プロテインＳが相互作用パートナーの場合に取得したシグナルよりもはるかに低かった。低いＧＡＳ６結合シグナルの動態解析はエラーが起きやすかったため、センサーグラムを視覚的に検討して抗標的結合を推定した。ＪＢＳ２５７２は、１μＭ濃度でＧＡＳ６との特異的な結合を示さなかった。ＪＢＳ２５７２の抗標的に対する親和性は、当該ペプチドのヒトプロテインＳに対する親和性より少なくとも１０倍（実際は、少なくとも１５０倍）小さかった。本実施例によって提供されたデータは、本明細書に記載のペプチドが特異的にプロテインＳと結合することを確証するものである。

【0094】

実施例４
ヒトプロテインＳに対する親和性が増加したペプチドは、ＪＢＳ２５７２（配列番号６２）の配列を基にしたライブラリーを部分的に無作為化したものから取得した。高親和性結合物の選定は、実施例１及び２に記載した方法に類似した方法を用いたｍＲＮＡディスプレイ及びスクリーニングアッセイによって達成した。ペプチドプールに適用された選定条件は、プロテインＳへの増加した結合シグナルを結果としてもたらした。３つの選択過程からの強化されたペプチドプールを配列決定し、例えばＪＢＳ３２１６〜３２２３（配列番号４６２〜４６９）及びＪＢＳ３２３１〜３３１４（配列番号４７７〜５６０）のアミノ酸配列を得た。親和性成熟プールからのいくつかのペプチドを化学的に修飾した。ＪＢＳ３３１９を４０ｋＤのＰＥＧ部分とコンジュゲートさせ、ＪＢＳ３３１８（配列番号５６４）を得た。ＪＢＳ３３１９単量体が４本のアームの１０ｋＤのＰＥＧ部分で一緒になった四量体は、ＪＢＳ３３２１（配列番号５６７）を得た。ＪＢＳ３１７９（配列番号４３３）は、４０ｋＤのＰＥＧ部分を含むＪＢＳ３２０６四量体である。ＪＢＳ３３２２（配列番号５６８）は、４０ｋＤのＰＥＧ部分を含むＪＢＳ３２０６単量体である。

【0095】

１８の代表的なペプチド（ＪＢＳ３２１６、ＪＢＳ３２１８、ＪＢＳ３２２１、ＪＢＳ３２２３、ＪＢＳ３２３２、ＪＢＳ３２３５、ＪＢＳ３２３６、ＪＢＳ３２５８、ＪＢＳ３２６０、ＪＢＳ３２６３、ＪＢＳ３２７４、ＪＢＳ３２８１、ＪＢＳ３２８３、ＪＢＳ３２８４、ＪＢＳ３２９６、ＪＢＳ３２９７、ＪＢＳ３３０６、及びＪＢＳ３３１４）について、Ｂｉａｃｏｒｅ及びＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイによってプロテインＳ結合親和性を評価した。ペプチドのプロテインＳ活性阻害能をＣＡＴアッセイによって判定し、血漿安定性についても調べた。

【0096】

１８のペプチド全ての親和性及び活性が、親のＪＢＳ２５７２と比較して向上していた。結果は、本明細書に記載のペプチドのアミノ酸配列内での複数の置換が許容的である（すなわち、ペプチドがプロテインＳと結合する能力を損なっていない）ことを実証している。例えば、ＪＢＳ２５７２の配列中７つのアミノ酸位置での置換（１〜３位、１３位、１５位、１７位、及び２０位）を含むＪＢＳ３２１６及びＪＢＳ２５１２は、親ペプチドＪＢＳ２５７２（Ｋ_Ｄ＝４ｎＭ）よりもプロテインＳに対する高い親和性（Ｋ_Ｄ＝０．２ｎＭ）を示した。実際、最適化されたペプチドは、１×１０^−４〜６×１０^−４ｓ^−１の範囲のｋ_ｏｆｆでｐＭ親和性（２０倍の向上）を示した。活性及び安定性は、１．５倍まで向上した。上述の内容に類似した方法を用いた例示的なＢｉａｃｏｒｅの結果を表４に示す。貯留された正常血漿及びマウス血漿において３７℃で血漿安定性を判定した；例示的な結果も表３に示す。安定性解析においても、ヒト血漿内での２４時間のインキュベーション後、ＪＢＳ３３１８、ＪＢＳ３１７９、及びＪＢＳ３３２２について８０％を超える結合活性、及びＪＢＳ３２１６について約５０％結合活性が残存していることが明らかになった。ＪＢＳ３１７９、ＪＢＳ３３１８、及びＪＢＳ３３２２はまた、抗標的であるＧＡＳ６（１μＭ）と相互作用しないと判定された。

【表3】

【0097】

重度の血友病Ａにかかっている３人の個体の血漿におけるペプチドの阻害活性をＣＡＴアッセイ（すなわち、トロンビン系のＡＰＣ抵抗試験）にて解析した。例えばＪＢＳ３１７９、ＪＢＳ３３１８、及びＪＢＳ３３２２では１００ｎＭより低いＥＣ５０で血漿内のプロテインＳ／ＡＰＣ依存トロンビン生成が向上した。ＪＢＳ３１７９はＣＡＴアッセイで６ｎＭのＥＣ５０を示し、ＪＢＳ３２１６についてもヒト血友病Ａ患者血漿におけるＣＡＴアッセイでの凝固が効率的に向上した（ＥＣ５０＝８５ｎＭ）。ＪＢＳ３２１６についてもいくつかの非ヒト哺乳類：カニクイザル、キヌザル、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、及びマウス、におけるトロンビン生成が向上した。

【0098】

ＪＢＳ３１７９もｉｎ ｖｉｖｏでの有益な活性を示した。ペプチドは、２５Ｕ／ｋｇのＡＤＶＡＴＥと投与の際は血友病マウス尾切断モデルにおける出血を用量依存的に低減し、サブ効果のあるＦＶＩＩＩ用量と同時投与の際は関節血症の血友病Ａマウスモデルにおける関節出血を大きく低減し、血友病誘発ウサギモデルにおけるｅｘ ｖｉｖｏのトロンビン形成を向上させた。

【0099】

実施例５
本実施例では、プロテインＳと結合する追加のペプチドについて記述し、本明細書に記載のペプチドにおけるアミノ酸配列内での可変性がプロテインＳ結合及び阻害に関して許容的であることを実証する。

【0100】

ＪＢＳ２５７２アミノ酸配列において複数の置換を有するいくつかのペプチドを合成し、上述したＬＡＮＣＥ ＩＣ５０及びＣＡＴアッセイを用いて評価した。アッセイについては、貯留された正常血漿に３ｎＭのＡＰＣを補充し、６ｐＭのＴＦ及び１５μＭのリン脂質（ＤＯＰＣ／ＰＯＰＳ ８０／２０）でトリガーした。保存ＡＰＣをＴＦ−ＰＬ混合物で２４ｎＭに希釈した（血漿濃度：３ｎＭ）。例示的な結果を表４に示す。解析は、１位、４位、５位、１３位、１５位、及び１７位にフォーカスし、親配列内での複数の置換が許容的であり、多くの場合において、ＪＢＳ２５７２親配列内に１つの置換を有するペプチドと比較して結合親和性及び阻害活性を増加させることを示した。

【表4】

【0101】

実施例６
本実施例では、本明細書に記載のペプチドがプロテインＳ（ＰＳ）のＣ４ＢＰに対する結合を妨害する能力について実証する。Ｃ４ＢＰは、７つの同一なα鎖（ＭＷ ７０ｋＤａ）及びより小さなベータ鎖（４５ｋＤａ）を含有する、タコに類似する分子である。プロテインＳはβ鎖に結合し、プロテインＳのＣ４ＢＰとの複合体形成は、プロテインＳのＡＰＣ補因子活性を消失させる。カルシウムイオン存在下におけるプロテインＳ及びＣ４ＢＰの解離定数は、約０．５ｎＭである。この高い親和性のため、遊離ＰＳのレベルはβ鎖含有Ｃ４ＢＰに対するモル過剰に対応している。

【0102】

本明細書に記載のペプチドのＰＳ／Ｃ４ＢＰ複合体に対する影響を調べるため、上述の方法に類似した方法を用いてＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイを確立した。ＪＢＳ２５７２またはＪＢＳ３２１６を、事前に作られたＣ４ＢＰ／ＰＳ複合体に加えた。複合体の濃度に変化があった後、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを記録した。両方のペプチドについて、Ｃ４ＢＰ／ＰＳ複合体の時間及び濃度依存の解離が観測された。ＪＢＳ３２１６のＩＣ５０は０．３ｎＭ、ＪＢＳ２５７２のＩＣ５０は２ｎＭであった。複合体減少の時間依存性は、両方のペプチドについて類似していた。１００ｎＭのＪＢＳ２５７２またはＪＢＳ３２１６の存在下における２時間のインキュベーション後、Ｃ４ＢＰ／ＰＳ複合体はそれぞれ６０％及び５０％減少していた。加えて、ＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイにおいて、ビオチン化されたＪＢＳ２５７２のプロテインＳに対する結合がＣ４ＢＰによって阻害されていた。ＪＢＳ２６９７をストレプトアビジンセファロースに結合させて、（ａ）プロテインＳ（１．６ｐｍｏｌ）、（ｂ）Ｃ４ＢＰ（８．５ｐｍｏｌ）、及び（ｃ）プロテインＳ（１．６ｐｍｏｌ）＋Ｃ４ＢＰ（８．５ｐｍｏｌ）と共に室温で１時間インキュベートしたプルダウン式実験は、改変したＬＡＮＣＥ ＩＣ５０アッセイの結果を支持するものだった。ＪＢＳ２６９７は、プロテインＳのみを用いた実験（ａ）ならびにＣ４ＢＰ及びプロテインＳの混合物を用いた実験（ｃ）でのみ、遊離プロテインＳと相互作用した。

【0103】

これらの発見は、本明細書に記載のペプチドが時間依存的様式において一定ｎＭ濃度で事前に作られたＣ４ＢＰ／ＰＳ複合体のフラクションを低減しうることを実証している。ペプチドによるＣ４ＢＰ／ＰＳ相互作用の中断（逆も同様）は、Ｃ４ＢＰ／ＰＳ複合体の競合的またはアロステリックな阻害性に由来しうる。Ｃ４ＢＰのプロテインＳに対する結合部位は、プロテインＳのラミニンＧドメインに０．１〜０．６ｎＭのＫ_Ｄで位置づけられていた。従って、ラミニンＧドメインは、ペプチドとプロテインＳ間の相互作用に関係していると思われる。タンパク質限定加水分解を用いた結合部位マッピング実験は、この観測を支持するものである。タンパク質分解フラグメントのＮ末端配列決定は、プロテインＳのＬＧ１ドメイン内のペプチド保護領域を同定した。これは、ＬＧ１ドメインがペプチドの標的結合領域であることを強く示唆するものである。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2AA】

【図2B】

【図2BB】

【図2C】

【図2CC】

【図2D】

【図2DD】

【図2E】

【図2EE】

【図2F】

【図2FF】

【図2G】

【図2GG】

【図2H】

【図2HH】

【図2I】

【図2II】

【図2J】

【図2JJ】

【図2K】

【図2L】

【図2M】

【図2N】

【図2O】

【図2P】

【図2Q】

【図2R】

【図2S】

【図2T】

【図2U】

【図2V】

【図2W】

【図2X】

【図2Y】

【図2Z】

【配列表】

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