特許 6715419 カンピロバクター・ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムに由来するＲＧＥＮを使用したゲノム編集

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6715419

(24)【登録日】2020年6月11日

(45)【発行日】2020年7月1日

(54)【発明の名称】カンピロバクター・ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムに由来するＲＧＥＮを使用したゲノム編集

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20200622BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20200622BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20200622BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20200622BHJP

   C12N 15/83 20060101ALI20200622BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20200622BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20200622BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 110

   C12N15/113 ZZNA

   C12N9/16 Z

   C12N15/55

   C12N15/83 Z

   C12N15/86 Z

   C12N15/864 100Z

【請求項の数】22

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2017-527527(P2017-527527)

(86)(22)【出願日】2015年8月6日

(65)【公表番号】特表2017-526387(P2017-526387A)

(43)【公表日】2017年9月14日

(86)【国際出願番号】KR2015008269

(87)【国際公開番号】WO2016021973

(87)【国際公開日】20160211

【審査請求日】2017年6月19日

(31)【優先権主張番号】62/033,852

(32)【優先日】2014年8月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517039427

【氏名又は名称】トゥールジェン インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】516355542

【氏名又は名称】インスティテュート フォー ベーシック サイエンス

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＡＳＩＣ ＳＣＩＥＮＣＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】キム，ウン ジ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ソク ジュン

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／０８９２９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０６５５９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／０７１４７４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 RAN FA et al., In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9,Nature [online], Vol.520, p.186-191, Epub 2015.04.01, [Retrieved on 2018.08.22], <URL: https://www.nature.com/articles/nature14299>

【文献】 FUJITA T et al., Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR, Biochem. Biophys. Res. Commun. [online], Vol.439, p.132-136, Epub 2013.08.11, [Retrieved on 2018.08.22], <URL= https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X13013296>

【文献】 Database: GenBank, [online], ACCESSION: NG_012637, DEFINITION: Homo sapiens chemokine (C-C motif) receptor 5 (CCR5), RefSeqGene on chromosome 3, 07-NOV-2011 uploaded, [retrieved on 2019-07-08], Internet，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/255652911?sat=18&satkey=18813226

【文献】 CHEN B et al., Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system, Cell [online], Vol.155, p.1479-1491, Epub 2013.12.19, [Retrieved on 2018.08.22], <URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867413015316>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲノムを改変する方法であって、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するＣａｓタンパク質、または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸；およびＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のＰＡＭ配列に隣接する標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列およびＣａｓタンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含むガイドＲＮＡ、または当該ガイドＲＮＡをコードする核酸を、ゲノムを含む細胞中に導入し、それによって標的ＤＮＡ配列でゲノムを改変することを含み
ここでＣａｓタンパク質は、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９タンパク質であり、
およびここで細胞は、ヒトインビボ（human in vivo）細胞ではない、前記方法。

【請求項2】

ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むデュアルＲＮＡである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ガイドＲＮＡが、1本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ｓｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含有する第一領域、およびＣａｓ９タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含有する第二領域を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

ｓｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含有するｃｒＲＮＡの一部、およびＣａｓ９タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含有するｔｒａｃｒＲＮＡの一部を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

Ｃａｓ９タンパク質が、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

（ｉ）ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のＰＡＭ配列と隣接した標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列およびＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のＰＡＭ配列を認識するカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含む単離されたガイドＲＮＡを発現するための発現カセット、または、前記単離されたガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、および
（ｉｉ）ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のＰＡＭ配列を認識する前記Ｃａｓ９タンパク質を発現するための発現カセット、または当該Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸、
ここで、標的ＤＮＡ配列は、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のＰＡＭ配列と隣接している、
を含む、組み換えウイルスベクター
を含む、標的ＤＮＡ配列でゲノムを改変するための組成物。

【請求項8】

単離されたガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡである、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

単離されたガイドＲＮＡが１本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項７に記載の組成物。

【請求項10】

ｓｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含有する第一領域、およびＣａｓ９タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含有する第二領域を含む、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

ｓｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含有するｃｒＲＮＡの一部、およびＣａｓ９タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含有するｔｒａｃｒＲＮＡの一部を含む、請求項９に記載の組成物。

【請求項12】

標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列が、１７〜２３ｎｔの長さを有する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

単離されたガイドＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列の５’末端の前に１〜３の追加のヌクレオチドをさらに含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

追加のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）を含む、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

組み換えウイルスベクターであって、ここで、ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項７に記載の組成物。

【請求項16】

前記ゲノムが真核生物ゲノムである、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

ガイドＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含む第一領域、およびステムが１３〜１８ｂｐの長さであるステム−ループ構造を含む第二領域を含む、請求項１〜６および１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

ステムが、配列番号２（５’−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＧＵＧ−３’）の配列およびその相補鎖を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ガイドＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含む第一領域、および５〜１０ｎｔの長さのループを含むステム−ループ構造を含む第二領域を含む、請求項１〜６および１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

ループが配列番号３（５’−ＡＵＡＵＵＣＡＡ−３’）のヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ゲノムの改変が、ゲノム編集である、請求項１〜６および１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

ゲノム改変が、標的ＤＮＡの切断である、請求項１〜６および１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ここで提供される本開示は、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムに由来する、ＲＮＡでガイドされた操作されたヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）およびそれを使用するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

操作されたヌクレアーゼは、ゲノムにおける所望の位置において部位特異的な二本鎖切断を作製することによって生細胞または生物全体において効果的に遺伝子を操作するために使用され得る（Nat Rev Genet, 2014. 15(5): p. 321-34.)。ＩＩ型制限酵素についてＤＮＡ結合ドメインおよび改変されたヌクレアーゼドメインを含む、操作されたヌクレアーゼは、バイオテクノロジーおよび医療分野ならびに様々な他の産業における広範囲のゲノム工学用途を有する。最近では、より有力なＲＧＥＮプラットフォームがＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９細菌性適応免疫システムに基づいて開発されている。

【0003】

ＲＧＥＮが標的とする配列は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって標的化されたＤＮＡ配列の直後のＤＮＡ配列である、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に限定されている。ＰＡＭ配列は、従来、ＣＲＩＳＰＲ細菌性適応免疫システムにおいて再プログラム可能ではなかった。標準的なＰＡＭは、配列５’−ＮＧＧ−３’を含み、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のＣＡＳ９ヌクレアーゼに由来するＲＧＥＮに関連する。よって、ＧＧモチーフは、ＲＧＥＮによるＤＮＡ認識のためにあらかじめ必要である。ＰＡＭとしての使用のための配列を拡張するために、汎用性ＰＡＭを有する種々の細菌種からＲＧＥＮを分離することが試みられている。実際に、種々のＰＡＭが、細菌ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（ＰＡＭ：ＮＮＡＧＡＡＷ）およびナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）（ＰＡＭ：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）のＣＡＳ９タンパク質に関連することが発見され、ＲＧＥＮ標的遺伝子座を決定することにおける選択の範囲を拡大している。

【発明の概要】

【0004】

本発明の詳細な記載
技術的課題
ここで記載されるとおり、ストレプトコッカス・ピオゲネス以外の細菌からのＲＧＥＮの開発への集中的かつ徹底した研究は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ジェジュニ）に由来するＣａｓタンパク質が特異的にＮＮＮＮＲＹＡＣ配列を認識し、当該配列が目的のＤＮＡの標的化においてＰＡＭとして使用され得るという発見をもたらした。さらに、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡの最適化のために操作され得、これにより効率的な目的のＤＮＡのゲノム編集、転写調節、および分離をもたらす。

【0005】

技術的解決策
したがって、一側面において、本発明は、配列番号１のＰＡＭ配列を含むＤＮＡ配列を標的化するための方法を提供し、当該方法は、配列番号１のＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質か、または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞中へ導入することを含む。

【0006】

別の側面において、本発明は、配列番号１のＰＡＭ配列に隣接した目的の標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成する（塩基対を形成するか、またはハイブリダイズする）ことが可能な配列を含む単離されたガイドＲＮＡ、またはそれを含む組成物を提供する。

【0007】

さらに別の側面において、ここで提供される本開示は、（ｉ）ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のＰＡＭ配列に隣接した標的ＤＮＡ配列と二本鎖を形成することが可能な配列を含むガイドＲＮＡ、または当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、および（ｉｉ）ＮＮＮＮＲＹＡＣ配列（配列番号１）を認識するＣａｓタンパク質、または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを提供する。

【0008】

さらに別の側面において、ここで提供される本開示は、（ｉ）ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号：１）に隣接した標的ＤＮＡ配列と二本鎖を形成することが可能な配列を含むガイドＲＮＡについての発現カセット、および（ｉｉ）ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）を認識するＣａｓタンパク質についての発現カセットを含む、組み換えウイルスベクターを提供する。

【0009】

さらに別の側面において、本開示は、長さ２１〜２３ｂｐの、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列を含む、単離されたガイドＲＮＡ、またはそれを含む組成物を提供する。

【0010】

さらに別の側面において、本開示は、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列を含む第一領域、および長さ１３〜１８ｂｐのステムによって特徴付けられたステム−ループ構造を含む第二領域を含む、単離されたガイドＲＮＡ、または単離されたガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。

【0011】

さらに別の側面において、本開示は、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列を含む第一領域、および長さ５〜１０ｂｐのループによって特徴付けられたステム−ループ構造を含む第二領域を含む、単離されたガイドＲＮＡ、または単離されたガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。

【0012】

さらに別の側面において、ここで提供される本開示は、単離されたガイドＲＮＡまたは当該単離されたガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、Ｃａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸とともに細胞中に導入することを含む、細胞におけるゲノム編集の方法を提供する。

【0013】

さらに別の側面において、本開示は、単離されたガイドＲＮＡまたは当該単離されたガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびＣａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することを含む、細胞において標的ＤＮＡを切断する方法を提供する。

【0014】

さらに別の側面において、本開示は、（ｉ）所与の配列においてＰＡＭ配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）の存在を同定すること；および（ｉｉ）ＰＡＭ配列の存在が工程（ｉ）において同定される場合、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）の上流に位置した配列を、ガイドＲＮＡによって認識可能であると決定することを含む、標的ＤＮＡが認識するガイドＲＮＡの配列を調製するための方法を提供する。

【0015】

さらに別の側面において、本開示は、（ｉ）ガイドＲＮＡまたは当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、不活性化されたＣａｓタンパク質または当該不活性化されたＣａｓタンパク質をコードする核酸とともに、細胞中に導入して、ガイドＲＮＡおよび不活性化されたＣａｓタンパク質を、標的ＤＮＡ配列を含む目的のＤＮＡと一緒に複合体を形成させること；および（ｉｉ）試料から複合体を分離することを含む、目的のＤＮＡを単離するための方法を提供する。

【0016】

さらに別の側面において、本開示は、標的ＤＮＡ配列を特異的に認識する単離されたガイドＲＮＡまたは当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、および転写エフェクタードメインに融合された不活性化されたＣａｓタンパク質または当該不活性化されたＣａｓタンパク質をコードする核酸を、細胞中に導入することを含む、標的ＤＮＡ配列を含む目的のＤＮＡにおけるＣａｓによって媒介された遺伝子発現調節のための方法を提供する。

【0017】

有利な効果
上記のとおり、いくつかの実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ＤＮＡを標的化するために効果的に使用され得、これにより目的のＤＮＡのゲノム編集、転写調節、および単離を達成する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、Ｃ．ジェジュニＣａｓ９発現ベクターの模式図を示す。ベクターは、ヒト化Ｃａｓ９タンパク質がＣＭＶプロモーターの調節下で発現されるように設計され、Ｃ末端領域における核局在化シグナル（ＮＬＳ）およびＨＡタグとともに提供される。

【0019】

【図2A】図２Ａは、内因性ヒトＡＡＶＳ１標的遺伝子座においてＣ．ジェジュニのＲＧＥＮによって誘導された変異についての実験を示す。図２Ａは、ＲＧＥＮによって駆動された染色体変異がＴ７Ｅ１アッセイを使用して検出されたことを示す。アスタリスク（＊）は、Ｔ７Ｅ１によって切断されることが予想されるＤＮＡバンドを示す。ＨＥＫ２９３野生型（ｗｔ）ｇＤＮＡは、ネガティブコントロール（−）として使用された。従来証明されたＲＧＥＮは、ポジティブコントロール（＋）として使用された。

【図2B】図２Ｂは、内因性ヒトＡＡＶＳ１標的遺伝子座においてＣ．ジェジュニのＲＧＥＮによって誘導された変異についての実験を示す。図２Ｂは、ｈＡＡＶＳ１変異体クローンのＤＮＡ配列を示す。キメラＲＮＡに相補的な標的配列領域は、太字で示される。ＣＡＳ９によって認識されるＰＡＭ配列は、下線が引かれている。図２ＢのＷＴ配列は配列番号４によって、（−２，ｘ１）配列は配列番号５によって、および（−１，ｘ１）配列は配列番号６によって表わされる。

【0020】

【図3A】図３Ａは、内因性マウスＲＯＳＡ２６（ｍＲＯＳＡ）標的遺伝子座においてＣ．ジェジュニのＲＧＥＮによって誘導された変異についての実験を示す。図３Ａは、ＲＧＥＮによって駆動された染色体変異が、Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して検出されたことを示す。アスタリスク（＊）は、Ｔ７Ｅ１によって切断されるが予想されるＤＮＡバンドを示す。ＮＩＨ３Ｔ３ ｗｔ ｇＤＮＡは、ネガティブコントロール（−）として使用された。従来証明されたＲＧＥＮは、ポジティブコントロール（＋）として使用された。

【図3B】図３Ｂは、内因性マウスＲＯＳＡ２６（ｍＲＯＳＡ）標的遺伝子座においてＣ．ジェジュニのＲＧＥＮによって誘導された変異についての実験を示す。図３Ｂは、ｍＲＯＳＡ変異体クローンのＤＮＡ配列を示す。キメラＲＮＡに相補的な標的配列領域は、太字で示される。Ｃ．ジェジュニＣＡＳ９によって認識されるＰＡＭ配列は、下線が引かれている。図３ＢのＷＴ配列は配列番号７によって、（−１，ｘ１）配列は配列番号８によって、および（＋１，ｘ１）配列は配列番号９によって表わされる。

【0021】

【図4】図４は、変異体Ｃ．ジェジュニｓｇＲＮＡ構造によって内因性ＡＡＶＳ１標的遺伝子座において誘導された所定の変異を示す。ＲＧＥＮによって駆動された染色体変異は、Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して検出された。アスタリスク（＊）は、Ｔ７Ｅ１によって切断されることが予想されるＤＮＡバンドを示す。ＨＥＫ２９３ ｗｔ ｇＤＮＡは、ネガティブコントロール（−）として使用された。従来証明されたＲＧＥＮは、ポジティブコントロール（＋）として使用された。

【0022】

【図5A】図５Ａは、ｓｇＲＮＡのスペーサーの長さの最適化を説明する。図５Ａは、様々なｓｇＲＮＡ構造を示す。ｓｇＲＮＡのスペーサーの５’末端のすぐ上流の追加のヌクレオチドは、下線が引かれ、ここで、小文字は、標的配列に関してミスマッチのヌクレオチドを表わす。ＰＡＭ配列は囲われている。図５Ａにおいて、標的配列は配列番号１０によって、ＧＸ１９は配列番号１１によって、ＧＸ２０は配列番号１２によって、ＧＸ２１は配列番号１３によって、ＧＸ２２は配列番号１４によって、ＧＸ２３は配列番号１５によって、ＧＧＸ２０は配列番号１６によって、およびＧＧＧＸ２０は配列番号１７によって表わされる。

【図5B】図５Ｂは、ｓｇＲＮＡのスペーサーの長さの最適化を説明する。図５Ｂは、ｓｇＲＮＡの標的部位を示し、ここで、ｈＡＡＶＳ−ＣＪ１、ｈＡＡＶＳ−ＮＲＧ１、ｈＡＡＶＳ−ＮＲＧ３、およびｈＡＡＶＳ−ＮＲＧ５についての配列は、それぞれ配列番号１８、１９、２０、および２１によって表わされる。

【図5C】図５Ｃは、ｓｇＲＮＡのスペーサーの長さの最適化を説明する。図５Ｃは、ＲＧＥＮによって媒介される変異を誘導するｓｇＲＮＡ構築の効率を示す。簡単には、ｓｇＲＮＡは、様々な長さのスペーサー（１９〜２３ｂｐ）およびスペーサーのすぐ上流に存在する様々な数の追加のＧ（グアニン）残基を有するように構築された。図５Ａにおいて示されたｓｇＲＮＡのそれぞれは、ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座の４つの標的部位について設計され（図５Ｂ）、ヒト２９３細胞に送達された。その後、ＮＨＥＪによって誘導された変異が前記細胞において同定された。この実施態様において、標的部位は、ＰＣＲによって増幅され、miSEQ（Illumine）を使用したディープシーケンシングによって分析され、変異を検出した。全体として、ゲノム編集（変異）頻度は、認識配列が長さ２１〜２３ｂｐであるか、またはその５’末端において２または３の追加のＧ残基とともに提供されたとき、Ｃ．ジェジュニまたは他の種において使用されたＧＸ１９またはＧＸ２０と比較して、増加された。

【0023】

【図6】図６は、ＡＡＶＳ１−ＣＪ１遺伝子座がサロゲートレポーターに挿入されている、Ｃ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の活性を示すグラフである。ＡＣＡＣ配列についてＰＡＭ部位において検出された活性（１００）に対して、種々のヌクレオチドが各位置において置換されたとき、活性が算出された。第一位置において、ＧならびにＡは高活性を保証した。ＴならびにＣは、第二位置において効果的であった。しかしながら、ＡおよびＣのみが第三および第四の位置においてそれぞれ活性を示した。したがって、ＮＮＮＮ−Ａ／Ｇ−Ｃ／Ｔ−Ａ−Ｃ（またはＮＮＮＮＲＹＡＣ、配列番号１、ここで、Ａ／Ｇ＝Ｒ、Ｃ／Ｔ＝Ｙ）は、少なくともいくつかの実施態様において、最適なＰＡＭ配列であることが推定される。

【0024】

【図7】図７は、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−Ｓｅｑ分析によって発掘されたｈＡＡＶＳ１−ＣＪ１ ｓｇＲＮＡの潜在的なオフターゲットの配列についてのコンセンサスロゴを示す。

【0025】

【図8】図８は、Ｃ．ジェジュニＣａｓ９のＰＡＭ配列についての試験結果を示す。ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）の７つの標的部位は変異効率について分析された。ｈＡＡＶＳ１−ＲＹＮ１−７：ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９処理した細胞における各部位における変異の比、ＷＴ１−７：モック処理した細胞のゲノムＤＮＡにおける各部位における変異の比。

【0026】

【図9】図９は、Ｃ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現ＡＡＶベクターの構造を示す模式図である。

【0027】

【図10】図１０は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座においてＣ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）によって行われたゲノム編集を示す。簡単には、Ｃ２Ｃ１２細胞は、種々のＭＯＩ（感染多重度）においてＲｏｓａ２６−ｓｇＲＮＡおよびＣ．ジェジュニＣａｓ９の両方を運ぶ組み換えＡＡＶベクターで感染させた。感染後３、５、７、１０および１４日において、ゲノムＤＮＡは単離され、ディープシーケンシングによって変異比について分析された。

【0028】

本発明の実施態様
本発明の一実施態様は、細胞中にＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸を導入することを含む、目的のＤＮＡ配列を標的化するための方法を提供する。

【0029】

詳細には、一側面にしたがって、本開示は、配列番号１のＰＡＭ配列ＮＮＮＮＲＹＡＣを認識するＣａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することを含む、配列番号１のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を含むＤＮＡ配列を標的化するための方法を提供する。配列番号１において、ＩＵＰＡＣ命名法によれば、「Ｎ」は例えばＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴから選択される任意のヌクレオチドを指し、「Ｒ」は、プリン（Ａ／Ｇ）を指し；「Ｙ」はピリミジン（Ｃ／Ｔ）を指す。

【0030】

本開示のある側面において、方法は、配列番号１のＰＡＭ配列に隣接した目的のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列を含むガイドＲＮＡを導入することをさらに含み得る。ガイドＲＮＡは、配列番号１のＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸とともに同時または順次に導入され得る。

【0031】

ここで使用されるとおり、用語「標的化する」は、目的のＤＮＡ配列に対するＣａｓタンパク質の結合を、ＤＮＡ切断とともに、またはＤＮＡ切断なしのいずれかで包含することが意図される。

【0032】

後に記載されるであろう用語法は、本開示のすべての実施態様に適用可能であり、組み合わせて使用され得る。

【0033】

Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と複合体を形成し、ｃｒＲＮＡをトランス活性化（ｔｒａｃｒＲＮＡ）した後、その活性を行い得る。Ｃａｓタンパク質は、エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を示し得る。

【0034】

Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のＧｅｎＢａｎｋなどのよく知られたデータベースにおいて見出され得る。一実施態様によれば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。別の実施態様において、Ｃａｓタンパク質は、カンピロバクターｓｐｐ．（すなわち、カンピロバクター属）を起源（由来）とするものであり得、特にカンピロバクター・ジェジュニを起源とするものであり得る。より特に、Ｃａｓ９タンパク質は、カンピロバクター・ジェジュニに由来し得る。本開示のいくつかの実施態様において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２２によって表わされたアミノ酸配列を含み得るか、または配列番号２２のアミノ酸配列に相同であり得、その内在的活性を保持する。例えば、限定することなく、Ｃａｓタンパク質および本開示によって包含されるその相同配列は、配列番号２２の配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性の配列相同性を有し得る。

【0035】

さらに、Ｃａｓタンパク質は、本開示の所定の実施態様に使用されるとおり、活性化エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼとして、ガイドＲＮＡならびに天然タンパク質と共同して働き得る任意のバリアントを包含することが意図される。活性化エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼは、標的ＤＮＡを切断し得、または切断機能でゲノム編集を行うことができ得る。不活性化されたバリアントについて、それらの機能は、目的のＤＮＡを転写または単離することを調節するために使用され得る。

【0036】

Ｃａｓ９タンパク質バリアントは、触媒作用のアスパラギン酸またはヒスチジン残基の異なるアミノ酸との置換からもたらされる、Ｃａｓ９の誘導体、バリアント、または変異体であり得る。例えば、異なるアミノ酸は、アラニンであり得るが、これに限定されない。

【0037】

具体的には、Ｃａｓタンパク質、例えばＣ．ジェジュニに由来するＣａｓ９タンパク質は、８位における触媒作用のアスパラギン酸（Ｄ）または５５９位におけるヒスチジン残基（Ｈ）の野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸との置換を含み得る。いくつかの実施態様において、配列番号２２の配列の、８位における触媒作用のアスパラギン酸（Ｄ）または５５９位におけるヒスチジン残基（Ｈ）は、種々のアミノ酸と置換される。例えば、種々のアミノ酸は、限定することなく、アラニンであり得る。天然Ｃａｓ９ヌクレアーゼの１つの活性部位に対して変異を導入することによって調製されたＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントは、ガイドＲＮＡと共同してニッカーゼとして作用し得る。１つのガイドＲＮＡ分子に結合されるとき、２つのニッカーゼ分子は、目的のＤＮＡ二本鎖の両方の鎖を切断し得、これにより二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製する。よって、かかるバリアントは、本開示によって包含されたＲＧＥＮの範囲にもまた属する。

【0038】

ここで使用されるとおり、用語「不活性化されたＣａｓタンパク質」は、Ｃａｓヌクレアーゼを指し、その機能は全体的または部分的に不活性化されている。不活性化されたＣａｓタンパク質は、ｄＣａｓと省略され得る。Ｃａｓは、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。さらに、それはカンピロバクターｓｐｐ．を起源とし得、特にＣ．ジェジュニを起源とし得る。任意の方法は、それがヌクレアーゼ活性を除く限り、不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼの調製において使用され得る。例えば、ｄＣＡＳ９タンパク質は、変異をＣａｓ９ヌクレアーゼの２つの上記活性遺伝子座へ導入することによって構築され得る。ｄＣＡＳ９は、次いでガイドのＮＡを有するＤＮＡによって結合された複合体として作用し得る一方、ＤＮＡ切断機能を欠く。さらに、ｄＣＡＳ９タンパク質は、８位におけるアスパラギン酸（Ｄ）および５５９位におけるヒスチジン（Ｈ）以外のものを有する置換基を有し得る。例えば、いくつかの実施態様において、ｄＣＡＳ９タンパク質は、配列番号２２の配列の８位におけるアスパラギン酸（Ｄ）および５５９位におけるヒスチジン（Ｈ）以外を有する置換基を有し得る。置換基は、限定することなく、アラニンであり得る。

【0039】

ここで使用されるとおり、用語「切断」は、ヌクレオチド分子の共有結合性の主鎖の切断を指す。

【0040】

本開示のいくつかの実施態様において、Ｃａｓタンパク質は、組み換えタンパク質であり得る。

【0041】

用語「組み換え」は、例えば細胞、核酸、タンパク質、またはベクターと併せて使用されるとおり、異種由来の核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されるか、またはかかる改変された細胞に由来する、細胞、核酸、タンパク質またはベクターを指す。したがって、例えば、組み換えＣａｓタンパク質は、ヒトコドン表に基づき、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列（すなわち、Ｃａｓタンパク質をコードする配列）を再構成することによって生成され得る。

【0042】

本開示のいくつかの実施態様において、Ｃａｓタンパク質またはそれをコードする核酸は、核内で活性であり得る形態にあり得る。

【0043】

本開示のいくつかの実施態様において、単離されたＣａｓタンパク質は、細胞中に導入することが容易である形態であり得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、細胞に浸透するペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインに連結され得る。タンパク質形質導入ドメインは、限定することなく、ポリアルギニンまたはＨＩＶ由来ＴＡＴタンパク質であり得る。本開示は、当該技術分野においてよく知られた細胞に浸透するペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインの様々な例を包含する。

【0044】

本開示のいくつかの実施態様において、Ｃａｓタンパク質またはそれをコードする核酸は、前記タンパク質または核酸を細胞において核輸送によって核中に輸送するための核局在化シグナル（ＮＳＬ）をさらに含み得る。さらに、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列をさらに含み得る。したがって、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、限定されないが、ＮＬＳ配列ならびにプロモーターなどの調節性要素を含有し得る、発現カセットの成分として存在し得る。

【0045】

本開示のいくつかの実施態様において、Ｃａｓタンパク質は、分離および／または精製を促すタグに連結され得る。非限定的な例として、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグなどの小ペプチドタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグなどが目的に依存して使用され得る。

【0046】

本開示のいくつかの実施態様において、Ｃａｓタンパク質が標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡに関連する場合、Ｃａｓタンパク質は、まとめてＲＧＥＮ（ＲＮＡでガイドされた操作されたヌクレアーゼ）と称され得る。ここで使用されるとおり、用語「ＲＧＥＮ」は、標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を有するヌクレアーゼを指す。

【0047】

細胞に対する用途については、本開示のいくつかの実施態様によれば、ＲＧＥＮは、標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡまたは当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；ならびに単離されたＣａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を有し得る。これに関して、ガイドＲＮＡまたは当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と同時または順次に細胞に適用され得る。

【0048】

本開示の側面において、細胞に対する送達のためのＲＧＥＮは、１）標的ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡおよび単離されたＣａｓタンパク質、または２）当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡまたは当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む。１）の形態における送達は、「ＲＮＰ送達」と示される。

【0049】

単離されたガイドＲＮＡの例は、限定されないが、インビトロ転写されたＲＮＡを含み得る。

【0050】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ（ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）およびＣａｓタンパク質をコードする核酸は、それら自体単離された核酸として使用され得る。代替的に、限定することなく、それらは、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質を発現するための発現カセットを有するベクターにおいて存在し得る。

【0051】

好適なベクターの例は、ウイルスベクター、プラスミドベクター、およびアグロバクテリウムベクターを含む。ウイルスベクターは、限定されないが、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）によって例示され得る。

【0052】

本開示のいくつかの実施態様において、限定することなく、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードする核酸は、それぞれのベクターに分離して、または一本のベクター中で一緒に存在し得る。

【0053】

主題の前述の用途の実施態様は、この明細書に記載されたより例示的な実施態様に適用され得る。さらに、後に記載されるであろう用途の実施態様は、他の構成上の要素と組み合わせて適用され得る。

【0054】

ここで使用されるとおり、用語「ガイドＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質に結合して標的ＤＮＡへＣａｓタンパク質をガイドし得る、標的ＤＮＡに対する特異性を有するＲＮＡ（すなわち、標的ＤＮＡに特異的なＲＮＡ）を指し得る。

【0055】

さらに、少なくともいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは、所定の標的に対して特異的であるように設計されて切断され得る。

【0056】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、すなわちｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡからなるデュアルＲＮＡであり得る。他の実施態様において、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖と二本鎖を形成すること可能な標的ＤＮＡに相補的な配列を含有する第一領域、およびＣａｓタンパク質と相互作用することを担当する配列を含有する第二領域を含むか、またはこれらからなる、ｓｇＲＮＡであり得る。より特に、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのそれぞれの必須の部分を融合することによって合成されたｓｇＲＮＡ（一本ガイドＲＮＡまたは１本鎖ガイドＲＮＡ）であり得る。

【0057】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡにおける標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列は、限定することなく、１７〜２３ｂｐ、１８〜２３ｂｐ、１９〜２３ｂｐ、特に２０〜２３ｂｐ、およびより特に２１〜２３ｂｐの長さの範囲に及び得る。長さは、デュアルＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの両方に適用され得、より特にｓｇＲＮＡに適用され得る。

【0058】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列の５’末端の直前に、１〜３、より特に２または３の追加のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、およびこれらの組み合わせの間から選択される。ガイドＲＮＡは、追加のヌクレオチドとして、１〜３の連続するグアニン（Ｇ）残基、より好ましくは、２または３の連続するＧ残基を含み得る。これは、限定することなく、デュアルＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの両方、より好ましくはｓｇＲＮＡに適用される。

【0059】

本開示のいくつかの実施態様において、ｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列（「スペーサー領域」、「標的ＤＮＡ認識配列」、「塩基対領域」などと称される）に相補的な領域、およびＣａｓタンパク質に結合するためのヘアピン構造を含み得る。

【0060】

本開示のいくつかの実施態様において、ｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に相補的な領域、Ｃａｓタンパク質に結合するためのヘアピン構造、および転写終結配列を含み得る。これらの要素は、限定することなく、５’〜３’方向へ順次配置され得る。

【0061】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡの任意の形態は、それがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのそれぞれの必須の部分ならびに標的ＤＮＡに相補的な領域を含有する限り、使用され得る。

【0062】

本開示のいくつかの実施態様において、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る。

【0063】

本開示のいくつかの実施態様において、ＲＧＥＮは、Ｃａｓタンパク質およびデュアルＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質およびｓｇＲＮＡからなり得る。代替的に、ＲＧＥＮは、Ｃａｓタンパク質およびｓｇＲＮＡをコードするそれぞれの核酸を、構成上の要素として含み得るが、これらに限定されない。

【0064】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡ（例えばｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ配列に相補的な配列を含有し得、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの上流、特にｓｇＲＮＡまたはデュアルＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端に位置する１以上の追加のヌクレオチドを含み得る。追加のヌクレオチドは、限定されないが、グアニン（Ｇ）残基であり得る。

【0065】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）に隣接した標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成する（すなわち、塩基対を形成するか、またはハイブリダイズする）ことが可能な配列を含み得る。

【0066】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一領域、およびステム１３〜１８ｂｐの長さによって特徴付けられたステム−ループ構造を含む第二領域を含み得る。所定の実施態様において、ステムは、配列番号２（５’−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＧＵＧ−３’）のヌクレオチド配列およびその相補的配列を含み得る。

【0067】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一領域、およびループ５〜１０ｂｐの長さによって特徴付けられたステム−ループ構造を含む第二領域を含み得る。ループは、配列番号３（５’−ＡＵＡＵＵＣＡＡ−３’）のヌクレオチド配列を含み得る。

【0068】

本開示のいくつかの実施態様において、上または後に記載されている、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、とりわけｓｇＲＮＡは、天然に存在しないものであり得るか、または操作されたものであり得る。さらに、各事項について記載された因子は、用途について一緒に組み合わせられ得る。

【0069】

本開示のいくつかの実施態様において、ＲＧＥＮの細胞内導入は、限定されないが、（１）細菌性の過剰発現の後に精製されたＣａｓ９タンパク質、および細胞におけるインビトロ転写の後に調製された特異的ＨＬＡ標的配列を認識するｓｇＲＮＡ（一本ガイドのＲＮＡ）を送達すること、または（２）Ｃａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡを運ぶプラスミドを発現または転写のために細胞中へ送達することによって達成され得る。

【0070】

さらに、本開示の範囲内で包含されたタンパク質、ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡは、限定することなく、エレクトロポレーション、またはリポソーム、ウイルスベクター、ナノ粒子、またはＰＴＤ（タンパク質転移ドメイン）融合タンパク質を使用した手法などの当該技術分野において既知の様々な方法を通じて細胞中へ導入され得る。

【0071】

いくつかの実施態様において、本開示の方法は、配列番号１のＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを切断するために、より特にはゲノムを編集するために使用され得る。これに関して、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有する活性形態にあり得る。

【0072】

所定の実施態様において、Ｃａｓタンパク質は、不活性化された（deactivated）（不活化された（inactivated））形態にあり得る。この場合において、本開示の方法は、配列番号１のＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡ配列が切断されないがＣａｓタンパク質に関連するように行われる。

【0073】

さらに、いくつかの他の実施態様において、Ｃａｓタンパク質、より特に、不活性化されたＣａｓタンパク質は、転写エフェクタードメインをさらに含み得る。詳細には、不活性化されたＣａｓタンパク質は、限定することなく、アクチベーター、リプレッサーなどに連結され得る。

【0074】

転写エフェクタードメインの場合、方法は、少なくともいくつかの実施態様において、転写調節またはエピジェネティック調節を含む、Ｃａｓによって媒介された遺伝子発現調節に適用され得る。

【0075】

別の側面にしたがって、本開示は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）に隣接した標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列を含む、単離されたガイドＲＮＡを提供する。単離されたガイドＲＮＡは、天然に存在するものではないか、または人為的に操作されたものであり得る。

【0076】

個々の要素は、上記のとおりである。

【0077】

本開示のいくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列が、１７〜２３ｂｐ、１８〜２３ｂｐ、１９〜２３ｂｐ、特に２０〜２３ｂｐ、より特に２１〜２３ｂｐの長さの範囲に及び得るが、これらに限定されることはない、一本ガイドＲＮＡであり得る。

【0078】

さらに、ガイドＲＮＡは、少なくともいくつかの実施態様において、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端のちょうど上流に１〜３の連続するグアニン（Ｇ）残基を含み得るが、これらに限定されない。さらに、追加のヌクレオチドの前述の記載は、この実施態様にもまた適用可能であり得る。

【0079】

また、本開示の別の側面にしたがって提供されるものは、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）に隣接した標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列を含むガイドＲＮＡ、または当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物である。

【0080】

各成分は、少なくともいくつかの実施態様において、上記のとおりである。

【0081】

本開示のいくつかの実施態様において、組成物は、配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）を認識するＣａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。

【0082】

さらに、所定の実施態様において、組成物はゲノム編集のために使用され得る。

【0083】

さらに、いくつかの実施態様において、組成物は、以下を含み得る：（ｉ）ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）に隣接した標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列を含むガイドＲＮＡ、または当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；および（ｉｉ）不活性化されたＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）または当該ｄＣａｓをコードする核酸。

【0084】

実施態様において、不活性化されたＣａｓタンパク質は、転写エフェクタードメインをさらに含み得る。

【0085】

本開示のいくつかの実施態様において、組成物は、標的ＤＮＡ配列を含む目的のＤＮＡを単離するために使用され得る。これに関して、不活性化されたＣａｓタンパク質は、分離および精製に有用なタグで標識され得るが、これに限定されない。タグは、上記のとおりであり得る。

【0086】

本開示のいくつかの実施態様において、組成物は、転写調節またはエピジェネティック調節を含む、Ｃａｓによって媒介された遺伝子発現調節のために使用され得る。

【0087】

本開示のいくつかの実施態様において、標的ＤＮＡは、単離された細胞、例えば、真核細胞に存在し得る。真核細胞の例は、酵母、真菌、原生動物、植物由来細胞、高等植物、昆虫または両生動物、およびＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、およびＣＯＳ−１細胞などの哺乳動物細胞を含む。限定することなく、培養された細胞（インビトロ）、移植細胞、初代細胞培養（インビトロおよびエクスビボ）、インビボ細胞、およびヒト細胞を含む哺乳動物細胞は、当該技術分野において一般的に使用される。

【0088】

なおさらなる側面にしたがって、本開示は、（ｉ）ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）に隣接した標的ＤＮＡ配列と二本鎖を形成することが可能な配列を含むガイドＲＮＡまたは当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；および（ｉｉ）ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）を認識するＣａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを提供する。

【0089】

個々の因子は上記のとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0090】

本開示のなお別の側面は、（ｉ）ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列に隣接した標的ＤＮＡ配列と二本鎖を形成することが可能な配列を含むガイドＲＮＡのための発現カセット、および（ｉｉ）ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質のための発現カセットを含む、組み換えウイルスベクターに関係する。

【0091】

個々の因子は上記のとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0092】

ウイルスベクターは、少なくともいくつかの実施態様において、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）由来のものであり得る。

【0093】

本開示のなお別の側面は、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な２１〜２３ｂｐの長さの配列を含む単離されたガイドＲＮＡに関係する。

【0094】

ガイドＲＮＡは上に定義されるとおりである。ガイドＲＮＡは、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0095】

本開示のさらになお別の側面は、ガイドＲＮＡまたは当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物に関係する。

【0096】

個々の因子は上記のとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0097】

組成物は、少なくともいくつかの実施態様において、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）を認識するＣａｓタンパク質、または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み得る。

【0098】

さらに、組成物は、いくつかの実施態様において、ＮＮＮＮＲＹＡＣ配列（配列番号１）を認識する不活性化されたＣａｓ、または当該不活性化されたＣａｓタンパク質をコードする核酸を含み得る。

【0099】

不活性化されたＣａｓタンパク質は、いくつかの実施態様において、転写エフェクタードメインをさらに含み得る。

【0100】

追加の側面によれば、本開示は、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列を含む第一領域、およびステムの１３〜１８ｂｐの長さによって特徴付けられたステム−ループ構造を含む第二領域を含む、単離されたガイドＲＮＡを提供する。

【0101】

個々の因子は上に定義されるとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0102】

所定の実施態様において、ステムは、配列番号２（５’−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＧＵＧ−３’）のヌクレオチド配列およびその相補的配列を含み得る。

【0103】

さらなる追加の側面によれば、本開示は、標的ＤＮＡ配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な配列を含む第一領域、およびループ５〜１０ｂｐの長さによって特徴付けられたステム−ループ構造を含む第二領域を含む、単離されたガイドＲＮＡを提供する。

【0104】

個々の因子は上に定義されるとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0105】

所定の実施態様において、ループは、配列番号３（５’−ＡＵＡＵＵＣＡＡ−３’）のヌクレオチド配列を含み得る。

【0106】

なお追加の側面によれば、本開示は、ガイドＲＮＡを含む組成物を、Ｃａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸とともに提供する。

【0107】

個々の因子は上に定義されるとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0108】

本開示のさらになお別の側面は、単離されたガイドＲＮＡまたは当該単離されたガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、Ｃａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と一緒に、細胞中に導入することを含む、細胞におけるゲノム編集のための方法を提供する。

【0109】

個々の因子は上に定義されるとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0110】

本開示のなおさらなる側面は、単離されたガイドＲＮＡまたは当該単離されたガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、Ｃａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸とともに、細胞中に導入することを含む、細胞において標的ＤＮＡを切断するための方法を提供する。

【0111】

個々の因子は上に定義されるとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0112】

所定の実施態様において、ガイドＲＮＡまたは当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質または当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と同時または順次に細胞中に導入され得る。

【0113】

本開示のなおさらなる側面は、以下を含む、標的ＤＮＡが認識するガイドＲＮＡの配列（すなわち、標的ＤＮＡを認識することを担当するガイドＲＮＡにおける配列）を調製するための方法を提供する：（ｉ）所与の配列においてＰＡＭ配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）の存在を同定すること；および（ｉｉ）ＰＡＭ配列の存在が工程（ｉ）において同定される場合、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）のちょうど上流に位置する配列を、ガイドＲＮＡによって認識可能であると決定すること。

【0114】

個々の因子は上に定義されるとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0115】

本開示のいくつかの実施態様において、ＰＡＭ配列の上流に位置する配列は、限定することなく、１７〜２３ｂｐ、１８〜２３ｂｐ、１９〜２３ｂｐ、より特に２０〜２３ｂｐ、およびさらにより特に２１〜２３ｂｐの長さの範囲に及び得る。

【0116】

本開示のなお別の側面は、以下を含む、目的のＤＮＡを単離するための方法を提供する：（ｉ）ガイドＲＮＡまたは当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、不活性化されたＣａｓタンパク質または当該不活性化されたＣａｓタンパク質をコードする核酸とともに細胞中に導入し、これによりガイドＲＮＡおよび不活性化されたＣａｓタンパク質を、標的ＤＮＡ配列を含む目的のＤＮＡと一緒に複合体を形成させること；および（ｉｉ）試料から複合体を分離すること。

【0117】

個々の因子は上に定義されるとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0118】

不活性化されたＣａｓタンパク質は、少なくともいくつかの実施態様において、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）を認識し得る。

【0119】

所定の実施態様において、目的のＤＮＡを単離する方法は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を目的のＤＮＡに特異的に結合させ、不活性化されたＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）を当該目的のＤＮＡとの目的のｄＣａｓ−ｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を形成させること；および試料から複合体を分離することによって行われ得る。

【0120】

目的のＤＮＡは、いくつかの実施態様において、ＰＣＲ増幅などのよく知られた検出方法を使用して同定され得る。

【0121】

単離方法は、いくつかの実施態様において、ＤＮＡ、ｇＲＮＡ、およびｄＣａｓの間の共有結合を介した架橋を形成することなく、インビトロ無細胞ＤＮＡに適合され得る。

【0122】

さらに、いくつかの実施態様において、単離方法は、複合体から目的のＤＮＡを単離することをさらに含み得る。

【0123】

不活性化されたＣａｓタンパク質は、いくつかの実施態様において、目的のＤＮＡを単離することにおける使用のためのアフィニティータグと連結され得る。アフィニティータグは、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグ、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）タグ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグ、ＣＢＰ（キチン結合タンパク質）タグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＳＢＰタグ、ｓｏｆｔａｇ１、ｓｏｆｔａｇ３、ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシル担体タンパク質）タグ、およびＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）タグからなる群から選択され得るが、これらに限定されない。

【0124】

不活性化されたＣａｓタンパク質は、いくつかの実施態様において、ＤＮＡ切断活性を欠くＣａｓタンパク質であり得る。

【0125】

目的のＤＮＡの単離は、いくつかの実施態様において、使用されるタグに結合することが可能なアフィニティーカラムまたは磁気ビーズを使用して達成され得る。例えば、Ｈｉｓタグが目的のＤＮＡを単離するために使用されるとき、Ｈｉｓタグに結合することが可能な金属アフィニティーカラムまたは磁気ビーズが用いられ得る。磁気ビーズは、限定されないが、Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズを含み得る。

【0126】

いくつかの実施態様において、複合体からの目的のＤＮＡの単離は、ＲＮａｓｅおよびプロテアーゼを使用して行われ得る。

【0127】

目的のＤＮＡを単離するための方法におけるいくつかの実施態様において、所定の遺伝子型のＤＮＡ、または２以上の種々の目的のＤＮＡが、２以上の種々の遺伝子型のＤＮＡの混合物を含有する単離された試料から単離され得る。当該方法が２以上の種々の目的のＤＮＡを単離することを伴うとき、２以上の種々の目的のＤＮＡについてそれぞれ特異的であるガイドＲＮＡは、２以上の目的のＤＮＡを単離するために用いられ得る。

【0128】

所定の実施態様において、ガイドＲＮＡは、一本ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡであり得る。ガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡであり得るか、またはプラスミドにおいてコードされ得る。

【0129】

単離方法は、所定の実施態様において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、１）目的のＤＮＡおよび２）不活性化されたＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）に特異的に結合させて、目的のＤＮＡとのｄＣａｓ−ｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を形成させること；および試料から複合体を分離することによって行われ得る。

【0130】

本開示のなお追加の側面は、標的ＤＮＡ配列を含む目的のＤＮＡにおいてＣａｓによって媒介された遺伝子発現調節のための方法を提供し、当該方法は、標的ＤＮＡを特異的に認識する単離されたガイドＲＮＡまたは当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、転写エフェクタードメインに融合した不活性化されたＣａｓタンパク質または当該不活性化されたＣａｓタンパク質をコードする核酸とともに、細胞中に導入することを含む。

【0131】

個々の因子は上に定義されるとおりである。これらの因子は、天然に存在しないものか、または操作されたものであり得る。

【0132】

例
以下の例は、ここで提供される本開示のいくつかの側面を説明する目的のために提供され、それらは本開示の範囲を何らかに限定するものとして解釈されるべきではない。

【0133】

Ｃ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム
例１：Ｃ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したゲノム編集
本発明者は、Ｃ．ジェジュニからＲＧＥＮを単離することに成功した。ゲノム編集に関するＣ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９に由来するＲＧＥＮの特性を同定するために、ヒトコドンについて最適化されたＣ．ジェジュニＣＡＳ９遺伝子が合成され（表１）、次いで当該遺伝子が哺乳動物の発現ベクター中へ挿入されて、ＨＡタグが付されたＮＬＳに連結されたＣａｓ遺伝子がＣＭＶプロモーター（図１）の調節下にある、Ｃ．ジェジュニＣＡＳ９発現カセットを構築した。

【表1】

【0134】

Ｃ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムの天然ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび標的特異的ｃｒＲＮＡからなる。ガイドＲＮＡが、それら自体において２つのＲＮＡ分子、または、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが互いに融合されている一本ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として使用されるという考えに鑑みて、本発明者は、Ｃ．ジェジュニｓｇＲＮＡ（表２）について発現プラスミドを設計し、構築した。

【表2】

【0135】

次いで、ヒトＡＡＶＳ１およびマウスＲｏｓａ−２６についての潜在的な標的遺伝子座が、Ｃ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムのＰＡＭ配列（ＮＮＮＡＣＡ）に基づき選択された（表３）。

【表3】

【0136】

Ｃ．ジェジュニＲＧＥＮが、哺乳動物細胞における内因性遺伝子の標的化の中断のために使用され得るかを検討するために、野生型および変異体ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションによって形成されたヘテロ二本鎖を特異的に認識し、かつ切断するＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）、ミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼを使用して、トランスフェクションされた細胞から単離されたゲノムＤＮＡが分析された。使用されたプライマー配列は、以下のとおりである（表４）。

【表4】

【0137】

結果として、変異（互換的に置換または変化）は、ＣＡＳ９タンパク質およびガイドＲＮＡが一緒に導入された細胞においてのみ検出された。変異頻度は、相対的なＤＮＡバンド強度に基づき測定されたとおり、ＲＮＡ用量依存的であることが見出された（図２Ａ）。さらに、ＰＣＲアンプリコンのＤＮＡシーケンシング分析は、内因性部位においてＲＧＥＮによって媒介された変異の誘導を裏付けた。エラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復の特性であるインデルおよびマイクロホモロジーが標的部位において観察された（図２Ｂ）。変異頻度は、ダイレクトシーケンシング（＝２つの変異体クローン／１２クローン）によって測定されたとおり１６．７％であった。

【0138】

同様に、マウスＲｏｓａ２６のＣ．ジェジュニＲＧＥＮがマウスＮＨＩ３Ｔ３細胞中へ送達されたとき、Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定されたとおり、変異が効果的に誘導された（図３Ａ）。さらに、ＰＣＲアンプリコンのＤＮＡシーケンシング分析は、内因性遺伝子部位における、Ｃ．ジェジュニＲＧＥＮによって媒介された変異の誘導を明らかにした（図３Ｂ）。変異頻度は、ダイレクトシーケンシング（２つの変異体クローン／９クローン）によって測定されたとおり２２．２％であることが見出された。

【0139】

例２：ｓｇＲＮＡの構造的な改変
Ｃ．ジェジュニｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、他の細菌種からのものよりも短いループ構造を含むであろうことを予想し、改変されたステムまたはループ構造が、例１において構築されたＣ．ジェジュニＲＧＥＮのｓｇＲＮＡを構造的に安定化するように設計された（表５）。

【表5】

【0140】

表５において、基準（norm）ステム部分は太字で示され、かつ下線が引かれている。

【0141】

改変されたｓｇＲＮＡが、ヒトＡＡＶＳ１のＣ．ジェジュニＲＧＥＮの標的部位を標的化するように導入され、変異が通常のｓｇＲＮＡ構造を通じて順調に誘導されたとき、同様な変異頻度が観察された（図４）。これに関して、使用されたプライマー配列は表４において示される。

【0142】

例３：ｓｇＲＮＡスペーサーの長さの最適化
標的配列を認識するＣ．ジェジュニｃｒＲＮＡのスペーサー配列は、文献において２０ｂｐの長さであるものと報告された。いずれのスペーサーの長さが最適であるかを決定するために、表６において示されるとおり、様々な長さを有するスペーサー、および追加のヌクレオチドを５’末端において有するｓｇＲＮＡ変異体構造（図５Ａ〜５Ｃ）を使用して、ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＣｊ Ｃａｓ９の４つの標的部位についてゲノム編集試験が行われた。この実験において使用された方法について、Genome Res. 2014 Jan; 24(1):132-41に対して参照がなされた。

【表6】

【0143】

ｓｇＲＮＡ発現ベクターが２９３細胞中へ送達されてから３日後、ゲノムＤＮＡは単離され、ディープシーケンシングによって変異効率について分析された。結果は、図５Ｃにおいて示される。見て取れるとおり、スペーサーが２１〜２３ｂｐの長さの範囲に及ぶとき、高い効率が検出された。さらに、２〜３の追加のＧ残基が２０ｂｐの長さのスペーサーのｓｇＲＮＡの５’末端に加えられたとき、ゲノム編集における改善さえもが観察された。

【表7】

【0144】

ここで、Ｆ^＊は、フォワードプライマーを示し、Ｒ^＊＊は、リバースプライマーを示す。

【0145】

例４：Ｃ．ジェジュニＣａｓ９ＰＡＭ配列の分析
本開示において、Ｃ．ジェジュニＣａｓ９のＰＡＭ配列は、既存の文献におけるデータに基づき「ＮＮＮＮＡＣＡ」を含むことが推定され、実験が行われた。５種のゲノム部位について構築された３４種のＣ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのうち、３種のみが活性を示した。特に、当該３種の活性なシステムにおける部位をカバーする配列の追加の分析は、ヌクレオチド「Ｃ」が、すべての３種の部位におけるＰＡＭ配列（ＮＮＮＮＡＣＡ）のすぐ後に同定されたことを示した（表８）。

【表8-1】

【表8-2】

【0146】

この結果に基づき、ＰＡＭ配列は「ＮＮＮＮＡＣＡＣ」を含有することが推定された。「ＡＣＡＣ」の各部位におけるヌクレオチドはＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃによって置換される一方、Ｃ．ジェジュニＣａｓ９の活性はＣ．ジェジュニＲＧＥＮのＰＡＭ配列を同定するために分析された。このため、サロゲートレポーターアッセイが利用された。結果として、Ｃ．ジェジュニは「ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）」（図６、ここで、Ｒはプリン残基（ＡまたはＧ）であり、Ｙはピリミジン残基（Ｃ／Ｔ）である）のＰＡＭ配列を含むことが同定された。この実験は、Nat Methods. 2011 Oct 9;8(11):941-3に記載されたサロゲートレポーターアッセイを使用して実施された。

【0147】

例５：Ｃ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の特異性およびＰＡＭ配列のアッセイ
ＡＡＶＳ１−ＣＪ１遺伝子座におけるＣ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９の切断部位は、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（本発明者によって開発され、特許保護のために提出された、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オフターゲットアッセイ）を使用してゲノムレベルで分析された。実験はNat Methods. 2015 Mar; 12(3):237-43に記載された方法を使用して実施された。

【0148】

Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−Ｓｅｑを通じて、ＡＡＶＳ１−ＣＪ１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が切断されたように見えた４１種の遺伝子座が決定された（表９におけるゲノム位置）。コンセンサス配列は当該４１種の遺伝子座の切断部位配列のアラインメントから得られ、例４において同定されたものと整合するＰＡＭが実証された。

【0149】

さらに、オフターゲットの変異がＤｉｇｅｎｏｍｅ−Ｓｅｑによって獲得された潜在的なオフターゲット中へ実際に導入されるかを検討するために、操作されたＡＡＶＳ１−ＣＪ１ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが送達された２９３細胞からのゲノムＤＮＡが、４０種の潜在的なオフターゲット部位についてディープシーケンシングに供された。表９に示されるとおり、顕著な変異は観察されなかった。

【表9-1】

【表9-2】

【0150】

さらに、コンセンサス配列は、インビトロで切断を示した４１種の遺伝子座の配列の全アラインメントから得られた。従来の結果と整合して、ＰＡＭはＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）として実際に観察された。

【0151】

例６：ＰＡＭの初めの２つのヌクレオチドにおける縮重
Ｃ．ジェジュニのＰＡＭ配列は、例５における「ＮＮＮＮＲＹＡＣ」ならびに「ＮＮＮＮＡＣＡＣ」であることが見出され、初めの２つの位置における縮重を示した。縮重を裏付けるために、ｓｇＲＮＡは、ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座のＣ．ジェジュニの７種のＰＡＭ標的配列（初めの２つの位置においてＧまたはＴ残基を有する（表１０））についてそれぞれ構築され、ＨＥＫ２９３細胞における変異効率について分析された。

【表10】

【0152】

７種の構築されたｓｇＲＮＡのうち、６種が変異を誘導することが見出され、ＰＡＭ配列の初めの２つの位置における縮重を実証した（図８）。したがって、この縮重は、ＰＡＭ配列の頻度を増加させ、Ｃ．ジェジュニのゲノム編集の正確性を改善させる。

【0153】

例７：ＡＡＶを使用したＣ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９送達を通じたゲノム編集
ゲノム編集が用途を見出す有望な分野間で代表的なものは、遺伝子および細胞治療のためのゲノム編集技術である。ゲノム編集の実際的な治療への用途は、操作されたヌクレアーゼおよびドナーＤＮＡを標的細胞へインビトロまたはインビボで効果的に送達するための臨床的に適用可能なベクターを必要とする。２種の最も広く使用された操作されたヌクレアーゼプラットフォームであるＴＡＬＥＮおよびＲＧＥＮは、それらの大きな大きさのために、確立された遺伝子治療ベクターに対する用途に限定されている。対照的に、本開示のＣ．ジェジュニＲＧＥＮは、これまで開発されたＲＧＥＮ間で最小のＣＡＳ９タンパク質およびｓｇＲＮＡからなる。その小さい大きさのおかげで、Ｃ．ジェジュニＲＧＥＮは、大きな大きさの遺伝子治療ベクターをゲノム操作において使用することができる。例えば、遺伝子治療のための最も重要なベクターの１つとして働くＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）は、これにより運ばれるＤＮＡの大きさについて厳格な限定を課し、したがって、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）、Ｓ．サーモフィルス（S. thermophilus）、もしくはＮ．メニンギティディス（N. meningitidis）に由来するＲＧＥＮまたは現在使用されている操作されたヌクレアーゼプラットフォームＴＡＬＥＮを適用することは困難である。対照的に、Ｃ．ジェジュニＲＧＥＮは、ＡＡＶベクターに適用され得る。

【0154】

本開示において、検討は、実際的なＡＡＶ送達を通じたＣ．ジェジュニＣａｓ９の運用からなる。この目的のために、Ｃ．ジェジュニＣａｓ９発現カセットおよびｓｇＲＮＡ発現カセットの両方を運ぶＡＡＶベクターが構築され（図９）、ＡＡＶを生産するために使用された。ＡＡＶによる感染後、マウスＣ２Ｃ１２細胞は、変異について定量的に分析された（図１０）。見て取れるとおり、ＡＡＶ用量依存的および時間依存的な様式で、標的部位において変異が誘導された。特に、高いＭＯＩ（１００）での感染から４週間後、標的部位において９０％以上の効率で変異が誘導された。

【0155】

したがって、Ｃ．ジェジュニＲＧＥＮは、培養された細胞においてゲノム編集を効果的に行うことが証明された。さらに、従来の研究において提案された配列は完璧ではないことが見出されたことから、Ｃ．ジェジュニＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのＰＡＭ配列が実際に決定された。さらに、Ｃ．ジェジュニＲＧＥＮは、その要素の小さい大きさのおかげで一本のウイルス中へ積載され得、したがって、効果的なゲノム編集のために使用され得る。

【0156】

ｄＣＡＳ９：ｇＲＮＡ複合体を使用した標的ＤＮＡの濃縮
さらに、標的ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ピオゲネスに由来する不活性化されたＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡからなるＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を使用して単離され、濃縮された。

【0157】

これに関して、ｄＣａｓ９タンパク質は、Ｈｉｓタグに選択的に結合するためのＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズを使用して精製され得るように、６つの連続するＨｉｓ残基でタグが付加された。さらに、ｄＣａｓタンパク質−ｓｇＲＮＡ複合体は、所定のＤＮＡ配列に特異的に結合できるが、ヌクレアーゼ活性を欠くことから、標的ＤＮＡの選択的な精製のために使用され得る。

【0158】

ガイドＲＮＡおよび不活性化されたＣａｓヌクレアーゼからなるＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）は、標的ＤＮＡを単離する能力について試験された。このため、まず、プラスミドｐＵＣ１９は制限酵素（ＳｐｅＩ、ＸｍａＩ、ＸｈｏＩ）によって消化され、それぞれ４１３４ｂｐ、２５７０ｂｐ、および１２６３ｂｐの長さのプラスミドＤＮＡフラグメントを産生した。

【0159】

制限酵素によって消化されたプラスミドＤＮＡフラグメントの各々について、２種の異なるｓｇＲＮＡが合成された（４１３４ｂｐ＿ｓｇ＃１、４１３４ｂｐ＿ｓｇ＃２、２５７０ｂｐ＿ｓｇ＃１、２５７０ｂｐ＿ｓｇ＃２、１２６３ｂｐ＿ｓｇ＃１、および１２６３ｂｐ＿ｓｇ＃２）。精製手順は、標的ＤＮＡに対応するｓｇＲＮＡを単独でまたは組み合わせて使用して実施された（４１３４ｂｐ＿ｓｇ＃１＋２、２５７０ｂｐ＿ｓｇ＃１＋２、および１２６３ｂｐ＿ｓｇ＃１＋２）。ｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列は、以下の表１１に列挙される。

【表11】

【0160】

ＤＮＡ：ｄＣａｓ９タンパク質：ｓｇＲＮＡを１：２０：１００のモル比で含有する全２００μｌの混合液は、３７oＣで１．５ｈｒインキュベートされた。次いで、当該溶液は、５０μｌのＨｉｓタグに特異的に結合するＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズと混合され、２００μｌの洗浄バッファーで２回洗浄され、その後、２００μｌの溶出バッファー（Bioneer、K-7200)でｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体を精製した。

【0161】

その後、溶出物は０．２ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ（Amresco、E866）で３７oＣで２ｈｒ、次いで０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで５５oＣで４５ｍｉｎインキュベートされ、ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９タンパク質の両方を除去した。標的ＤＮＡは単独でエタノールにおいて沈殿させた。

【0162】

結果として、個々の標的ＤＮＡについてｓｇＲＮＡを単独またはその２種を組み合わせて使用することによって、所望の標的ＤＮＡは、３種の消化されたＤＮＡフラグメントから大きさ毎に単離され得た。さらに、２種の異なる標的ＤＮＡについて全４種の異なるｓｇＲＮＡ（各標的ＤＮＡについて２種のｓｇＲＮＡ）などのｓｇＲＮＡの組み合わせによって複数の標的ＤＮＡが精製されたとき、標的ＤＮＡは対応するｓｇＲＮＡに関連し、そして精製された。当該結果は、各標的ＤＮＡが９５％以上の純度で単離され得るであろうことを示す。

【0163】

また、当該精製手法は、本開示のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１）を認識するＣａｓタンパク質に当てはまる。

【0164】

上の記載に基づき、ここで記載された本発明の実施態様への様々な変更は、技術的思想または以下の請求項において定義された本発明の必須の特徴から逸脱することなく、本発明を実施することにおいて用いられ得ることが、当業者によって理解されるべきである。これに関して、上に記載された例は、説明目的のためのものに過ぎず、本発明はこれらの例によって限定されることを意図されない。本発明の範囲は、以下の請求項または同等な概念の意味および範囲に由来する、すべての改変または改変された形態を含むものと理解されるべきである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]