特許 6715586 高度不飽和脂肪酸の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6715586

(24)【登録日】2020年6月11日

(45)【発行日】2020年7月1日

(54)【発明の名称】高度不飽和脂肪酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/64 20060101AFI20200622BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/64

【請求項の数】4

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2015-201819(P2015-201819)

(22)【出願日】2015年10月13日

(65)【公開番号】特開2017-73980(P2017-73980A)

(43)【公開日】2017年4月20日

【審査請求日】2018年9月21日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】松井 勇樹

(72)【発明者】

【氏名】加瀬 実

【審査官】 木原 啓一郎

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−２０８５４６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ ７／６４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＦＳＴＡ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に対し、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼと部分グリセリドリパーゼとを、それぞれ担体に固定化した固定化リパーゼとして同時に作用させて２．５〜５０時間加水分解し、高度不飽和脂肪酸を含有する脂肪酸を得る工程、を含む高度不飽和脂肪酸の製造方法。

【請求項2】

部分グリセリドリパーゼがペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）由来の部分グリセリドリパーゼである請求項１記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。

【請求項3】

高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂が、その油脂を構成する全脂肪酸中にドコサヘキサエン酸を１０〜７５質量％含む油脂である請求項１又は２記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。

【請求項4】

高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂がジグリセリドを０．１〜７５質量％含む油脂である請求項１〜３のいずれか１項記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高度不飽和脂肪酸を製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年の健康指向の高まりを受けて、油脂中の脂肪酸の機能について多数の研究がなされている。なかでも、魚油の構成成分であるエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６、ＤＨＡ）等の高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生理活性が注目され、高度不飽和脂肪酸は、医薬品や健康食品の原料等として活発に利用されている。

【0003】

工業的に利用される高度不飽和脂肪酸の多くはこれを豊富に含む油脂、例えば魚油から酵素反応を利用して製造される。一般的には、先ず、リパーゼの脂肪酸選択性を利用して高度不飽和脂肪酸を含む油脂から炭素数の少ない脂肪酸を遊離させ、高度不飽和脂肪酸を濃縮したグリセリド画分を得た後に、更に加水分解を行って、高度不飽和脂肪酸を高濃度に含有する脂肪酸を分取する。
そのため、加水分解率や高度不飽和脂肪酸の濃度を高める技術が種々検討され、例えば、高度不飽和脂肪酸を含む油脂をキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属由来のリパーゼを用いて加水分解することにより高度不飽和脂肪酸の濃縮油脂を得た後、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のリパーゼを用いて加水分解し、高度不飽和脂肪酸を高濃度に含有する脂肪酸を分取する方法（特許文献１）、リパーゼを用いて高度不飽和脂肪酸を含む油脂を加水分解して高度不飽和脂肪酸の濃縮油脂を得た後、これを特定の２種のリパーゼを同時に作用させて加水分解することにより高度不飽和脂肪酸を高濃度に含有する脂肪酸を得る方法（特許文献２）等が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平７−５１０７５号広報

【特許文献2】特開２００４−２０８５４６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

前記特許文献２では、高度不飽和脂肪酸を濃縮した油脂に対して、トリグリセリドに作用するリパーゼと部分グリセリドリパーゼを同時に作用させるため、油脂中のトリグリセリド、ジグリセリド及びモノグリセリド全ての上に濃縮された高度不飽和脂肪酸を利用することができ、特許文献１に比べて高い収率で高度不飽和脂肪酸を得ることができる。
しかしながら、特許文献２で使用されるリパーゼにおいては高度不飽和脂肪酸を濃縮した油脂を加水分解するために長時間を要するという問題があった。
従って、本発明は、高度不飽和脂肪酸を短時間で且つ高い収率で製造する新たな方法を提供しようとするものである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者は、上記課題に鑑み鋭意研究を行ったところ、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含む油脂を、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼと部分グリセリドリパーゼとを併用して加水分解すれば、短い時間で反応が進行し、しかも高い収率で、高度不飽和脂肪酸を得られることを見出した。

【0007】

すなわち、本発明は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に対し、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼと部分グリセリドリパーゼとを同時に作用させて加水分解し、高度不飽和脂肪酸を含有する脂肪酸を得る工程、を含む高度不飽和脂肪酸の製造方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、高度不飽和脂肪酸を含む油脂を短時間で効率的に加水分解することができ、高度不飽和脂肪酸を高い収率で得ることができる。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明の高度不飽和脂肪酸の製造方法は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に対し、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼと部分グリセリドリパーゼとを同時に作用させて加水分解し、高度不飽和脂肪酸を含有する脂肪酸を得る工程、を含む。

【0010】

本発明において、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）とは、二重結合を３個以上有する炭素数２０以上の脂肪酸を意味する。具体的には、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６、ＤＨＡ）、アラキドン酸（Ｃ２０：４、ＡＡ）等が挙げられ、ω３系高度不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸が好ましい。

【0011】

高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂とは、少なくとも１つ以上の高度不飽和脂肪酸がグリセリンにエステル結合で付加しているグリセリドであり、トリグリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれら２種以上の混合物である。尚、構成脂肪酸として高度不飽和脂肪酸が結合していないグリセリドが含まれていてもよい。
高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂としては、一般的には、魚油、藻油等の微生物油が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。魚油とは、水産動物油脂であり、例えば、イワシ、ニシン、サンマ、サバ、カツオ、マグロ、クジラ、イカ、たら肝臓等の原料から採取することができる。また、藻油は、緑藻綱、珪藻綱等に属する藻類から採取することができる。これらは、酵素反応前に、不純物を除くために、適宜、液−液分液、濾過、遠心分離等公知の分離手段や精製手段を行なうのが好ましい。
また、油脂を構成する脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸の比率を高めた所謂高度不飽和脂肪酸濃縮油を用いてもよい。構成脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸の比率を高める方法としては、従来公知の方法、例えば、リパーゼを用いて高度不飽和脂肪酸以外の脂肪酸を優先的に遊離・除去する方法や溶剤分別法等が挙げられ、いずれの方法も使用できる。
また、市販されている高度不飽和脂肪酸含有油脂、高度不飽和脂肪酸濃縮油を用いてもよい。

【0012】

高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂中、油脂を構成する全脂肪酸に対するＤＨＡの含有量は、グリセリド中のＤＨＡ濃度を高くできる点から、１０〜７５質量％であることが好ましく、更に１５〜６５質量％、更に２０〜５５質量％であることが好ましい。なお、本明細書における脂肪酸量は遊離脂肪酸換算量である。

【0013】

高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂は、ジグリセリドを０．１〜７５質量％、更に０．５〜６５質量％、更に１〜６０質量％含有する油脂であるのが、ＤＨＡを濃縮しやすくする点から好ましい。
また、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂中、トリグリセリドの含有量は、２５〜９９．８質量％、更に３５〜９９.５質量％、更に４０〜９９質量％であるのが、同様の点から好ましい。
また、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂中、モノグリセリドの含有量は、０．０１〜１０質量％、更に０．１〜７質量％、更に０．５〜５質量％であるのが、同様の点から好ましい。
また、遊離脂肪酸又はその塩の含有量は、油脂の工業的生産性、劣化抑制の点から、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂中に０．０１〜１０質量％が好ましく、更に０．０２〜５質量％が好ましい。

【0014】

本発明で用いられる１，３−位を優先的に分解するリパーゼは、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属を起源とするリパーゼで、トリグリセリドのｓｎ−１位とｓｎ−３位に特異性を示す。
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼの市販品としては、例えば、リパーゼＱＬＭ（名糖産業（株）製）がある。

【0015】

アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼは、当該リパーゼを担体に固定化した固定化リパーゼを用いることが、リパーゼ活性を有効利用できる点、コストの点から好ましい。リパーゼを固定化する固定化担体、固定化方法については後述する部分グリセリドリパーゼと共通である。

【0016】

本発明で用いられる部分グリセリドリパーゼは、モノグリセリド及びジグリセリドを加水分解するが、トリグリセリドを加水分解し難いリパーゼである。したがって、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に部分グリセリドリパーゼを作用させることで、主に油脂中の部分グリセリドが分解される。
部分グリセリドリパーゼとしては、ラット小腸、ブタ脂肪組織等の動物臓器由来のモノグリセリドリパーゼ又はジグリセリドリパーゼ；バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｈ−２５７由来モノグリセリドリパーゼ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２７，４１９−４２５，２０００）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＬＰ７３１５由来モノグリセリドリパーゼ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９１（１），２７−３２，２００１）、ペニシリウム・サイロピウム由来リパーゼ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，８７（１），２０５−２１１，１９８０）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）Ｕ−１５０由来リパーゼ（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７２（３），１６２−１６７，１９９１）等が挙げられる。なかでも、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）由来の部分グリセリドリパーゼが好ましい。
市販品としては、例えば「モノグリセライドリパーゼ（ＭＧＬＰＩＩ）」（旭化成社）、「リパーゼＧ「アマノ」５０」（天野エンザイム社）等がある。

【0017】

部分グリセリドリパーゼは、当該リパーゼを担体に固定化した固定化部分グリセリドリパーゼを用いることがリパーゼ活性を有効利用できる点から好ましい。
固定化担体としては、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられる。なかでも、保水力が高い点からイオン交換樹脂が好ましい。また、イオン交換樹脂の中でも、大きな表面積を有することにより酵素の吸着量を高くできるという点から、多孔質であることが好ましい。

【0018】

固定化担体として用いる樹脂の粒子径は５０〜２０００μｍが好ましく、更に１００〜１０００μｍが好ましい。細孔径は１０〜１５０ｎｍが好ましく、更に１０〜１００ｎｍが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、更にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ社製Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８）がリパーゼ吸着性向上の点から好ましい。
このとき、用いるリパーゼ量は、担体質量に対して１０〜３００質量％、更に３０〜２００質量％、更に５０〜１５０質量％が工業的生産性の点から好ましい。固定化の際、リパーゼを溶液状態にするが、緩衝剤を用いてｐＨ３〜７に調整して用いることが好ましい。固定化時の温度は０〜６０℃、更に３〜４０℃が好ましい。

【0019】

固定化リパーゼの活性を高めるために、リパーゼの固定化前に予め脂溶性脂肪酸又はその誘導体を担体に吸着させる処理を施しても良い。処理を施す方法としては、例えば、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等の有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加える方法が挙げられる。
使用する脂溶性脂肪酸としては、炭素数８〜１８の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基が置換していても良い脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、リシノール酸等が挙げられる。またその誘導体としては、これらの脂肪酸と一価又は多価アルコールとのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加した誘導体が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体は、２種以上を併用しても良い。

【0020】

アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼは、Ｄｏｌｅ法により測定した力価が１００Ｕ／ｇ以上、更に１，０００〜１，０００，０００Ｕ／ｇ、更に１０，０００〜５００，０００Ｕ／ｇの範囲であることが好ましい。
部分グリセリドリパーゼはＬＶ乳化法により測定した脂肪消化力が１００Ｕ／ｇ以上、更に１，０００〜１，０００，０００Ｕ／ｇ、更に１０，０００〜５００，０００Ｕ／ｇの範囲であることが好ましい。

【0021】

アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼと部分グリセリドリパーゼの使用量（乾燥質量）は、リパーゼの活性を考慮して適宜決定することができるが、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼは、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に対して、０．０１〜２０質量％、更に０．０２〜１０質量％、更に０．０５〜５質量％使用するのが工業的生産性の点から好ましい。固定化リパーゼの場合は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に対して、０．１〜３５質量％、更に１〜２５質量％、更に３〜１５質量％使用するのが工業的生産性の点から好ましい。
また、部分グリセリドリパーゼは、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に対して、０．０１〜２０質量％、更に０．０２〜１０質量％、更に０．０５〜５質量％使用するのが工業的生産性の点から好ましい。固定化部分グリセリドリパーゼの場合は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に対して、０．１〜３５質量％、更に１〜２５質量％、更に３〜１５質量％使用するのが工業的生産性の点から好ましい。

【0022】

高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に前記リパーゼを作用させるには、当該油脂とリパーゼとを接触させればよく、接触手段としては、浸漬、攪拌、該固定化酵素を充填したカラムにポンプ等で通液すること等が挙げられる。攪拌する場合には、反応槽径によって異なるが、固定化リパーゼが沈降せず、破砕を抑制し、効率的に加水分解反応を進行させる点から、１０〜１０００ｒ／ｍｉｎが好ましく、更には２０〜７００ｒ／ｍｉｎ、更には３０〜５００ｒ／ｍｉｎが好ましい。

【0023】

本発明において、油脂の加水分解は、回分式、連続式、又は半連続式で行うことができる。油脂と水の装置内への供給は、並流式、向流式どちらでもよい。加水分解反応装置に供給される油脂及び水は、必要により予め脱気又は脱酸素した油脂及び水を用いてもよい。

【0024】

油脂の加水分解反応は、得られる加水分解油中の脂肪酸濃度によって管理し、所定の脂肪酸濃度に到達した時点で終了することができる。なお、本発明における「遊離脂肪酸濃度」は、後述の〔分析方法〕（iii）に記載した方法に従って求めた値をいう。
本発明において、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂の加水分解反応は、ＤＨＡ濃度・収率を高くできる点から、遊離脂肪酸濃度が８２〜９９質量％、更に８６〜９８質量％、更に９１〜９７質量％となるまで行うことが好ましい。

【0025】

加水分解反応において、反応系内の水分量は、工業的な生産性の観点から、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂に対して、５〜５００質量％、更に１０〜３００質量％、更に２０〜２００質量％とすることが好ましい。

【0026】

加水分解の反応温度は、リパーゼの特性によって決定することができるが、反応速度を向上する点、酵素の失活を抑制する点から、０〜８０℃、更に１０〜７０℃、更に２０〜６０℃が好ましい。

【0027】

また、反応時間は、工業的な生産性の点から、１〜２００時間が好ましく、更に２〜１００時間、更に２．５〜５０時間が好ましい。本発明の方法では、前記２種のリパーゼを同時に使用することにより短時間で効率的に加水分解することができる。

【0028】

加水分解反応は、空気との接触が出来るだけ回避されるように、窒素等の不活性ガス存在下で行うことが好ましい。

【0029】

加水分解反応により得られる加水分解油には、高度不飽和脂肪酸を含む遊離した脂肪酸の他に、未反応の油脂、すなわちトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドが含まれる。したがって、加水分解反応物から、リパーゼ、グリセリン等を含む水層を除去した後、例えば、クロマトグラフィー、分子蒸留、液液分配、結晶分別、脱酸法等の分別手段、好ましくは蒸留により高度不飽和脂肪酸を含有する遊離脂肪酸画分を分取するのが好ましい。蒸留条件は特に制限されない。次いで、更に吸着剤処理、ろ過等を行うこともできる。

【0030】

以上の処理により得られる脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸の含有量が高いものである。脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸のＤＨＡ含有量は、１０〜７５質量％が好ましく、更に２０〜６５質量％、更に３０〜５５質量％、更に４５〜５５質量％が品質の点から好ましい。

【0031】

高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂からの高度不飽和脂肪酸の収率は、８４〜９９．９質量％、更に８７〜９９質量％、更に９１〜９８質量％であることが製造効率の点から好ましい。

【実施例】

【0032】

〔原料油脂〕
原料油脂として、表１に示す高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂（ＤＤオイル ＤＨＡ-４６、日本水産（株）製）を用いた。

【0033】

〔分析方法〕
（ｉ）構成脂肪酸組成の測定
日本油化学会編「基準油脂分析試験法２００３年版」中の「メチルエステル化法（三フッ化ホウ素メタノール法）（２．４．１．２−１９９６）」に従って測定した。
トリヘンイコサノイン（和光純薬工業製）を内部標準として、試料から脂肪酸メチルエステルを調製し、得られたサンプルをガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）に供して、構成脂肪酸の分析を行った。

【0034】

（ii）グリセリド組成の測定
「グリセリド組成」は、ガラス製サンプル瓶に、サンプル１０ｍｇとトリメチルシリル化剤（「シリル化剤ＴＨ」、関東化学製）０．５ｍＬを加え、密栓した後、７０℃で１５分間加熱した。これに蒸留水１．０ｍＬ、ヘキサン２．０ｍＬを加えて、混合後、ヘキサン層をガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）に供して、グリセリド組成の分析を行った。

【0035】

（iii）遊離脂肪酸濃度の算出
遊離脂肪酸濃度は、加水分解油の酸価及び脂肪酸組成を測定し、油脂製品の知識（（株） 幸書房）に従って、次の式（１）で求めた。
遊離脂肪酸濃度（質量％）＝ｘ×ｙ／５６．１／１０ （１）
（ｘ＝酸価［ｍｇ-ＫＯＨ／ｇ］、ｙ＝脂肪酸組成から求めた平均分子量）

【0036】

（iv）酸価の測定
日本油化学会編「基準油脂分析試験法２００３年版」中の「酸価（２．３．１−１９９６）」に従って測定した。

【0037】

【表1】

【0038】

〔固定化リパーゼＱＬＭ〕
まず、アニオン交換樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ社製）１００ｇに対して０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液１０００ｍＬを加え、１時間攪拌し、アルカリ洗浄した。その後、固定化担体を１０００ｍＬの蒸留水で１時間洗浄し、５００ｍＭのリン緩衝液（ｐＨ７）１０００ｍＬで２時間ｐＨの平衡化を行った。続いて、５０ｍＭのリン緩衝液（ｐＨ７）１０００ｍＬで２時間ずつ２回、ｐＨの平衡化を行った。終了後、エタノール５００ｍＬでエタノール置換を３０分間行った。濾過した後、大豆脂肪酸から飽和脂肪酸を除いた低融点脂肪酸を１００ｇ含むエタノール５００ｍＬを加え、３０分間吸着操作を行った。その後、担体を回収した後、５０ｍＭのリン緩衝液（ｐＨ７）５００ｍＬで４回洗浄し、エタノールを除去し、濾過して担体を回収した。
次いで、回収した担体と、市販のアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼ（リパーゼＱＬＭ，名糖産業製、力価１０３０００Ｕ/ｇ）１００ｇを５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ７）１８００ｍＬに溶解させた酵素溶液１９００ｍＬとを２時間接触させ、固定化を行った。１，３位を優先的に分解するリパーゼは担体質量に対して１００質量％用いた。回収した固定化酵素を、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ７）５００ｍＬで洗浄し、吸着しなかった酵素や蛋白を除去した。以上の操作はいずれも常圧２０℃で行った。その後、菜種油４００ｇを加え、４０℃、２時間攪拌した後、濾過して菜種油と分離し、固定化酵素とした。
こうして得られた固定化リパーゼＱＬＭを、使用前に実際に反応を行う基質である原料油脂で洗浄した。

【0039】

〔固定化リパーゼＡＹの製造方法〕
リパーゼＱＬＭを、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属由来のリパーゼＡＹ「アマノ」３０−ＳＤ（天野エンザイム製、脂肪消化力３７９００Ｕ/ｇ）に変えた以外は、固定化リパーゼＱＬＭと同じ製造法で固定化リパーゼＡＹを得た。

【0040】

〔固定化リパーゼＧの製造方法〕
リパーゼＱＬＭを、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）由来のリパーゼＧ「アマノ」５０（天野エンザイム製、脂肪消化力５４３００Ｕ/g）に、リン酸緩衝液（ｐＨ７）を酢酸緩衝液（ｐＨ５）に変更した以外は、固定化リパーゼＱＬＭと同じ製造法で固定化リパーゼＧを得た。

【0041】

〔蒸留方法〕
加水分解反応により得られた加水分解油をワイプトフィルム蒸発装置（２−０３型：神鋼環境ソリューション製）により、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）及びモノグリセリド（ＭＧ）から成る留分とトリグリセリド（ＴＧ）及びジグリセリド（ＤＧ）から成る残渣に分画した。蒸留条件は、温度２３０℃、圧力２Ｐａ以下、油供給流量１００ｍＬ／ｈｒで処理した。

【0042】

〔実施例１〕
表１に示す高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有する油脂（以下、原料油脂と記する）に対して、酵素加水分解反応を行った。酵素は、リパーゼＱＬＭ（ＱＬＭ、名糖産業製、力価１０３０００Ｕ/ｇ）及びリパーゼＧ「アマノ」５０（Ｇ、天野エンザイム製、脂肪消化力５４３００Ｕ/g）の粉体を併用した。仕込み条件は、２００ｍＬの４つ口フラスコに原料油脂３０ｇ、水３０ｇ、酵素量は各０．３ｇを仕込んだ。加水分解反応条件は、常圧、温度４０℃、撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、反応時間４８ｈｒとした。
反応終了後、加水分解油の酸価及びグリセリド組成を分析した。その後、上述した蒸留方法により分離した（ＤＧ＋ＴＧ）画分（＝残渣）および（ＦＦＡ＋ＭＧ）画分（＝留分）中のＤＨＡ濃度を、ガスクロマトグラフィーにより分析した。ここで、本系においては、加水分解油中のＭＧ濃度はいずれも６質量％以下となった。従って、蒸留操作により得た留分は全て遊離脂肪酸とみなした。留分のＤＨＡ収率（％）は式（２）より求めた。

【0043】

留分のＤＨＡ収率（％）＝{留分のＤＨＡ濃度×留分重量}/{［留分のＤＨＡ濃度×留分重量］＋［残渣のＤＨＡ濃度×残渣重量］}・・・・（２）

【0044】

表２に示す結果より、遊離脂肪酸濃度は８９．３質量％に達し、原料油脂からの加水分解が進行した。また、留分のＤＨＡ濃度は、原料油脂中のＤＨＡ濃度４５．６％に対して、４５．２質量％を示した。その際のＤＨＡ収率は、９０.１％となった。

【0045】

〔実施例２〕
酵素は、固定化リパーゼＱＬＭと固定化リパーゼＧを併用した。仕込み条件は、原料油脂２００ｇに対して水２００ｇ、固定化酵素量は各２０ｇとした。加水分解反応条件は、常圧、温度４０℃、撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、反応時間４８ｈｒとした。
反応終了後、加水分解油の酸価及びグリセリド組成を定量した。その後、蒸留により分離した各画分中のＤＨＡ濃度をガスクロマトグラフィーにより定量した。
その結果、遊離脂肪酸濃度は９４．５質量％に達し、ＱＬＭ単用時に比べ加水分解が進行したことが明らかになった。また、留分のＤＨＡ濃度は、４７．３質量％を示し、原料油脂中のＤＨＡ濃度よりも高くなり、ＤＨＡが選択的に分解された。その際のＤＨＡ収率は、９６．８％となり、ＤＨＡをほぼ遊離できることが示された。

【0046】

〔比較例１〕
酵素は、リパーゼＱＬＭ（名糖産業製）の粉体を使用した。仕込み条件は、原料油脂３０ｇに対して水３０ｇ、酵素量は０．３ｇとした。加水分解反応条件は、常圧、温度４０℃、撹拌速度３００ｒｐｍ、反応時間４８ｈｒとした。
反応終了後、酸価及びグリセリド組成を定量した。その後、カラムにより分離した各画分中のＤＨＡ濃度をガスクロマトグラフィーにより定量した。遊離脂肪酸濃度は７６．５１質量％であった。留分のＤＨＡ濃度は、４２．７質量％を示した。その際のＤＨＡ収率は、７６．４％となった。

【0047】

〔比較例２〕
酵素は、固定化リパーゼＱＬＭを使用した。仕込み条件は、原料油脂２００ｇに対して水２００ｇ、酵素量は２０ｇとした。加水分解反応条件は、常圧、温度４０℃、撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、反応時間４８ｈｒとした。
反応終了後、加水分解油の酸価及びグリセリド組成を定量した。その後、蒸留により分離した各画分中のＤＨＡ濃度をガスクロマトグラフィーにより定量した。遊離脂肪酸濃度は７３．８質量％となった。また、留分のＤＨＡ濃度は、４４．５質量％を示した。その際のＤＨＡ収率は、７５．９％となった。

【0048】

〔比較例３〕
酵素は、固定化リパーゼＡＹを使用した。仕込み条件は、原料油脂２００ｇに対して水２００ｇ、酵素量は２０ｇとした。加水分解反応条件は、常圧、温度４０℃、撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、反応時間４８ｈｒとした。
反応終了後、加水分解油の酸価及びグリセリド組成を定量した。その後、カラムにより分離した各画分中のＤＨＡ濃度をガスクロマトグラフィーにより定量した。遊離脂肪酸濃度は４５．８質量％となり、加水分解はリパーゼＱＬＭに比べて進行しなかった。留分のＤＨＡ濃度については、２８．０質量％と比較的低い値を示した。その際のＤＨＡ収率は、３１．１％となった。

【0049】

〔比較例４〕
酵素は、固定化リパーゼＡＹ及び固定化リパーゼＧを併用した。仕込み条件は、原料油脂２００ｇに対して水２００ｇ、各酵素量は２０ｇとした。加水分解反応条件は、常圧、温度４０℃、撹拌速度３００ｒ／ｐｍ、反応時間４８ｈｒとした。
反応終了後、加水分解油の酸価及びグリセリド組成を定量した。その後、カラムにより分離した各画分中のＤＨＡ濃度をガスクロマトグラフィーにより定量した。遊離脂肪酸濃度は８１．１質量％に達した。また、留分のＤＨＡ濃度は、４３．０質量％を示した。その際のＤＨＡ収率は、８３．４％となった。

【0050】

実施例及び比較例の結果を表２に示す。

【0051】

【表2】

【0052】

表２より明らかなように、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属由来の１，３位を優先的に分解するリパーゼと部分グリセリドリパーゼとを同時に作用させた実施例１は、遊離脂肪酸濃度が高く、短時間で収率良くＤＨＡを得ることができた。更に、実施例２に示す通り、上記のリパーゼを固定化することにより、遊離脂肪酸濃度を向上させ、ＤＨＡを高収率で得ることができた。