特許 6716198 検体分析方法および検体分析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6716198

(24)【登録日】2020年6月12日

(45)【発行日】2020年7月1日

(54)【発明の名称】検体分析方法および検体分析装置

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20200622BHJP

   C12Q 1/6841 20180101ALI20200622BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20200622BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200622BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20200622BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20200622BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20200622BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20200622BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20200622BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68

   C12Q1/6841 Z

   C12Q1/686 Z

   G01N33/53 M

   G01N33/574 D

   G01N21/64 F

   G01N21/78 C

   C12Q1/02

   C12M1/00 A

【請求項の数】9

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2015-65666(P2015-65666)

(22)【出願日】2015年3月27日

(65)【公開番号】特開2016-185075(P2016-185075A)

(43)【公開日】2016年10月27日

【審査請求日】2018年3月15日

(73)【特許権者】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100111383

【弁理士】

【氏名又は名称】芝野 正雅

(72)【発明者】

【氏名】久保 卓也

(72)【発明者】

【氏名】岩永 茂樹

【審査官】 斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００２３４３３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１２００６０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０８−０３３５００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００２７５１８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 藤田克昌，化学とバイオイメージング，化学と生物，２０１１年，Vol.49, No.12，pp.852-856

【文献】 小路武彦，光顕in situハイブリダイゼーションによる特異的ＲＮＡ分子の細胞質内不均一分布証明，電子顕微鏡，２００２年，Vol.37, No.2，P.77-80

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｇ０１Ｎ １／３４

Ｇ０１Ｎ ３３／５３−３３／６０

Ｇ０１Ｎ ２１／６２−２１／７４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

測定試料に対する脱パラフィン処理工程と、
前記測定試料に対する賦活化処理工程と、
前記測定試料に対するプロテアーゼ処理工程と、
前記測定試料に熱を与えてＤＮＡに変性を生じさせるＤＮＡ変性処理工程と、
前記測定試料から生じる自家蛍光を抑制するブリーチング工程と、
前記測定試料中の被検物質に蛍光色素を結合させる標識工程と、
前記測定試料に光を照射して前記蛍光色素から生じる蛍光を撮像する撮像工程と、を含み、
前記ブリーチング工程の前に前記脱パラフィン処理工程、前記賦活化処理工程、前記プロテアーゼ処理工程および前記ＤＮＡ変性処理工程を行い、
前記脱パラフィン処理工程は、前記測定試料を４４℃以上に高める処理を含み、
前記賦活化処理工程および前記ＤＮＡ変性処理工程は、前記測定試料を６２℃以上に高める処理を含む、検体分析方法。

【請求項2】

前記ブリーチング工程は、前記測定試料に光を照射して前記測定試料から生じる前記自家蛍光を抑制する、請求項１に記載の検体分析方法。

【請求項3】

前記撮像工程により得られた撮像画像を処理して前記被検物質を検出する解析工程をさらに含む、請求項１または２に記載の検体分析方法。

【請求項4】

前記測定試料は、乳癌の病変組織から採取した細胞であり、
前記被検物質は、ＨＥＲ２遺伝子である、請求項１ないし３の何れか一項に記載の検体分析方法。

【請求項5】

前記蛍光色素は、励起用の光が照射されると蛍光が励起される活性状態と、前記励起用の光が照射されても蛍光が励起されない不活性状態と、にスイッチング可能であり、
前記撮像工程は、前記蛍光色素を消光させる不活性化処理と、消光された前記蛍光色素のうち一部の前記蛍光色素を活性化する活性化処理と、測定試料に前記励起用の光を照射して前記蛍光を撮像する撮像処理と、を含む、請求項１ないし４の何れか一項に記載の検体分析方法。

【請求項6】

測定試料に含まれる被検物質を撮像するための前処理を前記測定試料に施す前処理部と、
前記前処理部により前処理が施された前記測定試料を撮像する撮像部と、
前記撮像部により得られた撮像画像を処理して前記被検物質を抽出する解析部と、
を備え、
前記前処理部は、
前記測定試料に対する脱パラフィン処理を行う処理ユニットと、
前記測定試料に対する賦活化処理を行う処理ユニットと、
前記測定試料に対するプロテアーゼ処理を行う処理ユニットと、
前記測定試料に熱を与えてＤＮＡに変性を生じさせるＤＮＡ変性処理を行う処理ユニットと、
前記測定試料に自家蛍光を抑制するためのブリーチング処理を行う処理ユニットと、
前記測定試料中の被検物質に蛍光色素を結合させる標識処理を行う処理ユニットと、を含み、
前記脱パラフィン処理を行う処理ユニット、前記賦活化処理を行う処理ユニット、前記プロテアーゼ処理を行う処理ユニットおよび前記ＤＮＡ変性処理を行う処理ユニットは、前記ブリーチング処理を行う処理ユニットよりも先に前記測定試料に処理を行い、
前記撮像部は、
前記前処理が施された前記測定試料に光を照射して前記蛍光色素から生じる蛍光を撮像し、
前記脱パラフィン処理は、前記測定試料を４４℃以上に高める処理を含み、
前記賦活化処理および前記ＤＮＡ変性処理は、前記測定試料を６２℃以上に高める処理を含む、検体分析装置。

【請求項7】

前記ブリーチング処理を行う処理ユニットは、前記測定試料に光を照射して前記測定試料から生じる前記自家蛍光を抑制する、請求項６に記載の検体分析装置。

【請求項8】

前記測定試料は、乳癌の病変組織から採取した細胞であり、
前記被検物質は、ＨＥＲ２遺伝子である、請求項６または７に記載の検体分析装置。

【請求項9】

前記蛍光色素は、励起用の光が照射されると蛍光が励起される活性状態と、前記励起用の光が照射されても蛍光が励起されない不活性状態と、にスイッチング可能であり、
前記撮像部は、前記蛍光色素を消光させる不活性化処理と、消光された前記蛍光色素のうち一部の前記蛍光色素を活性化する活性化処理と、測定試料に前記励起用の光を照射して前記蛍光を撮像する撮像処理と、を実行する、請求項６ないし８の何れか一項に記載の検体分析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、測定試料を撮像した撮像画像により測定試料中の被検物質を分析する検体分析方法および検体分析装置に関する。

【背景技術】

【0002】

所定の疾病においては、特定の遺伝子や特定のタンパク質等が、病状の進行に関与する。被験者から採取した細胞について特定の物質の存在および状況を確認することは、これら疾病の診断や治療方針を決定する際に極めて有用である。

【0003】

特定の物質の検出は、たとえば、特定の物質を蛍光色素により標識し、蛍光色素から生じる蛍光を撮像することにより行われる。被検細胞を含む測定試料に光を照射することにより蛍光色素から蛍光が励起されるが、測定試料によっては、励起用の光の照射により測定試料自身から自家蛍光が生じる場合がある。この自家蛍光は、蛍光色素から生じる蛍光に対しバックグラウンドノイズとなる。

【0004】

特許文献１には、この自家蛍光を抑制する手法が記載されている。特許文献１に記載の手法では、測定試料に光を照射することにより自家蛍光の発生が抑制される。このように測定試料に所定の作用を付与して自家蛍光を抑制することを、一般にブリーチングと呼ぶ。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許公開公報 ＵＳ２０１０／０１２００６０Ａ１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

病状の進行に従って増幅する特定の遺伝子として、乳癌の予後因子であるＨＥＲ２遺伝子が知られている。本願発明者らは、被験者の病変組織から採取した乳癌を模擬したゼノグラフトでできた測定試料に対し乳癌の細胞分析を行う際に、上記特許文献１の手法を適用して自家蛍光の抑制を試みた。しかしながら、測定試料から生じる自家蛍光を効果的に抑制できず、蛍光色素から得られる蛍光を精度良く検出できなかった。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の第１の態様に係る検体分析方法は、測定試料に対する脱パラフィン処理工程と、前記測定試料に対する賦活化処理工程と、前記測定試料に対するプロテアーゼ処理工程と、前記測定試料に熱を与えてＤＮＡに変性を生じさせるＤＮＡ変性処理工程と、前記測定試料から生じる自家蛍光を抑制するブリーチング工程と、前記測定試料中の被検物質に蛍光色素を結合させる標識工程と、前記測定試料に光を照射して前記蛍光色素から生じる蛍光を撮像する撮像工程と、を含む。検体分析方法は、前記ブリーチング工程の前に前記脱パラフィン処理工程、前記賦活化処理工程、前記プロテアーゼ処理工程および前記ＤＮＡ変性処理工程を行い、前記脱パラフィン処理工程は、前記測定試料を４４℃以上に高める処理を含み、前記賦活化処理工程および前記ＤＮＡ変性処理工程は、前記測定試料を６２℃以上に高める処理を含む。

【0008】

本発明の第２の態様に係る検体分析装置は、測定試料に含まれる被検物質を撮像するための前処理を前記測定試料に施す前処理部と、前記前処理部により前処理が施された前記測定試料を撮像する撮像部と、前記撮像部により得られた撮像画像を処理して前記被検物質を抽出する解析部と、を備える。前記前処理部は、前記測定試料に対する脱パラフィン処理を行う処理ユニットと、前記測定試料に対する賦活化処理を行う処理ユニットと、前記測定試料に対するプロテアーゼ処理を行う処理ユニットと、前記測定試料に熱を与えてＤＮＡに変性を生じさせるＤＮＡ変性処理を行う処理ユニットと、前記測定試料に自家蛍光を抑制するためのブリーチング処理を行う処理ユニットと、前記測定試料中の被検物質に蛍光色素を結合させる標識処理を行う処理ユニットと、を含む。前記脱パラフィン処理を行う処理ユニット、前記賦活化処理を行う処理ユニット、前記プロテアーゼ処理を行う処理ユニットおよび前記ＤＮＡ変性処理を行う処理ユニットは、前記ブリーチング処理を行う処理ユニットよりも先に前記測定試料に処理を行う。前記撮像部は、前記前処理が施された前記測定試料に光を照射して前記蛍光色素から生じる蛍光を撮像する。前記脱パラフィン処理は、前記測定試料を４４℃以上に高める処理を含み、前記賦活化処理および前記ＤＮＡ変性処理は、前記測定試料を６２℃以上に高める処理を含む。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、測定試料から固有に生じる自家蛍光を効果的に抑制することができ、特定の物質に結合した蛍光色素からの蛍光を精度良く検出できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、実施形態に係る検体分析方法の処理を示すフローチャートである。

【図2】図２は、実施形態に係る蛍光色素が被検物質に結合した状態を示す図である。

【図3】図３は、実施形態に係る撮像部と解析部の構成を示す図である。

【図4】図４（ａ）は、実施形態に係る２つの焦点が光軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて受光面上で回転することを示す図である。図４（ｂ）は、実施形態に係る撮像工程の処理を示すフローチャートである。

【図5】図５（ａ）は、実施形態に係る解析工程の処理を示すフローチャートである。図５（ｂ）は、実施形態に係る３次元超解像画像を示す図である。

【図6】図６（ａ）は、実施形態の検証１に係る脱パラフィン処理の直後にブリーチング処理を行い、その後、賦活化処理を行った場合の自家蛍光の検証結果を示す図である。図６（ｂ）は、実施形態の検証１に係る賦活化処理の直後にブリーチング処理を行い、その後、プロアテーゼ処理とＤＮＡ変性処理を順番に行った場合の自家蛍光の検証結果を示す図である。図６（ｃ）は、実施形態の検証１に係るＤＮＡ変性処理の直後にブリーチング処理を行い、その後、ブロッキング処理と１次抗体処理を順番に行った場合の自家蛍光の検証結果を示す図である。

【図7】図７は、実施形態に係る検証１の検証結果を纏めた表である。

【図8】図８（ａ）は、実施形態の検証２に係るブリーチング処理が行われた測定試料を室温で２０分間放置した場合の自家蛍光の回復状況を撮像した撮像画像である。図８（ｂ）は、実施形態の検証２に係るブリーチング処理が行われた測定試料を４４℃で２０分間加熱した場合の自家蛍光の回復状況を撮像した撮像画像である。図８（ｃ）は、実施形態の検証２に係るブリーチング処理が行われた測定試料を６２℃で２０分間加熱した場合の自家蛍光の回復状況を撮像した撮像画像である。

【図9】図９は、実施形態の検証２の検証結果を纏めたグラフである。

【図10】図１０（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、実施形態の検証３の操作１〜操作３により異なる波長の光でブリーチング処理を行った場合の蛍光色素の検出度合いを、ブリーチング処理を行わなかった場合の蛍光色素の検出度合いと比較して示すグラフである。

【図11】図１１（ａ）は、実施形態の検証３に係る測定試料の自家蛍光をブリーチング処理により抑制した状態で被検物質の蛍光を撮像した撮像画像である。図１１（ｂ）は、実施形態の検証３に係る測定試料の自家蛍光を抑制しない状態で被検物質の蛍光を撮像した撮像画像である。

【図12】図１２は、実施形態に係る検体分析装置の構成を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下に示す実施形態は、被験者の病変組織から採取した測定試料に対し乳癌の分析を行う検体分析方法および検体分析装置に本発明を適用したものである。実施形態では、乳癌の予後因子の一つであるＨＥＲ２遺伝子を、被検物質として検出する。蛍光色素により標識されたＨＥＲ２遺伝子を撮像する際に、測定試料から生じる固有の光放出、すなわち測定試料の自家蛍光が、バックグランドノイズとなって被検物質の検出精度を低下させる。本願発明者らは、測定試料を前処理する前処理工程において、測定試料から生じる自家蛍光を効果的に抑制する手法を見出した。以下、本願発明者らの検証とともに、その手法を説明する。

【0012】

１．基本工程
図１に示すように、検体分析方法は、病変組織から採取した測定試料に対する前処理工程として、脱パラフィン処理工程、賦活化処理工程、プロアテーゼ処理工程、ＤＮＡ変性処理工程、ブロッキング処理工程、１次抗体処理工程、２次抗体処理工程および保存工程を実行する。各処理工程で用いる試薬等の具体的な処理内容は、後述の検証において示されている。ここでは、各処理工程における処理を包括的に説明する。

【0013】

ステップＳ１１の脱パラフィン処理工程は、測定試料からパラフィンを除去する処理工程である。パラフィンは、測定試料である組織切片を保存するために測定試料に用いられている。ステップＳ１１では、染色プローブ、すなわち、ＤＮＰ標識した核酸や色素標識した抗体が測定試料の細胞内に入り易くするために、測定試料からパラフィンが除去される。ステップＳ１１では、測定試料の温度を７５℃に高めて処理が行われる。パラフィンが溶融する４４℃以上１００℃以下でステップＳ１１の反応が行われても良い。

【0014】

ステップＳ１２の賦活化処理工程およびステップＳ１３のプロアテーゼ処理工程は、細胞内の核酸の反応性を高めるために行われる処理工程である。ステップＳ１２、Ｓ１３の処理により、メチレン架橋等が切断されて抗原が賦活化され、特定アミノ酸残基のペプチド結合が切断される。ステップＳ１２では、測定試料の温度を９０℃に高めて処理が行われる。ステップＳ１３では、測定試料の温度を３７℃に高めて処理が行われる。

【0015】

ステップＳ１４のＤＮＡ変性処理工程は、ＤＮＡ変性処理、ハイブリタイゼーション処理およびストリンジェンシー洗浄処理を含む。ステップＳ１４の処理により、２本鎖のＤＮＡが１本鎖に分離される。これにより、染色プローブ、すなわちＤＮＰ標識した核酸が結合する部位が露出される。温度を９５℃の高温に保つことにより、分離されたＤＮＡの再結合が抑制される。その後、温度を４４℃に下げて、ＤＮＰ標識した核酸プローブを結合部位に結合させる。本反応では、核酸プローブの配列や塩濃度など溶液の組成によって適温が変わる。本反応の温度は、室温以上、８０℃以下の範囲である。その後、ストリンジェンシー洗浄を６２℃で行う。ストリンジェンシー洗浄の温度は、核酸プローブを結合部位に結合させる温度よりも高温となる。ステップＳ１４では、測定試料の温度を９５℃、４４℃、６２℃に高めて処理が行われる。

【0016】

ステップＳ１５のブロッキング処理工程は、核酸プローブに蛍光標識するための抗体、すなわち、一次抗体や二次抗体が測定試料の組織切片に非特異的に結合しないように、組織切片上にブロッキング処理を施す処理工程である。この処理により、撮像画像のノイズが低減される。ステップＳ１５では、反応時間の短縮のため、測定試料の温度を３７℃に高めて処理が行われる。室温すなわち２４℃程度で、ステップＳ１５の反応が行われても問題ない。

【0017】

ステップＳ１６の１次抗体処理工程は、測定試料中の被検物質に結合したＤＮＰ標識核酸プローブに１次抗体を結合させるための処理工程である。ステップＳ１７の２次抗体処理工程は、ＤＮＰ標識核酸プローブに結合した１次抗体に、さらに蛍光色素、すなわち蛍光標識された２次抗体を結合させるための処理工程である。ステップＳ１６およびＳ１７は、測定試料中の被検物質を蛍光標識するための標識工程である。ステップＳ１６、Ｓ１７では、反応時間の短縮のため、測定試料の温度を３７℃に高めて処理が行われる。室温すなわち２４℃程度で、ステップＳ１６、Ｓ１７の反応が行われても問題ない。

【0018】

ＨＥＲ２遺伝子の他、ＣＥＰ１７等の他の物質も被検物質とされる場合、ステップＳ１４、ステップＳ１６およびステップＳ１７では、他の被検物質に対する標識処理がさらに行われる。ステップＳ１７の２次抗体処理工程では、核を染色する色素を用いて測定試料中の核の染色を併せて行っても良い。

【0019】

図２に示すように、被検物質であるＨＥＲ２遺伝子に結合したＤＮＰ標識核酸プローブに１次抗体が結合し、結合した１次抗体に２次抗体が結合する。２次抗体は蛍光色素を含む。２次抗体の蛍光色素は、励起用の光が照射されることにより蛍光を生じる活性状態と、励起用の光が照射されても蛍光を生じない不活性状態とにスイッチング可能であっても良い。本実施形態において、ＨＥＲ２遺伝子を標識する蛍光色素は、活性化状態にあるときに所定の強度と時間で励起用の光が照射されると蛍光を発するとともに不活性化し、その後、励起用の光と異なる波長の光が照射されると活性化する。以下では、不活性化することを「消光する」という。光による作用に代えて、熱や化学薬品等の作用によって蛍光色素の活性化が行われても良い。

【0020】

図１に戻り、ステップＳ１８の保存工程は、ステップＳ１１〜Ｓ１７の処理が行われた測定試料を洗浄および乾燥させ、撮像まで冷暗所で保存する工程である。測定試料をすぐに撮像する場合は、測定試料を冷暗所で保存しなくても良い。

【0021】

ステップＳ１９の撮像工程は、前処理がなされた測定試料を撮像する工程である。ステップＳ１９では、被検物質に結合した蛍光色素から生じる蛍光が撮像される。ステップＳ２０の解析工程は、ステップＳ１９の撮像工程で取得された撮像画像を解析して細胞内に含まれる被検物質を検出し計数する工程である。

【0022】

ステップＳ１９の撮像工程は、たとえば、図３に示す撮像部１００によって行われる。ステップＳ２０の解析工程は、たとえば、図３に示す解析部２００によって行われる。撮像部１００は、解析部２００の処理部２０１による制御のもと、測定試料に対する撮像処理を実行する。

【0023】

撮像部１００は、光源部１０１と、シャッター１０２と、１／４波長板１０３と、ビームエキスパンダ１０４と、集光レンズ１０５と、ダイクロイックミラー１０６と、対物レンズ１０７と、ステージ１０８と、ビームエキスパンダ１０９と、位相板１１０と、集光レンズ１１１と、撮像素子１１２と、を備える。撮像素子１１２は、たとえば、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣＭＯＳイメージセンサである。ステージ１０８には、測定試料が載せられたスライドガラス１２１が設置される。

【0024】

光源部１０１は、２つの波長の光を出射する。第１波長の光は、被検物質であるＨＥＲ２遺伝子に結合した蛍光色素に蛍光を励起させる。第２波長の光は、核を染色する蛍光を励起させる。第２波長の光は、ＨＥＲ２遺伝子に結合した蛍光色素の活性化にも用いられる。第１波長は、たとえば６４０ｎｍであり、第２波長は、たとえば４０５ｎｍである。ＨＥＲ２遺伝子の他、ＣＥＰ１７等の他の物質も被検物質とされる場合、光源部１０１は、さらに、第３波長の光を出射する。第３波長は、たとえば７５０ｎｍである。光源部１０１は、たとえば、各波長の光を出射する光源とこれらの光の光軸を一致させるダイクロイックミラーにより構成される。光源部１０１は、レーザ光源を用いるのが好ましいが、水銀ランプ、キセノンランプ、ＬＥＤ等を用いてもよい。

【0025】

シャッター１０２は、コントローラ１２３により駆動される。コントローラ１２３は、光源部１０１から出射された光を通過させる状態と、光源部１０１から出射された光を遮断する状態とにシャッター１０２を切り替える。これにより、被検物質に対する光の照射時間が調整される。

【0026】

１／４波長板１０３は、光源部１０１から出射された直線偏光の光を円偏光に変換する。蛍光色素は、所定の偏光方向の光に反応する。よって、励起用の光を円偏光に変換することにより、励起用の光の偏光方向が、蛍光色素が反応する偏光方向に一致し易くなる。これにより、被検物質に含まれる蛍光色素に効率良く蛍光を励起させることができる。励起用の光を円偏光とせず、励起効率を考慮しない場合、１／４波長板１０３は省略しても良い。ビームエキスパンダ１０４は、スライドガラス１２１上における光の照射領域を広げる。集光レンズ１０５は、対物レンズ１０７からスライドガラス１２１に平行光が照射されるよう光を集光させる。

【0027】

ダイクロイックミラー１０６は、光源部１０１から出射された光を反射し、被検物質から生じた蛍光を透過する。対物レンズ１０７は、ダイクロイックミラー１０６で反射された光を、スライドガラス１２１に導く。ステージ１０８は、コントローラ１２２により駆動され、水平面内で移動する。これにより、スライドガラス１２１上に広く光が照射される。被検物質から生じた蛍光は、対物レンズ１０７を通り、ダイクロイックミラー１０６を透過する。

【0028】

レンズ１０９ａは、ダイクロイックミラー１０６を透過した蛍光を集光し結像させる。位相板１１０は、レンズ１０９ｂで形成されたフーリエ面に配置される。位相板１１０は、ビームエキスパンダ１０９を透過した蛍光に位相変調作用を付与する。集光レンズ１１１は、位相板１１０を透過した蛍光を集光して、撮像素子１１２の受光面に導く。撮像素子１１２は、蛍光を撮像し、撮像画像を解析部２００に出力する。

【0029】

位相板１１０は、フーリエ面に配置され、撮像素子１１２の受光面に２点の焦点が現れるように点像分布関数を変調する作用を有する。測定試料中の１つの蛍光色素から生じた蛍光は、位相板１１０の作用により、撮像素子１１２の受光面上で２つの焦点に結像される。このとき、２つの焦点は、図４（ａ）に示すように、対物レンズ１０７の光軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて受光面上で回転する。つまり、２つの焦点を結ぶ直線と、基準となる直線とがなす角が、光軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて、撮像素子１１２の受光面上において変化する。

【0030】

たとえば、スライドガラス１２１において対物レンズ１０７の光軸方向に異なる２つの位置にある蛍光色素から生じた蛍光は、それぞれ位相板１１０により２つに分割され、撮像素子１１２の受光面上に照射される。このとき、受光面上における２つの焦点を結ぶ直線は、たとえば、図４（ａ）に示すように、一方の蛍光色素については基準線と＋θ１の角をなし、もう一方の蛍光色素については基準面と＋θ２の角をなす。したがって、２つの焦点を結ぶ直線が基準線に対してなす角を取得すれば、光軸方向における蛍光色素の位置を取得できる。

【0031】

図３に戻り、解析部２００は、たとえばパーソナルコンピュータである。解析部２００は、処理部２０１と、記憶部２０２と、インターフェース２０３と、表示部２０４と、入力部２０５を備える。

【0032】

処理部２０１は、たとえばＣＰＵである。記憶部２０２は、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスク等である。処理部２０１は、記憶部２０２に記憶されたプログラムに基づいて様々な機能を実行する。処理部２０１は、撮像素子１１２により得られた画像を処理するとともに、その他の様々な処理を行う。また、処理部２０１は、インターフェース２０３を介して、光源部１０１と、撮像素子１１２と、コントローラ１２２、１２３とを制御する。表示部２０４は、処理部２０１による処理結果等を表示するためのディスプレイである。入力部２０５は、ユーザによる指示の入力を受け付けるためのキーボードとマウスである。

【0033】

図１のステップＳ１９の撮像工程において、解析部２００の処理部２０１は、光源部１０１および撮像素子１１２を制御して、測定試料中の核の画像と被検物質に結合した蛍光色素の画像を取得する。図１のステップＳ２０の解析工程において、処理部２０１は、ステップＳ１９で取得した画像から核および蛍光色素を検出する。処理部２０１は、核および蛍光色素の画像に基づいて、核に含まれる被検物質、すなわちＨＥＲ２遺伝子を抽出し計数する。

【0034】

図４（ｂ）に示すように、ステップＳ１０１において、処理部２０１は、光源部１０１からの第２波長の光を測定試料に照射して、核を染色する色素から蛍光を生じさせる。処理部２０１は、生じた蛍光を撮像素子１１２で撮像し、核の画像を取得する。処理部２０１は、光が測定試料に照射されている間に撮像を繰り返して所定枚数、たとえば１００枚の核の画像を取得する。ステップＳ１０１で撮像される画像の枚数は１００枚に限られず、たとえば１枚であっても良い。処理部２０１は、対物レンズ１０７を光軸方向に変位させて、光軸方向の異なる複数のフォーカス位置において、上記核の画像の取得処理を実行する。これにより、各フォーカス位置において、たとえば１００枚の核の画像が取得される。

【0035】

ステップＳ１０２において、処理部２０１は、光源部１０１から第１波長の光を測定試料に照射して、被検物質に結合した蛍光色素を消光させる。ステップＳ１０３において、処理部２０１は、光源部１０１から第２波長の光を測定試料に照射して、被検物質に結合した蛍光色素を活性化する。ステップＳ１０４において、処理部２０１は、光源部１０１から第１波長の光を測定試料に照射して、蛍光色素から蛍光を生じさせ、生じた蛍光を撮像素子１１２により撮像する。

【0036】

ステップＳ１０４において、処理部２０１は、第１波長の光が測定試料に照射されている間に撮像を繰り返して、所定枚数、たとえば１００枚の蛍光の画像を取得する。ステップＳ１０４で撮像される画像の枚数は１００枚に限られず、たとえば１枚であっても良い。ステップＳ１０４で光源１０１部から第１波長の光が照射される間に、被検物質に結合する蛍光色素は消光される。

【0037】

ステップＳ１０５において、処理部２０１は、蛍光の撮像画像の取得が終了したか否かを判定する。処理部２０１は、ステップＳ１０３、Ｓ１０４の処理を所定回数繰り返す。たとえば、ステップＳ１０３、Ｓ１０４の処理が３０回繰り返される。こうして、処理部２０１は、３０００枚の蛍光の撮像画像を取得する。図４（ａ）のように、一つの蛍光色素から生じた蛍光は、撮像素子１１２の受光面において、２つの焦点に結像する。このため、蛍光の撮像画像は、２つの蛍光の輝点のペアを、ステップＳ１０３で活性化された蛍光色素の数だけ含んでいる。

【0038】

ステップＳ１０３では、被検物質に結合した全ての蛍光色素が活性化される訳ではない。一つの被検物質には、多数の蛍光色素が結合している。Ｓ１０３では、このうち所定の割合の蛍光色素が活性化する。一つの被検物質に結合した多数の蛍光色素は、ステップＳ１０３による活性化が繰り返されるごとに、必ずしも同じ蛍光色素が活性化される訳ではない。各回の活性化処理において活性化される蛍光色素の分布はランダムである。

【0039】

したがって、ステップＳ１０３、Ｓ１０４の処理により、活性化処理、撮像処理および不活性化処理を複数回繰り返すことにより、蛍光色素を満遍なく発光させつつ、それぞれの撮像画像において蛍光色素の蛍光を分散させ得る。よって、それぞれの撮像画像から、蛍光色素に基づく輝点を円滑に抽出できる。

【0040】

図５（ａ）に示すように、ステップＳ１１１において、処理部２０１は、上記のように消光と活性化を繰り返して取得した蛍光色素の撮像画像から、３次元超解像画像を取得する。３次元超解像画像とは、３次元空間における被検物質の分布を示す画像のことである。ステップＳ１１１において、処理部２０１は、蛍光色素の撮像画像について、ガウスフィッティングを行って蛍光の輝点を抽出し、さらに、抽出した輝点の輝度を取得する。次に、処理部２０１は、輝度が同程度で且つ距離が所定の範囲以内にある２つの輝点をペアリングする。続いて、処理部２０１は、ペアリングした２つの輝点を、予め記憶部２０２に記憶された２つの輝点のテンプレートとフィッティングさせ、ある精度以上でフィッティングできた２つの輝点を、１つの蛍光色素から生じた蛍光が位相板１１０により分割された蛍光に基づくものであると判定する。

【0041】

続いて、処理部２０１は、受光面上のペアとなる２つの輝点の中点を蛍光色素の撮像視野における２次元平面上の位置とする。処理部２０１は、上述したようにペアとなる２つの輝点を結ぶ直線と、基準線とのなす角に基づいて、対物レンズ１０７の光軸方向における蛍光色素の位置を決定する。こうして、処理部２０１は、２次元平面上の位置と、光軸方向における位置とに基づいて、複数の蛍光色素の座標点を３次元座標軸において特定する。処理部２０１は、特定した座標点を全ての撮像画像について重ね合わせることにより、３次元超解像画像を作成する。これにより、たとえば、図５（ｂ）に示す３次元超解像画像が取得される。図５（ｂ）において、Ｘ−Ｙ平面が撮像視野における２次元平面であり、Ｚ軸方向が対物レンズ１０７の光軸方向である。

【0042】

ステップＳ１１２において、処理部２０１は、特定した座標点を、被検物質に対応するグループに分類して被検物質を抽出する。座標点のグループ化は、たとえば、所定の参照空間を３次元座標空間において走査させ、この参照空間内に含まれる座標点の数が閾値より多く、且つ、周囲よりも座標点の数が多い参照空間の位置を抽出し、抽出した位置において参照空間に含まれる座標点のグループを一つの被検物質に対応するグループに分類する。処理部２０１は、こうして分類した座標点のグループから、３次元座標空間における被検物質の位置を抽出する。

【0043】

ステップＳ１１３において、処理部２０１は、被検物質の３次元空間における核の範囲を取得する。処理部２０１は、図４（ｂ）のステップＳ１０１において、光軸方向の異なる複数のフォーカス位置で、それぞれ、複数の核の撮像画像を取得している。処理部２０１は、各フォーカス位置で取得した複数の核の画像を平均化して、各フォーカス位置における核の平均化画像を取得する。処理部２０１は、各フォーカス位置の平均化画像ごとに、蛍光が検出された領域から核の輪郭を取得する。処理部２０１は、各フォーカス位置とその位置の核の輪郭とに基づいて、３次元空間における核の範囲を取得する。

【0044】

ステップＳ１１４において、処理部２０１は、ステップＳ１１２で特定した被検物質の位置とステップＳ１１３で取得した核の範囲とに基づいて、核の範囲に含まれる被検物質の数を取得する。これにより、処理部２０１は、解析工程における処理を終了する。Ｓ１１４で取得された被検物質、すなわちＨＥＲ２遺伝子の数は、診断において、治療方針を決定するための指標として医師等に参照される。医師等は、参照したＨＥＲ２遺伝子の数に基づき、ＨＥＲ２遺伝子の増幅度合いを把握でき、投薬等、治療方針を決定できる。

【0045】

なお、ＨＥＲ２遺伝子の他、ＣＥＰ１７等の他の物質も被検物質とされる場合、他の被検物質について蛍光の撮像画像が取得され、取得した撮像画像に基づいて、核に含まれる他の被検物質の数が取得される。他の被検物質がＣＥＰ１７である場合、核に含まれるＨＥＲ２遺伝子の数と核に含まれるＣＥＰ１７の数の比が算出される。算出された比は、診断において、治療方針を決定するための指標として、医師等に参照される。

【0046】

図１に戻り、ステップＳ１９およびステップＳ２０では、以上のようにして測定試料の撮像と、撮像画像に基づく被検物質の解析が行われる。ステップＳ１９においては、核の蛍光と被検物質に結合する蛍光色素の蛍光を確実に撮像できることが求められる。しかしながら、測定試料は自家蛍光を発するため、撮像時には、この自家蛍光が、核の蛍光および蛍光色素の蛍光のバックグラウンドノイズとなる。特に、個々の蛍光色素から生じる蛍光は微弱であるため、蛍光色素から生じた蛍光が自家蛍光に混ざって識別できないことが起こり得る。さらに、上記のように、一つの蛍光色素から生じた蛍光が位相板１１０によって２つに分割される場合には、分割されたそれぞれの蛍光の強度が一層微弱になる。このため、自家蛍光が生じると、分割された蛍光の識別がさらに困難になる。

【0047】

なお、図３の撮像部１００は、位相板１１０で蛍光を分割する構成であったが、位相板１１０を省略し、蛍光色素から生じた蛍光をそのまま撮像素子１１２に導く構成であっても良い。つまり、レンズ１０９ａの後に形成される結像面に撮像素子１１２が配置される。この場合は、対物レンズ１０７の光軸方向において蛍光色素の位置を分離することはできないが、撮像視野における２次元平面上において蛍光色素の位置を特定することは可能である。撮像部１００がこのような構成である場合、上記のように位相板１１０で蛍光を分割する場合に比べて撮像素子１１２が受光する蛍光の強度は高くなる。しかし、この場合も、蛍光色素の蛍光は微弱であるため、測定試料から生じる自家蛍光が、蛍光色素から生じる蛍光を検出する際の障害となり得る。

【0048】

以上の問題から、図１の処理では、測定試料から生じる自家蛍光を抑制するために、ステップＳ２１のブリーチング工程が行われる。ブリーチング工程では、所定波長の光が所定時間、測定試料に照射されて、自家蛍光が抑制される。

【0049】

本願発明者らは、測定試料から生じる自家蛍光を抑制するために、前処理工程において、測定試料にブリーチング処理を行うことを試みた。しかしながら、ブリーチング処理を行っても、ステップＳ１９の撮像工程において蛍光色素の蛍光を撮像する際に、測定試料の自家蛍光が抑制されておらず、蛍光色素から生じた蛍光を確実に撮像できなかった。

【0050】

本願発明者らは、自家蛍光を抑制できなかった原因を種々の検証のもと鋭意追求した。その結果、撮像の際に測定試料の自家蛍光を効果的に抑制するには、前処理工程のどのタイミングでプリーチング工程を実行すれば良いかを新たに見出した。図１に示すステップＳ２１のブリーチング工程の実行タイミングは、本願発明者らが見出したブリーチング工程の実行タイミングの一例である。ステップＳ２１のブリーチング工程は、測定試料の温度を６２℃以上に高めるステップＳ１１、Ｓ１２、Ｓ１４の後に行われる。ステップＳ１４のＤＮＡ変性処理工程は、ステップＳ２１のブリーチング工程の前に行われる。ステップＳ１１の脱パラフィン処理工程およびステップＳ１２の賦活化処理工程も、ステップＳ２１のブリーチング工程の前に行われる。また、ステップＳ２１のブリーチング工程とステップＳ１９の撮像工程との間には、測定試料の温度を６２℃以上に高める処理工程が含まれていない。

【0051】

本願発明者らは、測定試料を摂氏６２度以上に高めて測定試料に処理を施す処理工程の後にブリーチング工程を行い、且つ、ブリーチング工程から撮像工程の間において、測定試料を摂氏６２度以上に高めて測定試料に処理を施す処理工程を含めないことにより、ブリーチング工程により抑制された測定試料からの蛍光が、撮像工程までに回復しないことを見出した。本願発明者らは、この手法により、蛍光色素から生じる蛍光を測定試料からの自家蛍光の影響なく確実に検出できることを確認した。

【0052】

２．検証
以下、本願発明者らが見出した手法を、検証とともに説明する。検証では、ＨＥＲ２遺伝子とともにＣＥＰ１７を前処理工程において標識した。ＨＥＲ２遺伝子を標識する蛍光色素の励起波長は６４０ｎｍであり、ＣＥＰ１７を標識する蛍光色素の励起波長は７３０ｎｍである。核を染色する染料の励起波長は４０５ｎｍである。ＨＥＲ２遺伝子を標識する蛍光色素は、波長６４０ｎｍの光により消光し、波長４０５ｎｍの光で活性化する。以下の検証では、ＨＥＲ２遺伝子を標識する蛍光色素を対象に、細胞から生じる自家蛍光の影響等の検討を行った。

【0053】

＜前処理工程＞
検証では、以下の方法で前処理工程を行った。

【0054】

[測定試料]
ベンタナインフォームDual ISH HER2キット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用い、HER2 Dual ISH3-in-1コントロールスライド(ventana）上のヒト乳癌細胞MCF7のFISH染色を実施した。

【0055】

［脱パラフィン工程］
Dry Block Bath THB（アズワン）上で、６５℃、２０分間、コントロールスライドを乾燥させた。７５℃で５分間、Ez Prepをスライド上に乗せ脱パラフィンを行った。この操作を５回繰り返した後、コントロールスライドをReaction Bufferに浸漬した。

【0056】

［賦活化処理工程］
Dry Block BathTHBを９０℃にし、コントロールスライドにCC2を滴下し、１０分間コンディショニングを行った。コントロールスライドが乾燥しないように、CC2は適宜追加した。この操作を３回行った後、コントロールスライドをReaction Bufferに４分間浸漬した。

【0057】

［プロテアーゼ処理工程］
コントロールスライド上にISH Protease IIを滴下し、カバーガラスを被せ、３７℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で１６分間酵素処理を行った。コントロールスライドを2×SSCに４分間、３回浸漬し洗浄した。

【0058】

[ＤＮＡ変性処理工程]
HybReadyとHER2 DNAカクテルプローブを混合した混合液を、コントロールスライドに滴下した後、カバーガラスを被せ、ペーパーボンドで封入した。Dry Block BathTHB上で９５℃で２０分間、コントロールスライドの乳癌細胞に対して熱変性を行った。その後、４４℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で、コントロールスライドに対しオーバーナイトでハイブリダイゼーションを行った。コントロールスライドを６２℃の2×SSCに４分間浸漬しストリンジェンシー洗浄を行った。この操作を３回繰り返した後、コントロールスライドをReactionBufferに浸漬した。

【0059】

[ブロッキング処理工程]
コントロールスライド上に１％ BSA/Reaction bufferを滴下し、カバーガラスを被せ、３７℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で２０分間ブロッキングを行った。その後、コントロールスライドをReaction bufferに浸漬し、洗浄した。

【0060】

[一次抗体処理工程]
Rabbit Anti DNP Abをと、Mouse Anti DIG Abをを混合した混合液を、コントロールスライドに滴下し、カバーガラスを被せ、３７℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で２０分間反応させた。その後、コントロールスライドReaction Bufferに３分間浸漬し、洗浄した。これを３回行った。

【0061】

[二次抗体処理工程]
Alexa Fluor 647F(ab’)2fragment of goat anti-rabbit IgG (H+L) (Life Technologies, A-21246)、Alexa Fluor 750 Goat Anti Mouse IgG(H+L) (Life Technologies,A-21037)、Hoechst 33342(Life Technologies, H1399, をPBSに希釈して保存したもの)を１％BSA/Reactionbufferで希釈した混合液を、コントロールスライドに滴下し、カバーガラスを被せ、３７℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で２０分間反応させた。その後、コントロールスライドをTBSTに５分間浸漬し洗浄した。この操作を３回行った。

【0062】

Alexa Fluor 647は、ＨＥＲ２遺伝子を標識する蛍光色素である。Alexa Fluor 750は、ＣＥＰ１７を標識する蛍光色素である。Hoechst33342は、核を染色する蛍光色素である。

【0063】

[保存工程]
コントロールスライドを精製水に浸漬し洗浄した。この操作を２回行った後、コントロールスライドを３７℃のインキュベーターで１５分間乾燥させ、観察まで４℃の暗所にて保存した。

【0064】

＜検証１＞
検証１では、上記処理による前処理工程において、ブリーチング工程を行うタイミングを変えて自家蛍光の抑制状態を確認した。検証１では、３つの実施例１〜３で自家蛍光の抑制効果を確認できたが、２つの比較例では、一度抑制された自家蛍光が回復したことが確認された。実施例１〜３および比較例１、２では、以下のようにブリーチング工程を行った。

【0065】

[実施例１]
プロテアーゼ処理工程前にコントロールスライドにReaction bufferを滴下し、カバーガラスで封入した。その後、コントロールスライドを蛍光顕微鏡にセットして蛍光画像を取得した後、波長６４０ｎｍのレーザ光を４７０Ｗ／ｃｍ^２のパワーで２分間コントロールスライドに照射してブリーチング処理を行った。プロテアーゼ処理後に再度同一視野で蛍光画像を取得した。

【0066】

[実施例２]
ブロッキング処理工程前にコントロールスライドにReaction bufferを滴下し、カバーガラスで封入した。その後、コントロールスライドを蛍光顕微鏡にセットして実施例１とは異なる視野にて蛍光画像を取得した後、波長６４０ｎｍのレーザ光を４７０Ｗ／ｃｍ^２のパワーで２分間コントロールスライドに照射してブリーチング処理を行った。ブロッキング処理後に再度同一視野で蛍光画像を取得した。

【0067】

[実施例３]
実施例２で観察を行った視野について、一次抗体処理後に再度蛍光画像を取得した。

【0068】

[比較例１]
賦活化処理工程前にコントロールスライドにReaction bufferを滴下し、カバーガラスで封入した。その後、コントロールスライドを蛍光顕微鏡にセットして実施例１〜３とは異なる視野にて蛍光画像を取得した後、波長６４０ｎｍのレーザ光を４７０Ｗ／ｃｍ^２のパワーで２分間コントロールスライドに照射してブリーチング処理を行った。賦活化処理後に再度同一視野で蛍光画像を取得した。

【0069】

[比較例２]
実施例１で蛍光画像を取得した視野について、ＤＮＡ変性処理工程を行った後に再度蛍光画像を取得した。

【0070】

実施例１〜３、比較例１、２において、撮像に用いた蛍光顕微鏡には、図３に示す位相板１１０は含まれていない。

【0071】

[検証結果]
図６（ａ）は、比較例１の検証結果を示す図である。図６（ａ）の左端の画像は、コントロールスライドのヒト乳癌細胞に対して脱パラフィン処理工程を行った後、賦活化処理工程を行う前にコントロールスライドを撮像した撮像画像である。図６（ａ）の左端の撮像画像に示すように、脱パラフィン処理後の乳癌細胞では自家蛍光が撮像された。撮像画像上の白く光る部分が自家蛍光である。

【0072】

図６（ａ）の中央の画像は、上記のように波長６４０ｎｍのレーザ光を照射してブリーチング処理を行った後の撮像画像である。撮像視野は、図６（ａ）の左端の撮像画像と同じである。破線白丸で囲まれた領域にレーザ光が照射された。図６（ａ）の中央の画像から分かるとおり、ブリーチング処理により自家蛍光が抑制された。

【0073】

図６（ａ）の右端の画像は、ブリーチング処理の後、さらにコントロールスライドに賦活化処理工程を行った後の撮像画像である。この撮像画像は、比較例１の検証結果に対応する。撮像視野は、図６（ａ）の左端および中央の撮像画像と同じである。図６（ａ）の右端の画像から分かるとおり、賦活化処理により自家蛍光が回復することが確認された。

【0074】

図６（ｂ）は、実施例１および比較例２の検証結果を示す図である。図６（ｂ）の撮像視野は、図６（ａ）の場合と異なっている。図６（ｂ）の左端の画像は、コントロールスライドのヒト乳癌細胞に対して賦活化処理工程を行った後、プロアテーゼ処理工程を行う前にコントロールスライドを撮像した撮像画像である。図６（ｂ）の左端の撮像画像に示すように、賦活化処理後の乳癌細胞では自家蛍光が撮像された。撮像画像上の薄白く光る部分が自家蛍光である。

【0075】

図６（ｂ）の左から２番目の画像は、上記のように波長６４０ｎｍのレーザ光を照射してブリーチング処理を行った後の撮像画像である。撮像視野は、図６（ｂ）の左端の撮像画像と同じである。破線白丸で囲まれた領域にレーザ光が照射された。図６（ｂ）の左から２番目の画像から分かるとおり、ブリーチング処理により自家蛍光が抑制された。

【0076】

図６（ｂ）の左から３番目の画像は、ブリーチング処理の後、さらにコントロールスライドにプロアテーゼ処理工程を行った後の撮像画像である。この撮像画像は、実施例１の検証結果に対応する。撮像視野は、図６（ｂ）の左端および左から２番目の撮像画像と同じである。図６（ｂ）の左から３番目の画像から分かるとおり、プロアテーゼ処理工程が行われても自家蛍光は略回復しないことが確認された。

【0077】

図６（ｂ）の右端の画像は、さらにコントロールスライドにＤＮＡ変性処理工程を行った後の撮像画像である。この撮像画像は、比較例２の検証結果に対応する。撮像視野は、図６（ｂ）のその他の撮像画像と同じである。図６（ｂ）の右端の画像から分かるとおり、ＤＮＡ変性処理工程により自家蛍光が回復することが確認された。

【0078】

図６（ｃ）は、実施例２および実施例３の検証結果を示す図である。図６（ｃ）の撮像視野は、図６（ａ）、（ｂ）の場合と異なっている。図６（ｃ）の左端の画像は、コントロールスライドのヒト乳癌細胞に対してＤＮＡ変性処理工程を行った後、ブロッキング処理工程を行う前にコントロールスライドを撮像した撮像画像である。図６（ｃ）の左端の撮像画像に示すように、ＤＮＡ変性処理後の乳癌細胞では自家蛍光が撮像された。撮像画像上の白く光る部分が自家蛍光である。

【0079】

図６（ｃ）の左から２番目の画像は、上記のように波長６４０ｎｍのレーザ光を照射してブリーチング処理を行った後の撮像画像である。撮像視野は、図６（ｃ）の左端の撮像画像と同じである。破線白丸で囲まれた領域にレーザ光が照射された。図６（ｃ）の左から２番目の画像から分かるとおり、ブリーチング処理により自家蛍光が抑制された。

【0080】

図６（ｃ）の左から３番目の画像は、ブリーチング処理の後、さらにコントロールスライドにブロッキング処理工程を行った後の撮像画像である。この撮像画像は、実施例２の検証結果に対応する。撮像視野は、図６（ｃ）の左端および左から２番目の撮像画像と同じである。図６（ｃ）の左から３番目の画像から分かるとおり、ブロッキング処理工程が行われても自家蛍光は略回復しないことが確認された。

【0081】

図６（ｃ）の右端の画像は、さらにコントロールスライドに１次抗体処理工程を行った後の撮像画像である。この撮像画像は、実施例３の検証結果に対応する。撮像視野は、図６（ｃ）のその他の撮像画像と同じである。図６（ｃ）の右端の画像から分かるとおり、１次抗体処理工程が行われても自家蛍光が略回復しないことが確認された。

【0082】

図７は、以上の検証結果を纏めた表である。実施例１〜３および比較例１、２ではそれぞれ丸印が付された工程が行われ、最後に丸印が付された工程が行われた後に撮像が行われた。最下段に、撮像画像に基づく自家蛍光の回復度が＋印の数で示されている。＋が１個の場合、自家蛍光が略回復しなかったことを示し、＋の数が増えるに従って自家蛍光の回復度が高かったことを示している。「温度」の欄には、各工程の処理においてコントロールスライドが加熱された加熱温度が示されている。

【0083】

実施例１では、ブリーチング処理の後、３７℃の加熱温度でプロアテーゼ処理工程が行われても、自家蛍光は略回復しなかった。実施例２では、ブリーチング処理の後、３７℃の加熱温度でブロッキング処理工程が行われても、自家蛍光は略回復しなかった。実施例３では、ブリーチング処理の後、３７℃の加熱温度でブロッキング処理工程が行われ、さらに、３７℃の加熱温度で１次抗体処理が行われても、自家蛍光は略回復しなかった。

【0084】

これらの検証結果から、ブリーチング処理工程の後に、３７℃以下の加熱温度で処理工程が行われても、ブリーチング処理で抑制された自家蛍光が略回復しないことが確認された。つまり、ブリーチング処理工程の後に行う処理工程では、少なくとも３７℃を超える温度に高めて処理を行わなければ、ブリーチング処理で抑制された自家蛍光が略回復しないと言える。図１の処理工程および上記検証時の前処理工程においても、ブリーチング工程から撮像工程までの間に測定試料を３７℃を超える温度に高めて処理を行う処理工程が含まれていない。これにより、ブリーチング処理で抑制された自家蛍光は撮像時には略回復しないと言える。

【0085】

比較例１では、ブリーチング処理の後、９０℃の加熱温度で賦活化処理工程が行われることにより、自家蛍光が大幅に回復した。比較例２では、ブリーチング処理の後、３７℃の加熱温度でプロアテーゼ処理工程が行われ、さらに、加熱温度９５℃、４４℃、６２℃でＤＮＡ変性処理工程が行われることにより、自家蛍光がさらに顕著に回復した。比較例２と実施例１とを比較すると、比較例２では実施例１に比べてＤＮＡ変性処理工程が追加されただけであるので、比較例２において自家蛍光が顕著に回復した原因はＤＮＡ変性処理工程にあることが分かる。ただし、比較例２の検証結果からは、自家蛍光が回復した原因が、９５℃、４４℃、６２℃の何れの加熱温度にあるかが分からない。したがって、比較例１、２の検証結果からは、ブリーチング処理工程の後に、少なくとも加熱温度を９０℃以上に高める処理工程を行うと、ブリーチング処理で抑制された自家蛍光が大幅に回復することが分かるに留まる。

【0086】

＜検証２＞
検証２では、加熱温度と自家蛍光の回復度との関係を検討した。検証２では、ブリーチング処理の後、コントロールスライドの温度を３つの温度に同じ時間維持し、その後、自家蛍光の回復度を確認した。検証２では、コントロールスライドのヒト乳癌細胞に対して脱パラフィン処理工程のみを行った後、ブリーチング処理を行った。ブリーチング処理では、平行光を視野絞りで絞ってコントロールスライドに一定時間照射した。ブリーチング処理の前後において、それぞれ、コントロールスライドを蛍光顕微鏡で撮像して自家蛍光の撮像画像を取得した。その後、コントロールスライドを所定の温度に一定時間維持した後に再び蛍光顕微鏡で自家蛍光を撮像した。撮像に用いた蛍光顕微鏡には、図３に示す位相板１１０は含まれていない。

【0087】

図８（ａ）〜（ｃ）の左端の画像は、それぞれ、ブリーチング処理前に、互いに異なる視野でコントロールスライドを撮像した撮像画像である。図８（ａ）〜（ｃ）の左端の撮像画像に示すように、脱パラフィン処理後の乳癌細胞では自家蛍光が撮像された。撮像画像上の白く光る部分が自家蛍光である。

【0088】

図８（ａ）〜（ｃ）の中央の画像は、上記のように波長６４０ｎｍのレーザ光を照射してブリーチング処理を行った後の撮像画像である。これら撮像画像の撮像視野は、それぞれ、図８（ａ）〜（ｃ）の左端の撮像画像と同じである。破線白丸で囲まれた領域にレーザ光が照射された。図８（ａ）〜（ｃ）の中央の画像から分かるとおり、ブリーチング処理により自家蛍光が抑制された。

【0089】

図８（ａ）の右端の画像は、ブリーチング処理の後、室温２４℃で２０分間、コントロールスライドを放置した後にコントロールスライドを撮像した撮像画像である。撮像視野は、図８（ａ）の左端および中央の画像と同じである。図８（ｂ）の右端の画像は、ブリーチング処理の後、温度４４℃で２０分間、コントロールスライドを加熱した後にコントロールスライドを撮像した撮像画像である。撮像視野は、図８（ｂ）の左端および中央の画像と同じである。図８（ｃ）の右端の画像は、ブリーチング処理の後、温度６２℃で２０分間、コントロールスライドを加熱した後にコントロールスライドを撮像した撮像画像である。撮像視野は、図８（ｃ）の左端および中央の画像と同じである。

【0090】

図８（ａ）において、中央の撮像画像と右端の撮像画像とを比較すると、ブリーチング処理の後、コントロールスライドを室温２４℃で放置した場合は、ブリーチング処理により抑制された自家蛍光が略回復しなかったことが確認できる。同様に、図８（ｂ）において、中央の撮像画像と右端の撮像画像とを比較すると、ブリーチング処理の後、コントロールスライドを温度４４℃に加熱した場合も、ブリーチング処理により抑制された自家蛍光が略回復しなかったことが確認できる。これに対し、図８（ｃ）において、中央の撮像画像と右端の撮像画像とを比較すると、ブリーチング処理の後、コントロールスライドを温度６２℃に加熱した場合は、ブリーチング処理により抑制された自家蛍光が回復したことが確認できる。

【0091】

図９は、図８（ａ）〜（ｃ）において、中央の撮像画像から右端の撮像画像へと自家蛍光の状態が変化した場合の自家蛍光回復率を、各画像の輝度値に基づいて算出した算出結果を示すグラフである。

【0092】

自家蛍光回復率は、以下のように求めた。たとえば、図８（ａ）の場合、ブリーチング処理前の左端の撮像画像において破線の丸内に含まれる細胞内の任意の箇所の輝度を求めた。ブリーチング処理後の中央の撮像画像および所定時間温度を維持した後の右端の撮像画像においても、同じ箇所の輝度を求めて。求めた輝度から、以下の式により、自家蛍光回復率を算出した。

【0093】

（温度維持後の輝度−ブリーチング後の輝度）／（ブリーチング前の輝度−ブリーチング後の輝度）×１００ …（１）
同様にして、破線の丸内の異なる８カ所について、自家蛍光回復率を算出し、計９カ所について平均と標準偏差を求めた。図８（ｂ）、（ｃ）の場合も同様の方法で、９カ所の自家蛍光回復率の平均と標準偏差を算出した。

【0094】

図９において、「室温２４（２４℃）」、「４４℃」および「６２℃」のグラフは、それぞれ、図８（ａ）〜（ｃ）の撮像画像に対する自家蛍光回復率を示している。各グラフの頂上には、自家蛍光回復率の標準偏差を示すバーが示されている。図９のグラフを参照すると、ブリーチング処理後にコントロールスライドを室温２４℃の環境下に放置した図８（ａ）の例では、自家蛍光回復率が２０％程度であり、自家蛍光が略回復しなかったことが分かる。ブリーチング処理後にコントロールスライドを４４℃に加熱した図８（ｂ）の例でも、自家蛍光回復率が２０％をやや越える程度であり、自家蛍光が略回復しなかったことが分かる。これに対し、ブリーチング処理後にコントロールスライドを６２℃に加熱した図８（ｃ）の例では、自家蛍光回復率が６０％を越えており、自家蛍光が大幅に回復したことが分かる。

【0095】

図８および図９の検証結果から、ブリーチング処理工程の後に、少なくとも加熱温度を６２℃以上に高める処理工程を行うと、ブリーチング処理で抑制された自家蛍光が大幅に回復することが分かる。したがって、前処理工程は、ブリーチング処理工程の後に、少なくとも加熱温度を６２℃以上に高める処理工程を含まない必要がある。これにより、ブリーチング処理で抑制された自家蛍光が撮像時に回復していることを回避できる。

【0096】

また、図８および図９の検証結果から、ブリーチング処理工程の後に、４４℃以下の加熱温度で処理工程が行われても、ブリーチング処理で抑制された自家蛍光がさほど回復しないことが確認された。つまり、ブリーチング工程の後に行う処理工程では、少なくとも４４℃を超える温度に高めて処理を行わなければ、ブリーチング処理で抑制された自家蛍光が略回復しないと言える。図１の処理工程および上記検証時の前処理工程においても、ブリーチング工程から撮像工程までの間に測定試料を４４℃以上に高める処理工程が含まれていない。これにより、ブリーチング処理で抑制された自家蛍光が撮像時に回復していることを確実に回避できる。

【0097】

＜検証３＞
検証３では、前処理工程においてブリーチング処理を行った場合と行わなかった場合とで、解析工程において蛍光色素からの蛍光の検出度合いがどのように変化するかを検討した。

【0098】

[前処理工程]
検証例３においても、上述の前処理工程を行った。検証例３では、２次抗体処理工程前にコントロールスライドを顕微鏡にセットし、３通りの操作でブリーチング処理を行った。すなわち、操作１では、波長４０５ｎｍのレーザ光を１３０Ｗ／ｃｍ^２のパワーで２分間コントロールスライドに照射した。操作２では、波長５１４ｎｍのレーザ光を２００Ｗ／ｃｍ^２のパワーで２分間コントロールスライドに照射した。操作３では、波長６４０ｎｍのレーザ光を１１００Ｗ／ｃｍ^２のパワーで１０分間コントロールスライドに照射する操作である。各操作では、互いに異なる３つの視野に対してレーザ光の照射を行った。

【0099】

［撮像準備工程］
前処理工程で準備したコントロールスライドに対し、以下の組成のマウントメディウム50μLをスライドに滴下後、カバーガラスを被せ、マニキュアで固定した。
1M Tris (pH 7.4)5 μL
1M NaCl1 μL
25% glucose40 μL
2-mercaptoethanol1 μL
5000 U/mL Glucose Oxidase1 μL
1000 μg/mL catalase1 μL
H2O51 μL

【0100】

［撮像工程］
撮像準備工程で準備したコントロールスライドを顕微鏡にセットし、ブリーチング処理で光照射した部位について、波長６４０ｎｍのレーザ光を露光時間１５ｍｓｅｃで照射しながら蛍光画像を５００枚取得した。露光時のレーザ光のパワーは６９０Ｗ／ｃｍ^２とした。なお、画像取得時には、図３の撮像部１００と同様、顕微鏡の鏡体と蛍光検出用のカメラとの間に位相板を設置し、蛍光が２点に分割される条件で撮像を行った。

【0101】

［解析工程］
撮像工程で取得した５００枚の画像の内、５００枚目に取得した画像について、一つの視野の中心に存在する任意の３つの細胞の核について、それぞれ核内に収まる任意の範囲を円で囲み、円内の蛍光強度の標準偏差を算出した。この作業をブリーチング処理工程で光照射した他の２つの視野についても行い、計９細胞の標準偏差を得た。続いてこの９カ所の標準偏差について、平均と標準偏差を算出した。

【0102】

[比較例]
操作１〜３において光を照射しなかった部位についても、波長６４０ｎｍのレーザ光をパワーで露光時間１５ｍｓｅｃで照射しながら、蛍光画像を５００枚取得した。露光時のレーザ光のパワーは６９０Ｗ／ｃｍ^２とした。この場合も、位相板を用いて撮像を行った。

【0103】

操作１〜３のそれぞれについて、上記と同様の解析工程により、任意の９細胞の核内蛍光強度の標準偏差を取得し、取得した標準偏差の平均値と標準偏差を算出した。

【0104】

[検証結果]
図１０（ａ）において、右側のグラフが操作１によりレーザ光を照射した部位から取得した核内蛍光強度の標準偏差の平均値であり、左側のグラフが操作１によりレーザ光を照射しなかった部位から取得した核内蛍光強度の標準偏差の平均値である。各グラフの頂上には、核内蛍光強度の標準偏差の標準偏差を示すバーが示されている。操作１では、ブリーチング処理によりレーザ光を照射した部位の方が非照射部位よりも標準偏差の平均値が低かった。すなわち、レーザ光を照射した部位の方が非照射部位よりも蛍光強度のバラつきが小さく、蛍光色素からの蛍光が分離良く検出されていることが分かる。

【0105】

図１０（ｂ）、（ｃ）も、図１０（ａ）と同様の形態で、操作２、３に対する検証結果のグラフが示されている。図１０（ｂ）、（ｃ）に示すように、操作２、３においても、ブリーチング処理によりレーザ光を照射した部位の方が非照射部位よりも標準偏差の平均値が低かった。すなわち、レーザ光を照射した部位の方が非照射部位よりも蛍光強度のバラつきが小さく、蛍光色素からの蛍光が分離良く検出されていることが分かる。

【0106】

検証３から、レーザ光を照射してブリーチング処理を行うことにより、蛍光色素からの蛍光の検出度合いを高め得ることが確認された。図１０（ａ）〜（ｃ）を参照すると、蛍光色素からの蛍光の検出度合いは、操作１〜３で略同じであった。このことから、ブリーチング処理時に照射する光は、波長が短いほど短時間かつ低パワーで蛍光を抑制できることが分かる。よって、より迅速かつ効率的にブリーチング処理を行うには、より波長が短い光を用いるのが好ましい。

【0107】

なお、ブリーチング処理は、光の他に、試薬を用いて行うことも可能である。たとえば、リポフスチンの自家蛍光を抑制する試薬を用い得る。上記のようにブリーチング処理に光を用いると、光を所定時間照射するのみであるので、ブリーチング処理を簡易に行える。特に、短波長のレーザ光を用いると、短時間かつ低パワーでブリーチング処理を行い得る。

【0108】

＜検証４＞
検証４では、蛍光色素の蛍光に対する自家蛍光の影響について検討した。

【0109】

[前処理工程、撮像準備工程]
検証例４においても、上述の前処理工程を行った。検証例４では、２次抗体処理工程前にコントロールスライドを顕微鏡にセットし、波長５１４ｎｍのレーザ光を２００Ｗ／ｃｍ^２のパワーで５分間照射してブリーチング処理を行った。撮像準備工程は、上記検証３と同様に行った。

【0110】

［撮像工程］
撮像準備工程で準備したコントロールスライドを顕微鏡にセットし、ブリーチング処理で光照射した部位について、波長６４０ｎｍのレーザ光を６９０Ｗ／ｃｍ^２で５秒間照射した後、露光時間１５ｍｓｅｃで照射しながら蛍光画像を３０枚取得した。なお、画像取得時には、図３の撮像部１００と同様、顕微鏡の鏡体と蛍光検出用のカメラとの間に位相板を設置し、蛍光が２点に分割される条件で撮像を行った。

【0111】

[比較例]
ブリーチング処理において光を照射しなかった部位についても、波長６４０ｎｍのレーザ光を６９０Ｗ／ｃｍ^２で５秒間照射した後、露光時間１５ｍｓｅｃで照射しながら蛍光画像を３０枚取得した。この場合も、位相板を用いて撮像を行った。

【0112】

[検証結果]
図１１（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、ブリーチング処理を行った場合の撮像画像とブリーチング処理を行わなかった場合の撮像画像である。図１１（ａ）、（ｂ）では、便宜上、輝点のペアを示すための白丸が撮像画像に追加されている。

【0113】

図１１（ａ）に示すように、ブリーチング処理を行った部位の撮像画像では、白丸で囲んだ部分に輝点のペアを確認できた。確認可能な輝点のペアの数は１７であった。これに対し、図１１（ｂ）では、細胞からの自家蛍光の影響により、６個の起点のペアしか確認できなかった。この検証結果から、ブリーチング処理を行うことにより、蛍光色素から生じる蛍光が位相板で２つに分割される場合も良好に、蛍光色素からの蛍光を検出できることが分かる。

【0114】

３．検体分析装置
上記検証結果に基づいて、本実施形態に係る検体分析装置１は、たとえば図１２のように構成され得る。

【0115】

図１２に示すように、検体分析装置１は、上述の撮像部１００および解析部２００の他、前処理部３００と、コンベア４００と、データバス５００とを備える。撮像部１００および解析部２００は、図３で示した構成を備え、それぞれ、図４（ｂ）の撮像工程の処理と図５（ａ）の解析工程の処理を実行する。撮像部１００は、前処理部３００により前処理が施された測定試料を上記のように撮像する。解析部２００は、撮像部１００により得られた撮像画像を上記のように処理して被検物質を抽出する。

【0116】

前処理部３００は、被検物質を撮像するための前処理を測定試料に施す。前処理部３００は、図１に示すステップＳ１１〜Ｓ１７の処理と、ステップＳ２１の処理を行う。なお、図１２では、図１のステップＳ２１のブリーチング工程が、ステップＳ１５のブロッキング処理工程の後段で行われるように前処理部３００が構成されている。しかし、ブリーチング工程の順番は、図１のステップＳ１５よりも後ろであれば良く、たとえば、ステップＳ１６とステップＳ１７の間でブリーチング工程が行われても良い。前処理部３００においても、ブリーチング工程を行う処理ユニットの配置は適宜変更され得る。

【0117】

前処理部３００は、７つの処理ユニット３０１〜３０７と、コンベア３０８を備える。コンベア３０８は、測定試料が載せられたスライドガラス１２１を処理ユニット３０１〜３０７の前に順番に搬送する。コンベア３０８は、スライドガラス１２１を左方向のみに搬送する。処理ユニット３０１〜３０６は、前方に搬送されたスライドガラス１２１をコンベア３０８から内部に取り込んで処理し、処理が済んだスライドガラス１２１をコンベア３０８に戻す。処理ユニット３０７は、前方に搬送されたスライドガラス１２１をコンベア３０８から内部に取り込んで処理し、処理が済んだスライドガラス１２１を左方のコンベア４００に送り出す。

【0118】

処理ユニット３０１〜３０５は、それぞれ、図１のステップＳ１１〜Ｓ１５の処理を行う。すなわち、処理ユニット３０１〜３０５は、それぞれ、スライドガラス１２１上の測定試料に対して、脱パラフィン処理、賦活化処理、フロアテーゼ処理、ＤＮＡ変性処理およびブロッキング処理を行う。

【0119】

処理ユニット３０６は、図１のステップＳ２１の処理を行う。すなわち、処理ユニット３０６は、スライドガラス１２１上の測定試料に光を照射して、測定試料にブリーチング処理を行う。処理ユニット３０６は、たとえば、レーザ光源と、レーザ光源から出射された光を平行光に変換するコリメータレンズと、コリメータレンズを透過した光を絞って測定試料に照射する絞りとを備える構成とされ得る。このように光を用いてブリーチング処理を行うことにより、ブリーチング処理を簡易に行える。

【0120】

処理ユニット３０７は、図１のステップＳ１６、Ｓ１７の処理を行う。すなわち、処理ユニット３０７は、測定試料中の被検物質に結合したＤＮＰ標識核酸プローブに１次抗体を結合させるための処理と、ＤＮＰ標識核酸プローブに結合した１次抗体にさらに蛍光色素、すなわち蛍光標識された２次抗体を結合させるための処理とを実行する。処理ユニット３０１〜３０７およびコンベア３０８は、データバス５００を介して解析部２００に接続されている。処理ユニット３０１〜３０７およびコンベア３０８は、解析部２００によって制御される。処理ユニット３０１〜３０７およびコンベア３０８は、所定位置にスライドガラス１２１に到着したことを検出するセンサ等の検出部を備える。

【0121】

処理ユニット３０７による標識処理が終了したスライドガラス１２１は、処理ユニット３０７から左方のコンベア４００に送り出される。コンベア４００は、スライドガラス１２１を撮像部１００の前に搬送する。撮像部１００は、搬送されたスライドガラス１２１をコンベア４００から内部に取り込んで撮像し、撮像が済んだスライドガラス１２１をコンベア４００に戻す。コンベア４００は、撮像部１００から戻されたスライドを、回収ユニットへと搬送する。コンベア４００も解析部２００によって制御される。コンベア４００は、所定位置にスライドガラス１２１が到着したことを検出するセンサ等の検出部を備える。

【0122】

なお、処理ユニット３０１〜３０７は、必ずしも別個のユニットとして設けられなくとも良く、複数の処理ユニットが一つのユニットまたは装置に纏められ、その中で各処理ユニットの処理が行われても良い。また、前処理部３００と撮像部１００が一つにユニット化されても良い。

【0123】

図１２の検体分析装置１では、前処理部３００において、測定試料の温度を６２℃以上に高めて測定試料を処理する処理ユニット３０４に対して処理順序の下流側に、ブリーチング処理を行う処理ユニット３０６が配置されている。測定試料に熱を与えてＤＮＡに変性を生じさせるＤＮＡ変性処理を行う処理ユニット３０４は、ブリーチング処理を行う処理ユニット３０６よりも先に測定試料に処理を行う。脱パラフィン処理を行う処理ユニット３０１および賦活化処理を行う処理ユニット３０２も、ブリーチング処理を行う処理ユニット３０６よりも先に測定試料に処理を行う。また、前処理部３００は、ブリーチング処理を行う処理ユニット３０６よりも下流側に、測定試料を６２℃以上に加熱して処理を行う処理ユニットを含まない。よって、上記検証にて示したように、測定試料からの自家蛍光を確実に抑制した状態で測定試料が撮像部１００に提供される。これにより、撮像部１００は、被検物質に結合した蛍光色素からの蛍光を、測定試料からの自家蛍光が抑制された状態で撮像できる。解析部２００は、自家蛍光が抑制された撮像画像を解析するため、精度良く結合色素の蛍光を検出できる。よって、解析部２００は、測定試料に含まれる被検物質を高精度に解析できる。

【0124】

図１２の検体分析装置１では、前処理部３００は、ブリーチング処理を行う処理ユニット３０６よりも処理順序の下流側に測定試料を４４℃以上に加熱して処理を行う処理ユニットと測定試料を３７℃より高めて処理を行う処理ユニットの何れも含まない。よって、上記検証にて示したように、測定試料からの自家蛍光をより確実に抑制した状態で測定試料が撮像部１００に提供される。これにより、撮像部１００は、被検物質に結合した蛍光色素からの蛍光を、測定試料からの自家蛍光がさらに抑制された状態で撮像できる。解析部２００は、自家蛍光が確実に抑制された撮像画像を解析するため、さらに精度良く結合色素の蛍光を検出できる。よって、解析部２００は、測定試料に含まれる被検物質をより高精度に解析できる。

【0125】

本発明は、ＨＥＲ２遺伝子やＣＥＰ１７以外の被検物質を分析する検体分析方法および検体分析装置にも適用可能である。また、本発明は、乳癌の検診以外の疾病の診断にも用いられ得る。本発明は、凍結組織や生細胞などを分析する検体分析方法および検体分析装置に適用可能である。この他、本発明は、デジタルＰＣＲで用いる磁性ビーズから生じる自家蛍光を抑制する場合にも適用可能である。

【符号の説明】

【0126】

１ … 検体分析装置
１００ … 撮像部
２００ … 解析部
３００ … 前処理部
３０１、３０２、３０４、３０７、３０７ … 処理ユニット

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】