特許 6720406 耐熱保護剤、室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6720406

(24)【登録日】2020年6月19日

(45)【発行日】2020年7月8日

(54)【発明の名称】耐熱保護剤、室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/187 20060101AFI20200629BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20200629BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20200629BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20200629BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20200629BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20200629BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20200629BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20200629BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200629BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/187

   A61K47/26

   A61P31/14

   A61K47/10

   A61K47/18

   A61K47/42

   A61P37/04

   A61K39/00 E

   A61K39/00 G

   A61P43/00 105

【請求項の数】9

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2019-517082(P2019-517082)

(86)(22)【出願日】2017年9月21日

(65)【公表番号】特表2019-532949(P2019-532949A)

(43)【公表日】2019年11月14日

(86)【国際出願番号】CN2017102667

(87)【国際公開番号】WO2019028976

(87)【国際公開日】20190214

【審査請求日】2019年3月28日

(31)【優先権主張番号】201710670177.6

(32)【優先日】2017年8月8日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】516158068

【氏名又は名称】江▲蘇▼省▲農▼▲業▼科学院

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】呂 芳

(72)【発明者】

【氏名】盧 宇

(72)【発明者】

【氏名】侯 継波

(72)【発明者】

【氏名】趙 艶紅

(72)【発明者】

【氏名】▲ドン▼ 碧華

(72)【発明者】

【氏名】張 金秋

(72)【発明者】

【氏名】張 暁燕

(72)【発明者】

【氏名】左 暁▲シン▼

【審査官】 渡邉 潤也

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５２３１２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０５９９９２８４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４２２５６０６（ＣＮ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／１５７２０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特公昭４８−１４８４（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】 特開平０２−２４２６７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Vaccine，２０１６年，34，p.3746-3750

【文献】 Journal of Agricultural Science and Technology，２０１６年，18(4)，p.168-173

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

豚コレラウィルスに耐熱性を付与し、保存安定性を向上させるための耐熱保護剤であって、
質量パーセンテージでラフィノース１％〜５％、麦芽糖５％〜１０％、蔗糖１５％〜３０％、ラクトース１％〜５％、ブドウ糖１％〜５％、ポリソルベート８０ ０.１％〜１.５％、ポリエチレングリコール８０００ ０.１％〜０.５％、チロシン０.５％〜３％、フィブロイン３％〜６％、残りは注射用水である、
ことを特徴とする耐熱保護剤。

【請求項2】

質量パーセンテージでラフィノース１.５％〜４％、麦芽糖６％〜９％、蔗糖２０％〜２５％、ラクトース２％〜４％、ブドウ糖２％〜４％、ポリソルベート８０ ０.５％〜１％、ポリエチレングリコール８０００ ０.２％〜０.４％、チロシン１％〜２％、フィブロイン４％〜５％、残りは注射用水である、
ことを特徴とする請求項１に記載の耐熱保護剤。

【請求項3】

ラフィノース、麦芽糖、蔗糖、ラクトース、ブドウ糖、ポリソルベート８０を水に溶かし、高圧蒸気滅菌法で滅菌して溶液１を得るステップ１）と、
ポリエチレングリコール８０００、チロシン、フィブロインを水に溶かし、濾過法で除菌して溶液２を得るステップ２）と、
溶液１と溶液２を混合し、水を補足し、耐熱保護剤を得るステップ３）とを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の耐熱保護剤の製造方法。

【請求項4】

請求項１に記載の耐熱保護剤の豚コレラ生ワクチン製造への使用。

【請求項5】

請求項１に記載の耐熱保護剤の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチン製造への使用。

【請求項6】

豚コレラウィルスを含む溶液と請求項１または２に記載の耐熱保護剤を体積比１〜３：１の割合で均一に混合して得た豚コレラ生ワクチン溶液を用い、
前記豚コレラ生ワクチン溶液を常温常圧で０.５〜２時間放置した後、真空度５００ｍＢａｒ〜８００ｍＢａｒ、温度５℃〜３０℃の条件で０.５〜１時間、真空度８０ｍＢａｒ〜５００ｍＢａｒ、温度１０℃〜３５℃の条件で０.５〜２時間、真空度３０ｍＢａｒ〜８０ｍＢａｒ、温度１０℃〜４０℃の条件で０.５〜２時間、真空度０.０１ｍＢａｒ〜０.０５ｍＢａｒ、温度２０℃〜４０℃で８〜１２時間、真空度０.００１ｍＢａｒ〜０.０１ｍＢａｒ、温度２０℃〜４０℃の条件で１２〜２４時間保持する乾燥方法を用いて乾燥した後、豚コレラ生ワクチンを得る、
ことを特徴とする室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法。

【請求項7】

前記乾燥した豚コレラ生ワクチンを走査電子顕微鏡で観察するとガラス様のラメラ構造を呈し、そのガラス転移温度は５０℃以上に達する、
ことを特徴とする請求項６に記載の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法。

【請求項8】

前記ガラス転移温度は６５〜７０℃に達する、
ことを特徴とする請求項７に記載の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法。

【請求項9】

前記豚コレラウィルスは細胞毒性である、
ことを特徴とする請求項６に記載の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はワクチンの製造保存の分野に属し、具体的には耐熱保護剤、室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法及びその使用、特に室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンとその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

豚コレラ（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ，ＣＳＦ）はフラビウィルス科ペスチウィルス属豚コレラウィルス（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ，ＣＳＦＶ）によって引き起こされる急性、熱性、高度接触性伝染病で、流行性が広く、病死率が高く、養豚業に大きな安全的脅威と経済的損失をもたらしている。現在豚コレラを予防する効果があるのは豚コレラ生ワクチンと家兎化ワクチンで、いずれもＣ株を基礎にしたものである。

【0003】

豚コレラウィルスは熱に非常に敏感で、文献によると、豚コレラウィルスは３７℃での半減期はわずか３時間しかない。現在よく使われている豚コレラ生ワクチンは主に冷凍乾燥技術で製造されたもので、よく使われている冷凍乾燥保護剤の配合が単純で、その多くは蔗糖、ゼラチン、チオ尿素、牛血清アルブミン、ラクトアルブミン水解物、燐酸塩などの成分が多く含まれており、ワクチンの耐熱性が限られており、３７℃でわずか７−１０日間しか保存できず、−１５℃で長期保存するか、あるいは２〜８℃で１−２年間保存することが可能であるが、コールドチェーンが一旦切れると、常温においてわずか数時間で製品の力価が５０％以上失われてしまい、場合によっては完全に失効してしまうこともある。同時に冷凍過程で形成した氷結晶はウィルスの嚢膜あるいは細胞壁に機械的損傷を与え、ウィルスの活性が大きく低下してしまう。そのため、ワクチンの乾燥損失を減らし、ワクチンの耐熱性を高めることによってワクチンの品質を保障することは、免疫効力を充分に発揮させるための重要なカギとなっている。近年、多くの研究者は耐熱技術の改良、例えばスプレー乾燥、バイオミネラリゼーションなどの研究を行っているが、いずれも実験室レベルに留まっている。

【0004】

糖ガラス化保存技術はワクチンをガラスの状態にする方法で、当該技術は主に真空勾配乾燥プロセスを通じて実現されるもので、真空勾配降下の過程において、ワクチンを含む高粘度の糖液を沸騰、泡立ちさせ、水分を揮発させることによって、次第にガラス体に固まる技術である。非還元糖が非常に安定しているため、ワクチンを包んでいる糖ガラスはタンパク質と反応しない。この技術は冷凍する必要がなく、常温で行うことができるため、伝統的な冷凍乾燥の「冷凍」によって形成される氷結晶によるウィルスの機械的損傷を避けることができる。また、ワクチンの糖質含有量が高く、粘度が高いため、形成されたガラス状のワクチンはより高いガラス転移温度を持ち、室温など「コールドチェーン」以外の環境でも長期保存することができる。

【0005】

ガラス転移温度Ｔｇ（Ｇｌａｓｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とは物質の重要かつ特徴的な熱パラメーターで、物質がガラスの状態から高弾性状態に変化する温度を指す。Ｔｇ以下では重合度の高い物質がガラスの状態にあるため、分子鎖やセグメントが運動できず、分子を構成する原子（またはラジカル）のみ平衡位置で振動する。Ｔｇの時点で分子鎖が移動できないが、セグメントは運動し始め、高弾性が現れ、温度がさらに上昇すると、分子鎖全体が運動し始め、粘性流の性質が現れる。乾燥したワクチンにとって、Ｔｇが高ければ、またＴｇと貯蔵温度の差が大きくなるほど、ワクチンの長期貯蔵にとって好都合である。

【0006】

以上の原理に基づいて、ワクチンに対する真空勾配乾燥を行う前に増粘剤を加えてワクチンの粘度を高めると同時に、乾燥過程で泡を立ててかつサンプルを噴き出さないようにするために真空度の降下速度があまり速すぎるといけない。そのため、配合を設計する時に多価アルコール、ポリマー、表面活性剤、アミノ酸およびタンパク質安定剤が含まれるように留意する必要がある。多価アルコールは乾燥過程において水合作用によって失われた水に代わって、生物活性物質の変性を防ぎ、増粘剤の役割を果たし、その靭性で泡の形成と安定を支えることができるため、乾燥した後の泡構造を保つことができる。一般的によく使われている発泡成分として蔗糖、トレハロース、ソルボース、メレチトース、ソルビトール、スタキオース、ラフィノース、果糖、マンノース、麦芽糖、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、ブドウ糖、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、トレイトール、グリセリン、Ｌ−スチボグルコン酸ナトリウムなどがある。大部分の多価アルコールは生物活性物質と配合して混合溶液を作り、その濃度は１−３５％、または１.５−９％、または１０−２５％である。

【0007】

ポリマーは処方の中で主に保護の役割を果たし、多価アルコールと併用することによって、配合の粘度を高め、線状あるいは分枝重合体は本発明の乾燥した後の泡構造の強度を増加させることができる。多くのポリマーの水溶性が非常に高いため、それらが乾燥後の泡の再構築に著しい阻害を与える心配はない。表面活性剤は主に泡形成の過程に表面張力を保って生物活性成分の変性を防ぎ、泡の安定性、迅速な再構築に役立つ。表面活性剤は適当なイオン／非イオン洗浄剤、Ｔｗｅｅｎ表面活性剤、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ表面活性剤などでよい。タンパク質やアミノ酸の添加は乾燥製品の長期保存中に抗酸化作用の働きをし、一般的なタンパク質としてはウシ血清アルブミン、フィブロインなどがある。アミノ酸としてはチロシン、アルギニン、ヒスチジン、システインなどがある。

【0008】

また、ワクチンを良好なガラス状態に保つために、糖ガラスワクチンの残留水分を１〜３％に抑え、あまり高くならないように留意する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明が解決しようとする技術的問題は耐熱保護剤を提供することである。

【0010】

また、本発明が解決しようとする技術的問題は耐熱保護剤の製造方法を提供することである。

【0011】

また、本発明が解決しようとする技術的問題は耐熱保護剤のワクチンの製造への使用である。

【0012】

更に、本発明が解決しようとする技術的問題は耐熱保護剤の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造への使用である。

【0013】

本発明が最後に解決しようとする技術的問題は室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明の目的は次の技術手段によって実現される。

【0015】

耐熱保護剤であって、前記耐熱保護剤は質量パーセンテージ含有量として次の組成を含むが、それらに限るものではなく、ラフィノース１％〜５％、麦芽糖５％〜１０％、蔗糖１５％〜３０％、ラクトース１％〜５％、ブドウ糖１％〜５％、ポリソルベート８０ ０.１％〜１.５％、ポリエチレングリコール８０００ ０.１％〜０.５％、チロシン０.５％〜３％、フィブロイン３％〜６％で、残りは注射用水である。

【0016】

ここで、前記耐熱保護剤は質量パーセンテージ含有量として次の組成を含むが、それらに限るものではなく、ラフィノース１.５％〜４％、麦芽糖６％〜９％、蔗糖２０％〜２５％、ラクトース２％〜４％、ブドウ糖２％〜４％、ポリソルベート８０ ０.５％〜１％、ポリエチレングリコール８０００ ０.２％〜０.４％、チロシン１％〜２％、フィブロイン４％〜５％、残りは注射用水である。

【0017】

また、本発明は耐熱保護剤の製造方法を含み、前記方法は、
ラフィノース、麦芽糖、蔗糖、ラクトース、ブドウ糖、ポリソルベート８０を水に溶かし、高圧蒸気滅菌法で滅菌して溶液１を得るステップ１）と、
ポリエチレングリコール８０００、チロシン、フィブロインを水に溶かし、濾過法で除菌して溶液２を得るステップ２）と、
溶液１と溶液２を混合し、水を補足して、耐熱保護剤を得るステップ３）とを備える。

【0018】

また、本発明は前記耐熱保護剤のワクチンの製造への使用を含む。

【0019】

また、本発明は前記耐熱保護剤の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造への使用を含む。

【0020】

また、本発明は室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法を含み、前記方法では、豚コレラウィルス溶液と前記耐熱保護剤を体積比１〜３:１の割合で均一に混合して豚コレラ生ワクチンの溶液を作り、真空勾配乾燥した後前記豚コレラワクチンを得る。乾燥過程において、真空度を段階的に降下させ、温度を室温に維持し、水分を揮発させて、液体が粘稠になり、沸点が低下し、真空度と溶液の粘稠度が一定の閾値に達した場合、溶液は泡立ち始め、水分揮発の表面積が増大するため、ワクチンの乾燥が加速する。当該方法は冷凍プロセスを経ていないため、氷結晶によるウィルスの損傷を免れることができる。

【0021】

具体的には、真空勾配乾燥方法は次の通りであり、
豚コレラ生ワクチン溶液を常温常圧で０.５〜２時間放置した後、真空度５００ｍＢａｒ〜８００ｍＢａｒ、温度５℃〜３０℃の条件で０.５〜１時間、真空度８０ｍＢａｒ〜５００ｍＢａｒ、温度１０℃〜３５℃の条件で０.５〜２時間、真空度３０ｍＢａｒ〜８０ｍＢａｒ、温度１０℃〜４０℃の条件で０.５〜２時間、真空度０.０１ｍＢａｒ〜０.０５ｍＢａｒ、温度２０℃〜４０℃の条件で８〜１２時間、真空度０.００１ｍＢａｒ〜０.０１ｍＢａｒ、温度２０℃〜４０℃の条件で１２〜２４時間保持して、乾燥した豚コレラ生ワクチンを得る。

【0022】

ここで、本発明で製造した豚コレラ生ワクチンは３７℃で３ヶ月、２５℃で１年間保存することができる。

【0023】

本発明によると、前記乾燥した豚コレラ生ワクチンは走査型電子顕微鏡で観察するとガラス様のラメラ構造を示し、そのガラス転移温度は５０℃以上に達し、前記ガラス転移温度は６５〜７０℃にのぼる。

【0024】

ここで、前記豚コレラウィルス溶液は細胞毒性（Ｃ株）である。

【発明の効果】

【0025】

従来の技術と比較して、本発明は次の利点がある。

【0026】

１、本発明の耐熱保護剤は、成分の配合が合理的で、豚コレラ生ワクチンに耐熱性、耐貯蔵性を持たせているため、ウィルスを休眠状態にして、乾燥や保存期間中におけるウィルスの生命活動を低下させることができる。

【0027】

２、本発明の真空勾配乾燥技術は、氷結晶による損傷を避けることができるため、豚コレラ生ワクチンの製造過程での損失を最低限に抑え、豚コレラウィルスの活性を保つことができる。

【0028】

３、本発明で製造した豚コレラ生ワクチンは３７℃で３ヶ月、２５℃で１年間保存することができる。

【0029】

４、本発明で製造したワクチンの外観は緻密な乾燥した泡状で、走査型電子顕微鏡で観察するとガラス様のラメラ構造を呈し、そのガラス転移温度は５０℃以上に達し、通常の冷凍乾燥ワクチンより３０℃以上も高い。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】豚コレラ生ワクチンの外観（緻密な乾燥した泡状）を示す図である。

【図2】豚コレラ生ワクチンの電子顕微鏡写真（ガラス様ラメラ構造）である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

以下の実施例は本発明を詳細に説明するものであるが、本発明にいかなる制限を与えるものではない。

【0032】

実施例１：耐熱保護剤１および豚コレラ生ワクチン１の調製
特に説明がない限り、本実施例のパーセンテージは重量パーセントである。

【0033】

耐熱保護剤１の処方
ラフィノース １.０％
麦芽糖 １０.０％
蔗糖 １５.０％
ラクトース ５.０％
ブドウ糖 １.０％
ポリソルベート８０ ０.１％
ポリエチレングリコール８０００ ０.５％
チロシン ３.０％
フィブロイン ３.０％
注射用水 ６１.４％

【0034】

耐熱保護剤１の具体的な調製プロセスは次の通りである。ラフィノース、麦芽糖、蔗糖、ラクトース、ブドウ糖、ポリソルベート８０を水に溶かし、高圧蒸気滅菌法（１１０℃、２０ｍｉｎ）で滅菌し、ポリエチレングリコール８０００、チロシン、フィブロインを水に溶かし、０.２２μmのフィルタで濾過して除菌し、高圧滅菌したものと濾過除菌したものを同容量で混合し、注射用水を補足し、前記耐熱保護剤１を得た。

【0035】

豚コレラ生ワクチン１の調製：耐熱保護剤１と豚コレラウィルス溶液（Ｃ株、ウィルス含有量５０×１０^４ＲＩＤ／ｍｌ）を体積比３：１の割合で混合し、７ｍｌのペニシリンボトルにそれぞれ１ｍｌずつ入れて、ブチルゴム栓で半栓した後、凍結乾燥機に入れて真空勾配乾燥を行って、豚コレラ生ワクチン１を得た。

【0036】

当該真空勾配乾燥の具体的なステップとして、豚コレラ生ワクチン溶液を常温常圧で０.５時間放置した後、真空度５００ｍＢａｒ、温度２０℃の条件で０.５時間、真空度５００ｍＢａｒ、温度２０℃の条件で１時間、真空度８０ｍＢａｒ、温度２５℃の条件で０.５時間、真空度０.０５ｍＢａｒ、温度４０℃の条件で１２時間、真空度０.０１ｍＢａｒ、温度４０℃の条件で２４時間保持して、乾燥した豚コレラ生ワクチン１を得た。

【0037】

実施例２：耐熱保護剤２および豚コレラ生ワクチン２の調製
特に説明がない限り、本実施例のパーセンテージは重量パーセントである。

【0038】

耐熱保護剤２の処方：
ラフィノース ５.０％
麦芽糖 ５.０％
蔗糖 ３０.０％
ラクトース １.０％
ブドウ糖 ５.０％
ポリソルベート８０ １.５％
ポリエチレングリコール８０００ ０.１％
チロシン ０.５％
フィブロイン ６.０％
注射用水 ４５.９％

【0039】

耐熱保護剤２の具体的な調製プロセスは次の通りである。ラフィノース、麦芽糖、蔗糖、ラクトース、ブドウ糖、ポリソルベート８０を水に溶かし、高圧蒸気滅菌法で滅菌し、ポリエチレングリコール８０００、チロシン、フィブロインを水に溶かして、濾過法で除菌し、高圧滅菌したものと濾過除菌したものを同容量で混合し、注射用水を補足し、耐熱保護剤２を得た。

【0040】

豚コレラ生ワクチン２の調製：耐熱保護剤２と豚コレラウィルス溶液（Ｃ株、ウィルス含有量５０×１０^４ＲＩＤ／ｍｌ）を体積比１：１の割合で混合し、７ｍｌのペニシリンボトルにそれぞれ１ｍｌずつ入れて、ブチルゴム栓で半栓した後、凍結乾燥機に入れて真空勾配乾燥を行って、豚コレラ生ワクチン２を得た。

【0041】

真空勾配乾燥の具体的なステップとして、豚コレラ生ワクチン溶液を常温常圧で１時間放置した後、真空度８００ｍＢａｒ、温度１０℃の条件で１時間、真空度８０ｍＢａｒ、温度１０℃の条件で０.５時間、真空度５０ｍＢａｒ、温度１５℃の条件で２時間、真空度０.０２ｍＢａｒ、温度２０℃の条件で１２時間、真空度０.００１ｍＢａｒ、温度２０℃の条件で２４時間保持して、乾燥した豚コレラ生ワクチン２を得た。

【0042】

実施例３：耐熱保護剤３および豚コレラ生ワクチン３の調製
特に説明がない限り、本実施例のパーセンテージは重量パーセントである。

【0043】

耐熱保護剤３の処方
ラフィノース ２.５％
麦芽糖 ７.５％
蔗糖 ２２.５％
ラクトース ２.５％
ブドウ糖 ２.５％
ポリソルベート８０ ０.７５％
ポリエチレングリコール８０００ ０.２５％
チロシン １.５％
フィブロイン ４.５％
注射用水 ５５.５％

【0044】

耐熱保護剤３の具体的な調製プロセスは次の通りである。ラフィノース、麦芽糖、蔗糖、ラクトース、ブドウ糖、ポリソルベート８０を水に溶かし、高圧蒸気滅菌法で滅菌し、ポリエチレングリコール８０００、チロシン、フィブロインを水に溶かして、濾過法で除菌し、高圧滅菌したものと濾過除菌したものを同容量で混合し、注射用水を補足し、耐熱保護剤３を得た。

【0045】

豚コレラ生ワクチン３の調製：耐熱保護剤３と豚コレラウィルス溶液（Ｃ株、ウィルス含有量５０×１０^４ＲＩＤ／ｍｌ）を体積比３：１の割合で混合し、７ｍｌのペニシリンボトルにそれぞれ１ｍｌずつ入れて、ブチルゴム栓で半栓した後、凍結乾燥機に入れて真空勾配乾燥を行って、豚コレラ生ワクチン３を得た。

【0046】

真空勾配乾燥の具体的なステップとして、豚コレラ生ワクチン溶液を常温常圧で２時間放置した後、真空度７００ｍＢａｒ、温度５℃の条件で０.７時間、真空度３００ｍＢａｒ、温度１０℃の条件で０.５時間、真空度３０ｍＢａｒ、温度２５℃の条件で２時間、真空度０.０１ｍＢａｒ、温度２５℃の条件で１２時間、真空度０.００１ｍＢａｒ、温度２５℃の条件で１２時間保持して、乾燥した豚コレラ生ワクチン３を得た。

【0047】

実施例４：耐熱保護剤４および豚コレラ生ワクチン４の調製
特に説明がない限り、本実施例のパーセンテージは重量パーセントである。

【0048】

耐熱保護剤４の処方
ラフィノース １.５％
麦芽糖 ６.０％
蔗糖 ２５.０％
ラクトース ４.０％
ブドウ糖 ４.０％
ポリソルベート８０ ０.５％
ポリエチレングリコール８０００ ０.４％
チロシン ２.０％
フィブロイン ５.０％
注射用水 ５１.６％

【0049】

耐熱保護剤４の具体的な調製プロセスは次の通りである。ラフィノース、麦芽糖、蔗糖、ラクトース、ブドウ糖、ポリソルベート８０を水に溶かし、高圧蒸気滅菌法で滅菌し、ポリエチレングリコール８０００、チロシン、フィブロインを水に溶かして、濾過法で除菌し、高圧滅菌したものと濾過除菌したものを同容量で混合し、注射用水を補足し、耐熱保護剤３を得た。

【0050】

豚コレラ生ワクチン４の調製：耐熱保護剤４と豚コレラウィルス溶液（Ｃ株、ウィルス含有量５０×１０^４ＲＩＤ／ｍｌ）を体積比３：１の割合で混合し、７ｍｌのペニシリンボトルにそれぞれ１ｍｌずつ入れて、ブチルゴム栓で半栓した後、凍結乾燥機に入れて真空勾配乾燥を行って、豚コレラ生ワクチン４を得た。

【0051】

真空勾配乾燥の具体的なステップとして、豚コレラ生ワクチン溶液を常温常圧で０.５時間放置した後、真空度５００ｍＢａｒ、温度１５℃の条件で０.５時間、真空度８０ｍＢａｒ、温度１５℃の条件で２時間、真空度５０ｍＢａｒ、温度２０℃の条件で１時間、真空度０.０５ｍＢａｒ、温度２０℃の条件で１２時間、真空度０.０１ｍＢａｒ、温度２５℃の条件で１８時間保持して、乾燥した豚コレラ生ワクチン４を得た。

【0052】

実施例５：耐熱保護剤５および豚コレラ生ワクチン５の調製
特に説明がない限り、本実施例のパーセンテージは重量パーセントである。

【0053】

耐熱保護剤５の処方：
ラフィノース ４.０％
麦芽糖 ９.０％
蔗糖 ２０.０％
ラクトース ２.０％
ブドウ糖 ２.０％
ポリソルベート８０ １.０％
ポリエチレングリコール８０００ ０.２％
チロシン １.０％
フィブロイン ４.０％
注射用水 ５６.８％

【0054】

耐熱保護剤５の具体的な調製プロセスは次の通りである。ラフィノース、麦芽糖、蔗糖、ラクトース、ブドウ糖、ポリソルベート８０を水に溶かし、高圧蒸気滅菌法で滅菌し、ポリエチレングリコール８０００、チロシン、フィブロインを水に溶かして、濾過法で除菌し、高圧滅菌したものと濾過除菌したものを同容量で混合し、注射用水を補足し、耐熱保護剤５を得た。

【0055】

豚コレラ生ワクチン５の調製：耐熱保護剤５と豚コレラウィルス溶液（Ｃ株、ウィルス含有量５０×１０^４ＲＩＤ／ｍｌ）を体積比２：１の割合で混合し、７ｍｌのペニシリンボトルにそれぞれ１ｍｌずつ入れて、ブチルゴム栓で半栓した後、凍結乾燥機に入れて真空勾配乾燥を行って、豚コレラ生ワクチン５を得た。

【0056】

真空勾配乾燥の具体的なステップとして、豚コレラ生ワクチン溶液を常温常圧で０.５時間放置した後、真空度８００ｍＢａｒ、温度３０℃の条件で０.５時間、真空度８０ｍＢａｒ、温度３５℃の条件で２時間、真空度５０ｍＢａｒ、温度４０℃の条件で１時間、真空度０.０５ｍＢａｒ、温度３０℃の条件で１２時間、真空度０.０１ｍＢａｒ、温度３０℃の条件で１８時間保持して、乾燥した豚コレラ生ワクチン５を得た。

【0057】

実施例６：耐熱保護剤６および豚コレラ生ワクチン６の調製
特に説明がない限り、本実施例のパーセンテージは重量パーセントである。

【0058】

耐熱保護剤６の処方
ラフィノース ３.０％
麦芽糖 ８.０％
蔗糖 ２８.０％
ラクトース ３.０％
ブドウ糖 １.０％
ポリソルベート８０ ０.６％
ポリエチレングリコール８０００ ０.２％
チロシン １.０％
フィブロイン ３.０％
注射用水 ５２.２％

【0059】

耐熱保護剤６の具体的な調製プロセスは次の通りである。ラフィノース、麦芽糖、蔗糖、ラクトース、ブドウ糖、ポリソルベート８０を水に溶かし、高圧蒸気滅菌法で滅菌し、ポリエチレングリコール８０００、チロシン、フィブロインを水に溶かして、濾過法で除菌し、高圧滅菌したものと濾過除菌したものを同容量で混合し、注射用水を補足し、耐熱保護剤６を得た。

【0060】

豚コレラ生ワクチン６の調製：耐熱保護剤６と豚コレラウィルス溶液（Ｃ株、ウィルス含有量５０×１０^４ＲＩＤ／ｍｌ）を体積比１：１の割合で混合し、７ｍｌのペニシリンボトルにそれぞれ１ｍｌずつ入れて、ブチルゴム栓で半栓した後、凍結乾燥機に入れて真空勾配乾燥を行って、豚コレラ生ワクチン６を得た。

【0061】

真空勾配乾燥の具体的なステップとして、豚コレラ生ワクチン溶液を常温常圧で０.５時間放置した後、真空度５００ｍＢａｒ、温度２５℃の条件で１時間、真空度８０ｍＢａｒ、温度２５℃の条件で２時間、真空度５０ｍＢａｒ、温度３０℃の条件で１時間、真空度０.０５ｍＢａｒ、温度３０℃の条件で８時間、真空度０.０１ｍＢａｒ、温度３５℃の条件で２４時間保持して、乾燥した豚コレラ生ワクチン６を得た。

【0062】

実施例７：対照耐熱保護剤１
対照耐熱凍乾燥保護剤１（ＣＮ１０３３４１１７６Ａにて開示）の具体的な調製プロセスは次の通りである。

【0063】

（１）Ａ液の調製：ＮＺ−アミン（ＮＺ aｍｉｎe [商] ＮＺアミン［カゼインの酵素分解物］）３ｇ、グルタミン酸カリウム（ＣＡＳ：６３８２−０１−０）０.３７５ｇ、蔗糖２５ｇ、ラクトアルブミン水解物１.８７５ｇを順次に１００ｍｌの注射用水に溶かし、充分に溶解した後均一に振り混ぜて、０.２２μmのフィルタで除菌濾過した後２〜８℃に保存した。

【0064】

（２）Ｂ液の調製：ゼラチン加水分解物２０ｇを取り、７０〜８０℃の注射用水１００ｍｌで充分に溶解した後、１２１℃、１５ポンドの高圧で３０分滅菌し、滅菌した後３７℃に保存した。

【0065】

（３）Ａ液とＢ液を４:１の割合で配合し、均一に混合して耐熱冷凍乾燥保護剤を得た。ここで各成分の質量体積パーセンテージ濃度は次の通りである。ＮＺ−アミン２.４％、グルタミン酸カリウム０.３％、蔗糖２０％、ラクトアルブミン水解物１.５％、ゼラチン加水分解物４％。

【0066】

対照豚コレラ生ワクチン１：対照耐熱冷凍乾燥保護剤１と豚コレラウィルス抗原液（Ｃ株、ウィルス含有量５０×１０^４ＲＩＤ／ｍｌ）を体積比１：４の割合で混合して、７ｍｌのペニシリンボトルに１ｍｌずつ入れて、ブチルゴム栓で半栓した後、凍結乾燥機に入れる。

【0067】

具体的な凍結乾燥ステップとして、混合液を冷凍乾燥機に入れて、予備冷凍温度を−５０℃に設定し、予備冷凍保持時間を２ｈ、予備冷凍前半の温度を−１５℃に制御し、製品から解析熱を放出した後急速に冷凍し、昇華段階の製品温度は−３３℃、ラメラ温度は−８℃、昇華時間は１１ｈ、解析温度は２６℃、解析時間は４ｈ、冷凍乾燥全行程は２４ｈで、蓋をした後取り出し、対照豚コレラ生ワクチン１を得た。

【0068】

実施例８：対照耐熱保護剤２
対照耐熱凍乾燥保護剤２（ＣＮ１０３０４１３９９Ａにて開示）の具体的な調製プロセスは次の通りである。

【0069】

トレハロース ６８％
グリシン ６％
ゼラチン ３％
カゼイン加水分解物 ６％
ポリビニルピロリドン ６％
グリセリン ５％
プルロニック６８ ６％

【0070】

各耐熱保護剤の処方に基づいて、各成分を秤量し、対照耐熱保護剤２を得た。

【0071】

対照豚コレラ生ワクチン２：対照耐熱保護剤２と豚コレラウィルスの抗原液（Ｃ株、ウィルス含有量５０×１０^４ＲＩＤ／ｍｌ）を体積比１：１の割合で混合し、７ｍｌのペニシリンボトルにそれぞれ１ｍｌずつ入れて、ブチルゴム栓で半栓した後、凍結乾燥機に入れた。

【0072】

具体的な凍結乾燥ステップとして、対照豚コレラ生ワクチン２を常圧、温度−５２℃の条件で４時間、真空度５.０ｍＢａｒ、温度−３℃の条件で１８時間、真空度２.５ｍＢａｒ、温度２０℃の条件で５時間保持して、対照豚コレラ生ワクチン２を得た。

【0073】

実施例９：豚コレラ生ワクチンの物理化学的特性の分析
実施例１〜８の各豚コレラ生ワクチンの物理的性状、残留水分、ガラス転移温度と真空度を測定した。乾燥ワクチンの残留水分と真空度の測定は現行の「中華人民共和国獣薬典」付録の方法と基準に基づいて行い、ガラス転移温度は示差走査熱量計を用いて測定した。結果は表１に示した通りである。表１からわかるように、すべて「中華人民共和国獣薬典」付録の規定に合致し、かつ豚コレラ生ワクチン１−６の残留水分と真空度などもすべて規定を満たしていて、残留水分は対照豚コレラ生ワクチン１と２より若干低かった。ガラス転移温度において、豚コレラ生ワクチン１−６はすべて対照豚コレラ生ワクチン１（伝統的な冷凍乾燥ワクチン）より３０℃以上高かった。ここで、豚コレラ生ワクチン５のガラス転移温度Ｔｇはもっとも高く、６９±１.６８℃であった。

【0074】

表１：豚コレラ生ワクチンの物理的性状、残留水分の測定結果

【表1】

【0075】

実施例１０：豚コレラ生ワクチン耐熱性能の測定
実施例１〜８の豚コレラ生ワクチンの乾燥前後、３７℃で１０日、３０日、６０日、９０日と１２０日間貯蔵した後のウィルス含有量、ならびに２５℃で１月、３月、６月、９月、１２月と１５月間貯蔵した後のウィルス含有量を測定した。豚コレラ生ワクチンのウィルス含有量の測定は現行の『中華人民共和国獣用生物製品規程』に基づいて行った。表２は豚コレラ生ワクチンを３７℃で長期保存した後のウィルス含有量の測定結果で、表３は豚コレラ生ワクチンを２５℃で長期保存した後のウィルス含有量の測定結果である。

【0076】

表２において、乾燥損失とは乾燥前と乾燥後０dにおけるワクチンウィルス含有量の差を指す。耐熱損失とはワクチン乾燥０日後と３７℃で保存した後のワクチンウィルス含有量の差を指す。

【0077】

表２からわかるように、豚コレラ生ワクチン１〜６の乾燥過程におけるウィルス含有量の損失は０.４〜０.５２Ｌｇ ＲＩＤ/ｍＬで、３７℃で１０日間貯蔵した後、ウィルス含有量の損失はすべて≦０.３Ｌｇ ＲＩＤ/ｍＬで、３７℃で９０日間貯蔵した後、ウィルス含有量の損失は０.８８〜１.０Ｌｇ ＲＩＤ /ｍｌであった。豚コレラ生ワクチン１〜６の耐熱過程におけるウィルス含有量の損失はいずれも対照豚コレラ生ワクチンより低かった。ここで、豚コレラ生ワクチン４と豚コレラ生ワクチン５の耐熱性は最も高く、３７℃で１２０日間貯蔵した場合、耐熱損失はすべて１.２２Ｌｇであった。

【0078】

表２

【表2】

【0079】

表３において、乾燥損失とは乾燥前と乾燥後０ｄのワクチンウィルス含有量の差を指す。耐熱損失とはワクチン乾燥０日後と２５℃で保存した後のワクチンウィルス含有量の差を指す。

【0080】

表３

【表3】

【0081】

表３からわかるように、豚コレラ生ワクチン１〜６の乾燥過程におけるウィルス含有量の損失は０.４〜０.５２Ｌｇ ＲＩＤ/ｍｌであった。２５℃で６ヶ月間貯蔵した後、ウィルス含有量の損失は平均≦０.６Ｌｇ ＲＩＤ／ｍｌで、２５℃で１２ヶ月間貯蔵した後、ウィルス含有量の損失は０.８２〜１.０Ｌｇ ＲＩＤ/ｍｌであった。対照豚コレラ生ワクチン１と２を２５℃で１ヶ月間貯蔵した場合のウィルス含有量の損失は１.０〜１.４８ＬｇＲＩＤ/ｍｌで、豚コレラ生ワクチン１〜６の耐熱過程におけるウィルス含有量の損失はいずれも対照豚コレラ生ワクチンより低かった。ここで、豚コレラ生ワクチン５の耐熱性が最も高く、２５℃で１２ヶ月貯蔵した後のウィルス含有量の損失はわずか０.８２ＬｇＲＩＤ/ｍｌであり、この結果からＴｇが最も高く、３７℃で９０−１２０日間貯蔵した後の耐熱性能が最も高かった結果との関連性が認められた。

【0082】

［付記］
［付記１］
質量パーセンテージでラフィノース１％〜５％、麦芽糖５％〜１０％、蔗糖１５％〜３０％、ラクトース１％〜５％、ブドウ糖１％〜５％、ポリソルベート８０ ０.１％〜１.５％、ポリエチレングリコール８０００ ０.１％〜０.５％、チロシン０.５％〜３％、フィブロイン３％〜６％、残りは注射用水である、
ことを特徴とする耐熱保護剤。

【0083】

［付記２］
質量パーセンテージでラフィノース１.５％〜４％、麦芽糖６％〜９％、蔗糖２０％〜２５％、ラクトース２％〜４％、ブドウ糖２％〜４％、ポリソルベート８０ ０.５％〜１％、ポリエチレングリコール８０００ ０.２％〜０.４％、チロシン１％〜２％、フィブロイン４％〜５％、残りは注射用水である、
ことを特徴とする付記１に記載の耐熱保護剤。

【0084】

［付記３］
ラフィノース、麦芽糖、蔗糖、ラクトース、ブドウ糖、ポリソルベート８０を水に溶かし、高圧蒸気滅菌法で滅菌して溶液１を得るステップ１）と、
ポリエチレングリコール８０００、チロシン、フィブロインを水に溶かし、濾過法で除菌して溶液２を得るステップ２）と、
溶液１と溶液２を混合し、水を補足し、耐熱保護剤を得るステップ３）とを含む、
ことを特徴とする付記１に記載の耐熱保護剤の製造方法。

【0085】

［付記４］
付記１に記載の耐熱保護剤のワクチン製造への使用。

【0086】

［付記５］
付記１に記載の耐熱保護剤の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチン製造への使用。

【0087】

［付記６］
豚コレラウィルスを含む溶液と付記１または２に記載の耐熱保護剤を体積比１〜３：１の割合で均一に混合して得た豚コレラ生ワクチン溶液を、真空勾配乾燥した後、豚コレラ生ワクチンを得る、
ことを特徴とする室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法。

【0088】

［付記７］
豚コレラ生ワクチン溶液を常温常圧で０.５〜２時間放置した後、真空度５００ｍＢａｒ〜８００ｍＢａｒ、温度５℃〜３０℃の条件で０.５〜１時間、真空度８０ｍＢａｒ〜５００ｍＢａｒ、温度１０℃〜３５℃の条件で０.５〜２時間、真空度３０ｍＢａｒ〜８０ｍＢａｒ、温度１０℃〜４０℃の条件で０.５〜２時間、真空度０.０１ｍＢａｒ〜０.０５ｍＢａｒ、温度２０℃〜４０℃で８〜１２時間、真空度０.００１ｍＢａｒ〜０.０１ｍＢａｒ、温度２０℃〜４０℃の条件で１２〜２４時間保持して、乾燥した豚コレラ生ワクチンを得る真空勾配乾燥方法を用いる、
ことを特徴とする付記６に記載の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法。

【0089】

［付記８］
前記乾燥した豚コレラ生ワクチンを走査電子顕微鏡で観察するとガラス様のラメラ構造を呈し、そのガラス転移温度は５０℃以上に達する、
ことを特徴とする付記６または７に記載の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法。

【0090】

［付記９］
前記ガラス転移温度は６５〜７０℃に達する、
ことを特徴とする付記６または７に記載の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法。

【0091】

［付記１０］
前記豚コレラウィルスは細胞毒性である、
ことを特徴とする付記６に記載の室温で保存可能な豚コレラ生ワクチンの製造方法。

【図1】

【図2】