特許 6722189 単量体Ｆｃドメイン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6722189

(24)【登録日】2020年6月23日

(45)【発行日】2020年7月15日

(54)【発明の名称】単量体Ｆｃドメイン

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20200706BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20200706BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200706BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00

   C07K16/00ZNA

   C12N15/13

   A61P35/00

   A61P31/00

   A61P29/00

   A61P37/06

   A61K39/395 H

【請求項の数】21

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2017-535678(P2017-535678)

(86)(22)【出願日】2016年1月4日

(65)【公表番号】特表2018-505154(P2018-505154A)

(43)【公表日】2018年2月22日

(86)【国際出願番号】EP2016050032

(87)【国際公開番号】WO2016110468

(87)【国際公開日】20160714

【審査請求日】2018年11月8日

(31)【優先権主張番号】62/099,634

(32)【優先日】2015年1月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506000184

【氏名又は名称】イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＡＴＥ ＰＨＡＲＭＡ ＰＨＡＲＭＡ Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】ローラン・ゴーティエ

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０４５２６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５４４３００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１３１２４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 BIOCHEMISTRY，米国，１９９８年 ６月３０日，VOL:37, NR:26，PAGE(S):9266 - 9273，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1021/bi980270i

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３１／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３７／０６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

可動性リンカーによって分離されている第１及び第２のＣＨ３ドメインを含む、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合能を有するポリペプチド鎖であって、前記ポリペプチドが：
（ＡＢＤ）−リンカー−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
（ＡＢＤ_１）−リンカー−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−リンカー−（ＡＢＤ_２）、および
（ＡＢＤ_１）−リンカー−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−リンカー−（ＡＢＤ_２）、
から選択されるドメイン配置、ここで、ＡＢＤは目的の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン、ＡＢＤ_１は目的の第１の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン、ＡＢＤ_２は目的の第２の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインである、
を有するものである、ポリペプチド鎖。

【請求項2】

前記第１及び第２のＣＨ３ドメインが、前記第１及び第２のＣＨ３ドメインが非共有相互作用により互いの結合することを許容するのに十分な長さのリンカーによって分離されている、請求項１に記載のポリペプチド鎖。

【請求項3】

前記第１及び第２のＣＨ３ドメインを分離するアミノ酸配列が１０〜３０残基を有するペプチドリンカーである、請求項１又は２に記載のポリペプチド鎖。

【請求項4】

前記第１及び第２のＣＨ３ドメインを分離する前記アミノ酸配列が式（Ｇ_４Ｓ）_ｘ（式中、ｘは、２、３、４、５又は６である）を有するペプチドリンカーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド鎖。

【請求項5】

前記ポリペプチドが、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ６４からなる群から選択される１つ以上のヒトＦｃγ受容体とのそのＦｃドメインを介した結合を実質的に欠いている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド鎖を含む組成物。

【請求項6】

前記ＣＨ２ドメインが、ヒトＦｃγ受容体との結合を低下させるアミノ酸置換を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

各ＡＢＤが抗体の超可変領域、任意選択により重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む、請求項５又は６に記載の組成物。

【請求項8】

ＡＢＤが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

ＡＢＤがｓｃＦｖである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記ポリペプチドが二重特異的ポリペプチドである、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記抗原結合ドメインのうちの一方が癌抗原に結合する、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記抗原結合ドメインのうちの一方がウイルス抗原又は細菌抗原に結合する、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記抗原結合ドメインのうちの一方が免疫エフェクター細胞上の細胞表面受容体に結合する、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記抗原結合ドメインのうちの一方が免疫エフェクター細胞上の細胞表面受容体に結合し、及び前記抗原結合ドメインのうちの他方が癌抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原に結合する、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

免疫エフェクター細胞上の前記細胞表面受容体が免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、請求項１３又は１４に記載の組成物。

【請求項16】

免疫エフェクター細胞上の前記細胞表面受容体が、ナチュラル細胞傷害性受容体ファミリー又はＮＫ細胞レクチン様受容体ファミリーのメンバーである、請求項１３又は１４に記載の組成物。

【請求項17】

免疫エフェクター細胞上の前記細胞表面受容体が、活性化ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ８及びＣＤ３からなる群から選択される、請求項１３又は１４に記載の組成物。

【請求項18】

前記抗原結合ドメインがヒトフレームワーク領域由来のフレームワーク残基を含む、請求項５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項５〜１８のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項20】

疾患の治療用医薬としての、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項５〜１８のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物、又は請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記疾患が癌、感染症又は炎症性若しくは自己免疫性疾患である、請求項２０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、全ての図面を含め、参照にその全内容が本明細書に組み入れられる、２０１５年１月５日出願の米国仮特許出願第６２／０９９，６３４号明細書の利益を主張するものである。

【0002】

配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と合わせて出願されている。この配列表は、２０１５年１２月３１日に作成された１００ＫＢサイズの「ＮＴＥＣＨ２ ＰＣＴ＿ＳＴ２５ ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。

【0003】

単量体Ｆｃドメイン、並びに単量体Ｆｃドメインを含む多量体及び単鎖タンパク質が提供される。これらのタンパク質は疾患の治療に有用性がある。特に、多重特異的ポリペプチドが含まれる。

【背景技術】

【0004】

縮小したサイズの、且つ組織透過性の向上をもたらし得る、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ及びＶＨＨなどの抗体断片、並びにさらに新規の抗体断片形態の開発が、例えば固形腫瘍の治療に向けて進められている。また、特異性を高め、効力の幅を広げ、且つ従来のモノクローナル抗体では実現できない新規作用機構を利用する機会を提供する、２つの異なるエピトープと結合する二重特異的抗体についても新規形態が開発されている。しかしながら、これらの形態の多くは、フルサイズのＩｇＧと比較して半減期が極めて短い。

【0005】

Ｆｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）とのそのユニークなｐＨ依存的結合を介してＩｇＧの半減期を増加させる。インターナリゼーション後、エンドソームの酸性環境内でＩｇＧのＦｃドメインはＦｃＲｎに結合することができ、それによりＩｇＧは次に細胞表面上に循環され、再び循環中に放出される。この生体システムはＩｇＧを分解から保護し、長い血清中半減期をもたらす。Ｆｃドメインと治療用分子との融合物は長い半減期を有する。加えて、ＩｇＧのＦｃ断片は密に充填されたホモ二量体からなるため、各分子に２つの治療用タンパク質が存在する。より小さい単量体Ｆｃ融合物を作製するための１つの手法は、ＣＨ３ドメインに突然変異を導入してＣＨ３−ＣＨ３ホモ二量体化を妨げることを伴うものであった（例えば、（特許文献１）及び（特許文献２）を参照されたい）。しかしながら、突然変異の導入は、ヒトへの投与時に免疫原性のリスクを伴う。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２０１３／１３８６４３号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２０１１／０６３３４８号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

従って、単量体Ｆｃドメインの使用を可能にする新規タンパク質形態を作製することが依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、Ｆｃドメインが単量体のままであり、且つ新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用する機能性タンパク質を生じる、直列に配置された２つの免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むＦｃポリペプチド構築物の発見によってもたらされる。この構築物は、限定されないが、単鎖及び多量体二重特異的結合タンパク質、例えば抗体を含めた多岐にわたる単鎖及び多重鎖（多量体）タンパク質の構築を可能にする。

【0009】

単一のポリペプチド鎖内の２つのＣＨ３ドメイン（「直列型ＣＨ３ドメイン」と称される）は、任意のＦｃドメイン含有分子、例えば、直列型ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖と多量体化する他のアミノ酸配列又はタンパク質ドメインを同じポリペプチド鎖上及び／又は追加的なポリペプチド鎖上に含む分子に組み込むことができる。Ｆｃドメインは単量体のままであるが（例えば、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を起こす２つのＦｃドメインで形成されるＦｃ二量体ではない）、直列型ＣＨ３ドメインを含有するタンパク質は単量体又は多量体（２つ以上のポリペプチド鎖を含有するもの、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体）であってもよい。

【0010】

直列型ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖は、典型的には、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方に連結したＣＨ２ドメイン、及び任意選択によりさらに、目的のタンパク質ドメイン、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）などの免疫グロブリン可変領域、及び／又は概して任意の抗原結合ドメインを含み得る。このドメインは、例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインに直接融合してもよく、又はペプチドリンカー、ヒンジ、ＣＨ１ドメイン又はＣＫドメインなどのアミノ酸残基の介在配列を介して融合してもよい。直列型ＣＨ３ドメイン内の２つのＣＨ３ドメイン間に好適なリンカー（例えば任意のアミノ酸配列又は他の可動性分子）を提供すると、それらのＣＨ３ドメインが非共有相互作用によって互いに結合することが可能になる。従って、２つのＣＨ３ドメインは他のポリペプチド鎖とのＣＨ３−ＣＨ３二量体化には利用できず、そのため、ＣＨ３ドメイン含有分子間でのホモ二量体化が回避される。一例において、直列型ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインをさらに含むポリペプチドに組み込まれ、単量体のままであるＦｃドメインをもたらす。単量体Ｆｃドメインを有する単一のポリペプチド鎖は、それ自体使用することもでき、又はさらなるポリペプチド鎖と組み合わせて、単量体Ｆｃドメインを有する多量体ポリペプチドを生じさせることもできる。

【0011】

本明細書に開示されるこれらのＦｃドメイン含有分子には、天然ＣＨ３ドメインを受け入れることができるという利点がある。本分子はまた、容易に作製することができる。本分子は、さらには、２つ以上の機能性タンパク質ドメイン、例えば抗原結合ドメインを有することができ、幅広いＦｃドメイン含有分子の作製を可能にする。詳細には、新生児Ｆｃ（ＦｃＲｎ）受容体に結合する単量体Ｆｃドメインを有する二重特異性抗体を作製することができる。

【0012】

一態様において、直列型ＣＨ３ドメインが提供される。一態様において、ＣＨ２ドメインと直列型ＣＨ３ドメインとを含むＦｃドメインが提供される。一態様において、直列型ＣＨ３ドメイン又はＦｃドメインを含むポリペプチド鎖が提供される。一態様において、かかる直列型ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む多量体ポリペプチドが提供される。一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメインの２つのＣＨ３ドメインは可動性ペプチドリンカーによって分離されている。一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメインの２つのＣＨ３ドメインは非共有相互作用によって互いに結合している。一実施形態において、２つのＣＨ３ドメインは、各ＣＨ３ドメインのＣＨ３二量体化界面を介して互いに結合している。一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメインは、（例えば別のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインとの）さらなるＣＨ３−ＣＨ３二量体化能を有しない。

【0013】

一実施形態において、第１及び第２のＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が提供され、ここで、これらの２つのＣＨ３ドメインは非共有相互作用によって互いに結合している。一実施形態において、２つのＣＨ３ドメインは各ＣＨ３ドメインのＣＨ３二量体化界面を介して互いに結合している。一実施形態において、ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインを含む別のポリペプチド鎖と二量体化しない。

【0014】

一実施形態において、単量体Ｆｃドメインを有する多量体（例えば二量体、三量体、四量体、五量体）タンパク質が提供され、このタンパク質は、ＣＨ２ドメインと直列型ＣＨ３ドメインとを含むＦｃドメインを含むポリペプチド鎖を含む。一実施形態において、Ｆｃドメインの２つのＣＨ３ドメインは非共有相互作用によって互いに結合している。

【0015】

本明細書における任意の態様の一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインはリンカーによって第２のＣＨ３ドメインに接続されている。従って、直列型ＣＨ３ドメインは、以下のとおりのドメイン配置を有するように同じポリペプチド鎖上に配置することができる。
−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−

【0016】

リンカーは可動性リンカー（例えばペプチドリンカー）であり得る。一実施形態において、リンカーは、ＣＨ３ドメインが非共有相互作用によって互いに結合することを可能にする。一実施形態において、リンカーは、１０〜５０アミノ酸残基を有するペプチドリンカーである。一実施形態において、リンカーは式（Ｇ_４Ｓ）_ｘを有する。任意選択により、ｘは、２、３、４、５又は６である。

【0017】

任意の実施形態において、各ＣＨ３ドメインは、独立に、ヒト完全長及び／又は天然ＣＨ３ドメイン、若しくは機能性ＣＨ３二量体化界面を維持する（例えば、別のＣＨ３ドメインとのＣＨ３−ＣＨ３二量体化を起こす能力を維持するその）断片若しくは改変ＣＨ３ドメインである。

【0018】

本明細書における任意の実施形態において、直列型ＣＨ３ドメイン又はＦｃドメインに使用される例示的ＣＨ３ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％同一の配列を含む。

【0019】

本明細書における任意の実施形態において、例示的直列型ＣＨ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％同一の配列を含む。

【0020】

一態様において、天然ＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃドメイン（即ち、機能性ＣＨ３二量体化界面を維持しているもの）を含むポリペプチドが提供される。一態様において、このポリペプチドは単量体ポリペプチドである。一態様において、このポリペプチドは、単量体Ｆｃドメインを含む多量体ポリペプチドである。一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメインは、さらなるＣＨ３−ＣＨ３二量体化能（即ちポリペプチドの別のＣＨ３ドメインとの二量体化能）を有しない。

【0021】

任意の実施形態の一態様において、直列型ＣＨ３ドメインを含む単離単鎖ポリペプチドが提供される。また、単量体Ｆｃドメイン分子又は直列型ＣＨ３ドメインを含む融合タンパク質など、直列型ＣＨ３ドメインを含む単鎖Ｆｃドメイン分子も提供される。一実施形態において、Ｆｃドメイン分子は、Ｆｃドメインに融合した可溶性ポリペプチドを含む。一実施形態において、Ｆｃドメイン分子は、任意選択によりアミノ酸残基の介在配列（例えばリンカー、タンパク質ドメイン等）を介してＦｃドメインに融合した細胞表面受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。Ｆｃ融合ポリペプチドの一例は、Ｎ末端（左）からＣ末端（右）に、ドメイン配置：
（ＥＣＤ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３
を含むポリペプチドである。

【0022】

一実施形態において、融合タンパク質は単量体又は多量体抗体由来ポリペプチドである。これらの分子は、Ｆｃドメイン又はＣＨ３ドメインのＮ末端又はＣ末端に融合したさらなるポリペプチドを含む。一部の非限定的な例では、異種タンパク質は、目的のタンパク質（以下のドメイン配置において（Ｐ）として示される）、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、免疫グロブリン可変ドメイン、サイトカイン、又は受容体ポリペプチドである。タンパク質（Ｐ）は、アミノ酸残基、例えば１〜２０、２０〜５０、１０〜１００、１〜２００、１〜５００、又は２０〜５００アミノ酸残基の任意の所望の配列であってよい。直列型ＣＨ３ドメインは、以下のドメイン配置の１つを有するポリペプチド鎖に含まれることができ、このポリペプチド鎖は単量体のままであってもよく、又はさらなるポリペプチド鎖と結合して、単量体Ｆｃドメインを含む多量体ポリペプチドを形成してもよい：
（Ｐ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
（ＡＢＤ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
又は
（ｓｃＦｖ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３。

【0023】

必要に応じて、Ｆｃドメイン又はＣＨ３ドメインのＮ末端及びＣ末端の両方に異種ポリペプチドを融合させることができ、例えば直列型ＣＨ３ドメインは、第１及び第２の目的のタンパク質（以下のドメイン配置において（Ｐ_１及びＰ_２）として示される）と共に、例示的ドメイン配置：
（Ｐ_１）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（Ｐ_２）
に従いポリペプチド鎖に含まれることができる。

【0024】

単量体Ｆｃドメインを含む多量体抗体由来ポリペプチドの例には、以下のドメイン配置を含むポリペプチドが含まれ、ここで、ポリペプチド鎖は、ＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化（ＣＨ１とＣＫとの間に示される連結）により、それぞれの相補的なＣＨ１及びＣＫドメイン間に鎖間非共有結合、及び任意選択によりさらなるジスルフィド結合）を形成して互いに結合し得る。

【0025】

一例は以下のとおり示される：

【化1】

ここで、一方の鎖の可変領域がＶＨであり、且つ他方の鎖の可変領域がＶＬであり、ＶＨとＶＬとが、目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを形成し、及び一方の鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域がＣＨ１であり、且つ他方の鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域がＣＫであり、それぞれの鎖のＣＨ１及びＣＫが非共有結合（及び任意選択によりさらなるジスルフィド結合）によって結合している。各ポリペプチド鎖は、任意選択により、そのＮ末端及び／又はＣ末端に１つ以上のドメインを含み得る。一実施形態において、ＣＨ１又はＣＫドメインとＣＨ２ドメインとの間にヒンジドメインが置かれる。

【0026】

タンパク質ドメイン配置の例としては、以下が挙げられる。

【化2】

【0027】

各ポリペプチド鎖は、任意選択により、そのＮ末端及び／又はＣ末端に１つ以上のドメインを含み得る。一実施形態において、ＣＨ１又はＣＫドメインとＣＨ２ドメインとの間にヒンジドメインが置かれる。本明細書における任意のポリペプチドの一実施形態において、ＶＨ若しくはＶＫドメイン、又はＣＨ１若しくはＣＫ（若しくはＣλ）ドメインは、ヒンジ領域を介してＦｃドメイン（例えば又はそのＣＨ２ドメイン）に融合されることになる。

【0028】

抗体はまた、特に、多重特異的（例えば二重特異的）結合タンパク質としての使用にも良く適している。例えば、二重特異的タンパク質は、除去しようとする標的細胞上の第１の抗原と、免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）上の第２の抗原とに結合することができ、ここで、エフェクター細胞は標的細胞、例えば癌細胞に仕向けられる。多重特異的抗体はＦｃＲｎ結合を維持しているが、ＦｃγＲ結合は欠いており、そのため、この多重特異的抗体は魅力的なインビボ薬力学を有するが、目的とする特定のエフェクター細胞（即ち第２の抗原を発現する細胞）に対して選択的であり、従って抗体が結合する特定のエフェクター細胞表面抗原を発現するもの以外の免疫細胞によって媒介される毒性が低下する。多重特異的ポリペプチドは、例えば、目的の抗原を発現するエフェクター細胞が、標的抗原、例えば癌抗原、ウイルス抗原等を発現する標的細胞を溶解するように仕向ける能力を有する。多重特異的抗体は、エフェクター細胞表面タンパク質と第２の抗原（標的細胞が発現する抗原）との両方に一価の様式で結合するときに特に有効である。

【0029】

一実施形態において、目的の第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_１）と、目的の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_２）と、可動性リンカーによって分離されている第１及び第２のヒトＣＨ３ドメインとを含む、第１及び第２の抗原にそれぞれ一価の様式で結合する多重特異的（例えば二重特異的）ポリペプチドが提供される。一実施形態において、可動性リンカーによって分離されている第１及び第２のヒトＣＨ３ドメインは、第１及び第２の抗原結合ドメイン間に配置されている。一実施形態において、ヒトＣＨ２ドメインはＡＢＤとＣＨ３ドメインとの間に置かれる。一実施形態において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれ免疫グロブリン可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを含む。一実施形態において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖである。

【0030】

例としては、以下のドメイン配置を含むポリペプチドが挙げられ、ここで、ポリペプチド鎖は、ＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化（ＣＨ１とＣＫとの間に示される連結）により、それぞれの相補的なＣＨ１及びＣＫドメイン間に鎖間非共有結合、及び任意選択によりさらなるジスルフィド結合）を形成して互いに結合し得る。

【0031】

一例は以下のとおり示される：

【化3】

ここで、２つのｓｃＦｖの各々は、目的の抗原（例えば２つの異なる抗原）と結合する抗原結合ドメインを形成し、及び一方の鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域がＣＨ１であり、且つ他方の鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域がＣＫであって、それぞれの鎖のＣＨ１及びＣＫが非共有結合（及び任意選択によりさらなるジスルフィド結合）によって結合している。各ポリペプチド鎖は、任意選択により、そのＮ末端及び／又はＣ末端に１つ以上のドメインを含み得る。一実施形態において、ＣＨ１又はＣＫドメインとＣＨ２ドメインとの間にヒンジドメインが置かれる。

【0032】

任意の多重特異的ポリペプチドの一実施形態において、各ＣＨ３ドメイン（又はその断片）は天然ヒトＣＨ３ドメイン（又はその断片）のアミノ酸を有する。任意選択により、多重特異的ポリペプチド（及び／又はそのＦｃドメイン）は、例えば完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体との結合が低下している。一実施形態において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に、ヒトＣＨ２ドメイン、第１のヒトＣＨ３ドメイン、可動性アミノ酸リンカー、及び第２のヒトＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインによって分離されている。

【0033】

任意の多重特異的ポリペプチドの一実施形態において、２つのＣＨ３ドメインは非共有相互作用によって互いに結合している。一実施形態において、２つのＣＨ３ドメインは各ＣＨ３ドメインのＣＨ３二量体化界面を介して互いに結合している。一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメインは、さらなるＣＨ３−ＣＨ３二量体化能（即ち別のＣＨ３ドメイン又はそれを含むポリペプチドとの二量体化能）を有しない。

【0034】

一実施形態において、多重特異的ポリペプチド（及び／又はそのＦｃドメイン）は、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合能を有する。

【0035】

一実施形態において、多重特異的ポリペプチドは別のＦｃ由来ポリペプチドと二量体を形成しない（例えば別の同一のポリペプチドとホモ二量体を形成しない）。

【0036】

二重特異的ポリペプチドの一例において、直列型ＣＨ３ドメインは、以下のドメイン配置を有するポリペプチド鎖に含まれることができ、このポリペプチド鎖は単量体のままであってもよく、又はさらなるポリペプチド鎖と結合して、単量体Ｆｃドメインを含む多量体ポリペプチドを形成してもよい。
（ＡＢＤ_１）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＡＢＤ_２）

【0037】

任意選択により、ポリペプチドは、前述のドメイン間に連結アミノ酸をさらに含む。一実施形態では、ＡＢＤ_１とＣＨ２との間にＣＨ１又はＣＫドメイン又はその断片、ヒンジ領域又はその断片、及び／又はリンカーペプチドを置くことができる。一実施形態では、ＣＨ３とＡＢＤ_２との間にＣＨ１又はＣＫドメイン又はその断片、ヒンジ領域又はその断片、及び／又はリンカーペプチドを置くことができる。

【0038】

単量体Ｆｃドメインを含む多量体抗体由来二重特異的ポリペプチドの例としては、以下のドメイン配置を含むポリペプチドが挙げられ、ここで、ポリペプチド鎖は、ＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化（ＣＨ１とＣＫとの間に示される連結）により、それぞれのヒンジドメイン間及び／又は相補的なＣＨ１及びＣＫドメイン間に鎖間ジスルフィド結合を形成して互いに結合し得る。

【化4】

【0039】

本明細書における任意の実施形態の一態様において、ＡＢＤ_１及び／又はＡＢＤ_２は、それぞれ独立に、ｓｃＦｖ、アフィボディ、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、Ｖ−ＮＡＲドメイン又はＶ_ＨＨドメインなどのシングルドメイン抗体（ナノボディ）を含む。任意選択により、ＡＢＤ_１及びＡＢＤ_２は、それぞれｓｃＦｖ、アフィボディ、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、又はＶ−ＮＡＲドメイン若しくはＶ_ＨＨドメインなどのシングルドメイン抗体（ナノボディ）を含む。任意選択により、各ＡＢＤ_１及びＡＢＤ_２は、それぞれヒト又はヒト化ｓｃＦｖ、アフィボディ、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、Ｖ−ＮＡＲドメイン又はＶ_ＨＨドメインなどのシングルドメイン抗体（ナノボディ）である。

【0040】

本明細書における任意の実施形態の一態様において、ポリペプチドは、Ｃ末端及び／又はＮ末端に追加のタンパク質ドメイン、例えばさらなるＡＢＤ、可変ドメイン、ｓｃＦｖ等をさらに含んでもよい（又は含まなくてもよい）。

【0041】

一実施形態において、ポリペプチド（及び／又はそのＦｃドメイン）は、例えば完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体（例えばＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４）との（即ちそのＦｃドメインを介した）結合が低下している。一実施形態において、ポリペプチドは、例えばヒトＩｇＧ１アイソタイプの野生型Ｆｃドメインを有する同じポリペプチドと比較して、ポリペプチドの抗原結合ドメインが結合する目的の抗原を発現しない免疫エフェクター細胞によって媒介されるとき（即ち抗原結合ドメインが結合する目的の抗原を発現する細胞の非存在下で）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えばＦｃＲ架橋結合によるサイトカイン放出）、及び／又はＦｃＲ媒介血小板活性化／枯渇が低下している（例えばそれが部分的又は完全に欠損している）。

【0042】

抗原結合ドメインは、存在する場合、抗体重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含んでもよく、任意選択により第１の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含む。

【0043】

一実施形態において、第１又は第２の抗原結合ドメインは、存在する場合、それぞれ独立に抗体重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、任意選択により第１の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含む。

【0044】

一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメインは、溶液中における別のＦｃ由来ポリペプチドとのＣＨ３−ＣＨ３二量体の形成能を実質的に有しない。例えば、直列型ＣＨ３ドメインは別の同一のポリペプチドと二量体を形成せず、又は野生型ヒトＩｇＧ重鎖と二量体を形成しない。

【0045】

一実施形態において、ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２ドメインと比較してヒトＦｃγ受容体との結合を低下させるアミノ酸改変を含む。一実施形態において、Ｆｃポリペプチドは残基Ｎ２９７にＮ結合型グリコシル化を含む。一実施形態において、Ｆｃポリペプチドは残基Ｎ２９７にＮ結合型グリコシル化を欠いているか、又は改変されたＮ結合型グリコシル化を有する。一実施形態において、ＦｃポリペプチドはＮ２９７Ｘ突然変異（ＥＵ付番）を含み、ここで、Ｘはアスパラギン以外の任意のアミノ酸である。

【0046】

本明細書における実施形態のいずれかの一態様において、ポリペプチドは、癌抗原に結合する第１の抗原結合ドメインと、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異的ポリペプチドであり、ここで、このタンパク質は癌抗原（又はウイルス抗原又は細菌抗原）に対し、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に対するよりも高い結合親和性（一価）を有する。かかるポリペプチドは有利な薬理学的特性をもたらし得る。このポリペプチドは、標的抗原に対するアビディティが高く且つＦｃ受容体に対する親和性が低い天然抗体を（より良好な特異性を有するにも関わらず）より綿密に模倣し得る。本発明の実施形態のいずれかの一態様において、ポリペプチドは、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に対する結合（一価）について、１０^−６Ｍ未満、任意選択により１０^−７Ｍ未満、任意選択により１０^−８Ｍ未満、又は任意選択により１０^−９Ｍ未満のＫｄを有する。本発明の実施形態のいずれかの一態様において、ポリペプチドは、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に対する結合（一価）について、１０^−７Ｍ未満、任意選択により１０^−８Ｍ未満、任意選択により１０^−９Ｍ未満、又は任意選択により１０^−１０Ｍ未満のＫｄを有する。一実施形態において、ポリペプチドは、癌抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原に対する結合（一価）について、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に対する結合（一価）のＫｄ未満のＫｄを有する（即ちそれより良好な結合親和性を有する）。例えば、ポリペプチドは、癌抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原に対する結合（一価）について、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に対する結合（一価）のＫｄよりも少なくとも５倍低い、任意選択により少なくとも１０倍低いＫｄを有する。

【0047】

本明細書におけるポリペプチドのいずれかの一実施形態において、多重特異的ポリペプチドは、第１又は第２の目的の抗原の一方を発現するエフェクター細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞）が前記第１又は第２の目的の抗原の他方を発現する標的細胞（例えば癌細胞）を溶解するように仕向ける能力を有する。

【0048】

本明細書における実施形態のいずれかの一態様において、本開示のタンパク質のいずれかのポリペプチド鎖をコードする組換え核酸が提供される。本明細書における実施形態のいずれかの一態様において、本開示のタンパク質のいずれかのポリペプチド鎖をコードする核酸を含む組換え宿主細胞が提供され、任意選択により、この宿主細胞は本開示のタンパク質を少なくとも１、２、３又は４ｍｇ／Ｌの収率（精製後の最終産生率）で産生する。また、本開示の第１のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、本開示の第２のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、及び任意選択により、本開示の第３、第４及び／又は第５のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸を含む核酸のキット又はセットも提供される。また、本開示の単量体又は多量体タンパク質の作製方法も提供される。

【0049】

一実施形態において、本発明は、タンパク質（例えば任意のヘテロ二量体、三量体、四量体又は五量体タンパク質）の作製方法を提供し、この方法は、
ａ）本明細書に記載されるとおりの直列型ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を用意するステップ、
ｂ）任意選択により、本明細書に記載されるさらなるポリペプチド鎖（例えば非共有結合性及び／又は共有結合性の相互作用によって（ａ）の鎖と結合する鎖）をコードするさらなる核酸を用意するステップ、及び
ｃ）前記第１の（及び任意選択によりさらなる）核酸を宿主細胞で発現させて、それぞれ前記第１の（及び任意選択によりさらなる）ポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つ単量体（又は任意選択によりヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体又は五量体）タンパク質を回収するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｃ）は、産生されたタンパク質を、アフィニティー精製支持体、任意選択によりアフィニティー交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を収集するステップ；及び／又は産生されたタンパク質（例えば、アフィニティー交換又はプロテインＡカラムにローディングした後に収集されたタンパク質）をイオン交換カラムにローディングし、且つ単量体（又は任意選択によりヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体又は五量体）画分を収集するステップを含む。

【0050】

本明細書におけるタンパク質のいずれかの一実施形態において、本明細書に記載される直列型ＣＨ３ドメイン含有タンパク質を複数含む組成物が提供され、ここで、直列型ＣＨ３ドメイン含有タンパク質の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％は単量体Ｆｃドメインを有する（第２のポリペプチドとの二量体化時に二量体Ｆｃドメインを有しない）。一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメイン含有タンパク質の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％は単量体（即ち単鎖ポリペプチド）である。一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメイン含有タンパク質の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％は二量体である。一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメイン含有タンパク質の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％は三量体である。一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメイン含有タンパク質の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％は四量体である。

【0051】

これらの方法のいずれも、特に「発明の詳細な説明」にあるものを含めて本出願に記載される任意のステップを含むものとしてさらに特徴付けることができる。本発明はさらに、本方法のいずれかによって得ることのできる抗体に関する。本開示はさらに、本発明の抗体の医薬製剤又は診断用製剤に関する。本開示はさらに、治療又は診断方法における抗体の使用方法に関する。

【0052】

本発明の以上の及びさらなる有利な態様及び特徴が本明細書の他の部分にさらに記載され得る。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1A-1C】直列型ＣＨ３ドメインを含む単量体Ｆｃドメインを含む単量体多重特異的ポリペプチドの例を示す。

【発明を実施するための形態】

【0054】

定義
本明細書で使用される「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は１つ以上を意味し得る。請求項において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は１つ又は２つ以上を意味し得る。

【0055】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、任意選択により「本質的に〜からなる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」で置き換えることができ、さらに任意選択により「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に置き換えることができる。

【0056】

本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という語は、エピトープに免疫特異的に結合することができる３次元構造を含むドメインを指す。従って、一実施形態では、前記ドメインは、超可変領域、任意選択により抗体鎖のＶＨ及び／又はＶＬドメイン、任意選択により少なくとも１つのＶＨドメインを含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、非免疫グロブリン足場からのポリペプチドドメインを含み得る。

【0057】

本明細書の「抗体」という語は、広い意味で使用され、特に、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、並びに抗体断片及び誘導体（但し、所望の生物学的活性を示すものに限られる）を含む。抗体の作製に適切な様々な技術が、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）に示されている。「抗体断片」は、完全長抗体、例えば、その抗原結合領域又は可変領域の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的には、ＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、及びＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７；１０：９４９−５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに抗体断片から形成された多重特異的抗体断片、及び１つ以上の単離されたＣＤＲ又は機能的パラトープが挙げられ、単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基若しくはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するように１つに結合又は連結され得る。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３，１１２６−１１３６；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書及び同第２００２０１６１２０１号明細書に記載され、再考察されている。

【0058】

本明細書で使用される「抗体誘導体」という語は、完全長抗体、又は例えばその少なくとも抗原結合領域又は可変領域を含む抗体の断片を含み、１つ以上のアミノ酸が、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成などによって化学修飾されている。これは、限定されるものではないが、ＰＥＧ化抗体、システイン−ＰＥＧ化抗体、及びこれらの変異体を含む。

【0059】

「超可変領域」という語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）、及び／又は「超可変ループ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１−９１７）を含む。典型的には、この領域のアミノ酸残基の付番は、前出のＫａｂａｔらに記載の方法によって行われる。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基の付番」、及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについてのこの付番方式を指す。Ｋａｂａｔ付番方式を用いると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又はＦＲ又はＣＤＲへの挿入に一致するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、抗体の配列の相同領域と「基準」Ｋａｂａｔ付番配列とのアラインメントによって所与の抗体について決定することができる。

【0060】

本明細書で使用される「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、ＣＤＲとして定義される部分を除く抗体可変ドメインの領域のことである。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離された連続した領域にさらに細分することができる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）。

【0061】

本明細書で定義される「定常領域」とは、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによってコードされる抗体由来定常領域のことである。本明細書で使用される「定常軽鎖」又は「軽鎖定常領域」とは、κ（Ｃκ）又はλ（Ｃλ）軽鎖によってコードされる抗体の領域のことである。定常軽鎖は、典型的には、単一ドメインを含み、且つ本明細書で定義されるように、Ｃκの１０８〜２１４位、又はＣλを指し、付番は、ＥＵインデックスによる（（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。本明細書で使用される「定常重鎖」又は「重鎖定常領域」とは、μ、δ、γ、α、又はε遺伝子によってそれぞれコードされてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥとして抗体のアイソタイプを確定する抗体の領域のことである。完全長ＩｇＧ抗体では、本明細書で定義される定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端までを指し、従って１１８〜４４７位を含み、付番は、ＥＵインデックスによる。

【0062】

本明細書で使用される「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドのことである。Ｆａｂは、分離されたこの領域、又はポリペプチド、多重特異的ポリペプチド、若しくはＡＢＤ、又は本明細書で概説されたその他の実施形態との関連でのこの領域を指し得る。

【0063】

本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片のことであり、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖを作製する方法は当技術分野で周知である。ｓｃＦｖを作製する方法の再考察については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。

【0064】

本明細書で使用される「Ｆｖ」、又は「Ｆｖ断片」、又は「Ｆｖ領域」とは、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドのことである。

【0065】

本明細書で使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドのことである。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びに可撓性ヒンジＮ末端からこれらのドメインまでを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２（ＣＨ２）及びＣγ３（ＣＨ３）、並びにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６、Ｐ２３０、又はＡ２３１からそのカルボキシ末端までを含むように定義され、この付番はＥＵインデックスによる。Ｆｃは、以下に記載される、分離されたこの領域、又はＦｃポリペプチドとの関連でのこの領域を指し得る。本明細書で使用される「Ｆｃポリペプチド」又は「Ｆｃ由来ポリペプチド」とは、Ｆｃ領域の全て又は一部を含むポリペプチドのことである。Ｆｃポリペプチドは、限定されるものではないが、抗体、Ｆｃ融合体、及びＦｃ断片を含む。

【0066】

ＩｇＧの「ヒンジ」、「ヒンジ領域」又は「ヒンジドメイン」は、概して、Ｋａｂａｔ方式によるヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６を含み、且つＰｒｏ２３０で終わるものとして定義されるが、機能的には、鎖の可動性部分は、Ｇｌｕ２１６〜Ｇｌｙ２３７など、上部及び下部ヒンジ領域と呼ばれる追加の残基を含むものと見なすことができ（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：４０８３）、下部ヒンジはＦｃ領域の残基２３３〜２３９と称されている。本明細書で使用されるとき、「ヒンジ」は上部及び下部ヒンジ領域を包含する。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を置くことにより、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。Ｋａｂａｔ方式により付番したとき境界は少し変わり得るが、ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接して、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域よりアミノ末端側にあり、且つ例えばおよそＥＵ位置１１８〜２１５からの、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインを含む。Ｆｃドメインはアミノ酸２３１〜アミノ酸４４７に延在し；ＣＨ２ドメインはおよそＡｌａ２３１〜Ｌｙｓ３４０又はＧｌｙ３４１にあり、及びＣＨ３はおよそＧｌｙ３４１又はＧｌｎ３４２〜Ｌｙｓ４４７にある。ＣＨ１領域のＩｇＧ重鎖定常領域の残基はＬｙｓで終わる。当該技術分野では従来ＥＵ付番方式が用いられる（概して、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，米国保健社会福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）（１９９１）を参照されたい）。

【0067】

本明細書で使用される「可変領域」とは、それぞれ軽鎖（κ及びλを含む）免疫グロブリン遺伝子座及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＬ（Ｖκ及びＶλを含む）遺伝子及び／又はＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む抗体の領域のことである。軽鎖可変領域又は重鎖可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲとの関連では、例えば、Ｋａｂａｔと同様に（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）を参照されたい）、及びＣｈｏｔｈｉａと同様に正確に定義されている。抗体のフレームワーク領域、即ち、構成軽鎖及び構成重鎖の組み合わせフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置して整列させる役割を果たし、ＣＤＲは抗原への結合に主に関与する。

【0068】

「特異的に結合する」という語は、抗体又はポリペプチドを、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、又は単離された標的細胞の表面に存在するナイーブタンパク質のいずれかを用いて評価される、好ましくは競合的結合アッセイでの結合パートナー、例えば、ＮＫｐ４６に結合できることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的結合を決定する他の方法は、以下にさらに記載され、当技術分野で周知である。

【0069】

本明細書で使用される「親和性」という語は、抗体又はポリペプチドのエピトープへの結合の強さを指す。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数Ｋ_Ｄによって示され、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、及び［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和定数Ｋ_Ａは１／Ｋ_Ｄによって定義される。ｍＡｂの親和性の決定に好ましい方法は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＨａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に記載されている。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の１つの好ましい標準的な方法では、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析によって）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングを使用する。

【0070】

本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書のアミノ酸改変の一例は置換である。本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」とは、タンパク質配列の所与の位置のアミノ酸の別のアミノ酸での置換のことである。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、親ペプチドの変異体を指し、５０位のチロシンがトリプトファンで置換されている。ポリペプチドの「変異体」は、基準ポリペプチド、典型的にはナイーブ又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、ナイーブアミノ酸配列内の特定の位置に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る。

【0071】

「保存的な」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で公知であり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。

【0072】

２つ以上のポリペプチドの配列間の関係で使用される「同一性」又は「同一の」という語は、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の計算モデル又はコンピュータープログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって行われる、（存在する場合）ギャップアライメントを用いた同様の２つ以上の配列間の完全な一致のパーセントを示す。関連ポリペプチド間の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が挙げられる。

【0073】

同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を得るように設計されている。同一性を決定する方法は、公表されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含め、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，前出）から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。

【0074】

「単離された」分子は、組成物中の主な種である分子であり、この組成物中では、この分子は、この分子が属する分子のクラスに対して見出される（即ち、単離された分子は、組成物中の分子のタイプの少なくとも約５０％を構成し、典型的には、組成物中の分子、例えば、ペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％以上を構成する）。通常、ポリペプチドの組成は、組成物中に存在する全てのペプチド種との関連でのポリペプチドに対して、又は少なくとも提案される使用との関連での実質的に活性なペプチド種に対して９８％、９８％、又は９９％の均一性を示す。

【0075】

本明細書に関連して、「処置」又は「処置する」は、反対の旨の記載がない限り、疾患又は障害の１つ以上の症状又は臨床的に関連する兆候を予防すること、緩和すること、管理すること、治癒すること、又は軽減することを指す。例えば、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認されていない患者の「処置」は、防止又は予防療法であり、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認された患者の「処置」は、一般に、防止又は予防療法とはならない。

【0076】

本明細書で使用される「ＮＫ細胞」は、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、特定の特徴及び生物学的特性、例えば、ヒトＮＫ細胞のＣＤ５６及び／又はＮＫｐ４６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解装置の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の異常細胞を殺す能力、及び免疫応答を刺激又は抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力によって特定することができる。これらの特徴及び活性のいずれかを用いて、当技術分野で周知の方法でＮＫ細胞を特定することができる。ＮＫ細胞のいかなる亜集団もＮＫ細胞という語に包含される。本明細書に関連して、「活性な」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解する又は他の細胞の免疫機能を促進する能力を有するＮＫ細胞を含む生物学的に活性なＮＫ細胞を指す。例えば、「活性」ＮＫ細胞は、活性化ＮＫ受容体に対するリガンドを発現する細胞及び／又はＮＫ細胞上のＫＩＲによって認識されるＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞を死滅させることが可能であり得る。ＮＫ細胞は、当技術分野で公知の様々な技術、例えば、血液サンプルからの単離、細胞吸着除去療法、組織又は細胞の収集などによって得ることができる。ＮＫ細胞を伴うアッセイの有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＳ ａｎｄ Ｃｏｌｏｎｎａ Ｍ）．Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２１９−２３８（２０００）に記載されている。

【0077】

本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞」は、胸腺で成熟する、且つ数ある分子の中でも特にＴ細胞受容体をその表面上に提示する一部のリンパ球集団を指す。Ｔ細胞は、ＴＣＲ、ＣＤ４又はＣＤ８を含めた特定の表面抗原の発現、ある種のＴ細胞が腫瘍又は感染細胞を死滅させる能力、ある種のＴ細胞が免疫系の他の細胞を活性化させる能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力など、ある種の特徴及び生物学的特性のために同定することができる。当該技術分野において周知の方法を用いたＴ細胞の同定に、これらの特徴及び活性のいずれを用いることもできる。本明細書に関連して、「活性な」又は「活性化した」Ｔ細胞は、生物学的に活性なＴ細胞、より詳細には細胞溶解能又は例えばサイトカインの分泌による免疫応答の刺激能を有するＴ細胞を指す。活性細胞は、機能アッセイ及びＴＮＦ−αなどのサイトカインの発現など、発現ベースのアッセイを含めた幾つもの周知の方法の任意のもので検出することができる。

【0078】

ポリペプチド産生
本明細書の発明は、直列型ＣＨ３ドメイン及び直列型ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドに関する。直列型ＣＨ３ドメインは単一のポリペプチド鎖内に構成することができ、従って２つのＣＨ３ドメインはＣＨ３−ＣＨ３二量体を形成することによって相互作用する。かかるＣＨ３ドメインは、従って、他のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド、特にＦｃドメイン含有ポリペプチドとのさらなる二量体化には利用できない。目的とする任意のアミノ酸配列、ポリペプチドドメイン又はポリペプチド、例えば「親」、「出発」又は「非変異」ポリペプチドを出発点として、又は当該技術分野でポリペプチドの作成に利用可能な技術を用いて直列型ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドに組み込むアミノ酸配列の供給源として使用することができる。直列型ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドは、例えば、ＣＨ３ドメインに連結したＣＨ２ドメインを含むヒトＦｃ領域を含むことができ、ここで、このＣＨ３ドメインは直列型ＣＨ３ドメインのうちの一方である。

【0079】

親ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む任意のポリペプチド、例えばＦｃドメイン（例えば二量体Ｆｃドメイン）を含むＦｃ融合タンパク質であってもよい。本明細書の例は、Ｆｃドメイン及び抗体由来の抗原結合ドメイン（例えば可変ドメイン）を含む。

【0080】

Ｆｃドメインは、目的とする任意のタンパク質の半減期を延長させ、又はその他、Ｆｃドメインによって付与される所望の機能性、例えば二次試薬による認識、精製用の固体支持体に対する結合等をもたらすのに有用であり得る。従って、Ｆｃドメイン分子は任意の異種ポリペプチドを含み得る。融合パートナーは、酵素、検出可能分子、細胞表面受容体との相互作用時に活性化するリガンド、攻撃病原体に対するペプチド抗原（Ａｇ）又はタンパク質マイクロアレイにおいてアセンブルされた結合パートナーを同定するための「ベイト」タンパク質など、目的とする任意の他のタンパク質性分子であり得る。

【0081】

タンパク質の例としては、標識、受容体、成長因子、リガンド、酵素、エリスロポエチン、ケモカイン、非免疫グロブリン足場由来の抗原結合ドメイン、治療用タンパク質及びホルモンが挙げられる。一部の非限定的な例では、異種タンパク質は、ヒトインターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、可溶性腫瘍壊死因子受容体、ＣＴＬＡ−４、可溶性インターロイキン（ＩＬ）−４受容体、又は第ＩＸ因子である。単量体Ｆｃドメインを含む単量体又は多量体タンパク質として使用し、且つ直列型ＣＨ３ドメインの組み込みによって改変することのできるＦｃドメイン含有分子の例としては、ヒトＩｇＧ１のＦｃに融合したＣＴＬＡ−４（Ｎｕｌｏｊｉｘ（ベラタセプト）、臓器拒絶反応の治療用）；ヒトＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２（Ｅｙｌｅａ（アフリベルセプト）、加齢黄斑変性症の治療用）；ヒトＩｇＧ１のＦｃに融合したＩＬ−１Ｒ（Ａｒｃａｌｙｓｔ（リロナセプト）、クリオピリン関連周期性症候群の治療用）；ヒトＩｇＧ１のＦｃに融合したトロンボポエチン結合ペプチド（ＮＰｌａｔｅ（ロミプロスチム）、慢性免疫性血小板減少性紫斑病患者における血小板減少症の治療用）；ヒトＩｇＧ１のＦｃに融合した変異型ＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ（アバタセプト）、関節リウマチの治療用）；ヒトＩｇＧ１のＦｃに融合したＬＦＡ−３（Ａｍｅｖｉｖｅ（アレファセプト）、乾癬及び移植片拒絶反応の治療用）；及びヒトＩｇＧ１のＦｃに融合したＴＮＦＲ（Ｅｎｂｒｅｌ（エタネルセプト）、関節リウマチの治療用）が挙げられる。

【0082】

抗体であるＦｃポリペプチドを作成する例示的方法について、以下の節にさらに詳細に記載する。本明細書に記載されるポリペプチドに使用される抗原結合ドメインは、種々の免疫グロブリン又は非免疫グロブリン足場、例えばブドウ球菌プロテインＡのＺドメインをベースとしたアフィボディ、エンジニアリングされたＫｕｎｉｔｚドメイン、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの１０番目の細胞外ドメインをベースとしたモノボディ又はアドネクチン、リポカリンに由来するアンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートドメイン、多量体化ＬＤＬＲ−Ａモジュール、アビマー又はシステインリッチｋｎｏｔｔｉｎペプチドから容易に得ることができる。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。

【0083】

抗原結合ドメインは、通常、抗体（免疫グロブリン鎖）に由来し、例えば、２つのポリペプチド鎖に存在する結合したＶＬ及びＶＨドメイン、又は一本鎖抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、又はＶ_ＨＨドメインの形態である。抗原結合ドメイン（例えば、ＡＢＤ_１及びＡＢＤ_２）はまた、Ｆａｂのような抗体から容易に得ることができる。

【0084】

典型的には、抗体は、最初は、抗体（例えば、ヒトポリペプチド）を得るのに望ましいポリペプチド、又は典型的には免疫原性断片であるその断片若しくは誘導体を含む免疫原を用いて、非ヒト動物、例えば、マウスの免疫によって得られる。非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップは、マウスの抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の任意の方式で行うことができる（例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＥ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。

【0085】

ヒト抗体は、ヒト抗体レパートリーを発現するようにエンジニアリングされたトランスジェニック動物（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）を免疫に用いることによって、又はファージ提示法を用いる抗体レパートリーの選択によって産生することもできる。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を免疫に使用することができる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子によって置き換えられたマウス宿主である。従って、このマウスによって、又はこのマウスのＢ細胞から産生されたハイブリドーマで産生される抗体は既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、参照によりその内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。

【0086】

抗体はまた、例えば、（参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４）に開示されているように、免疫グロブリンの組み合わせライブラリーの選択によって産生することもできる。ファージ提示法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３）を用いて、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから抗体を産生することができる。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；米国特許第５５６５３３２号明細書；同第５５７３９０５号明細書；同第５５６７６１０号明細書；同第５２２９２７５号明細書）を参照されたい。組み合わせライブラリーが、ヒト起源の可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを含む場合、組み合わせライブラリーからの選択により、ヒト抗体が得られる。

【0087】

加えて、広範囲の抗体が、ＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列を含む化学文献及び特許文献で、又は民間供給業者から入手可能である。抗体は、典型的には、所定の抗原に対するものである。抗体の例としては、除去されるべき標的細胞、例えば、増殖細胞又は病理の原因となる細胞によって発現される抗原を認識する抗体が挙げられる。例としては、腫瘍抗原、微生物（例えば、細菌）抗原、又はウイルス抗原を認識する抗体が挙げられる。

【0088】

目的の抗原に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、所望の細胞標的に基づいて選択することができ、例えば、癌抗原、細菌抗原、又はウイルス抗原などを含み得る。本明細書で使用される「細菌抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷細菌、弱毒細菌、若しくは死菌、あらゆる構造的若しくは機能的細菌タンパク質若しくは炭水化物、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）の細菌タンパク質の任意のペプチド部分を含む。例としては、グラム陽性細菌抗原及びグラム陰性細菌抗原が挙げられる。一部の実施形態では、細菌抗原は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、特にヘリコバクターピロリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）；ボレリア（Ｂｏｒｅｌｉａ）種、特にボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、特にレジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）；マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓ）種、特に結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アビウム菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、イントラセルラ菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）；ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、特に淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ファエカリス（Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）；嫌気性連鎖球菌（ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種；病原性カンピロバクター（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種；ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、特にヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚｕｅ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特に炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種、特にブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特にウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、特にエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、特にクレブシエラ１Ｓニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ １Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パストレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパストレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種；フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にストレプトバチルス・モリホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、特にトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；病原性エシェリキア種（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）；及びアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、特にアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）からなる群から選択される細菌に由来する。

【0089】

本明細書で使用される「ウイルス抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷全ウイルス、弱毒全ウイルス、若しくは死滅全ウイルス、任意の構造的若しくは機能的ウイルスタンパク質、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）のウイルスタンパク質の任意のペプチド部分を含む。ウイルス抗原の供給源としては、限定されるものではないが、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；及び他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス；ヒトコクサッキーウイルス；ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、及びロタウイルス）；ボルナビリダエ科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス（殆どのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（バリオラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリダウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；及び未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の作用物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）と考えられる）、Ｃ型肝炎；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）の科からのウイルスが挙げられる。別法では、ウイルス抗原は、組換えにより作製することができる。

【0090】

本明細書で使用されるとき、用語「癌抗原」及び「腫瘍抗原」は同義的に使用され、癌細胞が差次的に発現するか、又は腫瘍促進効果（例えば免疫抑制効果）を有する非腫瘍細胞（例えば免疫細胞）が発現する抗原であって、そのため、癌細胞の標的化に利用することのできる（ＮＫｐ４６又はＣＤ１６以外の）抗原を指す。癌抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫反応を潜在的に刺激し得る抗原である。これらの抗原の一部は、必ずしも発現するとは限らないが、正常細胞によってコードされ、又は正常細胞が低レベル若しくは低頻度で発現する。これらの抗原は、正常細胞で通常サイレントなもの（即ち、発現しない）、特定の分化段階でのみ発現するもの、及び胚抗原及び胎児性抗原など、一時的に発現するものとして特徴付けることができる。他の癌抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異ｐ５３）、内部欠失又は染色体転座から生じる融合タンパク質などの突然変異細胞遺伝子によってコードされる。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスに担持されるものなど、ウイルス遺伝子によってコードされ得る。さらに他の癌抗原は、腫瘍促進効果の媒介能を有する免疫細胞、例えば単球又はマクロファージ、任意選択によりサプレッサーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、又は骨髄系由来サプレッサー細胞上に発現し得る。

【0091】

癌抗原は、通常は正常な細胞表面抗原が過剰発現するか若しくは異常な回数発現するものであるか、又は標的とする細胞集団によって発現される。理想的には、標的抗原は増殖細胞（例えば、腫瘍細胞）又は腫瘍促進細胞（例えば免疫抑制効果を有する免疫細胞）においてのみ発現するが、しかしながら、実際にはこれは稀にのみ観察される。結果として、標的抗原は、多くの場合、増殖／疾患組織と健常組織との間の発現差に基づき選択される。癌抗原の例としては、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４７、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、シグレックファミリーメンバー、例えばＣＤ２２（シグレック２）又はＣＤ３３（シグレック３）、ＣＤ７９、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＰＳＣＡ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ７０、Ｅ−セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｄ ６及びＴＭＥＦＦ２が挙げられる。癌抗原の例としてはまた、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）、例えば、サイトカイン受容体、キラーＩｇ様受容体、ＣＤ２８ファミリータンパク質、例えば、キラーＩｇ様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＰＤ−Ｌ１、ＩＬ−６受容体も挙げられる。例としてはまた、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、プロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、受容体プロテインチロシンキナーゼ３（ＴＹＲＯ−３）、ネクチン（例えばネクチン−４）、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリーのタンパク質、レチノイン酸初期トランスクリプト−１（ＲＡＥＴ１）ファミリーのタンパク質、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ζ鎖、ＭＡＧＥ腫瘍抗原ファミリー、ＧＡＧＥ腫瘍抗原ファミリー、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ＤＲ５、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１又はＮＴＲＫＲ１（ＥＣ ２．７．１０．１）としても知られる、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリー、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、アンギオポエチン−２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４又は少なくとも１つのＨＥＲサブユニットで構成されるヘテロ二量体受容体、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ−１、ＣＡ１２５、インテグリン受容体、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３−インテグリン、ＰＤＧＦβ受容体、ＳＶＥ−カドヘリン、ＩＬ−８受容体、ｈＣＧ、ＩＬ−６受容体、ＣＳＦ１Ｒ（腫瘍関連単球及びマクロファージ）、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫性ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物、ｉｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、及びｃ−ｅｒｂＢ−２も挙げられ、しかし、これは網羅的であることを意図するものではない。一態様において、目的の抗原は、Ｆｃγ受容体細胞の存在下又は非存在下のいずれかで、例えば従来のヒトＩｇＧ１抗体が結合したときに、細胞内インターナリゼーションを受けることが可能な抗原（例えば上記に列挙した抗原のいずれか１つ）である。

【0092】

一実施形態において、抗原標的は、腫瘍促進効果の媒介能を有する免疫細胞、例えば単球又はマクロファージ、任意選択によりサプレッサーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、又は骨髄系由来サプレッサー細胞上に存在するポリペプチドである。

【0093】

ＡＢＤ_１とＡＢＤ_２とを含む多重特異的分子の例示的実施形態において、かかるＡＢＤのうちの一方は、除去しようとする標的細胞が発現する抗原（例えば、腫瘍抗原、微生物（例えば細菌）抗原、ウイルス抗原、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患に寄与する免疫細胞上に発現する抗原と結合してもよく、ＡＢＤ_１又はＡＢＤ_２のうちの他方は、免疫細胞、例えば免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞などのエフェクター細胞の細胞表面受容体上に発現する抗原に結合することになる。免疫細胞、任意選択により免疫エフェクター細胞上に発現する抗原の例としては、ヒトリンパ様細胞系列のメンバー、例えばヒトＴ細胞、ヒトＢ細胞又はヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ヒト単球、ヒト好中性顆粒球又はヒト樹状細胞上に発現する抗原が挙げられる。有利には、かかる細胞は、除去しようとする標的細胞（例えば、腫瘍抗原、微生物抗原、ウイルス抗原、又は炎症性若しくは自己免疫性疾患に寄与する免疫細胞上に発現する抗原を発現するもの）に対して細胞傷害効果又はアポトーシス効果のいずれかを有し得る。特に有利には、ヒトリンパ系細胞は、活性化すると標的細胞に細胞傷害効果を及ぼす細胞傷害性Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。この実施形態によれば、従って、ヒトエフェクター細胞の細胞傷害活性が動員される。別の実施形態によれば、ヒトエフェクター細胞はヒト骨髄細胞系列のメンバーである。

【0094】

多重特異的ポリペプチドのＡＢＤは、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞受容体、例えば、除去しようとする意図した標的細胞にＮＫ細胞又はＴ細胞を仕向ける役割を果たし得るそれぞれＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上の任意の分子など、免疫細胞上に発現する抗原に結合し得る。例としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲ）ファミリー、又はレクチンファミリー若しくはＮＫ細胞レクチン様受容体ファミリーのメンバーが挙げられる。活性は、例えば多重特異的ポリペプチドの存在下で標的細胞とエフェクター細胞とを接触させることによって計測し得る。

【0095】

任意選択により、免疫細胞受容体は活性化受容体、例えば活性化ＮＫ細胞又はＴ細胞受容体である。本明細書で使用されるとき、用語「活性化ＮＫ細胞受容体」及び「活性化Ｔ細胞受容体」は、刺激されると、サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α）産生、細胞内遊離カルシウムレベルの増加、例えば本明細書の他の部分に記載されるとおりのリダイレクトキリングアッセイにおいて標的細胞を溶解させる能力、又はそれぞれＮＫ細胞若しくはＴ細胞増殖を刺激する能力など、当該技術分野においてそれぞれＮＫ細胞又はＴ細胞活性に関連するものとして知られる任意の特性又は活性の計測可能な増加を生じる、それぞれＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上の任意の分子を指す。用語「活性化ＮＫ受容体」は、活性化又は共活性化受容体を含み、且つ限定されないが、各種形態のＫＩＲタンパク質（例えばＫＩＲ２ＤＳ受容体、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４）、ＮＫＧ２受容体、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ及びＩＬ−２１Ｒを含む。１つの重要な活性化受容体ファミリーは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６を含むナチュラル細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）である。

【0096】

細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、例えば、この実施形態の多重特異的（例えば二重特異的）ポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞の表面上にあるエフェクター抗原としてのＣＤ３抗原に結合することによって起こり得る。ヒトＣＤ３抗原はヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の両方に存在する。ヒトＣＤ３は、多分子Ｔ細胞複合体の一部としてＴ細胞上に発現する抗原であって、３つの異なる鎖、即ちＣＤ３−ε、ＣＤ３−δ及びＣＤ３−γを含む抗原を意味する。

【0097】

多重特異的ポリペプチドが結合する例示的リンパ系細胞関連エフェクター抗原は、ヒトＣＤ８抗原、ヒトＣＤ１６抗原、ヒトＮＫＧ２Ｄ抗原、ヒトＮＫｐ４６抗原、ヒトＮＫｐ３０抗原、ヒトＣＤ２抗原、ヒトＣＤ２８抗原又はヒトＣＤ２５抗原である。エフェクターＴ細胞上に発現するヒトＣＤ８抗原を用いて、例えばＣＤ４ Ｔ細胞（望ましくないサイトカイン産生及び関連毒性を伴い得る）又はＴＲｅｇ細胞に影響を及ぼすことなく、かかるＴ細胞を目的の標的細胞にリダイレクトすることができる。ヒトＮＫｐ３０及び特にＮＫｐ４６抗原は、主にＮＫ細胞上に発現し、従ってＮＫ細胞エフェクター活性を選択的に動員することが可能である。一実施形態において、免疫細胞又は免疫エフェクター細胞上に発現する抗原は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）ポリペプチドから選択される。

【0098】

Ｆｃポリペプチドに組み込まれる１つ又は複数のＡＢＤは、ポリペプチドに含める前に任意の所望の活性に関して試験することができる。所望の特異性及び／又は活性を有する適切な抗原結合ドメインが同定された後、ＡＢＤの各々をコードするＤＮＡを、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、リンカー及び適切な宿主へのトランスフェクション用の任意の他の任意選択のエレメント（例えばリンカー又はヒンジ領域をコードするＤＮＡ）など、任意のエレメントをコードするＤＮＡと共に、適切な１つ又は複数の発現ベクターに好適な配置で置くことができる。次に宿主を用いてＦｃポリペプチドが組換え産生される。

【0099】

抗体に由来するＡＢＤは、概して、最小限でも、結合活性を付与するのに十分な超可変領域を含み得る。ＡＢＤは、必要に応じて、限定されないが、リンカーエレメント（例えばリンカーペプチド、ＣＨ１、Ｃκ又はＣλドメイン、ヒンジ、又はこれらの断片（これらの各々はＡＢＤとＣＨ２又はＣＨ３ドメインとの間、又は必要に応じて他のドメイン間に置くことができる））を含めた他のアミノ酸又は機能ドメインを含んでもよく、又はそれに融合してもよいことが理解されるであろう。一例において、ＡＢＤは、ｓｃＦｖ、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメイン、又はＶ−ＮＡＲドメイン若しくはＶ_ＨＨドメインなどのシングルドメイン抗体（ナノボディ又はｄＡｂ）を含む。例示的抗体形態は本明細書にさらに記載され、ＡＢＤは所望の形態に基づき選択することができる。

【0100】

任意の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体から得ることができ、このヒト化抗体では、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元の抗体（親又はドナー抗体、例えば、マウス又はラット抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されているが、所望の特異性、親和性、及び元の抗体の能力を維持している。非ヒト生物を起源とする核酸によって一部又は全てがコードされた親抗体のＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに全て又は一部を移植して、その特異性が移植されるＣＤＲによって決まる抗体を作製する。このような抗体の作製は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５，Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。従って、抗原結合ドメインは、非ヒト超可変領域又はＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域の配列（任意選択により逆突然変異を含む）を有し得る。

【0101】

タンパク質ドメイン、例えばＡＢＤ又はＥＣＤは、互いに作動可能に連結された所望のドメインを有するＦｃポリペプチドが産生されるように発現ベクターに配置されることになる。次に、適切な宿主細胞で、又は任意の好適な合成方法によって、Ｆｃポリペプチドを産生することができる。宿主細胞は哺乳類起源のものであってもよく、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫又は植物細胞、又はこれらの任意の誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択されてもよい。或いは、宿主細胞は、抗体に哺乳類グリコシル化を生じさせることができない種又は生物、例えば天然の又はエンジニアリングされた大腸菌種（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｐｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、又はシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）などの原核細胞又は生物から選択されてもよい。

【0102】

（ａ）目的のタンパク質ドメイン（例えば、細胞表面受容体のＥＣＤ、ＶＨ及び／又はＶＬ、目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_１））、（ｂ）ＣＨ２ドメイン（又はその断片）と、第１のＣＨ３ドメイン及び第１のＣＨ３ドメインとアミノ酸残基の介在配列（例えば可動性ペプチドリンカー）によって分離されている第２のＣＨ３ドメインを含む直列型ＣＨ３ドメインとを含むＦｃドメイン、を含むＦｃ由来ポリペプチド鎖を構築することができる。任意選択により、ＣＨ２ドメインと目的のドメインとは、リンカー、ＣＨ１又はＣＫドメイン、及び／又はヒンジ領域によって分離されている。任意選択により、Ｆｃドメインは、（ｉ）別のＦｃ由来ポリペプチドとのＣＨ３−ＣＨ３二量体化を起こさず、（ｉｉ）ヒトＦｃＲｎとの結合能を有し、及び／又は（ｉｉｉ）野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較してヒトＦｃγ受容体との結合が低下している。例としては、以下のうちの１つのドメイン配置を有するポリペプチドが挙げられる：
（ＥＣＤ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
（ＥＣＤ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
（ＶＨ又はＶＬ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
（ＶＨ又はＶＬ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
（ＡＢＤ_１）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
又は
（ＡＢＤ_１）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３。

【0103】

（ａ）目的の第１のタンパク質ドメイン（例えば、細胞表面受容体のＥＣＤ、ＶＨ及び／又はＶＬ、目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_１））；（ｂ）ＣＨ２ドメイン（又はその断片）と、第１のＣＨ３ドメイン及び第１のＣＨ３ドメインと介在アミノ酸配列（例えば可動性ペプチドリンカー）によって分離されている第２のＣＨ３ドメインを含む直列型ＣＨ３ドメインとを含むＦｃドメイン、及び（ｃ）目的の第２のタンパク質ドメイン（例えば、細胞表面受容体のＥＣＤ、ＶＨ及び／又はＶＬ、目的の第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_２））を含む多重特異的、例えば二重特異的Ｆｃ由来ポリペプチド鎖を構築することができる。目的の第１及び第２のタンパク質ドメインの各々は、独立に、任意の所望のアミノ酸配列、例えば抗原結合ドメイン、機能性ペプチド、例えば、検出可能タグ、酵素認識タグ又は精製タグ、受容体ポリペプチド、酵素、サイトカイン等であってもよい。ドメイン配置を有するポリペプチドの例は以下のとおりである：
（目的のドメイン_１）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（目的のドメイン_２）、
（目的のドメイン_１）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（目的のドメイン_２）、
（ＡＢＤ_１）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＡＢＤ_２）、
（ＡＢＤ_１）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＡＢＤ_２）、
（ＥＣＤ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＡＢＤ）、
（ＥＣＤ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＡＢＤ）、
（ＡＢＤ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＥＣＤ）、
又は
（ＡＢＤ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ＥＣＤ）。

【0104】

任意選択により、目的のタンパク質ドメインはリンカーペプチド、ＣＨ１又はＣＫドメイン、及び／又はヒンジ領域を介して隣接ＣＨ２ドメインに融合している。任意選択により、ＣＨ３ドメインはリンカーペプチドを介して隣接ＣＨ３ドメインに融合している。任意選択により、Ｆｃドメインは、（ｉ）別のＦｃ由来ポリペプチドとのＣＨ３−ＣＨ３二量体化能を有さず、（ｉｉ）ヒトＦｃＲｎとの結合能を有し、及び／又は（ｉｉｉ）野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較してヒトＦｃγ受容体との結合が低下している。

【0105】

上記の例の直列型ＣＨ３ドメイン含有部分は、例えば以下のとおりのドメイン配置を含み得る（Ｎ末端からＣ末端に）：ＣＨ２−ＣＨ３−ペプチドリンカー−ＣＨ３−。

【0106】

従って、Ｆｃドメイン又はＦｃポリペプチドは、任意選択により、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む天然ヒトＦｃドメインであるか、又はそれを含むものとして記載することができ、ここで、ＣＨ３ドメインはその遊離末端でペプチドリンカーに融合しており、次にはペプチドリンカーがその遊離末端で第２のＣＨ３ドメインに融合している。

【0107】

様々なドメイン配置を想定することができる。例えば直列型ＣＨ３ドメイン含有Ｆｃ部分は、直列型ＡＢＤ又はｓｃＦｖのＣ末端に融合することができる。非限定的な例としては、以下のドメイン配置のいずれかを有するポリペプチドが挙げられる（Ｎ末端からＣ末端に）：
（ＡＢＤ_１）−（ＡＢＤ_２）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
（ＡＢＤ_１）−（ＡＢＤ_２）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３、
又は
（ｓｃＦｖ_１）−（ｓｃＦｖ_２）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３。

【0108】

ｓｃＦｖを用いる他の例としては、以下のドメイン配置を有するタンパク質が挙げられる（Ｎ末端からＣ末端に）：
（ｓｃＦｖ_１）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ｓｃＦｖ_２）
又は
（ｓｃＦｖ_１）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−（ｓｃＦｖ_２）。

【0109】

多重特異的タンパク質のさらなる例としては、国際公開第２０１５／１９７５９３号パンフレット（この開示は参照により組み入れられる）に示される単量体Ｆｃドメインを有するタンパク質及びドメイン配置を含めた多量体タンパク質が挙げられる。例えば、ヘテロ二量体は、例えば以下のとおりの構成を有し得る（図１Ｃに示す形態１１及び１２として示されるかかるタンパク質の実施例も参照されたい）：

【化5】

ここで、第１のポリペプチド鎖のＶ_ａ−１及び第２のポリペプチド鎖のＶ_ｂ−１のうちの一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、及びＶ_ａ−２及びＶ_ｂ−２のうちの一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインである。

【0110】

得られるヘテロ二量体は、別の例において、以下のとおりの構成を有し得る（図１Ｂに示す形態１０として示されるかかるタンパク質の実施例も参照されたい）：

【化6】

ここで、第１のポリペプチド鎖のＶ_ａ−１及び第２のポリペプチド鎖のＶ_ｂ−１のうちの一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインであり、及びＶ_ａ−２及びＶ_ｂ−２のうちの一方が軽鎖可変ドメインであり、且つ他方が重鎖可変ドメインである。

【0111】

さらなる例としては、三量体が挙げられる。例示的三量体は以下のとおりの構成を有し得る（図１Ｃに形態１７として示されるものも参照されたい）。

【化7】

【0112】

任意のＦｃポリペプチドにおいて、目的のタンパク質又はドメイン、例えば、ＡＢＤ、ＥＣＤとＣＨ２ドメインとの間にＣＨ１又はＣＫ（又はＣλ）ドメインが存在してもよく、又は目的のドメインとＣＨ２ドメインとの間にＣＨ１又はＣＫ（又はＣλ）ドメインは存在しなくてもよい。一実施形態において、目的のタンパク質又はドメインとＣＨ２ドメインとの間にはペプチドリンカーが存在する。一実施形態において、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間にヒンジ領域又はその断片、例えば天然抗体重鎖において鎖間架橋に関与するシステインの一方又は両方を欠いている改変されたヒンジが存在する。第１及び第２のＡＢＤは、ＡＢＤの結合が意図されるそれぞれの抗原との結合を許容するようにＡＢＤの折り畳みを可能にするのに十分な長さのリンカーによって共に連結することができる。ＡＢＤ_１をＡＢＤ_２に連結するのに用いられる、又はＡＢＤをＣＨ２若しくはＣＨ３に連結するのに用いられる好適なペプチドリンカーは当該技術分野において公知であり、例えば国際公開第２００７／０７３４９９号パンフレット（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。リンカー配列の例としては、（Ｇ_４Ｓ）_ｘ（式中、ｘは整数（例えば、１、２、３、４、又はそれを超える）である）が挙げられる。従って、Ｆｃポリペプチドは、例えば構造（ＡＢＤ_１−ペプチドリンカー−ＡＢＤ_２−ペプチドリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３−ペプチドリンカー−ＣＨ３）を有し得る。例えば、ポリペプチドは、融合産物として、構造（ｓｃＦｖ_１−ペプチドリンカー−ｓｃＦｖ_２−ペプチドリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３）を含むことができ、ここで、各エレメントは続くエレメントに融合している。Ｆｃポリペプチドの別の例は、構造：（ＡＢＤ_１−ペプチドリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３−ペプチドリンカー−ＣＨ３−ペプチドリンカー−ＡＢＤ_２）を有する。

【0113】

説明上、配置はＮ末端（左）からＣ末端に示す。ドメインは、互いに融合していると称することができる（例えばドメインはその左側のドメインのＣ末端に融合していると言うことができ、及び／又はドメインはその右側のドメインのＮ末端に融合していると言うことができる）。ドメインは、直接、又は介在アミノ酸配列を介して互いに融合することができる。

【0114】

特定の例に示されるとおり、２つの抗原結合ドメインがＦｃドメインの両末端に位置している多重特異的抗体を調製することができる。このタンパク質は、種々の細胞上の標的抗原とのより良好な結合を提供し得るコンホメーションをもたらし得る。この構成はまた、より幅広い抗体可変領域の使用も可能にする。直列型ｓｃＦｖ形態では機能性が保たれない一部の抗体結合ドメインが、シングルｓｃＦｖ形態では機能性のままとなり得る。従って、一態様においてポリペプチドは以下を含み得る：（ａ）目的の第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_１）、（ｂ）第１のＣＨ３ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメインと介在アミノ酸配列によって分離されている第２のＣＨ３ドメインを含むヒトＦｃドメインの少なくとも一部分を含む直列型ＣＨ３ドメイン含有部分、ここで、直列型ＣＨ３ドメイン含有部分は（任意選択によりアミノ酸残基の介在配列を介して）第１の抗原結合ドメインのＣ末端に融合しており、及び（ｃ）目的の第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_２）は（任意選択により介在アミノ酸配列を介して）直列型ＣＨ３ドメイン含有部分のＣ末端に融合している。

【0115】

任意の実施形態の一態様において、第１の抗原結合ドメイン及び／又は第２の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、任意選択によりｓｃＦｖはヒトフレームワークアミノ酸配列を含む。

【0116】

直列型ＣＨ３ドメイン内に使用される例示的ＣＨ３ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％同一の配列を含み得る。

【化8】

【0117】

可動性ペプチドリンカー（下線）を含む例示的直列型ＣＨ３を以下に示す。従って、例示的直列型ＣＨ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％同一の配列を含み得る。

【化9】

【0118】

一実施形態において、ＡＢＤ（例えばｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＬドメイン）をＣＨ２又はＣＨ３に連結するために使用されるペプチドリンカーは、ＣＨ１ドメイン又はＣＨ１ドメインの断片を含む。例えば、ＣＨ１ドメイン、又はＣＨ１ドメインのＮ末端アミノ酸配列をＡＢＤ（例えばｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＬドメイン等）に融合することにより、抗体の天然構造を可能な限り綿密に模倣することができる。一実施形態において、リンカーは、２〜４残基、２〜４残基、２〜６残基、２〜８残基、２〜１０残基、２〜１２残基、２〜１４残基、２〜１６残基、２〜１８残基、２〜２０残基、２〜２２残基、２〜２４残基、２〜２６残基、２〜２８残基、２〜３０残基、１０〜２０残基、１０〜２２残基、１０〜２４残基、２〜２６残基、１０〜２８残基、１２〜２０残基、１５〜３０残基、１５〜２０残基又は１０〜３０残基のＮ末端ＣＨ１アミノ酸配列を含む。一実施形態において、リンカーはアミノ酸配列ＲＴＶＡを含むか、又はそれからなる。

【0119】

ＡＢＤがｓｃＦｖである場合、ｓｃＦｖを形成するＶＨドメイン及びＶＬドメイン（ＶＬ又はＶＨドメイン、又は結合特異性を維持したその断片）は、ＡＢＤが結合する予定の抗原への結合を可能にするようにＡＢＤを折り畳むことができる十分な長さのリンカーによって互いに連結される。リンカーの例としては、例えば、グリシン及びセリン残基、例えば、アミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ_２Ｓ）_２ＧＧＡＤを含むリンカーが挙げられる。特定の一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインは、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_３によって互いに連結される。

【0120】

２つのＣＨ３ドメインを互いに連結するために使用されるペプチドリンカーは、非共有相互作用によるそれらの結合を許容するように２つのＣＨ３ドメインが折り畳まれること、特にＣＨ３−ＣＨ３二量体化が起こることを可能にするのに十分な長さの任意のアミノ酸配列であってもよい。リンカーの例としては、例えば、グリシン及びセリン残基を含むリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_ｘ（式中、ｘは１〜１０、任意選択により２〜６である）、例えば（Ｇ_４Ｓ）_３が挙げられる。

【0121】

２つのＣＨ３ドメインを互いに連結するために使用されるペプチドリンカーはいずれも少なくとも５残基、任意選択により少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０残基、少なくとも２５残基、少なくとも３０残基又はそれを超える長さを含み得る。他の実施形態において、リンカーは、５〜１０残基、４〜１２残基、５〜１４残基、５〜１６残基、５〜１８残基、５〜２０残基、５〜２２残基、５〜２４残基、５〜２６残基、５〜２８残基、５〜３０残基、１０〜２０残基、１０〜２２残基、１０〜２４残基、２〜２６残基、１０〜２８残基、１２〜２０残基、１５〜３０残基、１５〜２０残基又は１０〜３０残基の長さを含む。

【0122】

一実施形態では、ヒンジ領域は、ヒンジ領域の断片（例えば、システイン残基を含まない切断ヒンジ領域）であるか、又はシステイン残基、任意選択によりヒンジ領域中の両方のシステイン残基を（例えば、別のアミノ酸による置換、又は欠失により）除去するために１つ以上のアミノ酸改変を含み得る。システインの除去は、単量体ポリペプチドのジスルフィド架橋の形成を防止するのに有用であり得る。

【0123】

定常領域ドメインは、任意の適切な抗体から得ることができる。特に興味深いのは、定常重（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体との関連では、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれ３つのＣＨ領域を有する。従って、ＩｇＧとの関連での「ＣＨ」ドメインは、次のとおりである：「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによると１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによると２３７〜３４０位を指す。「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによると３４１〜４４７位を指す。「ヒンジ」、「ヒンジ領域」、又は「抗体ヒンジ領域」とは、抗体における第１及び第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドのことである。構造的に、ＩｇＧ Ｃｈ１ドメインは、ＥＵ２２０位で終端し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、ＥＵ２３７位の残基で始まる。従って、ＩｇＧでは、ヒンジは、本明細書では、２２１位（ＩｇＧ１のＤ２２１）〜２３６位（ＩｇＧ１のＧ２３６）を含むように定義され、付番は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従った。ポリペプチド内に見られる定常領域ドメイン内のアミノ酸残基について言及する場合、特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、ＩｇＧ抗体との関連で、Ｋａｂａｔに準拠するものとする。

【0124】

本抗体に役立ち得るＣＨ３ドメインは、任意の適切な抗体から得ることができる。このようなＣＨ３ドメインは、改変ＣＨ３ドメインの基準として役立ち得る。任意選択により、ＣＨ３ドメインはヒト起源である。本明細書における特定の実施形態において、ＣＨ３ドメインは天然ヒトＣＨ３ドメインであってもよく、一方、他の実施形態において、ＣＨドメインは１つ以上のアミノ酸改変（例えばアミノ酸置換）を含んでもよい。これらの改変は、概してＣＨ３二量体化界面の破壊を回避し、そのため、直列型ＣＨ３ドメインは互いに結合する能力を維持し得る。任意選択により、ＣＨ３ドメイン改変はさらに、Ｆｃ由来ポリペプチドが新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、例えばヒトＦｃＲｎに結合する能力を妨げない。

【0125】

ＣＨ２ドメインは、任意の適切な抗体から容易に得ることができる。任意選択により、ＣＨ２ドメインはヒト起源である。ＣＨ２は、ヒンジ又はリンカーアミノ酸配列に（例えば、そのＮ末端で）連結されてもよく、又は連結されなくてもよい。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、天然に存在するＩｇＧ１、２、３、４、又は４サブタイプのヒトＣＨ２ドメインである。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの断片（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０のアミノ酸）である。

【0126】

一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、本明細書に記載のポリペプチドに存在する場合、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特にヒトＦｃＲｎに対する結合性を維持する。

【0127】

一実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドに存在するときのＣＨ２ドメイン、及び本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）に対する結合の低下又は欠如を付与し得る。ＣＤ１６に結合しないＣＨ２ドメインを含むポリペプチドは、目的のエフェクター細胞抗原（例えばＮＫｐ４６、ＣＤ３等）を発現しない細胞（例えばＮＫ細胞、Ｔ細胞）によるＡＤＣＣを活性化又は媒介する能力を有しない。

【0128】

一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド並びにそのＦｃドメイン及び／又はそのＣＨ２ドメインは、低下した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋によるサイトカインの放出）、及び／又はＮＫｐ４６陰性免疫細胞によって媒介されるＦｃＲ媒介血小板活性化／減少を有するか、又はそれらを実質的に欠いている。

【0129】

一実施形態では、ポリペプチド内のＣＨ２ドメインは、活性化Ｆｃγ受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、若しくはＣＤ６４に対する結合性、又は抑制性Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）に対する結合性が実質的に消失する。一実施形態では、ポリペプチドのＣＨ２ドメインはさらに、補体（Ｃ１ｑ）の第１の成分に対する結合性が実質的に消失する。

【0130】

任意選択により、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２残基への置換をさらに含み、Ｆｃγ受容体との結合をさらに低減する。２３３〜２３６位（ＥＵ付番）での置換及び３２７、３３０及び３３１位（ＥＵ付番）におけるＩｇＧ４残基が、Ｆｃγ受容体との結合、従ってＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低減することが示されたことが示されている。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４は、Ｋ３２２を含めた種々の位置のアラニン置換が補体活性化を大幅に低減することを実証した。一実施形態において、ヒトＦｃＲｎとの結合を維持しているが、Ｆｃγ受容体との結合は低下しているＣＨ２ドメインは、例えば残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ）が欠けているか、又はそこに改変されたＮ結合型グリコシル化を有する。一実施形態において、Ｆｃγ受容体との結合を失っているＣＨ２ドメインは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸改変を含み得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、又はそれを超えるアミノ酸改変を有する）。

【0131】

一実施形態において、単量体ポリペプチドは１：１の比でＦｃＲｎに結合し得る（各単量体ポリペプチドにつき１個のＦｃＲｎ）。

【0132】

単量体Ｆｃドメイン含有ポリペプチドは、（例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較して）部分的なＦｃＲｎ結合を維持していてもよい。任意選択により、単量体ポリペプチドは、中間の親和性でのヒトＦｃＲｎとの結合能を有し、例えばＦｃＲｎとの結合を維持しているが、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較するとヒトＦｃＲｎ受容体との結合が低下している。Ｆｃ部分は、例えばＣＨ２ドメインに、１つ以上のＦｃγ受容体との結合を調節する１つ以上のアミノ酸改変をさらに含み得る。

【0133】

本明細書におけるポリペプチドのいずれかの一実施形態において、直列型ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドは、実質的に単量体形態で（即ち単一のポリペプチド鎖として）存在する。これは、直列型ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドが最終産物である場合にも、又はポリペプチドが多量体（例えば二量体）ポリペプチドである場合に直列型ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドが産物中間体であるときも該当し得る。

【0134】

化合物の使用
一態様では、それを必要としている哺乳動物の処置又は診断用の医薬製剤の製造における本明細書で定義される任意の化合物の使用が提供される。また、薬剤として、又は薬剤中の活性成分若しくは活性物質として上記定義された任意の化合物の使用も提供される。さらなる態様では、経口投与、局所投与、又は注射用の固体又は液体製剤を提供するために、上記定義された化合物を含む医薬組成物を調製する方法が提供される。このような方法又はプロセスは、少なくとも化合物を薬学的に許容され得る担体と混合するステップを含む。

【0135】

一態様において、本明細書における化合物、又は本明細書に開示される化合物を含む（医薬）組成物を用いてある種の効果を発揮することによるか、又はある種の状態を検出することにより、所定の状態を治療し、予防し、又はより一般的にはそれに影響を及ぼす方法が提供される。

【0136】

本明細書に記載のポリペプチドを使用して、抗体で処置することができる障害、例えば、癌、固形及び非固形腫瘍、血液悪性腫瘍、感染、例えば、ウイルス感染、及び免疫又は自己免疫疾患を予防又は処置することができる。

【0137】

一実施形態において、目的の抗原は、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含めた癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫を含めたリンパ系造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含めた骨髄細胞系造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含めた間葉由来腫瘍；神経芽細胞腫及び神経膠腫を含めた他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及びシュワン腫を含めた中枢及び末梢神経系腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含めた間葉由来腫瘍；及び黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞癌及びテラトカルシノーマ、リンパ系造血器腫瘍、例えばＴ細胞及びＢ細胞腫瘍を含めた他の腫瘍からなる群から選択されるタイプの癌の悪性細胞の表面上に発現する。

【0138】

一実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含めた癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫を含めたリンパ系造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含めた骨髄細胞系造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含めた間葉由来腫瘍；神経芽細胞腫及び神経膠腫を含めた他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及びシュワン腫を含めた中枢及び末梢神経系腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含めた間葉由来腫瘍；及び黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞癌及びテラトカルシノーマを含めた他の腫瘍からなる群から選択される癌の予防又は治療に使用することができる。本発明により治療し得る他の例示的障害には、リンパ系造血器腫瘍、例えばＴ細胞及びＢ細胞腫瘍が含まれる。

【0139】

一態様では、処置の方法は、治療有効量の多重特異的ポリペプチドを個人に投与するステップを含む。治療有効量は、疾患又は障害を有する患者に治療効果を有する（又は疾患若しくは障害を有する患者及び患者と実質的に同様の特徴を有する患者の少なくとも相当数でこのような効果を促進する、高める、及び／又は誘導する）任意の量であり得る。

【0140】

多重特異的ポリペプチドは、キットに含めることができる。このキットは、任意選択により、任意の数のポリペプチド及び／又は他の化合物、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又はその他の数の多重特異的ポリペプチド及び／又は他の化合物をさらに含み得る。キットの内容についてのこの記載は、全く限定ではないことを理解されたい。例えば、キットは、他のタイプの治療化合物を含み得る。任意選択により、キットは、ポリペプチドの使用についての取扱説明書、例えば、本明細書に記載の方法の詳細も含む。

【0141】

また、上記定義された化合物を含む医薬組成物も提供される。化合物は、医薬組成物として医薬担体と共に精製された形態で投与することができる。形態は、意図する投与方式及び治療又は診断用途によって決まる。医薬担体は、化合物を患者に送達するのに適した任意の適合性の非毒性物質とすることができる。薬学的に許容され得る担体は、当技術分野で公知であり、例えば、水溶液、例えば、（滅菌）水若しくは生理緩衝食塩水、又は他の溶媒若しくはビヒクル、例えば、グリコール、グリセロール、油、例えば、オリーブ油、又は注射可能な有機エステル、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体を含む。薬学的に許容され得る担体は、例えば化合物の吸収を安定させる又は高めるように作用する、生理的に許容され得る化合物をさらに含み得る。このような生理的に許容され得る化合物は、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストラン、抗酸化物、例えば、アスコルビン酸又はグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは賦形剤を含む。当業者であれば、生理的に許容され得る化合物を含む薬学的に許容され得る担体の選択が、例えば、組成物の投与経路によって決まることを理解されよう。薬学的に許容され得るアジュバント、緩衝剤、及び分散剤なども医薬組成物に含まれ得る。

【0142】

化合物は、非経口投与することができる。非経口投与用の化合物の調製は、滅菌でなければならない。滅菌は、任意選択により凍結乾燥及び再生の前又は後での、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易に達成される。化合物の投与の非経口経路は、公知の方法、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、動脈内経路、若しくは病巣内経路による注射又は注入に従う。化合物は、注入又はボーラス注射によって連続的に投与することができる。静脈注射用の典型的な組成物は、特定のタイプの化合物及びその必要な投与計画に合わせて、任意選択により２０％アルブミン溶液が添加された１００〜５００ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコース及び１ｍｇ〜１０ｇの化合物を含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野で公知である。

【実施例】

【0143】

実施例１：二重特異的単量体直列型ＣＨ３ Ｆｃポリペプチドの構築
材料及び方法
ヒト腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）及びＮＫ細胞上のヒト活性化受容体ＮＫｐ４６に特異的なｓｃＦＶ（抗ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ）をベースとする二重特異的Ｆｃポリペプチドの調製に使用する種々の構築物を作製した。

【0144】

以下の表１には、このタンパク質の抗ＣＤ１９成分の軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列を示す。

【0145】

【表1】

【0146】

以下の表２には、このタンパク質の抗ＮＫｐ４６成分の軽鎖及び重鎖可変領域及びｓｃＦｖアミノ酸配列を示す。

【0147】

【表2】

【0148】

組換えタンパク質のクローニング及び産生
コード配列を、直接合成及び／又はＰＣＲによって構築した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，＃Ｒ０４５Ａ）を用いて行い、ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル及びＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６０９．２５０）を用いて１％アガロースゲルから精製した。精製した後、ＰＣＲ産物を定量してから、製造者のプロトコル（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，＃ＳＴ０３４５）に記載されているようにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ連結反応を行った。プラスミドは、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ９６プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６２５．４）を用いてＥＶＯ２００（Ｔｅｃａｎ）で行われたミニプレップ調製後に得た。次いで、ＣＨＯ細胞株のトランスフェクションの前に、プラスミドを配列の確認のために配列決定した。

【0149】

ＣＨＯ細胞を、フェノールレッド及び６ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘが添加されたＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖した。トランスフェクションの前日に、細胞をカウントし、１７５，０００細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションのために、細胞（２００，０００細胞／トランスフェクション）を、ＡＭＡＸＡ ＳＦ細胞株キット（ＡＭＡＸＡ，＃Ｖ４ＸＣ−２０３２）に記載されているように調製し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄ装置でＤＳ１３７プロトコルを用いてヌクレオフェクトした。全てのトランスフェクションは、３００ｎｇの検証済みプラスミドを用いて行った。トランスフェクション後、細胞を、２４ウェルプレートの予熱された培養培地に播種する。２４時間後、ハイグロマイシンＢを、培養培地に添加した（２００μｇ／ｍｌ）。タンパク質の発現を、１週間後に培地で監視する。次いで、タンパク質を発現している細胞をサブクローニングして最高の産生株を得る。９６平底ウェルプレートを用いて、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢが添加された２００μｌの培養培地に１細胞／ウェルで細胞を播種して、サブクローニングを行った。クローンの生産性を試験する前に、細胞を３週間放置した。

【0150】

ＩｇＧ１−Ｆｃ断片を含む組換えタンパク質を、プロテインＡビーズ（−ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｒｅｆ．：１７−１２７９−０３）を用いて精製する。簡単に述べると、細胞培養上清を濃縮し、遠心分離によって清澄化し、プロテインＡカラムに注入し、組換えＦｃ含有タンパク質を捕捉した。タンパク質を酸性ｐＨ（クエン酸０．１Ｍ ｐＨ３）で溶出し、ＴＲＩＳ−ＨＣＬ ｐＨ８．５を用いて即座に中和し、１×ＰＢＳで透析した。「ｓｉｘ ｈｉｓ」タグを含む組換えｓｃＦｖを、コバルト樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。他の組換えｓｃＦｖを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。

【0151】

形態３（Ｆ３）：ＣＤ１９−Ｆ３−ＮＫｐ４６−３
Ｆ３ポリペプチドのドメイン構造が図１Ａに示されている。Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、同じポリペプチド鎖上の２つのＣＨ３ドメインが互いに結合し、それにより、異なる二重特異的タンパク質間の二量体化が防止される直列型ＣＨ３ドメインを含んでいた。

【0152】

一本鎖ポリペプチドは、以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する。
（ＶＫ−ＶＨ）^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）^{抗ＮＫｐ４６}

【0153】

（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。タンパク質を上記と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィール有していた。Ｆ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されている。

【0154】

形態４（Ｆ４）：ＣＤ１９−Ｆ４−ＮＫｐ４６−３
図１Ａに「形態４」として示すドメイン配置ｓｃＦｖＣＤ１９−ＣＨ２（Ｎ２９７Ｓ）−ＣＨ３−ＣＨ３−ｓｃＦｖＮｋｐ４６−３を有するタンパク質を構築した。Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ３と同じく直列型ＣＨ３ドメインを含んだが、それに加え、Ｎ結合型グリコシル化を防止し且つＦｃγＲ結合を無効にするためにＮ２９７Ｓ突然変異を含んだ。上記のとおりタンパク質をクローニングし、産生し、精製した。細胞培養上清からｐｒｏｔ−Ａビーズを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって二重特異的タンパク質を精製し、ＳＥＣによって分析及び精製した。タンパク質は１ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有した。ＮＫｐ４６−３可変ドメインを含むＦ４タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１に示す。

【0155】

形態９（Ｆ９）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ９ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びそれぞれＣＨ１−ＣＫの二量体化によって中心鎖に結合された２つのポリペプチド鎖を有する三量体ポリペプチドである。三量体Ｆ９タンパク質のドメイン構造が図１Ｂに示されており、ＣＨ１とＣＫドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインは、抗体がｓｃＦｖ形態で機能を支持するか否かにかかわらず、この抗体の使用を可能にするＦ（ａｂ）構造を有する。Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４と同様の直列型ＣＨ３ドメイン及びＮ２９７Ｓ置換を含むＣＨ２ドメインを含んでいた。Ｆ９タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ９Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている（Ｆ９Ｂ）、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳがヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換している（Ｆ９Ｃ）。変異型Ｆ９Ｂ及びＦ９Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。このヘテロ三量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ^{抗ＣＤ１９}−ＣＫ
タンパク質を上記と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、８．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ａ）及び３．０ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ｂ）の高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。

【0156】

Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ａの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１２、１３、及び１４に示されている。Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ｂの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１２、１５、及び１４に示されている。Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ｃの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１２、１６、及び１４に示されている。

【0157】

形態１０（Ｆ１０）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１０ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びＣＨ１−ＣＫの二量体化によって中心鎖に結合された第２のポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質である。二量体Ｆ１０タンパク質のドメイン構造が図１Ｂに示され、ＣＨ１とＣＫドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４と同様の直列型ＣＨ３ドメイン及びＮ２９７Ｓ置換を有するＣＨ２ドメインを含んでいた。加えて、Ｆ１０タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ１０Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている（Ｆ１０Ｂ、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳ（配列番号２８）がヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２９）を置換している（Ｆ１０Ｃ）。変異型Ｆ１０Ｂ及びＦ１０Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）^{抗ＮＫｐ４６}、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ^{抗ＣＤ１９}−ＣＫ。

【0158】

タンパク質を上記と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２ｍｇ／Ｌ（Ｆ１０Ａ）の良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１０Ａタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７（第２鎖）及び配列番号１８（第１鎖）に示されている。Ｆ１０Ｂタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７（第２鎖）及び配列番号１９（第１鎖）に示されている。Ｆ１０Ｃタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７（第２鎖）及び配列番号２０（第１鎖）に示されている。

【0159】

形態１１（Ｆ１１）：ＣＤ１９−Ｆ１１−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１１ポリペプチドのドメイン構造が図１Ｃに示されている。このヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ１０に類似しているが、抗原結合ドメインの構造が逆である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ様構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１。

【0160】

タンパク質を上記と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１１タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号２１（第１鎖）及び配列番号２２（第２鎖）に示されている。

【0161】

形態１２（Ｆ１２）：ＣＤ１９−Ｆ１２−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１２ポリペプチドのドメイン構造が図１Ｃに示されており、ＣＨ１とＣＫドメインとの間の結合は、ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ１１に類似しているが、Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１とＣＫドメインが逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＫ。

【0162】

タンパク質を上記と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２．８ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１２タンパク質のＤＮＡ及びアミノ酸配列が、以下に示されている。Ｆ１２タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号２３（第１鎖）及び配列番号２４（第２鎖）に示されている。

【0163】

形態１７（Ｆ１７）：ＣＤ１９−Ｆ１７−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１７ポリペプチドのドメイン構造が図１Ｃに示されており、ＣＨとＣＫドメインとの間の結合はジスルフィド結合である。ヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ９と同様であるが、ＶＨ及びＶＫドメイン、並びにＣ末端Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１及びＣＫドメインは、それぞれ、それらのパートナーと逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＫ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＨ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＫ、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ^{抗ＣＤ１９}−ＣＫ
加えて、Ｆ１７タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ１７Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されえいる（Ｆ１０Ｂ、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳ（配列番号２８）がヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２９）を置換している（Ｆ１７Ｃ）。タンパク質を上記と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｆ１７Ｂタンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号２５、２６、及び２７に示されている。

【0164】

実施例２：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、二重特異的タンパク質によるＮＫｐ４６結合親和性
Ｂａｃｏｒｅ Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮａＯＨ １０ｍＭは、それぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。プロテインＡを（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から購入した。ヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質を、クローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａで精製した。

【0165】

プロテインＡの固定化
プロテインＡタンパク質を、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡを、結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。

【0166】

結合試験
ＮＫｐ４６−３抗体由来の抗ＮＫｐ４６可変領域を有する種々の形態Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１としての二重特異的タンパク質を試験し、完全長ヒトＩｇＧ１としてのＮＫｐ４６−３抗体と比較した。

【0167】

１μｇ／ｍＬの二重特異的タンパク質をプロテインＡチップ上に捕捉し、捕捉された二重特異的抗体上に５μｇ／ｍＬの組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を注入した。ブランク差し引きのため、ＮＫｐ４６タンパク質をランニング緩衝液に置き換えて再度サイクルを実施した。

【0168】

親和性試験
一価親和性試験を、製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｗｉｚａｒｄ）が推奨する正規のＣａｐｔｕｒｅ−Ｋｉｎｅｔｉｃプロトコルに従って行った。６２．５〜４００ｎＭの範囲のヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質の７段階希釈物を、捕捉した二重特異的抗体に連続的に注入し、再生の１０分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、１：１動態結合モデルを用いてフィッティングした。

【0169】

結果
ＳＰＲから、形態Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０及びＦ１１の全ての二重特異的ポリペプチドがＮＫｐ４６との結合を維持したことが示された。一価親和性及び動力学的結合及び解離速度定数を以下の表３に示す。

【0170】

【表3】

【0171】

実施例３：
ＮＫｐ４６作用機序
ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ ＮＫ細胞株がＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞を溶解するように仕向ける機能的能力に関して、実施例１に記載するＦ３形態に従う配置を有するＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質をリツキシマブ（抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体）及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した。

【0172】

簡単に述べると、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性を、Ｕ底９６ウェルプレートで、典型的な４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞を^５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０^６細胞）で標識し、次いで、１／５希釈（ｎ＝８の濃度）で１０^−７ｍｏｌ／ｍＬから始まる希釈範囲の試験抗体の存在下、５０：１に等しいエフェクター／標的比でＫＨＹＧ−１と混合した。

【0173】

短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、^５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。

【0174】

結果
ＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ実験モデルにおいて、各ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質は、ヒトＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ又はＢ２２１細胞の特異的溶解を誘導し、一方、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体はそれを誘導しなかった。

【0175】

実施例４：
様々な二重特異的形態のＦｃＲｎに対する結合性
様々な抗体形態のヒトＦｃＲｎに対する親和性について、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、組換えＦｃＲｎタンパク質をセンサーチップＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合的に固定化することによって調べた。ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ完全長抗ＣＤ１９抗体、及び実施例１に記載するＦ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０、又はＦ１１形態に係る配置を有するＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質を試験した。各分析物について、定常状態又は１：１ ＳＣＫ結合モデルを用いてセンサーグラム全体をフィッティングした。

【0176】

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の概略手順及び試薬
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において２５℃で実施した。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験において、酢酸塩緩衝液（５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ５．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％界面活性剤ｐ２０）及びＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をそれぞれランニング緩衝液及び再生緩衝液として用いた。センサーグラムはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。組換えマウスＦｃＲｎはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。

【0177】

ＦｃＲｎの固定化
組換えＦｃＲｎタンパク質をセンサーチップＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合的に固定化した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。ＦｃＲｎタンパク質をカップリング緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．６）中１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち２５００ＲＵ）に達するまで注入した。１００ｍＭエタノールアミンｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、残りの活性化基の不活性化を実施した。

【0178】

親和性試験
シングルサイクルキネティクス（ＳＣＫ）プロトコルに従い一価親和性試験を行った。４１．５〜６６０ｎＭの範囲の可溶性分析物（抗体及び二重特異的分子）の５段階希釈物をＦｃＲｎ上に注入し（再生なし）、１０分間解離させた後、再生した。各分析物について、１：１ ＳＣＫ結合モデルを用いてセンサーグラム全体をフィッティングした。

【0179】

結果
結果を以下の表４に示す。単量体Ｆｃドメインを含む二重特異的タンパク質（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１）はＦｃＲｎとの結合性を示した。二量体Ｆｃドメインを有するヒトＩｇＧ１／Ｋ抗ＣＤ１９抗体は７．８のＫＤ（ｎＭ）を示した。

【0180】

【表4】

【0181】

表題及び副題は、本明細書では便宜のためにのみ使用され、本発明を限定すると決して一切解釈するべきではない。上述の要素の全ての可能なバリエーションでのあらゆる組み合わせが、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、本発明に包含される。本明細書で述べられた値の範囲は、本明細書に特段の記載がない限り、範囲内に含まれるそれぞれの別個の値について個々に述べられる省略方法の役割を単に果たすものであり、それぞれの別個の値は、本明細書で個々に述べられたかのように本明細書に包含される。特段の記載がない限り、本明細書に記載される全ての正確な値は、対応するおおよその値を代表する（例えば、特定の因子又は測定値に関して記載される全ての正確な例示的な値は、適切な場合には「約」によって変更される、対応するおおよその測定値を示すものと見なすことができる）。

【0182】

本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、任意の適切な順序で行うことができる。

【0183】

本明細書に記載されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「〜など」）の使用は、単に本発明をより明確にするためのものであり、特段の記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明確な記載がない限り、いずれの要素も本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈される語は本明細書には存在しない。

【0184】

語、例えば、１つ又は複数の要素を指す語を用いた、本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書の説明は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その１つ又は複数の特定の要素「からなる」、「から実質的になる」、又は「を実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態を支援するためである（例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載される組成物は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その要素からなる組成物の記載でもあることを理解されたい）。

【0185】

本発明は、適用される法律によって許容される最大程度まで、本明細書に記載される態様又は請求項で述べられる主題の全ての変更形態及び均等物を含む。

【0186】

本明細書で述べられる全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により含められると具体的且つ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。

【0187】

前述の本発明は、理解を明確にするために例示及び例によってある程度詳細に説明されたが、当業者であれば、添付の特許請求の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変形形態及び変更形態をなし得ることが本発明の教示から明白であろう。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]