特許 6723924 ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子のエクソンを増幅するためのプライマーセット及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6723924

(24)【登録日】2020年6月26日

(45)【発行日】2020年7月15日

(54)【発明の名称】ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子のエクソンを増幅するためのプライマーセット及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6883 20180101AFI20200706BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20200706BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20200706BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6883 ZZNA

   C12Q1/686 Z

   !C12N15/09 Z

【請求項の数】10

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2016-560183(P2016-560183)

(86)(22)【出願日】2015年11月13日

(86)【国際出願番号】JP2015081941

(87)【国際公開番号】WO2016080299

(87)【国際公開日】20160526

【審査請求日】2018年10月16日

(31)【優先権主張番号】特願2014-235066(P2014-235066)

(32)【優先日】2014年11月19日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000206956

【氏名又は名称】大塚製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】葛城 粛典

(72)【発明者】

【氏名】木下 盛敏

(72)【発明者】

【氏名】古賀 大輔

(72)【発明者】

【氏名】東山 諒

【審査官】 星 功介

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５４４３１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２８５９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−２１２７１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１８５６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nefrologia，2009, Vol.29，pp.327-330

【文献】 Human Mutation，2012, Vol.33, NO.8，pp.1239-1250

【文献】 BioTechniques，2000, Vol.29, No.6，pp.1186-1190

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

単一のＰＣＲサイクル条件でＰＫＤ１遺伝子及びＰＤＫ２遺伝子の全てのエクソン を増幅させるための、下記表１に示されるプライマー対１〜１８を全て含む、プライマーセット。

【表1】

【請求項2】

各プライマーが１５〜４０塩基の長さを有する、請求項１に記載のプライマーセット。

【請求項3】

１Ｆプライマーが、配列番号１で示される塩基配列の少なくとも第１５位〜第２９位の塩基配列を有し、
１Ｒプライマーが、配列番号２で示される塩基配列の少なくとも第１６位〜第３０位の塩基配列を有し、
２Ｆプライマーが、配列番号３で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
２Ｒプライマーが、配列番号４で示される塩基配列の少なくとも第１３位〜第２７位の塩基配列を有し、
３Ｆプライマーが、配列番号５で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
３Ｒプライマーが、配列番号６で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
４Ｆプライマーが、配列番号７で示される塩基配列の少なくとも第６位〜第２０位の塩基配列を有し、
４Ｒプライマーが、配列番号８で示される塩基配列の少なくとも第８位〜第２２位の塩基配列を有し、
５Ｆプライマーが、配列番号９で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
５Ｒプライマーが、配列番号１０で示される塩基配列の少なくとも第１０位〜第２４位の塩基配列を有し、
６Ｆプライマーが、配列番号１１で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、
６Ｒプライマーが、配列番号１２で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、
７Ｆプライマーが、配列番号１３で示される塩基配列の少なくとも第２１位〜第３５位の塩基配列を有し、
７Ｒプライマーが、配列番号１４で示される塩基配列の少なくとも第２０位〜第３４位の塩基配列を有し、
８Ｆプライマーが、配列番号１５で示される塩基配列の少なくとも第１６位〜第３０位の塩基配列を有し、
８Ｒプライマーが、配列番号１６で示される塩基配列の少なくとも第１３位〜第２７位の塩基配列を有し、
９Ｆプライマーが、配列番号１７で示される塩基配列の少なくとも第２１位〜第３５位の塩基配列を有し、
９Ｒプライマーが、配列番号１８で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
１０Ｆプライマーが、配列番号１９で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１０Ｒプライマーが、配列番号２０で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１１Ｆプライマーが、配列番号２１で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１１Ｒプライマーが、配列番号２２で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１２Ｆプライマーが、配列番号２３で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１２Ｒプライマーが、配列番号２４で示される塩基配列の少なくとも第１７位〜第３１位の塩基配列を有し、
１３Ｆプライマーが、配列番号２５で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１３Ｒプライマーが、配列番号２６で示される塩基配列の少なくとも第１６位〜第３０位の塩基配列を有し、
１４Ｆプライマーが、配列番号２７で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１４Ｒプライマーが、配列番号２８で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、
１５Ｆプライマーが、配列番号２９で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１５Ｒプライマーが、配列番号３０で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１６Ｆプライマーが、配列番号３１で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
１６Ｒプライマーが、配列番号３２で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１７Ｆプライマーが、配列番号３３で示される塩基配列の少なくとも第１６位〜第３０位の塩基配列を有し、
１７Ｒプライマーが、配列番号３４で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、
１８Ｆプライマーが、配列番号３５で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、及び／又は
１８Ｒプライマーが、配列番号３６で示される塩基配列の少なくとも第１３位〜第２７位の塩基配列を有する、
請求項１又は２に記載のプライマーセット。

【請求項4】

各プライマーが凍結乾燥されている、請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセット。

【請求項5】

各プライマーがＰＣＲでの使用に適した溶液含まれている、請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセット。

【請求項6】

単一のＰＣＲサイクル条件が、６２〜８０℃のアニーリング温度及び伸長反応温度を含む、請求項１〜５のいずれに記載のプライマーセット。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれかに記載のプライマーセットを含む、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを単一のＰＣＲサイクル条件で増幅させるためのキット。

【請求項8】

請求項１〜６のいずれかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程を含む、単一のＰＣＲサイクル条件でＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを増幅させる方法。

【請求項9】

前記ＰＣＲが、複数の別個のＰＣＲを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記複数の別個のＰＣＲの全てが同時に行われる、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子のエクソンを増幅するためのプライマーセット及び方法等に関する。

【背景技術】

【0002】

多発性嚢胞腎（Polycystic Kidney Disease; PKD）は腎臓に多数の嚢胞が生じることにより腎容積の増加及び腎機能の低下を引き起こし、最終的には透析が必要な腎不全を引き起こす疾患である。ＰＫＤは頻度の高い遺伝性疾患であり、常染色体優性多発性嚢胞腎（Autosomal Dominant PKD; ADPKD）と常染色体劣性多発性嚢胞腎（Autosomal Recessive PKD; ARPKD）に区分することができるが、ＡＲＰＫＤは非常に稀である。ＡＤＰＫＤの罹患者は３００人から５００人に１人とも言われているが（非特許文献１）、医療機関を受療しているADPKD患者数は２，０００人から４，０００人に１人にとどまるという報告もある（非特許文献２及び３）。生涯にわたって自身がＡＤＰＫＤに罹患していることを知らず、適切な治療を受けられない患者が多いため（非特許文献３）、より適切な診断が広まることが望まれている。

【0003】

ＡＤＰＫＤの病原遺伝子としてＰＫＤ１遺伝子（非特許文献４）及びＰＫＤ２遺伝子（非特許文献５）の２種類の遺伝子が同定されており、ＰＫＤ１遺伝子の変異が原因の患者が８５%〜９０%、ＰＫＤ２の変異が原因の患者が１０%〜１５%であると報告されている（非特許文献６）。ＰＫＤ１遺伝子に異常がある患者の場合、透析に移行する年齢は平均で５３歳であり、ＰＫＤ２遺伝子に異常がある患者のそれが６３歳であることと比べると、ＰＫＤ１遺伝子に異常がある患者の病状の進行は速い（非特許文献７）。ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子に存在する病原変異の種類及び位置は多岐にわたり、各家系に特徴的な病原変異が存在する（非特許文献８）。

【0004】

現在、ＡＤＰＫＤの確定診断にはＣＴやＭＲＩ、超音波断層像を用いた画像診断が行われており、腎臓内に確認できる嚢胞の数によって診断されている。しかしながら、この方法では嚢胞が生じてからでなければ診断ができないため、嚢胞が多数形成される前にＰＫＤ遺伝子変異保因者であることを知ることは不可能である。技術の革新によりＰＫＤ遺伝子診断がより利用しやすい環境になれば、まだ発病していないＰＫＤ変異保因者の確定診断補助や、変異が生じている遺伝子および領域を同定することにより病状進行速度の違いを知ることができるようになると考えられている。

【0005】

ＰＫＤ１及びＰＫＤ２遺伝子の変異を検出する方法として、(1)サンガー法を用いた変異検出（非特許文献９）、(2)ＤＨＰＬＣ（denaturing high-pressure liquid chromatography）法を用いた変異検出（非特許文献１０）、(3)エンドヌクレアーゼとDHPLCを用いた変異検出（非特許文献１１）、(4)次世代シークエンサーを用いた変異検出(非特許文献１２)等が報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Adult polycystic kidney disease in Hong Kong Chinese: an autopsy study. Chan KW. Pathology., Vol.25, pp.229-232, 1993.

【非特許文献2】Polycystic kidney disease re-evaluated: a population-based study. Davies F et al.Q J Med. Vol. 79. pp. 477-485. 1991.

【非特許文献3】Prevalence and renal prognosis of diagnosed autosomal dominant polycystic kidney disease in Japan. Higashihara E et al. Nephron. Vol. 80. pp. 421-427, 1998.

【非特許文献4】The polycystic kidney disease 1 gene encodes a 14 kb transcript and lies within a duplicated region on chromosome 16. The European Polycystic Kidney Disease Consortium. Cell. Vol. 77, pp. 881-94, 1994.

【非特許文献5】PKD2, a gene for polycystic kidney disease that encodes an integral membrane protein. Mochizuki T et al. Science. Vol. 272, pp. 1339-42, 1996.

【非特許文献6】The polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene encodes a novel protein with multiple cell recognition domains. Hughes J et al. Nat Genet. Vol.10. pp.151-160. 1995.

【非特許文献7】Linkage, clinical features, and prognosis of autosomal dominant polycystic kidney disease types 1 and 2. Torra R et al. J Am Soc Nephrol. Vol.7. pp. 2142-2151. 1996 .

【非特許文献8】A Complete mutation screen of the ADPKD genes by DHPLC. Rossetti S et al. Kidney International. Vol.61, pp.1588-1599, 2002.

【非特許文献9】Mutation analysis of the entire PKD1 gene: Genetic and diagnostic implications. Rossetti S et al. The American Journal of Human Genetics. Vol. 68, pp.46-63, 2001.

【非特許文献10】Novel method for genomic analysis of PKD1 and PKD2 mutations in autosomal dominant polycystic kidney disease. YC Tan et al. Human Mutation. Vol. 30, p.264-273, 2009.

【非特許文献11】Identification of gene mutations in autosomal dominant polycystic kidney disease through targeted resequencing. Rossetti S et al. J Am Soc Nephrol 23: 915-933, 2012.

【非特許文献12】Genes homologous to the autosomal dominant polycystic kidney disease genes (PKD1 and PKD2). Barbera Veldhuisen et al. European Journal of Human Genetics. Vol. 7, p.860-872, June 1999.

【非特許文献13】A novel long-range PCR sequencing method for genetic analysis of the entire PKD1 gene. Ying-Cai Tan et al. Journal of Molecular Diagnostics. Vol. 14, No.4, July 2012.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子は、いずれも長大であり、各々４６のエクソン及び１５のエクソンが存在する。また、ＰＫＤ１遺伝子には、その配列との相同性が非常に高い偽遺伝子が６種類存在するため、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子のエクソンを増幅するためには、偽遺伝子を回避することが求められる。更に、ＰＫＤ１遺伝子には、ＧＣ含有率が非常に高い領域が存在する。これらの理由により、これまでに報告されているＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを増幅させる方法は、複数の異なるＰＣＲ条件下で多数（例えば、９個）の別個のＰＣＲを実施する必要があった（非特許文献１３）。その為、全エクソンの増幅産物の取得には、多大な時間を要した。そこで、本発明は、より効率的にＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子のエクソンを増幅する手段を提供することを主な目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明者等は、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の特定の領域をターゲットとしてプライマーを設計し、それらを組み合わせて利用することにより、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全エクソンの増幅産物を取得する効率が飛躍的に向上することを見出した。斯かる知見及び更なる検討と改良に基づき、下記に代表される発明が提供される。
項１．
単一のＰＣＲサイクル条件でＰＫＤ１遺伝子及びＰＤＫ２遺伝子の全てのエクソンを増幅させるためのプライマーセット。
項２．
下記表１に示されるプライマー対１〜１８を含む、項１に記載のプライマーセット。

【0009】

【表1】

【0010】

項３．
各プライマーが１５〜４０塩基の長さを有する、項１又は２に記載のプライマーセット。

【0011】

項４．
１Ｆプライマーが、配列番号１で示される塩基配列の少なくとも第１５位〜第２９位の塩基配列を有し、
１Ｒプライマーが、配列番号２で示される塩基配列の少なくとも第１６位〜第３０位の塩基配列を有し、
２Ｆプライマーが、配列番号３で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
２Ｒプライマーが、配列番号４で示される塩基配列の少なくとも第１３位〜第２７位の塩基配列を有し、
３Ｆプライマーが、配列番号５で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
３Ｒプライマーが、配列番号６で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
４Ｆプライマーが、配列番号７で示される塩基配列の少なくとも第６位〜第２０位の塩基配列を有し、
４Ｒプライマーが、配列番号８で示される塩基配列の少なくとも第８位〜第２２位の塩基配列を有し、
５Ｆプライマーが、配列番号９で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
５Ｒプライマーが、配列番号１０で示される塩基配列の少なくとも第１０位〜第２４位の塩基配列を有し、
６Ｆプライマーが、配列番号１１で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、
６Ｒプライマーが、配列番号１２で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、
７Ｆプライマーが、配列番号１３で示される塩基配列の少なくとも第２１位〜第３５位の塩基配列を有し、
７Ｒプライマーが、配列番号１４で示される塩基配列の少なくとも第２０位〜第３４位の塩基配列を有し、
８Ｆプライマーが、配列番号１５で示される塩基配列の少なくとも第１６位〜第３０位の塩基配列を有し、
８Ｒプライマーが、配列番号１６で示される塩基配列の少なくとも第１３位〜第２７位の塩基配列を有し、
９Ｆプライマーが、配列番号１７で示される塩基配列の少なくとも第２１位〜第３５位の塩基配列を有し、
９Ｒプライマーが、配列番号１８で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
１０Ｆプライマーが、配列番号１９で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１０Ｒプライマーが、配列番号２０で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１１Ｆプライマーが、配列番号２１で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１１Ｒプライマーが、配列番号２２で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１２Ｆプライマーが、配列番号２３で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１２Ｒプライマーが、配列番号２４で示される塩基配列の少なくとも第１７位〜第３１位の塩基配列を有し、
１３Ｆプライマーが、配列番号２５で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１３Ｒプライマーが、配列番号２６で示される塩基配列の少なくとも第１６位〜第３０位の塩基配列を有し、
１４Ｆプライマーが、配列番号２７で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１４Ｒプライマーが、配列番号２８で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、
１５Ｆプライマーが、配列番号２９で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１５Ｒプライマーが、配列番号３０で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１６Ｆプライマーが、配列番号３１で示される塩基配列の少なくとも第１４位〜第２８位の塩基配列を有し、
１６Ｒプライマーが、配列番号３２で示される塩基配列の少なくとも第１１位〜第２５位の塩基配列を有し、
１７Ｆプライマーが、配列番号３３で示される塩基配列の少なくとも第１６位〜第３０位の塩基配列を有し、
１７Ｒプライマーが、配列番号３４で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、
１８Ｆプライマーが、配列番号３５で示される塩基配列の少なくとも第１２位〜第２６位の塩基配列を有し、及び／又は
１８Ｒプライマーが、配列番号３６で示される塩基配列の少なくとも第１３位〜第２７位の塩基配列を有する、
項２又は３に記載のプライマーセット。

【0012】

項５．
各プライマーが凍結乾燥されている、項１〜４のいずれかに記載のプライマーセット。
項６．
各プライマーがＰＣＲでの使用に適した溶液含まれている、項１〜４のいずれかに記載のプライマーセット。
項７．
単一のＰＣＲサイクル条件が、６２〜８０℃のアニーリング温度及び伸長反応温度を含む、項１〜６のいずれに記載のプライマーセット。
項８．
項１〜６のいずれかに記載のプライマーセットを含む、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを単一のＰＣＲサイクル条件で増幅させるためのキット。
項９．
項１〜７のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、被検体から得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行う工程を含む、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを単一のＰＣＲサイクル条件で増幅させる方法。
項１０．
前記ＰＣＲが、複数の別個のＰＣＲを含む、項９に記載の方法。
項１１．
前記複数の別個のＰＣＲの全てが同時に行われる、項１０に記載の方法。
項１２．
項９〜１１のいずれかに記載の方法によって得られた増幅産物の塩基配列を決定する工程を含む、被検体のＰＫＤ１遺伝子及び／又はＰＫＤ２遺伝子における変異の有無を測定する方法。
項１３．
項１２に記載の方法によって測定されたＰＫＤ１遺伝子及び／又はＰＫＤ２遺伝子における変異の有無に基づいて、被検体が多発性嚢胞腎を発症するリスク又は多発性嚢胞腎の罹患の有無を判定する方法。
項Ｅ１．
単一のＰＣＲサイクル条件で、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを増幅させるための、項１〜６のいずれかに記載のプライマーセットの使用。
項Ｅ２．
ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを単一のＰＣＲサイクル条件で増幅させるための、項１〜６のいずれかに記載のプライマーセットを含むキットの使用。

【発明の効果】

【0013】

本発明に従えば、効率的にＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全エクソンを増幅させることが出来る。好ましくは、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全エクソンを単一（又は少ないバリエーション）のＰＣＲサイクル条件で増幅させることができる。例えば、本発明に従えば、一台のＰＣＲ装置（サーマルサイクラー）でＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全エクソンを同時に増幅させることができる。また、本発明の好適な実施形態に従えば、複数のプライマー対を用いたＰＣＲを単一の反応容器内で同時に実施することができるため、より効率的且つ経済的にＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ遺伝子のエクソンのうち必要なものを増幅させることができる。更に、本発明に従えば、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子のエクソンの増幅を、偽遺伝子の増幅を回避しながら行うことができる。よって、本発明を利用することにより、被験者のＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子における変異の存在を検出すること、及び／又は、当該検出に基づく、多発性嚢胞腎の発症の判断、若しくは、そのリスクの予測を効率的に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例の「マルチプレックスＰＣＲ」の項で採用したＰＣＲサイクル条件を示す。

【図2】マルチプレックスＰＣＲで得られた増幅産物を１％アガロースゲルを用いて電気泳動した泳動写真を示す。プライマーミックスＡ、Ｂ、及びＣを用いて得られた増幅産物については、２本のバンドが確認された。プライマーミックスＥを用いて得られた増幅産物については、バンドが３本確認された。プライマーミックスＤ、Ｆ、及びＧを用いて得られた増幅産物については、サイズが近い増幅産物が２つ含まれるため、２本のバンドが見られた。

【図3-1】サンガー法を用いて決定した領域１の部分配列と対応する偽遺伝子配列とのアライメント結果を示す。領域１とは、表３に示すプライマー対１が増幅する領域（Region）を意味する。配列は、上から順に、マルチプレックスＰＣＲで得られた増幅産物についてサンガー法で決定した配列（Exon.1(R)）、PKD1遺伝子の参照配列（PKD1(R)、及び３種類のPKD1偽遺伝子の配列（PKD1P3(R)、PKD1P5(R)、PKD1P6(R)）である。（R）は、リバースの向きで配列が並べられていることを示す。黒矢印はＰＫＤ１に特異的な塩基が存在する場所を示す。

【図3-2】サンガー法を用いて決定した領域２の部分配列と対応する偽遺伝子配列とのアライメント結果を示す。領域２とは、表３に示すプライマー対２が増幅する領域を意味する。配列は、上から順に、マルチプレックスＰＣＲで得られた増幅産物についてサンガー法で決定した配列（Exon.6(R)）、PKD1遺伝子の参照配列（PKD1(R)、及び６種類のPKD1偽遺伝子の配列（PKD1P1(R)〜PKD1P6(R)）である。（R）は、リバースの向きで配列が並べられていることを示す。黒矢印はPKD1に特異的な塩基が存在する場所を示す。

【図3-3】サンガー法を用いて決定した領域３の部分配列と対応する偽遺伝子配列とのアライメント結果を示す。領域３とは、表３に示すプライマー対３が増幅する領域を意味する。配列は、上から順に、マルチプレックスＰＣＲで得られた増幅産物についてサンガー法で決定した配列（Exon11A(R)）、PKD1遺伝子の参照配列（PKD1(R)、及び５種類のＰＫＤ１偽遺伝子の配列（PKD1P1(R)〜PKD1P5(R)）である。（R）は、リバースの向きで配列が並べられていることを示す。黒矢印はＰＫＤ１に特異的な塩基が存在する場所を示す。

【図3-4】サンガー法を用いて決定した領域４の部分配列と対応する偽遺伝子配列とのアライメント結果を示す。領域４とは、表３に示すプライマー対４が増幅する領域を意味する。配列は、上から順に、マルチプレックスＰＣＲで得られた増幅産物についてサンガー法で決定した配列（Exon15A (F)）、PKD1遺伝子の参照配列（PKD1(F)、及び５種類のPKD1偽遺伝子の配列（PKD1P1(F)〜PKD1P5(F)）である。（F）は、フォワード向きで配列が並べられていることを示す。黒矢印はＰＫＤ１に特異的な塩基が存在する場所を示す。

【図3-5】サンガー法を用いて決定した領域５の部分配列と対応する偽遺伝子配列とのアライメント結果を示す。領域５とは、表３に示すプライマー対５が増幅する領域を意味する。配列は、上から順に、マルチプレックスＰＣＲで得られた増幅産物についてサンガー法で決定した配列（Exon21(F)）、PKD1遺伝子の参照配列（PKD1(F)、及び６種類のPKD1偽遺伝子の配列（PKD1P1(F)〜PKD1P6(F)）である。（F）は、フォワード向きで配列が並べられていることを示す。黒矢印はPKD1に特異的な塩基が存在する場所を示す。

【図3-6】サンガー法を用いて決定した領域６の部分配列と対応する偽遺伝子配列とのアライメント結果を示す。領域６とは、表３に示すプライマー対６が増幅する領域を意味する。配列は、上から順に、マルチプレックスＰＣＲで得られた増幅産物についてサンガー法で決定した配列（Exon26(R)）、PKD1遺伝子の参照配列（PKD1(R)、及び６種類のPKD1偽遺伝子の配列（PKD1P1(R)〜PKD1P6(R)）である。（R）は、リバース向きで配列が並べられていることを示す。黒矢印はPKD1に特異的な塩基が存在する場所を示す。

【図3-7】サンガー法を用いて決定した領域７の部分配列と対応する偽遺伝子配列とのアライメント結果を示す。領域７とは、表３に示すプライマー対７が増幅する領域を意味する。配列は、上から順に、マルチプレックスＰＣＲで得られた増幅産物についてサンガー法で決定した配列（Exon30(F)）、PKD1遺伝子の参照配列（PKD1(F)、及び６種類のPKD1偽遺伝子の配列（PKD1P1(F)〜PKD1P6(F)）である。（F）は、フォワード向きで配列が並べられていることを示す。黒矢印はPKD1に特異的な塩基が存在する場所を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

１．プライマー、プライマー対、及びプライマーセット
ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを単一のＰＣＲサイクル条件で増幅することを可能にするプライマーセットが提供される。上記表１に示される１８のプライマー対を組み合わせて使用することにより、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを含む領域を、ＰＫＤ１遺伝子の偽遺伝子を増幅することなく、増幅させることができる。好適な一実施形態において、１８のプライマー対セットを用いることにより、単一のＰＣＲサイクル条件でＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを含む領域を増幅させることができる。

【0016】

表１は、左側の「プライマー対」の欄に示されるプライマー対が、中央の「プライマー」の欄に示される２種類のプライマー（フォワード及びリバース）を含むことを示す。また、表１は、「プライマー」の欄に示されたプライマーがその右側の「特異的認識領域」の欄に記載された領域に特異的に結合することを意味する。本書において「〜」を用いて示された数値範囲は、別段の表示をした場合を除き、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。

【0017】

配列番号３７の塩基配列は、National Center for Biotechnology Information（NCBI）にAccession No. NC_000016（version: NC_000016.9）で登録されている、ヒト第１６番染色体に存在するＰＫＤ１遺伝子の塩基配列である。配列番号３８の塩基配列は、、NCBIにAccession No．NC_000004（version: NC_000004.11）で登録されている、第４番染色体に存在するＰＫＤ２遺伝子の塩基配列である。

【0018】

特異的に認識するとは、ヒトのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行う場合に、プライマーがその特異的認識領域以外の領域に結合せず、実質的に特異的認識領域のみに結合することを意味する。より好ましくは、後述するＰＣＲを行う際の条件下で、ヒトのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合に、特異的認識領域にのみ結合することを意味する。

【0019】

プライマー対１に含まれるフォワードプライマー（１Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第48916位〜第48930位の領域、より好ましくは第48916位〜第48931位の領域、より好ましくは第48916位〜第48932位の領域、より好ましくは第48916位〜第48933位の領域、より好ましくは第48916位〜第48934位の領域、より好ましくは第48916位〜第48935位の領域、より好ましくは第48916位〜第48936位の領域、より好ましくは第48916位〜第48937位の領域、より好ましくは第48916位〜第48938位の領域、より好ましくは第48916位〜第48939位の領域、より好ましくは第48916位〜第48940位の領域、より好ましくは第48916位〜第48941位の領域、より好ましくは第48916位〜第48942位の領域、より好ましくは第48916位〜第48943位の領域、より好ましくは第48916位〜第48944位の領域である。

【0020】

具体的な１Ｆプライマーとしては、配列番号１の第１５位〜第２９位の塩基配列、好ましくは第１４位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第１３位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２９位の塩基配列、好ましくは第９位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２９位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２９位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。尚、配列表に示される各塩基配列は、５’末端の塩基が第１位の塩基である。

【0021】

プライマー対１に含まれるリバースプライマー（１Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第46427位〜第46413位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46412位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46411位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46410位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46409位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46408位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46407位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46406位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46405位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46404位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46403位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46402位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46401位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46400位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46399位の相補的領域、より好ましくは第46427位〜第46398位の相補的領域である。

【0022】

具体的な１Ｒプライマーとしては、配列番号２の第１６位〜３０位の塩基配列、好ましくは第１５位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１４位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１３位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第３０位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0023】

プライマー対２に含まれるフォワードプライマー（２Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第31431位〜第31445位の領域、より好ましくは第31431位〜第31446位の領域、より好ましくは第31431位〜第31447位の領域、より好ましくは第31431位〜第31448位の領域、より好ましくは第31431位〜第31449位の領域、より好ましくは第31431位〜第31450位の領域、より好ましくは第31431位〜第31451位の領域、より好ましくは第31431位〜第31452位の領域、より好ましくは第31431位〜第31453位の領域、より好ましくは第31431位〜第31454位の領域、より好ましくは第31431位〜第31455位の領域、より好ましくは第31431位〜第31456位の領域、より好ましくは第31431位〜第31457位の領域、より好ましくは第31431位〜第31458位の領域である。

【0024】

具体的な２Ｆプライマーとしては、配列番号３の第１４位〜第２８位の塩基配列、好ましくは第１３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２８位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0025】

プライマー対２に含まれるリバースプライマー（２Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第27875位〜第27861位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27860位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27859位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27858位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27857位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27856位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27855位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27854位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27853位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27852位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27851位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27850位の相補的領域、より好ましくは第27875位〜第27849位の相補的領域である。

【0026】

具体的な２Ｒプライマーとしては、配列番号４の第１３位〜第２７位の塩基配列、好ましくは第１２位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２７位の塩基配列の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0027】

プライマー対３に含まれるフォワードプライマー（３Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第27875位〜第27889位の領域、より好ましくは第27875位〜第27890位の領域、より好ましくは第27875位〜第27891位の領域、より好ましくは第27875位〜第27892位の領域、より好ましくは第27875位〜第27893位の領域、より好ましくは第27875位〜第27894位の領域、より好ましくは第27875位〜第27895位の領域、より好ましくは第27875位〜第27896位の領域、より好ましくは第27875位〜第27897位の領域、より好ましくは第27875位〜第27898位の領域、より好ましくは第27875位〜第27899位の領域、より好ましくは第27875位〜第27900位の領域、より好ましくは第27875位〜第27901位の領域、より好ましくは第27875位〜第27902位の領域である。

【0028】

具体的な３Ｆプライマーとしては、配列番号５の第１４位〜第２８位の塩基配列、好ましくは第１３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２８位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0029】

プライマー対３に含まれるリバースプライマー（３Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第24227位〜第24213位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24212位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24211位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24210位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24209位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24208位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24207位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24206位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24205位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24204位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24203位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24202位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24201位の相補的領域、より好ましくは第24227位〜第24200位の相補的領域である。

【0030】

具体的な３Ｒプライマーとしては、配列番号６の第１４位〜第２８位の塩基配列、好ましくは第１３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２８位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0031】

プライマー対４に含まれるフォワードプライマー（４Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第24247位〜第24261位の領域、より好ましくは第24247位〜第24262位の領域、より好ましくは第24247位〜第24263位の領域、より好ましくは第24247位〜第24264位の領域、より好ましくは第24247位〜第24265位の領域、より好ましくは第24247位〜第24266位の領域の領域である。

【0032】

具体的な４Ｆプライマーとしては、配列番号７の第６位〜第２０位の塩基配列、好ましくは第５位〜第２０位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２０位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２０位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２０位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２０位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0033】

プライマー対４に含まれるリバースプライマー（４Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第18933位〜第18919位の相補的領域、より好ましくは第18933位〜第18918位の相補的領域、より好ましくは第18933位〜第18917位の相補的領域、より好ましくは第18933位〜第18916位の相補的領域、より好ましくは第18933位〜第18915位の相補的領域、より好ましくは第18933位〜第18914位の相補的領域、より好ましくは第18933位〜第18913位の相補的領域、より好ましくは第18933位〜第18912位の相補的領域である。

【0034】

具体的な４Ｒプライマーとしては、配列番号８の第８位〜第２２位の塩基配列、好ましくは第７位〜第２２位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２２位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２２位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２２位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２２位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２２位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２２位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0035】

プライマー対５に含まれるフォワードプライマー（５Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第19226位〜第19240位の領域、より好ましくは第19226位〜第19241位の領域、より好ましくは第第19226位〜第19242位の領域、より好ましくは第19226位〜第19243位の領域、より好ましくは第19226位〜第19244位の領域、より好ましくは第19226位〜第19245位の領域、より好ましくは第19226位〜第19246位の領域、より好ましくは第19226位〜第19247位の領域、より好ましくは第19226位〜第19248位の領域、より好ましくは第19226位〜第19249位の領域、より好ましくは第19226位〜第19250位の領域、より好ましくは第19226位〜第19251位の領域、より好ましくは第19226位〜第19252位の領域、より好ましくは第19226位〜第19253位の領域である。

【0036】

具体的な５Ｆプライマーとしては、配列番号９の第１４位〜第２８位の塩基配列、好ましくは第１３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２８位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0037】

プライマー対５に含まれるリバースプライマー（５Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第16698位〜第16684位の相補的領域、より好ましくは第16698位〜第16683位の相補的領域、より好ましくは第16698位〜第16682位の相補的領域、より好ましくは第16698位〜第16681位の相補的領域、より好ましくは第16698位〜第16680位の相補的領域、より好ましくは第16698位〜第16679位の相補的領域、より好ましくは第16698位〜第16678位の相補的領域、より好ましくは第16698位〜第16677位の相補的領域、より好ましくは第16698位〜第16676位の相補的領域、より好ましくは第16698位〜第16675位の相補的領域である。

【0038】

具体的な５Ｒプライマーとしては、配列番号１０の第１０位〜第２４位の塩基配列、好ましくは第９位〜第２４位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２４位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２４位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２４位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２４位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２４位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２４位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２４位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２４位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0039】

プライマー対６に含まれるフォワードプライマー（６Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第16393位〜第16407位の領域、より好ましくは第16393位〜第16408位の領域、より好ましくは第16393位〜第16409位の領域、より好ましくは第16393位〜第16410位の領域、より好ましくは第16393位〜第16411位の領域、より好ましくは第16393位〜第16412位の領域、より好ましくは第16393位〜第16413位の領域、より好ましくは第16393位〜第16414位の領域、より好ましくは第16393位〜第16415位の領域、より好ましくは第16393位〜第16416位の領域、より好ましくは第16393位〜第16417位の領域、より好ましくは第16393位〜第16418位の領域である。

【0040】

具体的な６Ｆプライマーとしては、配列番号１１の第１２位〜第２６位の塩基配列、好ましくは第１１位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２６位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0041】

プライマー対６に含まれるリバースプライマー（６Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第12889位〜第12875位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12874位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12873位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12872位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12871位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12870位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12869位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12868位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12867位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12866位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12865位の相補的領域、より好ましくは第12889位〜第12864位の相補的領域である。

【0042】

具体的な６Ｒプライマーとしては、配列番号１２の第１２位〜第２６位の塩基配列、好ましくは第１１位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２６位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0043】

プライマー対７に含まれるフォワードプライマー（７Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第12193位〜第12207位の領域、より好ましくは第12193位〜第12208位の領域、より好ましくは第12193位〜第12209位の領域、より好ましくは第12193位〜第12210位の領域、より好ましくは第12193位〜第12211位の領域、より好ましくは第12193位〜第12212位の領域、より好ましくは第12193位〜第12213位の領域、より好ましくは第12193位〜第12214位の領域、より好ましくは第12193位〜第12215位の領域、より好ましくは第12193位〜第12216位の領域、より好ましくは第12193位〜第12217位の領域、より好ましくは第12193位〜第12218位の領域、より好ましくは第12193位〜第12219位の領域、より好ましくは第12193位〜第12220位の領域、より好ましくは第12193位〜第12221位の領域、より好ましくは第12193位〜第12222位の領域、より好ましくは第12193位〜第12223位の領域、より好ましくは第12193位〜第12224位の領域、より好ましくは第12193位〜第12225位の領域、より好ましくは第12193位〜第12226位の領域、より好ましくは第12193位〜第12227位の領域である。

【0044】

具体的な７Ｆプライマーとしては、配列番号１３の第２１位〜３５位の塩基配列、好ましくは第２０位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１９位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１８位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１７位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１６位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１５位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１４位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１３位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第３５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0045】

プライマー対７に含まれるリバースプライマー（７Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第8534位〜第8520位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8519位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8518位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8517位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8516位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8515位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8514位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8513位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8512位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8511位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8510位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8509位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8508位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8507位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8506位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8505位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8504位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8503位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8502位の相補的領域、より好ましくは第8534位〜第8501位の相補的領域である。

【0046】

具体的な７Ｒプライマーとしては、配列番号１４の第２０位〜３４位の塩基配列、好ましくは第１９位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１８位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１７位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１６位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１５位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１４位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１３位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第３４位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第３４位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0047】

プライマー対８に含まれるフォワードプライマー（８Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第6284位〜第6298位の領域、より好ましくは第6284位〜第6299位の領域、より好ましくは第6284位〜第6300位の領域、より好ましくは第6284位〜第6301位の領域、より好ましくは第6284位〜第6302位の領域、より好ましくは第6284位〜第6303位の領域、より好ましくは第6284位〜第6304位の領域、より好ましくは第6284位〜第6305位の領域、より好ましくは第6284位〜第6306位の領域、より好ましくは第6284位〜第6307位の領域、より好ましくは第6284位〜第6308位の領域、より好ましくは第6284位〜第6309位の領域、より好ましくは第6284位〜第6310位の領域、より好ましくは第6284位〜第6311位の領域、より好ましくは第6284位〜第6312位の領域、より好ましくは第6284位〜第6313位の領域である。

【0048】

具体的な８Ｆプライマーとしては、配列番号１５の第１６位〜３０位の塩基配列、好ましくは第１５位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１４位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１３位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第３０位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0049】

プライマー対８に含まれるリバースプライマー（８Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第3261位〜第3247位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3246位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3245位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3244位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3243位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3242位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3241位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3240位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3239位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3238位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3237位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3236位の相補的領域、より好ましくは第3261位〜第3235位の領域である。

【0050】

具体的な８Ｒプライマーとしては、配列番号１６の第１３位〜第２７位の塩基配列、好ましくは第１２位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２７位の塩基配列の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0051】

プライマー対９に含まれるフォワードプライマー（９Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第3525位〜第3539位の領域、より好ましくは第3525位〜第3540位の領域、より好ましくは第3525位〜第3541位の領域、より好ましくは第3525位〜第3542位の領域、より好ましくは第3525位〜第3543位の領域、より好ましくは第3525位〜第3544位の領域、より好ましくは第3525位〜第3545位の領域、より好ましくは第3525位〜第3546位の領域、より好ましくは第3525位〜第3547位の領域、より好ましくは第3525位〜第3548位の領域、より好ましくは第3525位〜第3549位の領域、より好ましくは第3525位〜第3550位の領域、より好ましくは第3525位〜第3551位の領域、より好ましくは第3525位〜第3552位の領域、より好ましくは第3525位〜第3553位の領域、より好ましくは第3525位〜第3554位の領域、より好ましくは第3525位〜第3555位の領域、より好ましくは第3525位〜第3556位の領域、より好ましくは第3525位〜第3557位の領域、より好ましくは第3525位〜第3558位の領域、より好ましくは第3525位〜第3559位の領域である。

【0052】

具体的な９Ｆプライマーとしては、配列番号１７の第２１位〜３５位の塩基配列、好ましくは第２０位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１９位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１８位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１７位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１６位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１５位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１４位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１３位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第３５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第３５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0053】

プライマー対９に含まれるリバースプライマー（９Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号37の第28位〜第14位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第13位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第12位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第11位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第10位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第9位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第8位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第7位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第6位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第5位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第4位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第3位の相補的領域、より好ましくは第28位〜第2位の領域、より好ましくは第28位〜第1位の相補的領域である。

【0054】

具体的な９Ｒプライマーとしては、配列番号１８の第１４位〜第２８位の塩基配列、好ましくは第１３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２８位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0055】

プライマー対１０に含まれるフォワードプライマー（１０Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第25位〜第11位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第10位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第9位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第8位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第7位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第6位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第5位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第4位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第3位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第2位の相補的領域、より好ましくは第25位〜第1位の相補的領域である。

【0056】

具体的な１０Ｆプライマーとしては、配列番号１９の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0057】

プライマー対１０に含まれるリバースプライマー（１０Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第1537位〜第1551位の領域、より好ましくは第1537位〜第1552位の領域、より好ましくは第1537位〜第1553位の領域、より好ましくは第1537位〜第1554位の領域、より好ましくは第1537位〜第1555位の領域、より好ましくは第1537位〜第1556位の領域、より好ましくは第1537位〜第1557位の領域、より好ましくは第1537位〜第1558位の領域、より好ましくは第1537位〜第1559位の領域、より好ましくは第1537位〜第1560位の領域、より好ましくは第1537位〜第1561位の領域である。

【0058】

具体的な１０Ｒプライマーとしては、配列番号２０の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0059】

プライマー対１１に含まれるフォワードプライマー（１１Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第11432位〜第11418位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11417位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11416位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11415位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11414位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11413位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11412位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11411位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11410位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11409位の相補的領域、より好ましくは第11432位〜第11408位の相補的領域である。

【0060】

具体的な１１Ｆプライマーとしては、配列番号２１の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0061】

プライマー対１１に含まれるリバースプライマー（１１Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第12623位〜第12637位の領域、より好ましくは第12623位〜第12638位の領域、より好ましくは第12623位〜第12639位の領域、より好ましくは第12623位〜第12640位の領域、より好ましくは第12623位〜第12641位の領域、より好ましくは第12623位〜第12642位の領域、より好ましくは第12623位〜第12643位の領域、より好ましくは第12623位〜第12644位の領域、より好ましくは第12623位〜第12645位の領域、より好ましくは第12623位〜第12646位の領域、より好ましくは第12623位〜第12647位の領域である。

【0062】

具体的な１１Ｒプライマーとしては、配列番号２２の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0063】

プライマー対１２に含まれるフォワードプライマー（１２Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第28901位〜第28887位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28886位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28885位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28884位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28883位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28882位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28881位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28880位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28879位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28878位の相補的領域、より好ましくは第28901位〜第28877位の相補的領域である。

【0064】

具体的な１２Ｆプライマーとしては、配列番号２３の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0065】

プライマー対１２に含まれるリバースプライマー（１２Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第31264位〜第31278位の領域、より好ましくは第31264位〜第31279位の領域、より好ましくは第31264位〜第31280位の領域、より好ましくは第31264位〜第31281位の領域、より好ましくは第31264位〜第31282位の領域、より好ましくは第31264位〜第31283位の領域、より好ましくは第31264位〜第31284位の領域、より好ましくは第31264位〜第31285位の領域、より好ましくは第31264位〜第31286位の領域、より好ましくは第31264位〜第31287位の領域、より好ましくは第31264位〜第31288位の領域、より好ましくは第31264位〜第31289位の領域、より好ましくは第31264位〜第31290位の領域、より好ましくは第31264位〜第31291位の領域、より好ましくは第31264位〜第31292位の領域、より好ましくは第31264位〜第31293位の領域、より好ましくは第31264位〜第31294位の領域である。

【0066】

具体的な１２Ｒプライマーとしては、配列番号２４の第１７位〜３１位の塩基配列、好ましくは第１６位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第１５位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第１４位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第１３位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第３１位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第３１位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0067】

プライマー対１３に含まれるフォワードプライマー（１３Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第35718位〜第35704位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35703位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35702位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35701位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35700位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35699位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35698位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35697位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35696位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35695位の相補的領域、より好ましくは第35718位〜第35694位の相補的領域である。

【0068】

具体的な１３Ｆプライマーとしては、配列番号２５の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0069】

プライマー対１３に含まれるリバースプライマー（１３Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第39836位〜第39850位の領域、より好ましくは第39836位〜第39851位の領域、より好ましくは第39836位〜第39852位の領域、より好ましくは第39836位〜第39853位の領域、より好ましくは第39836位〜第39854位の領域、より好ましくは第39836位〜第39855位の領域、より好ましくは第39836位〜第39856位の領域、より好ましくは第39836位〜第39857位の領域、より好ましくは第39836位〜第39858位の領域、より好ましくは第39836位〜第39859位の領域、より好ましくは第39836位〜第39860位の領域、より好ましくは第39836位〜第39861位の領域、より好ましくは第39836位〜第39862位の領域、より好ましくは第39836位〜第39863位の領域、より好ましくは第39836位〜第39864位の領域、より好ましくは第39836位〜第39865位の領域である。

【0070】

具体的な１３Ｒプライマーとしては、配列番号２６の第１６位〜３０位の塩基配列、好ましくは第１５位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１４位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１３位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第３０位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0071】

プライマー対１４に含まれるフォワードプライマー（１４Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第44259位〜第44245位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44244位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44243位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44242位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44241位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44240位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44239位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44238位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44237位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44236位の相補的領域、より好ましくは第44259位〜第44235位の相補的領域である。

【0072】

具体的な１４Ｆプライマーとしては、配列番号２７の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0073】

プライマー対１４に含まれるリバースプライマー（１４Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第45415位〜第45429位の領域、より好ましくは第45415位〜第45430位位の領域、より好ましくは第45415位〜第45431位の領域、より好ましくは第45415位〜第45432位の領域、より好ましくは第45415位〜第45433位の領域、より好ましくは第45415位〜第45434位の領域、より好ましくは第45415位〜第45435位の領域、より好ましくは第45415位〜第45436位の領域、より好ましくは第45415位〜第45437位の領域、より好ましくは第45415位〜第45438位の領域、より好ましくは第45415位〜第45439位の領域、より好ましくは第45415位〜第45440位の領域である。

【0074】

具体的な１４Ｒプライマーとしては、配列番号２８の第１２位〜第２６位の塩基配列、好ましくは第１１位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２６位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0075】

プライマー対１５に含まれるフォワードプライマー（１５Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第47754位〜第47740位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47739位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47738位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47737位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47736位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47735位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47734位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47733位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47732位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47731位の相補的領域、より好ましくは第47754位〜第47730位の相補的領域である。

【0076】

具体的な１５Ｆプライマーとしては、配列番号２９の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0077】

プライマー対１５に含まれるリバースプライマー（１５Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第52221位〜第52235位の領域、より好ましくは第52221位〜第52236位の領域、より好ましくは第52221位〜第52237位の領域、より好ましくは第52221位〜第52238位の領域、より好ましくは第52221位〜第52239位の領域、より好ましくは第52221位〜第52240位の領域、より好ましくは第52221位〜第52241位の領域、より好ましくは第52221位〜第52242位の領域、より好ましくは第52221位〜第52243位の領域、より好ましくは第52221位〜第52244位の領域、より好ましくは第52221位〜第52245位の領域である。

【0078】

具体的な１５Ｒプライマーとしては、配列番号３０の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0079】

プライマー対１６に含まれるフォワードプライマー（１６Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第53806位〜第53792位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53791位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53790位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53789位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53788位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53787位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53786位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53785位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53784位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53783位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53782位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53781位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53780位の相補的領域、より好ましくは第53806位〜第53779位の相補的領域である。

【0080】

具体的な１６Ｆプライマーとしては、配列番号３１の第１４位〜第２８位の塩基配列、好ましくは第１３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２８位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２８位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0081】

プライマー対１６に含まれるリバースプライマー（１６Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第55288位〜第55302位の領域、より好ましくは第55288位〜第55303位の領域、より好ましくは第55288位〜第55304位の領域、より好ましくは第55288位〜第55305位の領域、より好ましくは第55288位〜第55306位の領域、より好ましくは第55288位〜第55307位の領域、より好ましくは第55288位〜第55308位の領域、より好ましくは第55288位〜第55309位の領域、より好ましくは第55288位〜第553010位の領域、より好ましくは第55288位〜第55311位の領域、より好ましくは第55288位〜第55312位の領域である。

【0082】

具体的な１６Ｒプライマーとしては、配列番号３２の第１１位〜第２５位の塩基配列、好ましくは第１０位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２５位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２５位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0083】

プライマー対１７に含まれるフォワードプライマー（１７Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第57914位〜第57900位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57899位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57898位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57897位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57896位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57895位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57894位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57893位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57892位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57891位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57890位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57889位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57888位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57887位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57886位の相補的領域、より好ましくは第57914位〜第57885位の相補的領域である。

【0084】

具体的な１７Ｆプライマーとしては、配列番号３３の第１６位〜３０位の塩基配列、好ましくは第１５位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１４位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１３位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１２位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第３０位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第３０位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0085】

プライマー対１７に含まれるリバースプライマー（１７Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第60808位〜第60822位の領域、より好ましくは第60808位〜第60823位の領域、より好ましくは第60808位〜第60824位の領域、より好ましくは第60808位〜第60825位の領域、より好ましくは第60808位〜第60826位の領域、より好ましくは第60808位〜第60827位の領域、より好ましくは第60808位〜第60828位の領域、より好ましくは第60808位〜第60829位の領域、より好ましくは第60808位〜第60830位の領域、より好ましくは第60808位〜第60831位の領域、より好ましくは第60808位〜第60832位の領域、より好ましくは第60808位〜第60833位の領域である。

【0086】

具体的な１７Ｒプライマーとしては、配列番号３４の第１２位〜第２６位の塩基配列、好ましくは第１１位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２６位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0087】

プライマー対１８に含まれるフォワードプライマー（１８Ｆ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第67328位〜第67314位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67313位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67312位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67311位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67310位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67309位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67308位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67307位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67306位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67305位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67304位の相補的領域、より好ましくは第67328位〜第67303位の相補的領域である。

【0088】

具体的な１８Ｆプライマーとしては、配列番号３５の第１２位〜第２６位の塩基配列、好ましくは第１１位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２６位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２６位の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0089】

プライマー対１８に含まれるリバースプライマー（１８Ｒ）が特異的に認識する塩基配列は、好ましくは配列番号38の第68792位〜第68806位の領域、より好ましくは第68792位〜第68807位の領域、より好ましくは第68792位〜第68808位の領域、より好ましくは第68792位〜第68809位の領域、より好ましくは第68792位〜第68810位の領域、より好ましくは第68792位〜第68811位の領域、より好ましくは第68792位〜第68812位の領域、より好ましくは第68792位〜第68813位の領域、より好ましくは第68792位〜第68814位の領域、より好ましくは第68792位〜第68815位の領域、より好ましくは第68792位〜第68816位の領域、より好ましくは第68792位〜第68817位の領域、より好ましくは第68792位〜第68818位の領域である。

【0090】

具体的な１８Ｒプライマーとしては、配列番号３６の第１３位〜第２７位の塩基配列、好ましくは第１２位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第１１位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第１０位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第９位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第８位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第７位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第６位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第５位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第４位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第３位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第２位〜第２７位の塩基配列、より好ましくは第１位〜第２７位の塩基配列の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0091】

上記に例示される１Ｆプライマー〜１８Ｒプライマーが有する具体的な塩基配列は、ＰＣＲを実施する条件下で、それぞれの特異的認識領域を特異的に認識でき、好ましくは単一の反応容器内で使用されるプライマー同士のアニーリング及びセルフアニーリングが生じない限り、１又は数個の塩基が他の塩基にされていても良く、１又は数個の塩基が３’末端又は５’末端に付加されていてもよい。ここで、数個とは、例えば、２〜３個である。プライマーに１又は数個の塩基が付加される場合は、プライマーの５’末端に付加されることが好ましい。好適な一実施形態において、１Ｆプライマー〜１８Ｒプライマーは、３’末端の配列として、それぞれについて上述する具体的な塩基配列を有することが好ましい。

【0092】

上記に例示される１Ｆプライマー〜１８Ｒプライマーが有する具体的な塩基配列の１又は数個の塩基が他の塩基に置換された塩基配列は、置換される前の塩基配列（即ち、配列番号に示される塩基配列）との同一性が、好ましくは７０％以上であり、より好ましくは７５％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上である。

【0093】

上記１Ｆプライマー〜１８Ｒプライマーが有する具体的な塩基配列の１又は数個の塩基配列方の塩基に置換される場合は、次の塩基は置換されないことが好ましい：配列番号４で示される塩基配列における第２７位及び第２３位の塩基（２Ｒプライマー）、配列番号５で示される塩基配列における第２８位及び９位の塩基（３Ｆプライマー）、配列番号７で示される塩基配列の第２０位の塩基（４Ｆプライマー）、配列番号８で示される塩基配列２２位の塩基（４Ｒプライマー）、配列番号１０で示される塩基配列の第２４位の塩基（５Ｒプライマー）、配列番号１２で示される塩基配列の第２６位、第２３位、第１１位及び第２位の塩基（６Ｒプライマー）、並びに、配列番号１３で示される塩基配列の第３５位及び３４位の塩基（７Ｆプライマー）。

【0094】

各プライマーの長さは、対応する特異的認識領域を特異的に認識可能であり、プライマー同士でのハイブリダイゼーションが生じない限り特に制限されないが、好ましくは１５塩基以上４０塩基以下である。より好ましくは、プライマーの長さの下限は、１６塩基以上、更に好ましくは、１７塩基以上、更に好ましくは１８塩基以上である。より好ましくはプライマーの長さの上限は、３９塩基以下であり、更に好ましくは３８塩基以下であり、更に好ましくは ３７塩基以下である。

【0095】

単一のＰＣＲサイクル条件下で全ての必要なＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子のエクソン全てを増幅させるという観点から、プライマーセットに含まれるプライマーは、それらのＴｍ値の差が小さいことが好ましい。例えば、プライマーセットに含まれるプライマーのＴｍ値の差は、５℃以内であることが好ましくは、より好ましくは４℃以内であり、更に好ましくは３．６℃以内である。

【0096】

上記１Ｆプライマー〜１８Ｒプライマーは、各プライマーが特異的に認識する領域の塩基配列に応じて設計されることが好ましい。例えば、各プライマーのＧＣ含量は約４０〜７５％であり、単一の反応容器内で使用される各プライマー同士がアニーリングしないように（例えば、３’末端で３塩基以上相補的な配列がない）、及び／又は自己相補的な配列を含まないように設計されることが好ましい。

【0097】

プライマー対１によって増幅される領域には、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン１が含まれる。プライマー対２によって増幅される領域には、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン２〜８が含まれる。プライマー対３によって増幅される領域には、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン９〜１３が含まれる。プライマー対４によって増幅される領域には、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン１４〜１６が含まれる。プライマー対５によって増幅される領域には、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン１７〜２１が含まれる。プライマー対６によって増幅される領域には、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン２２〜２６が含まれる。プライマー対７によって増幅される領域には、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン２７〜３４が含まれる。プライマー対８によって増幅される領域には、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン３５〜４１が含まれる。プライマー対９によって増幅される領域には、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン４１〜４６が含まれる。

【0098】

プライマー対１０によって増幅される領域には、ＰＫＤ２遺伝子のエクソン１が含まれる。プライマー対１１によって増幅される領域には、ＰＫＤ２遺伝子のエクソン２が含まれる。プライマー対１２によって増幅される領域には、ＰＫＤ２遺伝子のエクソン３及び４が含まれる。プライマー対１３によって増幅される領域には、ＰＫＤ２遺伝子のエクソン５及び６が含まれる。プライマー対１４によって増幅される領域には、ＰＫＤ２遺伝子のエクソン７が含まれる。プライマー対１５によって増幅される領域には、ＰＫＤ２遺伝子のエクソン８及び９が含まれる。プライマー対１６によって増幅される領域には、ＰＫＤ２遺伝子のエクソン１０が含まれる。プライマー対１７によって増幅される領域には、ＰＫＤ２遺伝子のエクソン１１〜１３が含まれる。プライマー対１８によって増幅される領域には、ＰＫＤ２遺伝子のエクソン１４及び１５が含まれる。

【0099】

従って、ＰＫＤ１遺伝子の全てのエクソンを増幅させるために、プライマー対１〜９を含むプライマーセットを利用することができる。また、ＰＫＤ１遺伝子の全てエクソンを増幅する必要がない場合は、目的とするエクソンの増幅に必要なプライマー対のみを選択し、それらを組み合わせて使用することができる。同様に、ＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを増幅させるために、プライマー対１０〜１８を含むプライアーセットを利用することができる。また、ＰＫＤ２遺伝子の全てのエクソンを増幅する必要がない場合は、目的とするエクソンの増幅に必要なプライマー対のみを選択し、それらを組み合わせて使用することができる。よって、目的に応じて、プライマー対１〜１８を任意に組み合わせたプライマーセットが想定される。更に、後述するような追加的なＰＣＲを実施することが想定される場合は、プライマー対の組み合わせは、追加的なＰＣＲに使用するプライマー対を更に含んでいても良い。

【0100】

プライマーとして利用するオリゴヌクレオチドは、化学合成することができ、例えば、凡用のＤＮＡ合成装置を用いて合成することが効率的である。１Ｆプライマー〜１８Ｒプライマーは、任意の状態で保管することができる。例えば、１Ｆプライマー〜１８Ｒプライマーは、乾燥又は凍結乾燥された状態、又は、ＰＣＲでの使用に適した溶液（例えば、緩衝液）中で保管することができる。プライマーを含む溶液は、必要に応じて、プライマーの安定化剤等を含んでいても良い。

【0101】

１Ｆプライマー〜１８Ｒプライマー、又は、それらの任意の組み合わせとＰＣＲに用いる試薬及び／又は容器等と組み合わせてキットを提供することができる。例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、マグネシウム及び、ＰＣＲ用緩衝液、並びに、それらの品質を適切に保持可能な保存容器等と組み合わせたキットを提供することができる。キットに含まれるプライマーは、プライマー毎に別個の容器に収容されていてもよく、プライマー対毎に別個の容器に収容されていてもよく、後述するプライマー対の組み合わせ毎に別個の容器に収容されていても良い。また、後述するような追加的なＰＣＲを実施することが想定される場合は、キットは、追加的なＰＣＲに使用するプライマー対を更に含んでいても良い。

【0102】

２．ＰＫＤ１遺伝子及び／又はＰＫＤ２遺伝子のエクソンの増幅方法
プライマー対１〜１８のいずれか又はその任意の組み合わせを用いてＰＣＲを行うことにより、ＰＫＤ１遺伝子及び／又はＰＫＤ２遺伝子の目的のエクソンを増幅することができる。ＰＣＲは、常法に準じて行うことができ、例えば、市販されているＰＣＲ装置及びロングレンジＰＣＲ用キット等を用いて、そのマニュアルに従って実施することができる。具体的に、ＰＣＲは、下記の工程（１）〜（５）のいずれか、任意の組み合わせ、又は全てを含むことができる。下記の工程（３）及び（４）は、同一の温度条件で行うことが可能であり、一実施形態において、工程（３）及び（４）は同一の温度条件で同時に（連続的に）行うことが好ましい。
（１）鋳型ＤＮＡ、プライマー対、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンを含むヌクレオチドを含む反応液を調製する工程；
（２）反応液を所定の温度に加熱し、２本鎖の鋳型ＤＮＡを２本の１本鎖に解離させる熱変性工程；
（３）反応液を所定の温度に冷却し、プライマー対を構成する各プライマーを、一本鎖の鋳型ＤＮＡにおける各々の特異的認識領域に結合させるアニーリング工程；
（４）反応液を所定の温度で維持し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに、プライマーを起点として鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成させる伸長工程；及び／又は
（５）所定量の増幅産物（目的とするエクソンに相当するＤＮＡ）が得られるまで、工程（２）〜（４）を繰り返す工程
鋳型ＤＮＡには、ヒトゲノムＤＮＡを用いることが好ましい。ヒトゲノムＤＮＡは、被検体から採取した血液又は他の任意の組織から市販されるＤＮＡ抽出キット等を用いて容易に取得することができる。被検体は、特に制限されないが、好ましくは、多発性嚢胞腎を発症していることが疑われるヒト、或いは遺伝的にＰＫＤ１遺伝子又はＰＫＤ２遺伝子に変異が存在する可能性が比較的高いと考えられるヒトを挙げることができる。

【0103】

ＰＣＲ用の反応液や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、任意であり、市販するＰＣＲ用キットに含まれるものを使用することができる。反応液としては、ＰＣＲ用に通常用いることが知られている任意の緩衝液を使用することができ、例えば、トリス−塩酸緩衝液、トリス−硫酸緩衝液、及びトリシン緩衝液等を挙げることができる。耐熱性ポリメラーゼとしては、例えば、Taq DNAポリメラーゼ（例えば、FastStart Taq DNA Polymerase（Roche）、Ex Taq（登録商標）（Takara）、Z-Taq、AccuPrime Taq DNA Polymerase、M-PCRキット（QIAGEN）等）又はKOD DNAポリメラーゼ等を用いることが出来る。

【0104】

使用するプライマー及び鋳型ＤＮＡ等の量は、使用するＰＣＲキット及び装置に応じて調整することができる。プライマーは、通常、ＰＣＲ反応溶液中の濃度が０．１〜０．５μＭとなるように添加される。鋳型となるヒトゲノムＤＮＡは、例えば、反応溶液５０μｌ中に２５〜１５０ｎｇ程度添加される。

【0105】

ＰＣＲサイクル条件は、目的とするＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子のエクソンの増幅が可能である限り特に制限されない。例えば、熱変性の温度は９２〜１００℃ 、好ましくは９４〜９８℃に設定することができる。熱変性時間は、例えば、５〜１８０秒、好ましくは１０〜１３０秒に設定することができる。プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング温度は、例えば、６２〜８０℃ 、好ましくは６４〜７８℃に設定することができる。アニーリング時間は、例えば１０〜６０秒、好ましくは２０〜３０秒に設定することができる。伸長反応の温度は、例えば、６２〜８０℃、好ましくは、６４〜７８℃に設定することができる。伸張反応の時間は、例えば、４〜１５分、好ましくは４〜１０分に設定することができる。アニーリング及び伸長反応は同一の条件で行うことができる。熱変性、アニーリング及び伸張反応を組み合わせた操作を１サイクルとし、それを必要な量の増幅産物が得られるまで繰り返すことができる。例えば、サイクル数は、３０〜４０回、好ましくは３０〜３５回程度に設定することができる。

【0106】

本書において、「ＰＣＲサイクル条件」には、ＰＣＲの熱変性、アニーリング、及び伸張反応の温度及び時間に関する条件並びにサイクル数のいずれか、任意の組み合わせ、又は全てが含まれる。ＰＣＲサイクル条件の設定には、後述する実施例に示すように、非特異的な増幅を抑制するという観点からタッチダウンＰＣＲ法を利用することも好ましい。タッチダウンＰＣＲとは、最初のアニーリング温度を比較的高めに設定しておき、１サイクルごとに少しずつアニーリング温度を下げ、途中からは一般的なＰＣＲと同様に行うという手法である。また、非特異的な増幅を抑制するという観点からシャトルＰＣＲを利用することも好ましい。シャトルＰＣＲとは、アニーリングと伸長反応とは同じ温度で行うＰＣＲである。

【0107】

ＰＣＲサイクル条件は、プライマー対毎に異なる条件を設定することができるが、操作性及び効率性の観点から、異なるプライマー対間で同じＰＣＲサイクル条件が使用できるように設計し、必要な増幅産物を得るために用いるＰＣＲサイクル条件のバリエーションができる限り少なくなるようにＰＣＲサイクル条件を設定することが好ましい。ＰＣＲサイクル条件のバリエーションは、好ましくは５以下であり、より好ましくは４以下、更に好ましくは３以下、更に好ましくは２以下、更に好ましくは１である。必要な全ての増幅産物を得るために必要なＰＣＲサイクル条件のバリエーションを少なくすることにより、同一のＰＣＲサイクル条件を用いるＰＣＲを一つのＰＣＲ装置で同時に実施することができるため、より少ない資源を用いて短時間で目的の増幅産物を得ることができる。

【0108】

ＰＣＲは、プライマー対毎に別個の反応容器内で実施しても良いが、操作性及び効率性の観点から、複数の異なるプライマー対を用いたＰＣＲを単一の反応容器内で実施すること（マルチプレックスＰＣＲ）が好ましい。異なるプライマー対を用いたＰＣＲを単一の反応容器内で実施する場合、プライマー間でのアニーリングが生じないように注意することが好ましい。このような観点から、単一の反応容器内で使用することが好ましいプライマー対の組み合わせとしては、下記の（Ａ）〜（Ｇ）を挙げることができる。
組み合わせ（Ａ）：プライマー対２及び１２
組み合わせ（Ｂ）：プライマー対４及び１７
組み合わせ（Ｃ）：プライマー対６及び１５
組み合わせ（Ｄ）：プライマー対１、５及び／又は９
組み合わせ（Ｅ）：プライマー対３、８及び／又は１８
組み合わせ（Ｆ）：プライマー対７、１３及び／又は１６
組み合わせ（Ｇ）：プライマー対１０、１１及び／又は１４
組み合わせ（Ｄ）は、プライマー対１、５及び／又は９であるが、好ましくはプライマー対１、５、及び９である。組み合わせ（Ｆ）は、プライマー対７、１３及び／又は１７であるが、好ましくはプライマー対７、１３及び１７である。組み合わせ（Ｇ）は、プライマー対１０、１１及び／又は１４であるが、好ましくはプライマー対１０、１１及び１４である。

【0109】

上記の組み合わせ（Ａ）〜（Ｇ）は、全てを採用する必要はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、組み合わせ（Ａ）〜（Ｇ）から成る群より選択される１つ以上を採用することができ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、より好ましくは４つ以上、より好ましくは５つ以上、より好ましくは６つ以上、より好ましくは全てを採用することができる。全てのプライマー対毎に別個のＰＣＲ反応容器（例えば、チューブ）を準備する場合、１８個のＰＣＲ反応容器が必要となるが、組み合わせ（Ａ）〜（Ｇ）を全て採用すると、必要な反応容器は７個に減らすことができる。必要な反応容器の数を減らすことは、経済的であるだけでなく、一度に増幅できる検体数を増加させることができるため好ましい。

【0110】

プライマー対１〜１８を用いてヒトゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の全エクソンを含む領域を増幅させることができるが、必要に応じて、更なるＰＣＲを組み合わせても良い。例えば、ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ装置、増幅領域に含まれるＧＣ含有率、増幅領域のサイズ、及びＰＣＲサイクル条件等によっては、十分な量の増幅産物が均等に得られない場合がある。そのような場合、使用する増幅産物の解析手段によっては、更なる増幅が望ましい場合があり、必要に応じて、追加的なＰＣＲを行うことができる。

【0111】

例えば、プライマー対１によって増幅される領域のＧＣ含有率は比較的高いため、他のプライマー対と同じＰＣＲサイクル条件で同時にＰＣＲを行うと、プライマー対１によって得られる増幅産物の量が相対的に少ない場合があり得る。そのような場合は、配列の解析に使用する次世代シークエンサーの種類によっては、プライマー対１による増幅産物を鋳型として、更なるＰＣＲを行い、増幅産物の量を調整することが好ましい。プライマー対１による増幅産物を鋳型としてＰＣＲを行う場合に使用するプライマーは、特に制限されず、任意に設計することができる。

【0112】

追加的なＰＣＲは、市販されるＰＣＲ装置及びＰＣＲ試薬等を用いて実施することができる。追加的ＰＣＲのＰＣＲサイクル条件は任意であり、増幅する領域、使用するプライマー、及び試薬等の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、上述のプライマー対１〜１９を用いる場合のＰＣＲサイクル条件と同じ条件やそれを改良した条件を設定することができる。

【0113】

ＰＣＲによって得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって、被検体のＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子に変異（遺伝子多型）が存在するか否かを特定することができる。塩基配列の解析は、公知のシークエンシング技術を用いて実施することができる。例えば、サンガー法、ＤＨＰＬＣ（denaturing high-pressure liquid chromatography）法、エンドヌクレアーゼとＤＨＰＬＣとを組み合わせた変異検出法、及び次世代シークエンサーを用いたＰＫＤ１遺伝子及びＰＫＤ２遺伝子の変異検出方法が知られているため、これらを利用して変異の存在を検出することができる。塩基配列の解析に先立ち、必要に応じて、増幅産物を濃縮することもできる。増幅は、例えば、増幅産物を断片化し、ライブラリを調整して、エマルジョンＰＣＲを利用して実施することができる。また、増幅産物の濃縮は、例えば、固相増幅（ブリッジ増幅）と呼ばれる手法で実施することができる。

【0114】

塩基配列の解析の結果、遺伝子多型が検出された場合は、その被検体は、多発性嚢胞腎を発症するリスクが高いと判断することができる。また、既に多発性嚢胞腎を発症していると疑われる被検体については、遺伝子多型の存在を、多発性嚢胞腎を発症しているとの診断に役立てることができる。更に、遺伝子多型がＰＫＤ１遺伝子に存在することが確認された場合は、多発性嚢胞腎の進行速度（発症した場合）が比較的早いと判断するために役立てることができる。多発性嚢胞腎を発症しているかそのリスクが高いと判断された場合、症状の悪化又は発症を遅延させるために適切な治療又は処置を施すことができる。

【実施例】

【0115】

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されない。

【0116】

１．検体
超音波検査にて腎臓に嚢胞が認められず、確実にPKDの素因が否定された35歳以上の健康成人（男女は問わない）から採取した140例の検体を用いて試験を行った。本書では、140例のうち6検体についての解析結果を代表例として示す。DNA検体は次の手順で採取した。健康成人より末梢血7mLを真空採血管に採取し、2〜3回静かに転倒混和した後、採血実施施設の冷凍庫内で冷凍保管した。冷凍保管された血液から、QIAamp DNA Blood Maxi キット（キアゲン社）を用いてゲノムDNAを抽出し、これを検体DNAとした。

【0117】

２．プライマーの設計及び混合
下記表２及び３に示す塩基配列を有する、PKD1遺伝子増幅用プライマー（９ペア）及びPKD2遺伝子増幅用プライマー（９ペア）を設計して合成した。

【0118】

【表2】

【0119】

（PKD1用プライマーの表）

【0120】

【表3】

【0121】

（PKD2用プライマーの表）
表２及び３において、「Start」欄に示される数字は、各プライマーの５’末端塩基がハイブリダイズする染色体ＤＮＡ（表２の場合は配列番号３７に示される塩基配列、表３の場合は配列番号３８に示される塩基配列）の塩基の位置を示す。同様に「End」の欄に示される数字は、各プライマーの３’末端の塩基がハイブリダイズする染色体ＤＮＡの塩基の位置示す。「Exon」の欄に示される数字は、各プライマーペアによって増幅される領域に含まれるエクソンの番号を示す。「Size」の欄に示される数字は、増幅される領域の大きさ（塩基数）を示す。「From」の欄に示される数字は、増幅される領域の５’末端の塩基が対応する染色体ＤＮＡの塩基の位置を示す。「To」の欄に示される数字は、増幅される領域の３’末端の塩基が対応する染色体ＤＮＡの塩基の位置を示す。

【0122】

表２及び３に示す各プライマーを３０μMの濃度で別個に含む溶液を作成し、それらを下記表４に示す組み合わせで混合し、マルチプレックスPCR用のプライマーミックスを調製した。

【0123】

【表4】

【0124】

３．マルチプレックスPCR
上記１において健康成人から採取した10種類の検体DNAについて、上記２で調製したプライマーミックス及びマルチプレックスPCR用の試薬（SequalPrep Long PCR Kit with dNTPs, Life Technologies社）を用い、サーマルサイクラー（Veriti 96Well Thermal Cycler, Life Technologies社）でマルチプレックスPCRを実施した。具体的には次の手順で行った。反応容器内に、緩衝液、DMSO、エンハンサー、DNA合成酵素、滅菌水、プライマーミックス、鋳型DNA（検体DNA）を加えた。プライマーミックスは7種類（A〜G）あるため、1検体当たり7ウェルを用い、各ウェルにいずれかのプライマーミックスを添加した。鋳型DNAは各ウェルに100ngを添加し、1ウェルあたりの反応液の総量は50μLとなるように調製した。反応液の組成を下記表５に示す。

【0125】

【表5】

【0126】

図１に示す条件でPCRを行った。即ち、サーマルサイクラーを用いて94℃で2分間加熱し、二本鎖の鋳型DNAを熱変性させた。次に、98℃での熱変性を10秒間行った後、74℃で5分間、アニーリング反応及び伸長反応を行った。この操作を更に2回繰り返し、その都度アニーリング温度を2℃ずつ低下させた。その後は98℃での熱変性を10秒間行った後、68℃で5分間反応させるサイクル反応を30サイクル行い、最後に68℃で7分間反応させ全体の反応を完了した。得られた増幅産物の存在及び大きさを1%アガロースゲルを用いた電気泳動で確認した（図２）。電気泳動では、λ/HindIII digestを分子マーカーとして用いた。また、各増幅産物を磁気ビーズ精製試薬（Agencourt AmpureXP, Beckman Coulter）を用いて精製し、40uLの精製水に溶解して、超微量紫外・可視分光光度計（Nanodrop, Thermo Scientific）を用いて濃度を測定した。測定された濃度は、最小の増幅産物で21.7ng/μL、最大で92.1ng/μLであった。

【0127】

４．ライブラリの調製
上記３．のマルチプレックスPCRにより、1検体あたり7種類の増幅産物混合物が得られた。それぞれの増幅産物を3μLずつ分取し1本のチューブに纏めた。このように検体毎にまとめたサンプルでカラムを用いて増幅産物の精製を行った。その後濃度測定を行い、0.2ng/μLとなるように調製した。濃度調製済みサンプルについてDNAフラグメントライブラリ調製キット（Nextera XT DNA Sample Prep Kit，Illumina）を用いてサンプルの断片化及びバーコード配列の付加を行い、サンプル間の濃度の均一化を行った。

【0128】

５．次世代シークエンサーを用いた解析
ライブラリ調製が完了したサンプルについて、シークエンシングキット（MiSeq Reagent Kit v2 2×150bp, Illumina）を用いて前処理し、次世代シークエンサー（MiSeq, Illumina）を用いてシークエンスを実施した。得られたシークエンスデータを基に変異の検出を行った。その結果、各検体について11個から25個の多型変異の存在が確認された。このように、上述のプライマーを用いたマルチプレックスPCR法で作製したライブラリを利用してPKD遺伝子における多型変異（SNP、InsertionおよびDeletion）を検出することが可能であることが確認された。

【0129】

６．マッピング結果
次世代シークエンサーにより出力された数百塩基の長さから成る約数十万個のDNA断片（リード）を参照配列に対してマッピングし、ビューワーソフト（Integrative Genomics Viewer：IGV）を用いて、全体の状況を可視化した。その結果、マッピングされている箇所はPKD1およびPKD2遺伝子のマルチプレックスPCRを行った領域だけであり、偽遺伝子の影響は受けていないことが明らかとなった。

【0130】

７．サンガー法を用いて得られたPKD1遺伝子配列との比較
上記３のマルチプレックスPCRで得られた増幅産物を精製し、サンガー法を用いてシークエンス解析を行った。偽遺伝子が6種類存在するPKD1遺伝子においては、PKD1に特異的であり、他の偽遺伝子は全て異なる塩基を有する箇所が複数存在する。偽遺伝子を増幅する可能性が存在する7領域の増幅産物についてそのような箇所を重点的に確認したところ、いずれの増幅産物の配列も真正なPKD1遺伝子の配列に一致することが判明した（図３）。以上から、上述のプライマーセットを用いることにより、偽遺伝子を増幅することなく、効率的にPKD1遺伝子及びPKD2遺伝子の全てのエクソン領域を増幅することができることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図3-6】

【図3-7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]