特許 6723982 インターロイキン−２／インターロイキン−２受容体アルファ融合タンパク質および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6723982

(24)【登録日】2020年6月26日

(45)【発行日】2020年7月15日

(54)【発明の名称】インターロイキン−２／インターロイキン−２受容体アルファ融合タンパク質および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20200706BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20200706BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 15/26 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20200706BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20200706BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20200706BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20200706BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20200706BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20200706BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00

   C07K14/715

   C07K14/55

   C12N15/26ZNA

   C12N5/10

   C12N15/63 Z

   C12P21/02 K

   C12P21/02 C

   A61K38/20

   A61K47/65

   A61P19/02

   A61P29/00 101

   A61P1/04

   A61P37/02

   A61P17/06

   A61P17/14

   A61P9/00

【請求項の数】26

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2017-506395(P2017-506395)

(86)(22)【出願日】2015年8月5日

(65)【公表番号】特表2017-523789(P2017-523789A)

(43)【公表日】2017年8月24日

(86)【国際出願番号】US2015043792

(87)【国際公開番号】WO2016022671

(87)【国際公開日】20160211

【審査請求日】2018年8月3日

(31)【優先権主張番号】62/033,726

(32)【優先日】2014年8月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510250892

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ マイアミ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＡＭＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・マレック

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０２０７６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００３／０２９４７５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平１０−５１１８４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５４５３９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００８９５１６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Nature Med., 2007年，Vol.13, No.9，p.1108-1113

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３８／２０

Ａ６１Ｋ ４７／６５

Ａ６１Ｐ １／０４

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ １７／０６

Ａ６１Ｐ １７／１４

Ａ６１Ｐ １９／０２

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３７／０２

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）融合タンパク質のＮ末端で第一のポリペプチド、ここで前記第一のポリペプチドがインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含む；および
（ｂ）融合タンパク質のＣ末端で第二のポリペプチド、ここでリンカーにより第一のポリペプチドにインフレームで融合された第二のポリペプチド、を含む、
融合タンパク質であって、
リンカーが配列番号１３に記載の配列であり、かつ第二のポリペプチドが、ＩＬ−２に結合できるインターロイキン−２受容体アルファ（ＩＬ−２Ｒα）の細胞外ドメインを含み、
ここで、融合タンパク質がＩＬ−２活性を有する、融合タンパク質。

【請求項2】

融合タンパク質が、天然型ＩＬ−２と比較した場合、増加したＩＬ−２の効能を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

天然型ＩＬ−２と比較した場合、融合タンパク質がインビボでＩＬ−２Ｒベアリングリンパ球（ｂｅａｒｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の増加した持続性のＩＬ−２刺激を有する、請求項１または２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

（ａ）ＩＬ−２を含む第一のポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し；かつ／または、
（ｂ）ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインを含む第二のポリペプチドが、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、
請求項１−３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

（ａ）ＩＬ−２を含む第一のポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有し；かつ／または、
（ｂ）ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインを含む第二のポリペプチドが、配列番号７と少なくとも９５％の配列同一性を有する、
請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

融合タンパク質が、
（ａ）配列番号２６、２７、３６、３７、５７、または５９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；または、
（ｂ）配列番号２６、２７、３６、３７、５７、または５９のいずれか１つと少なくとも９０％、または９５％を有する配列を含む、
請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

配列番号２６、２７、３６、３７、５７、または５９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

融合タンパク質が、
（ａ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６２と少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む、
請求項１−８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

配列番号６２のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

請求項１−１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項13】

宿主細胞が、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞を含む、請求項１２に記載の宿主細胞。

【請求項14】

宿主細胞に、請求項１−１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入し、かつ宿主細胞中で融合タンパク質を発現することを含む、請求項１−１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を作製するための方法。

【請求項15】

融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞中で活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

免疫応答を減少させることにおける、それを必要とする対象における、使用のための請求項１−１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項17】

対象が、自己免疫性疾患を有する、請求項１６に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

自己免疫性疾患が、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎または全身性硬化症、移植片対宿主病、乾癬、円形脱毛症、またはＨＣＶ誘発性血管炎を含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。

【請求項19】

治療有効量の融合タンパク質が、対象当たり１０^３から１０^６ＩＵのＩＬ−２活性または対象当たり１０^４±１００倍のＩＬ−２活性を含む、請求項１６−１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項20】

ワクチンの免疫原性を増強することにおける、それを必要とする対象における、使用のための請求項１−１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項21】

ワクチンに対する抑制された免疫応答を克服することにおける、それを必要とする対象における、使用のための請求項１−１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項22】

融合タンパク質およびワクチンが同時に投与される、請求項２０または２１に記載の融合タンパク質。

【請求項23】

融合タンパク質およびワクチンが任意の順序で連続的に投与される、請求項２０または２１に記載の融合タンパク質。

【請求項24】

ワクチンが癌ワクチンである、請求項２０−２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項25】

治療有効量の融合タンパク質が、対象当たり少なくとも１０^４から１０^７ＩＵのＩＬ−２活性または対象当たり少なくとも１０^５±１００のＩＬ−２活性を含む、請求項２０−２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項26】

対象が、ヒトである、請求項１６−２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ここに開示される主題は、一般に、インターロイキン−２／インターロイキン−２受容体アルファ融合タンパク質を利用する免疫応答を調節するための方法および組成物に関する。

【0002】

ＥＦＳ−ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
配列表の正式なコピーは、米国標準コード情報交換（ＡＳＣＩＩ）に準拠して、ファイル名４６４１７３ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔ、作成日２０１５年７月３０日、およびサイズ１３９ＫＢで、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してテキストファイルとして明細書と同時提出された。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、明細書の一部であり、これによって出典明示により本明細書中にその全体が組み込まれる。

【0003】

連邦政府補助金の声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）、国立糖尿病・消化器・腎疾病研究所（ＮＩＤＤＫ）により授与された認可番号Ｒ０１ ＤＫ０９３８６６による政府の支援によりなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、癌およびＨＩＶ／ＡＩＤ患者における免疫応答を高めるための試みにおいて使用されてきた生物製剤である。より最近では、より低用量のＩＬ−２は、自己組織の自己免疫様攻撃に関連する望ましくない免疫応答を抑制するために選択的に耐性を高めるために使用されている。重要なことに、これらの低用量のＩＬ−２は、自己反応性Ｔ細胞の増強または再活性化のいかなる兆候も示さなかった。それにもかかわらず、ＩＬ−２は、その有効性を限定するインビボでの非常に短い半減期、および高用量での毒性を含み、治療剤として重要な欠点を有する。これらの理由に関して、改善された薬物動態および使用のための応答の持続性を有する、新規のＩＬ−２生物製剤が必要とされる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

免疫系を調節するために利用され得る、多様な方法および組成物が提供される。組成物は、（ａ）インターロイキン−２（ＩＬ−２）もしくは機能的なバリアントまたはその断片を含む、第一のポリペプチド；および（ｂ）第一のポリペプチドにインフレームで融合された第二のポリペプチドを含む、融合タンパク質を含み、ここで、第二のポリペプチドは、インターロイキン−２受容体アルファ（ＩＬ−２Ｒα）の細胞外ドメインもしくは機能的なバリアントまたはその断片を含み、融合タンパク質は、ＩＬ−２活性を有する。

【0006】

免疫応答の減少を必要とする対象に、本明細書中に開示される治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む、対象における免疫応答を減少させるための多様な方法が提供される。

【0007】

免疫応答の増加を必要とする対象に、本明細書中に開示される治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む、対象における免疫応答を増加させるための方法がさらに提供される。Ｔ制御細胞活性を増加させるための方法がさらに提供される。

【0008】

対象におけるワクチンの免疫原性を増強することまたはワクチンに対する抑制された免疫応答を克服することを含む、さらなる方法は、以下：（ａ）対象に、本明細書中に開示される治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を投与すること；および、（ｂ）対象にワクチンを投与すること、を含み、ここで、融合タンパク質は、ワクチンの免疫原性を増強する、またはワクチンに対する抑制された免疫応答を克服する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の模式図を提供し、ここで、Ｌ＝リーダーペプチド、ＬＫ＝リンカー領域、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、およびＴ＝終止コドンである。

【図2】図２Ａおよび図２Ｂは、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の非限定例の推定されるタンパク質配列を提供する。図２Ａは、マウスＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の非限定例の推定されるタンパク質配列を提供する。マウスＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒαの配列は、それぞれ、融合タンパク質の上および下に示される。ＩＬ−２として表される配列は、配列番号３に記載される；ＩＬ−２−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ−２Ｒαとして表される配列は、配列番号５４に記載される；ＩＬ−２−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ−２Ｒαとして表される配列は、配列番号５５に記載される；ＩＬ−２−（Ｇ３Ｓ）４−ＩＬ−２Ｒαとして表される配列は、配列番号５６に記載される；ＩＬ−２−（Ｇ３Ｓ）３−ＩＬ−２Ｒαとして表される配列は、配列番号５７に記載される；およびＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインは、配列番号１０に記載される。図２Ｂは、ヒトＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の非限定例の推定されるタンパク質配列を提供する。ヒトＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒαの配列は、それぞれ、融合タンパク質の上および下に示される。ＩＬ−２として表される配列は、配列番号１に記載される；ＩＬ−２−（Ｇ３Ｓ）２−ＩＬ−２Ｒαとして表される配列は、配列番号５８に記載される；ＩＬ−２−（Ｇ３Ｓ）３−ＩＬ−２Ｒαとして表される配列は、配列番号５９に記載される；ＩＬ−２−（Ｇ３Ｓ）４−ＩＬ−２Ｒαとして表される配列は、配列番号６０に記載される；ＩＬ−２−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ−２Ｒαとして表される配列は、配列番号６１に記載される；およびＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインは、配列番号７に記載される。

【図3】図３は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の生物活性を示す。ＣＯＳ−７細胞は、示されたリンカーを有するＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合ｃＤＮＡを遺伝子導入されている。これらの細胞からの上清は、ＩＬ−２活性を評価するために、抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞ブラスト（ｂｌａｓｔ）と共に培養された。（Ａ）示された融合タンパク質の希釈後のＴブラストによる増殖応答。（Ｂ）示された融合タンパク質を含有する１：２希釈の培養上清により刺激された増殖に対する抗ＩＬ−２の影響。

【図4】図４は、精製されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の活性を示す。遺伝子導入されたＣＨＯ細胞の上清を使用して６ｘ−Ｈｉｓタグに対するニッケル−ベースのアフィニティークロマトグラフィーによりＩＬ−２／（Ｇ_３Ｓ）_３／ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−２／（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４／ＩＬ−２Ｒαを精製した。（Ａ）示された精製された融合タンパク質への抗ＣＤ３ Ｔ細胞ブラストの増殖により測定されたＩＬ−２生物活性。（Ｂ）ＰＣ６１と７Ｄ４の非リガンド結合部位、抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞ブラストに向けられる抗ＩＬ−２Ｒαモノクローナル抗体の結合を阻害する、それぞれの精製された融合タンパク質の効果。

【図5】図５は、ＩＬ−２ＲαのＩＬ−２結合部位に向けられたモノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα抗体は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質に結合するできないことを示す。示されたように、可変リンカーを有する精製された融合タンパク質を、ＩＬ−２Ｒαのリガンド結合部位に向けられた３Ｃ７抗ＩＬ−２Ｒαモノクローナル抗体またはＩＬ−２Ｒαの非リガンド結合部位に向けられた７Ｄ４モノクローナル抗体と最初にインキュベートした。次いで、細胞表面ＩＬ−２Ｒαに結合する３Ｃ７または７Ｄ４の能力をＩＬ−２Ｒα遺伝子導入ＥＬ４細胞を使用して評価した。

【図6】図６は、精製されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαの生化学的な特性を示す。（Ａ）精製されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαを、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した；ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαを融合タンパク質の６ｘ−Ｈｉｓタグに対する抗体を用いて探索することによるウェスタンブロット解析により可視化した。（Ｂ）示された量の精製されたＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒαを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクマシーブルー染色に供した。

【図7】図７は、インビボのＩＬ−２依存性シグナル伝達に対するＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＩＬ−２／（Ｇ_３Ｓ）_３／ＩＬ−２Ｒαの単回腹腔内投与（４０００ユニットのＩＬ−２活性）を受け、示された脾臓細胞集団におけるｐＳＴＡＴ５レベルを即時に評価した。ｐＳＴＡＴ５レベルをＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の注射の０．５時間後に決定した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞に関して、細胞はＦｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ細胞を除外するためゲートされた。

【図8】図８は、インビボでのＴｒｅｇ細胞に対するＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の効果を示す。ＮＯＤマウスに、ＩＬ−２／（Ｇ_３Ｓ）_３／ＩＬ−２Ｒαに関連する示された量のＩＬ−２活性で、３回（１、３、５日）腹腔内注射した。Ｔｒｅｇに対する効果を、最後の注射２４時間後の脾臓、膵臓リンパ節（ＰＬＮ）および膵臓に関して評価した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＴｒｅｇの割合；コントロール治療マウスからのＴｒｅｇによるＣＤ２５発現への標準化後のＴｒｅｇによるＣＤ２５発現に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）；増殖マーカーＫｉ６７の発現により評価されるＴｒｅｇの増殖状態；およびＩＬ−２依存性の最終分化した亜集団を示す、Ｋｌｒｇ１を発現するＴｒｅｇの％が評価される。

【図9】図９は、インビボでＴｒｅｇ細胞中の変化を誘導する、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質と組換え型ＩＬ−２の比較を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＩＬ−２／（Ｇ_３Ｓ）_３／ＩＬ−２Ｒα（２０００ユニット）、組換えヒトＩＬ−２（２５，０００ユニット）または抗ＩＬ−２（Ｊｅｓ−６．１；５μｇ）とマウスＩＬ−２（１０，０００ユニット）の予め形成された複合体（ＩＬ２／ＩＣ）を３回（１、３、５日）腹腔内注射した。最後の注射の２４、７２時間および１週間後に、Ｔｒｅｇに対する効果を脾臓に関して評価した。Ｔｒｅｇを図８に記載されるように評価した。

【図10】図１０は、低用量のＩＬ−２の制限された適用が、ＮＯＤマウスにおける糖尿病を遅延させることを示す。ＮＯＤマウス（８マウス／集団）に、（Ａ）のスケジュールに従ってＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα、可溶性ＩＬ−２Ｒα、またはＰＢＳを投与した。尿および血中のグルコースレベルを、マウスが４０週齢に達するまでモニターした。マウスは、グルコースレベル＞２５０ｍｇ／ｄｌの２連続の読み取り後に糖尿病と考えられた。

【図11】図１１は、高用量のＩＬ−２／ＩＬ−２ＲαがＣＤ８^＋Ｔ細胞メモリーの発生を増強することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに類遺伝子性のクラスＩ制限オボアルブミン（ＯＶＡ）−特異的ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞受容体遺伝子導入Ｔ細胞を投与した。これらのマウスをＩＬ−２／（Ｇ_３Ｓ）_３／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質、１５，０００ユニットのＩＬ−２を含有するＩＬ２／ＩＣ、または組換え型ＩＬ−２（２５，０００ユニット）の単回投与で免疫し、治療した。示された時間に、末梢血における総ＣＤ８^＋Ｔ細胞区画内のＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の相対的な割合を評価した。

【図12】図１２は、高用量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質により支持される持続性のＯＴ−Ｉ免疫メモリー細胞のタイプ：（Ａ）エフェクターメモリー（ＥＭ）およびセントラルメモリー（ＣＭ）細胞を同定するゲーティング戦略。（Ｂ）ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα（１２，０００ユニット）も投与されたマウスの免疫化後２８および２０２日のＯＴ−Ｉ免疫メモリー細胞の分布を示す。

【図13】図１３は、示される可変長のグリシン／セリンリンカーを含有するヒトＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の特徴を示す。（Ａ）ＣＴＬＬ生物検定を使用する精製されたヒトＩＬ−２／／ＩＬ−２ＲαのＩＬ−２−生物活性。（Ｂ）還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のヒトＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質のウェスタンブロット解析。

【図14】図１４は、ヒトＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質がモノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα抗体に結合することを示す。示されたリンカーを有する精製された融合タンパク質は、ヒトＩＬ−２Ｒαのリガンド結合領域に向けられるＢＣ９６抗ＩＬ−２Ｒαモノクローナル抗体またはヒトＩＬ−２Ｒαの非リガンド結合領域に向けられるＭ−Ａ２５７モノクローナル抗体と最初にインキュベートされる。次いで、細胞表面ＩＬ−２Ｒαに結合するＢＣ９６またはＭ−Ａ２５７の能力をＩＬ−２Ｒα−遺伝子導入ＣＨＯ細胞を使用して評価した。

【図15】図１５は、ＩＬ−２が、ヒトＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質との関連でＩＬ−２ＲαのＩＬ−２結合部位と相互作用することを示す。可変グリシン／セリンリンカーを有する示された融合タンパク質のＩＬ−２−生物活性を、ＣＴＬＬ細胞を使用して評価した。Ｍｕｔは、ＩＬ−２ＲαがＡｒｇ^３５→Ｔｈｒ、Ａｒｇ^３６→Ｓｅｒ変異を含有する融合タンパク質を指す。ウェスタンブロット解析により、全ての融合タンパク質が同量であることを確認した（未掲載）。

【0010】

発明の詳細な説明
本発明は、発明の実施形態の全てが示されるわけではないいくつかの添付の図面を参照して、より詳細に以下に記載されるだろう。実際に、これらの発明は多くの様々な形態で具体化されてもよく、本明細書中に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない；むしろ、これらの実施形態は、適用される法的要件を満たすよう提供される。同様の番号は、全体を通して同様の要素を指す。

【0011】

本明細書中に記載された発明の多くの改変および他の実施形態が、これらの発明が関係する分野の当業者に思い浮かび、前述の記載および関連する図に示された教示の利益を有するだろう。従って、本発明は開示された特定の実施形態に限定されず、かつ改変および他の実施形態は添付の請求の範囲内に含まれていることを意図すると理解される。特定の用語が本明細書中で利用されるが、それらは包括的かつ説明的な意味でのみ使用され、限定の目的ではない。

【0012】

Ｉ．概要
現在の技術は、弱い薬理学的な特性、特にその有用性を制限する短い半減期を有する組換えインターロイキン−２（ＩＬ−２）の使用に依存している。インターロイキン−２／インターロイキン−２受容体アルファ（ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα）融合タンパク質は、組換え型ＩＬ−２と他のＩＬ−２融合タンパク質からそれらを分離する固有の特性を有することが、本明細書中で提供される。第一に、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質のサイズはインビボでその半減期を増加させるだろう。第二に、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の関連における、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒα（ＩＬ−２Ｒの１つのサブユニット）との間の弱い相互作用は、ＩＬ−２の有効性を延長するもう一つの機構を提供する。作用の特定の機構に限定されないが、ＩＬ−２活性の延長された有効性が、ＩＬ−２部分と、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合物のＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−２Ｒを発現する細胞の間の競合的な相互作用を介して生じてもよい。

【0013】

ＩＩ．インターロイキン−２／インターロイキン−２受容体アルファ融合タンパク質および同一のものをコードするポリヌクレオチド
インターロイキン−２受容体アルファ（ＩＬ−２Ｒα）ポリペプチドもしくは機能的なバリアントまたはその断片の細胞外ドメインを含む、または、インターロイキン−２受容体アルファ（ＩＬ−２Ｒα）ポリペプチドもしくは機能的なバリアントまたはその断片の細胞外ドメインからなる第二のポリペプチドにインフレームで融合された、インターロイキン−２（ＩＬ−２）もしくは機能的なバリアントまたはその断片を含む第一のポリペプチドを含む、融合タンパク質が提供される。

【0014】

本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異種のポリペプチドのインフレームの遺伝子の連結を指す。転写／翻訳に際して、単一のタンパク質が作製される。このように、複数のタンパク質またはその断片は、単一のポリペプチドに組み込まれ得る。「作動可能に連結された」は、２以上の要素間の機能的な連結を意味することを意図する。例えば、２つのポリペプチド間の作動可能な連結は、両方のポリペプチドをインフレームで共に融合させて単一のポリペプチド融合タンパク質を生産する。特定の態様では、融合タンパク質は、下記にさらに詳細に記載されるように、リンカー配列を含むことができる第三のポリペプチドをさらに含む。

【0015】

ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質もしくは活性バリアントまたはそれらの断片は、１つ以上の以下の特性／活性を有することができる：（１）低用量のＩＬ−２−ベースの治療において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を増加させ、および／または免疫寛容を増加させること；（２）より高用量の治療における免疫応答およびメモリーを増加させること；（３）組換え型ＩＬ−２と比較した場合、ＩＬ−２の有効性を増加させること；および／または（４）インビボでのＩＬ−２Ｒベアリングリンパ球（ｂｅａｒｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の持続性ＩＬ−２刺激を増加させること。かかる活性およびアッセイの方法が、本明細書の他の所でさらに詳細に開示される。例えば、本明細書中で提供される実施例１を参照されたい。

【0016】

１つの非限定的な実施形態では、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質もしくは活性バリアントまたはそれらの断片に起因するＴｒｅｇの増加した活性は、例えば、（１）ＣＤ４^＋ Ｔ細胞区画におけるＴｒｅｇの提示および数の増加；（２）ＩＬ−２依存性ＣＤ２５の増加；（３）増殖マーカーＫｉ６７の発現により評価される増殖の増加；ならびに（４）ＩＬ−２依存性の最終分化したＫＩｒｇ１^＋Ｔｒｅｇサブセットの分画の増加を含む種々の方法でアッセイされ得る。Ｔｒｅｇに対するかかる効果は、例えば、脾臓および炎症膵臓において見ることができる。

【0017】

１つの非限定的な実施形態では、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質もしくは活性バリアントまたはそれらの断片は、免疫寛容原性および免疫抑制性ＴｒｅｇおよびＴエフェクター／メモリー応答の増加を介する免疫を増加させ、かつ、さらなる実施形態では、それは（１）天然型または組換え型ＩＬ−２と比較して、より低い有効レベルのＩＬ−２活性でかかる応答を送達することにより、改善された薬物動態を示し；（２）天然型または組換え型ＩＬ−２よりも持続的な生物学的反応を呈し；かつ／または（３）Ｔエフェクター／免疫メモリー細胞よりも低レベルの用量で応答するＴｒｅｇの階層を保持する。

【0018】

具体的な実施形態では、融合タンパク質は、天然型または組換え型ＩＬ−２よりも改善された活性を有する。例えば、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の効果は、天然型もしくは組換え型ＩＬ−２と比較して約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍以上の低レベルのＩＬ−２活性で、免疫寛容原性Ｔｒｅｇを増加させることができる。他の実施形態では、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、Ｔｒｅｇの持続的な増大および関連する特性を誘導する際に天然型または組換え型ＩＬ−２よりも有効である。

【0019】

種々の生物由来の多様なＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒα断片ならびにバリアントが、本明細書中で提供されるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質を生成するために使用され得る。かかる成分は、本明細書の他の所でさらに詳細に説明される。非限定的な未処理のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質の例は、配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７、３６、３８、４４、４６、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、および６１に記載され、ＩＬ−２／ＩＬ−Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質の成熟型の非限定例は、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、３７、３９、４３、４５、６２、および６４に記載される。かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの非限定例は、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、４２、４７、４８、４９、６３、および６５に記載される。

【0020】

「分泌シグナル配列」という用語は、より大きいポリペプチドの構成要素としてのポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするポリヌクレオチド配列を示し、ここで、当該ポリヌクレオチド配列は、それが合成された細胞の分泌経路を介して、そのより大きいポリペプチドを方向付ける。より大きいポリペプチドは、一般的に、分泌経路を介する移行の間に分泌ペプチドを除去するために切断される。本明細書中で使用される場合、融合タンパク質またはポリペプチドの「成熟した」形態は、除去された分泌ペプチドを有するポリペプチドの処理された形態を含む。本明細書中で使用される場合、融合タンパク質の「未処理の」形態は、分泌ペプチド配列を保持する。

【0021】

ＩＬ−２／ＩＬ−Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質の、成熟した形態および未処理の形態の生物学的に活性な断片およびバリアント、ならびに同一のものをコードするポリヌクレオチドも提供される。かかる機能的なポリペプチド断片は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３６、３７、３８、３９、４３、４４、４５、４６、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６４のいずれかに記載の、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００以上の連続アミノ酸を含むことができる。あるいは、機能的なポリペプチドバリアントは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３６、３７、３８、３９、４３、４４、４５、４６、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６４に記載される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。

【0022】

ＩＬ−２／ＩＬ−Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの活性バリアントおよび断片がさらに提供される。かかるポリヌクレオチドは、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、４２、４７、４８、４９、６３または６５の少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、１１００、１２００、１３００、１５００、１８００、２０００連続ヌクレオチドまたは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３６、３７、３８、３９、４３、４４、４５、４６、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６４に記載されるポリペプチドをコードし、機能的なＩＬ−２／ＩＬ−Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質のコードを続けるポリヌクレオチドを含むことができる。あるいは、機能的なポリヌクレオチドは、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、４２、４７、４８、４９、６３または６５に記載される配列または配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３６、３７、３８、３９、４３、４４、４５、４６、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６４に記載されるポリペプチドをコードし、機能的なＩＬ−２／ＩＬ−Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質のコードを続けるポリヌクレオチドと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。

【0023】

ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の構成要素は任意の順序で見出され得ることがさらに認識される。一実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドはＮ末端であり、ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインは融合タンパク質のＣ末端である。

【0024】

ｉ．インターロイキン−２
本明細書中で使用される場合、「インターロイキン−２」または「ＩＬ−２」は、特に示さない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびに家畜哺乳動物もしくは農業哺乳動物などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型または組換え型ＩＬ−２を指す。当該用語は、未処理のＩＬ−２、並びに、細胞でのプロセシングに起因するＩＬ−２の任意の形態（つまり、ＩＬ−２の成熟型）を包含する。当該用語は、例えば、スプライスバリアントまたは対立形質バリアント、ならびに非天然型などの、ＩＬ−２の天然に存在するバリアントおよび断片も包含する。ヒトＩＬ−２（２０アミノ酸シグナル配列を有する）の典型的な成熟型のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。未処理のヒトＩＬ−２は、成熟したＩＬ−２分子に存在しないＮ末端２０アミノ酸シグナルペプチド（配列番号１）をさらに含む。マウスＩＬ−２（２０アミノ酸シグナル配列を有する）の典型的な成熟型のアミノ酸配列は、配列番号４に示される。未処理のマウスＩＬ−２は、成熟したＩＬ−２分子に存在しないＮ末端２０アミノ酸シグナルペプチド（配列番号３）をさらに含む。図２Ａおよび図２Ｂも参照されたい。「野生型ＩＬ−２」とも称される「天然のＩＬ−２」は、天然に存在するＩＬ−２または組換え型ＩＬ−２を意図する。

【0025】

ＩＬ−２に関する、さらなる核酸およびアミノ酸配列が知られている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｑ７ＪＦＭ２（オータス・レムリヌス（Ａｏｔｕｓ ｌｅｍｕｒｉｎｕｓ）（グレイ・ベリード・ナイト・モンキー（Ｇｒａｙ−ｂｅｌｌｉｅｄ ｎｉｇｈｔ ｍｏｎｋｅｙ）））；Ｑ７ＪＦＭ５（オータス・ナンシマエ（Ａｏｔｕｓ ｎａｎｃｙｍａａｅ）（マズ・ナイト・モンキー（Ｍａ’ｓ ｎｉｇｈｔ ｍｏｎｋｅｙ）））；Ｐ０５０１６（ボス・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）（ウシ））；Ｑ２９４１６（カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（イヌ）（カニス・ルプス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）））；Ｐ３６８３５（カプラ．ヒルクス（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）（ヤギ））；および、Ｐ３７９９７（エクウス・カバルス（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）（ウマ））を参照されたい。

【0026】

ＩＬ−２の生物学的に活性な断片およびバリアントも提供される。かかるＩＬ−２活性バリアントまたは断片はＩＬ−２活性を保持するだろう。「ＩＬ−２の生物学的活性」という表現は、ＩＬ−２受容体ベアリングリンパ球を刺激する能力を含むがこれらに限定されないＩＬ−２の１つ以上の生物学的活性を指す。かかる活性はインビトロおよびインビボの両方で測定され得る。ＩＬ−２は、免疫活性の網羅的な制御因子であり、ここで見られる効果はかかる活性の合計である。例えば、それは生存活性（Ｂｃｌ−２）を制御し、Ｔエフェクター活性（ＩＦＮ−ガンマ、グランザイムＢ、およびパーフォリン）を誘導し、かつＴ制御活性（ＦｏｘＰ３）を促進する。例えば、その全体が出典明示により本明細書中に組み込まれるＭａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３３（２）：１５３−６５を参照されたい。

【0027】

ＩＬ−２の生物学的活性バリアントが知られている。例えば、それぞれが出典明示により本明細書中に組み込まれる、米国出願公開第２００６０２６９５１５および２００６０１６０１８７号およびＷＯ９９／６０１２８を参照されたい。

【0028】

ＩＬ−２の生物学的に活性な断片およびバリアントは、本明細書中に開示される融合タンパク質において利用され得る。かかる機能的な断片は、配列番号１、２、３、または４の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができる。あるいは、機能的なバリアントは配列番号１、２、３、または４に記載される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。

【0029】

ＩＬ−２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの活性バリアントおよび断片がさらに提供される。かかるポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、または４をコードするポリペプチドの少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００連続ヌクレオチドを含み、ＩＬ−２活性を有するタンパク質のコードを続けることができる。あるいは、機能的なポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、または４に記載されるアミノ配列をコードするポリペプチドと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含み、機能的なＩＬ−２ポリペプチドのコードを続けることができる。

【0030】

ｉｉ．インターロイキン−２受容体アルファ
「ＣＤ２５」または「ＩＬ−２受容体α」もしくは「ＩＬ−２Ｒα」という用語は、本明細書中で使用される場合、特に示さない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびに家畜哺乳動物もしくは農業哺乳動物などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型または組換え型ＩＬ−２Ｒαを指す。当該用語は、例えば、スプライスバリアントまたは対立形質バリアント、または非天然型などの、ＩＬ−２Ｒαの天然に存在するバリアントも包含する。ヒトＩＬ−２は、その受容体系、ＩＬ−２Ｒを介したシグナル伝達を介するその生物学的効果を発揮する。ＩＬ−２およびその受容体（ＩＬ−２Ｒ）は、免疫応答に重大なＴ細胞増殖および他の基本的な機能に必要とされる。ＩＬ−２Ｒは、アルファ（ｐ５５）、ベータ（ｐ７５）、およびガンマ（ｐ６５）鎖である３つの非共有結合的に連結されたＩ型膜貫通タンパク質からなる。ヒトＩＬ−２Ｒアルファ鎖は、２１９アミノ酸の細胞外ドメイン、１９アミノ酸の膜貫通ドメイン、および１３アミノ酸の細胞内ドメインを含有する。ＩＬ−２Ｒアルファ（ＩＬ−２Ｒα）の分泌された細胞外ドメインが、本明細書中に記載される融合タンパク質において利用され得る。

【0031】

ヒトＩＬ−２Ｒαの典型的な成熟型のアミノ酸配列は、配列番号６に示される。未処理のヒトＩＬ−２Ｒαは配列番号５に示される。配列番号６の細胞外ドメインは、配列番号７に記載される。マウスＩＬ−２Ｒαの典型的な成熟型のアミノ酸配列は配列番号９に示される。未処理のマウスＩＬ−２Ｒαは配列番号８に示される。配列番号９の細胞外ドメインは、配列番号１０に記載される。「野生型ＩＬ−２Ｒα」とも称される「天然のＩＬ−２Ｒα」は、天然に存在するＩＬ−２Ｒαまたは組換え型ＩＬ−２Ｒαを意図する。天然のヒトＩＬ−２Ｒα分子の配列は、配列番号５および６に示される。

【0032】

ＩＬ−２Ｒαに関する核酸およびアミノ酸配列が知られている。例えば、それぞれが出典明示により本明細書中に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿００１０３０５９７．１（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）；ＮＰ＿００１０２８０８９．１（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ）；ＮＭ＿００１００３２１１．１（Ｃ．ｌｕｐｕｓ）；ＮＰ＿７７６７８３．１（Ｂ．ｔａｕｒｕｓ）；ＮＰ＿０３２３９３．３（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；および、ＮＰ＿０３７２９５．１（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）を参照されたい。

【0033】

ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインの生物学的に活性な断片およびバリアントも提供される。かかるＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン活性バリアントまたは断片は、ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン活性を保持するだろう。「ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメインの生物学的活性」という用語は、ＩＬ−２受容体応答性細胞において細胞内シグナル伝達を増強する能力を含むが、これらに限定されないＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインの１つ以上の生物学的活性を指す。ＩＬ−２Ｒａの生物学的に活性な断片およびバリアントの非限定例は、例えば、出典明示により本明細書中に組み込まれるＲｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５６５４−５６５８，１９８８中に開示される。

【0034】

ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインの生物学的に活性な断片およびバリアントは、本明細書中に開示される融合タンパク質において利用され得る。かかる機能的な断片は、配列番号６、９、７、１０、５、または８のいずれかに記載の細胞外ドメインの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２１５またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができる。あるいは、機能的なバリアントは、配列番号６、９、７、１０、５、または８に記載される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。

【0035】

一実施形態では、本明細書中で提供される融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメイン内で少なくとも１つの変異を含むことができる。具体的な実施形態では、ＩＬ−２Ｒαの３５位のアルギニンは、ＩＬ−２Ｒαの３６位のスレオニンおよび／またはアルギニンをセリンに変異させることができる。かかる融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメイン中のこれらの変異を含まない融合タンパク質と比較しておよび／または天然型または組換え型ＩＬ−２と比較してＩＬ−２活性の増加を有することができる。ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメイン内で変異を有するＩＬ−２Ｒαを含む典型的な融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６２および６４に記載される。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６２もしくは６４のいずれかに記載のアミノ酸配列；または配列番号６２もしくは６４のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％を有する配列を含む。

【0036】

ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの活性バリアントおよび断片がさらに提供される。かかるポリヌクレオチドは、配列番号６、９、７、１０、５、または８をコードするポリペプチドの少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００以上の連続ヌクレオチドを含み、ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメイン活性を有するタンパク質のコードを続けることができる。あるいは、機能的なポリヌクレオチドは、配列番号６、９、７、１０、５、または８に記載されるアミノ配列をコードするポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含み、ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメイン活性を有するタンパク質のコードを続けることができる。

【0037】

ｉｉｉ．さらなる構成要素
ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質はさらなるエレメントをさらに含むことができる。かかるエレメントは、融合タンパク質の発現を助け、融合タンパク質の分泌を助け、融合タンパク質の安定性を改善し、タンパク質のより効率的な精製を可能にし、かつ／または活性融合タンパク質を調節することができる。

【0038】

ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して「異種」は、異なるタンパク質またはポリヌクレオチドに由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。融合タンパク質のさらなる構成要素は融合タンパク質の他のポリペプチド構成要素と同一の生物に由来でき、またはさらなる構成要素は融合タンパク質の他のポリペプチド構成要素とは異なる生物に由来し得る。一実施形態では、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、ＩＬ−２ポリペプチドとＩＬ−２Ｒαポリペプチドの間に位置するリンカー配列を含む。

【0039】

リンカーは任意の長さであり得、かつ少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０または６０以上のアミノ酸を含むことができる。一実施形態では、リンカー配列は、グリシンアミノ酸残基を含む。他の実施例では、リンカー配列は、グリシンおよびセリンアミノ酸残基の組み合わせを含む。かかるグリシン／セリンリンカーは、ペプチドＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳまたはこれらの所与のペプチド類の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の反復を含む、同一のものの反復を含むが、これらに限定されないアミノ酸残基の任意の組み合わせを含むことができる。例えば、リンカー配列は、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１３）（（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３として有名）；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１）（（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４として有名）；または（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５；（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６；（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_７等を含むことができる。リンカー配列は、配列番号５０に記載される（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）（（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４として有名）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）（（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５として有名）；（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_１、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６；（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_７；（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_８等をさらに含むことができる。さらに、任意のリンカーの活性バリアントおよび断片は、本明細書中に開示される融合タンパク質においてさらに利用され得る。

【0040】

ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、融合タンパク質の翻訳を助けるさらなるエレメントを含むことができることがさらに認識される。かかる配列は、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端に結合したコザック配列を含む。コザックコンセンサス配列は、翻訳工程の開始に役割を果たす真核生物のｍＲＮＡ上に生じる配列であり、かつコンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号３５）を有し；ここで、（１）小文字は、塩基が変わり得るが、その位置でのもっとも一般的な塩基を表示する；（２）大文字は、高度に保存された塩基を指し示し、すなわち、「ＡＵＧＧ」配列は一定であり、またはプリン（アデニンまたはグアニン）がこの位置で通常観察されることを示す、ＩＵＰＡＣ多義性コード（ａｍｂｉｇｕｉｔｙ ｃｏｄｅ）「Ｒ」を除く変化は、たとえあったとしてもまれであり；かつ（３）括弧中の配列（（ｇｃｃ））は不確かな意義のもの（ｕｎｃｅｒｔａｉｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）である。一実施形態では、コザック配列は、配列番号５３に記載される配列を含む。

【0041】

１つの非限定的な実施形態では、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、配列番号２８に記載されるＩＬ−２リーダー最適化コザック配列もしくは機能的なバリアントまたはその断片を含む。コザック配列の機能的なバリアントまたは断片は、当該リーダーを欠く配列からの翻訳のレベルと比較した場合、タンパク質の翻訳を増加させる能力を保持するだろう。かかる機能的な断片は、コザック配列または配列番号２８もしくは５３に記載される配列の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０連続ヌクレオチドを含むことができる。あるいは、機能的なバリアントは、コザック配列または配列番号２８もしくは５３に記載される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むことができる。

【0042】

さらに別の実施形態では、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、ポリペプチドの精製を助けるためにＣ末端に１つ以上のタグを含む。かかるタグは知られており、例えば、ヒスチジンタグを含む。特定の実施形態では、６ＸＨｉｓタグが利用される。さらなるリンカー配列が融合タンパク質とＨｉｓタグの間に利用され得ることがさらに認識される。

【0043】

ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の非限定的な実施形態は、図１、図２Ａ、および図２Ｂに記載される。かかる融合タンパク質は、リーダーペプチド、ＩＬ−２もしくは機能的なバリアントまたはその断片、可変リンカー、ＩＬ−２Ｒα、グリシンリンカー、６ｘＨｉｓタグ、ならびに２つの終止コドンを含む。

【0044】

ｉｖ．バリアントおよび断片
ａ．ポリヌクレオチド
ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質またはその中に含有される多様な構成要素（すなわち、ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン、ＩＬ−２Ｒαポリペプチド、リンカー配列および／またはコザック配列）をコードするポリヌクレオチドの断片およびバリアントが、本発明の多様な方法および組成物において利用され得る。「断片」という用語は、ポリヌクレオチドの部分、および、それによってコードされたタンパク質またはポリペプチドの部分を意図する。ポリヌクレオチドの断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持し、それ故にＩＬ−２活性、ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン活性、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質活性を有するタンパク質断片をコードすることができ、またはもしリンカー配列をコードする場合、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の所望の活性を提供できる。

【0045】

ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン、ＩＬ−２ポリペプチド、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質、コザック配列、またはリンカー配列の生物学的に活性な部分は、ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメインまたはＩＬ−２ポリペプチドの部分をコードするポリヌクレオチドの１つの一部を単離し、ポリペプチドのコードされた部分を発現し（例えば、インビトロでの組換え発現による）、かつＩＬ−２Ｒα細胞外ドメインまたは／およびＩＬ−２ポリペプチドの部分の活性またはＩＬ−２／ＩＬＲα融合タンパク質の活性を評価することにより調製され得る。

【0046】

「バリアント」配列は、高度な配列類似性を有する。ポリヌクレオチドに関して、保存されたバリアントは、遺伝暗号の縮重のために、ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメインポリペプチド、ＩＬ−２ポリペプチド、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質、またはリンカー配列のうちの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらなどのバリアントは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術などの周知の分子生物学技術の使用により同定され得る。バリアントポリヌクレオチドは、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用することにより生成された配列などの合成的に得られたヌクレオチド配列も含むが、依然としてＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン、ＩＬ−２ポリペプチド、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質、コザック配列、またはリンカー配列をコードする。

【0047】

ｂ．ポリペプチド
「バリアント」タンパク質という用語は、天然タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端への１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆるトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ））または付加；天然タンパク質中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；または天然タンパク質中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換による、天然タンパク質由来のタンパク質を意図する。バリアントタンパク質は生物学的に活性である、つまり、それらは所望の生物学的活性、すなわち、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質活性、ＩＬ−２活性またはＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン活性を有し続ける。かかるバリアントは例えば、遺伝子多型または人間の操作に起因してもよい。ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質またはその構成成分（すなわち、ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメインポリペプチド、ＩＬ−２ポリペプチド、またはリンカー配列）のいずれかの生物学的活性バリアントは、本明細書中の他の所で記載される配列アライメントプログラムおよびパラメータにより決定される天然タンパク質に関するアミノ酸配列と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するだろう。タンパク質の生物学的活性バリアントは、わずか１−１５アミノ酸残基、６−１０などのわずか１−１０、わずか５、わずか４、３、２、または、たった１アミノ酸残基により、そのタンパク質と異なっていてもよい。

【0048】

タンパク質は、アミノ酸置換、欠失、トランケーション（ｔｒａｎｃａｔｉｏｎ）、および挿入を含む多様な方法で改変され得る。かかる操作のための方法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、ＩＬ−２Ｒα細胞外ドメイン、ＩＬ−２ポリペプチド、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質、またはリンカー配列のアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の変異により調製され得る。変異原性およびヌクレオチド配列の改変のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許番号第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびその中に引用された引用文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、出典明示により本明細書中に組み込まれるＤａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出されてもよい。同様の特性を有する別のアミノ酸とアミノ酸を交換するなどの保存的置換が好ましくてもよい。

【0049】

従って、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドは、天然に存在する配列、「天然の」配列、並びに変異体形態を含むことができる。同様に、本発明の方法において使用されるタンパク質は、天然に存在するタンパク質並びにそれらの変形および改変された形態を包含する。かかるバリアントは、組換え現象を実行する能力を有し続けるだろう。一般に、バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中に生じた変異は、リーディングフレーム外の配列にあるべきではなく、かつ／または二次ｍＲＮＡ構造を作り出すことができる相補性領域を作るべきではない。欧州特許出願公開番号第７５，４４４号を参照されたい。

【0050】

バリアントポリヌクレオチドおよびタンパク質は、変異原性法およびＤＮＡシャフリングなどの組換え方法により得られた配列およびタンパク質も包含する。かかる方法では、１つ以上の様々なＩＬ−２Ｒα細胞外ドメインまたはＩＬ−２コード配列は、所望の特性を有する新規のＩＬ−２Ｒα細胞外ドメインまたはＩＬ−２ポリペプチドを作製するために操作され得る。このようにして、組換えポリヌクレオチドのライブラリーは実質的な配列同一性を有する配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドのから生成され、かつインビトロまたはインビボで相同的に組み換えられ得る。かかるＤＮＡシャフリングに関する戦略は、当技術分野で知られている。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；および米国特許番号第５，６０５，７９３号および５，８３７，４５８号を参照されたい。

【0051】

ＩＩＩ．ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび作製方法
組成物は、本明細書で上述した多様な融合タンパク質ならびにそれらのバリアントおよび断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターおよび発現カセットはさらに開示される。一般的には、発現カセットは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターならびに転写のおよび翻訳の終結領域を含むだろう。

【0052】

「ポリヌクレオチド」という用語の使用は、本発明を、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドに限定することを意図しない。当業者はポリヌクレオチドがリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができるを認識するだろう。かかるデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然に存在する分子と合成類似体の両方を含む。

【0053】

「単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドもしくはタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境において見出されるポリヌクレオチドまたはタンパク質を、通常伴うまたは相互作用する構成要素から、実質的にまたは本質的に遊離している。従って、単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術により生産される場合、他の細胞材料または培養培地を実質的に含んでおらず、または化学的に合成される場合、化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含んでいない。好ましくは、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ中のポリヌクレオチドに自然に隣接する配列（すなわち、ポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列）（好ましくはタンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、多様な実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ中のポリヌクレオチドに自然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満を含有できる。細胞材料を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量で）未満の夾雑タンパク質を有するタンパク質の調製を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え生産される場合、好ましくは、培養培地は化学前駆物質または目的の非タンパク質の化学物質の約３０％、２０％、１０％、５％、または１％（乾燥重量で）未満を表す。

【0054】

当技術分野内の通常の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が本明細書中で利用されてもよい。かかる技術は文献中に十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照されたい。

【0055】

プロモーターに作動可能に連結された上記記載のポリヌクレオチドを含むベクターも本明細書中で提供される。発現制御配列が、その配列の転写および翻訳を制御し（ｃｏｎｔｒｏｌ）かつ制御する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）場合に、ヌクレオチド配列は発現制御配列（例えば、プロモーター）に「作動可能に連結」されている。ヌクレオチド配列に言及する場合、「作動可能に連結された」という用語は、発現するヌクレオチド配列の前の適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有すること、および発現制御配列の制御下の配列の発現および配列によりコードされる所望の産物の産生を可能にするために正しいリーディングフレームを維持することを含む。組換え核酸分子に挿入したい遺伝子が適切な開始シグナルを含有しない場合、かかる開始シグナルは遺伝子の前に挿入され得る。「ベクター」は、付属したセグメントの複製をもたらすために別の核酸セグメントが付属していてもよいプラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。プロモーターは細菌、酵母、昆虫または哺乳動物のプロモーターと同一であってもよいし、または同一である。さらに、ベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリオファージまたは真核生物ウイルスＤＮＡであってもよい。

【0056】

タンパク質発現に有用な、当技術分野で知られている他の多数のベクター骨格が利用されてもよい。かかるベクターは、アデノウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス、ＤＮＡデリバリーシステム、すなわちリポソーム、および発現プラスミドデリバリーシステムを含むが、これらに限定されない。さらに、ベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスまたはセムリキ森林ウイルスなどのウイルス由来のＤＮＡエレメントを含む。かかるベクターは商業的に得られてもよいし、または当技術分野で周知の方法により記載される配列から構築されてもよい。

【0057】

適した宿主細胞のベクターを含む、ポリペプチドの産生に関する宿主ベクター系が本明細書中で提供される。適した宿主細胞は、原核生物または真核細胞、例えば、バクテリア細胞（グラム陽性細胞を含む）、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および動物細胞を含むがこれらに限定されない。多数の哺乳動物細胞は、マウス線維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ⁻細胞等を含むがこれらに限定されない宿主として使用されてもよい。Ｒｌ．ｌ、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）などのさらなる動物細胞、ならびに組織培養物中のヒト細胞および植物細胞も使用され得る。

【0058】

多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせが、本明細書中に示されるポリヌクレオチド配列を発現することにおいて利用されてもよい。例えば、有用な発現ベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなってもよい。適したベクターは、ＳＶ４０の誘導体ならびに既知の細菌性プラスミド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡＳ、例えば、λファージの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミドまたはその誘導体などの酵母プラスミド；昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクターなどの、真核細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を利用して改変されたプラスミド；等を含む。

【0059】

多種多様な発現制御配列（それに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を制御する配列）のいずれかが、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を発現するために、これらのベクターにおいて使用されてもよい。かかる有用な発現制御配列は、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマもしくはアデノウイルスの初期もしくは後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の解糖系酵素のためのプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母α−接合因子のプロモーター、および原核生物もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御すると知られている他の配列、ならびにそれらの多様な組み合わせを含む。

【0060】

全てのベクター、発現制御配列および宿主が、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を発現するよう同等に良好に機能する訳ではないことが理解されるだろう。全ての宿主が、同一の発現系で同等に良好に機能する訳ではないだろう。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、所望の発現を達成するために過度の実験なしで、適切なベクター、発現制御配列、および宿主を選択することができるだろう。例えば、ベクターを選択する際に、ベクターが宿主中で機能しなければならないので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによりコードされる他のタンパク質の発現もまた考慮されるだろう。

【0061】

発現制御配列を選択する際に、種々の因子が通常考慮されるだろう。これらは、例えば、系の相対強度、その可制御性、ならびに特に潜在的な二次構造に関して、発現された特定のヌクレオチド配列もしくは遺伝子とのその適合性を含む。適した単細胞宿主は、例えば、選択されたベクターとそれらの適合性、それらの分泌特性、正確にタンパク質を折りたたむそれらの能力、およびそれらの発酵要件、並びに発現されるヌクレオチド配列によりコードされる産物の宿主に対する毒性、ならびに発現産物の精製の容易さを考慮して適合されるだろう。

【0062】

発現カセットを調製する際、多様なポリヌクレオチドが、適切な向き、かつ必要に応じて、適切なリーディングフレームのポリヌクレオチド配列を提供するために操作されてもよい。この目的のために、アダプターまたはリンカーは、ポリヌクレオチドを結合させるために利用されてもよく、または他の操作が、簡便な制限部位、過剰なＤＮＡの除去、制限部位の除去等を提供するために関与してもよい。例えば、２つのグリシンなどのリンカーがポリペプチド間に加えられてもよい。ａｔｇヌクレオチド配列によりコードされるメチオニン残基は、遺伝子転写の開始を可能にするために加えられてもよい。この目的のために、インビトロ突然変異、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転移およびトランスバージョンが関与してもよい。

【0063】

ポリペプチドの産生を可能にし、かつそのように産生されたポリペプチドを回収するのに適した条件下で、宿主細胞中で本明細書中に開示される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現することを含む、ポリペプチドを産生する方法がさらに提供される。

【0064】

ＩＶ．使用方法
免疫応答を調節するための多様な方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、「調節する」という用語は、所与の活性または応答を誘導、阻害、増強、上昇、増加、または減少させることを含む。

【0065】

「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等であるが、これらに限定されない農業動物および家畜動物を意図する。一実施形態では、本明細書中で提供される医薬製剤による治療を受ける対象は、ヒトである。

【0066】

「治療有効量」のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、所望の生物学的反応を誘発するのに十分な量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を指す。当業者に認識されるように、有効である特定のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の絶対量は、所望の生物学的なエンドポイント、送達されるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質、標的細胞または組織等の因子に依存して変化し得る。当業者は、有効な量は、単回用量で投与され得る、または複数の用量（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の用量）の投与により達成され得ることをさらに理解するだろう。

【0067】

ｉ．免疫応答を増加させるための方法
対象における免疫応答を増加させるための多様な方法が提供される。かかる方法は、免疫応答の増加を必要とする対象に治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む。このように、具体的な実施形態では、より高用量のＩＬ−２の一過性の適用は、免疫エフェクターおよび記憶応答を高めるために利用される。

【0068】

多様なＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質が、抗原に対する免疫応答を増強する抗原と組み合わせて使用され得ることがさらに認識される。従って、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、特に細胞性免疫メモリーを高めるワクチンアジュバントとしても使用され得る。

【0069】

例えば、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、ワクチン製剤を増強するために使用され得る。従って、多様なＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、抗癌ワクチンまたは不十分な免疫原性であるワクチンの有効性を増加させるために有用である。対象における有効性もしくはワクチンの免疫原性、または対象におけるワクチンに対する抑制された免疫応答を克服することを増強するための方法であって、（ｉ）対象に、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を投与すること、および（ｉｉ）対象に、ワクチンを投与することを含む、方法がさらに提供される。

【0070】

「ワクチン」という用語は、対象における特異的免疫応答（または免疫原性応答）を刺激するために有用な組成物を意図する。いくつかの実施形態では、免疫原性応答は保護的であるか、または防御免疫を提供する。例えば、疾患を引き起こす生物の場合、ワクチンは、ワクチンが標的とする生物による感染またはワクチンが標的とする生物からの疾患の進行に、対象がよりよく抵抗できるようにする。あるいは癌の場合、ワクチンは、既に発生した癌に対する対象の自然防御を強化する。ワクチンのこれらのタイプはまた、現存している癌のさらなる増殖を予防し、治療された癌の再発を予防し、かつ／または以前の治療により死んでいない癌細胞を除去してもよい。

【0071】

代表的なワクチンは、ジフテリア、テタヌス、百日咳、ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、Ｂ型肝炎、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｂ型、水痘、髄膜炎、ヒト免疫不全ウイルス、結核、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、マラリア、Ｅ型肝炎、デング熱、ロタウイルス、疱疹、ヒトパピローマウイルス、および癌に対するワクチンを含むが、これらに限定されない。目的のワクチンは、米国食品医薬品局によりライセンスされている、癌をもたらし得るウイルス感染を予防する２つのワクチン：肝癌に関連する感染性の病原体、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染を予防するＢ型肝炎ワクチン（ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ．Ｒｅｐ．４６：１０７−０９，１９９７）；および世界中で子宮頸癌の症例の７０パーセント共に引き起こす２種類のヒトパピローマウイルスによる感染を予防するＧａｒｄａｓｉｌ^ＴＭ（Ｓｐｅｃｋ ａｎｄ Ｔｙｒｉｎｇ，Ｓｋｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｌｅｔｔ．１１：１−３，２００６）を含む。目的の他の治療ワクチンは、癌、子宮頸癌、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、腎癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、前立腺癌、および多発性骨髄腫の治療のための治療用ワクチンを含む。

【0072】

ワクチンに関して「有効性を増強する」または「免疫原性を増強する」という用語は、例えば、防御免疫に関連するワクチンの活性の特定のパラメータにおける増加または減少などの特異的な値の変化により測定される結果を改善することを意図する。一実施形態では、増強は、特定のパラメータにおける少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％超の増加を指す。別の実施形態では、増強は、特定のパラメータにおける少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％超の減少を指す。一実施例では、有効性／ワクチンの免疫原性の増強は、疾患進行を阻害し、または治療するワクチンの能力における増加、例えば、当該目的のためのワクチンの有効性における少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％、または１００％超の増加を指す。さらなる例では、有効性／ワクチンの免疫原性の増強は、既に発生した癌に対する、対象の自然防御を補充するワクチンの能力における増加、例えば、当該目的のためのワクチンの有効性における少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％、または１００％超の増加を指す。

【0073】

同様に、ワクチンに関して「抑制された免疫応答を克服する」という用語は、防御免疫に関連するワクチンの活性の特定のパラメータにおける、以前の陽性の値への復帰などの特異的な値の変化により測定される結果を改善することを意図する。一実施形態では、克服することは、特定のパラメータにおける少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％超の増加を指す。一実施例では、ワクチンに対する抑制された免疫応答を克服することは、疾患進行を阻害し、または治療するワクチンの復活した能力、例えば、当該目的のためのワクチンの有効性における少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％、または１００％超の復活を指す。さらなる例では、ワクチンに対する抑制された免疫応答を克服することは、既に発生した癌に対する、対象の自然防御を補充するワクチンの復活した能力、例えば、当該目的のためのワクチンの有効性における少なくとも２５％、５０％、１００％、または１００％超の復活を指す。

【0074】

「治療有効量」という用語は、疾患または状態の治療、予防または診断における有用な量を意図する。本明細書中で使用される場合、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、対象に投与される場合、対象における実質的な細胞毒性効果を引き起こさずに、対象における免疫応答を調節することなどの所望の効果を達成するのに十分な量である。上記で概説したように、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、免疫応答を増加させ、抗原に対する免疫応答を増強し、対象における有効性もしくはワクチンの免疫原性を増強し、またはワクチンに対する抑制された免疫応答を克服するために対象に投与され得る。かかる機能を調節するために有用な有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、治療される対象、苦痛の重篤度、およびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の投与様式に依存するだろう。典型的な用量は、成人一人当たり約１０^４から約１０^７ＩＵのＩＬ−２活性、成人一人当たり約１０^４から１０^５ＩＵのＩＬ−２活性、成人一人当たり約１０^５から約１０^６ＩＵのＩＬ−２活性、成人一人当たり約１０^６から約１０^７ＩＵのＩＬ−２活性を含む。他の実施例では、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、約１０^５ＩＵ±１００倍のＩＬ−２活性であり、約１０^５ＩＵ±１０倍のＩＬ−２活性、約１０^５ＩＵ±２倍のＩＬ−２活性、約１０^５ＩＵ±２０倍のＩＬ−２活性、約１０^５ＩＵ±３０倍のＩＬ−２活性、約１０^５ＩＵのＩＬ−２活性±４０倍、約１０^５ＩＵ±５０倍のＩＬ−２活性、約１０^５ＩＵ±６０倍のＩＬ−２活性、約１０^５ＩＵ±７０倍のＩＬ−２活性、約１０^５ＩＵ±８０倍のＩＬ−２活性、または約１０^５ＩＵ±９０倍のＩＬ−２活性である。具体的な非限定的な実施形態では、ヒトＩＬ−２融合タンパク質はこの用量で投与される。

【0075】

一実施形態では、マウスＩＬ−２融合タンパク質に関する参照標準はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のマウスＩＬ−２（カタログ番号：１４−８０２１）である。簡潔に述べると、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のマウスＩＬ−２の生物活性は以下の通りである：ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイにより測定されるこのタンパク質のＥＤ５０は、１７５ｐｇ／ｍＬ以下である。これは、５．７ｘ１０^６ユニット／ｍｇ以上の比活性に相当する。

【0076】

別の実施形態では、ヒトＩＬ−２融合タンパク質に関する参照標準は、ヒトＩＬ−２薬剤アルデスロイキン（プロロイキン）である。従って、本明細書中に開示されるＩＬ−２融合タンパク質は、低用量または高用量のＩＬ−２治療において使用されるＩＬ−２薬剤との融合タンパク質と直接比較される。マウスおよびヒトＩＬ−２に関するＩＬ−２活性は、同一のアッセイを使用し、かつユニット／ｍｇにおけるそれらの活性は同様である。ヒトＩＬ−２薬剤、すなわちアルデスロイキン（プロロイキン）に関して、ＩＬ−２の量の標準的な尺度は技術的に一定の量ではないが、生物学的活性の特異的なアッセイ、すなわちＣＴＬＬ増殖アッセイにおいて一定の効果を生じる量である国際単位（ＩＵ）である。実際には、ＩＬ−２の製造は標準化され、かつ薬剤重量と国際単位間に変換が存在する。それは１．１ｍｇのＩＬ−２＝１８百万ＩＵ（１８ＭＩＵと省略される）。

【0077】

適切な用量の機能的な薬剤は、調節される活性に関する活性剤の効能に依存するとさらに理解される。かかる適切な用量は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定されてもよい。さらに、それは、任意の特定の動物対象に関する特定の用量レベルは、利用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事、投与時間、投与経路、排泄速度、および／または任意の薬剤の組み合わせを含む種々の因子に依存するだろうと理解される。

【0078】

投与が治療目的である場合、投与は、予防的なまたは治療目的のいずれかであり得る。予防的に提供される場合、当該物質は任意の症状より前に提供される。物質の予防的投与は、任意のその後の症状を予防する、または軽減するのに役立つ。治療的に提供される場合、物質は症状の開始（または直後）に提供される。物質の治療的投与は、任意の実際の症状を軽減するのに役立つ。

【0079】

当業者は、対象の疾患または障害の重症度、以前の治療、全般的な健康状態および／もしくは年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象を効率的に治療するために必要とされる用量に影響し得ることを認識するだろう。さらに、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質による対象の治療は、単回の治療を含むことができ、または、好ましくは、一連の治療を含むことができる。特定の治療の経過にわたって、増加または減少してもよいことも認識されるだろう。用量の変化は、本明細書中に記載される診断検査の結果から生じ、明らかになり得る。

【0080】

治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、動物研究により決定され得る。動物アッセイが使用される場合、用量は、動物アッセイにおいて有効であることが示されているものと同様の標的インビボ濃度を提供するために投与される。

【0081】

ｉｉ．免疫応答を減少させるための方法
対象における免疫応答を減少させるための多様な方法が、提供される。かかる方法は、免疫応答の減少を必要とする対象に治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む。

【0082】

望ましくない免疫応答を阻害するためにＴｒｅｇの抑制力を利用することには、多くの関心がある。マウスおよびヒトのデータは、低用量のＩＬ−２でＩＬ−２Ｒシグナル伝達を増強することは、選択的にＴｒｅｇを高め、かつ免疫寛容原性機構を増強することを示す。本明細書中で提供されるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、より潜在的にＴｒｅｇを増強するＩＬ−２の新規かつ改善された形態を表す。従って、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、自己免疫性疾患、慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応、および目的が自己反応性を抑制することである他の状態を有する患者に投与され得る。

【0083】

例えば、免疫寛容を促進する治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、例えば、移植片拒絶およびアレルギーを含むがこれらに限定されない自己免疫性または炎症性障害を有する対象を治療する際に使用され得る。従って、一実施形態では、自己免疫性または炎症性障害を有する対象を治療する方法が提供される。かかる方法は、対象に、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む。

【0084】

治療し、または予防することができる自己免疫異常の非限定例は、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎または全身性硬化症、移植片対宿主病、ＨＣＶ誘発性血管炎、円形脱毛症または乾癬を含む。

【0085】

さらなる自己免疫性疾患は、Ｔｒｅｇが障害を受けている可能性があり、かつＩＬ−２依存性のＴｒｅｇを高めることの恩恵を受けるであろうという兆候が既にあるものを含む。この点について、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα、またはＩＬ−２Ｒ１３中の一塩基多型（ＳＮＰ）は、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および全身性硬化症に関する遺伝的リスクとして関連付けられている。研究は、遺伝的リスクは、障害性のＴｒｅｇの数および／または活性に関連していることを示唆している。さらに、低用量のＩＬ−２治療は、慢性のＧｖＨＤおよびＨＣＶ誘発性血管炎を有する患者に恩恵をもたらすことを示した。従って、かかる患者集団には、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質が投与され得る。

【0086】

他の実施形態では、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は治療剤と組み合わせて使用され得、当該治療剤（すなわち、タンパク質）に対する免疫応答を減少させ得る。例えば、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、慢性的に対象に投与されなければならない治療剤タンパク質と組み合わせて使用され得る。従って、具体的な実施形態では、当該方法は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質と組み合わせて少なくとも１つのさらなる治療剤を、対象に投与することを含む。かかる治療剤は、サイトカイン、グルココルチコイド、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンまたはエピルビシン）、フルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン）、葉酸代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート）、代謝拮抗薬（例えば、フルオロウラシル）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカンまたはエトポシド）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、ミトラクトール、またはメルファラン）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、白金化合物（例えば、シスプラチン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビノレルビン、ビンブラスチンまたはビンデシン）、または有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）を含むが、これらに限定されない。

【0087】

さらに、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、Ｔｒｅｇおよび耐性を増加させる併用療法においてさらに投与され得る。かかる併用療法は、抗ＴＮＦαまたは炎症反応を阻害する他の薬剤と組み合わせた治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を含むことができる。

【0088】

免疫応答を減少させるために有用な治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、治療される対象、苦痛の重篤度、およびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の投与様式に依存するだろう。典型的な用量は、成人一人当たり約１０^３ＩＵから約１０^６ＩＵのＩＬ−２活性または成人一人当たり約１０^４ＩＵから約１０^６ＩＵのＩＬ−２活性を含む。典型的な用量は、成人一人当たり約１０^３から約１０^６ＩＵのＩＬ−２活性、成人一人当たり約１０^３から約１０^４ＩＵのＩＬ−２活性、成人一人当たり約１０^４から約１０^６ＩＵのＩＬ−２活性、成人一人当たり約１０^４から１０^５ＩＵのＩＬ−２活性、または成人一人当たり約１０^５から約１０^６ＩＵのＩＬ−２活性を含む。他の実施例では、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、約１０^４ＩＵ±１００倍のＩＬ−２活性であり、約１０^４ＩＵ±１０倍のＩＬ−２活性、約１０^４ＩＵ±２倍のＩＬ−２活性、約１０^４ＩＵ±２０倍のＩＬ−２活性、約１０^４ＩＵ±３０倍のＩＬ−２活性、約１０^４ＩＵ±４０倍のＩＬ−２活性、約１０^４ＩＵ±５０倍のＩＬ−２活性、約１０^４ＩＵ±６０倍のＩＬ−２活性、約１０^４ＩＵ±７０倍のＩＬ−２活性、約１０^４ＩＵ±８０倍のＩＬ−２活性、または約１０^４ＩＵ±９０倍のＩＬ−２活性である。具体的な非限定的な実施形態では、ヒトＩＬ−２融合タンパク質は、この用量で投与される。

【0089】

一実施形態では、マウスＩＬ−２融合タンパク質に関する参照標準は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のマウスＩＬ−２（カタログ番号：１４−８０２１）である。簡潔に述べると、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のマウスＩＬ−２の生物活性は以下の通りである：ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイにより測定されるこのタンパク質のＥＤ５０は、１７５ｐｇ／ｍＬ以下である。これは、５．７ｘ１０^６ユニット／ｍｇ以上の比活性に相当する。

【0090】

別の実施形態では、ヒトＩＬ−２融合タンパク質に関する参照標準は、ヒトＩＬ−２薬剤アルデスロイキン（プロロイキン）である。従って、本明細書中に開示されるＩＬ−２融合タンパク質は、低用量または高用量のＩＬ−２治療において使用されるＩＬ−２薬剤との融合タンパク質と直接比較される。マウスおよびヒトＩＬ−２に関するＩＬ−２活性は、同一のアッセイを使用し、かつユニット／ｍｇにおけるそれらの活性は同様である。ヒトＩＬ−２薬剤、すなわちアルデスロイキン（プロロイキン）に関して、ＩＬ−２の量の標準的な尺度は技術的に一定の量ではないが、生物学的活性の特異的なアッセイ、すなわちＣＴＬＬ増殖アッセイにおいて一定の効果を生じる量である国際単位（ＩＵ）である。実際には、ＩＬ−２の製造は標準化され、かつ薬剤重量と国際単位間に変換が存在する。それは１．１ｍｇのＩＬ−２＝１８百万ＩＵ（１８ＭＩＵと省略される）。

【0091】

適切な用量の機能的な薬剤は、調節される発現または活性に関する活性剤の効能に依存するとさらに理解される。かかる適切な用量は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定されてもよい。さらに、それは、任意の特定の動物対象に関する特定の用量レベルは、利用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事、投与時間、投与経路、排泄速度、および／または任意の薬剤の組み合わせを含む種々の因子に依存するだろうと理解される。

【0092】

投与が治療目的である場合、投与は、予防的なまたは治療目的のいずれかであり得る。予防的に提供される場合、当該物質は任意の症状より前に提供される。物質の予防的投与は、任意のその後の症状を予防する、または軽減するのに役立つ。治療的に提供される場合、物質は症状の開始（または直後）に提供される。物質の治療的投与は、任意の実際の症状を軽減するのに役立つ。

【0093】

当業者は、対象の疾患または障害の重症度、以前の治療、全般的な健康状態および／もしくは年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象を効率的に治療するために必要とされる用量に影響し得ることを認識するだろう。さらに、治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質による対象の治療は、単回の治療を含むことができ、または、好ましくは、一連の治療を含むことができる。特定の治療の経過にわたって、増加または減少してもよいことも認識されるだろう。用量の変化は、本明細書中に記載される診断検査の結果から生じ、明らかになり得る。

【0094】

治療有効量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、動物研究により決定され得る。動物アッセイが使用される場合、用量は、動物アッセイにおいて有効であることが示されているものと同様の標的組織濃度を提供するために投与される。

【0095】

ｉｉｉ．医薬組成物
本明細書中に開示される多様なＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質（本明細書中で「活性化合物」としても称される）は、投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。かかる組成物は、典型的には、融合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という語は、薬学的投与に適合する、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌性および抗真菌性の薬剤、等張剤および吸収遅延薬剤等を含むことを意図する。薬剤的に活性な物質に関する、かかる培地および薬剤の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の培地または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物におけるその使用が考慮される。補助活性化合物も組成物に組み込まれ得る。

【0096】

本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方される。投与経路の例は、非経口的、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、および経粘膜を含む。さらに、治療有効量の医薬組成物を局所的に治療を必要とする領域に投与することが望ましいことがある。これは、例えば、局所（ｌｏｃａｌ）または領域（ｒｅｇｉｏｎａｌ）注入または手術中の灌流、局所投与、注射、カテーテル、坐薬、または移植（例えば、シラスティックな（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜または線維を含む、多孔性の、非多孔性の、またはゼラチン質の材料から形成される移植）等により達成され得る。別の実施形態では、治療有効量の医薬組成物は、リポソームなどの小胞中に送達される（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−３３，１９９０ ａｎｄ Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３５３−６５，１９８９を参照されたい）。

【0097】

さらに別の実施形態では、治療有効量の医薬組成物は、放出制御システムで送達され得る。一実施例では、ポンプが使用され得る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−３３，１９９０；Ｓｅｆｔｏｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−４０，１９８７；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７−１６，１９８０；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−７９，１９８９を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒにより説明されたものなどの他の放出制御システム（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−３３，１９９０）も使用され得る。

【0098】

非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射、生理食塩水の水などの無菌希釈液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸塩などの緩衝液ならびに塩化ナトリウムもしくはブドウ糖などの浸透圧の調整に関する薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなど酸または塩基と調節ことができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量のガラスまたはプラスチック製のバイアルに封入され得る。

【0099】

注射使用に適した医薬組成物は、無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌粉末を含む。静脈内投与のために、適した担体は、生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬJ（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合では、組成物は無菌でなければならず、かつ容易な注射可能性が存在する程度に流動的であるべきである。製造および保存の条件下で安定でなければならなず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）を含有する溶媒もしくは分散培地ならびにそれらの適した混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持により、および界面活性物質の使用により維持され得る。微生物の作用の予防は、多様な抗菌性および抗真菌性の薬剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成され得る。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射組成物の延長された吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中にを含むことによりもたらされ得る。

【0100】

無菌注射溶液は、必要に応じて、適切な溶媒中に活性化合物を上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせ必要量で組み込み、次いで濾過滅菌により調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散培地および上記に列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する無菌のビヒクルに組み込むことにより調製される。無菌注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その予め滅菌濾過した溶液からの有効成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。

【0101】

吸入による投与に関して、化合物は、適した噴霧剤、例えば二酸化炭素等のガスを含有する加圧容器またはディスペンサー（ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）または噴霧器からエアロゾル噴霧の形態で送達される。

【0102】

全身投与は、経粘膜的または経皮的な手段によってもあり得る。経粘膜または経皮投与に関して、障壁を透過するのに適切な浸透剤は、製剤中に使用される。かかる浸透剤は当技術分野で一般的に知られており、かつ経粘膜投与に関して、例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬または坐薬の使用を介して達成され得る。経皮投与に関して、活性化合物は、当技術分野で一般的に知られている軟膏、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに配合される。化合物はまた、坐薬（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を用いて）または直腸送達のための保持浣腸の形態で調製され得る。

【0103】

一実施形態では、活性化合物は、移植およびマイクロカプセル化されたデリバリーシステムを含む放出制御製剤など、身体からの急速な除去から化合物を保護するだろう担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーは、使用され得る。かかる製剤の調製のための方法は当業者に明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からも商業的に得られ得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いる感染細胞に標的化されたリポソームを含む）は、薬学的に許容可能な担体として使用され得る。これらは、当業者に知られている方法、例えば、米国特許番号第４，５２２，８１１号に記載される方法によって調製され得る。

【0104】

投与の容易さおよび用量の均一性のために、用量単位形態で経口または非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書中で使用される用量単位形態は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生産するよう計算された所定の量の活性化合物を含有する、それぞれの単位で治療される対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を指す。本発明の用量単位形態に関する仕様は、活性化合物の独自の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに個々の治療のためのかかる機能的な化合物を調合する技術分野で固有の制限により決定され、かつ直接的に依存する。

【0105】

医薬組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、またはディスペンサー（ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）に入れることができる。

【0106】

ｉｖ．キット
本明細書中で使用される場合、「キット」は、本明細書中の他の所で記載されるように、免疫応答を調節することにおける使用のためのＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を含む。本明細書中で使用される場合、「キット」および「系」という用語は、具体的な実施形態では、１つ以上の他の種類の要素または構成要素（例えば、他の種類の生化学試薬、容器、商業販売を目的とする包装などのパッケージ、使用説明書等）と組み合わせた少なくとも１つ以上のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を指すことを意図する。

【0107】

Ｖ．配列同一性
上述したように、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の多様な構成要素を含む、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の活性バリアントおよび断片、または同一のものをコードするポリヌクレオチドが提供される。かかる構成要素は、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメイン、リンカー配列またはコザック配列を含む。融合タンパク質の活性バリアントもしくは断片または融合タンパク質の所与の構成要素により保持される活性は、本明細書の他の所でさらに詳細に説明される。

【0108】

かかるバリアントは、所与の参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。断片は、少なくとも１０、２０、３０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００の連続ヌクレオチドの所与の参照ヌクレオチド配列または所与のヌクレオチド参照配列の全長までを含むことができる；または断片は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００の連続アミノ酸または所与の参照ポリペプチド配列の全長までを含むことができる。

【0109】

本明細書中で使用される場合、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の関連における「配列同一性」または「同一性」は、指定の比較ウィンドウに最大限の一致について整列された場合に同一である、２つの配列中の残基を参照する。配列同一性の割合がタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが多いと認識されており、ここで、アミノ酸残基は、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換されおり、従って分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整されてもよい。かかる保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有する。この調整をするための手段は、当業者によく知られている。典型的には、これは、完全なミスマッチよりむしろ部分的なものとして保存的置換をスコアリングすることに関係し、それによって配列同一性の割合を増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸は１のスコアが与えられ、非保存的置換は０のスコアが与えられている場合、保存的置換は０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に実装されているように計算される。

【0110】

本明細書中で使用される場合、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウの２つの最適に整列された配列の比較により決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントに関する参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ（ｇａｐ））を含んでもよい。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在し、一致した位置の数を生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の全数で割り、かつ配列同一性の割合を得るためにその結果に１００を掛けることにより計算される。

【0111】

特に明記しない限り、本明細書中で提供される配列同一性／類似性の値は、以下のパラメータを使用するＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を指す：５０のＧＡＰウェイトおよび３の長さウェイト（Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ）、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア化マトリックス；８のＧＡＰウェイトおよび２の長さウェイト（Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ）を使用するヌクレオチド配列に関する％同一性および％類似性、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックスを使用するアミノ酸配列に関する％同一性および％類似性；またはそれらと同等の任意のプログラム。「同等のプログラム」という用語は、問題となる任意の２つの配列に関して、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致を有するアライメントおよびＧＡＰバージョン１０により生成された対応しているアライメントと比較した場合、同一のパーセント配列同一性を生成する、任意の配列比較プログラムを意図する。

【0112】

本明細書中で使用される場合、単数の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に示さない限り、複数の参照対象を含む。同様に、「または（ｏｒ）」という用語は、文脈が明確に示さない限り、「および（ａｎｄ）」を含むことを意図する。核酸またはポリペプチドについて、全ての塩基サイズもしくはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量または分子量値は近似が与えられ、かつ説明のために提供されるとさらに理解される。

【0113】

本開示の主題は、以下の非限定例によりさらに説明される。

【実施例1】

【0114】

実験
ＩＬ−２は、癌およびＨＩＶ／ＡＩＤ患者における免疫応答を高めるための試みにおいて使用されてきた生物製剤である。より最近では、はるかに低用量のＩＬ−２を、自己組織の自己免疫様攻撃に関連する望ましくない免疫応答を抑制するために選択的に耐性を高めるために使用されてきた。重要なことに、これらの低用量のＩＬ−２は、自己反応性Ｔ細胞の増強または再活性化の兆候を示さなかった。それにもかかわらず、ＩＬ−２は、その有効性を限定するインビボでの非常に短い半減期、および高用量での毒性を含み、治療剤として重大な欠点を有する。これらの理由から、新規のＩＬ−２生物製剤を、その薬物動態ならびに１）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および免疫寛容を高めるための低用量のＩＬ−２−ベースの治療および２）免疫応答および免疫メモリーを高めるためのより高用量での補助療法、における使用のための応答の持続性を改善する目的で生産した。これらの目的を達成するために、インビボでＩＬ−２Ｒ−ベアリングリンパ球の持続性のＩＬ−２刺激の増加によりＩＬ−２の有効性を増加させるようにこれらの融合を設計し、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質を開発した。これらの融合は、以下の通り操作されたタンパク質からなる（図１）：１）効率的な翻訳のための最適化されたコザック配列を含有する、ＩＬ−２のリーダー配列；２）ＩＬ−２の全長配列；３）可変長のリシンまたはグリシン／セリンリンカー配列；４）発現するＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインのコード配列；５）２アミノ酸グリシンスペーサー；６）精製のための６アミノ酸ポリヒスチジン領域；および７）２つの終止コドン。これらのマウスおよびヒトｃＤＮＡ由来の予測されたタンパク質配列は、それぞれ図２Ａおよび図２Ｂにおいて、ＩＬ−２／（ＧｌｙＳｅｒ）／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質に関して示される。これらのｃＤＮＡをｐＣｌｎｅｏ発現ベクターにクローン化し、かつＣＯＳ７細胞におけるこれらの融合タンパク質の発現に使用した。培養上清の解析は、それぞれのマウス融合タンパク質が、インビトロでＩＬ−２生物活性を示し、ＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質に関連するものが最適な活性であることを示した（図３Ａ）。従って、この生物検定における抗ＩＬ−２の包含は、増殖を完全に阻害した（図３Ｂ）。より多い量のＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−２／（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４／ＩＬ−２ＲαをＣＨＯ細胞における発現後に調製し、かつ固定化されたニッケルへの融合タンパク質の６ｘＨｉｓタグの結合を介するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。両方の融合タンパク質が同様に、ＩＬ−２Ｒαを発現する細胞への、２つの抗ＩＬ２Ｒα抗体（ＰＣ６１および７Ｄ４）の結合を阻害したが（図４Ｂ）、マウスＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、ＩＬ−２／（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４／ＩＬ−２Ｒαより大きいＩＬ−２生物活性を示し（図４Ａ）、より大きいＩＬ−２活性は前者の融合タンパク質に関連することを確認した。ＰＣ６１および７Ｄ４の結合の阻害は、融合タンパク質のＩＬ−２Ｒα部分が、これらの抗体に結合するのに十分な三次構造を保持したことも示す。しかしながら、これらの融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒαを発現する細胞への、ＩＬ−２ＲαのＩＬ−２結合部位に対するモノクローナル抗体（３Ｃ７）の結合を阻害しなかった。この結果は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質内のＩＬ−２が、ＩＬ−２Ｒαの結合部位に空間的に近いことを意味する（図５）。これらの融合タンパク質のウェスタンブロット解析は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαが５５−６５ｋＤａであり、非還元条件下で幾分か速い移動度であり、かつそれは可溶性のＩＬ−２Ｒαについて観察されたものより約１５ｋＤａ大きいことを示した（図６Ａ）。これ対応して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製されたマウスＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒαの直接解析は、異種の５５−６５ｋＤａ単量体タンパク質と一致し（図６Ｂ）、これはＩＬ−２（１５ｋＤａ）とＩＬ−２Ｒα（４０−５０ｋＤａ）融合分子について予測されたサイズであり（図６）、ここで、ＩＬ−２Ｒαは、広範な可変グリコシル化によるサイズ異質性を示す（Ｍａｌｅｋ ａｎｄ Ｋｏｒｔｙ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：４０９２−４０９８，１９８６）。ＩＬ−２依存性シグナル伝達の直接の結果は、ＳＴＡＴ５のチロシンリン酸化（ｐＳＴＡＴ５）である。マウスＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒαによるマウスの治療は、治療３０分後に、ＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５の広範かつ選択的な活性化をもたらした（図７）。用量反応研究は、マウスＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒαは、インビボでＴｒｅｇの多くの主要な活性に影響したことを示した（図８）。Ｔｒｅｇに対するこれらの効果は、以下を含んだ：ＣＤ４^＋Ｔ細胞区画におけるＴｒｅｇの増加した提示（図８Ａ）および数（未掲載）；ＩＬ−２依存性ＣＤ２５の増加（図８Ｂ）；増殖マーカーＫｉ６７の発現により評価される増加した増殖（図８Ｃ）；およびＩＬ−２依存性の最終分化したＫｌｒｇ１^＋Ｔｒｅｇサブセットの分画の増加（図８Ｄ）。これらの効果は、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの脾臓および炎症性膵臓におけるＴｒｅｇについて最も顕著であった。標準ＣＴＬＬ ＩＬ−２生物検定において測定されるように、ＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒαに関連する１０００ユニットのＩＬ−２活性は、より低いが、Ｔｒｅｇに対して容易に測定可能な効果を示した（図８）。ＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒα（２０００ユニットのＩＬ−２活性）で治療されたＣ５７／ＢＬ６マウスに、組換え型ＩＬ−２（２５，０００ユニット）またはＩＬ−２／抗ＩＬ−２のアゴニスト複合体（ＩＬ２／ＩＣ）（１０，０００ユニットのＩＬ−２活性）を投与したマウスと比較した（図９）。ＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒαは、Ｔｒｅｇの持続的な増大および関連する特性を誘導することにおいて、組換え型ＩＬ−２よりもはるかに有効であり、ＩＬ２／ＩＣよりもわずかに有効である（図９）。免疫寛容原性Ｔｒｅｇにおけるこれらの増加は、ＩＬ２／ＩＣおよび組換え型ＩＬ−２と比較して、それぞれ、５および１２．５倍低いレベルのＩＬ−２活性だった。直接的に生体外でのＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５のＩＬ−２依存性活性化を考慮すると（図９）、これらのデータは、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαに関して約７２時間の生物学的半減期を示唆する。糖尿病前のＮＯＤマウスは低量のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαで短期の治療を受けた（図１０）。ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαに関連する８００ＵのＩＬ−２活性で治療されたそれらのマウスにおいて、糖尿病の発症の遅延が観察された。免疫に関して、単回高用量のＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒα（１２，０００ＵのＩＬ−２活性）の適用もまた、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答、特に長寿命の免疫メモリー細胞を実質的に高めた（図１１）。免疫化後の初期（２８日）に、ＣＤ４４^ｈｉＣＤ６２Ｌ^ｌｏＣＤ１２７^ｈｉエフェクターメモリー（ＥＭ）細胞はメモリープールを支配した；しかしながら、時間の増加とともにＣＤ４４^ｈｉ ＣＤ６２Ｌ^ｈｉ ＣＤ１２７^ｈｉセントラルメモリー（ＣＭ）細胞が増加し、ＣＭ細胞は免疫化後２０２日でメモリープールを支配した（図１２）。従って、ＩＬ−２／（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３／ＩＬ−２Ｒαは組換え型ＩＬ−２と類似の様式で機能して、免疫寛容原性および免疫抑制性ＴｒｅｇおよびＴエフェクター／メモリー応答の増加を介する免疫を高めるが、それは、１）より低い有効レベルのＩＬ−２活性で；２）より持続的な生物学的反応で；および３）Ｔエフェクター／免疫メモリー細胞より低用量で応答するＴｒｅｇで階層を保持して、かかる応答を提供することにより改善された薬物動態を示す。これらの知見は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質が、適切な用量およびレジメンで投与される場合に免疫寛容または免疫メモリーを選択的に高める、ＩＬ−２活性を送達する薬剤の、改善されかつ新規のクラスを示すという考えを支持する。

【0115】

ヒトＩＬ−２およびヒトＩＬ−２Ｒαを含むＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質もまた生産された（図１、図２Ｂ）。これらのｃＤＮＡをＣＨＯ細胞において発現させ、かつ分泌された融合タンパク質を、６ｘ−Ｈｉｓタグに基づくニッケルアフィニティークロマトグラフィーで精製した。融合タンパク質は、マウスＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαに使用されるものと類似の様式でグリシン／セリンリンカーの長さが変化した。得られたヒトＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の４つ全てが、マウスＣＴＬＬアッセイを使用してＩＬ−２生物活性を示した（図１３Ａ）。ウェスタンブロット解析は、ヒトＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαがまた、５５から６０ｋＤａの間に異種のバンドを示し（図１３Ｂ）、ＩＬ−２Ｒαに結合したＩＬ−２について予測された高度にグリコシル化された分子と一致したことを確認した。

【0116】

（Ｇ_３Ｓ）_３および特に（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーを有するＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質は、等量のＩＬ−２活性をそれぞれのレーンにロードしたにもかかわらず、より少ない融合タンパク質が見られたため、より高い活性を有してもよい（図１３Ｂ）。抗ＩＬ−２Ｒαモノクローナル抗体、Ｍ−Ａ２５７およびＢＣ９６のヒトＩＬ−２Ｒα関連細胞への、融合タンパク質の結合を阻害する能力は、融合タンパク質のＩＬ−２Ｒαが、これらの抗体に結合するのに十分な三次構造を保持したことを示す（図１４）。しかしながら、これらの融合タンパク質ＩＬ−２ＲαのＩＬ−２結合部位に対するモノクローナル抗体（ＢＣ９６）の結合を部分的にのみ阻害し、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質内のＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒαの結合部位に空間的に近いことを意味する。さらに、我々は、（Ｇ_３Ｓ）_３リンカーを含有するマウスおよびヒトＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の比活性が、１ユニット／ｍｌのＩＬ−２生物活性活性についてそれぞれ８０および２０００ｐＭであると推定した。これらの値は、１ユニット／ｍｌで１０ｐＭである組換え型ＩＬ−２の活性よりはるかに高い。ヒトとマウスＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα間の異なる活性は、ヒト融合タンパク質の相対的な非有効性により少なくとも部分的に説明され、マウス融合タンパク質またはマウスとヒト組換え型ＩＬ−２と比較して、生物検定におけるマウスＣＴＬＬ細胞の増殖を支持する（未掲載）。これらの相対的に低い比活性および抗体ブロッキングの結果（図５および図１２）は、ＩＬ−２Ｒを有する細胞を刺激するために融合タンパク質中のＩＬ−２の量を制限する融合タンパク質との関連において、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒαの間の特異的な分子内相互作用が存在する可能性を高めた。この考えを直接的に試験するために、ヒトＩＬ−２Ｒα（Ｒｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５６５４−５６５８，１９８８を参照されたい）のＩＬ−２結合部位内の２つのアルギニン残基をスレオニンおよびセリンに変異させた。我々はこれらの変異体ＩＬ−２Ｒ融合タンパク質に関連するはるかに大きい生物活性を検出した（図１５）；変異したＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の比活性は、１ユニット／ｍｌのＩＬ−２活性について約５ｐＭであると推定され、値は組換え型ＩＬ−２と非常に類似していた。従って、これらのデータは、ヒトＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαが生物学的に活性であり、かつこれらの融合タンパク質における延長されたＩＬ−２活性を説明する１つの特異的な作用機構が、ＩＬ−２Ｒα融合タンパク質のＩＬ−２結合領域を有するＩＬ−２部分とＩＬ−２Ｒを発現する細胞を有するＩＬ−２部分の間の競合的な相互作用を介することを示す。

【0117】

表１．配列のまとめ

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【0118】

本明細書で言及された全ての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が出典明示により組み込まれるように具体的にかつ個別に示されたのと同程度に、出典明示により本明細書中に組み込まれる。

【0119】

前述の発明は、理解を明確にするために図および例によって幾分か詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内で特定の変更および改変が実施されてもよいことは明らかであろう。

【図1】

【図2-A】

【図2-B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]