特許 6724105 ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための方法、そのペプチドを生成するためのプロセス、前記方法／プロセスを用いて入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドおよびＡＰＲＩＬ結合ペプチドの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6724105

(24)【登録日】2020年6月26日

(45)【発行日】2020年7月15日

(54)【発明の名称】ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための方法、そのペプチドを生成するためのプロセス、前記方法／プロセスを用いて入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドおよびＡＰＲＩＬ結合ペプチドの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20200706BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20200706BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200706BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200706BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C12N15/13

   C12P21/08

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   G01N33/53 D

【請求項の数】8

【外国語出願】

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2018-206560(P2018-206560)

(22)【出願日】2018年11月1日

(62)【分割の表示】特願2016-540838(P2016-540838)の分割

【原出願日】2014年9月5日

(65)【公開番号】特開2019-55957(P2019-55957A)

(43)【公開日】2019年4月11日

【審査請求日】2018年11月29日

(31)【優先権主張番号】2011406

(32)【優先日】2013年9月6日

(33)【優先権主張国】NL

(73)【特許権者】

【識別番号】512333423

【氏名又は名称】アデュロ・バイオテック・ホールディングス・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップ

【氏名又は名称原語表記】ＡＤＵＲＯ ＢＩＯＴＥＣＨ ＨＯＬＤＩＮＧＳ， ＥＵＲＯＰＥ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ファン・エーネンナーム，ハンス

(72)【発明者】

【氏名】ファン・エルサス，アンドレア

(72)【発明者】

【氏名】ドリエッセン，リリアン

(72)【発明者】

【氏名】メデマ，ヤン・パウル

【審査官】 金田 康平

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５１９１９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５０９９４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５３７２９０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ・ＷＰＩ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫グロブリンＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含むＡＰＲＩＬ結合ペプチドであって、
Ｖ_Ｈドメインが、重鎖ＣＤＲ１の位置に配列番号２５で示される相補性決定領域配列、重鎖ＣＤＲ２の位置に配列番号２６で示される相補性決定領域配列および重鎖ＣＤＲ３の位置に配列番号２７で示される相補性決定領域配列を有し、配列番号２３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、
Ｖ_Ｌドメインが、軽鎖ＣＤＲ１の位置に配列番号２８で示される相補性決定領域配列、軽鎖ＣＤＲ２の位置に配列番号２９で示される相補性決定領域配列および軽鎖ＣＤＲ３の位置に配列番号３０で示される相補性決定領域配列を有し、配列番号２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＡＰＲＩＬ結合ペプチド。

【請求項2】

Ｖ_Ｈドメインが、配列番号２３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、Ｖ_Ｌドメインが、配列番号２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＡＰＲＩＬ結合ペプチド。

【請求項3】

Ｖ_Ｈドメインが配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、Ｖ_Ｌドメインが配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＡＰＲＩＬ結合ペプチド。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列。

【請求項5】

請求項４に記載のヌクレオチド配列を含む宿主細胞。

【請求項6】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを産生するためのプロセスであって、
請求項５に記載の細胞を提供するステップと、
前記ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを発現する、好ましくは分泌するように、前記細胞を培養するステップとを含む、プロセス。

【請求項7】

試料中のＡＰＲＩＬの存在またはＡＰＲＩＬの量を検出するための診断試験における、請求項１〜３にいずれか１項に記載のＡＰＲＩＬ結合ペプチドの使用。

【請求項8】

前記試料がヒトから得られた組織試料である、請求項７に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、医学的／獣医学的診断および医学的／獣医学的研究を含むヒトおよび動物の医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、この分野または他の分野において使用するのに適した、モノクローナル抗体を含む、ＡＰＲＩＬ結合ペプチド（ｐｅｔｉｄｅｓ）に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
ＡＰＲＩＬは、ＩＩ型膜貫通タンパク質として発現されるが、他のほとんどのＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、主に分泌タンパク質としてプロセシングされ、ゴルジ装置において切断されるものであり、そのゴルジ装置において、フーリンコンバターゼによって切断されて、活性な可溶型が放出される（Ｌｏｐｅｚ−Ｆｒａｇａ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ２：９４５−５１，）。ＡＰＲＩＬは、タンパク質の折り畳みが他のいくつかのＴＮＦファミリーリガンドと類似の構造的相同性を有する、非共有結合的に連結されたホモ三量体として集合する（Ｗａｌｌｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４３，２８３−９０）。ＡＰＲＩＬは、２つのＴＮＦレセプター：Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）ならびに膜貫通型活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ａｎｄ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）（ＴＡＣＩ）に結合する（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１８（１）：１−８に概説されている）。さらに、ＡＰＲＩＬは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合すると最近示された（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｅｌｌ
Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ １２，６３７−４８）。ＡＰＲＩＬは、Ｂ細胞シグナル伝達に関与すると示されており、インビトロにおいてヒトＢ細胞およびマウスＢ細胞の増殖と生存の両方を駆動するとも示されている（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１８（１）：１−８に概説されている）。

【0003】

ＡＰＲＩＬは、主に、免疫細胞サブセット、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、Ｂ細胞およびＴ細胞によって発現され、それらの多くは、ＢＡＦＦも発現する。さらに、ＡＰＲＩＬは、非免疫細胞、例えば、破骨細胞、上皮細胞および種々の腫瘍組織によって発現され得る（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃｅｌｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１８（１）：１−８に概説されている）。実際に、ＡＰＲＩＬは、当初、癌細胞におけるその発現に基づいて同定された（Ｈａｈｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８，１１８５−９０）。ＡＰＲＩＬ ｍＲＮＡの高発現レベルが、腫瘍細胞株のパネル、ならびにヒト原発腫瘍、例えば、結腸、およびリンパ系癌腫において見られた。

【0004】

９５人の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）ＣＬＬ患者における遡及研究は、血清中のＡＰＲＩＬレベルの上昇を示し、これは、疾患の進行および全体的な患者生存時間と相関し、ＡＰＲＩＬ血清レベルが高い患者では予後がより不良だった（Ｐｌａｎｅｌｌｅｓ ｅｔ
ａｌ．，２００７，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９２，１２８４−５）。同様に、（高レベルの）ＡＰＲＩＬが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）において発現されると示された（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．
，２００９，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１８（１）：１−８に概説されている）。ＤＬＢＣＬ患者（ＮＨＬ）における遡及研究は、癌病変における高いＡＰＲＩＬ発現が、不良な生存率と相関することを示した（Ｓｃｈｗａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｌｏｏｄ １０９，３３１−８）。最近、直腸結腸癌に罹患している患者由来の血清中のＡＰＲＩＬ血清レベルが、陽性の診断価値を有すると示された（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｌｉｎｂｉｏｃｈｅｍ．２０１３．０６．００８）。

【0005】

ＡＰＲＩＬは、Ｂ細胞の生態におけるその役割に起因して、多くの自己免疫疾患にも関与する。ＡＰＲＩＬの高い血清レベルは、多くのＳＬＥ患者において報告されている（Ｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６４，１０６５−７）。遡及的解析から、ＡＰＲＩＬ血清レベルが、抗ｄｓＤＮＡ抗体価と相関する傾向があることが明らかになった。また、炎症性関節炎を有する患者の滑液中でも、変形性関節症などの非炎症性関節炎に罹患している患者のＡＰＲＩＬレベルと比べて有意に高いＡＰＲＩＬレベルが検出された（Ｓｔｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｅｎｄｏｃｒ Ｍｅｔａｂ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｏｒｄ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ６，３５１−８；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８，９８２−９２）。

【0006】

いくつかの研究が、全身の免疫に基づくより広範囲のリウマチ性疾患（現在では、シェーグレン症候群、ライター症候群、乾癬性関節炎、多発性筋炎および強直性脊椎炎も含む）に罹患している患者の血清中のＡＰＲＩＬの存在に焦点を当てたところ、これらの患者において有意に高いＡＰＲＩＬレベルが見出されたことから、同様にこれらの疾患におけるＡＰＲＩＬの重要な役割が示唆された（Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｓｕｐｐｌ ６１，１６６−９；Ｒｏｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９，４３１４−２１）。さらに、上昇したＡＰＲＩＬ血清レベルは、アトピー性皮膚炎に罹患している患者由来の血清でも検出された（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １７，１９７−２０２）。また、血清ＡＰＲＩＬレベルは、敗血症においても上昇し、危篤状態の患者における死亡を予測する（Ｒｏｄｅｒｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ，２０１３，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｃｒｃ．２０１２．１１．００７）。最後に、上昇したＡＰＲＩＬ発現は、多発性硬化症（ＭＳ）にも関連する。ＡＰＲＩＬ発現は、正常なコントロールと比べて、ＭＳ罹患者のアストロサイトにおいて上昇することが見出された。これは、神経膠芽腫および神経膠芽腫患者の血清における、報告されたＡＰＲＩＬ発現と一致する（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３，３００５−１２；Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ８，４０３−１０）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

要旨
疾患、例えば、以下に限定されないが自己免疫疾患、炎症性疾患および悪性疾患に対する重要なマーカーであるＡＰＲＩＬを用いた、ヒト被験体の血清中のＡＰＲＩＬの検出は、重要である。現在利用可能なアッセイは、（明確に定義されておらず、利用可能性が限られている）ポリクローナル抗体の使用を含み（Ｐｌａｎｅｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９２，１２８４−５）、血清中の報告されたＡＰＲＩＬレベルを再現せず、かつ／またはＡＰＲＩＬの定量は、ヒト血清の存在によって大きく影響され（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、実施例１を参照のこと）、ＡＰＲＩＬタンパク質レベルの評価の前に免疫グロブリン吸収工程を必要とする（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ
ａｌ．，２００７，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １７，１９７−２０２）か、または限られた検出限界を示す（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）。この従来技術の抗ＡＰＲＩＬ抗体の欠点に鑑みて、本発明の発明者らは、ヒトサンプル、好ましくは、血液由来サンプル、例えば、血清サンプルの状況におけるＡＰＲＩＬの検出に適したＡＰＲＩＬ結合ペプチドを同定し、それを得る方法の開発に着手した。特に、それらの抗体を発現するめったに豊富でないＢ細胞を、ＡＰＲＩＬを免疫されたマウスから選択する方法をデザインし、開発した。

【0008】

手短に言えば、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための本発明の方法は、以下の工程：
・バインダーペプチドのライブラリーを提供する工程；
・固体支持体上に固定化された標的ペプチドを使用する親和性選択を用いて、そのライブラリーからＡＰＲＩＬ結合ペプチドを選択する工程であって、前記標的ペプチドは、ＡＰＲＩＬの、いくつかのＡＰＲＩＬエピトープおよびＡＰＲＩＬレセプター結合領域を含む、工程
を含み、その標的ペプチドは、ＡＰＲＩＬレセプターまたはそのＡＰＲＩＬ結合等価物のＡＰＲＩＬ結合領域を含むペプチドであるシールドペプチド（ｓｈｉｅｌｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）と相互作用することを特徴とする。この方法を用いて、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドが、入手および／または選択され得る。

【0009】

開発された方法は、広く利用することができ、広範囲のＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、ＡＰＲＩＬ結合抗体を得るために使用することができる。

【0010】

本発明のさらなる態様は、本発明に係る方法を用いて入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチド、本発明に係るＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを生成するためのプロセス、およびこのプロセスを用いて入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドに関する。さらに、診断検査、好ましくは、エキソビボにおける診断検査における本発明に係るＡＰＲＩＬ結合ペプチドの使用もまた、本発明の範囲内である。

【0011】

配列の簡単な説明
配列表に提示される配列は、本発明の方法を用いて得られる５つの免疫グロブリン（ｈＡＰＲＩＬ．１３０、ｈＡＰＲＩＬ．１３２、ｈＡＰＲＩＬ．１３３、ｈＡＰＲＩＬ．１３５、ｈＡＰＲＩＬ．１３８）のＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖のアミノ酸配列およびコードするＤＮＡ配列に関する。さらに、これらの免疫グロブリンのＶ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖の両方のＣＤＲ領域のアミノ酸配列が提示される。下記の表１は、配列番号をそれらのそれぞれの配列と相互に関連させている。

【0012】

【表1-1】

【0013】

【表1-2】

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＡＰＲＩＬを検出する商業的に入手可能なアッセイ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから得られる）は、血清の存在下ではＡＰＲＩＬの定量を再現しない。直腸結腸癌患者由来のヒト血清は、ＢＣＭＡ−Ｆｃコーティングおよび検出用のポリクローナル抗体に基づくＥＬＩＳＡによって検出されたとき（ｘ軸、Ｐｌａｎｅｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００７年９月；９２（９）：１２８４−５によって報告されたようなアッセイ）または市販のＢｉｏｌｅｇｅｎｄ ＥＬＩＳＡを用いて検出されたとき（ｙ軸）、様々な量のヒトＡＰＲＩＬを含む。患者１人あたりの両方の値の間の比較から、Ｓｐｅａｒｍａｎ係数（Ｒ＝０，５９６４）によって表されるように、限られた相関関係が明らかになる。

【図2A】現在商業的に入手可能なアッセイを使用したＡＰＲＩＬの定量は、ヒト血清の存在によって負の影響を受ける。１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２３、０．４１、０．１３６および０．０４ｎｇ／ｍｌという濃度に、ＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清＋２０％ヒト血清（ＨＳ）（ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＨＳと称される）で希釈されるかまたはＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡと称される）で希釈される組換えＡＰＲＩＬを使用して、２つの標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ）を作製した。これらの２つの標準物質の検出は、以下のアッセイにおいて測定された：Ａ）Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＥＬＩＳＡ。

【図2B】現在商業的に入手可能なアッセイを使用したＡＰＲＩＬの定量は、ヒト血清の存在によって負の影響を受ける。１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２３、０．４１、０．１３６および０．０４ｎｇ／ｍｌという濃度に、ＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清＋２０％ヒト血清（ＨＳ）（ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＨＳと称される）で希釈されるかまたはＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡと称される）で希釈される組換えＡＰＲＩＬを使用して、２つの標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ）を作製した。これらの２つの標準物質の検出は、以下のアッセイにおいて測定された：Ｂ）ＢＣＭＡ−ＦＣでコーティングされ、ＡＰＲＩＬＹ−５バイオ抗体を用いて検出されるアッセイ。

【図2C】現在商業的に入手可能なアッセイを使用したＡＰＲＩＬの定量は、ヒト血清の存在によって負の影響を受ける。１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２３、０．４１、０．１３６および０．０４ｎｇ／ｍｌという濃度に、ＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清＋２０％ヒト血清（ＨＳ）（ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＨＳと称される）で希釈されるかまたはＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡと称される）で希釈される組換えＡＰＲＩＬを使用して、２つの標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ）を作製した。これらの２つの標準物質の検出は、以下のアッセイにおいて測定された：Ｃ）Ｓａｓｈａ−２でコーティングされ、ＡＰＲＩＬＹ−５抗体を用いて検出されるアッセイ。

【図2D】現在商業的に入手可能なアッセイを使用したＡＰＲＩＬの定量は、ヒト血清の存在によって負の影響を受ける。１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２３、０．４１、０．１３６および０．０４ｎｇ／ｍｌという濃度に、ＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清＋２０％ヒト血清（ＨＳ）（ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＨＳと称される）で希釈されるかまたはＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡと称される）で希釈される組換えＡＰＲＩＬを使用して、２つの標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ）を作製した。これらの２つの標準物質の検出は、以下のアッセイにおいて測定された：Ｄ）Ｒ＆Ｄ ＥＬＩＳＡ。

【図3】血清中での検出を可能にするＡＰＲＩＬ結合ペプチドを同定する選択ストラテジー。磁気ＤｙｎａＢｅａｄｓにＢＣＭＡ−Ｆｃ組換えタンパク質を搭載した。それは、十分に洗浄した後も、組換えＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬに結合することが可能になっていた。

【図4A】本発明のＡＰＲＩＬモノクローナルは、血清の存在下でもＡＰＲＩＬを検出する。Ａ．ＡＰＲＩＬ結合モノクローナル抗体を使用して、ＣＬＬ患者の血清中のＡＰＲＩＬを検出した。３人の無関係な患者の血清を使用したところ（ＣＬＬ１、ＣＬＬ３およびＣＬＬ６）、様々な量のＡＰＲＩＬが示された。すべてのＡＰＲＩＬ結合抗体が、ＡＰＲＩＬを捕捉するためにコーティングされたＢＣＭＡ−Ｆｃの量に関係なく、３人の異なる患者において同様のＡＰＲＩＬの検出を示す（５００ｎｇ／ウェル対１００ｎｇ／ウェルのＢＣＭＡ−Ｆｃについて上と下を比較のこと）。

【図4B】本発明のＡＰＲＩＬモノクローナルは、血清の存在下でもＡＰＲＩＬを検出する。Ｂ．ＣＬＬ患者の血清中のＡＰＲＩＬの検出を、さらに１０人の個体サンプル（ＣＬＬ１１〜２０）を使用して抗体ｈＡＰＲＩＬ．１３３で測定したところ、様々な量のＡＰＲＩＬが示された。

【図5】ＢＣＭＡ−Ｆｃおよび本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチド（ｈＡＰＲＩＬ．１３３ｍＡｂ）を使用したＡＰＲＩＬの定量は、ヒト血清の存在によって影響を受けない。１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２３、０．４１、０．１３６および０．０４ｎｇ／ｍｌという濃度に、ＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清＋２０％ヒト血清（ＨＳ）（ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＨＳと称される）で希釈されるかまたはＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡと称される）で希釈される組換えＡＰＲＩＬを使用して、２つの標準物質を作製した。

【発明を実施するための形態】

【0015】

詳細な説明
ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための本発明の方法において、バインダーペプチドのライブラリーが提供される。用語「ライブラリー」は、当該分野で公知であり、この用語の公知の意味の範囲内で、「バインダーペプチドのライブラリー」は、異なるバインダーペプチドのコレクションまたはアレイを意味すると理解され得る。ペプチドライブラリーの文脈における用語「バインダーペプチド」あるいは「結合ペプチド」は、他の化合物および／または構造、特にエピトープ、より詳細には、ペプチドエピトープに結合する潜在的な能力を有するペプチドのことを指していると理解され得る。本発明の範囲内において、バインダーペプチドは、特に、潜在的なＡＰＲＩＬ結合能を有する。

【0016】

抗体（免疫グロブリン）および抗体の結合フラグメントは、他の化合物および／または構造に結合する潜在的な能力を有する公知のペプチドであり、その構造には、エピトープ、例えば、ペプチドエピトープが含まれる。したがって、本発明の範囲内において、抗体または抗体フラグメントのライブラリーが提供されることが特に想定される。当業者は、抗体または抗体フラグメントのライブラリーをどのようにして得るのかを承知しており、ゆえに、そのようなライブラリーをどのように提供するのかを承知している。

【0017】

抗体または抗体フラグメントは、例えば、ファージライブラリーを使用したマウス抗体およびヒト抗体の単離をそれぞれ説明しているＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１
９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４．Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されている手法を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離され得る。その後の刊行物には、チェインシャフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３）ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６）による高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作製が記載されている。

【0018】

抗体または抗体フラグメントは、ｍＲＮＡディスプレイライブラリーを使用した抗体フラグメントの単離を記載しているＦｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３４：ｅ１２７に記載されている手法を使用して作製されたｍＲＮＡディスプレイライブラリーから単離され得る。

【0019】

あるいは、抗体ライブラリーは、哺乳動物、例えば、非ヒト哺乳動物におけるＡＰＲＩＬ特異的免疫応答の誘発に適した作用物質で免疫されたその哺乳動物から回収されたリンパ球、好ましくは、脾細胞のコレクションを含み得る。（非ヒト）哺乳動物の免疫化および脾細胞（または他のリンパ球）の回収は、当該分野において通常の慣例である。免疫化のために使用される、ＡＰＲＩＬ特異的免疫応答の誘発に適した作用物質は、特に、精製された形態、最も好ましくは、実質的に純粋な形態の、ＡＰＲＩＬタンパク質またはその一部であり得る。あるいは、免疫化は、ＡＰＲＩＬまたはその一部をコードするヌクレオチド配列、好ましくは、ｃＤＮＡ配列を使用するＤＮＡの免疫化によって行われ得る。ＤＮＡの免疫化のための方法および手順は、当業者に公知である。ＤＮＡの免疫化に対する例示的な手順は、実施例に示される。

【0020】

抗体（または抗体フラグメント）のライブラリーのほかに、非免疫グロブリンタンパク質骨格上で操作された結合ペプチドのライブラリーが提供され得る。そのようなタンパク質骨格の例としては、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）およびＤＡＲＰｉｎが挙げられるが、これらに限定されない（Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００９，１３：２４５−２５５およびＣａｒａｖｅｌｌａ ａｎｄ Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１０，１４：５２０−５２８）。選択方法としては、例えば、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを発現するタンパク質骨格を同定するためのファージディスプレイが挙げられる。

【0021】

さらに、コンビナトリアルペプチドライブラリーが、バインダーペプチドライブラリーとして提供され得る。例えば、１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）コンビナトリアルライブラリーは、広範なペプチドセットをビーズ上に発現するライブラリーであり、ここで、１つのビーズが１つのペプチドに結合している。選択手順の後、ビーズを回収し、例えば、質量分析法を使用して、ペプチドを同定する（Ｌａｍ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９６，９：４８２−９３；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，２０１３年３月１３日（ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）。

【0022】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための方法において、ＡＰＲＩＬに特異的に結合するペプチドは、親和性選択を用いてバインダーペプチドのライブラリーから選択される。親和性選択手順では、固体支持体上に固定化された標的ペプチドが使用される。リガンド／レ
セプター、抗体／抗原または他の結合対について言及するとき、「特異的に」結合するとは、タンパク質および／または他の生物学的物質の不均一な集団におけるそのタンパク質、例えば、ＡＰＲＩＬの存在を判定する結合プロセスを示す。したがって、指定の条件下において、特定のリガンド／抗原は、特定のレセプター／抗体に結合するが、サンプル中に存在する他のタンパク質には相当量で結合しない。

【0023】

標的ペプチドは、ＡＰＲＩＬの、いくつかのＡＰＲＩＬエピトープおよびＡＰＲＩＬレセプター結合領域を含む。ＡＰＲＩＬエピトープは、好ましくは、ＡＰＲＩＬのＡＰＲＩＬレセプター結合領域の外側の領域に由来するものである。明らかであるように、ＡＰＲＩＬの、いくつかのＡＰＲＩＬエピトープおよびＡＰＲＩＬレセプター結合領域は、天然のＡＰＲＩＬまたはその誘導体の形態で適切に提供され得る。天然のＡｐｒｉｌを標的ペプチドとして使用することが好ましい。

【0024】

選択されるべきバインダーペプチドに対して、固定化されたリガンドを使用する親和性選択手順が、当該分野で公知である。例えば、パニングまたはバイオパニング手順が公知である。公知であるように、また、当業者には明らかであるように、典型的な親和性選択手順は、３つの工程：捕捉、洗浄および捕捉された結合物の同定を含む。

【0025】

本発明の方法において使用される親和性選択手順の場合、捕捉工程は、ＡＰＲＩＬのＡＰＲＩＬレセプター結合領域を含む標的ペプチドと、ライブラリーのバインダーペプチドとの結合を含む。当該分野で公知であるように、ＡＰＲＩＬは（現在のところ）、２つの公知の天然のレセプター、すなわち、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを有する。したがって、ＡＰＲＩＬレセプターという用語は、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩのことを意味していると理解され得る。本発明は、大方の場合（ｔｏ ａ ｌａｒｇｅ ｅｘｔｅｎｄ）、ＡＰＲＩＬレセプターとしてＢＣＭＡを使用することによって例証されるが、ＴＡＣＩの使用も等しく適している。天然のレセプターへの結合に関わるＡＰＲＩＬの領域は、公知である（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：７２１８−７２２７）。標的ペプチドは、このＡＰＲＩＬのＡＰＲＩＬレセプター結合領域を、ＡＰＲＩＬレセプター（またはその結合等価物）の結合を可能にする形態で含む。標的ペプチドは、選択された標的と特異的に相互作用するバインダーペプチドの同定および／または単離を可能にするために、固体支持体上に固定化される。用語「固定化される」は、限られた可動性を有すること、すなわち、低い可動性（ｒｅｄｕｃｅ ｍｏｂｉｌｉｔｙ）を意味すると理解されるべきである。限られた可動性、すなわち低い可動性は、洗浄工程において使用される洗浄媒質に対するものである。「固定化された」標的ペプチドは、固体支持体に直接結合されているかまたは固体支持体と直接相互作用する必要はない。その代わりに、それは、固体支持体に結合されているまたは固体支持体と相互作用する化合物または部分と相互作用し得る。ペプチドの固定化の手段の例としては、プラスチックへの非特異的な粘着、ビーズへのＮＨ２結合、トシル活性化ビーズへの結合またはプロテインＡビーズへの結合が挙げられるが、これらに限定されない。固体支持体上にペプチドを固定化するための方法は、当業者には明らかである。

【0026】

本発明の方法において使用される親和性選択手順における標的ペプチドは、ＡＰＲＩＬのＡＰＲＩＬレセプター結合領域およびいくつかのＡＰＲＩＬエピトープを含む。ＡＰＲＩＬのＡＰＲＩＬレセプター結合領域は、完全なＡＰＲＩＬタンパク質またはＡＰＲＩＬタンパク質の一部の形態で提示され得る。ＡＰＲＩＬタンパク質またはその一部の配列は、好ましくは、ヒト起源である。ＡＰＲＩＬエピトープは、ＡＰＲＩＬのＡＰＲＩＬレセプター結合領域上または標的ペプチドの異なる部分上に存在し得る。ＡＰＲＩＬのＡＰＲＩＬレセプター結合領域およびＡＰＲＩＬエピトープの選択は、標的ペプチドとシールドペプチドとの結合相互作用が可能であるようなものである。本明細書および添付の請求項において、いくつかとは、そうでないことが具体的に述べられない限り、使用されるたび
に、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７つまたはそれ以上のことを意味すると理解されるべきである。

【0027】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための本発明の方法において、標的ペプチド（ＡＰＲＩＬのＡＰＲＩＬ結合領域およびいくつかのＡＰＲＩＬエピトープを含む）は、ＡＰＲＩＬレセプターのＡＰＲＩＬ結合領域またはそのＡＰＲＩＬ結合等価物を含むシールドペプチドと相互作用した状態で、固体支持体上に固定化される。ＡＰＲＩＬレセプターのＡＰＲＩＬ結合領域は、完全なＡＰＲＩＬレセプタータンパク質またはＡＰＲＩＬレセプタータンパク質の一部において提示され得る。ＡＰＲＩＬレセプタータンパク質またはその一部の配列は、好ましくは、ヒト起源である。

【0028】

ＡＰＲＩＬレセプタータンパク質のＡＰＲＩＬ結合領域に対する代替物として、そのようなＡＰＲＩＬレセプタータンパク質のＡＰＲＩＬ結合等価物のＡＰＲＩＬ結合領域を使用してもよい。ＡＰＲＩＬレセプタータンパク質のＡＰＲＩＬ結合等価物は、例えば、ＡＰＲＩＬ−ＡＰＲＩＬレセプター界面においてＡＰＲＩＬに結合するペプチド、例えば、抗体であり得る。そのようなペプチドは、ＡＰＲＩＬといくつかのそのレセプター（ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ）との相互作用を干渉するペプチドから選択され得る。例えば、ＷＯ２０１０／１０００５６に開示されているｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ抗体またはそのアナログ。ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａのアナログは、本明細書において定義されるような、抗体アナログ、特に、抗体フラグメントである。ある特定のＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、ＡＰＲＩＬ結合抗体がＡＰＲＩＬとＡＰＲＩＬレセプターとの相互作用を干渉するか否かは、ＷＯ２０１０／１０００５６の実施例２における“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋａｄｅ”に記載されている方法に従って判定され得る。

【0029】

標的ペプチドは、シールドペプチドとの相互作用によって固体支持体上に固定化され得ることに注意するべきであり、前記シールドペプチドは、上で例証された公知の手段によって固体支持体上に固定化される。

【0030】

洗浄工程が、捕捉工程の後に続く。この工程では、未結合のエレメント（バインダーペプチドおよび／または標的ペプチドおよび／またはシールドペプチドおよび／または他の任意のエレメント）が、洗浄媒質、例えば、洗浄液を使用することによって、固体支持体から洗浄される。洗浄条件を選択することによって、選択のストリンジェンシーが、選択され得る。そのような方法は、当業者には明らかである。例えば、細胞を含む洗浄手順では、洗浄液としてリン酸緩衝食塩水または培養液が使用され得る。洗浄液は、洗浄手順のストリンジェンシー（イオン強度）に影響する高塩（例えば、１Ｍ塩化ナトリウム）または低塩（例えば、５０ｍＭ塩化ナトリウム）を含み得る。洗浄液は、洗浄手順のストリンジェンシー（疎水性強度）に影響する界面活性剤、例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０も含み得る。

【0031】

洗浄工程の後の同定工程では、洗浄工程の後も標的ペプチドと相互作用した状態のままであるバインダーペプチドが、同定される。同定工程は、固体支持体からのバインダーペプチドの溶出を含み得、その後、溶出されたバインダーペプチドが、任意の好適な公知の方法で同定され得る。当業者は、ペプチドを同定するために質量分析法、バインダーペプチドをコードするＲＮＡ分子を同定するためにＲＮＡ配列決定、またはバインダーペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を同定するためにＤＮＡ配列決定を適用し得る。あるいは、同定は、バインダーペプチドまたは標的ペプチドに連結された標識部分、例えば、蛍光標識を使用することによって行われ得、例えば、バイオマイクロアレイの適用において行われる。

【0032】

ある特定の実施形態によると、本発明の方法は、固体支持体および／またはシールドペ
プチドに結合するペプチドのネガティブ選択の工程をさらに含み得る。ある特定の親和性選択手順では、そのようなネガティブ選択工程の使用は、ＡＰＲＩＬに対して改善された特異性を有するＡＰＲＩＬ結合ペプチドをもたらし得る。その改善は、ネガティブ選択工程を含まない方法において得られるＡＰＲＩＬ結合ペプチドと比較したときのものである。

【0033】

ネガティブ選択工程では、バインダーペプチドが、標的ペプチドよりもシールドペプチドまたは固体支持体に対して高い親和性を有する場合、そのバインダーペプチドを廃棄する。ネガティブ選択工程は、シールドペプチドと相互作用した状態の標的ペプチドを使用して、捕捉工程の前または後に行われ得る（第１捕捉工程）。ある特定の実施形態によると、ネガティブ選択工程は、標的ペプチドの非存在下における、シールドペプチド（固体支持体上に固定化されたもの）へのライブラリーのバインダーペプチドの結合を含むネガティブ捕捉工程を含めることによって、第１捕捉工程の前に行われる。このネガティブ事前選択工程では、未結合のバインダーペプチドが、第１工程において使用するために選択される。ある特定の他の実施形態によると、ネガティブ選択工程は、標的ペプチドの非存在下におけるシールドペプチド（固体支持体上に固定化されたもの）への、第１捕捉工程において選択されたバインダーペプチドの結合を含むネガティブ捕捉工程を含めることによって、第１捕捉工程の後に行われる。このネガティブ事後選択工程では、未結合のバインダーペプチドが、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドとして選択される。ネガティブ選択工程を行う場合、標的ペプチドの固定化が、シールドペプチドとの相互作用に依存すること（シールドペプチドは、標的ペプチドよりも固体支持体とより強く相互作用すること）が好ましい。この実施形態において、標的ペプチドは、事前選択テストの後に固体支持体上に固定化されたシールドペプチドとの相互作用をもたらし得るか、または標的ペプチドと固定化されたシールドペプチドとの相互作用は、事後選択工程のために妨害され得る。

【0034】

上に記載された本発明の方法の手順において、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドが、同定および／または単離される。ＡＰＲＩＬ結合ペプチドの生成を促進するために、選択されたＡＰＲＩＬ結合ペプチドのアミノ酸配列、ならびに／またはその方法を用いて同定されたおよび／もしくは得られたＡＰＲＩＬ結合ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を決定することが有益であり得る。これにより、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列のトランスフェクションが可能になり、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを良好な効率で産生できる生物が作出される。使用されるバインダーペプチドのライブラリーに応じて、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当業者に利用可能な様々な方法によって決定および／または単離され得る。

【0035】

ライブラリーが、免疫された哺乳動物から回収されたリンパ球のコレクションである場合、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、得られたリンパ球クローンの細胞表面上に提示される免疫グロブリン分子であり得る。ＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、そのリンパ球クローンの培養物からＲＮＡを単離し、免疫グロブリン特異的プライマーを使用してその免疫グロブリン配列を選択的に増幅した後、選択的に増幅された配列を配列決定することによって得られる場合がある。

【0036】

ライブラリーが、ファージのコレクションである場合、選択された結合ペプチドは、ファージの表面上に提示される抗体または抗体フラグメントであり得る。ＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチドは、単離されたファージからＤＮＡを単離した後、そのＤＮＡを配列決定することによって、単離され得る。

【0037】

ライブラリーが、リボソーム上にディスプレイされるｍＲＮＡのコレクションである場合、選択された結合ペプチドは、リボソーム上にディスプレイされ得る。ＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチドは、リボソームに結合したｍＲＮＡを単離することに
よって単離され得る。その結合ペプチドが何であるか（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、直接的なＲＮＡの配列決定、またはｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを生成した後の選択的に増幅された配列の配列決定によって明らかにされる。

【0038】

ライブラリーが、ビーズに結合した結合ペプチドのコレクション（１ビーズ１化合物ライブラリー）である場合、１つの結合ペプチドは、１つのビーズに結合されている。ＡＰＲＩＬ結合ペプチドが何であるかは、親和性選択手順において選択されたビーズからペプチドを回収した後の質量分析手順によって明らかにされる。

【0039】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための本発明の方法では、反応およびプロセス、例えば、結合親和性選択プロセスおよび関連するプロセス、例えば、捕捉工程および洗浄工程は、好適な容器内、例えば、反応容器内、特に、そのようなスクリーニング方法のために実験室規模で使用される容器内で行われ得ることが明らかであろう。

【0040】

本発明はさらに、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための本発明に係る方法を用いて入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドに関する。本発明の方法を用いると、多数の異なるＡＰＲＩＬ結合ペプチドが得られる場合があることは、当業者には明らかであろう。本発明の方法を用いて入手可能な結合ペプチドは、公知のＡＰＲＩＬ結合ペプチドと比べて、ＡＰＲＩＬがそのレセプターに結合するのを干渉する程度が低いという共通の特徴を共有する。したがって、それらは、レセプターまたはその結合等価物、例えば、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたはそのアナログと複合体化したＡＰＲＩＬに、より良好に結合することができる。本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、抗体は、通常、それらの標的（ＡＰＲＩＬ、好ましくは、ヒトＡＰＲＩＬ）に対して、約１０^−３Ｍ未満、より通常は、１０^−６Ｍ未満、典型的には、１０^−７Ｍ未満、より典型的には、１０^−８Ｍ未満、好ましくは、１０^−９Ｍ未満、より好ましくは、１０^−１０Ｍ未満、最も好ましくは、１０^−１１Ｍ未満のＫ_Ｄを有し得る（例えば、Ｐｒｅｓｔａ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：３７９−３８９；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３８：１７−２３；Ｃａｒｎａｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（Ｓｕｐｐｌ．）９：３９８２ｓ−３９９０ｓを参照のこと）。ある特定の実施形態によると、標的（ＡＰＲＩＬ、好ましくは、ヒトＡＰＲＩＬ）に対する本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、抗体のＫ_Ｄは、１×１０^−６〜０．５×１０^−１１Ｍ、１×１０^−７〜０．５×１０^−１１Ｍ、１×１０^−８〜０．５×１０^−１１Ｍ、１×１０^−８〜１×１０^−１１Ｍ、好ましくは、５×１０^−９〜１×１０^−１１Ｍ、より好ましくは、５×１０^−９〜１×１０^−１０Ｍから選択され得る。結合親和性は、標準的な解析を使用して測定され得る。ある特定の実施形態によると、入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、少なくとも５×１０^−９Ｍ、好ましくは、１×１０^−８Ｍ超、より好ましくは、１×１０^−７Ｍ超、最も好ましくは、１×１０^−６Ｍ超という、ＡＰＲＩＬレセプター−ＡＰＲＩＬ相互作用の阻害に対するＩＣ５０を有する。例えば、ＡＰＲＩＬレセプター−ＡＰＲＩＬ相互作用の阻害に対するＩＣ５０は、５×１０^−９〜１×１０^−４Ｍ、例えば、５×１０^−９〜１×１０^−５Ｍ、好ましくは、１×１０^−８〜１×１０^−５Ｍ、例えば、１×１０^−８〜１×１０^−６Ｍ、１×１０^−８〜１×１０^−７Ｍ、１×１０^−７〜１×１０^−５Ｍまたは１×１０^−７〜１×１０^−６Ｍであり得る。

【0041】

ある特定の実施形態によると、入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの結合フラグメントである。本明細書および添付の請求項では、免疫グロブリンおよび抗体という用語は、同義語として使用され、ゆえに、相互交換可能である。用語「抗体」とは、所望の活性、特に、標的に結合する活性を示す任意の形態の抗体のことを指す。標的に結合することによって、ある特定の所望の効果が促進され得る。例えば、抗体に結合されることによって会合される化合物または部分が、その標的の位置
に標的化され得る。本発明では、標的は、ＡＰＲＩＬ、好ましくは、ヒトＡＰＲＩＬである。ＡＰＲＩＬを標的とする抗体は、ＡＰＲＩＬがそのレセプターまたはそのアナログに結合されたとき、ＡＰＲＩＬに結合し得る。

【0042】

用語「抗体」は、最も広い意味において使用され、詳細には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を網羅するがこれらに限定されない。本発明において、ある特定の抗体に由来するペプチドは、抗体アナログであると考えられ得る。当業者は、本発明の文脈において抗体アナログが適切に機能するために、得られた抗体（または抗体アナログ）が、その元の抗体の抗原結合領域を含むことを理解するだろう。抗体アナログは、特に、抗体フラグメント、改変されたエフェクター機能を有する抗体、下記で定義されるようなキメラ抗体およびヒト化抗体を含む。

【0043】

「抗体フラグメント」および「抗体結合フラグメント」は、典型的には、親抗体の抗原結合領域または可変領域の少なくとも一部を含む、抗体の抗原結合フラグメントおよび類似の部分のことを意味する。抗体フラグメントは、親抗体の結合特異性の少なくともいくらかを保持する。このために、抗体フラグメントは、いくつかのＣＤＲ、特に、Ｖ_Ｈ領域のいくつかのＣＤＲ、例えば、Ｖ_Ｈ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。Ｖ_Ｈ領域のいくつかのＣＤＲに加えて、抗体フラグメントは、Ｖ_Ｌ領域のいくつかのＣＤＲ、例えば、Ｖ_Ｌ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３も含み得る。ある特定の実施形態によると、抗体フラグメントは、Ｖ_Ｌ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とともに、Ｖ_Ｈ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。典型的には、抗体フラグメントは、その活性がモル濃度に基づいて表現されるとき、親の結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、抗体フラグメントは、親抗体の、標的に対する結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％またはそれ以上を保持する。ゆえに、当業者にとって明らかであるように、多くの用途における「抗体フラグメント」は、抗体に取って代わることがあり、用語「抗体」は、そのような置き換えが適切であるとき、「抗体フラグメント」を含むと理解されるべきである。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃ−Ｆｖ、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｉｅｓ）またはデュオボディ（ｄｕｏｂｏｄｉｅｓ）（Ｇｅｎｍａｂの技術）；ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓの技術）；ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘの技術）；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。操作された抗体バリアントは、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６において概説されている。

【0044】

「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖ならびに１本の重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。

【0045】

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含む。その２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合およびＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用によって一体として保持される。

【0046】

「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖、ならびにＶ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメイン、およびまたＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間の領域を含む１本の重鎖の一部を含み、鎖間ジスルフィド結合が、２つのＦａｂ’フラグメントの２本の重鎖の間に形成されて、Ｆ（ａｂ’）_２分子が形成され得る。

【0047】

「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は、２本の軽鎖、およびＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２本の重鎖を含み、鎖間ジスルフィド結合が、それら
の２本の重鎖の間に形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、その２本の重鎖の間のジスルフィド結合によって一体として保持される２つのＦａｂ’フラグメントから構成される。

【0048】

「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く。
「一本鎖Ｆｖ抗体」（または「ｓｃＦｖ抗体」）とは、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む抗体フラグメントのことを指し、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖として存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合にとって所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９４，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照のこと。国際特許出願公開番号ＷＯ８８／０１６４９ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号も参照のこと。

【0049】

「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントである。それらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）（Ｖ_Ｈ−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ）を含む。短すぎて、同じ鎖上でそれらの２つのドメインの間で対形成ができないリンカーを使用することによって、それらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８により十分に説明されている。

【0050】

「ドメイン抗体フラグメント」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域だけを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、２つ以上のＶ_Ｈ領域が、ペプチドリンカーによって共有結合的に連結されて、二価のドメイン抗体フラグメントが形成される。二価のドメイン抗体フラグメントの２つのＶ_Ｈ領域は、同じ抗原を標的化してもよいし、異なる抗原を標的化してもよい。

【0051】

本発明の抗体フラグメントは、低下したジスルフィド結合能を有する重鎖の二量体化（または多量体化）を可能にするのに十分な定常領域の一部を含み得、例えば、通常、重鎖間のジスルフィド結合に関わるヒンジシステインの少なくとも１つが、当業者に利用可能な公知の方法を用いて変更される。別の実施形態において、抗体フラグメント、例えば、Ｆｃ領域を含む抗体フラグメントは、インタクトな抗体として存在するとき、通常、Ｆｃ領域に関連する生物学的機能の少なくとも１つ、例えば、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）機能および／または補体結合（例えば、その抗体が、ＡＤＣＣ機能または補体結合に必要なグリコシル化プロファイルを有する場合）を保持する。

【0052】

本発明では、抗体は、ＡＰＲＩＬ、好ましくは、ヒトＡＰＲＩＬに対して産生され、ゆえにＡＰＲＩＬ、好ましくは、ヒトＡＰＲＩＬに結合するおよび／またはそれと相互作用する結合ドメインを含む。抗体は、ヒト抗原に対する抗体の誘発に適した非ヒト種の動物において産生され得る。あるいは、抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４．Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されている手法を使用して作製された抗体ファージライブラリーから単離され得る。当業者は、ヒト抗原に対する抗体の誘発に適した非ヒト種を選択できるだろう。例えば、選択は、非ヒト哺乳動物、例えば
、マウス（ラットまたはマウス）もしくはハムスター種を含むげっ歯類、あるいはラクダ科動物種から行われ得る。

【0053】

抗体は、非ヒト種において産生されるとき、好ましくは、「キメラ抗体」を形成するための当該分野で公知の方法および手法によってキメラ化される。

【0054】

用語「キメラ」抗体とは、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種から得られた抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、それらの鎖の残りの部分は、別の種から得られる抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにそのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一または相同である抗体のことを指す（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５を参照のこと）。本発明において、「キメラ抗体」は、好ましくは、「ヒト化抗体」である。

【0055】

本明細書中で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト（例えば、マウス）抗体由来の配列ならびにヒト抗体由来の配列を含む抗体の形態のことを指す。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含み得る。げっ歯類抗体のヒト化型は、親のげっ歯類抗体と同じＣＤＲ配列を本質的には含むが、親和性を高めるため、ヒト化抗体の安定性を高めるため、または他の理由のために、ある特定のアミノ酸置換が含められ得る。しかしながら、ＣＤＲループ交換によって、元の抗体と同じ結合特性を有する抗体が均一にもたらされることはないので、抗原結合親和性を保存するために、ＣＤＲループ支持に関わる残基であるフレームワーク残基（ＦＲ）の変更も、ヒト化抗体に導入され得る（Ｋａｂａｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７０９）。

【0056】

用語「抗体」には、「完全ヒト」抗体、すなわち、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列だけを含む抗体も含まれる。完全ヒト抗体は、マウス、非ヒト細胞（例えば、マウスまたはハムスター）またはマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて産生される場合、非ヒト、例えば、マウス（ラットまたはマウス）の糖鎖を含み得る。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」とは、それぞれマウスまたはラットの免疫グロブリン配列だけを含む抗体のことを指す。完全ヒト抗体は、人間において、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系列の配列を有するトランスジェニック非ヒト動物において、ファージディスプレイによって、または他の分子生物学的方法によって、生成され得る。また、組換え免疫グロブリンもまた、トランスジェニックマウスにおいて産生され得る。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６を参照のこと。Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｍｅｄａｒｅｘ、ＭｅＭｏおよびＫｙｍａｂの技術も参照のこと。

【0057】

用語「超可変領域」は、本明細書中で使用されるとき、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基のことを指す。超可変領域は、配列アラインメントによって定義される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基、例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ
Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．を参照のこと）、ならびに／または構造的に定義されるような「超可変ループ」（ＨＶＬ）の残基、例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋｌ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照のこと）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

【0058】

ある特定の実施形態によると、入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、抗体またはそのアナログは、配列番号５、６および７または配列番号１５、１６および１７または配列番号２５、２６および２７または配列番号３５、３６および３７または配列番号４５、４６および４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列類似性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリンＶ_Ｈドメイン、例えば、配列番号３、１３、２３、３３または４３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列類似性を有するＶ_Ｈドメインを含む。当業者が理解するように、Ｖ_Ｈドメインは、主に、抗体の結合親和性および特異性の決定において支配的である。したがって、Ｖ_Ｌドメインの非存在下において、例えば、ラクダ科動物由来の抗体およびラクダ化（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ）抗体において、有効な結合が得られることがある。

【0059】

前記ＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、抗ＡＰＲＩＬ抗体またはそのアナログは、配列番号５、６、７、８、９および１０または配列番号１５、１６、１７、１８、１９および２０または配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０または配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０または配列番号４５、４６、４７、４８、４９および５０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列類似性を有するＶ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２ Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２およびＶ_ＬＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリンＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン、例えば、配列番号３および４または１３および１４または２３および２４または３３および３４または４３および４４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列類似性を有するＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの対を含み得る。これらの様々な配列をコードするＤＮＡ配列は、遺伝暗号の知識に基づいて、当業者によって決定され得る。下記の表２には、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列をコードするいくつかのＤＮＡ配列を列挙する。それらの配列は、配列表に提供されている。

【0060】

当業者が理解するように、「配列類似性」とは、個々のヌクレオチド配列またはペプチド配列が似ている程度のことを指す。２つの配列の間の類似性の程度は、保存的変更の程度と組み合わせた同一性の程度に基づく。「配列類似性」のパーセンテージは、同一であるかまたは保存的に変更された、アミノ酸またはヌクレオチドのパーセンテージ、すなわち、「配列類似性」＝（％配列同一性）＋（％保存的変更）である。

【0061】

本発明の目的で、「保存的変更」および「同一性」は、より広い用語「類似性」の一種であると考えられる。したがって、配列「類似性」という用語が使用されるときは必ず、その用語は、配列「同一性」および「保存的変更」を包含する。

【0062】

用語「配列同一性」は、当業者に公知である。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列によって共有される配列同一性の程度を測定するために、それらの配列を、最適な比較
目的でアラインメントする（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列にギャップが導入され得る）。そのようなアラインメントは、比較される配列の全長にわたって行われ得る。あるいは、アラインメントは、より短い比較長にわたって、例えば、約２０個、約５０個、約１００個またはそれ以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたって、行われ得る。

【0063】

次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されているとき、それらの分子は、その位置において同一である。配列間で共有される同一性の程度は、典型的には、２つの配列間の同一性パーセンテージに関して表現され、それらの配列において同一の残基によって共有された同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝対応する位置における同一の残基の数／位置の総数×１００）。好ましくは、比較される２つの配列は、同じ長さまたは実質的に同じ長さである。

【0064】

「保存的変更」のパーセンテージは、配列同一性のパーセンテージと同様に測定され得る。しかしながら、この場合、元の残基の機能特性を保存する可能性があるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の特定の位置における変更は、あたかも変更が生じていないようにスコア付される。

【0065】

アミノ酸配列の場合、関係する機能特性は、アミノ酸の物理化学的特性である。本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸の保存的置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、特定のサイズまたは特徴（例えば、電荷、疎水性および親水性）を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸が、タンパク質の活性を、特に、生物学的活性と直接関連しないそのタンパク質の領域において、実質的に変更することなく、別のアミノ酸の代わりに用いられ得ることは、タンパク質生化学の分野で周知である（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（第４版、１９８７）を参照のこと）。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。極性で中性のアミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性の）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性の）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。保存的置換としては、例えば、正電荷を維持するための、Ａｒｇの代わりのＬｙｓおよびその逆；負電荷を維持するための、Ａｓｐの代わりのＧｌｕおよびその逆；自由な−ＯＨを維持するような、Ｔｈｒの代わりのＳｅｒおよびその逆；ならびに自由な−ＮＨ_２を維持するための、Ａｓｎの代わりのＧｌｎおよびその逆が挙げられる。

【0066】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドのアミノ酸配列における例示的な保存的置換は、以下のような下記に示されるものに従って行われ得る：

【0067】

【表2】

【0068】

ヌクレオチド配列の場合、関係する機能特性は、主に、その配列のオープンリーディングフレーム内のある特定のヌクレオチドが有する、転写および／または翻訳の機構に関する生物学的情報である。遺伝暗号が縮重（または冗長性）を有すること、および複数のコドンが、それらがコードするアミノ酸に関して同じ情報を有し得ることは、通常の知識である。例えば、ある特定の種では、アミノ酸であるロイシンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧコドン（またはＤＮＡの場合はＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ）によってコードされ、アミノ酸であるセリンは、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、ＡＧＵ、ＡＧＣ（またはＤＮＡの場合はＴＣＡ、ＴＣＧ、ＴＣＣ、ＴＣＴ、ＡＧＴ、ＡＧＣ）によって特定される。翻訳された情報を変化させないヌクレオチドの変更は、保存的変更であると考えられる。

【0069】

当業者は、種々の数学的アルゴリズムを使用するいくつかの異なるコンピュータプログラムが、２つの配列間の同一性を測定するために利用可能であるという事実を承知している。例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ
ｅｔ ａｌ．（１９７０））を用いるコンピュータプログラムが、使用され得る。ある実施形態によると、コンピュータプログラムは、Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｕ．Ｓ．Ａ）におけるＧＡＰプログラムである。使用され得る代替行列は、例えば、１６、１４、１２、１０、８、６または４というギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）および１、２、３、４、５または６というレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）を用いる、ＢＬＯＳＵＭ６２行列またはＰＡＭ２５０行列である。当業者は、これらの種々のパラメータのすべてが、わずかに異なる結果をもたらし得るが、異なるアルゴリズムを使用しても、２つの配列の全体的な同一性パーセンテージは有意に変化しないことを認識するだろう。

【0070】

ある実施形態によると、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｕ．Ｓ．Ａ）におけるＧＡＰプログラムを使用して測定される。ＮＷＳｇａｐｄｎａ ＣＭＰ行列および４０、５０、６０、７０または８０というギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６というレングスウェイトが使用される。

【0071】

別の実施形態において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２というギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）および４というギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（ＧｅｎｅｓｔｒｅａｍサーバーＩＧＨ Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ Ｆｒａｎｃｅ ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａｊｇｈ．ｍｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉの配列データを使用してＡＬＩＧＮ Ｑｕｅｒｙにおいて利用可能である）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９））を使用して測定される。

【0072】

本発明では、ヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージおよび／または類似性パーセンテージを測定するためにＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）を使用することが最も好ましい。

【0073】

Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）のＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｐ、ＢＬＡＳＴｘ、ｔＢＬＡＳＴｎおよびｔＢＬＡＳＴｘプログラムを使用するクエリーは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を介してアクセス可能なＢＬＡＳＴのオンラインバージョンを通じてポストされ得る。あるいは、ＮＣＢＩのインターネットサイトを通じてもダウンロード可能なＢＬＡＳＴのスタンドアローンバージョン（例えば、バージョン２．２．２４（２０１０年８月２３日公開））を使用してもよい。好ましくは、ＢＬＡＳＴクエリーは、以下のパラメータを用いて行われる。アミノ酸配列間の同一性パーセンテージおよび／または類似性パーセンテージを測定するために：アルゴリズム：ｂｌａｓｔｐ；ワードサイズ：３；スコア行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：有り（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）：１１、伸長：１；組成調整（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ）：条件的組成スコアマトリックス調整（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）；フィルター：オフ；マスク：オフ。ヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージおよび／または類似性パーセンテージを測定するために：アルゴリズム：ｂｌａｓｔｎ；ワードサイズ：１１；クエリー範囲内の最大マッチ数：０；マッチ／ミスマッチスコア：２、−３；ギャップコスト：有り：５、伸長：２；フィルター：低複雑領域；マスク：ルックアップテーブルのみに対してマスク。

【0074】

「保存的変更」のパーセンテージは、示されたアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを活用して、配列同一性のパーセンテージと同様に測定され得る。いくつかのコンピュータプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴｐは、正（＝類似性）の数値／パーセンテージおよび同一性の数値／パーセンテージを示す。保存的変更のパーセンテージは、正／類似性のパーセンテージから同一性のパーセンテージを減算することによって、それらから導き出され得る（保存的変更パーセンテージ＝類似性パーセンテージ−同一性パーセンテージ）。

【0075】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチドに対する入手可能な配列情報に基づいて、さらなる操作が可能である。ＡＰＲＩＬ結合ペプチドが抗体である場合、その抗体ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインに対するコード配列を相同なマウス配列の代
わりに置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１）または非免疫グロブリン材料（例えば、タンパク質ドメイン）に対するコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結することによって、改変され得る。典型的には、そのような非免疫グロブリン材料は、抗体の定常ドメインの代わりに用いられるか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いられることにより、ある抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体が形成される。

【0076】

ラクダ化抗体は、マウス抗体に由来する重鎖のみの抗体である。ラクダ化は、Ｔａｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，２００６，１９：５０３−９の方法に従って行われ得る。

【0077】

ヒト化抗体は、非ヒトである起源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称され、典型的には、「移入」可変ドメインから選び取られる。ヒト化は、通常、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって、行われ得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的に決してインタクトでないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換された抗体である。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、非ヒト抗体、例えば、げっ歯類抗体における類似の部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。

【0078】

ヒト化抗体を作製する際に使用される軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、低抗原性が妥当である場合、非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によると、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体に対するヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが使用される。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体に対して使用され得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１５１：２６２３）。

【0079】

抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的特性を保持した状態で、抗体がヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によると、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用する、親配列および様々な概念上のヒト化産物の解析のプロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルが、通常、利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な３次元立体配座構造を図示および表示するコンピュータプログラムが、利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際のそれらの残基が担う可能性のある役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の解析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基は、レシピエントから選択され、組み合わされ得、配列を移入し得、所望の抗体特性、例えば、標的抗原に対する高い親和性が達成される。通常、ＣＤＲ残基は、抗原結合性への影響に直
接かつ最も実質的に関わる。

【0080】

抗体のヒト化は、端的なタンパク質工学の課題である。ほぼすべてのマウス抗体が、抗原結合性の保持をもたらすＣＤＲ移植によってヒト化され得る。Ｌｏ，Ｂｅｎｎｙ，Ｋ．Ｃ．，ｅｄｉｔｏｒ，ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌｕｍｅ ２４８，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００４を参照のこと。

【0081】

ヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変更をヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体のＤＮＡに導入することによってまたはペプチド合成によって調製される。そのようなバリアントとしては、例えば、ヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体に対して示されたアミノ酸配列からの欠失および／またはそのアミノ酸配列への挿入および／またはそのアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせが行われることにより、最終的な構築物に到達するが、但し、その最終的な構築物は、所望の特徴を有する。アミノ酸の変更は、ヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体の翻訳後プロセスも変化させることがあり、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させることがある。

【0082】

突然変異誘発にとって好ましい位置であるヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体ポリペプチドのある特定の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５によって報告された「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基のうちの１つの残基または群が、同定され（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕ）、中性アミノ酸または負に帯電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられることにより、それらのアミノ酸とＡＰＲＩＬ抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで、それらの置換に対して機能感受性を示したアミノ酸残基が、その置換の部位においてまたはその置換の部位の代わりに、さらなるまたは他のバリアントを導入することによって、洗練される。したがって、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位は、あらかじめ決められているが、変異の性質自体は、あらかじめ決められている必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を解析するために、Ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは標的領域において行い、発現されたヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体のバリアントを、所望の活性についてスクリーニングする。

【0083】

通常、ヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体のアミノ酸配列バリアントは、元のマウス抗体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、９８％または９９％を有するアミノ酸配列を有し得る。この配列に対する同一性または相同性は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として見なさないとき、ヒト化残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと本明細書中で定義される。抗体配列に対してＮ末端、Ｃ末端または内部における伸長、欠失または挿入のいずれもが、配列同一性または相同性に影響すると解釈されないものとする。２つの配列の間の同一性のパーセンテージは、ＳｅｑＭａｎＩＩ（ＤＮＡｓｔａｒ Ｉｎｃ，バージョン５．０５）などのコンピュータアプリケーションを用いて決定され得る。このプログラムを使用し、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの最適なアラインメントアルゴリズム（１９８１）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４７：１９５−１９７）を使用して、２つの配列をアラインメントすることができる。２つの配列をアラインメントした後、それらの２つの配列の間で同一のアミノ酸の数を、アラインメントされた配列の長さ−全ギャップの長さで除算することによって、同一性パーセンテージを計算することができる。

【0084】

ヒト化抗ＡＰＲＩＬ抗体において望ましいと本明細書中で特定された特徴を有する抗体は、インビトロにおける生物学的な阻害活性または好適な結合親和性についてスクリーニングされ得る。ヒトＡＰＲＩＬ上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているアッセイなどの通例の交差阻止（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイが行われ得る。同じエピトープに結合する抗体は、そのようなアッセイにおいて交差阻止する可能性があるが、交差阻止は、重複するエピトープに結合する抗体または重複していない近傍のエピトープに結合する抗体による、抗体結合の立体障害に起因し得るので、必ずしもすべての交差阻止抗体が、まったく同じエピトープに結合するわけでない。

【0085】

あるいは、当該抗体が目的のエピトープに結合するか否かを判定するために、例えば、Ｃｈａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されているような、エピトープマッピングを行うことができる。ヒトＡＰＲＩＬにおけるアミノ酸残基の、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５によって報告された「アラニンスキャニング突然変異誘発」またはいくつかの他の形態の点突然変異誘発もまた、本発明の抗ＡＰＲＩＬ抗体に対する機能的エピトープを判定するために使用され得る。抗体のエピトープをマッピングする別の方法は、Ｍｅｄｅｍａら（ＷＯ／２０１０／１０００５６）、Ｓｌｏｏｔｓｔｒａら（Ｓｌｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ １：８７−９６）およびＴｉｍｍｅｒｍａｎら（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２０：２８３−２９９）によって報告されたようなクレジットカード型ミニＰＥＰＳＣＡＮカード（ｃｒｅｄｉｔ−ｃａｒｄ
ｆｏｒｍａｔ ｍｉｎｉ ＰＥＰＳＣＡＮ ｃａｒｄｓ）を使用してスクリーニングされ得る合成直鎖ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドへの抗体の結合を調べるものである。各ペプチドへの抗体の結合は、ＰＥＰＳＣＡＮに基づく酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）において測定される。

【0086】

本発明の抗体と同じエピトープに結合するさらなる抗体は、例えば、ＡＰＲＩＬに対して産生された抗体をそのエピトープへの結合についてスクリーニングすること、またはエピトープ配列を含むヒトＡＰＲＩＬのフラグメントを含むペプチドで動物を免疫することによって、得られる場合がある。同じ機能的エピトープに結合する抗体は、類似の生物学的活性、例えば、レセプター結合の阻止を示すと予想され得、そのような活性は、それらの抗体の機能的アッセイによって確認することができる。

【0087】

本発明の抗体と同じエピトープに対する他のＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、例えば、本発明の選択技術および結合ペプチドをディスプレイするライブラリーを用いて結合ペプチドをあらかじめ選択することによって、得られる場合がある。同じ機能的エピトープに結合する結合ペプチドは、類似の生物学的活性、例えば、レセプター結合の阻止を示すと予想され得、そのような活性は、それらの抗体の機能アッセイによって確認することができる。

【0088】

ＡＰＲＩＬに対するＡＰＲＩＬ結合ペプチドの親和性は、標準的な解析を用いて測定され得る。好ましい結合ペプチド、例えば、抗体は、約１×１０^−７未満；好ましくは、約１×１０^−８未満；より好ましくは、約１×１０^−９未満；最も好ましくは、約１×１０^−１０未満または１×１０^−１１Ｍ未満というＫｄ値でヒトＡＰＲＩＬに結合するものである。

【0089】

本明細書中で使用されるとき、用語「約」は、当業者によって測定されたときの特定の値に対して許容され得る誤差範囲内の値のことを指し、その誤差範囲は、その値がどのようにして計測または測定されたか、すなわち、計測システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該分野の慣例に従って１以内または１を超える標準偏差のことを意味し得る。あるいは、「約」または「〜を本質的に含む」は、２０％までの範囲を意味し得る。さらに、特に生体系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の最大１桁または最大５倍を意味し得る。特定の値が、本願および請求項において提供されるとき、別段述べられない限り、「約」または「〜を本質的に含む」の意味は、その特定の値に対する許容され得る誤差範囲内であると見なされるべきである。

【0090】

抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリンから選択され得る。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプのＩｇＧを使用することができる。ＩｇＧアイソタイプのバリアントも企図される。ヒト化抗体は、２つ以上のクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含み得る。所望の生物学的活性をもたらすのに必要な定常ドメイン配列の最適化は、実施例に記載される生物学的アッセイにおいて抗体をスクリーニングすることによって容易に達成される。

【0091】

同様に、いずれかのクラスの軽鎖を本明細書中の組成物および方法において使用することができる。詳細には、カッパ、ラムダまたはそれらのバリアントが、本組成物および本方法において有用である。

【0092】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、抗ＡＰＲＩＬ抗体またはその抗体アナログは、標識、例えば、フルオロフォア、例えば、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体を含む、蛍光標識または化学発光（ｃｈｅｍｉｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識から選択される標識、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌａｄｅｈｙｄｅ）、フルオレサミン、^１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｍｉｕｍ）塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識ならびに安定したフリーラジカルと結合体化され得る。

【0093】

Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９６２，Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄ
ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．，１９８２，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７に記載された方法をはじめとした、タンパク質分子を様々な部分に結合体化するための当該分野で公知の任意の好適な方法が使用され得る。抗体およびタンパク質を結合体化するための方法は、当該分野における慣習的かつ周知のものである。

【0094】

ある特定の実施形態によると、本発明の方法を用いて入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、コンビナトリアルペプチドライブラリーから入手可能な結合ペプチドである。そのようなＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、抗体構造に基づく必要はなく、ゆえに、非抗体結合ペプチドであり得る。例としては、１ビーズ−１ペプチドライブラリーに由来するＡＰＲＩＬ結合ペプチドが挙げられる。他の例としては、操作されたタンパク質骨格、例えば、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリンおよびＤＡＲＰｉｎに基づくＡＰＲＩＬ結合ペプチドが挙げられる。

【0095】

本発明のさらなる態様は、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための本発明の方法を用いて
入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞に関する。上で論じたように、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、使用されるバインダーペプチドのライブラリーに応じて、種々の手順を用いて決定および／または単離され得る。このようにして、本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列が得られる場合がある。そのようなヌクレオチド配列は、宿主細胞のトランスフェクションのために使用され得る。したがって、その細胞は、遺伝的に改変された細胞であり得る。特に、その細胞は、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドをコードするヌクレオチドを異種ヌクレオチド配列として含めることによって遺伝的に改変され得る。

【0096】

宿主細胞は、クローニング宿主または発現宿主であり得る。発現宿主として選択されるとき、宿主細胞発現系は、好ましくは、異種ペプチド、例えば、抗体または抗体フラグメントを産生することができ、より好ましくは、その産生が最適化されている。宿主細胞は、単細胞生物に由来してもよいし、多細胞生物に由来してもよく、免疫グロブリンタンパク質またはＡＰＲＩＬ結合ペプチドを別途産生しない、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞から選択され得る。トランスフェクションに向けて、単離されたＤＮＡが発現ベクターに挿入され得、次いで、その発現ベクターが宿主細胞にトランスフェクトされる。

【0097】

あるいは、免疫された際に、内因性の免疫グロブリン産生の非存在下においてヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作出することも可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失が、内因性の抗体産生を完全に阻害すると報告されている。そのような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを移すことにより、抗原チャレンジの際にヒト抗体が産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７：３３；およびＤｕｃｈｏｓａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８を参照のこと。

【0098】

本発明に係る細胞を使用して、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドが産生され得る。したがって、本発明のさらなる態様は、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを生成するためのプロセスに関し、そのプロセスは、本発明に係る細胞を提供する工程、前記細胞を培養する工程、およびそれらの細胞が、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを発現すること、好ましくは、分泌することを可能にする工程を含む。

【0099】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、宿主細胞発現系から単離され得、このための様々な手順は、当業者には容易に利用可能である。最も適した具体的な手順は、使用される宿主細胞発現系に依存し、当業者は、利用可能な通常の一般的な知識に基づいて好適な選択を行うことができる。

【0100】

組換え法を使用するとき、ＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、抗体（またはアナログ）は、細胞内に産生され得るか、細胞周辺腔において産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。ＡＰＲＩＬ結合ペプチドが、細胞内に産生される場合、第１の工程として、粒状の残屑である宿主細胞または溶解されたフラグメントが、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７には、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順が記載されている。簡潔には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下において約３０分間にわたって融解する。遠心分離によって細胞残屑を除去し得る。ＡＰＲ
ＩＬ結合ペプチドが培地に分泌される場合、通常はまず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、そのような発現系からの上清を濃縮する。タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前述の任意の工程に含めてもよく、外来性の夾雑物の増殖を妨げるために抗生物質を含めてよい。

【0101】

細胞から調製されるＡＰＲＩＬ結合ペプチド組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィが特に有益な精製法である。免疫グロブリン（ｉｍｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）に対する親和性リガンドとしてのプロテインＡの適格性は、そのタンパク質配列に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種類およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用することにより、ヒトＩｇ．ガンマ１、Ｉｇ．ガンマ２またはＩｇ．ガンマ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３）。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒト．ガンマ．３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＥＭＢＯ Ｊ ５：１５６７−１５７５）。親和性リガンドが付着したマトリックスは、最も頻繁には、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定したマトリックス、例えば、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成され得るものと比べて、より速い流速およびよい短い処理時間を可能にする。ＡＰＲＩＬ結合ペプチドが、抗体であり、Ｃ_Ｈ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が、精製に有用である。タンパク質精製に対する他の手法、例えば、イオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）におけるクロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）におけるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫安塩析もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。

【0102】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを生成するためのプロセスを用いて入手可能な、ＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、免疫グロブリンの結合フラグメントを含む免疫グロブリンが、本発明のさらなる態様である。このＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、通常、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための方法を用いて入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドの定義の範囲内のペプチド配列を有する。しかしながら、グリコシル化プロファイルなどの翻訳後修飾に関して差異が存在し得る。例えば、コアフコース残基を欠く抗体は、高いＡＤＣＣ活性を示すと示されている。抗体のグリコシル化のパターンの調節は、当業者に公知である。例えば、ＧｌｙｃｏＦｉ技術は、所望のレベルのＦｃエフェクター機能を示すように抗体のグリコシル化を特異的に調節することを可能にする（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２０１０，５：９５−１１１）。

【0103】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを生成するためのプロセスを用いて入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、単離された抗体であり得る。「単離された」抗体は、同定され、その天然の環境の成分から分離および／または回収されている抗体である。その天然の環境の夾雑物成分は、その抗体に対する診断的または治療的な使用を干渉し得る材料であり、その夾雑物成分としては、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、（１）例えば、Ｌｏｗｒｙ法によって測定されたとき、そのペプチドを含む組成物中のタンパク質の少なくとも５０重量％、例えば、少なくとも６０重量％、好ましくは、少なくとも８０重量％、例えば、少なくとも９０重量％、最も好ましくは、そのペプチドを含む組成物中のタンパク質の９５重量％超、例えば、少なくとも９９重量％に相当するように、（２）スピニングカッ
プ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度にまで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる、還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製される。その抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

【0104】

本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことを指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いては同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して産生されているので、高度に特異的である。さらに、種々の決定基（エピトープ）に対して産生された種々の抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して産生されている。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られているという抗体の性質を指すものであって、任意の特定の方法による抗体の精製を必要とするものと解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５が初めて報告したハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されている手法を使用してファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。本明細書中のモノクローナル抗体は、特に、「キメラ」抗体を含む。

【0105】

モノクローナル抗体は、試験被験体にヒトＡＰＲＩＬ抗原を注射し、次いで、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現しているハイブリドーマを作製するという当該分野の知識および技術に従って作製され得る。それらのモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、それらのモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。それらのハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。

【0106】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、抗体またはそのアナログを生成するための本発明のプロセスを用いて入手可能なＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、配列番号５、６および７または配列番号１５、１６および１７または配列番号２５、２６および２７または配列番号３５、３６および３７または配列番号４５、４６および４７からそれぞれ選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列類似性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリンＶ_Ｈドメイン、例えば、配列番号３、１３、２３、３３または４３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列類似性を有するＶ_Ｈドメインを含み得る。

【0107】

前記ＡＰＲＩＬ結合ペプチド、例えば、抗ＡＰＲＩＬ抗体またはそのアナログは、配列番号５、６、７、８、９および１０または配列番号１５、１６、１７、１８、１９および２０または配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０または配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０または配列番号４５、４６、４７、４８、４９および５０からそれぞれ選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列類似性を有す
るＶ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２ Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２およびＶ_ＬＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリンＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン、例えば、配列番号３および４または１３および１４または２３および２４または３３および３４または４３および４４からそれぞれ選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％の配列類似性を有するＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの対を含み得る。これらの様々な配列をコードするＤＮＡ配列は、遺伝暗号の知識に基づいて、当業者によって決定され得る。下記の表２には、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列をコードするいくつかのＤＮＡ配列を列挙する。それらの配列は、配列表に提供されている。

【0108】

本発明に係るＡＰＲＩＬ結合ペプチドには、好ましくは、エキソビボ診断方法のための、診断ツールおよび／または分析ツールとしての使用法が見出されている。したがって、本発明のさらなる態様は、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドのそのような使用に関する。例えば、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、被験体由来のサンプル、例えば、組織サンプル、全血または血液由来サンプル、例えば、血漿または血清中のＡＰＲＩＬを検出するために使用され得る。あるいは、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、特定の細胞上、例えば、組織、血液または培養物に由来する細胞上のＡＰＲＩＬを検出するために使用され得る。そのような検査は、変化したＡＰＲＩＬレベルに関連する症状、例えば、癌、炎症に関連する症状、敗血症、アレルギー、自己免疫疾患または感染症、例えば、菌血症から選択される症状の診断を目的とし得る。その検査は、被験体が、変化したＡＰＲＩＬレベルに関連する症状に罹患しているか否かを判定するための診断において使用され得る。この場合、通常、被験体が、高い（正常値を超える）ＡＰＲＩＬレベルを有するか否かが評価される。正常なヒト血清ＡＰＲＩＬレベルに対する現在の標準値は、約１〜１０ｎｇ／ｍｌである（Ｐｌａｎｅｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９２，１２８４−５）。したがって、本発明では、変化したＡＰＲＩＬレベルは、高いＡＰＲＩＬレベル、例えば、１０ｎｇ／ｍｌを超えるＡＰＲＩＬレベル、例えば、１５、３０、５０または１００ｎｇ／ｍｌ超であり得る。または、特定の被験体の正常なＡＰＲＩＬレベルが既知である（例えば、正常なＡＰＲＩＬレベルに関連すると見なされたいくつかの特定の時点において行われたいくつかの測定による）場合、高いＡＰＲＩＬレベルは、その被験体に対して測定された正常なレベルと比べて判定され得る。あるいは、その検査は、被験体が罹患している、変化したＡＰＲＩＬレベルに関連する症状を治癒するためおよび／または安定させるために被験体が受けた処置の成果を評価するために使用され得る。この場合、通常、被験体における高いＡＰＲＩＬレベルが、正常であると見なされるレベルに接近するまで低下しているか否かが評価される。被験体が、変化したＡＰＲＩＬレベル、特に、高いＡＰＲＩＬレベルに関連する症状に罹患していると陽性の診断を受けた後、変化したＡＰＲＩＬレベルに関連する症状を治癒するためおよび／または安定させるために前記被験体が受けた処置の成果を評価するために診断が継続され得ることは明らかだろう。

【0109】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドを使用する検査が有用であり得る癌は、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性 前骨髄球性、骨髄単球性 単球性 赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫および辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、真性多血症 リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫（ｃｈｒｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、直腸結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌
、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、鼻咽頭癌、食道癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）の癌、子宮頸癌、絨毛癌、直腸結腸癌、結合組織癌、消化系の癌、子宮体癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、上皮内新生物、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌（小細胞、大細胞）、メラノーマ、神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口および咽頭）、卵巣癌、膵癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌；呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌ならびに泌尿器系の癌から選択され得る。

【0110】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドを使用する検査が有用であり得る炎症に関連する症状は、アテローム性動脈硬化症、尋常性ざ瘡、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、再灌流傷害、サルコイドーシス、移植片拒絶、脈管炎、間質性膀胱炎、ならびにマックル・ウェルズ症候群および他の自己炎症障害を含む無菌性炎症に関連する症状である。

【0111】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドを使用する検査が有用であり得る別の症状は、敗血症および／または関連する症状、例えば、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である。敗血症の病理は、当業者に公知である。特に、当業者は、敗血症が、以下の全身性炎症の特徴：発熱または低体温、白血球増加または白血球減少、頻拍、および頻呼吸または超正常の換気量のうちの２つ以上を含む、感染によって誘導される症候群と定義され得ることを理解しているだろう。当業者は、被験体における敗血症の発症が、全身性炎症反応症候群（「ＳＩＲＳ」）陰性から、ＳＩＲＳ陽性、そして敗血症に進行する経過をたどる場合があり、そして、重篤な敗血症、敗血症性ショック、多臓器機能不全（「ＭＯＤ」）に進行することがあり、最終的には死に至る場合があることも承知しているだろう。敗血症は、感染した被験体が後にＳＩＲＳを発症したときにも、その被験体において発生し得る。したがって、「敗血症」は、ＳＩＲＳ＋記述された感染による感染に対する全身性の宿主応答として定義され得る。「重篤な敗血症」は、ＭＯＤ、低血圧、播種性血管内凝固（「ＤＩＣ」）、または乳酸アシドーシス、乏尿および精神状態変化を含む灌流低下異常に関連する。「敗血症性ショック」は、一般に、初期蘇生輸液（ｆｌｕｉｄ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ）に抵抗性であり、灌流低下異常がさらに存在した状態で、敗血症によって誘導される低血圧と定義される。

【0112】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドを使用する検査が有用であり得る自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬、クローン病および他の炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎（ｐｏｌｙｐｙｏｓｉｔｉｓ）、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、乾癬性関節炎、インスリン抵抗性、自己免疫性真性糖尿病、自己免疫性肝炎、自己免疫性血友病、自己免疫性疾患症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性肝炎、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性網膜ブドウ膜炎、ギランバレー（Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｅ）症候群、動脈硬化症およびアルツハイマー病から選択され得る。

【0113】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドを使用する検査に対する例示的なアレルギー性障害としては、アレルギー性結膜炎、春季結膜炎、春季結膜炎および巨大乳頭結膜炎；アレルギー性鼻炎および静脈洞炎を含む鼻アレルギー性障害；エウスタキオ管のそう痒を含む耳ア
レルギー性障害；内因性喘息および外因性喘息を含む上気道および下気道のアレルギー性障害；皮膚炎、湿疹およびじんま疹を含む皮膚のアレルギー性障害；ならびに消化管のアレルギー性障害が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0114】

感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（ｃｏｒｎｏｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、耳下腺炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。

【0115】

感染症を引き起こす病原菌のいくつかの例としては、クラミジア、リケッチア菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌（ｃｏｎｏｃｏｃｃｉ）、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽、ペスト、レプトスピラ症およびライム病の病原菌が挙げられる。

【0116】

感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例としては、Ｃａｎｄｉｄａ（ａｌｂｉｃａｎｓ、ｋｒｕｓｅｉ、ｇｌａｂｒａｔａ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなど）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、ｎｉｇｅｒなど）、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ属（ｍｕｃｏｒ、ａｂｓｉｄｉａ、ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓおよびＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍが挙げられる。

【0117】

感染症を引き起こす病原性寄生生物のいくつかの例としては、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉおよびＮｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓが挙げられる。

【0118】

診断的用途のために、本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、典型的には、検出可能な標識基であるシグナル伝達部分に（直接的または間接的に）連結され得る。一般に以下のカテゴリーに分類され得る数多くの標識部分が利用可能である：ビオチン、蛍光色素、放射性ヌクレオチド、酵素、ヨウ素および生合成標識。また、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドが抗体またはそのアナログである場合、Ｆｃ鎖は、標識部分として働き得る。さらにＦｃ鎖は、標識として働く非抗体結合ペプチドに付加され得る。抗マウス抗体および抗ヒト抗体などの様々な種由来のＦｃ鎖を標的としている市販の抗体が数多く存在する。これらは、様々な標識を伴った状態で入手可能であり、本発明の抗ＡＰＲＩＬ抗体のＦｃ鎖を標的とするために、公知の方法を用いて使用され得る。したがって、抗ＡＰＲＩＬ抗体が使用される場合、その検査に存在する他のタンパク質（例えば、異種起源からの少なくとも主にタンパク質配列を含むことによって）、例えば、ＡＰＲＩＬおよびＡＰＲＩＬレセプター（またはその結合等価物）と抗原的に異なることが好ましい。これにより、検出プロセスにおいて、標識された抗体による抗ＡＰＲＩＬ抗体のＦｃ鎖の標的化が促進される。当業者は
、キメラ抗体の場合、Ｆｃ鎖が抗体の抗原性を主に決定することを承知しているだろう。

【0119】

検査方法のある特定の実施形態によると、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、被験体由来のサンプル中で検出され、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドの存在は、ＡＰＲＩＬの存在に対する指標として使用される。これらの実施形態では、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、通常、可溶型で使用され得る。検査方法のある特定の他の実施形態によると、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、固体支持体上に固定化され、ＡＰＲＩＬまたはＡＰＲＩＬを含む複合体を捕捉する捕捉物質として使用される。

【0120】

例えば、第１の検査形式では、ＡＰＲＩＬ結合レセプター（例えば、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ）またはその結合等価物、例えば、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａ（ＷＯ２０１０／１０００５６に開示されている）もしくはアナログが、固体支持体上に固定化され得、被験体由来のサンプル、例えば、血清が、その固体支持体に適用される。洗浄した後（未結合の材料、特に、ＡＰＲＩＬの検出を干渉する未結合の材料を除去するために）、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドが、その固体支持体に加えられ、例えば、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドに付着された標識を検出することによって、またはいくつかの実施形態によると、ＡＰＲＩＬ結合ペプチド上のＦｃ鎖に特異的な標識された抗体を加えることによって、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドの存在が検出される。検出は、定性的、半定量的または定量的であり得る。定量的な検出が好ましい。標識されたペプチド、例えば、標識された抗体を検出するための方法および手段は、当業者に公知である。例えば、ＡＰＲＩＬ結合抗体のＦｃ鎖に結合する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗体が、使用され得る。西洋ワサビペルオキシダーゼによる発色基質（例えば、ＴＭＢ、ＤＡＢ、ＡＢＴＳ）の有色産物への変換が、結合したＡＰＲＩＬの測定として使用される。

【0121】

代替の診断形式では、診断検査は、被験体由来のサンプルにおいて、被験体に投与された、ＡＰＲＩＬレセプター等価物、例えば、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたはそのアナログと複合体化したＡＰＲＩＬの量を検出するためのものである。この形式では、その検査は、・固体支持体上に固定化されたＡＰＲＩＬ結合ペプチドを提供すること；
・その固体支持体にサンプルを適用し、インキュベートして、サンプル中に存在する複合体が固体支持体に結合することを可能にすること；
・洗浄すること；
・結合した複合体を検出することおよび／または結合した複合体化していないＡＰＲＩＬを検出すること
を含み得る。

【0122】

この検査形式は、例えば、ＡＰＲＩＬ−ＡＰＲＩＬレセプター相互作用の遮断物質を用いる、被験体の血清中のＡＰＲＩＬの飽和の測定にとって価値がある。この場合、結合した複合体と結合した複合体化していないＡＰＲＩＬの両方を検出することが好ましい。これは、別個のインキュベーションにおいて複合体化したＡＰＲＩＬおよび複合体化していないＡＰＲＩＬを検出することによって、ならびに／または結合した複合体および結合した複合体化していないＡＰＲＩＬを標的とするときは異なる標識を使用することによって、達成され得る。複合体化していないＡＰＲＩＬは、上に提示された第１の検査形式においても測定され得る。

【0123】

同じインキュベーションにおいて、結合した複合体化したＡＰＲＩＬおよび結合した複合体化していないＡＰＲＩＬを検出する場合、複合体は、ＡＰＲＩＬレセプター等価物に対して産生された第１の検出ペプチド、例えば、抗体を用いて標的化され得、ここで、前記第１の検出ペプチドは第１の標識に結合され、複合体化されていないＡＰＲＩＬは、ＡＰＲＩＬに対して産生された第２の検出ペプチド、例えば、抗体によって標的化され得、ここで、前記第２の検出ペプチドは、第１の標識とは異なる第２の標識に結合されている
。第２の検出ペプチドは、例えば、ＡＰＲＩＬレセプター等価物と同じＡＰＲＩＬの領域に結合するように選択され得る。したがって、それは、ＡＰＲＩＬレセプターまたはＡＰＲＩＬレセプター等価物として選択され得る。実際に、ＡＰＲＩＬへの結合に関して、それは、被験体に投与されるレセプター等価物と同一であり得る。したがって、第２の検出ペプチドは、被験体に投与されたレセプター等価物の検出と判別可能な検出を可能にする付着された標識を有することによって、被験体に投与されるレセプター等価物、例えば、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたはそのアナログと異なり得る。例えば、異なるＦｃ鎖を含めることによって。本発明では、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａに対する言及は、そのアナログ、特に、ヒト化アナログを含む。第２の検出ペプチドは、好ましくは、選択されたＡＰＲＩＬ結合ペプチドがＡＰＲＩＬに結合するＡＰＲＩＬの同じ領域に結合するべきでないし、ＡＰＲＩＬへの結合が、選択されたＡＰＲＩＬ結合ペプチドの結合によって妨害されるべきでないことは明らかだろう。

【0124】

上記検査により、結合した複合体および／または結合した複合体化していないＡＰＲＩＬに対する検出結果、例えば、検出値が得られる。検出結果から、投与されたＡＰＲＩＬレセプター等価物によるＡＰＲＩＬ飽和レベルが測定され得、ＡＰＲＩＬレセプター等価物、例えば、ｈＡＰＲＩＬ．０１Ａまたはそのアナログによる被験体の処置の治療成果が評価され得る。

【0125】

本発明の診断検査の実施形態において、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドまたはＡＰＲＩＬ結合レセプター（またはその結合等価物）は、例えば、実験容器の表面上、例えば、マイクロタイタープレートのウェルの表面上に固定化され得る。サンプルを固体支持体に適用することによって、そのサンプルが、固定化されたＡｐｒｉｌ結合ペプチドに適用されることが明らかだろう。

【0126】

洗浄は、未結合の材料、特に、ＡＰＲＩＬの検出を干渉する未結合の材料を除去するためであり、当業者に公知の任意の好適な洗浄液を用いて達成され得る。一般に、水溶液が使用される。洗浄液に関連するいくらか一般的な指針も、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドを得るための方法に関して、上に提供されている。

【0127】

本発明の診断検査では、反応およびプロセス、例えば、サンプルを固体支持体に適用すること、インキュベートして、そのサンプル中に存在する複合体がその固体支持体に結合することを可能にすること、洗浄工程および検出工程が、好適な容器内、例えば、反応容器内、特に、診断目的のために実験室規模で使用される容器内で行われ（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ）得ることが明らかであろう。

【0128】

上に記載された（ｄｅｓｓｃｒｉｂｅｄ）例示的な（ｅｘａｍｐｌａｒｙ）診断形式は、固定化されたペプチド（ｐｅｔｉｄｅｓ）を有する固体支持体を含む。診断検査の形式が、例えば、時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴまたはＨＴＲＦ）を含む蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法によって、完全に溶液中でも実行され（ｅｘｃｕｔｅｄ）得ることが当業者には明らかだろう。当業者は、上に提示された検査形式を、例えばＦＲＥＴ法を使用することによって完全に溶液中で実行するために、それらの形式を改変する方法を承知しているだろう。また、完全に溶液中で実行される検査形式では、本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、ＡＰＲＩＬの存在に対する指標として使用され得るので、有用である。

【0129】

当業者は、様々な検査形式において、ＡＰＲＩＬ−ＡＰＲＩＬレセプター相互作用によるＡＰＲＩＬ結合ペプチドの干渉が低いことが有益であることを理解するだろう。しかしながら、本発明のペプチドの診断的使用は、これらの例示的な検査形式に限定されないことが強調されるべきである。診断的および分析的な用途において使用するための本発明の
ＡＰＲＩＬ結合ペプチドの可能性が、実験の項に提示される結果によってさらに支持される。

【0130】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、他の任意の公知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接および間接的なサンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイ（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７））においても使用され得る。

【0131】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、インビボ診断アッセイにも使用され得る。免疫シンチグラフィまたはポジトロン放出断層撮影法を用いて、ＡＰＲＩＬ抗原またはそれを発現している細胞の場所を突き止めることができるように、通常、ＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、放射性核種で標識される。

【0132】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、他の非治療的な使用法も有し得る。ＡＰＲＩＬ結合ペプチドに対する非治療的な使用法としては、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）および免疫組織化学が挙げられる。

【0133】

本発明のＡＰＲＩＬ結合ペプチドは、例えば、プロテインＡ−セファロースカラムへの固定化を介して、親和性精製試薬としても使用され得る。

【0134】

本発明は、本発明の非限定的な実施形態を提示する以下の実施例を参照してさらに例証され得る。

【0135】

実施例

【実施例1】

【0136】

商業的に入手可能なＡＰＲＩＬ検出アッセイは、ヒト血清（ＨＳ）中のＡＰＲＩＬを確実に検出しない。

【0137】

患者の血清中のＡＰＲＩＬを検出するために、ヒトＢＣＭＡによるＡＰＲＩＬの捕捉およびポリクローナルウサギＡＰＲＩＬ特異的抗体を使用する結合した抗体の検出に依存する、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイが報告されている（Ｐｌａｎｅｌｌｅｓ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ２００７，９２：１２８４−５）。しかしながら、入手可能なポリクローナル抗体は、ごく限られており、ポリクローナル抗体は、再現性よく得ることができない。この問題を解決するために、商業的に入手可能な抗ＡＰＲＩＬアッセイを、ポリクローナル抗体に基づくＥＬＩＳＡで観察された検出と比較した。ポリクローナルＥＬＩＳＡでは、プレートを、４℃のコーティング緩衝液（０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝６，５）中の１００ｎｇ／ウェルのＢＣＭＡ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした。一晩コーティングした後、プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。次いで、プレートを、室温において１時間、１０％ヒト血清を含むＰＢＳ（アッセイ希釈剤）でブロッキングした。市販のＥＬＩＳＡでは、あらかじめコーティングされたプレートを使用した（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）。組換えヒトＡＰＲＩＬ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するかまたは提供された組換えヒトＡＰＲＩＬ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、アッセイ希釈剤において、標準物質を作製した。続いて、直腸結腸癌患者由来のヒト血清をアッセイ希釈剤で１０倍希釈し、両方のＥＬＩＳＡにおいて並行して試験した。次いで、結合したＡＰＲＩＬの検出を、製造者の指示書（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に従って、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された提供されたモノクローナル抗体を用いるかまたはポ
リクローナル抗体を用いた後、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ（アッセイ希釈剤において１：１，０００）を使用する第２の工程によって行った。抗体インキュベーション工程はすべて、室温でのアッセイ希釈剤における１時間であり、その後、ＰＢＳ／０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。

【0138】

図１に提示されるように、商業的に入手可能なＡＰＲＩＬ ＥＬＩＳＡは、ポリクローナル抗体に基づくアッセイの結果を再現しない。いくつかの場合では、ポリクローナルＥＬＩＳＡを用いたとき、高検出が観察されたが、それは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＥＬＩＳＡにおける高発現と一致しない。相反的に、いくつかの場合は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＥＬＩＳＡにおいて明確な検出を示すが、ＡＰＲＩＬは、ポリクローナルＥＬＩＳＡにおいて検出されない。Ｓｐｅａｒｍａｎ Ｒ値を使用する相関関係の解析は、比較的不十分な信頼区間で０，５９４６という非常に低い相関関係を示す。ゆえに、このＥＬＩＳＡは、比較可能なデータを提供しない。

【0139】

さらに、ＡＰＲＩＬの定量に対するヒト血清の影響を解析するために、ＡＰＲＩＬにヒト血清を加えることの影響を調べた。野生型ＡＰＲＩＬを発現する構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって作製された組換えＡＰＲＩＬを使用して２つの標準物質を作製した。この組換えＡＰＲＩＬは、１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２３、０．４１、０．１３６および０．０４ｎｇ／ｍｌという濃度に、ＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清＋２０％ヒト血清（ＨＳ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）で希釈されるかまたはＰＢＳ／１％ＢＳＡで希釈される。ＡＰＲＩＬの定量に対する血清添加の影響を調べるために、これらの２つの標準物質の結合を、いくつかの商業的に入手可能な抗体またはＥＬＩＳＡキットにおいて試験した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄによって提供されるＡＰＲＩＬ ＥＬＩＳＡである、あらかじめコーティングされたプレートを含むＬｅｇｅｎｄ ＭＡＸ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：４３９３０７）に対して、使用前にすべての試薬を室温にした。プレートを、１ウェルあたり少なくとも３００μｌの１×洗浄緩衝液（製造者によって与えられたもの）で４回洗浄し、プレートを吸収紙の上に逆さにしてしっかりとたたくことによってすべての残留緩衝液を落とした。次に、１００μｌの標準物質希釈物を加え、キットに含まれているプレートシーラーを用いてプレートを密封し、室温において２時間、２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。この工程の後、プレートを１×洗浄緩衝液で４回洗浄した。次に、１００μｌのヒトＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３検出抗体溶液を、各ウェルに加え（製造者によって与えられたもの）、プレートを密封し、室温において１時間、２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを１×洗浄緩衝液で４回洗浄した。各ウェルに１００μｌのアビジン−ＨＲＰ Ａ溶液（製造者によって与えられたもの）を加え、室温において３０分間、振盪しながらインキュベートすることによって、１次抗体を認識した。最後に、プレートを１×洗浄緩衝液で５回洗浄した。各ウェルに１００μｌの基質液Ｆ（製造者によって与えられたもの）を加え、室温において１５分間、暗所でインキュベートすることによって、結合した複合体を可視化した。各ウェルに１００μｌの停止液（製造者によって与えられたもの）を加えることによって、反応を停止させた。吸光度を４５０ｎｍで読み出した。図２Ａは、ヒト血清の存在下のこのアッセイにおける低いＡＰＲＩＬ検出を示している。上に記載されたポリクローナル抗体アッセイと同様に、ＢＣＭＡ−Ｆｃによる捕捉後の、商業的に入手可能なモノクローナル抗体を使用したＡＰＲＩＬの検出を評価した。図２Ｂでは、検出モノクローナル抗体としてＡＰＲＩＬＹ−５を使用したときの、ＡＰＲＩＬの検出に対するヒト血清の影響が示されている。ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（上記を参照のこと）中の１００μｌの０．５μｇ／ｍｌ ＢＣＭＡ−Ｆｃ（ＥＢＣ０５１２０８１；Ｒ＆Ｄ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ（先に記載されたもの）で３回洗浄し、１５０μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡを使用して、３７℃において１時間ブロッキングした。ＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、１００μｌの種々の標準物質を各ウェルに加え
た。標準物質濃度を室温において２時間インキュベートした。そのインキュベーション時間の後、プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、商業的に入手可能なビオチン化されたＡＰＲＩＬＹ−５（ＡＬＸ−８０４−８０１−Ｃ１００，Ｅｎｚｏ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＢＶＢＡ，Ａｎｔｗｅｒｐｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで希釈された１００μｌの１μｇ／ｍｌとしてプレートに加え、これを３７℃で１時間行った。次に、プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。その後の工程に、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで１：１，０００希釈された１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（カタログ番号８９０８０３，Ｒ＆Ｄ，ＵＫ）を３７℃で１時間加える工程を含めた。プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質を使用して、結合した免疫複合体を可視化した。１００μｌの０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み出した。ヒト血清の存在下においてＡＰＲＩＬは検出されなかった。

【0140】

図２Ｃでは、ＡＰＲＩＬを捕捉するために商業的に入手可能なＳａｓｃｈａ−２抗ＡＰＲＩＬ抗体を使用し、結合したＡＰＲＩＬを検出するためにＡＰＲＩＬＹ−５バイオ抗体を使用する、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＡＰＲＩＬの定量に対するヒト血清の影響を調べた。このアッセイでは、ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（上記を参照のこと）中の１００μｌの抗ＡＰＲＩＬ抗体Ｓａｓｃｈａ−２（８０４−８０４−Ｃ１００，Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＢＶＢＡ，Ａｎｔｗｅｒｐｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、３７℃において１時間、１５０μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロッキングした。ＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、１００μｌの標準物質をインキュベートした。１００μｌのこれらの標準物質を各ウェルに加え、標準物質濃度を室温において２時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、商業的に入手可能なビオチン化されたＡＰＲＩＬＹ−５を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで希釈された１００μｌの１μｇ／ｍｌとして、３７℃において１時間プレートに加えた。次に、それらのプレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。その後の工程に、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで１：１，０００希釈された１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰを３７℃で１時間加える工程を含めた。プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質を使用して、結合した免疫複合体を可視化した。１００μｌの０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０で読み出した。ヒト血清の非存在下または存在下において、ＡＰＲＩＬの信頼できる検出は観察されなかった。最後に、図２Ｄにおいて、本発明者らは、第２の商業的に入手可能なＡＰＲＩＬ ＥＬＩＳＡである、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＤｕｏ Ｓｅｔ ＥＬＩＳＡ抗ヒトＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３（カタログ番号ＤＹ８８４）の使用を評価した。捕捉抗体（製造者によって与えられるもの、８４３３６２）を、ＰＢＳに希釈された２μｇ／ｍｌという最終濃度に希釈することによってプレートをコーティングした。９６ウェルプレートを１ウェルあたり１００μｌでコーティングし、室温において一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液（製造者によって与えられるもの、カタログ番号ＷＡ１２６）で４回洗浄した。各ウェルに３００μｌの試薬希釈剤（製造者によって与えられるもの、カタログ番号ＤＹ９９５）を加えることによってプレートをブロッキングし、室温において１時間インキュベートした。その後、プレートを４回洗浄した。そして、１００μｌの標準物質または血清サンプルを加えた。血清サンプルを試薬希釈剤で５倍希釈し、接着性ストリップでカバーし、室温において２時間インキュベートした。次に、プレートを４回洗浄し、各ウェルに対して、試薬希釈剤に希釈された１００μｌの検出抗体（製造者によって与えられるもの、カタログ番号８４３３６３）を使用して、血清中のＡＰＲＩＬを検出し、室温において２時間インキュベートした。プレートを４回洗浄した。その後、１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（カタログ番号８９０８０３，Ｒ＆Ｄ，ＵＫ）の作用希釈液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を各ウェルに加え、プレートをカバーし、室温において２０分間インキュベートした。プ
レートを４回洗浄した。各ウェルに１００μｌの基質溶液（製造者によって与えられるもの、ＤＹ９９９）を加えることによって免疫複合体を可視化し、室温において２０分間インキュベートした。各ウェルに５０μｌの停止液を加えることによって反応を停止させた（ＤＹ９９４）。４５０ｎｍにおける光学濃度によって、結合したＡＰＲＩＬを検出した。ＡＰＲＩＬは、検出されなかった。

【0141】

まとめると、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡアッセイまたはモノクローナル抗ＡＰＲＩＬ抗体のいずれもが、上に記載されたポリクローナル抗体を使用して得られたアッセイの結果を再現せず、すべてが、ヒトＡＰＲＩＬの定量においてヒト血清の大きな干渉を示した。

【実施例2】

【0142】

免疫化および抗ＡＰＲＩＬ抗体の選択
ＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡによるマウスの免疫化
ヒト血清の状況においてＡＰＲＩＬの検出を可能にするヒトＡＰＲＩＬタンパク質に対する抗体を単離するために、マウスをｈＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡで免疫した。次に、ＢＣＭＡとの結合相互作用においてヒトＡＰＲＩＬに結合する抗ｈＡＰＲＩＬ抗体を発現しているＢ細胞を特異的に単離する選択手順をデザインし、開発した。

【0143】

マウスのｃＤＮＡ免疫化によって、抗ｈＡＰＲＩＬ抗体を産生させた。第１に、ｈＡＰＲＩＬの完全長オープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にサブクローニングした。２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）におけるｐＣＩ−ｎｅｏ−ｈＡＰＲＩＬの一過性のトランスフェクション、およびマウス抗ｈＡＰＲＩＬ ＩｇＧ１ Ａｐｒｉｌｙ−５（１：５，０００）（Ａｌｅｘｉｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に続くヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ（１：２，０００）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）による免疫ブロット法によって、得られたベクターの発現を確かめた。Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子銃（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）およびＤＮＡをコーティングされた金弾丸（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の指示書に従って使用する遺伝子銃免疫化によって、マウスを免疫した。簡潔には、１μｍの金粒子を、ｐＣＩ−ｎｅｏ−ｈＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡならびにマウスＦｌｔ３ＬおよびマウスＧＭ−ＣＳＦに対する市販の発現ベクター（両方がＡｌｄｅｖｒｏｎ，Ｆａｒｇｏ，ＮＤ製）で、２：１：１の比率においてコーティングした。５００μｇの金粒子をコーティングするために、合計１μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。

【0144】

詳細には、遺伝子銃を用いて、７〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの耳に、両耳において３サイクルの発射を与える免疫を行った。３回のＤＮＡ免疫化後に、マウス血清におけるＥＬＩＳＡによって、およそ１：８００〜２，４００の抗ｈＡＰＲＩＬ力価が検出された。そのＥＬＩＳＡでは、すべてのインキュベーション工程の後に、ＰＢＳＴ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）による洗浄工程を行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を、４℃において一晩、ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＰＢＳ中の５０ｎｇ／ウェル）（Ｓｉｇｍａ，Ｆ７４２５）でコーティングし、ＲＴにおいて１時間、１０％ヤギ血清／ＰＢＳＴでブロッキングした。プレートを、ＣＭＶプロモーターが駆動する分泌型のＦＬＡＧ−ｈＡＰＲＩＬ（ｐＣＲ３−ｈＡＰＲＩＬ）によって一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの上清（ＰＢＳにおける１：１０）とともにＲＴにおいて１時間インキュベートした後、マウス血清希釈物および１：２，０００ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに、それぞれＲＴにおいて１時間インキュベートした。最後のＰＢＳＴでの洗浄の後、１００μｌの安定化されたクロマゲン（ｃｈｒｏ
ｍａｇｅｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳＢ０２）を用いて、抗ｈＡＰＲＩＬ免疫反応性を可視化した。１００μｌの０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０および６２０ｎｍにおいて読み出した。ｈＡＰＲＩＬに対して反応性を示したマウスにおいて最後の３回目の免疫を行い、４日後に屠殺した。

【0145】

赤血球を除去した脾臓およびリンパ節細胞集団を、先に記載されたように（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：６９−７７；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９：１２５−１３４）調製し、−１４０℃で凍結させた。

【0146】

抗ＡＰＲＩＬ抗体を産生するＢ細胞の選択
ヒト血清の存在下においてＡＰＲＩＬを検出する抗ｈＡＰＲＩＬ抗体を産生するＢ細胞を特異的に選択するために、ＢＣＭＡ−Ｆｃと結合相互作用の状態にあるときのＡＰＲＩＬに結合する抗ｈＡＰＲＩＬ抗体を発現するＢ細胞が優先的に結合する選択ストラテジーをデザインし、開発した（図３）。４×１０^７個のＭ−４５０トシル活性化磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｃａｔ １４０．１３）を、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中の２０μｇの組換えＢＣＭＡ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃１９３−１３Ｃ）とともに、週末にわたって４℃においてインキュベートした。次に、上清を吸引し、４℃での１時間のインキュベーションによってＰＢＳ／１％ＢＳＡでビーズをブロッキングした。次に、ビーズをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。続いて、４℃での１時間のインキュベーションによって、ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬ含有上清（ＰＢＳ中の１：１０、ＣＭＶプロモーターが駆動する分泌型のＦＬＡＧ−ｈＡＰＲＩＬ（ｐＣＲ３−ｈＡＰＲＩＬ）によって一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来）とともにビーズをインキュベートした。最後に、ビーズをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに再懸濁した。

【0147】

低阻止（ｒｅｄｕｃｅｄ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗ｈＡＰＲＩＬ抗体を産生するＢ細胞クローンを選択するために、１．４×１０^７個の赤血球除去脾細胞を融解した（ｔｈａｗｎ）。それらの脾細胞を、ＡＰＲＩＬ−ＢＣＭＡと複合体化したトシル活性化磁気ＤｙｎａＢｅａｄ上における１：１．５というビーズ：細胞比での選択に供することによって、ｈＡＰＲＩＬ特異的Ｂ細胞を選択した。非特異的に（Ａｓｐｅｃｉｆｉｃ）結合している脾細胞を、５ｍｌのＤＭＥＭ Ｆ１２／Ｐ／Ｓ／１０％ＢＣＳ培地で１５回洗浄することによって洗い流した。次に、選択されたＢ細胞を、Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９：１２５−１３４に記載されているように培養した。簡潔には、選択されたＢ細胞を、７．５％（ｖ／ｖ）Ｔ細胞上清および５０，０００個の照射された（２，５００ＲＡＤ）ＥＬ−４ Ｂ５栄養細胞と、２００μｌのＤＭＥＭ Ｆ１２／Ｐ／Ｓ／１０％ＢＣＳという最終体積で９６ウェル平底組織培養プレートにおいて混合した。

【0148】

９日目に、上清をＥＬＩＳＡによってｈＡＰＲＩＬ反応性についてスクリーニングした。そのＥＬＩＳＡでは、すべてのインキュベーション工程の後に、ＰＢＳＴ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）による洗浄工程を行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を、ＰＢＳ中の０．２μｇ／ｍｌ
ＢＣＭＡ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９３−１３Ｃ）（ＰＢＳ中の５０μｌ／ウェル）で４℃において一晩でコーティングし、ＲＴにおいて１時間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロッキングした。プレートを、ＣＭＶプロモーターが駆動する分泌型のＦＬＡＧ−ｈＡＰＲＩＬ（ｐＣＲ３−ｈＡＰＲＩＬ）によって一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの上清（ＰＢＳにおける１：１０）とともにＲＴにおいて１時間インキュベートした後、Ｂ細胞培養物からの５０μｌの上清および１：５，０００ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに、それぞれＲＴにおいて１時間インキュベートした。最後のＰＢＳＴでの洗浄の後、１００μｌの
安定化されたクロマゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳＢ０２）を用いて、抗ｈＡＰＲＩＬ免疫反応性を可視化した。１００μｌの０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍにおいて読み出した。ｈＡＰＲＩＬ反応性抗体を発現しているＢ細胞クローンをＥＬＩＳＡによって同定した。

【0149】

続いて、ｈＡＰＲＩＬ反応性上清のＢ細胞クローンを、公開されている手順（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：６９−７７；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１９：１２５−３４）に従ってミニ電気融合によって不死化した。詳細には、Ｂ細胞を１０^６個のＳｐ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と混合し、ＤＭＥＭ Ｆ１２培地で洗浄することによって、血清を除去した。細胞をプロナーゼ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号４３０８０７０．５３６）で３分間処理し、電気融合等モル濃度（Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ Ｉｓｏｍｏｌａｒ）緩衝液（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号５３７０２）で洗浄した。電気融合は、５０μｌの融合チャンバーにおいて、３０ｓ、２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電場に続いて、１０μｓ、３ｋＶ／ｃｍのスクエア高電場パルス（ｓｑｕａｒｅ，ｈｉｇｈ ｆｉｅｌｄ ｐｕｌｓｅ）、再度、３０ｓ、２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電場によって、行った。

【0150】

チャンバーの内容物をハイブリドーマ選択培地に移し、限界希釈条件下で９６ウェルプレートにプレーティングした。融合の１２日後に、上に記載したように、ハイブリドーマ上清をｈＡＰＲＩＬ結合活性についてスクリーニングした。ｈＡＰＲＩＬを認識した、上清中の抗体を分泌した５つのハイブリドーマを、限界希釈によってサブクローニングすることにより、それらの完全性を保護した。以下の抗ｈＡＰＲＩＬ抗体をさらなる解析のために選択した：ｈＡＰＲＩＬ．１３０、ｈＡＰＲＩＬ．１３２、ｈＡＰＲＩＬ．１３３、ｈＡＰＲＩＬ．１３５、ｈＡＰＲＩＬ．１３８。

【0151】

ＡＰＲＩＬ結合ペプチド（ここでは、Ｂ細胞（Ｂ）上に発現される免疫グロブリン）を同定するために使用された選択ストラテジーを図３に模式的に示す。この模式図では、ＢＣＭＡ−Ｆｃ（シールドペプチドとして作用する）が、固体支持体（ビーズ）に結合され（または固定化され）、ＢＣＭＡとの相互作用によって、標的ペプチド（ＡＰＲＩＬ）がその固体支持体に固定化される。しかしながら、上記の説明から明らかであるように、代替の実施形態では、標的ペプチドが、固体支持体に結合されてもよく（または固定化されてもよく）、標的ペプチドとの相互作用によって、シールドペプチドが固体支持体上に固定化されてもよい。

【実施例3】

【0152】

抗ＡＰＲＩＬ抗体の精製および特徴づけ
抗ＡＰＲＩＬを産生するハイブリドーマの安定化および抗ＡＰＲＩＬ抗体の精製
２回の限界希釈によって、ｈＡＰＲＩＬハイブリドーマに対するクローン細胞集団を得た。安定したハイブリドーマを無血清培地中で７〜１０日間培養し；上清を回収し、０．２２μｍニトロセルロース膜に通して濾過した。ｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＰｒｏｔＡ樹脂を製造者の指示書に従って使用して（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−５４３８）、抗体を精製した。ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、緩衝液をＰＢＳと交換した。分光測定法を用いて抗体を定量した。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングテストキット（Ｒｏｃｈｅ，＃１１４９３０２７００１）を使用して、すべてのｈＡＰＲＩＬ抗体の（サブ）−アイソタイプが、ＩｇＧ１、カッパであると判定された。

【0153】

免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
縮重プライマーＰＣＲに基づく方法を用いて、ｈＡＰＲＩＬハイブリドーマによって発
現されるマウス抗体：ｈＡＰＲＩＬ．１３０、ｈＡＰＲＩＬ．１３２、ｈＡＰＲＩＬ．１３３、ｈＡＰＲＩＬ．１３５およびｈＡＰＲＩＬ．１３８に対する可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，７４１０６）を製造者の指示書に従って使用して、全ＲＮＡを約５×１０^６個のハイブリドーマ細胞から単離し、製造者の指示書に従ってデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＮａｓｅ Ｈ Ｍｉｎｕｓ，点変異体キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｍ３６８３）を製造者の指示書に従って使用して、重鎖および軽鎖に対する遺伝子特異的ｃＤＮＡを合成した。Ｎｏｖａｇｅｎ式のＩｇプライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＡｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、それらのＶ_ＨおよびＶ_Ｌ遺伝子をＰＣＲ増幅した。５００ｂｐという予想アンプリコンサイズとマッチしたすべてのＰＣＲ産物をｐＣＲ４ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、それらの構築物を、製造者の指示書に従って、サブクローニングに有効なＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において形質転換した。

【0154】

ユニバーサルＭ１３順方向および逆方向プライマーを使用するコロニーＰＣＲによってクローンをスクリーニングし、各反応から少なくとも２つのクローンをＤＮＡ配列決定解析のために選択した。Ｋａｂａｔ規則（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ公開番号９１−３２４２）に従って、ＣＤＲを特定した。

【0155】

それらの配列は、添付の配列表に開示されており、上記の表１に列挙されている。

【実施例4】

【0156】

抗ＡＰＲＩＬ抗体は、ヒト血清およびトランスジェニックマウスにおいてＡＰＲＩＬを検出する
新しく同定されたＡＰＲＩＬモノクローナル抗体、ｈＡＰＲＩＬ．１３０、ｈＡＰＲＩＬ．１３２、ｈＡＰＲＩＬ．１３３、ｈＡＰＲＩＬ．１３５およびｈＡＰＲＩＬ．１３８を使用して、ＣＬＬ患者に由来する血清中のＡＰＲＩＬ血清レベルを定量するために、以下のＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（０，２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６，５）中の１００μｌの０．５μｇ／ｍｌ ＢＣＭＡ−Ｆｃ（ＥＢＣ０５１２０８１；Ｒ＆Ｄ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、３７℃において１時間、１５０μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロッキングした。ＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、１００μｌのサンプルまたは標準物質を加えた。ＣＬＬ血清サンプルをＰＢＳ／１０％ＦＣＳにおいて５倍希釈した一方で、標準物質をＰＢＳ＋ＦＣＳ１０％＋ＨＳ２０％において希釈した。サンプルおよび標準物質濃度を室温において２時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、それらのプレートに、１００μｌの抗ＡＰＲＩＬモノクローナル抗体を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡに希釈された１μｇ／ｍｌという濃度で加え、３７℃において１時間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡにおいて１：１，０００希釈された１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０３１−０５）を加え、３７℃において１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（ＴＭＢ）を加えることによって、結合した免疫複合体を可視化した。その反応体積に等量の１Ｍ塩酸を加えることによって、反応を停止させた。４５０ｎｍにおいて光学濃度を測定することによって、結合したＡＰＲＩＬを定量した。図４Ａに示されているように、すべてのモノクローナル抗体が、患者の血清中において同程度にＡＰＲＩＬを示した。

【0157】

次に、ｈＡＰＲＩＬ．１３３モノクローナル抗体を使用して、同じＥＬＩＳＡ設定を用いて、解析を広げた。様々な量のＡＰＲＩＬを有する１０人のＣＬＬ患者のさらなるサンプルを解析した（図４Ｂ）。

【0158】

さらに、ＢＣＭＡ−Ｆｃ捕捉および検出用のｈＡＰＲＩＬ．１３３抗体を使用するアッセイ形式を用いて、ＡＰＲＩＬの定量に対するヒト血清の存在の影響を調べた。ＡＰＲＩＬｗｔを発現する構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって作製された組換えＡＰＲＩＬを使用して２つの標準物質を作製した。この組換えＡＰＲＩＬは、１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２３、０．４１、０．１３６および０．０４ｎｇ／ｍｌという濃度に、ＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清＋２０％ヒト血清（ＨＳ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）で希釈されるかまたはＰＢＳ／１％ＢＳＡで希釈される。これらの２つの標準物質の結合を確立した（図５）。ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（０，２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６，５）中の１００μｌの０．５μｇ／ｍｌ ＢＣＭＡ−Ｆｃ（ＥＢＣ０５１２０８１；Ｒ＆Ｄ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、３７℃において１時間、１５０μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロッキングした。ＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、１００μｌの標準物質を加えた。標準物質濃度を室温において２時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、それらのプレートに、１００μｌの抗ｈＡＰＲＩＬ．１３３モノクローナル抗体を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡに希釈された１μｇ／ｍｌの濃度で加え、３７℃において１時間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡにおいて１：１，０００希釈された１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０３１−０５）を加え、３７℃において１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０．２％で３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（ＴＭＢ）を加えることによって、結合した免疫複合体を可視化した。その反応体積に等量の１Ｍ塩酸を加えることによって、反応を停止させた。４５０ｎｍにおいてＯＤを測定することによって、結合したＡＰＲＩＬを定量した。本発明の方法を用いて得られるＡＰＲＩＬ結合ペプチドを使用するこのアッセイ形式では、ヒト血清の存在の影響は観察されない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]