特許 6725908 生分解性セルロースナノファイバーマイクロゲル、生分解性セルロースナノファイバーゲル、及び生分解性セルロースナノファイバーシートの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6725908

(24)【登録日】2020年6月30日

(45)【発行日】2020年7月22日

(54)【発明の名称】生分解性セルロースナノファイバーマイクロゲル、生分解性セルロースナノファイバーゲル、及び生分解性セルロースナノファイバーシートの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C08B 15/02 20060101AFI20200713BHJP

   C08B 1/08 20060101ALI20200713BHJP

   A61L 27/20 20060101ALI20200713BHJP

   A61K 47/38 20060101ALI20200713BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20200713BHJP

   A61K 9/70 20060101ALI20200713BHJP

   C08J 5/18 20060101ALI20200713BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20200713BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20200713BHJP

   C08L 101/16 20060101ALN20200713BHJP

【ＦＩ】

   C08B15/02ZBP

   C08B1/08

   A61L27/20

   A61K47/38

   A61K9/06

   A61K9/70

   C08J5/18CEP

   B82Y40/00

   B82Y5/00

   !C08L101/16

【請求項の数】2

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2015-95925(P2015-95925)

(22)【出願日】2015年5月8日

(65)【公開番号】特開2016-210893(P2016-210893A)

(43)【公開日】2016年12月15日

【審査請求日】2018年5月7日

(73)【特許権者】

【識別番号】304024430

【氏名又は名称】国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学

(73)【特許権者】

【識別番号】591023642

【氏名又は名称】中越パルプ工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002332

【氏名又は名称】特許業務法人綾船国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100127133

【弁理士】

【氏名又は名称】小板橋 浩之

(72)【発明者】

【氏名】松村 和明

(72)【発明者】

【氏名】田中 裕之

(72)【発明者】

【氏名】横倉 佑亮

【審査官】 阿久津 江梨子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−２３５６８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０６８０２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１５−０４８４６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−１１８５２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Carbohydrate Polymers，２０１１年，Vol.85, No.4，p.733-737

【文献】 神野 和人，セルロースナノファイバーの高機能化技術（増粘・ゲル化），ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，２０１３年，Vol.30, No.9，p.29-36

【文献】 セルロースの事典，２０００年１１月１０日，p.336-337

【文献】 原 一広，生分解性を有するカルボキシルメチルセルロースゲルの環境浄化への利用の試み，２００４年（平成１６年）春季 第５１回応用物理学関係連合講演会講演予稿集 第１分冊，２００４年，p.474，31a-YK-9

【文献】 Materials Science and Engineering C，２００９年，Vol.29, No.5，p.1635-1642

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｂ １５／０２

Ａ６１Ｋ ９／０６

Ａ６１Ｋ ９／７０

Ａ６１Ｋ ４７／３８

Ａ６１Ｌ ２７／２０

Ｂ８２Ｙ ５／００

Ｂ８２Ｙ ４０／００

Ｃ０８Ｂ １／０８

Ｃ０８Ｊ ５／１８

Ｃ０８Ｌ １０１／１６

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

セルロースナノファイバー懸濁液を、強アルカリ水溶液中へ、撹拌しながら添加して、セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液を調製する工程、
セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液を、界面活性剤を含有する流動パラフィン中へ、撹拌しながら添加した後に撹拌して、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液を調製する工程、
セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液中へ、酸と有機溶媒を添加した後に、静置して、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液を中和し、流動パラフィンを除去する工程、
ＮａＩＯ₄水溶液へ、セルロースナノファイバーマイクロゲルを浸漬して、生分解性を付与する工程、
を含む、生分解性セルロースナノファイバーマイクロゲルの製造方法。

【請求項2】

ＮａＩＯ₄水溶液へ、セルロースナノファイバーマイクロゲルを浸漬して、生分解性を付与する工程が、
ＮａＩＯ₄水溶液へ、セルロースナノファイバーマイクロゲルを浸漬して、アルデヒド含有量（アルデヒド／グルコース単位 ％）を９．０〜９５％の範囲として、生分解性を付与する工程である、請求項１に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組織工学用足場材料やドラッグデリバリーシステム用担体として使用される、生分解性セルロースナノファイバーマイクロゲル、生分解性セルロースナノファイバーゲル、及び生分解性セルロースナノファイバーシート、及びそれらの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

組織工学用足場材料やドラッグデリバリーシステム用担体などの医療用材料として、コラーゲン、ゼラチンあるいはアルブミンなどのゲルやスポンジが研究、臨床の場で用いられている。しかし、これらの材料は、水溶液からの乾燥後でも水に溶解しやすく、力学的強度に乏しく、生体内で分解が早いなどの問題があり、そのままでは組織再生が完了するまで足場として、あるいは薬物の必要な徐放期間まで体内に残存することが難しい。そこで、架橋剤による様々な架橋によって生分解を抑制して、安定化することが試みられている。

【0003】

一般的な化学的架橋剤であるグルタルアルデヒドによる架橋では容易に架橋材が得られ分解性は低く抑えることができるが、毒性が高い、石灰化が起こるといった問題点がある。例えば、特許文献１（国際公開第９４/２７６３０）は、ゼラチン水溶液にオリーブ油を加え攪拌しＷ／Ｏエマルジョンとし、グルタルアルデヒド水溶液を添加し架橋ゼラチンを得る技術が開示されている。しかし、未反応のグルタルアルデヒドを除去するためグリシン水溶液で洗浄しているものの、グルタルアルデヒドは完全には除去されていない。

【0004】

近年、セルロースによるナノファイバーが開発されて、様々な産業分野での応用が試みられるようになってきた（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開ＷＯ９４/２７６３０号公報

【特許文献2】特許第５６９０３０３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

このように、組織工学用足場材料やドラッグデリバリーシステム用担体などの医療用材料として使用可能な材料であって、グルタルアルデヒド等の化学的架橋剤を使用することなく、十分に生分解が抑制されて、組織再生の完了あるいは薬物の必要な徐放期間まで生体内で安定に存在可能な材料が、求められている。

【0007】

したがって、本発明の目的は、組織工学用足場材料やドラッグデリバリーシステム用担体などの医療用材料として使用可能な材料であって、グルタルアルデヒド等の化学的架橋剤を使用することなく、十分に生分解が抑制されて、生体内で安定に存在可能な材料を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者は、鋭意研究の結果、セルロースナノファイバー懸濁液から、マイクロゲル、ゲル、及びシートを作成し、これに対して生分解性を付与した材料によって、上記目的を達成できることを見いだして、本発明に到達した。

【0009】

したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
セルロースナノファイバー懸濁液を、強アルカリ水溶液中へ、撹拌しながら添加して、セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液を調製する工程、
セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液を、界面活性剤を含有する流動パラフィン中へ、撹拌しながら添加した後に撹拌して、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液を調製する工程、
セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液中へ、酸と有機溶媒を添加した後に、静置して、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液を中和し、流動パラフィンを除去する工程、
ＮａＩＯ₄水溶液へ、セルロースナノファイバーマイクロゲルを浸漬して、生分解性を付与する工程、
を含む、生分解性セルロースナノファイバーマイクロゲルの製造方法。
（２）
セルロースナノファイバー懸濁液中へ、強アルカリ水溶液を添加した後に、静置して、セルロースナノファイバーゲルを形成する工程、
セルロースナノファイバーゲルへ、希酸水溶液を添加した後に、静置して、セルロースナノファイバーゲルを中和する工程、
ＮａＩＯ₄水溶液へ、セルロースナノファイバーゲルを浸漬して、生分解性を付与する工程、
を含む、生分解性セルロースナノファイバーゲルの製造方法。
（３）
セルロースナノファイバー懸濁液を、ろ過膜上でろ過して、セルロースナノファイバー層を形成する工程、
セルロースナノファイバー層を、ホットプレスした後に乾燥させて、セルロースナノファイバーシートを形成する工程、
ＮａＩＯ₄水溶液へ、セルロースナノファイバーシートを浸漬して、生分解性を付与する工程、
を含む、生分解性セルロースナノファイバーシートの製造方法。
（４）
（１）に記載の方法によって製造された生分解性セルロースナノファイバーマイクロゲル。
（５）
（２）に記載の方法によって製造された生分解性セルロースナノファイバーゲル。
（６）
（３）に記載の方法によって製造された生分解性セルロースナノファイバーシート。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、組織工学用足場材料やドラッグデリバリーシステム用担体などの医療用材料として使用可能な材料であって、グルタルアルデヒド等の化学的架橋剤を使用することなく、十分に生分解が抑制されて、生体内で安定に存在可能な材料を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、ＮａＯＨ水溶液中のＣＮＦ懸濁液の外観を示す画像である。

【図2】図２は、ＣＮＦゲルの外観を示す画像である。

【図3a】図３ａは、ＣＮＦゲルの表面のＳＥＭ画像である。

【図3b】図３ｂは、ＣＮＦゲルの断面のＳＥＭ画像である。

【図4】図４は、各ＣＮＦシートの膜厚測定を示すグラフである。

【図5a】図５ａは、０．２％ＣＮＦ１０ｇシート表面のＳＥＭ画像である。

【図5b】図５ｂは、０．２％ＣＮＦ２０ｇシート表面のＳＥＭ画像である。

【図6a】図６ａは、Ｔｗｅｅｎ８０（ＮａＯＨ濃度２０ｗｔ％）によるＣＮＦマイクロゲルのＳＥＭ画像である。

【図6b】図６ｂは、Ｔｗｅｅｎ８０（ＮａＯＨ濃度３０ｗｔ％）によるＣＮＦマイクロゲルのＳＥＭ画像である。

【図7a】図７ａは、Ｓｐａｎ８０（ＮａＯＨ濃度２０ｗｔ％）によるＣＮＦマイクロゲルのＳＥＭ画像である。

【図7b】図７ｂは、Ｓｐａｎ８０（ＮａＯＨ濃度３０ｗｔ％）によるＣＮＦマイクロゲルのＳＥＭ画像である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。

【0013】

［生分解性セルロースナノファイバーマイクロゲルの製造］
本発明の生分解性セルロースナノファイバーマイクロゲルは、セルロースナノファイバー懸濁液を、強アルカリ水溶液中へ、撹拌しながら添加して、セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液を調製する工程、セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液を、界面活性剤を含有する流動パラフィン中へ、撹拌しながら添加した後に撹拌して、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液を調製する工程、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液中へ、酸と有機溶媒を添加した後に、静置して、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液を中和し、流動パラフィンを除去する工程、ＮａＩＯ₄水溶液へ、セルロースナノファイバーマイクロゲルを浸漬して、生分解性を付与する工程、を含む方法によって、製造することができる。

【0014】

［生分解性セルロースナノファイバーゲルの製造］
本発明の生分解性セルロースナノファイバーゲルは、セルロースナノファイバー懸濁液中へ、強アルカリ水溶液を添加した後に、静置して、セルロースナノファイバーゲルを形成する工程、セルロースナノファイバーゲルへ、希酸水溶液を添加した後に、静置して、セルロースナノファイバーゲルを中和する工程、ＮａＩＯ₄水溶液へ、セルロースナノファイバーゲルを浸漬して、生分解性を付与する工程、を含む方法によって、製造することができる。

【0015】

［生分解性セルロースナノファイバーシートの製造］
本発明の生分解性セルロースナノファイバーシートは、セルロースナノファイバー懸濁液を、ろ過膜上でろ過して、セルロースナノファイバー層を形成する工程、セルロースナノファイバー層を、ホットプレスした後に乾燥させて、セルロースナノファイバーシートを形成する工程、ＮａＩＯ₄水溶液へ、セルロースナノファイバーシートを浸漬して、生分解性を付与する工程、を含む方法によって、製造することができる。

【0016】

［セルロースナノファイバー］
セルロースナノファイバーは、セルロースを成分とするナノサイズのファイバーであって、例えば、特許文献２に記載の手段で製造されたセルロースナノファイバーを使用することができる。本発明において、ゲル、マイクロゲル、シートを作成可能なセルロースナノファイバーであって、生分解性を付与できるものであれば、特に制限はない。典型的には、ナノファイバーは、例えば、平均太さ５〜５０ｎｍ、平均長さ０．１〜５．０μｍのものを使用することができる。例えば、竹漂白パルプ由来、広葉樹漂白パルプ由来、針葉樹漂白パルプ由来の材料を、好適に使用することができる。市販のセルロースナノファイバーとしては、例えば、中越パルプ工業株式会社製の、ＣＮＦ−１をあげることができる。

【0017】

［セルロースナノファイバー懸濁液］
典型的にはセルロースナノファイバーは、中性の水溶液、例えば純水へ、懸濁又は分散させた、スラリー、懸濁液、又はペーストとして取り扱うことができる。懸濁液中の固形物濃度は、例えば０．０１質量％〜１０質量％、好ましくは０．０５質量％〜５質量％、０．１質量％〜２質量％の範囲とすることができる。

【0018】

［強アルカリ水溶液］
セルロースナノファイバー懸濁液（ＣＮＦ懸濁液）と混合される強アルカリ水溶液としては、例えばアルカリ金属の水酸化物の水溶液、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液をあげることができ、水酸化ナトリウム水溶液を好適に使用できる。好適な実施の態様において、ゲルの調製のためにＣＮＦ懸濁液を、例えば１〜１０Ｎ、２〜８Ｎ、３〜６Ｎの強アルカリ水溶液と混合することができる。あるいは、好適な実施の態様において、ゲルの調製のために、ＣＮＦ懸濁液を強アルカリ水溶液と、混合後に強アルカリの濃度が例えば５〜５０ｗｔ％、１０〜４０ｗｔ％、２０〜３０ｗｔ％となるように、混合することができる。

【0019】

［セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液の調製］
ＣＮＦマイクロゲルを調製する場合には、セルロースナノファイバー懸濁液（ＣＮＦ懸濁液）は、強アルカリ水溶液中へ、撹拌しながら添加して、セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液を調製する。この撹拌は、例えばマグネチックスターラー、プロペラ攪拌機によって行うことができる。

【0020】

［セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液の調製］
ＣＮＦマイクロゲルを調製する場合には、セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液を、界面活性剤を含有する流動パラフィン中へ、撹拌しながら添加した後に撹拌して、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液を調製する。この添加は、セルロースナノファイバー強アルカリ懸濁液を、界面活性剤を含有する流動パラフィン中へ、滴下して行うことができる。添加の際の撹拌は、例えばマグネチックスターラー、プロペラ攪拌機によって行うことができる。添加した後の撹拌は、例えば１〜２４時間、６〜１２時間、例えばマグネチックスターラー、プロペラ攪拌機によって行うことができる。流動パラフィンヌジョール (nujol)、ホワイト油、白色鉱油、水パラフィン、ミネラルオイル、ミネラルオイルホワイト、医療用パラフィン、パラフィンファックス、サクソール（saxol）、USPミネラルオイル、アデプシンオイル（adepsine oil）、アルボレン（Albolene）、グリモール（glymol）とも呼ばれる。流動パラフィンに代えて、同様の物性を有する化学的に不活性な水不溶性の液体を使用することも本発明の範囲内であり、このような液体として、例えばシリコンオイルをあげることができる。

【0021】

［界面活性剤］
上記流動パラフィンに含有される界面活性剤としては、オイルと水溶液を乳化させることが可能なものであれば特に制約はないが、好ましくはアトラス法によるＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｌｉｃ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ）が例えば２〜１８、４〜１６のものを使用でき、好ましくは非イオン性の界面活性剤を使用できる。使用可能な界面活性剤として、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８５、Ｓｐａｎ２０をあげることができる。流動パラフィン中に含有させる界面活性剤の濃度（重量％）は、例えば０．１〜５．０％、０．５〜２．０％とすることができる。

【0022】

［セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液の中和と流動パラフィン除去］
ＣＮＦマイクロゲルを調製する場合には、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液は、この中へ希酸水溶液と有機溶媒を添加した後に、静置して、セルロースナノファイバーマイクロゲル懸濁液を中和し、流動パラフィンを除去する。酸と有機溶媒の添加は、同時に行ってもよく、いずれかを先に添加してもよい。添加した後の静置は、中和と流動パラフィンの除去に十分な時間であればよく、例えば１〜１２時間、３〜９時間の静置とすることができる。静置した後に、上澄み液が分離するので、この分離した上澄み液を取り除いて、再び有機溶媒を添加して、静置し、上澄み液を取り除く操作を、複数回繰り返して、流動パラフィンをより完全に除去することができる。中和された後の上澄み液中に存在する塩を除去するために、水洗する工程をさらに行ってもよい。

【0023】

［酸］
上記中和に使用する酸としては、水洗除去可能な塩を生じる酸であって水溶性の酸であれば特に制限はなく、これらを酸又は酸の水溶液として使用することができる。酸としては、例えばカルボン酸、塩酸、硫酸、硝酸をあげることができる。カルボン酸として、例えば酢酸、クエン酸をあげることができる。好適な実施の態様において、酢酸を使用することができる。酸の添加量は、強アルカリの中和に必要な量から、適宜求めることができる。

【0024】

［有機溶媒］
上記パラフィン除去に使用する有機溶媒としては、水溶液との分離が可能であって本発明の成分との相溶性と反応性が低い有機溶媒であれば特に制限無く使用でき、例えばヘキサン、シクロヘキサンを使用することができる。

【0025】

［ＮａＩＯ₄水溶液への浸漬による生分解性付与］
上記得られたセルロースナノファイバーマイクロゲル（ＣＮＦマイクロゲル）は、ＮａＩＯ₄水溶液へ浸漬して、生分解性を付与することができる。ＮａＩＯ₄水溶液は、例えば０．１〜２０％、０．３〜１５％、０．５％〜１０％の濃度の水溶液を使用できる。浸漬は、例えば２０〜６０℃、３０〜６０℃、４０〜６０℃の温度で、例えば１０分〜１８０分、３０分〜９０分の時間、行うことができる。浸漬に際して、適宜撹拌又は振とうして、反応を進行させてもよい。このような浸漬によって、セルロースの構成単位が酸化変性して、ＣＮＦマイクロゲルは酸化ＣＮＦマイクロゲルとなり、ＤＭＥＭ培地等の通常の培地条件において分解性を備えたものとなるが、マイクロゲルとしての機械特性は失われずに維持されており、すなわち、生分解性だけを付与することができる。ここでいう生分解性とは、生体内と同様の条件下で分解する特性を指し、具体的には無血清培地（ＤＭＥＭ培地）中で、３７℃２４時間保持した場合に、セルロースの分解率が１％以上、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上である性質をいう。好適な実施の態様において、酸化ＣＮＦゲルのアルデヒド含有量（アルデヒド／グルコース単位 ％）を、例えば５〜９５％、１０％〜８０％とすることができる。好適な実施の態様において、付加された生分解性は、ＤＭＥＭ培地で３７℃２４時間保持した場合のセルロースの分解率が、例えば１０％以上、１４％以上、３９％以上、６８％以上、７５％以上とすることができる。

【0026】

［セルロースナノファイバーゲルの調製］
セルロースナノファイバーゲル（ＣＮＦゲル）を調製する場合には、セルロースナノファイバー懸濁液中へ、強アルカリ水溶液を添加した後に、静置して、セルロースナノファイバーゲルを形成する。撹拌することなく静置する点で、ＣＮＦマイクロゲルを調製する場合とは異なる。好適な実施の態様において、静置に先立つ強アルカリ水溶液の添加は、ＣＮＦ懸濁液の形状が所望のゲルの形状となるように、注意深くゆっくりと行う。静置は、例えば１〜２４時間、６〜１２時間行うことができる。ＣＮＦ懸濁液中へ添加する強アルカリ水溶液としては、ＣＮＦ懸濁液と混合する強アルカリ水溶液として上記した強アルカリ水溶液を使用することができる。

【0027】

［セルロースナノファイバーゲルの中和］
強アルカリ水溶液の添加によって形成されたＣＮＦゲルは、希酸水溶液を添加した後に、静置して、中和する。希酸水溶液の添加後の静置は、例えば１〜１２時間、３〜９時間の静置とすることができる。希酸水溶液での静置中和後に、ＣＮＦゲルを水洗する工程を行ってもよい。水洗としては、例えば流水で２〜２４時間洗う操作をあげることができる。

【0028】

［希酸水溶液］
上記ＣＮＦゲルの中和に使用する希酸水溶液としては、ＣＮＦマイクロゲル懸濁液の中和に使用する酸として記載した酸を希釈した水溶液を、使用することができる。酸の濃度として、例えば０．１〜１０重量％、２〜８重量％の濃度を使用することができる。

【0029】

［ＮａＩＯ₄水溶液への浸漬による生分解性付与］
上記得られたセルロースナノファイバーゲル（ＣＮＦゲル）は、セルロースナノファイバーマイクロゲル（ＣＮＦマイクロゲル）について上述した手順と同様の手順で、ＮａＩＯ₄水溶液へ浸漬して、生分解性を付与することができる。

【0030】

［セルロースナノファイバー層の形成］
セルロースナノファイバーシート（ＣＮＦシート）を調製する場合には、いったん、セルロースナノファイバー懸濁液を、ろ過膜上でろ過して、セルロースナノファイバー層を形成する。ろ過膜は、セルロースナノファイバー懸濁液のうち、セルロースナノファイバーが透過されることなくろ過膜上に残って濃縮されつつ、懸濁液の液体が透過可能なろ過膜であれば使用することができる。このようなろ過膜として、例えばポアサイズが０．１〜５．０μｍ、好ましくは０．１〜１．０μｍであるろ過膜をあげることができる。ろ過は、例えば吸引ろ過を好適に使用できる。

【0031】

［セルロースナノファイバーシートの形成］
ＣＮＦシートを調製する場合には、上記セルロースナノファイバー層（ＣＮＦ層）を、ホットプレスした後に乾燥させて、セルロースナノファイバーシートを形成する。ホットプレスに先だって、ＣＮＦ層に残る水分をろ紙などで除去してもよい。ホットプレスとしては、例えば金型で挟んで、例えば１〜８時間、２〜６時間の間、例えば４０℃〜８０℃、５０℃〜７０℃の温度で、例えば２〜２０ＭＰａ、８〜１６ＭＰａの圧力で、ホットプレスすることができる。その後の乾燥は、公知の手段によって行うことができる。

【0032】

［ＮａＩＯ₄水溶液への浸漬による生分解性付与］
上記得られたＣＮＦシートは、セルロースナノファイバーマイクロゲル（ＣＮＦマイクロゲル）について上述した手順と同様の手順で、ＮａＩＯ₄水溶液へ浸漬して、生分解性を付与することができる。

【0033】

［生分解性のＣＮＦマイクロゲル、ＣＮＦゲル、ＣＮＦシート］
本発明による、生分解性のＣＮＦマイクロゲル、ＣＮＦゲル、ＣＮＦシートは、植物由来のセルロースを使用した材料であるために、環境負荷や安全性の観点で安心でありながら、合成高分子由来の材料以上に制御された物性を有している。さらに、セルロースを使用した材料でありながら、生分解性を有しているために、従来はセルロースの使用が想定されていなかった組織工学用足場材料やドラッグデリバリーシステム用担体などの医療用材料として使用可能である。加えて、従来の医療用材料と対比した場合に、グルタルアルデヒド等の化学的架橋剤を使用することなく、十分に生分解が抑制されていて、組織再生の完了あるいは薬物の必要な徐放期間まで生体内で安定に存在可能である点で優れている。

【実施例】

【0034】

以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、特にことわりのない限り「％」及び「部」はそれぞれ重量％及び重量部を示す。また、特にことわりのない限り実験操作は室温において行った。

【0035】

［実施例１］
［ＣＮＦハイドロゲルの調製］
セルロースナノファイバー懸濁液（中越パルプ工業製：ＣｅＮＦ−１）（固形分濃度１重量％）１０ｇをビーカーに入れた。次に、５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム（４０ｇ）を懸濁液の形が変形しないようにビーカーの中に注意深く、ゆっくりと注ぎ、１２時間静置した。その後、４％希酢酸を加え６時間静置した後、流水で１２時間洗うことによりＣＮＦゲルを作製した。これらの操作は室温で行った。

【0036】

［ＣＮＦハイドロゲルの評価］
作製したＣＮＦゲルはＳＥＭで表面と断面の構造を観察した。
ＮａＯＨ水溶液中のＣＮＦ（セルロースナノファイバー）懸濁液を図１に示す。作製したＣＮＦ（セルロースナノファイバー）ゲルを図２に示す。また、ＣＮＦゲルの表面と断面のＳＥＭ画像を図３ａ及び図３ｂに示す。ＣＮＦゲル表面は多孔質であり、ナノからマイクロのポアサイズのものが数多く見られた（図３ａ）。ＣＮＦゲル断面は多層構造であった（図３ｂ）。

【0037】

［実施例２］
［ＣＮＦシートの調製］
セルロースナノファイバー懸濁液（中越パルプ工業製：ＣｅＮＦ−１）１０ｇを、固形分濃度０．２％に希釈撹拌したものを出発材料として、これに対して、メンブレンフィルター（ミリポア製、製品名オムニポアメンブレンフィルター、ポアサイズ１．０μｍ）を用いて吸引濾過を行った。次に、濃縮シートの非吸引面をテフロンシートに押し当て、もう片面にメンブレンフィルターの上から濾紙を３枚程度重ねた。次に、金型で挟み３〜４時間ホットプレス（６０℃、１０〜１５ＭＰａ）を行い、その後乾燥器で乾燥させて、ＣＮＦシートを得た（０．２％ＣＮＦ１０ｇシート）。
出発材料として、上記のようにＣＮＦ（セルロースナノファイバー）懸濁液１０ｇを０．２％に希釈したものを使用した（通常作製）ＣＮＦシート（０．２％ＣＮＦ１０ｇシート）に加えて、ＣＮＦ懸濁液１０ｇを希釈することなく１％のままで使用したＣＮＦシート（１％ＣＮＦ１０ｇシート）、ＣＮＦ懸濁液２０ｇを０．２％に希釈したものを使用した（作製量２倍）ＣＮＦシート（０．２％ＣＮＦ２０ｇシート）を、それぞれ作製して、この３つのサンプルに対して、膜厚を計測し、ＳＥＭで観察した。

【0038】

［ＣＮＦシートの評価］
各ＣＮＦシートの膜厚測定の結果を図４に示す。膜厚測定はシートのランダムな場所において１０回測定した。結果より、ＣＮＦ量を増加させるとそれに伴い膜厚も増加していることがわかった。また、０．２％に希釈したもの（０．２％ＣＮＦ１０ｇシート）と希釈していないもの（１％ＣＮＦ１０ｇシート）を比較すると、希釈していないものの方は膜厚が高かったが、エラーバーにも表れているように厚さの均一さにやや劣るシートとなっていた。したがって、希釈して用いた方が厚さの均一なシートを作製できることがわかった。

【0039】

次に、通常作製のもの（０．２％ＣＮＦ１０ｇシート）と作製量２倍のもの（０．２％ＣＮＦ２０ｇシート）とのＳＥＭ画像を図５ａ及び図５ｂに示す。２つを比較すると、通常作製のもの（０．２％ＣＮＦ２０ｇシート）は、多孔質であり数多くのクラックが観察された（図５ａ）。作製量２倍のもの（０．２％ＣＮＦ２０ｇシート）は、少し凹凸が観察されたが通常作製と比べると滑らかな表面をしており、クラックもほとんど観察されなかった（図５ｂ）。これより、使用するＣＮＦの絶対量を増加させると表面が滑らかなシートができることがわかった。

【0040】

［実施例３］
［ＣＮＦマイクロゲルの調製］
ＣＮＦ懸濁液を２．０ｇ入れたときにＮａＯＨ水溶液のＮａＯＨ濃度が２０ｗｔ％又は３０ｗｔ％になるように各ＮａＯＨ水溶液を調製し、１％ＣＮＦ懸濁液（中越パルプ工業製：ＣｅＮＦ−１）を２．０ｇ入れ、撹拌した。次に、１００ｍＬビーカーに界面活性剤１．０％含有の流動パラフィンを３０ｍＬ入れ、撹拌しながらＣＮＦ懸濁液とＮａＯＨ水溶液の混合溶液をピペットで４ｍＬ入れ、１２時間撹拌させた。次に、サンプルチューブに混合溶液を入れた後、ヘキサンと数滴の酢酸を加え混合し、６時間静置した。その後、分離した上澄みを取り除き、再びヘキサンを加えて上澄みを取り除くことによって複数回洗浄して、流動パラフィンを除去した。次に、ＮａＯＨと酢酸ナトリウムを取り除くために蒸留水を加え、何回か洗浄を行って、ＣＮＦマイクロゲルを分離した。
上記の界面活性剤として、ＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｌｉｃ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ）の異なるＴｗｅｅｎ８０（ＨＢＬ：１５．０）とＳｐａｎ ８０（ＨＢＬ：４．３）を用いて実験を行った。
分離したＣＮＦマイクロゲルをガラスプレート上に薄くのばし、凍結乾燥させたものをＳＥＭで観察した。

【0041】

［ＣＮＦマイクロゲルの評価］
Ｔｗｅｅｎ８０で作製したＣＮＦマイクロゲルのＳＥＭ画像を図６ａ及び図６ｂに示す。ＮａＯＨ濃度２０ｗｔ％は、きれいな粒子状のものが見られ、数マイクロから数十マイクロ程度の粒子サイズのものが確認できた（図６ａ）。ＮａＯＨ濃度３０ｗｔ％は、２０ｗｔ％よりは粒子サイズが数多く確認できたものの歪んだ粒子状のものが多かった（図６ｂ）。

【0042】

次に、Ｓｐａｎ ８０で作製したＣＮＦマイクロゲルのＳＥＭ画像を図７ａ及び図７ｂに示す。ＮａＯＨ濃度２０ｗｔ％は、粒子数が少なく、きれいな粒子状のものがあまり見られなかった。粒子サイズは数マイクロから数十マイクロ程度であった（図７ａ）。ＮａＯＨ濃度３０ｗｔ％は、２０ｗｔ％より粒子数が数多く確認できた。粒子サイズは２０ｗｔ％と同じくらいであった（図７ｂ）。

【0043】

これらのマイクロゲルの入った溶液を目視観察すると、Ｓｐａｎ ８０で作製したＣＮＦマイクロゲルの溶液は、液状というよりはややゲル状塊と思える部分も生じていたが、それは軽く振ると崩れる程度であった。Ｔｗｅｅｎ８０で作製したＣＮＦマイクロゲルの溶液は、ほとんど液状と見える状態であった。

【0044】

このように、界面活性剤にＴｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ ８０を使用した場合、ＮａＯＨ濃度が２０ｗｔ％、３０ｗｔ％ともにマイクロ粒子が確認でき、ＣＮＦマイクロゲルを生成できることがわかった。

【0045】

［実施例４］
［ＣＮＦゲルのマラプラード反応処理］
２０ｍＬ蒸留水に対して、１％、５％、１０％、１５％のＮａＩＯ₄溶液を調製し、そこへ上記実施例１で作製したＣＮＦハイドロゲル（直径１ｃｍ）を入れ、５０℃、１時間撹拌し反応させた。反応後、ＣＮＦゲルを蒸留水で２４時間洗浄し、その後、乾燥器で乾燥させた。乾燥後、ヨウ素滴定法を用いてアルデヒド含有量を定量した。

【0046】

［酸化ＣＮＦゲルのアルデヒド含有量の評価］
各ＮａＩＯ₄濃度における酸化ＣＮＦゲルのアルデヒド含有量の結果を次の表１に示す。

【0047】

【表1】

【0048】

上記の実験結果より、酸化剤の濃度の増加とともにグルコース１残基当たりのアルデヒド含有率が増加していることがわかった。これは、酸化されたアルデヒドセルロースを用いて行った実験と同様な結果が得られた。

【0049】

［実施例５］
［酸化ＣＮＦゲルの培地中での分解］
１０ｍＬ蒸留水に対して、０％、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％ＮａＩＯ₄溶液を調製し、そこへ上記実施例１で作製したＣＮＦゲル（直径１ｃｍ）を入れ、５０℃、１時間撹拌し反応させた。反応後、ＣＮＦゲルを蒸留水で２４時間洗浄した。次に、無血清培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）中に入れて２４時間撹拌させた。反応後、ＤＭＥＭをメンブレンフィルターを使い濾過し、これを乾燥させることにより、乾燥させたメンブレンフィルターの重さから溶け残ったセルロース量を求めた。

【0050】

［酸化ＣＮＦゲルの分解率の評価］
各ＮａＩＯ₄濃度で酸化されたＣＮＦゲルをＤＭＥＭ中で２４時間撹拌させた時に溶け残ったセルロース量とそこから算出した分解率の結果を表２に示す。

【0051】

【表2】

【0052】

この結果から、マラプラード反応後のＣＮＦゲルはＤＭＥＭ中で分解されることがわかった。また、マラプラード反応の酸化剤濃度増加と共に分解率が上昇しており、ＣＮＦゲルの分解率は酸化剤濃度によって変化することがわかった。
表１、表２の結果からＣＮＦゲルのアルデヒド含有量が増大するほどＤＭＥＭでの分解率が増大することがわかった。

【産業上の利用可能性】

【0053】

本発明によれば、組織工学用足場材料やドラッグデリバリーシステム用担体などの医療用材料として使用可能な材料であって、グルタルアルデヒド等の化学的架橋剤を使用することなく、十分に生分解が抑制されて、生体内で安定に存在可能な材料を得ることができる。本発明は産業上有用な発明である。

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図6a】

【図6b】

【図7a】

【図7b】