特許 6727596 カルバリゾホスファチジン酸

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6727596

(24)【登録日】2020年7月3日

(45)【発行日】2020年7月22日

(54)【発明の名称】カルバリゾホスファチジン酸

(51)【国際特許分類】

   C07F 9/38 20060101AFI20200713BHJP

   A61K 31/662 20060101ALI20200713BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200713BHJP

【ＦＩ】

   C07F9/38 B

   A61K31/662

   A61P43/00 111

   A61P43/00 105

【請求項の数】6

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2019-211367(P2019-211367)

(22)【出願日】2019年11月22日

【審査請求日】2020年4月30日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】305013910

【氏名又は名称】国立大学法人お茶の水女子大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】室伏 きみ子

(72)【発明者】

【氏名】後藤 真里

(72)【発明者】

【氏名】深澤 桂子

(72)【発明者】

【氏名】青木 淳賢

【審査官】 高森 ひとみ

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−２１１９２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１８−８０１１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 後藤真里 ほか，環状ホスファチジン酸の生理活性，生化学，２０１８年，Vol.90，No.6，pp.757-765

【文献】 MUKAI, M. et al.，Inhibition of tumor invasion and metastasis by a novel lysophosphatidic acid(cyclic LPA)，Int. J. Cancer，１９９９年，Vol.81，pp.918-922

【文献】 ENDO, T. et al.，Lysophosphatidylmethanol is a pan lysophosphatidic acid receptor agonist and is produced by autotaxin in blood，J. Biochem.，２００９年，Vol.146, No.2，pp.283-293

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｆ ９／３８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（１）で示される化合物。

【化1】

（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｍは、水素原子又は対カチオンである。）

【請求項2】

Ｒが、炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、又は炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

−ＣＯ−Ｒが、パルミトイル基又はオレオイル基である、請求項１又は２に記載の化合物。

【請求項4】

請求項１から３の何れか一項に記載の化合物を含む、オートタキシン阻害剤。

【請求項5】

請求項１から３の何れか一項に記載の化合物を含む、ＬＰＡ受容体活性化剤。

【請求項6】

請求項１から３の何れか一項に記載の化合物を含む、ＥＲＫリン酸化剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オートタキシン阻害活性、ＬＰＡ受容体活性化作用、及びＥＲＫリン酸化作用を有するカルバリゾホスファチジン酸に関する。

【背景技術】

【0002】

1992年に、真性粘菌Physarum polycephalumの単相体ミクソアメーバから、真核細胞のDNA複製酵素であるDNAポリメラーゼαの活性を抑え、動物培養細胞の増殖を抑制する脂溶性物質が見いだされ、単離・精製された（非特許文献１）。この物質はグリセロール骨格のsn-1位にシクロプロパンを含むヘキサデカン酸が結合し、2位と3位にリン酸が環状エステル結合した物質であることがわかり、Physarum由来のLPA様物質であることから、PHYLPAと命名された。PHYLPAがsn-1位に特徴的な脂肪酸を有することから、一般的な脂肪酸に置換した誘導体を化学合成し、その活性を検討した結果、細胞増殖を抑制することが示され、PHYLPAの増殖抑制作用が、2位と3位の環状リン酸基によることが明らかになった。現在では、このような環状リン酸基を持つLPA類似体を総称して、環状ホスファチジン酸（cPA、cyclic phosphatidic acid）と呼んでいる。

【0003】

【化1】

【0004】

環状ホスファチジン酸及びその誘導体については、神経栄養因子作用と神経変性疾患への適用（特許文献１及び２）、癌細胞の増殖と浸潤・転移の抑制（特許文献３）、鎮痛作用（特許文献４）、アトピー性皮膚炎への適用（特許文献５）、神経軸索の脱髄抑制作用（特許文献６）などについての報告がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００２−３０８７７８号公報

【特許文献2】特開２００２−３０８７７９号公報

【特許文献3】国際公開ＷＯ２００２／９４２８６号公報

【特許文献4】国際公開ＷＯ２００８／８１５８０号公報

【特許文献5】特開２０１２−５６８５３号公報

【特許文献6】国際公開ＷＯ２０１４／１１５８８５号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Murakami-Murofushi,K.,他, J.Biol.Chem. 267,21512-21517 (1992)

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、環状ホスファチジン酸誘導体であるカルバ環状ホスファチジン酸の新規な類縁体を同定し、その生理活性を明らかにすることを解決すべき課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、カルバ環状ホスファチジン酸の新規な類縁体であるカルバリゾホスファチジン酸を発見及び同定した。本発明者らはさらに、上記カルバリゾホスファチジン酸が、オートタキシン阻害活性、ＬＰＡ受容体活性化作用、及びＥＲＫリン酸化作用を有することを実証した。本発明は上記の知見に基づいて完成したものである。

【0009】

すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ 下記式（１）で示される化合物。

【化2】

（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｍは、水素原子又は対カチオンである。）
＜２＞ Ｒが、炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、又は炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基である、＜１＞に記載の化合物。
＜３＞ −ＣＯ−Ｒが、パルミトイル基又はオレオイル基である、＜１＞又は＜２＞に記載の化合物。
＜４＞ ＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の化合物を含む、オートタキシン阻害剤。
＜５＞ ＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の化合物を含む、ＬＰＡ受容体活性化剤。
＜６＞ ＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の化合物を含む、ＥＲＫリン酸化剤。

【0010】

本発明によればさらに、式（１）で示される化合物を、対象（被験者）に投与することを含む、オートタキシンを阻害する方法が提供される。
本発明によればさらに、式（１）で示される化合物を、対象（被験者）に投与することを含む、ＬＰＡ受容体を活性化する方法が提供される。
本発明によればさらに、式（１）で示される化合物を、対象（被験者）に投与することを含む、ＥＲＫをリン酸化する方法が提供される。

【0011】

本発明によればさらに、オートタキシンの阻害において使用するための、式（１）で示される化合物が提供される。
本発明によればさらに、ＬＰＡ受容体の活性化において使用するための、式（１）で示される化合物が提供される。
本発明によればさらに、ＥＲＫのリン酸化において使用するための、式（１）で示される化合物が提供される。

【0012】

本発明によればさらに、オートタキシン阻害剤の製造のための、式（１）で示される化合物の使用が提供される。
本発明によればさらに、ＬＰＡ受容体活性化剤の製造のための、式（１）で示される化合物の使用が提供される。
本発明によればさらに、ＥＲＫリン酸化剤の製造のための、式（１）で示される化合物の使用が提供される。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、新規なカルバリゾホスファチジン酸が提供される。本発明のカルバリゾホスファチジン酸は、オートタキシン阻害活性、ＬＰＡ受容体活性化作用、及びＥＲＫリン酸化作用を有する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、ＴＬＣを用いた２ｃａｒｂａＬＰＡの新規スポットの同定を示す。

【図2】図２は、化合物の質量分析の結果を示す。

【図3】図３は、化合物の質量分析の結果を示す。

【図4】図４は、化合物の質量分析の結果を示す。

【図5】図５は、２ｃａｒｂａＬＰＡをａｕｔｏｔａｘｉｎ（ＡＴＸ）を用いて合成した結果を示す。

【図6】図６は、質量分析装置を用いて２ｃａｒｂａＬＰＡによるＡＴＸ活性阻害を測定した結果を示す。

【図7】図７は、ＬＰＣを基質としたＡＴＸによるＬＰＡ合成活性が２ｃａｒｂａＬＰＡにより阻害されることを測定した結果を示す。

【図8】図８は、２ｃａｒｂａＬＰＡのＥＲＫリン酸化作用を測定した結果を示す。

【図9】図９は、２ｃａｒｂａＬＰＡのラット体内での産生を測定した結果を示す。

【図10】図１０は、２ｃｃＰＡ及び２ｃａｒｂａＬＰＡについて、human ＬＰＡ_１に対するアゴニスト活性を測定して結果を示す。

【図11】図１１は、２ｃｃＰＡ及び２ｃａｒｂａＬＰＡについて、human ＬＰＡ_２に対するアゴニスト活性を測定して結果を示す。

【図12】図１２は、２ｃａｒｂａＬＰＡについて、human ＬＰＡ_３に対するアゴニスト活性を測定して結果を示す。

【図13】図１３は、２ｃａｒｂａＬＰＡについて、human ＬＰＡ_４に対するアゴニスト活性を測定して結果を示す。

【図14】図１４は、２ｃｃＰＡ及び２ｃａｒｂａＬＰＡについて、human ＬＰＡ_５に対するアゴニスト活性を測定して結果を示す。

【図15】図１５は、２ｃｃＰＡ及び２ｃａｒｂａＬＰＡについて、human ＬＰＡ_６に対するアゴニスト活性を測定して結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明について更に具体的に説明する。
本発明は、下記式（１）で示される化合物に関する。

【化3】

（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｍは、水素原子又は対カチオンである。）

【0016】

式（１）において、置換基Ｒが示す炭素数1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基などが挙げられる。

【0017】

置換基Ｒが示す炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基の具体例としては、例えば、アリル基、ブテニル基、オクテニル基、デセニル基、ドデカジエニル基、ヘキサデカトリエニル基などが挙げられ、より具体的には、８−デセニル基、８−ウンデセニル基、８−ドデセニル基、８−トリデセニル基、８−テトラデセニル基、８−ペンタデセニル基、８−ヘキサデセニル基、８−ヘプタデセニル基、８−オクタデセニル基、８−イコセニル基、８−ドコセニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジエニル基、ヘプタデカ−８，１１，１４−トリエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３−テトラエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３，１６−ペンタエニル基、ヘニコサ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサエニル基などが挙げられる。

【0018】

置換基Ｒが示す炭素数2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基の具体例としては、例えば、８−デシニル基、８−ウンデシニル基、８−ドデシニル基、８−トリデシニル基、８−テトラデシニル基、８−ペンタデシニル基、８−ヘキサデシニル基、８−ヘプタデシニル基、８−オクタデシニル基、８−イコシニル基、８−ドコシニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジイニル基などが挙げられる。

【0019】

上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうるシクロアルカン環の具体例としては、例えば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロオクタン環などが挙げられる。シクロアルカン環は、1個以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、そのような例としては、例えば、オキシラン環、オキセタン環、テトラヒドロフラン環、Ｎ−メチルプロリジン環などが挙げられる。

【0020】

上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうる芳香環の具体例としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環、フラン環、チオフェン環などが挙げられる。

【0021】

従って、置換基Ｒがシクロアルカン環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、例えば、シクロプロピルメチル基、シクロヘキシルエチル基、８，９−メタノペンタデシル基などが挙げられる。

【0022】

置換基Ｒが芳香環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、ベンジ
ル基、フェネチル基、ｐ−ペンチルフェニルオクチル基などが挙げられる。

【0023】

Ｒは、好ましくは、炭素数９〜１７の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数９〜１７の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数９〜１７の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基である。Ｒは、さらに好ましくは、炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、又は炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基である。Ｒは、特に好ましくは、炭素数９、１１、１３、１５又は１７の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基である。

【0024】

特に好ましくは、式（１）において、−ＣＯ−Ｒは、パルミトイル基又はオレオイル基である。

【0025】

式（１）におけるＭは、水素原子又は対カチオンである。Ｍが対カチオンである場合の例としては、例えば、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換若しくは無置換アンモニウム基が挙げられる。アルカリ金属原子としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどが挙げられ、アルカリ土類金属原子としては、例えば、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。置換アンモニウム基としては、例えば、ブチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、テトラメチルアンモニウム基などが挙げられる。

【0026】

式（１）で示される化合物はその置換基の種類に応じて、位置異性体、幾何異性体、互変異性体、又は光学異性体のような異性体が存在する場合があるが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内のものである。

【0027】

式（１）で示される化合物は、水あるいは各種溶媒との付加物（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の範囲内のものである。さらに、式（１）で示される化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の範囲内のものである。

【0028】

式(１)で示される化合物は、例えば、後記の実施例１又は実施例２に記載の方法に準じて製造することができる。

【0029】

具体的には、下記構造：

【化4】

（式中、Ｒ及びＭは、式（１）における定義と同義である）
を有するカルバ環状ホスファチジン酸誘導体を、適当なバッファー（リン酸バッファーなど）に溶解した溶液を、人工胃液（例えば、塩化ナトリウム水溶液（２ｇ ＮａＣｌ，１２Ｍ ＨＣｌ ７ ｍＬ／１０００ｍＬ水，ｐＨ１．２））で希釈する。上記で得られた溶液をインキュベートすることにより、式(１)で示される化合物を製造することができる。

【0030】

あるいは、式(１)で示される化合物は、ａｕｔｏｔａｘｉｎ（ＡＴＸ）を用いて製造することができる。ＡＴＸと、上記構造を有するカルバ環状ホスファチジン酸誘導体を適当な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液など）に所定の濃度になるように溶解する。得られた溶液を３７℃でインキュベートして反応させることにより、式(１)で示される化合物を製造することができる。

【0031】

本発明の式(１)で示される化合物は、オートタキシン阻害剤、ＬＰＡ受容体活性化剤、又はＥＲＫリン酸化剤として使用することができる。

【0032】

オートタキシン（ＡＴＸ）は、リン脂質代謝酵素であり、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を分解し、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を産生する。
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、シグナル伝達にかかわる脂質メディエーターの一つであり，ＬＰＡ受容体（６種類のＧタンパク質共役型受容体）に結合する。
ＥＲＫ（Extracellular Signal-regulated Kinase）は、ＥＧＦ、血清刺激、酸化ストレスなどによって活性化されるＭＡＰＫのサブファミリーである。上皮増殖促進因子受容体 （ＥＧＦＲ） などの受容体にリガンドが結合することによりシグナルが流れ、その結果としてＥＲＫの活性化ループに存在するＴＥＹモチーフがリン酸化されて活性化する。

【0033】

本発明によるオートタキシン阻害剤、ＬＰＡ受容体活性化剤、又はＥＲＫリン酸化剤は、有効成分である式(１)で示される化合物と、１又は２以上の製剤学的に許容される製剤用添加物とを含む、試薬組成物又は医薬組成物の形態で提供されてもよい。

【0034】

本発明のオートタキシン阻害剤、ＬＰＡ受容体活性化剤、又はＥＲＫリン酸化剤は、種々の形態で投与することができるが、好適な投与形態としては、経口投与でも非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与など）でもよい。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明のオートタキシン阻害剤、ＬＰＡ受容体活性化剤、又はＥＲＫリン酸化剤の剤形はこれらに限定されることはない。さらに、公知の技術によって持続性製剤とすることもできる。例えば、ゼラチンを基剤としたハイドロゲル中に、有効成分である本発明の化合物を封入することによって、徐放性製剤とすることができる。

【0035】

本発明のオートタキシン阻害剤、ＬＰＡ受容体活性化剤、又はＥＲＫリン酸化剤の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、pH調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。

【0036】

経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、D-マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。

【0037】

注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、界面活性剤等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン,等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のpH調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。

【0038】

本発明のオートタキシン阻害剤、ＬＰＡ受容体活性化剤、又はＥＲＫリン酸化剤はヒトなどの哺乳動物に投与することができる。
本発明のオートタキシン阻害剤、ＬＰＡ受容体活性化剤、又はＥＲＫリン酸化剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたりの有効成分の量として１μg／ｋｇから１，０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。上記投与量の薬剤は一日一回に投与してもよいし、数回（例えば、２〜４回程度）に分けて投与してもよい。

【0039】

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。

【実施例】

【0040】

実施例１：２ｃａｒｂａＬＰＡの同定
（１）ＴＬＣを用いた新規スポットの発見
以下の構造を有する２ｃｃＰＡを使用した。

【化5】

【0041】

２ｃｃＰＡ（５ｍｇ）を１ｍＬのリン酸バッファーに溶解した後、２ｃｃＰＡ／ＰＢＳ溶液を第十七改正日本薬局方に記載されている人工胃液（塩化ナトリウム水溶液（２ｇ ＮａＣｌ，１２Ｍ ＨＣｌ ７ ｍＬ／１０００ｍＬ水，ｐＨ１．２））で最終濃度が１ ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。その後、この溶液を３７℃にし、１０，３０，６０分間インキュベートした。反応後の溶液を薄層クロマトグラフィープレート（ＴＬＣ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ ｐｌａｔｅ，（Ｍｅｒｃｋ））上に展開溶媒（クロロホルム／メタノール／水＝６０：３０：４（ｖ／ｖ／ｖ））を用いて展開させた。分離後のプレートは、酢酸銅−リン酸試薬（３％ 酢酸銅（ＩＩ）一水和物（ｗ／ｖ）、8％リン酸（ｖ／ｖ）、２％硫酸（ｖ／ｖ））を噴霧し、１５０℃で5分熱することで、化合物のスポットを可視化した（図１）。各スポットのシグナル強度はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）で測定し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ，ｖｅｒｓｉｏｎ８．１（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて定量した（図１内の数値）。その結果、２ｃｃＰＡのスポット（Ｒｆ値＝約０．３５）よりもＲｆ値が低下した位置（Ｒｆ値＝約０．２９）に新しいスポットが現れることが確認された。また、このスポットのシグナル強度は、インキュベート時間経過とともに増加することが示された。

【0042】

そこで、新しく得られたＲｆ値＝約０．２９のスポットの化合物の同定を質量分析装置Ｓｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ４６００ （ＱｑＴＯＦ）を用いて行うために、新規スポットの化合物の精製を行った。

【0043】

（２）新規スポットの精製
２ｃｃＰＡ（１０ｍｇ）を２ｍＬの上記人工胃液（塩化ナトリウム水溶液（２ｇ ＮａＣｌ，１２Ｍ ＨＣｌ ７ｍＬ／１０００ｍＬ水，ｐＨ１．２））に溶解した。その後、この溶液を３７℃にし、２時間後に８ｍＬクロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）を加えた。溶液を懸濁した後、遠心（1500ｇ×5分）により溶液を二層に分離させ下層を分取した。得られたクロロホルム含有下層溶液を薄層クロマトグラフィープレート上に展開溶媒（クロロホルム：メタノール：水＝６０：３０：４（ｖ／ｖ／ｖ））を用いて展開させた。その後、新規スポットが展開された部分のシリカゲルをかき取り、８ｍＬクロロホルム：メタノール（１：９、ｖ／ｖ）溶液に懸濁し、超音波処理をウォーターバスの中で３分間行い、遠心（1500ｇ×10分）し、上清を回収した。この作業を３回繰り返した。回収した上清を窒素乾固し、メタノール1ｍＬに溶解後、フィルターろ過（０．２μｍ Ｃａｐｔｉｖａ Ｐｒｅｍｉｕｍ ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ，アジレントテクノロジー）した。ろ液を窒素乾固し、約4.2ｍｇのＲｆ値約０．２９の化合物を得た。

【0044】

前述の薄層クロマトグラフィーにおける新規スポットの位置の同定は、溶液を薄層クロマトグラフィープレートに展開後、プレートの一部を切り落とし、切り落としたプレートに酢酸銅−リン酸試薬（３％酢酸銅（ＩＩ）一水和物（ｗ／ｖ）、8％リン酸（ｖ／ｖ）、２％硫酸（ｖ／ｖ））を噴霧し、１５０℃で5分熱することで、可視化し行った。

【0045】

（３）Ｓｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ４６００（ＱｑＴＯＦ）を用いた化合物の質量分析
（２）で得られた化合物（約4.2ｍｇ）を10ｍＬのメタノールに懸濁し、溶液を５ｍＭギ酸アンモニウム含有メタノール／水（９５：５，ｖ／ｖ）にて１００倍希釈しＳｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ４６００（ＱｑＴＯＦ）質量分析装置のサンプルとした（測定条件は下表に記す）。５０−５００ｍ／ｚでフルイオンスキャンを行った結果、４３３．２７６０に分子イオンピークを得た（図２）。次に、この分子イオンをコリジョンエナジー（−３０又は−７５ｅＶ）でフラグメント化し、得られるフラグメントイオンの質量測定を行った。その結果、コリジョンエナジーが−３０ｅＶでは、１４９．００１２，１５１．０１７４，１６９．０２７４，２８１．２４９４のフラグメントイオンが得られ（図３）、コリジョンエナジーが−７５ｅＶでは、７８．９６０２，１２１．００６４のフラグメントイオンも得られた（図４）。それぞれの分子量から想定される構造式を図中に示す（図２から図４）。これらの結果から、新規に現れたスポットの分子量は４３３．３の２ｃｃＰＡが加水分解してできる化合物であることが示され、２ｃａｒｂａＬＰＡと名付けた。

【0046】

【表1】

【0047】

実施例２：２ｃａｒｂａＬＰＡのａｕｔｏｔａｘｉｎ（ＡＴＸ）を用いた合成法
ＡＴＸ（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＭＩ） と２ｃｃＰＡをＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ_２，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）４０μＬにそれぞれ終濃度５０ｎＭ，１０μＭになるように溶解した。その後、３７℃で０，２，４時間反応させた。反応後の溶液に１６０ μＬの酸性メタノール（ｐＨ４．０）を添加し、よく懸濁した。その後、溶液をフィルターろ過（０．２μｍ Ｃａｐｔｉｖａ Ｐｒｅｍｉｕｍ ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）し、ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ／ｌｉｎｅａｒ ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＳＣＩＥＸ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）のサンプルとした。測定は論文（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ １０７６ （２０１８）１５−２１，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｃａｒｂａ ａｎａｌｏｇ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｏｒｇａｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ）と同様に行い、２ｃｃＰＡはＱ１／Ｑ３＝４１５．２６／２８１．２５、２ｃａｒｂａＬＰＡはＱ１／Ｑ３＝４３３．２７／１５１．０２で測定を行った。結果、ＡＴＸと反応させた溶液では時間依存的に２ｃｃＰＡ量が減少し（図５（Ａ））、２ｃａｒｂａＬＰＡが合成されてくることが示された（図５（Ｂ））。

【0048】

実施例３：２ｃａｒｂａＬＰＡのＡＴＸ活性阻害
（１）質量分析装置を用いたＡＴＸ活性測定
ＡＴＸとＬＰＣ１６：０をそれぞれ終濃度５０ｎＭ，１０μＭになるように、２ｃｃＰＡあるいは２ｃａｒｂａＬＰＡは終濃度１０μＭになるように、Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ_２，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）４０μＬに懸濁した。その後３７℃でインキュベートした。各反応時間ごとに溶液に１６０μＬの酸性メタノールを添加し、よく懸濁した。その後、溶液をフィルターろ過（０．２μｍ Ｃａｐｔｉｖａ Ｐｒｅｍｉｕｍ ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）し、ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ／ｌｉｎｅａｒ ｉｏｎ ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＳＣＩＥＸ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）のサンプルとした。測定は論文（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ １０７６（２０１８）１５−２１，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｃａｒｂａ ａｎａｌｏｇ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｏｒｇａｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）と同様に行い、２ｃｃＰＡはＱ１／Ｑ３＝４１５．２６／２８１．２５、２ｃａｒｂａＬＰＡはＱ１／Ｑ３＝４３３．２７／１５１．０２、ＬＰＡはＱ１／Ｑ３＝４０９．２４／１５３．００で測定を行った。各反応時間ごとに合成されてくるＬＰＡ１６：０量を測定した。その結果、２ｃｃＰＡ， ２ｃａｒｂａＬＰＡを含まない反応液では、時間依存的にＬＰＡが合成されるのに対し、２ｃｃＰＡ， ２ｃａｒｂａＬＰＡを含む反応液ではＬＰＡの合成が抑制されていることが示された（図６）。

【0049】

（２）ＬＰＣを基質としたｃｈｏｌｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅによるＡＴＸ活性測定
ＡＴＸとＬＰＣ１６：０をそれぞれ終濃度５０ｎＭ，３００μＭになるように、２ｃｃＰＡあるいは２ｃａｒｂａＬＰＡは終濃度０．０１−１０μＭになるようにＣｈｏｌｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ反応液（０．０５％ ４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ，０．０５％ ＴＯＯＳ（Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ， ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ, ｄｉｈｙｄｒａｔｅ），１ｕｎｉｔ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，１ｕｎｉｔ ｃｈｏｌｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ_２， １ｍＭ ＭｇＣｌ_２）１００μＬに溶解し、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注した（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。その後、プレートを１２０分、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、吸光（５５５ｎｍ）をプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）Ｃｙｔａｔｉｏｎ ３ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）で測定した。阻害活性は、阻害活性％＝（１−阻害剤入り１２０分後の増加吸光度／阻害剤なし１２０分後の増加吸光度）×１００で算出した。その結果、２ｃｃＰＡ， ２ｃａｒｂａＬＰＡは濃度依存的にＡＴＸ活性を阻害することが分かった（図７）。

【0050】

実施例４：２ｃａｒｂａＬＰＡのＥＲＫリン酸化作用
ＳＷ１３５３細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した。翌日、細胞培養液を血清フリーの培養液に交換し、６時間培養した後、終濃度が１０μＭになるように０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに溶かした２ｃａｒｂａＬＰＡ、あるいは０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を添加した。３０分間３７℃でインキュベートした後、細胞をサンプルバッファー（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０１％ＢＰＢ，１０％ ２−メルカプトエタノール）で回収した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写したタンパク質を一次抗体ａｎｔｉ−ｐＥＲＫ抗体、ａｎｔｉ−ＥＲＫ抗体、ａｎｔｉ−β−ｔｕｂｌｉｎ抗体、二次抗体ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体を用いて検出した。その結果、図８のようにｐＥＲＫのバンドが濃くなり、ＥＲＫをリン酸化できることが示された。

【0051】

実施例５：２ｃａｒｂａＬＰＡのラット体内での産生
２ｃｃＰＡ（１９．７０±１．３９ｍｇ）をカプセル（ｓｉｚｅ ９，Ｔｏｒｐａｃ Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ， ＮＪ））に封入した。カプセルを腸溶化するために、カプセルをＥｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００／ Ｌ１００（４／１，１１ ｍｇ／ｃｍ^２，ｐＨ６．８）にてコーティングした（Ｅｖｏｎｉｋ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）。得られたカプセルを７週齢のあらかじめ経静脈にカニューレが挿入してあるＳＤラット（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ １９０−２２０ｇ）にカプセルインジェクター（Ｎａｔｓｕｍｅ Ｓｅｉｓａｋｕｓｈｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて経口投与した。カニューレ挿入ラットはオリエンタル酵母から購入した。時間ごとに３００μＬずつ血液を頸動脈カテーテルから回収した。回収した血液はＥＤＴＡ-Ｎａ_２（１ｍｇ／ｍＬ）を加えたのち、遠心（１０００×ｇ、１０分、４℃）することで、血漿を得た。血漿サンプルは、すぐに液体窒素にて凍結し、測定するまで−８０℃で保存した。血漿サンプルからの脂質画分抽出はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ １０７６（２０１８）１５−２１，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｃａｒｂａ ａｎａｌｏｇ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｏｒｇａｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ）と同様に行い、２ｃｃＰＡ， ２ｃａｒｂａＬＰＡの質量分析装置を用いた測定は、実施例３（１）の質量分析装置を用いたＡＴＸ活性測定と同様に行った。結果、２ｃｃＰＡは２時間後をピークとして血液サンプルから検出され（図９Ａ）、ほぼ同じ時間をピークとして２ｃａｒｂａＬＰＡが血液サンプルから検出される（図９Ｂ）ことが示された。

【0052】

実施例６：human LPA 受容体に対する活性評価
ＨＥＫ２９３ＡまたはΔＬＰＡ_{２／５／６} ＨＥＫ２９３ＡをＤｕｌｂｅｃｃｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、１０％ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ、１００Ｕ／ｍＬｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）中で２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁後、１００ｍｍ径ｄｉｓｈに播種した（１０ｍＬ／ｄｉｓｈ）。その後、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間インキュベーションした。

【0053】

下記のプラスミド溶液とＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ） 溶液を５００μＬずつ混合し、室温下で２０分間インキュベーションした後、培養上清中に滴下した（１ｍＬ／ｄｉｓｈ）。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間インキュベーションした。

【0054】

【表2】

【0055】

【表3】

【0056】

ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ細胞には、ＧＰＣＲ発現ベクターの代わりにｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒをトランスフェクションした。また、ＬＰＡ_１、ＬＰＡ_５発現細胞とそのコントロール細胞は、Ｇα_ｑ／ｉ１発現ベクターも合わせてトランスフェクションした （０．５μｇ／ｄｉｓｈ）。ＬＰＡ_２、ＬＰＡ_４発現細胞とそのコントロール細胞は、Ｇα_ｑ／ｓ発現ベクターも合わせてトランスフェクションした（０．５μｇ／ｄｉｓｈ）。ＨＥＫ２９３Ａ細胞は、ＬＰＡ_１及びＬＰＡ_４を発現させるために使用した。ΔＬＰＡ_{２／５／６}ＨＥＫ２９３Ａは、ＬＰＡ_２、ＬＰＡ_３、ＬＰＡ_５、ＬＰＡ_６を発現させるために使用した。いずれのＬＰＡ受容体についても、ヒト遺伝子を使用した。

【0057】

ＨＥＫ２９３Ａ、ΔＬＰＡ_{２／５／６}ＨＥＫ２９３ＡをＰＢＳで洗浄後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡで剥がし（２ｍＬ／ｄｉｓｈ）、ＤＭＥＭで中和した （３ｍＬ／ｄｉｓｈ）。遠心した後（１９０×ｇ、５ｍｉｎ）、Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）含有）で再懸濁し（１０ｍＬ／ｄｉｓｈ）、室温下で１５分間インキュベーションした。遠心した後（１９０×ｇ、５ｍｉｎ）、ＨＢＳＳで再懸濁し、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（細胞プレート） に播種した（ＬＰＡ_１、ＬＰＡ_２、ＬＰＡ_３発現細胞とそのｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ細胞：９０μＬ／ｗｅｌｌ、ＬＰＡ_４、ＬＰＡ_５、ＬＰＡ_６発現細胞とそのｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ細胞：８０μＬ／ｗｅｌｌ、１−２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。

【0058】

３７℃、５％ＣＯ_２下で３０分間インキュベーションした後、終濃度の１０倍濃度のアゴニスト（２ｃｃＰＡ、又は２ｃａｒｂａＬＰＡ）を添加した（１０μＬ／ｗｅｌｌ、化合物は０．０１％ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ含有ＨＢＳＳで希釈した）。なお、ＬＰＡ_４、ＬＰＡ_５、ＬＰＡ_６発現細胞とそのｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ細胞を添加したウェルについては、１００μＭ Ｋｉ１６４２５をアゴニスト添加５分前に添加した（１０μＬ／ｗｅｌｌ）。

【0059】

３７℃、５％ＣＯ_２下で６０分間インキュベーションした後、プレートを遠心し（１９０×ｇ、２ｍｉｎ）、上清を別の９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（上清プレート） に移動した （８０μＬ／ｗｅｌｌ）。上清プレート、細胞プレートのそれぞれのウェルに、１Ｍ- ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．５）、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有）を分注し（８０μＬ／ｗｅｌｌ）、分注直後及び分注１時間後のＯＤ４０５を測定した。

【0060】

計算方法
ＡＰ−ＴＧＦα ｒｅｌｅａｓｅ（％）＝ΔＯＤ４０５_Ｓｕｐ／（ΔＯＤ４０５_Ｓｕｐ＋ΔＯＤ４０５_Ｃｅｌｌ） × １２５
ＧＰＣＲａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（％）＝ ＡＰ−ＴＧＦα ｒｅｌｅａｓｅ ｕｎｄｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ − ＡＰ−ＴＧＦα ｒｅｌｅａｓｅ ｕｎｄｅｒ ｎｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

【0061】

ＥＣ_５０及びＥ_ｍａｘは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて、データを４パラメーターロジスティック曲線にフィッティングすることで算出した。

【0062】

実験の測定結果を図１０〜図１５に示す。
２ｃａｒｂａＬＰＡは、全てのＬＰＡ受容体（ＬＰＡ_１、ＬＰＡ_２、ＬＰＡ_３、ＬＰＡ_４、ＬＰＡ_５、ＬＰＡ_６）に対してアゴニスト活性を示した。
２ｃａｒｂａＬＰＡについて、ＬＰＡ_１、ＬＰＡ_２、ＬＰＡ_３、ＬＰＡ_４、ＬＰＡ_５、ＬＰＡ_６に対するアゴニスト活性（ＥＣ_５０）はそれぞれ１０ｎＭ、９０ｎＭ、１．２ｎＭ、０．７ｎＭ、２７ｎＭ、４３ｎＭであった。

【要約】

【課題】環状ホスファチジン酸誘導体であるカルバ環状ホスファチジン酸の新規な類縁体を同定し、その生理活性を明らかにすること。
【解決手段】下記式（１）で示される化合物。
【化１】

（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。Ｍは、水素原子又は対カチオンである。）
【選択図】なし

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】