特許 6733900 分離用担体、分離用担体の製造方法、カラム、及び、液体クロマトグラフィー用装置又は固相抽出用装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6733900

(24)【登録日】2020年7月13日

(45)【発行日】2020年8月5日

(54)【発明の名称】分離用担体、分離用担体の製造方法、カラム、及び、液体クロマトグラフィー用装置又は固相抽出用装置

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/04 20060101AFI20200728BHJP

   B01J 20/28 20060101ALI20200728BHJP

   B01J 20/30 20060101ALI20200728BHJP

   B01J 20/282 20060101ALI20200728BHJP

   B01D 15/08 20060101ALI20200728BHJP

   C08F 2/44 20060101ALI20200728BHJP

   C08F 2/52 20060101ALI20200728BHJP

【ＦＩ】

   B01J20/04 A

   B01J20/28 Z

   B01J20/30

   B01J20/282 C

   B01D15/08

   C08F2/44 A

   C08F2/52

【請求項の数】10

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2016-92657(P2016-92657)

(22)【出願日】2016年5月2日

(65)【公開番号】特開2017-200678(P2017-200678A)

(43)【公開日】2017年11月9日

【審査請求日】2019年4月16日

(73)【特許権者】

【識別番号】899000079

【氏名又は名称】学校法人慶應義塾

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(72)【発明者】

【氏名】蛭田 勇樹

(72)【発明者】

【氏名】金澤 秀子

(72)【発明者】

【氏名】梅本 優太

(72)【発明者】

【氏名】今井 宏明

【審査官】 池田 周士郎

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭５３−０１７７８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−３１４９０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 INOUE Atsuharu, et al.，Switchable dispersivity and molecular-trapping performance of mesostructured CaCO3-thermosensitive polymer composite microspheres，Journal of Materials Chemistry B，２０１５年，Vol.3，pp.3604-3608

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ０１Ｊ ２０／００−２０／３４

Ｂ０１Ｄ １５／００−１５／４２

Ｃ０８Ｆ ２／００− ２／６０

Ｇ０１Ｎ ３０／００−３０／９６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子と、
前記炭酸カルシウム粒子の表面に形成されたポリマーからなる膜と、を含有し、
前記炭酸カルシウム粒子と前記ポリマーとの質量比が１：０．０１〜１：０．３である、
分離用担体。

【請求項2】

前記ポリマーが温度応答性ポリマーである、請求項１に記載の分離用担体。

【請求項3】

前記炭酸カルシウム粒子の比表面積が、２５ｍ^２／ｇ以上６００ｍ^２／ｇ以下である請求項１又は２に記載の分離用担体。

【請求項4】

液体クロマトグラフィー用又は固相抽出用である、請求項１から３のいずれかに記載の分離用担体。

【請求項5】

塩基性条件下における分離に用いられる、請求項１から４のいずれかに記載の分離用担体。

【請求項6】

請求項１から５のいずれかに記載の分離用担体を備える、液体クロマトグラフィー用又は固相抽出用カラム。

【請求項7】

請求項６に記載のカラムを備える、液体クロマトグラフィー用又は固相抽出用装置。

【請求項8】

平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子と、該炭酸カルシウム粒子の表面に形成されたポリマーからなる膜とを含有する分離用担体の製造方法であって、
重合性モノマーと平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子とを含有する第１の溶媒を調製する工程と、
前記第１の溶媒を揮発させ、前記炭酸カルシウム粒子と前記重合性モノマーとの混合物の塊を得る工程と、
前記混合物の塊を含有する第２の溶媒を調製する工程と、
前記第２の溶媒中の前記重合性モノマーを重合させる重合工程と、を有し、
前記第１の溶媒は、前記重合性モノマーに対する良溶媒であり、かつ、前記炭酸カルシウム粒子に対する貧溶媒であり、
前記第２の溶媒は、前記重合性モノマー及び前記炭酸カルシウム粒子に対する貧溶媒であり、
前記炭酸カルシウム粒子と前記ポリマーとの質量比が１：０．０１〜１：０．３である、
方法。

【請求項9】

前記重合工程における重合を、光重合により行う、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の溶媒を調製する工程において、前記炭酸カルシウム粒子と前記重合性モノマーとを１：０．０１０〜１：０．３の質量比で前記第１の溶媒に含有させる、請求項８又は９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分離用担体、分離用担体の製造方法、カラム、及び、液体クロマトグラフィー用装置又は固相抽出用装置に関する。

【背景技術】

【0002】

従来より、液体クロマトグラフィー等に用いられる分離用担体としては、シリカや、表面が修飾されたシリカが使用されている（例えば、非特許文献１を参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｇｃ−ｓｉ．ｃｏｍ／ｕｓｅ＿ｍｓｇｅｌ．ｓｈｔｍｌ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、シリカは、塩基条件下での耐久性が低いため、塩基性条件下における使用には適していないという問題があった。

【0005】

本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、塩基性条件下における使用に適した分離用担体、分離用担体の製造方法、並びにこのような分離用担体を備えるカラム、及び装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、所定の平均粒径の炭酸カルシウムが、分離用担体として使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供することを目的とする。

【0007】

（１） 平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子を含有する、分離用担体。

【0008】

（２） 前記炭酸カルシウム粒子の表面に形成されたポリマーからなる膜をさらに含有する、（１）に記載の分離用担体。

【0009】

（３） 前記ポリマーが温度応答性ポリマーである、（２）に記載の分離用担体。

【0010】

（４） 前記炭酸カルシウム粒子と前記ポリマーとの質量比が１：０．０１〜１：０．３である、（２）又は（３）に記載の分離用担体。

【0011】

（５） 前記炭酸カルシウム粒子の比表面積が、２５ｍ^２／ｇ以上６００ｍ^２／ｇ以下である（１）から（４）のいずれかに記載の分離用担体。

【0012】

（６） 液体クロマトグラフィー用又は固相抽出用である、（１）から（５）のいずれかに記載の分離用担体。

【0013】

（７） 塩基性条件下における分離に用いられる、（１）から（６）のいずれかに記載の分離用担体。

【0014】

（８） （１）から（７）のいずれかに記載の分離用担体を備える、液体クロマトグラフィー用又は固相抽出用カラム。

【0015】

（９） （８）に記載のカラムを備える、液体クロマトグラフィー用又は固相抽出用装置。

【0016】

（１０） 平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子と、該炭酸カルシウム粒子の表面に形成されたポリマーからなる膜とを含有する分離用担体の製造方法であって、
重合性モノマーと平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子とを含有する第１の溶媒を調製する工程と、
前記第１の溶媒を揮発させ、前記炭酸カルシウム粒子と前記重合性モノマーとの混合物の塊を得る工程と、
前記混合物の塊を含有する第２の溶媒を調製する工程と、
前記第２の溶媒中の前記重合性モノマーを重合させる重合工程と、を有し、
前記第１の溶媒は、前記重合性モノマーに対する良溶媒であり、かつ、前記炭酸カルシウム粒子に対する貧溶媒であり、
前記第２の溶媒は、前記重合性モノマー及び前記炭酸カルシウム粒子に対する貧溶媒である、方法。

【0017】

（１１） 前記重合工程における重合を、光重合により行う、（１０）に記載の方法。

【0018】

（１２） 前記第１の溶媒を調製する工程において、前記炭酸カルシウム粒子と前記重合性モノマーとを１：０．０１０〜１：０．３の質量比で前記第１の溶媒に含有させる、（１０）又は（１１）に記載の方法。

【発明の効果】

【0019】

本発明によれば、塩基性条件下における使用に適した分離用担体、分離用担体の製造方法、並びにこのような分離用担体を備えるカラム、及び装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】本発明の実施例６の順相カラムを用いて、液体クロマトグラフィーによる測定を行ったときのクロマトグラムである。

【図2】本発明の実施例６の順相カラムを用いて、液体クロマトグラフィーによる測定の耐久試験を行ったときの保持時間のグラフである。

【図3】本発明の実施例３の分離用担体についてのＳＥＭ画像である。

【図4】本発明の実施例４の分離用担体についてのＳＥＭ画像である。

【図5】本発明の実施例８のカラムを用いて、液体クロマトグラフィーによる測定を行ったときのクロマトグラムである。

【図6】本発明の実施例９のカラムを用いて、液体クロマトグラフィーによる測定を行ったときのクロマトグラムである。

【図7】本発明の実施例４のカラムを用いて、塩基性条件下で液体クロマトグラフィーによる測定を行ったときのクロマトグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに特に限定されない。

【0022】

＜分離用担体＞
本発明の分離用担体は、平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子を含有する。

【0023】

本発明において、「分離用担体」とは、物質の分離に用いられる担体を意味する。「物質の分離に用いられる」とは、例えば、複数の物質が混在する液体等の系において、１つの物質又は２つ以上の物質を検出、定量又は分取可能な程度にまで分離することを目的として用いられることを意味する。分離対象の物質は、化合物（低分子、高分子、ペプチド、たんぱく質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）のいずれであってもよく、特に限定されない。

【0024】

（炭酸カルシウム粒子）
炭酸カルシウムは、その特性上、シリカよりも塩基性条件における耐久性があるため、炭酸カルシウム粒子を分離用担体として使用できれば、シリカよりも塩基性条件における使用に適した分離用担体として使用できることが期待される。ここで、炭酸カルシウムは、液体クロマトグラフィーの歴史の初期段階では分離用担体として使用されていた（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗａｋａｙａｍａ−ｅｄｃ．ｂｉｇ−ｕ．ｊｐ／ｋａｎｋｙｏ／ｅｋｉｋｕｒｏ／ｅｋｉｋｕｒｏ．ｐｄｆの「１（１）クロマトグラフィーの歴史」）という経緯がある。しかしながら、炭酸カルシウム粒子は、液体クロマトグラフィー等の精密な分離解析の分離用担体としては使用できないと考えられており（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ／ｂｉｏｄｉｒｅｃｔ＿ｍａｉｌ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ＿ｔｉｐｓ／ｔｉｐｓ４８．ｈｔｍｌを参照）、現在は、炭酸カルシウムは分離用担体としては使用されておらず、もっぱらシリカが使用されている。

【0025】

このように、炭酸カルシウムは、長年にわたって、分離用担体として使用できないとされていたが、本発明者らは、平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下の炭酸カルシウム粒子が、液体クロマトグラフィー等における分離用担体として機能することを見出した。さらには、上述のとおり、炭酸カルシウム粒子は、シリカよりも塩基性条件における耐久性があるため、本発明は、塩基性条件下における使用に適した分離用担体を提供する。

【0026】

本発明の炭酸カルシウム粒子は、平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である粒子であれば特に限定されず、上記範囲において、目的に応じて、適宜平均粒径を調整することができる。例えば、本発明の分離用担体を、精製等の分取を目的として使用する場合は、炭酸カルシウム粒子の平均粒径は１５μｍ以上８５μｍ以下であることが好ましく、２０μｍ以上８２μｍ以下であることがより好ましく、３０μｍ以上８０μｍ以下であることがより一層好ましく、３８μｍ以上７５μｍ以下であることさらに好ましい。また、本発明の分離用担体を分析に用いる場合は、炭酸カルシウム粒子の平均粒径は０．２０μｍ以上２５μｍ以下であることが好ましく、０．３５μｍ以上２０μｍ以下であることがより好ましく、０．５０μｍ以上１５μｍ以下であることがより一層好ましく、１．０μｍ以上１０μｍ以下であることがさらに好ましく、２．５μｍ以上７．０μｍ以下であることが特に好ましい。なお、炭酸カルシウム粒子の平均粒径は、ＳＥＭ像より測定する。

【0027】

炭酸カルシウムの結晶構造は、カルサイト、アラゴナイト、バテライト、アモルファスの４つの形態のものが知られているが、炭酸カルシウム粒子の平均粒径を上記範囲内に制御しやすく、分離能の高い分離用担体が得られやすく、さらには塩基性下での耐久性がより優れるという観点から、本発明の炭酸カルシウム粒子はバテライトの結晶形であることが好ましい。本発明の炭酸カルシウム粒子は、単一の結晶構造から構成されていてもよいが、複数種の結晶構造が混在してもよい。複数種の結晶構造が混在する場合、全炭酸カルシウムのうち、８０質量％以上がバテライトであることが好ましく、８５質量％以上がバテライトであることがより好ましく、９０質量％以上がバテライトであることがより一層好ましく、９５質量％以上がバテライトであることがさらに好ましく、９９％以上がバテライトであることが特に好ましい。

【0028】

バテライトの結晶形であって、平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下の範囲に制御された炭酸カルシウム粒子は、以下のような方法で製造することができる。

【0029】

まず、炭酸源（Ｎａ_２Ｃｏ_３等）を含む水溶液と、カルシウム源（ＣａＣｌ_２等）を含む水溶液と、ポリスチレンスルホン酸等の親水性ポリマーとを溶解させた水溶液とを混合し、（例えば、５００ｒｐｍで）撹拌して混合液を得る。この混合液を、２４時間程度静置した後、濾過（吸引濾過等）してから、乾燥することで（乾燥条件は、例えば、１０〜６０℃、３０分〜３時間である。）、得ることができる。なお、０．１５μｍ以上９５μｍ以下の範囲内での平均粒径の制御は、平均粒径を小さくする場合は、攪拌速度を速くすることにより行うことができ、平均粒径を大きくする場合は、攪拌子を小さくすることにより行うことができる。また、炭酸カルシウムのバテライトの結晶形は、安定性が低く、カルサイトに転移しやすいので、安定性を高く保つために、後述する膜形成ポリマーにより表面を膜で覆うことが好ましい。膜形成ポリマーとして親水性ポリマーを用いることで、炭酸カルシウム粒子の表面が親水性ポリマーにより覆われ、平均粒径を制御しやすくなる。

【0030】

本発明における炭酸カルシウムの比表面積は、特に限定されないが、大きいほど分離能が高くなる傾向にあることから、その下限は５ｍ^２／ｇ以上であることが好ましく、１０ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、１５ｍ^２／ｇ以上であることがより一層好ましく、２０ｍ^２／ｇ以上であることがさらに一層好ましく、２５ｍ^２／ｇ以上であることが特に好ましい。本発明における炭酸カルシウムの比表面積の上限は１３００ｍ^２／ｇ以下であることが好ましく、１１００ｍ^２／ｇ以下であることがより好ましく、９００ｍ^２／ｇ以下であることがより一層好ましく、７００ｍ^２／ｇ以下であることがさらに一層好ましく、６００ｍ^２／ｇ以下であることが特に好ましい。なお、本発明における炭酸カルシウムの比表面積は、ＢＥＴ法により測定する。

【0031】

（膜形成ポリマー）
本発明の分離用担体は、炭酸カルシウム粒子の表面に形成されたポリマー（以下、本明細書において「膜形成ポリマー」と略称する場合がある。）からなる膜をさらに含有することが好ましい。これにより、膜形成ポリマーの種類に応じて分離用担体に様々な特性を与えることができ、また、炭酸カルシウム中のバテライトをより安定させることができる。

【0032】

本発明の膜形成ポリマーとしては、従来の分離用担体として使用されているようなポリマーを使用でき、分離対象の物性等に応じて、適宜選択できる。具体的には、温度応答性ポリマー、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー等のポリマーを使用できる。膜形成ポリマーは、重合性モノマーの重合により得られ、例えば、以下の式（１）、式（２）で表されるようなモノマーの重合体であってもよい。

【0033】

【化01】

【0034】

式（１）、（２）中、Ｒ^１は、置換基を表すが、式（１）、（２）で表されるモノマーは、例えば、以下の、式（３）で表されるアクリルアミド系モノマー、式（４）で表されるメタクリルアミド系モノマー、式（５）で表されるメタアクリレート系モノマー、式（６）で表されるアクリレート系モノマー、式（７）で表されるビニルエステル系モノマー、式（８）で表されるビニルアミド系モノマー、式（９）で表されるスチレン系モノマーが挙げられる。式（３）〜（９）中のＲ^２としては、炭化水素基、水素原子、アミノ基（脂肪族基を置換基として有してもよい）等が挙げられる。

【0035】

【化02】

【0036】

【化03】

【0037】

【化04】

【0038】

【化05】

【0039】

【化06】

【0040】

【化07】

【0041】

【化08】

式（９）中のＲ^２は、ベンゼン環のいずれの箇所（ただし、既に置換されている箇所は除く）が置換されていてもよいことを示す。

【0042】

温度応答性ポリマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（又はＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体等を構成モノマーとして構成されたポリマーや、これらのうちの２種類以上のモノマーの共重合体であってもよい。また、これらのモノマー以外のモノマーとの共重合、ポリマー同士のグラフト重合又は共重合を行ったものを用いてもよく、あるいはこれらモノマーの単独重合体と共重合体の混合物を用いてもよい。

【0043】

具体的な温度応答性ポリマーを構成するモノマーとしては、例えば、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。温度応答性ポリマーは、これらのモノマーの単独重合体であってもよく、２種以上の共重合体であってもよい。また、これらのモノマーとさらに共重合してもよいモノマーとしては、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、エチレンオキシド、（メタ）アクリル酸及びその塩、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。これらのうち、温度応答性ポリマーとしては、特に、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）の重合体、又は、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と他の重合性モノマーの共重合体であることが好ましい。

【0044】

疎水性ポリマーを構成するモノマーとしては、例えば、以下の式（１０）で示されるブチルメタクリレート、式（１１）で表されるオクタデシルメタクリレート等が挙げられる。

【0045】

【化09】

【0046】

【化10】

【0047】

カチオン性ポリマーを構成するモノマーとしては、例えば、以下の式（１２）で示されるＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド等が挙げられる。

【0048】

【化11】

【0049】

親水性ポリマーを構成するモノマーとしては、例えば、以下の式（１３）で示される２−（メタクリロイルオキシ）エチル２−（トリメチルアンモニオ）エチルリン酸等が挙げられる。

【0050】

【化12】

【0051】

アニオン性ポリマーを構成するモノマーとしては、例えば、以下の式（１４）で示されるメタクリル酸等が挙げられる。

【0052】

【化13】

【0053】

上記ポリマーは、安定して膜を形成するためには、架橋されていることが好ましい。架橋剤は、二重結合を２つ以上有する公知の架橋剤であれば特に限定されないが、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、エチレンジ（メタ）アクリレート、ペンタエリトリトールジアクリレートモノステアレート、ジビニルベンゼン、Ｎ，Ｎ’−ジアリル−Ｌ−酒石酸ジアミド、Ｎ，Ｎ’−ジアリル−酒石酸ジアミド、ピペラジンジアクリルアミド等が挙げられる。架橋剤の添加量は、膜形成ポリマーを構成する重合性モノマーの量に応じて、適宜設定することができ、例えば、重合性モノマーと架橋剤との質量比が、１：０．００１〜１：１であることが好ましく、１：０．０１〜１：０．５であることがより好ましく、１：０．０４〜１：０．２であることがさらに好ましい。

【0054】

本発明の分離用担体が膜形成ポリマーを含有する場合、膜形成ポリマーの含有量が過大であると、膜が厚くなりすぎて、均一な膜が得られにくくなり、分離能が低下する恐れがある。他方、膜形成ポリマーの含有量が少なすぎると、膜で炭酸カルシウム粒子の表面全体を覆いにくくなり、炭酸カルシウム粒子中のバテライトが安定せず、分離能が低下する恐れがある。このことから、炭酸カルシウム粒子と膜形成ポリマーとの質量比は、１：０．０００１〜１：１であることが好ましく、１：０００５〜１：０．５であることがより好ましく、１：０．０１０〜１：０．３０であることがさらに好ましく、０．０１５〜１：０．０４０であることが特に好ましい。

【0055】

本発明の分離用担体が、炭酸カルシウム粒子と上記膜形成ポリマーとから構成される場合、その平均粒径は、目的に応じて適宜決定されてもよい。例えば、本発明の分離用担体を、精製等の分取を目的として使用する場合は、炭酸カルシウムの分離用担体の平均粒径は１５μｍ以上８５μｍ以下であることが好ましく、２０μｍ以上８２μｍ以下であることがより好ましく、３０μｍ以上８０μｍ以下であることがより一層好ましく、３８μｍ以上７５μｍ以下であることさらに好ましい。また、本発明の分離用担体を分析に用いる場合は、本発明の分離用担体の平均粒径は０．２０μｍ以上２５μｍ以下であることが好ましく、０．３５μｍ以上２０μｍ以下であることがより好ましく、０．５０μｍ以上１５μｍ以下であることがより一層好ましく、１．０μｍ以上１０μｍ以下であることがさらに好ましく、２．５μｍ以上７μｍ以下であることが特に好ましい。なお、膜形成ポリマーを含有する態様の本発明の分離用担体の平均粒径は、炭酸カルシウム粒子の測定と同様の方法で測定される。

【0056】

本発明の炭酸カルシウムの表面において、上記の膜形成ポリマーからなる膜の平均膜厚は、１０．０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、２０．０ｎｍ以上４００ｎｍ以下であることがより好ましく、３０．０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることがさらに好ましく、５０．０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下であることが特に好ましい。また、炭酸カルシウムの表面の略全面（好ましくは、表面の９０％以上の面積、より好ましくは表面の９９％以上の面積）が覆われていることが好ましい。

【0057】

本発明における膜形成ポリマーの分子量は、膜形成ポリマーによる所望の性質を得られるように、適宜設定してもよい。

【0058】

本発明の炭酸カルシウム粒子の表面に膜形成ポリマーが形成された分離用担体の製造方法の詳細は後述する。

【0059】

（用途）
本発明の分離用担体の用途としては、分離対象物質と接触させて用いられる、従来の、検出、測定、分取等を目的とした用途であれば、特に限定されないが、液体クロマトグラフィー用又は固相抽出用であることが好ましく、液体クロマトグラフィー用であることが特に好ましい。また、上述のとおり、本発明の分離用担体は、炭酸カルシウムを用いることから、塩基性条件下における分離に適している。このことから、塩基性条件下における分離に用いられることが好ましい。

【0060】

また、本発明の分離用担体が分取を目的として用いられる場合において、分離対象物質を最終的に回収する方法は、目的や膜形成ポリマーの種類等に応じて、適宜選択できる。例えば、分離対象物質と本発明の分離用担体とを混合した後に、遠心分離を行い、沈殿した分離用担体を回収することで分取が可能である。あるいは、低温で親水性となり、かつ、高温で疎水性となる温度応答性ポリマーを膜形成ポリマーとして用いる場合は、疎水性の有機溶媒（トルエン、ニトロベンゼン等）と、分離対象物質を吸着した分離用担体を含む水と、を低温で混合した後、加温することで、分離用担体を疎水性の有機溶媒の層に移動させることができ、この有機溶媒に含まれる分離用担体を回収することで分取が可能である。

【0061】

＜カラム＞
本発明は、上述の分離用担体を備える、液体クロマトグラフィー用又は固相抽出用カラムを包含する。上述のとおり、液体クロマトグラフィー、固相抽出に適しているため、上述の分離用担体をカラムに充填することで、液体クロマトグラフィー用カラム、固相抽出用カラムとして使用できる。

【0062】

カラムの種類は、従来の液体クロマトグラフィーや、固相抽出に用いられるものであれば、特に限定されない。

【0063】

＜装置＞
本発明は、さらに、上記のカラムを備える、液体クロマトグラフィー用又は固相抽出用装置を包含する。

【0064】

液体クロマトグラフィー用装置、固相抽出用装置の種類は、従来の液体クロマトグラフィー用装置、固相抽出用装置に用いられるものであれば、特に限定されない。

【0065】

＜分離用担体の製造方法＞
本発明の上述の分離用担体のうち、平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子と、該炭酸カルシウム粒子の表面に形成されたポリマー（上述の膜形成ポリマーからなる膜）とを含有する分離用担体は、例えば、重合性モノマーと、平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子とを含有する第１の溶媒を調製する工程と、該第１の溶媒を揮発させ、炭酸カルシウム粒子と重合性モノマーとの混合物の塊を得る工程と、該混合物の塊を含有する第２の溶媒を調製する工程と、該第２の溶媒中の重合性モノマーを重合させる重合工程と、を有する方法で製造できる。以下に、かかる本発明の好ましい製造方法（以下、「本発明の製造方法」と略称する。）について、詳細に説明する。

【0066】

本発明の製造方法における重合性モノマー、炭酸カルシウム粒子は、上述のものと同様のものを例示できる。

【0067】

第１の溶媒は、重合性モノマーに対する良溶媒であり、かつ、炭酸カルシウム粒子に対する貧溶媒である。このような溶媒であれば、特に限定されず、重合性モノマーの種類に応じて適宜変更することができる。例えば、重合性モノマーがＮ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドである場合、第１の溶媒としては、クロロホルム、酢酸エチル、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、メタノール、エタノール等を用いることができる。あるいは、重合性モノマーがオクタデシルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレートである場合、第１の溶媒としては、ヘキサン、ペンタン、ヘプタンを用いることができる。また、本発明において、「良溶媒」とは、２０℃における溶媒１ｍＬに対する対象物質（第１の溶媒においては重合性モノマー）の溶解量が０．０１ｇ以上である溶媒のことを意味する。また、「貧溶媒」とは、２０℃における溶媒１ｍＬに対する対象物質（第１の溶媒においては炭酸カルシウム粒子、第２の溶媒においては炭酸カルシウム粒子及び重合性モノマー）の溶解量が０．００１ｇ以下である溶媒のことを意味する。

【0068】

第２の溶媒は、炭酸カルシウム粒子及び重合性モノマーに対する貧溶媒である。このような溶媒であれば、特に限定されず、重合性モノマーの種類に応じて適宜変更することができる。例えば、重合性モノマーがＮ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドである場合、第２の溶媒としてはヘキサン、ペンタン、ヘプタンを用いることができる。あるいは、重合性モノマーがオクタデシルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレートである場合、第２の溶媒としては、メタノール、エタノール、水を用いることができる。

【0069】

本発明において、重合性モノマーと平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子とを含有する第１の溶媒を調製する工程は、第１の溶媒に、重合性モノマーと平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子とを含有させることにより行う。このように、第１の溶媒に、重合性モノマーと炭酸カルシウム粒子とが含有させることで、重合性モノマーは第１の溶媒に溶解するが、炭酸カルシウムは、溶解しない。このような状態にすることで、炭酸カルシウム粒子の隙間に、重合性モノマーが入り込みやすくなり、均一な膜を得やすい。第１の溶媒に、重合性モノマーと炭酸カルシウム粒子とを含有させる手段であれば、どのような手段であってもよいが、まず、重合性モノマーを第１の溶媒に含有させて溶解させた後に、炭酸カルシウムを第１の溶媒に含有させることが好ましい。これにより、重合性モノマーが溶解した状態の第１の溶媒が、炭酸カルシウム粒子の隙間に浸透させやすくなり、均一な重合工程後に均一な膜を炭酸カルシウム粒子の表面に形成しやすくなる。

【0070】

本発明の製造方法において、使用する重合性モノマーの量が過大であると、重合工程後の膜が厚くなりすぎて、均一な膜が得られにくなり、製造される分離用担体の分離能が低下する恐れがある。他方、重合性モノマーの量が少なすぎると、膜で炭酸カルシウム粒子の表面全体を覆いにくくなり、分離能が低下する恐れがある。このことから、第１の溶媒に含有させる炭酸カルシウム粒子と重合性モノマーとの質量比は、１：０．０００１〜１：１であることが好ましく、１：０００５〜１：０．５であることがより好ましく、１：０．０１０〜１：０．３０であることがさらに好ましく、０．０１５〜１：０．０４０であることが特に好ましい。

【0071】

また、第１の溶媒には、必要に応じて添加剤（架橋剤）を加えてもよい。また、重合性モノマーを第１の溶媒に溶解させ、炭酸カルシウム粒子をこの第１の溶媒とは異なる別の液体に分散させておき、該液体と第１の溶媒とを混合してもよい。また、第１の溶媒中に、炭酸カルシウム粒子と重合性モノマーとを含有させた後、後述の揮発を行う前に、撹拌を行ってもよい。

【0072】

本発明の製造方法は、第１の溶媒中に、炭酸カルシウム粒子と重合性モノマーとを含有させた後、第１の溶媒を揮発させ、炭酸カルシウム粒子と重合性モノマーとの混合物の塊を得る工程を有する。

【0073】

揮発は、従来の公知のいずれの方法に行ってよく、第１の溶媒の揮発性に応じて適宜選択することができる。

【0074】

本発明の製造方法は、上記混合物の塊を得た後、混合物の塊を含有する第２の溶媒を調製する工程を有する。この混合物の塊は炭酸カルシウム粒子と重合性モノマーからなるものである。第２の溶媒中に含有させた状態であれば、炭酸カルシウム粒子も重合性モノマーも溶解しないため、後述の重合を行った際に、そのまま炭酸カルシウム粒子の表面で重合性モノマーが重合するため、その表面に膜を形成可能となる。

【0075】

本発明の製造方法は、第２の溶媒中に上記混合物の塊を含有させた後、第２の溶媒中の重合性モノマーを重合させる重合工程を有する。上述のとおり、かかる工程で炭酸カルシウム粒子の表面に重合性モノマーの重合体からなるポリマーにより膜を形成できる。重合性モノマーの重合は、重合性モノマーの種類に応じて、公知の重合方法で行うことができるが、加熱により重合を加えると、均一な膜を形成しにくくなることから、光重合であることが好ましい。この場合、光重合開始剤を、第２の溶媒に含有させて、光重合を行うことが好ましい。あるいは、第１の溶媒に光重合開始剤を予め含有させておき、その後、上述の混合物の塊を得ることで、光重合開始剤と重合性モノマーを共存させて、光重合を行ってもよい。

【0076】

上記の第２の溶媒に、混合物の塊を含有させている間や、重合を行っているときに、超音波処理、及び／又は撹拌を行うことが好ましい。これにより、より均一な膜を形成しやすくなる。

【0077】

重合後、得られた分離用単体は、平均粒径が０．１５μｍ以上９５μｍ以下である炭酸カルシウム粒子と、該炭酸カルシウム粒子の表面に形成されたポリマー（上述の膜形成ポリマーからなる膜）とを含有する分離用担体である。

【0078】

重合後の分離用単体は、遠心分離、乾燥を行うことで回収できる。

【0079】

なお、上記で述べた方法は、好ましい製造方法であって、他の方法（融液法）によっても、本発明の分離用単体は製造可能である。

【実施例】

【0080】

＜炭酸カルシウム粒子の作製＞
（実施例１）
１６ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３水溶液０．５ｄｍ^３に終濃度１．０ｇ／ｄｍ^３となるようにＰＳＳ（ポリスチレンスルホン酸）を溶解させ５００ｒｐｍで１分間撹拌しながら（撹拌子サイズ：２００ｍｍ ｘ ７ｍｍ）１ＭのＣａＣｌ_２水溶液１６ｍＬを混合し、混合後に２５℃で２４時間静置した。その後、６０℃で３時間乾燥することで平均粒径５．０μｍのバテライト型炭酸カルシウム／ＰＳＳの複合粒子を得た。ＰＳＳの除去得られた粒子を５％ＮａＣｌＯ水溶液（５０ｍＬ）に浸漬し、１分間超音波処理を行った後、２５℃で４８時間静置し、その後４００℃で２時間焼成することで、ＰＳＳを除去し、平均粒径５．０μｍのバテライト型炭酸カルシウムを作製し、このバテライト型炭酸カルシウムを実施例１に係る分離用担体とした。

【0081】

（実施例２）
炭酸カルシウム粒子の平均粒径が２．５μｍとなるように制御した点以外は、実施例１と同様の手順で実施例２に係る分離用担体を作製した。

【0082】

＜炭酸カルシウムの表面におけるポリマーからなる膜の形成＞
（実施例３：融液法による膜の形成）
ポリマーを形成する重合性モノマーとして、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）（０．５０ｇ）を、架橋剤としてＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）（０．０４４ｇ）を２０ｃｍ^３のスクリュー管に入れホットスターラーで６０℃に加熱した。ＮＩＰＡＡｍ、ＢＩＳが完全に溶解した後に、ナノスペースの拡張をした、実施例１の分離用担体である平均粒径２．５μｍの炭酸カルシウムを１．０ｇ加え、６時間撹拌した。その後放冷し、光重合開始剤である２，２’−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＢＤＫ）（０．０１ｇ）が溶解したヘキサン１５ｃｍ^３を加え、撹拌しながらキセノンランプを３時間照射し、光重合を行った。重合後、４０００ｒｐｍで遠心分離を３回行い洗浄し、凍結乾燥により回収し、炭酸カルシウムの表面にＮＩＰＡＡｍのポリマー（以下、「ＰＮＩＰＡＡｍ」と略称する。）からなる膜が形成された、実施例３に係る分離用担体を作製した。

【0083】

（実施例４：溶媒揮発法による膜の形成）
ＮＩＰＡＡｍ０．０５ｇ、ＢＩＳ０．０４４１ｇをクロロホルムに溶かした溶液に、実施例１のバテライト型の炭酸カルシウムの粒子を浸漬させた。クロロホルムが全て揮発した後、０．０１ｇのＢＤＫが溶解したヘキサン１５ｃｍ^３を加え、撹拌しながらキセノンランプを３時間照射し、光重合を行った。重合後、４０００ｒｐｍで３回遠心分離を行い洗浄し、凍結乾燥により回収し、実施例４に係る分離用担体を作製した。

【0084】

（実施例５：溶媒揮発法による膜の形成）
ＮＩＰＡＡｍの量を、０．０２５ｇに変更した点以外は、実施例４と同様の手順で、実施例５に係る分離用担体を作製した。

【0085】

＜比表面積、積算細孔容積、平均細孔直径の測定＞
実施例１の平均粒径５μｍの炭酸カルシウム粒子、実施例２の平均粒径２．５μｍの炭酸カルシウム粒子、実施例３の炭酸カルシウム／ＰＮＩＰＡＡｍ粒子について、比表面積、細孔容積、平均細孔直径の測定を測定した。また、参考例１として、シリカ粒子を、参考例２として、ＳｉＯ_２／ＰＮＩＰＡＡｍ粒子（ＳｉＯ_２粒子の表面にＰＮＩＰＡＡｍの膜が形成）を準備し、これらについても、比表面積、細孔容積、平均細孔直径の測定を測定した。

【0086】

比表面積は、ＢＥＴ法により測定し、積算細孔容積は、平均細孔直径（ポアサイズ）ＢＪＨ法により測定した。その結果を以下の表１に示す。

【0087】

【表1】

【0088】

表１に示す結果から、実施例１〜３の分離用担体は、カラムとしての分離能を発揮できるための十分な多孔性を有することがわかった。

【0089】

＜カラムの作製＞
（実施例６）
ＰＳＳ除去後の実施例１のバテライト型炭酸カルシウムを、カーボンテトラクロライド／テトラブロモエタン（１：１）（１３ｍＬ）に懸濁させ、ＨＰＬＣポンプ（日立ハイテクノロジーズ社製：Ｌ−６２００ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｐｕｍｐ）を用いてクロロホルム（グラジエント条件：６０ｍｉｎ）、メタノール（グラジエント条件：２０ｍｉｎ）、５０％メタノール．ａｑ（グラジエント条件：２０ｍｉｎ）、メタノール（グラジエント条件：５ｍｉｎ）を移動相としてカラム（φ２．１ｍｍ×１００ｍｍ）に充填（２５ＭＰａ、１０５ｍｉｎ）させることで、実施例１の分離用担体が充填された実施例６に係る順相カラムを作製した。

【0090】

（実施例７）
ＰＮＩＰＡＡｍによる膜形成後の実施例３のバテライト型炭酸カルシウムをメタノール／水（１：１）（１０ｍＬ）に懸濁させ、ＨＰＬＣポンプ（日立ハイテクノロジーズ社製：Ｌ−６２００ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｐｕｍｐ）を用いてメタノール／水（１：１）を移動相としてカラム（φ２．１ｍｍ×１００ｍｍ）に充填（２５ＭＰａ，９０ｍｉｎ）させることで、実施例３の分離用担体が充填された実施例７に係るカラムを作製した。

【0091】

（実施例８）
実施例３のバテライト型炭酸カルシウムの代わりに実施例４のバテライト型炭酸カルシウムを用いた点以外は、実施例７と同様の手順により実施例８に係るカラムを作製した。

【0092】

（実施例９）
実施例４のバテライト型炭酸カルシウムの代わりに実施例５のバテライト型炭酸カルシウムを用いた点以外は、実施例８と同様の手順により実施例９に係るカラムを作製した。

【0093】

＜試験１＞
実施例６の順相カラムを用いて、液体クロマトグラフィーのカラムとして機能するかを試験するために、以下の測定試料・分析条件で、液体クロマトグラフィーによる測定試験を行った。

【0094】

（測定試料）
テストステロンの０．１ｍｇ／ｍＬ酢酸エチル／ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）（９／１）溶液をフィルター（０．２μｍ）に通したものを測定試料とした。

【0095】

（分析条件）
移動相；ヘキサン、酢酸エチル
流速；０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度；２５℃
検出波長；２５４ｎｍ
カラム；炭酸カルシウム・カラム（実施例６のカラム）（φ２．１ ｍｍ×１００ ｍｍ）

【0096】

移動相であるヘキサンと酢酸エチルの溶媒比については、５０：５０、６０：４０、７０：３０と変化させて分析を行った。その結果を、図１に示す。図１に示すように、移動相の極性が高くなること（酢酸エチルの量の割合が多いほど）で保持時間が短くなった。このことから、バテライト型炭酸カルシウム粒子を充填したカラムは、順相カラムとして機能することがわかった。また、シャープなピーク形状が得られたことから、実施例１の平均粒径５μmのバテライト型炭酸カルシウムからなる分離用担体は、液体クロマトグラフィー用のカラムに充填される分離用担体として十分に使用可能なことがわかった。

【0097】

＜試験２＞
カラムの耐久性を試験するために、実施例６の順相カラムを用いて、作製後の初回の測定から、５か月後に２５回の測定試験を行い、保持時間の変化を評価した。測定試料・分析条件は、上記の試験１と同様のものを用いた。ただし、移動相のヘキサン、酢酸エチルは、ヘキサン：酢酸エチル＝６０：４０の比とした。その結果を、図２に示す。

【0098】

図２に示すように、５か月後も使用可能であり繰り返し使用しても保持時間が変化しなかったことから、２５回の測定でほぼ一定の保持時間であることから、カラムの耐久性が十分であることがわかった。

【0099】

＜ＳＥＭ画像観察＞
実施例３及び４に係る分離用担体（炭酸カルシウム／ＰＮＩＰＡＡｍ）について、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）を用いて画像観察を行った。まず、それぞれの分離用担体を導電性テープでアルミニウムの試料台に貼り付け、オスミウム真空蒸着を１０秒行いコーティングをした。その後、ＳＥＭを用いて結晶形態の観察を行った。実施例３の分離用担体についてのＳＥＭ画像を図３に、実施例４の分離用担体についてのＳＥＭ画像を図４に示す。

【0100】

図３に示すように、融液法により作製した実施例３の分離用担体は、粒子周辺に余分な有機物が存在することがわかった。一方、所定の溶媒揮発法により作製した実施例４の分離用担体は、粒子周辺に余分な有機物が存在していなかった。この結果から、実施例４の所定の溶媒分離法により作製した分離用担体の方が、実施例３の融液法により作製された分離用担体より分散性が非常に良く、粒子表面に均一にＰＮＩＰＡＡｍの膜が形成されることがわかった。

【0101】

＜試験３＞
実施例８、実施例９のカラムを用いて、液体クロマトグラフィーによる測定試験を行った。それぞれ、以下の測定試料・分析条件で、条件を行った。

【0102】

（実施例８についての測定試料）
テストステロンの０．１ｍｇ／ｍＬ Ｈ_２Ｏ／ＴＨＦ（９／１）溶液をフィルター（０．２μｍ）に通したものを測定試料とした。

【0103】

（実施例８についての分析条件）
移動相；水
流速；０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度；２５℃、３５℃、４０℃
検出波長；２５４ｎｍ
カラム；炭酸カルシウム／ＰＮＩＰＡＡｍ・カラム（実施例８のカラム）（φ２．１ｍｍ×１００ｍｍ）

【0104】

（実施例９についての測定試料）
実施例８と同様の測定試料を用いた。

【0105】

（実施例９についての分析条件）
移動相；水／メタノール（９５：５）
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
温度；３０℃、４０℃
検出波長；２５４ｎｍ
カラム；炭酸カルシウム／ＰＮＩＰＡＡｍ・カラム（実施例９のカラム）（φ２．１ｍｍ×１００ｍｍ）

【0106】

実施例８についての分析結果を、図５に示す。実施例９についての分析結果を、図６に示す。

【0107】

ＮＩＰＡＡｍのモノマー量が０．０２５ｇ（炭酸カルシウムの質量に対して０．００２５）の実施例９のクロマトグラムはピークは、ＮＩＰＡＡｍのモノマー量が０．０５ｇ（炭酸カルシウムの質量に対して０．０５）である実施例８のものよりもシャープなピーク形状が得られた。このことは、ＮＩＰＡＡｍの量を減らすことで、炭酸カルシウム粒子の表面に薄いＰＮＩＰＡＡｍの膜を形成でき、サンプルの膜の奥への潜り込みが抑えられたためだと考えられる。この結果から、ＰＮＩＰＡＡｍの膜が薄い方が、シャープなピーク形状を得られやすいことがわかった。

【0108】

＜試験４＞
作製した炭酸カルシウム／ＰＮＩＰＡＡｍのカラム（実施例４）について、塩基性条件下での溶出挙動を確認するために、移動相をｐＨ８に設定し、塩基性化合物であるアミトリプチリンを測定試料として、以下の条件で分析を行った。

【0109】

（測定試料）
アミトリプチリンの０．１ｍｇ／ｍＬＨ_２Ｏ／ＴＨＦ（９／１）溶液をフィルター（０．２μｍ）に通したものを測定試料とした。

【0110】

（分析条件）
移動相；１０ｍＭ酢酸緩衝液 ｐＨ８．０
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
温度；３０℃
検出波長；２５４ｎｍ
カラム；炭酸カルシウム／ＰＮＩＰＡＡｍ・カラム（実施例４のカラム）（φ２．１ｍｍ×１００ｍｍ）

【0111】

分析結果を、図７に示す。

【0112】

図７に示すように、塩基性条件下においてピークが確認されたことから、塩基性条件下における分析に使用できることが確認された。また、図には示さないが、温度を４０℃に変更した以外は上記と同じ条件で分析を行ったところ、ピークの保持時間が長くなったことが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】