特許 6738285 ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロンに結合する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6738285

(24)【登録日】2020年7月21日

(45)【発行日】2020年8月12日

(54)【発明の名称】ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロンに結合する抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20200730BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20200730BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20200730BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C07K16/28

   C12N15/13

【請求項の数】1

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2016-569639(P2016-569639)

(86)(22)【出願日】2015年5月22日

(65)【公表番号】特表2017-516786(P2017-516786A)

(43)【公表日】2017年6月22日

(86)【国際出願番号】EP2015061457

(87)【国際公開番号】WO2015181098

(87)【国際公開日】20151203

【審査請求日】2018年5月9日

(31)【優先権主張番号】14170140.9

(32)【優先日】2014年5月28日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】14180572.1

(32)【優先日】2014年8月11日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】306021192

【氏名又は名称】エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ティーフェンタラー， ゲオルク

(72)【発明者】

【氏名】メスナー， エッケハルト

(72)【発明者】

【氏名】リフケ， ヴァレリア

(72)【発明者】

【氏名】プラッツァー， ヨーゼフ

(72)【発明者】

【氏名】オフナー， ソニヤ

(72)【発明者】

【氏名】イェーガー， クリスティアーネ

(72)【発明者】

【氏名】リッター， ミルコ

【審査官】 飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５１１５２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２４４３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−０３０７８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 The Journal of Immunology, 1991, Vol.147, p.3047-3052

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １６／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体がヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化し、
抗体は、
（ａ）配列番号０４又は配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号０６から配列番号０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｃ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｄ）配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、ヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、交差反応性抗体の分野にある。本明細書では、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を生成するための方法及びその使用が報告されている。

【背景技術】

【0002】

Ｔ細胞は、適応免疫応答の重要なエフェクターであり、病原体の排除及び自己免疫疾患における多くの重要な役割を有する。異なる機能を有するＴ細胞の幾つかのサブセットが存在する。

【0003】

Ｔ細胞の表面上に見出されるＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）は、ＴＣＲ集団の約９５％を構成する組成物であるアルファ及びベータポリペプチド鎖又はγ及びδポリペプチド鎖の何れかからなるヘテロ二量体である（Pitcher and van Oers, 2003; Malissen, 2008）。各ポリペプチドは、定常（Ｃ）及び可変（Ｖ）領域を含む。定常領域は細胞膜に固定されるが、一方可変領域は細胞外に伸長し、抗原結合に関与する。ＴＣＲの短い細胞質尾部は、シグナル伝達能力を欠いている。細胞内シグナル伝達は、細胞内免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むＣＤ３タンパク質複合体によって開始される。

【0004】

ＣＤ３（分化３のクラスター）Ｔ細胞共受容体はタンパク質複合体であり、４つの異なる鎖からなる。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含む。これらの鎖は、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成するために、ＴＣＲ及びζ鎖（ゼータ鎖）と会合する。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子は共にＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。

【0005】

ＴＣＲは遊離のエピトープ／抗原に結合することはできず、代わりにＴＣＲはヒトにおけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系と同義である主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と会合するより大きなポリペプチドの酵素的に切断された断片を結合する（Rudd 1990; Gao et al., 2002）。免疫学的シナプスとして知られるようになっている空間内でこの相互作用は生じる。ＭＨＣクラスＩ分子は、身体の全ての有核細胞上で過剰発現され、抗原を細胞傷害性Ｔ細胞に提示し、これらの細胞上ではＣＤ８はＭＨＣ／ＴＣＲの相互作用を安定化させる。細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、続いて（ウイルスに）感染した細胞の破壊をもたらす。ＭＨＣクラスＩＩは、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞上に見出される。これらの免疫細胞は、ＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用を安定化するＣＤ４を有するヘルパーＴ細胞に抗原を提示する。ＭＨＣクラスＩＩとＴＣＲとの相互作用は、最終的には、抗体媒介性免疫応答をもたらす。ＣＤ４５、ＣＤ２８及びＣＤ２などの他の共刺激分子は、免疫学的シナプスにおけるＴ細胞活性化を促進し、細胞内シグナル伝達を担う高分子タンパク質複合体であるＴＣＲシグナロソームの形成を開始する。

【0006】

ヒトＣＤ３イプシロンに結合する幾つかの抗体、例えば、抗体ＯＫＴ３（例えば、Kung, P. et al., Science 206 (1979) 347-349; Salmeron, A. et al., J Immunol 147 (1991) 3047-3052）、抗体ＵＣＨＴ１（例えば、Callard, R.E. et al., Clin Exp Immunol 43 (1981) 497-505）又は抗体ＳＰ３４（例えば、Pessano, S. et al., EMBO J 4 (1985) 337-344）などが当技術分野で知られている。これらから、見た目上抗体ＳＰ３４のみが、ヒト カニクイザル交差反応性である（Conrad M.L., et. al., Cytometry A 71 (2007) 925-933）。

【0007】

国際公開第２００７／０４２２６１号は、交差種特異的抗体を含む組成物及びその使用を報告している。Soo Young Yang, et al., LN USA 137 (1986) 1097-1100において、ＣＤ３−Ｔｉ系複合体及びＣＤ２ヒツジ赤血球受容体の決定基の両方を含む、Ｔリンパ球の活性化のための共通の経路が報告されている。国際公開第２０１２／１５８８１８号は、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質及び使用方法を報告する。ＤＤ２７２４７３は、ヒトＴリンパ球のＣＤ３抗原のイプシロン鎖に対するモノクローナル抗体の産生のための方法が報告されている。

【0008】

発明の要旨
本明細書では、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生するための方法及びその使用を提供する。

【0009】

非ヒト実験動物をカニクイザル抗原のみで免疫することにより、すなわちヒトホモログで前又は後で実験動物を免疫しないでヒト カニクイザル交差反応性抗体を得ることができることが見いだされている。

【0010】

本明細書で報告される一態様は、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する／生成する／得るための唯一の抗原として、天然型カニクイザル抗原で非ヒト実験動物を免疫する工程を含む方法の使用である。

【0011】

一実施態様において、天然型カニクイザル抗原は、対応するヒト抗原に存在している一以上の（連続する）アミノ酸ストレッチを欠いており、対応するヒト抗原における、欠いている（連続する）アミノ酸ストレッチの一つが、ヒト抗原の主要免疫原性部位／エピトープである。一実施態様において、（天然型カニクイザル）抗原はＣＤ３イプシロンであり、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は配列番号０２の（天然型）ヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合する。一実施態様において、非ヒト実験動物は、初代カニクイザルＰＢＬで１回以上免疫され、それによりＰＢＬは（任意選択的に）Ｔ細胞について濃縮される。一実施態様において、免疫化は、第一工程（注射）として皮内投与、第二工程（注射）として筋肉内投与、及び第三段階（注射）として皮下投与を含む。一実施態様において、本方法は、変性剤を使用しない／使用する。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する。

【0012】

本明細書で報告される別の態様は、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生し／生成し／得るために、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せず／使用して、かつ変性剤を使用せず／使用して、非ヒト実験動物を初代カニクイザルＰＢＬで３回免疫し、（任意選択的に）Ｔ細胞について濃縮される工程を含む方法の使用であり、ここで抗体がヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３（例えば、Kung, P. et al., Science 206 (1979) 347-349; Salmeron, A. et al., J Immunol 147 (1991) 3047-3052を参照、抗体ＵＣＨＴ１（例えば、Callard, R.E. et al., Clin Exp Immunol 43 (1981) 497-505を参照）又は抗体ＳＰ３４（例えば、Pessano, S. et al., EMBO J 4 (1985) 337-344を参照）と同じエピトープに結合しない。一実施態様において、本明細書中に報告される抗体は、国際公開第２００７／０４２２６１号において報告された抗体と同じエピトープに結合しない。一実施態様において、本明細書に報告される抗体は、国際公開第２００７／０４２２６１号に報告された抗体と同じエピトープに結合せず、ヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、及び（／又は）ヒトＴ細胞を活性化する。

【0013】

本明細書で報告される別の態様は、唯一の抗原として、天然型カニクイザル抗原で非ヒト実験動物を免疫する工程を含むヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する方法である。

【0014】

一実施態様において、天然型カニクイザル抗原は、対応するヒト抗原に存在している一以上の（連続する）アミノ酸ストレッチを欠いており、対応するヒト抗原における、欠いている（連続する）アミノ酸ストレッチの一つが、ヒト抗原の主要免疫原性エピトープである。一実施態様において、非ヒト実験動物は、初代カニクイザルＰＢＬで１回以上免疫され、それによりＰＢＬは（任意選択的に）Ｔ細胞について濃縮される。一実施態様において、免疫化は、第一工程として皮内投与、第二工程として筋肉内投与、及び第三工程として皮下投与を含む。

【0015】

本明細書に報告される別の態様は、初代カニクイザルＰＢＬで非ヒト実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが（任意選択的に）Ｔ細胞について濃縮される工程を含む、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する方法であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない。

【0016】

本明細書に報告される別の態様は、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する。一実施態様において、本明細書中に報告される抗体は、国際公開第２００７／０４２２６１号において報告された抗体と同じエピトープに結合しない。一実施態様において、本明細書に報告される抗体は、国際公開第２００７／０４２２６１号に報告された抗体と同じエピトープに結合せず、ヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、及び（／又は）ヒトＴ細胞を活性化する。

【0017】

本明細書に報告される別の態様は、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４及び／又は国際公開第２００７／０４２２６１号に報告されている抗体と同じエピトープに結合しない。

【0018】

本明細書に報告される別の態様は、初代カニクイザルＰＢＬで非ヒト実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに／使用して、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが（任意選択的に）Ｔ細胞について濃縮されることにより得ることができる／得られる、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない。一実施態様において、本明細書中に報告される抗体は、国際公開第２００７／０４２２６１号において報告された抗体と同じエピトープに結合しない。一実施態様において、本明細書に報告される抗体は、国際公開第２００７／０４２２６１号に報告された抗体と同じエピトープに結合せず、ヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、及び（／又は）ヒトＴ細胞を活性化する。
発明の詳細な説明

【0019】

Ｔ細胞は、適応免疫応答の重要なエフェクターであり、病原体の排除及び自己免疫疾患における多くの重要な役割を有する。異なる機能を有するＴ細胞の幾つかのサブセットが存在する。

【0020】

Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞の形質細胞及び記憶Ｂ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を支援する。これらの細胞は、それらの表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋ Ｔ細胞としても知られている。Ｔヘルパー細胞は、それらがＡＰＣの表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示されると活性化される。活性化されると、それらは急速に分裂し、活性な免疫応答を調節又は補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。

【0021】

細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞は、それらの表面でＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋ Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩと会合する抗原に結合することによって、それらの標的を認識する。

【0022】

記憶Ｔ細胞は、感染が消散された後も長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同族抗原への再曝露時に、多数のエフェクターＴ細胞に迅速に増殖し、免疫系に過去の感染に対する「記憶」を提供する。記憶細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋の何れかである。

【0023】

以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた調節性Ｔ細胞は、免疫学的耐性の維持に重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の終焉に向かってＴ細胞媒介性免疫を停止し、胸腺において陰性選択の過程を逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

【0024】

ナチュラルキラーＴ細胞は、自然免疫系と適応免疫系を架橋する。ＮＫＴ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞とは異なり、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子によって提示される糖脂質抗原を認識する。一旦活性化されると、これらの細胞は、ヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の両方に起因する機能（すなわち、サイトカイン産生及び細胞溶解／細胞死滅分子の放出）を行うことができる。

【0025】

ＴＣＲとペプチド−ＭＨＣ複合体との相互作用の後、ＴＣＲ共受容体ＣＤ４及びＣＤ８は、ＳｒｃキナーゼＬＣＫをその基質（Veillette et al., 1988, Cell）：ＴＣＲ会合性ＣＤ３及びζ鎖免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）（Artyomov et al., 2010, Proc. Natl Acad. Sci. USA）の近傍への送達を標的化するために重要である。生存する無刺激Ｔ細胞は、シグネチャーチロシン、及びロイシン又はイソロイシン、原形質膜の脂質二重層中に埋め込まれたそれらのＣＤ３εＩＴＡＭの残基を有することが示された。活性化すると、これらの膜貫通ドメインは脂質二重層から放出され、ＬＣＫの基質として利用可能になる（Xu et al., 2008, Cell）。何がＣＤ３イプシロン細胞質ドメインの解離を引き起こすのかは明らかではないが、ＴＣＲ会合における局所脂質環境の過渡的変化（Xu et al., 2008, Cell）、又はペプチド−ＭＨＣ複合体に結合するＴＣＲによるＣＤ３イプシロン鎖に及ぼされるトルクのメカノセンシング（ｍｅｃｈａｎｏ−ｓｅｎｓｉｎｇ）が可能性のある原因として想定されている（Kim et al., 2012, Front. Immunol.）。動力学的分離モデルは、ＴＣＲシグナル伝達が、ＬＣＫが豊富で膜貫通型ホスファターゼＣＤ４５を欠いている脂質膜の領域に分割された結果として引き起こされることを示唆している。

【0026】

ＴＣＲの作動により、ＬＣＫの豊富さとその調節因子の豊富さと位置は、ＬＣＫの標的がリン酸化される程度を決定づける（Lovatt et al., 2006, Mol. Cell. Biol.）。これらの標的は、ＴＣＲ会合ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖及びゼータ鎖のＩＴＡＭの中のチロシン残基及びＳＹＫファミリーキナーゼＺＡＰ７０（７０ｋＤａのゼータ鎖会合プロテインキナーゼ）を含む。結果として、幾つかの主要なシグナル伝達枝が活性化され得る（Acuto et al., 2008, Nature Rev. Immunol.）：細胞接着を促進するインテグリン親和性の上方制御；Ｔ細胞の増殖及び分化に必要な遺伝子の発現に重要な転写因子の核への協調的動員；及びＴ細胞活性化、増殖、接着及びＴ細胞のエフェクターＴ細胞への分化に必須であるアクチン再編成（より詳細については、Brownlie & Zamoyska , 2013, Nat Rev Immunol.を参照）。

【0027】

種々の研究により、ＣＤ３分子がアルファベータＴＣＲの適切な細胞表面発現及び正常なＴ細胞発生にとって重要であることが明らかにされている（Berkhout et al., 1988, J. Biol. Chem.; Wang et al., 1998, J. Exp. Med.; Kappes, 1995, Curr. Opin. Immunol.）。システインリッチなストークは、ＣＤ３二量体化を促進する上で重要な役割を果たすようであるが（Su, loc. cit., Borroto, 1998, J. Biol. Chem.）、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ｅ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤｓ）及びＣＤ３γは、これらのタンパク質のＴＣＲβとの会合に十分である（Manolios, 1994, Eur. J. Immunol.; Manolios & Li, 1995, Immunol. Cell Biol.）。ＴＣＲの化学量論は、１つのアルファベータＴＣＲ、１つのＣＤ３イプシロンガンマヘテロ二量体、１つのＣＤ３イプシロンデルタヘテロ二量体及び１つのＣＤ３ゼータゼータホモ二量体を恐らく含む。免疫応答におけるヒトＣＤ３イプシロンガンマヘテロ二量体の中心的役割を考慮して、治療抗体ＯＫＴ３に結合したこの複合体の結晶構造は解明されている（Kjer-Nielsen, 2004, PNAS）。

【0028】

多くの治療戦略は、ＴＣＲシグナル伝達を標的とすることによって、特に臨床的に使用される抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体によってＴ細胞免疫を調節する。動物研究は、抗ＣＤ３抗体が同種異系移植に対する耐性を誘導することを示し（Nicolls et al., 1993）、ＣＤ３イプシロンに対する抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３は、拒絶反応の予防及び治療のための固形臓器移植において免疫抑制の誘導のためにヒトにおける使用が臨床的に承認されている（Norman 1995）。興味深いことに、Ｉ型糖尿病に対する感受性はＣＤ３イプシロン遺伝子座に関連しており（Wong et al., 1991）、抗ＣＤ３抗体はＩ型糖尿病及び他の自己免疫疾患の症状を改善することが示されている（Sprangers et al., 2011）。ＣＤ３特異的抗体（Tunnacliffe, 1989, Int. Immunol.）は、リンホカイン産生（Von Wussow, 1981, J. Immunol.; Palacious, 1982, J. Immunol.）、増殖（Van Wauve, 1980, J. Immunol.）及びサプレッサー−Ｔ細胞誘導（Kunicka, 1986, in "Lymphocyte Typing II"）などの様々なＴ細胞応答を誘導することができる。実験条件に依存して、ＣＤ３特異的モノクローナル抗体は、細胞傷害性を阻害するか又は誘導することができる（Leewenberg, 1985, J. Immunol.; Phillips, 1986, J . Immunol.; Platsoucas, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci.; Itoh, 1987, Cell. Immunol.; Mentzer, 1985, J. Immunol.; Landegren, 1982, J. Exp. Med.; Choi, 2001, Eur. J. Immunol.; Xu, 2000, Cell Immunol.; Kimball, 1995, Transpl. Immunol.）。

【0029】

幾つかの研究は、最も広く使用されているＣＤ３イプシロンモノクローナル抗体ＯＫＴ３、ＷＴ３１、ＵＣＨＴ１，７Ｄ６及びＬｅｕ−４は、ＣＤ３−イプシロン鎖で一度トランスフェクトされた細胞に結合しないことを報告している。しかし、これらの抗体は、ＣＤ３イプシロン＋ＣＤ３ガンマ又はＣＤ３デルタの何れかの組み合わせで二重にトランスフェクトされた細胞を染色した（Tunnacliffe, 1989, Int. Immunol.; Law, 2002, Int. Immunol.; Salmeron, 1991, J. Immunol.; Coulie, 1991, Eur. J. Immunol.）。２番目のより小さいグループでは、立体構造エピトープがＣＤ３イプシロンサブユニットそれ自体の内に形成されている。このグループのメンバーは、例えば、変性型ＣＤ３イプシロンに対して産生されたｍＡｂ ＡＰＡ１／１である（Risueno, 2005, Blood）。まとめると、当技術分野において記載されているＣＤ３イプシロン抗体の大部分は、ＣＤ３の二以上のサブユニットに位置する立体構造エピトープを認識し、従って、ＴＣＲの天然型の状況においてＣＤ３イプシロンのみを認識する。

【0030】

種特異性は、ヒト疾患の治療のための治療剤としての抗体の開発に対して大きな障害である。市場の承認を得るためには、何れの新規候補薬物も前臨床及び臨床段階を通過しなければならない。後者はヒト患者で実施されるが、前者は動物で実施される。前臨床試験の目的は、薬物候補が所望の活性を有し、かつ最も重要なことは安全であることを証明することである。動物における安全性及び薬物候補の潜在的な有効性が前臨床試験で確立された場合にのみ、この薬物候補はヒトにおける臨床試験について各規制当局によって承認される。チンパンジーは絶滅の危機に瀕していると考えられており、及び、そのヒトのような性質のために、薬物安全性試験のためのそのような動物の使用は、欧州では禁止されており、他の地域では非常に制限されているので、好ましくは、カニクイザルのような下等霊長類が免疫系を妨害する薬物候補の安全性試験に使用される。

【0031】

多くのＣＤ３抗体が種特異的であることが見出されている。最も広く使用され、かつ最も特徴付けられた、ＣＤ３複合体に特異的なモノクローナル抗体の１つはＯＫＴ−３である。この抗体は、マカク（例えば、カニクイザル）又はイヌＣＤ３（Sandusky et al., 1986, J. Med. Primatol.）などの他の霊長類のＣＤ３ホモログとは反応しないが、チンパンジーＣＤ３と反応する。抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＵＣＨＴ−１はまた、チンパンジーからのＣＤ３と反応するが、マカクからのＣＤ３とは反応しない。一方、マカク抗原を認識するが、抗体ＦＮ１８のようなそれらのヒト対応物は認識しないモノクローナル抗体の例もある。

【0032】

上記のように、ＣＤ３複合体のサブユニットであるＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ｅ）を介してヒトＴ細胞に結合して活性化する利用可能な抗体が幾つか存在する：ＯＫＴ３（Kung et al., 1979, Science; Salmeron et al., 1991, J Immunol）、ＵＣＨＴ１（Callard et al., 1981, Clin Exp Immunol）、その誘導体Ｖ９（Zhu & Carter, 1995, J Immunol）及びＳＰ３４（Pessano et al., 1985, EMBO J）。ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１（＝誘導体Ｖ９）は、カニクイザルＴ細胞に対して交差反応性ではない。カニクイザルＴ細胞に結合して活性化する唯一の抗体はＳＰ３４抗体であるように見える（Conrad et al., 2007, Cytometry A）。

【0033】

適切な抗体の生成は、例えば、組換え発現されたＣＤ３ｅが人工的なコンフォメーションを有するホモ二量体を形成するので、天然型コンフォメーションを有する組換え単量体ＣＤ３ｅを得ることが困難であるという事実により大きく妨げられている（Su et al., 2009, Int J Mol Med）。更に、ＣＤ３ｅ内の小胞体の保持シグナルは細胞内蓄積を引き起こし、その結果、ＣＤ３ｅは細胞内に組換え発現されると細胞表面に到達しない（Brodeur et al., 2009, Int Immunol）。更に悪いことに、細胞内の尾部において高度に荷電したアミノ酸も、細胞内及び細胞上における適切な組換え発現を妨げる（Call & Wucherpfennig 2005, Annu Rev Immunol）。

【0034】

更に、７２％同一性アミノ酸であるヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロンＥＣＤの低い配列類似性は、機能的なヒト カニクイザル交差反応性抗体を生成することを非常に困難にさせる。

【0035】

本発明は、少なくとも部分的には、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、非ヒト実験動物をカニクイザル抗原のみで免疫することにより、すなわち実験動物をヒトホモログにより前又はその後に免疫することなく得ることができるという知見に基づいている。当業者は、実験動物としてのカニクイザルを免疫することは、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を得るためには適切ではない、すなわち非ヒト実験動物も非カニクイザル実験動物であることを理解している。

【0036】

従って、本明細書で報告される一態様は、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生するための唯一の抗原として、天然型カニクイザル抗原で実験動物を免疫する工程を含む方法である。一実施態様において、天然型カニクイザル抗原は、対応するヒト抗原に対して８０％未満の配列同一性を有する。一実施態様において、天然型カニクイザル抗原は、対応するヒト抗原に対して８０％から６０％の配列同一性を有する。一実施態様において、天然型カニクイザル抗原は、対応するヒト抗原に対して８０％から７０％の配列同一性を有する。

【0037】

ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、ヒト抗原において高度に免疫原性であるアミノ酸ストレッチが免疫化のために回避される場合に得られることが見出されている。一実施態様において、天然型カニクイザル抗原は、対応するヒト抗原に存在している一以上の（連続する）アミノ酸ストレッチを欠いており、対応するヒト抗原における、欠いている（連続する）アミノ酸ストレッチの一つが、ヒト抗原の主要免疫原性エピトープである。

【0038】

一実施態様において、天然型カニクイザル抗原はＴ細胞抗原である。一実施態様において、天然型カニクイザル抗原はＣＤ３イプシロンである。一実施態様において、天然型カニクイザル抗原はＣＤ３イプシロンであり、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は配列番号０２の（天然型）ヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチド（ＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶ）に特異的に結合する。

【0039】

一実施態様において、実験動物は、初代カニクイザルＰＢＬで１回以上免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される。一実施態様において、実験動物は、初代カニクイザルＰＢＬで３回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される。

【0040】

Ｔ細胞を活性化するヒト カニクイザル交差反応性抗体は、その本来の形態である、すなわち変性されていない抗原で実験動物を免疫することによって生成され得ることが見出されている。従って、一実施態様において、本方法は変性剤を使用しない。一実施態様において、本方法は完全フロイントアジュバントを使用しない。

【0041】

本明細書に記載の方法により、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、更にＴ細胞を活性化することができるヒト カニクイザル交差反応性抗体が見出された。Ｔ細胞活性化は、カルシウムフラックスアッセイを用いて示すことができる。従って、一実施態様において、本明細書に報告されるヒト カニクイザル交差反応性抗体は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する。

【0042】

本明細書に報告される一態様は、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生するために、初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮される工程を含む方法であり、ここで抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する。

【0043】

本明細書に報告される別の態様は、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生するために、初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮される工程を含む方法であり、ここで抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない。更に、抗体はまた国際公開第２００７／０４２２６１号において報告された抗体と同じエピトープに結合しない。

【0044】

本明細書に報告される別の態様は、以下の工程を含む、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生するための方法である：
ａ）本明細書に報告される方法を用いてヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する工程、
ｂ）工程ａ）で産生された抗体をコードする核酸を含む細胞を提供する工程、
ｃ）工程ｂ）の細胞を培養する工程、
ｄ）細胞又は培養上清から抗体を回収する工程、
及び、それによりヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生する工程。

【0045】

本明細書に報告される別の態様は、以下の工程を含む、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生するための方法である：
ａ）本明細書に報告される方法を用いて抗体を産生する工程、
ｂ）工程ａ）で産生された抗体をコードする核酸を単離する工程、
ｃ）任意選択的に抗体をヒト化する工程、
ｄ）工程ｂ）で単離された、又は工程ｃ）で得られた抗体をコードする核酸を発現ベクターにクローニングする工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた発現ベクターで細胞をトランスフェクトする工程、
ｆ）工程ｅ）の細胞を培養する工程、
ｇ）細胞又は培養上清から抗体を回収する工程、
及び、それによりヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生する工程。

【0046】

本明細書に報告される別の態様は、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する。

【0047】

本明細書に報告される更なる態様は、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない。

【0048】

一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）配列番号０６から配列番号０８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号０４から配列番号０５からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０６から配列番号０８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号１０から配列番号１１からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、配列番号１４のＶＨ配列を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、配列番号１５のＶＬ配列を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列を含む。

【0049】

本明細書に報告される一態様は、本明細書に報告されるヒト カニクイザル交差反応性抗体及び細胞障害剤を含むイムノコンジュゲートである。

【0050】

本明細書に報告される一態様は、本明細書に報告されるヒト カニクイザル交差反応性抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的製剤である。

【0051】

本明細書で報告される一態様は、唯一の抗原として、天然型カニクイザル抗原で実験動物を免疫する工程を含む方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体である。

【0052】

本明細書に報告される一態様は、初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮されることにより得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する。

【0053】

本明細書に報告される一態様は、初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮されることにより得ることができる、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない。

【0054】

当業者は、カニクイザル由来の抗原を使用する場合、実験動物は免疫応答を得るために非カニクイザルの実験動物でなければならないという事実を認識している。
定義

【0055】

本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に配列が同一である。

【0056】

用語「抗ＣＤ３イプシロン抗体」及び「ＣＤ３イプシロンに結合する抗体」は、抗体がＣＤ３イプシロンを標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＣＤ３イプシロンに結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＣＤ３イプシロン抗体の、無関係な、非ＣＤ３イプシロンタンパク質への結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３イプシロンへの抗体のＥＴＢＲへの結合の約１０％未満である。

【0057】

「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」又は「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＳＰＲ）で決定された１０^−５Ｍ未満のＫ_Ｄ値（Ｍ＝ｍｏｌ／ｌ）（例えば、１０^−６Ｍ）を有する抗原への抗体の結合を指す。

【0058】

本明細書で使用する用語「ヒトＣＤ３イプシロン」は、ヒトＣＤ３イプシロンの全長アミノ酸配列の細胞外ドメイン、すなわちシグナル配列、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインを含まず、アミノ酸配列ＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤ（配列番号０２）を有する。

【0059】

本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。

【0060】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。

【0061】

用語「ヒト カニクイザル交差反応性抗体」は、ヒト抗原ならびに対応するカニクイザル抗原に特異的に結合する分子を指す。

【0062】

本明細書で報告されるＣＤ３イプシロンに結合する抗体と同じエピトープに結合する抗体は、例えば、Ｘ線結晶学又はペプチドスキャンにより決定されたＣＤ３イプシロンの同じアミノ酸残基に結合／相互作用する抗体を指す。

【0063】

用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。

【0064】

抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩＧＡ_１、及びＩｇＡ_２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0065】

本明細書で使用される場合の用語「細胞傷害性薬物」は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。

【0066】

「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体Ｆｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。

【0067】

薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、例えば、所望の治療的又は予防的結果を達成するために、必要な用量及び期間で有効な量を指す。

【0068】

用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在してなくともよい。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。

【0069】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、高頻度可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。

【0070】

用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

【0071】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は、親細胞と、核酸含有物において完全に同一ではなく、変異を含む場合もある。元来の形質転換細胞において、スクリーニング又は選択された場合に、同様の機能又は生物活性を有する変異子孫がここに含まれる。

【0072】

「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0073】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからなされる。一般的には、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のKabat et al.にあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のKabat et al.にあるサブグループＩＩＩである。

【0074】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。

【0075】

本明細書で用いられる「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に既定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域及び／又は抗原に接触する残基（「抗原コンタクト（ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｔａｃｔ）」を含有する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般的に、抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計六つのＨＶＲを含む。

【0076】

本明細書において、例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲのアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ。

【0077】

特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。

【0078】

「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。

【0079】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」なる修飾語句は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック実験動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

【0080】

本明細書で使用する「末梢血リンパ球」又は「ＰＢＬ」という用語は、臓器（脾臓又はリンパ節など）に局在化するのではなく、血液中を循環する成熟リンパ球を意味する。ＰＢＬは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞を含む。

【0081】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書において、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。

【0082】

アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。

【0083】

用語「薬学的製剤」は、その中に含有されている活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であって、製剤が投与される被験体にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。

【0084】

「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。

【0085】

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007)、91頁を参照）。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。更に、ある特定の抗原に結合する複数の抗体を、その抗原に特異的に結合するある一つの抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照。

【0086】

本明細書で使用される用語「ベクター」は、結合する別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように結合されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と言う。

【0087】

Ａ．例示的な抗ＣＤ３イプシロン抗体
一態様において、本発明は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロンに結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様において、抗ＣＤ３イプシロン抗体は
・配列番号０１のポリペプチドに結合し、及び／又は
・ヒト（配列番号０２）及びカニクイザル（配列番号２８）のＣＤ３イプシロンのＥＣＤに結合し、及び／又は
・ヒト及び／又はカニクイザルＴ細胞を活性化し、及び／又は
・ＣＤ３イプシロンのアゴニストであり、及び／又は
・その抗原に対して≦１０μＭの親和性で結合する。

【0088】

一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）配列番号０６から配列番号０８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号０４から配列番号０５からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０６から配列番号０８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号１０から配列番号１１からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、配列番号１４のＶＨ配列を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、配列番号１５のＶＬ配列を含む。一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列を含む。

【0089】

更なる実施態様において、上記実施態様の何れかに記載の抗ＣＤ３イプシロン抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。

【0090】

一実施態様において、抗ＣＤ３イプシロン抗体は抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）_２断片である。

【0091】

別の実施態様において、抗体は全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又は本明細書で定義される他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。

【0092】

更なる実施態様において、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様の何れかに記載の抗ＣＤ３抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる：

【0093】

１．抗体親和性
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、≦１００μＭ又は≦１０μＭ（例えば、１０^−５Ｍ又はそれ未満）の解離定数（Ｋｄ）を有する。

【0094】

別の実施態様によれば、ＣＭ４チップ上の固定化抗原により、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いてＫｄ値を測定する。例えば、捕捉系（１０μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ断片特異的；注文コード：１１１−００５−０４６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の約２０００共鳴単位（ＲＵ）をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを用いてｐＨ５．０でＣＭ４チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００５−３４）に結合させる。固定化のためのランニング緩衝液は、ＨＢＳ−Ｎ ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００６−７０）であった。追跡される動力学アッセイのために、ランニング及び希釈緩衝液はＨＢＳ−Ｐ ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００６−７１）である。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回刺激する。クローン６４５抗体は、１μｇ／ｍｌの溶液を１０μｌ／分の流速で６０秒間注入することによって捕捉する。会合は、溶液中の様々な濃度のヒトＣＤ３ｅ（ストーク）Ｆｃ−Ｋｎｏｂ−ＣＤ３ｄ（ストーク）ＦｃＨｏｌｅ又はカニクイザルＣＤ３ｅ（ストーク）Ｆｃ−Ｋｎｏｂ−ＣＤ３ｄ（ストーク）ＦｃＨｏｌｅの注入を、１３５０ｎＭで開始し、続いて１回１：１．５希釈し、更に１：３希釈して、３０μｌ／分の流速で１８０秒間の注入によって測定される。解離相を最高３００秒間モニターし、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによってトリガーする。表面を、１０μｌ／分の流速で６０秒間、グリシンｐＨ１．７溶液の２回の連続注入で洗浄することによって再生する。バルク屈折率の差は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ表面から得られた応答を差し引くことによって補正する。ブランク注入もまた減算される（＝ダブルリファレンス）。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋ_ｏｎ）と解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として算出する。例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照。

【0095】

２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。

【0096】

ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第０４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134;及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)に記載されている。

【0097】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照）。

【0098】

抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。

【0099】

３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

【0100】

ある実施態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したままヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。

【0101】

ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に総説され、更に、 Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号； Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及び Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。

【0102】

ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al.,J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒトの生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を参照）を含む。

【0103】

４．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。

【0104】

ヒト抗体は、抗原投与に応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック実験動物に、免疫原を投与することにより調製され得る。このような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは該動物の染色体にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の報告については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。

【0105】

ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の製造のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株が記述されている。（例えば、 Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005；Brodeur, B.R. et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; and Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95)；及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されたヒト抗体はまた、Li, J. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191に記載されている。

【0106】

ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。このような可変ドメイン配列は、次いで所望のヒト定常ドメインと組み合わされてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に記載される。

【0107】

５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、一又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなラリーをスクリーニングするために、当技術分野で知既知である。その方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に概説され、更に、McCafferty, J. et al., Nature348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に記載されている。

【0108】

所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片の何れかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。

【0109】

最後に、ナイーブなライブラリーはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の非再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを説明している特許公報は、例えば米国特許第５７５０３７３号並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、及び第２００９／０００２３６０号を含む。

【0110】

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。

【0111】

６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＣＤ３イプシロンに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。特定の実施態様において、二重特異性抗体は、ＣＤ３イプシロンの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＣＤ３イプシロンを発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。

【0112】

多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照）及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照）；二重特異性抗体断片をするため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照）；及び、例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することができる。

【0113】

「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。

【0114】

本明細書中の抗体又は断片はまた、ＣＤ３イプシロン並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。

【0115】

本明細書中の抗体又は抗体断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載される多重特異性抗体を含む。

【0116】

７．抗体変異体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような修飾は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。

【0117】

ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の目的の部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。例示的な変更は、「例示的置換」と題して表１に示され、アミノ酸側鎖のクラスを参照して下記に更に説明される。保存的置換は、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。

【0118】

アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．

【0119】

非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。

【0120】

置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0121】

改変（例えば、置換）を、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築され再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、該ライブラリーは、所望の親和性を持つ任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が多くの場合標的とされる。

【0122】

ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列のある実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。

【0123】

突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が該アミノ酸位に導入されて、最初の置換に対する機能的感受性を実証してもよい。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。

【0124】

アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。

【0125】

ｂ）グリコシル化変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。グリコシル化部位の抗体への付加又は欠失は、一又は複数のグリコシル化部位が創出又は削除されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成することができる。

【0126】

抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に付着した分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。

【0127】

一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着している全ての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７とはＦｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた抗体のわずかな配列変異に起因して、２９７位のおよそ±３アミノ酸上流又は下流に、すなわち２９４位から３００位に位置する場合もある。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；米国特許第２００４／００９３６２１号を参照。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞など（例えば、Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。

【0128】

抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。そのような抗体変異体は、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。このような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号；米国特許第６６０２６８４号；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記述される。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号；国際公開第１９９８／５８９６４号；及び国際公開第１９９９／２２７６４号に記述される。

【0129】

ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置でアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含みうる。

【0130】

ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照）；米国特許第５８２１３３７号（Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりに、又は更に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されている動物モデルなどの動物モデルで評価しうる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、従ってＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボでのクリアランス／半減期の測定は、当該分野で公知の方法を用いても行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769を参照）。

【0131】

エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二以上において置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。

【0132】

ＦｃＲへの改善又は減少した結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。

【0133】

ある実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。

【0134】

幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に説明される。

【0135】

増加した半減期を有し、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を有するものが含まれる。

【0136】

Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及びＦｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。

【0137】

ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の一以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それにより抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中で更に記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、以下の残基の任意の一以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号づけ）；重鎖のＡ１１８（ＥＵの番号づけ）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵの番号づけ）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。

【0138】

ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な付加的な非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。

【0139】

その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。

【0140】

組換え法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ３イプシロン抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしうる。更なる実施態様では、そのような核酸を含む一又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様では、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクターと、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＣＤ３イプシロン抗体を作製する方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。

【0141】

抗ＣＤ３イプシロン抗体の組み換え生産のために、例えば上述のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために、一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。

【0142】

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片の発現を記述しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, 248巻、Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003)、頁245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。

【0143】

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照。

【0144】

グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。

【0145】

植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照。

【0146】

脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合した哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載される２９３又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨｅＬａ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ⁻ ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照。

【0147】

薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＣＤ３イプシロン抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容可能な一以上の担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容可能な担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容可能な担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒｈｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。

【0148】

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。

【0149】

本明細書中の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。

【0150】

活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に、封入され得る。これらの技術は、RemingtonのPharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。

【0151】

徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。

【0152】

インビボ投与に使用される製剤は、一般に滅菌である。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を介した濾過によって、容易に達成され得る。

【0153】

Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＣＤ３イプシロン抗体は、当技術分野で周知の種々のアッセイによって同定され、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ又は特徴付けされうる。

【0154】

１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。

【0155】

別の態様では、競合アッセイを使用して、ＣＤ３イプシロンへの結合についてクローン６４５によって産生される抗体と競合する抗体を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、クローン６４５によって産生された抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)に提供されている。

【0156】

例示的競合アッセイでは、固定化ＣＤ３イプシロンは、ＣＤ３イプシロンに結合する第一の標識抗体（例えば、クローン６４５によって産生される抗体）と、ＣＤ３イプシロンへの結合について第一の抗体と競合する能力について試験される第二の標識化されていない抗体を含む溶液中においてインキュベートされる。第二の抗体はハイブリドーマ上清に存在してもよい。対照として、固定化ＣＤ３イプシロンが、第一の標識された抗体を含むが第二の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のＣＤ３イプシロンへの結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化されたＣＤ３イプシロンに結合した標識の量が測定される。固定化ＣＤ３イプシロンに結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体がＣＤ３イプシロンへの結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照。

【0157】

２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗ＣＤ３イプシロン抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、Ｔ細胞の活性化を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。

【0158】

ある実施態様では、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。抗ＣＤ３イプシロン抗体の機能活性を試験するために、ＣＤ３陽性（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１）及びＣＤ３陰性（Ｊｕｒｋａｔ ＲＴ３−Ｔ３．５）ヒトＴ細胞株を用いたカルシウムフラックスアッセイを使用することができる。従って、例えば、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞又はＣＤ３陰性Ｊｕｒｋａｔ ＲＴ３−Ｔ３．５を、ウェルあたり５０μｌの無血清培地（ＲＰＭＩ １６４０／２ｍＭのグルタミン／１ｍＭのピルビン酸ナトリウム／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／０．１ｍＭのＮＥＡＡ中２００，０００細胞で黒壁透明底９６ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）中に播種する。細胞にカルシウム感受性色素（ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｃａｌｃｉｕｍ ５ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）をロードする。色素の貯蔵溶液を製造業者の指示に従って調製する。使用直前にプロペネシドを添加し、５０μｌ／ウェルの希釈色素を細胞に添加する（プロベネシドの最終濃度は２．５ｍＭ／ウェルであろう）。効率的なローディングのために、細胞を暗所で室温で２時間色素と共にインキュベートする。続いて、２０μｌのウサギ抗ＣＤ３イプシロンｍＡｂ（ウサギＢ細胞上清）又はキメラＶ９ｍＡｂ、ウサギ免疫グロブリン定常領域及びヒト化抗ＣＤ３ ｍＡｂ Ｖ９の可変領域からなるキメラ抗ＣＤ３抗体の連続希釈物を添加することによって細胞を刺激する。非特異的ポリクローナルウサギＩｇＧは陰性対照として役割を果たす。抗ＣＤ３イプシロン誘導カルシウムフラックスの動力学を、３０秒の時間間隔で７．５−１０分間、蛍光（４８５ｎｍ ｅｘ．／５３０ｎｍ ｅｍ．）を測定することによってモニターする。キメラＶ９ ｍＡｂによって誘導されたカルシウムフラックスを図６Ａに示す。キメラＶ９ ｍＡｂは、ＣＤ３陰性Ｊｕｒｋａｔ ＲＴ３−Ｔ３．５細胞においてではなく、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞においてのみカルシウム動員を誘導し、その作用のＣＤ３依存性を実証する。同様に、細胞を非特異的ウサギＩｇＧで処理する場合、カルシウムフラックスは観察されない。

【0159】

Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＣＤ３イプシロン抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0160】

一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許第０４２５２３５（Ｂ１）号を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号及び第５７８０５８８号及び第７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、米国特許第５７１４５８６号、米国特許第５７３９１１６号、米国特許第５７６７２８５号、米国特許第５７７０７０１号、米国特許第５７７０７１０号、米国特許第５７７３００１号、及び米国特許第５８７７２９６号を参照；Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342；及びLode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928）；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。

【0161】

他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含む（ただし、これらに限定されない）酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしている、本明細書に記載の抗体を含む。

【0162】

他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載の抗体を含む。種々の放射性同位体が、放射性コンジュゲートの製造のために入手可能である。例としては、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、それは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ^９９ｍ又はＩ^１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても周知）用のスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。

【0163】

抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダート ＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104に記載されるように、リシンイムノトキシンを調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。

【0164】

本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。

【0165】

Ｅ．診断及び検出のための方法並びに組成物
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗ＣＤ３イプシロン抗体のいずれもが、生物学的試料中の抗ＣＤ３イプシロンの存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出（する）」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的試料は、細胞又は組織、例えば血液などを含む。

【0166】

一実施態様では、診断又は検出方法に使用される抗ＣＤ３イプシロン抗体が提供される。更なる態様では、生物学的試料中におけるＣＤ３イプシロンの存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、本方法は、抗ＣＤ３イプシロン抗体のＣＤ３イプシロンへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＣＤ３イプシロン抗体と生物学的試料を接触させること、及び複合体が抗ＣＤ３イプシロン抗体とＣＤ３イプシロンとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばＣＤ３イプシロンが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＣＤ３イプシロン抗体が抗ＣＤ３イプシロン抗体による治療に好適な被験体を選択するために使用される。

【0167】

本発明の抗体を用いて診断され得る典型的な障害はがんを含む。

【0168】

ある実施態様において、標識された抗ＣＤ３イプシロン抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。

【0169】

Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＣＤ３イプシロン抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容可能な一以上の担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容可能な担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容可能な担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒｈｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。

【0170】

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。

【0171】

本明細書中の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。

【0172】

活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に、封入され得る。これらの技術は、RemingtonのPharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。

【0173】

徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。

【0174】

インビボ投与に使用される製剤は、一般に滅菌である。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を介した濾過によって、容易に達成され得る。

【0175】

Ｇ．治療法及び組成物
本明細書で提供される抗ＣＤ３イプシロン抗体の何れかを、治療方法で使用することができる。

【0176】

一態様では、医薬として使用するための抗ＣＤ３イプシロン抗体が提供される。更なる態様では、がんの治療に使用するための抗ＣＤ３イプシロン抗体が提供される。ある実施態様において、治療の方法に使用される抗ＣＤ３イプシロン抗体が提供される。ある実施態様において、本発明は、個体に抗ＣＤ３イプシロン抗体の有効量を投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法における使用のための抗ＣＤ３イプシロン抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも一の付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、Ｔ細胞を活性化することに使用のための抗ＣＤ３イプシロン抗体を提供する。ある実施態様において、本発明は、個体にＴ細胞を活性化するための抗ＣＤ３イプシロン抗体の有効量を投与することを含む、Ｔ細胞を活性化する方法において使用のための抗ＣＤ３イプシロン抗体を提供する。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。

【0177】

更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＣＤ３イプシロン抗体の使用を提供する。一実施態様において、医薬品はがんの治療のためのものである。更なる実施態様において、医薬は、がんを有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、がんを治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、この方法は少なくとも一の付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、医薬はＴ細胞の活性化のためのものである。更なる実施態様にて、医薬は、Ｔ細胞を活性化するために医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体においてＴ細胞を活性化する方法において使用するためのものである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。

【0178】

更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供される抗ＣＤ３イプシロン抗体の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＣＤ３イプシロン抗体の何れか、及び薬学的に許容可能な担体を含む。別の実施態様において、薬学的製剤は、本本明細書で提供される抗ＣＤ３イプシロン抗体の何れか、及び少なくとも一の付加的治療剤を含む。

【0179】

本発明の抗体は、治療において、単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも一の付加的治療剤と共投与されうる。

【0180】

上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の抗体はまた放射線治療と併用して用いることができる。

【0181】

本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、及び鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。

【0182】

本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この文脈における考慮因子としては、治療すべき具体的な障害、治療すべき具体的な哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。抗体は、必要ではないが任意選択的に、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。

【0183】

疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の所望される抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が抗体の約２投与量から約２０投与量、又は例えば約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。

【0184】

上記の製剤又は治療方法の何れかが、抗ＣＤ３イプシロン抗体の代わりか又は抗ＣＤ３イプシロン抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。

【0185】

ＩＩＩ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属する添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示す添付文書を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。

【0186】

上記の製造品の何れかは、抗ＣＤ３イプシロン抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。

【0187】

本発明の特定の実施態様
１．ヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生するための唯一の抗原として、天然型カニクイザル抗原で実験動物を免疫する工程を含む方法の使用。

【0188】

２．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％未満の配列同一性を有する、実施態様１に記載の使用。

【0189】

３．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％から５０％の配列同一性を有する、実施態様１又は２の何れか一に記載の使用。

【0190】

４．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％から６０％の配列同一性を有する、実施態様１から３の何れか一に記載の使用。

【0191】

５．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％から７０％の配列同一性を有する、実施態様１から４の何れか一に記載の使用。

【0192】

６．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に存在している一以上の（連続する）アミノ酸ストレッチを欠いており、対応するヒト抗原における、欠いている（連続する）アミノ酸ストレッチの一つが、ヒト抗原の主要免疫原性エピトープである、実施態様１から５の何れか一に記載の使用。

【0193】

７．天然型カニクイザル抗原が、Ｔ細胞抗原である、実施態様１から６の何れか一に記載の使用。

【0194】

８．天然型カニクイザル抗原が、ＣＤ３イプシロンである、実施態様１から７の何れか一に記載の使用。

【0195】

９．天然型カニクイザル抗原がＣＤ３イプシロンであり、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は配列番号０２の（天然型）ヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合する、実施態様１から８の何れか一に記載の使用。

【0196】

１０．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで１回以上免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様１から９の何れか一に記載の使用。

【0197】

１１．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで２回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様１から１０の何れか一に記載の使用。

【0198】

１２．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで３回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様１から１１の何れか一に記載の使用。

【0199】

１３．免疫化が、皮内投与、筋肉内投与及び皮下投与を含む、実施態様１から１２の何れか一に記載の使用。

【0200】

１４．免疫化が第一工程として皮内投与、第二工程として筋肉内投与、及び第三工程として皮下投与を含む、実施態様１から１３の何れか一に記載の使用。

【0201】

１５．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで週１回１回以上免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様１から１４の何れか一に記載の使用。

【0202】

１６．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで毎週１回３回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様１０から１５の何れか一に記載の使用。

【0203】

１７．実験動物が（ヒト）トランスジェニック実験動物である、実施態様１から１６の何れか一に記載の使用。

【0204】

１８．実験動物がマウス又はラット又はモルモット又はウサギである、実施態様１から１７の何れか一に記載の使用。

【0205】

１９．実験動物がウサギである、実施態様１から１８の何れか一に記載の使用。

【0206】

２０．実験動物がラットである、実施態様１から１９の何れか一に記載の使用。

【0207】

２１．方法が変性剤を使用しない、実施態様１から２０の何れか一に記載の使用。

【0208】

２２．方法が完全フロイントアジュバントを使用しない、実施態様１から２１の何れか一に記載の使用。

【0209】

２３．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、ヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する、実施態様１から２２の何れか一に記載の使用。

【0210】

２４．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する、実施態様１から２３の何れか一に記載の使用。

【0211】

２５．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンの残基３０から６０からなるポリペプチドに特異的に結合しない、実施形態１から２４の何れか一に記載の使用。

【0212】

２６．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンの残基１から７０からなるポリペプチドに特異的に結合しない、実施形態１から２５の何れか一に記載の使用。

【0213】

２７．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない、実施形態１から２７の何れか一に記載の使用。

【0214】

２８．ヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生するために、初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮される工程を含む方法の使用であり、ここで抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する方法の使用。

【0215】

２９．配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生するために、初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮される工程を含む方法の使用であり、ここで抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない方法の使用。

【0216】

３０．唯一の抗原として、天然型カニクイザル抗原で実験動物を免疫する工程を含むヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する方法。

【0217】

３１．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％未満の配列同一性を有する、実施態様３０に記載の方法。

【0218】

３２．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％から５０％の配列同一性を有する、実施態様３０から３１の何れか一に記載の方法。

【0219】

３３．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％から６０％の配列同一性を有する、実施態様３０から３２の何れか一に記載の方法。

【0220】

３４．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％から７０％の配列同一性を有する、実施態様３０から３３の何れか一に記載の方法。

【0221】

３５．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に存在している一以上の（連続する）アミノ酸ストレッチを欠いており、対応するヒト抗原における、欠いている（連続する）アミノ酸ストレッチの一つが、ヒト抗原の主要免疫原性エピトープである、実施態様３０から３４の何れか一に記載の方法。

【0222】

３６．天然型カニクイザル抗原が、Ｔ細胞抗原である、実施態様３０から３５の何れか一に記載の方法。

【0223】

３７．天然型カニクイザル抗原が、ＣＤ３イプシロンである、実施態様３０から３６の何れか一に記載の方法。

【0224】

３８．天然型カニクイザル抗原がＣＤ３イプシロンであり、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は配列番号０２の（天然型）ヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合する、実施態様３０から３７の何れか一に記載の方法。

【0225】

３９．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで１回以上免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様３０から３８の何れか一に記載の方法。

【0226】

４０．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで２回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様３０から３９の何れか一に記載の方法。

【0227】

４１．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで３回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様３０から４０の何れか一に記載の方法。

【0228】

４２．免疫化が、皮内投与、筋肉内投与及び皮下投与を含む、実施態様３０から４１の何れか一に記載の方法。

【0229】

４３．免疫化が第一工程として皮内投与、第二工程として筋肉内投与、及び第三工程として皮下投与を含む、実施態様３０から４２の何れか一に記載の方法。

【0230】

４４．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで週１回１回以上免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様３０から４３の何れか一に記載の方法。

【0231】

４５．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで毎週１回３回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様３９から４４の何れか一に記載の方法。

【0232】

４６．実験動物がトランスジェニック実験動物である、実施態様３０から４５の何れか一に記載の方法。

【0233】

４７．実験動物がマウス又はラット又はモルモット又はウサギである、実施態様３０から４６の何れか一に記載の方法。

【0234】

４８．実験動物がウサギである、実施態様３０から４７の何れか一に記載の方法。

【0235】

４９．実験動物がラットである、実施態様３０から４８の何れか一に記載の方法。

【0236】

５０．方法が変性剤を使用しない、実施態様３０から４９の何れか一に記載の方法。

【0237】

５１．方法が完全フロイントアジュバントを使用しない、実施態様３０から５０の何れか一に記載の方法。

【0238】

５２．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、ヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する、実施態様３０から５１の何れか一に記載の方法。

【0239】

５３．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する、実施態様３０から５２の何れか一に記載の方法。

【0240】

５４．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンの残基３０から６０からなるポリペプチドに特異的に結合しない、実施形態３０から５３に記載の方法。

【0241】

５５．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンの残基１から７０からなるポリペプチドに特異的に結合しない、実施形態３０から５４の何れか一に記載の方法。

【0242】

５６．ヒト カニクイザル交差反応性抗体が、抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない、実施形態３０から５５の何れか一に記載の方法。

【0243】

５７．初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより初代ヒトＰＢＬを使用せずにＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮され、それにより変性剤を使用せずに免疫原としてＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮される工程を含むヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する方法であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する方法。

【0244】

５８．初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより初代ヒトＰＢＬを使用せずにＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮され、それにより変性剤を使用せずに免疫原としてＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮される工程を含む、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する方法であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない方法。

【0245】

５９．以下の工程：
ａ）実施態様３０から５８の何れか一に記載の方法を用いてヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する工程、
ｂ）工程ａ）で産生された抗体をコードする核酸を含む細胞を提供する工程、
ｃ）工程ｂ）の細胞を培養する工程、
ｄ）細胞又は培養上清から抗体を回収する工程、
及び、それによりヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生する工程
を含む、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生するための方法。

【0246】

６０．以下の工程：
ａ）実施態様３０から５８の何れか一に記載の方法を用いて抗体を産生する工程、
ｂ）工程ａ）で産生された抗体をコードする核酸を単離する工程、
ｃ）任意選択的に抗体をヒト化する工程、
ｄ）工程ｂ）で単離された、又は工程ｃ）で得られた抗体をコードする核酸を発現ベクターにクローニングする工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた発現ベクターで細胞をトランスフェクトする工程、
ｆ）工程ｅ）の細胞を培養する工程、
ｇ）細胞又は培養上清から抗体を回収する工程、
それによりヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生する工程
を含む、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生するための方法。

【0247】

６１．配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する。

【0248】

６２．配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない。

【0249】

６３．抗体が、（ａ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）配列番号０６から配列番号０８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、実施態様６１から６２の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0250】

６４．抗体が、（ａ）配列番号０４から配列番号０５からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０６から配列番号０８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、実施態様６１から６３の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0251】

６５．（ａ）配列番号１０から配列番号１１からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施態様６１から６４の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0252】

６６．抗体が、（ａ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施態様６１から６５の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0253】

６７．一実施態様において、ヒト カニクイザル交差反応性抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む、実施態様６１から６６の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0254】

６８．配列番号１４のＶＨ配列を含む、実施態様６１から６７の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0255】

６９．配列番号１５のＶＬ配列を含む、実施態様６１から６８の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0256】

７０．配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１５のＶＬ配列を含む、ヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0257】

７１．実施態様６１から７０の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体及び細胞障害剤を含むイムノコンジュゲート。

【0258】

７２．実施態様６１から７１の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的製剤。

【0259】

７３．医薬として使用のための実施態様６１から７２の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0260】

７４．抗体が配列番号１４のウサギＶＨ配列のヒト化変異体及び配列番号１５のウサギＶＬ配列のヒト化変異体を含む、実施態様６１から７３の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0261】

７５．抗体が配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、並びに抗体がヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する、実施態様６１から７４の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0262】

７６．抗体が配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、並びに抗体がヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない、実施態様６１から７５の何れか一に記載のヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0263】

７７．唯一の抗原として、天然型カニクイザル抗原で実験動物を免疫する工程を含む方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0264】

７８．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％未満の配列同一性を有する、実施態様７７に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0265】

７９．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％から５０％の配列同一性を有する、実施態様７７から７８の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0266】

８０．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％から６０％の配列同一性を有する、実施態様７７から７９の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0267】

８１．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に対して８０％から７０％の配列同一性を有する、実施態様７７から８０の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0268】

８２．天然型カニクイザル抗原が、対応するヒト抗原に存在している一以上の（連続する）アミノ酸ストレッチを欠いており、対応するヒト抗原における、欠いている（連続する）アミノ酸ストレッチの一つが、ヒト抗原の主要免疫原性エピトープである、実施態様７７から８１の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0269】

８３．天然型カニクイザル抗原が、Ｔ細胞抗原である、実施態様７７から８２の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0270】

８４．天然型カニクイザル抗原が、ＣＤ３イプシロンである、実施態様７７から８３の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0271】

８５．天然型カニクイザル抗原がＣＤ３イプシロンであり、抗体が配列番号０２の（天然型）ヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合する、実施態様７７から８４の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0272】

８６．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで１回以上免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様７７から８５の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0273】

８７．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで２回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様７７から８６の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0274】

８８．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで３回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様７７から８７の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0275】

８９．免疫化が、皮内投与、筋肉内投与及び皮下投与を含む、実施態様７７から８８の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0276】

９０．免疫化が、第一の注入として皮内投与、第二の注入として筋肉内投与及び第三の注入として皮下投与を含む、実施態様７７から８９の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0277】

９１．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで週１回１回以上免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様７７から９０の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0278】

９２．実験動物が、初代カニクイザルＰＢＬで週１回３回免疫され、それによりＰＢＬは任意選択的にＴ細胞について濃縮される、実施態様７７から９１の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0279】

９３．実験動物がトランスジェニック実験動物である、実施態様７７から９２の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0280】

９４．実験動物がマウス又はラット又はモルモット又はウサギである、実施態様７７から９３の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0281】

９５．実験動物がウサギである、実施態様７７から９４の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0282】

９６．実験動物がラットである、実施態様７７から９５の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0283】

９７．方法が変性剤を使用しない、実施態様７７から９６の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0284】

９８．方法が完全フロイントアジュバントを使用しない、実施態様７７から９７の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0285】

９９．抗体が、ヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する、実施態様７７から９８の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0286】

１００．抗体が、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する、実施態様７７から９９の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0287】

１０１．抗体が、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンの残基３０から６０からなるポリペプチドに特異的に結合しない、実施形態７７から１００の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0288】

１０２．抗体が、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンの残基１から７０からなるポリペプチドに特異的に結合しない、実施形態７７から１０１の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0289】

１０３．抗体が、抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない、実施形態７７から１０２の何れか一に記載の方法により得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体。

【0290】

１０４．初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮されることにより得ることができるヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞、配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＴ細胞を活性化する抗体。

【0291】

１０５．初代カニクイザルＰＢＬで実験動物を３回免疫し、それにより、免疫原として初代ヒトＰＢＬを使用せずに、かつ変性剤を使用せずに、ＰＢＬが任意選択的にＴ細胞について濃縮されることにより得ることができる、配列番号０２のヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号０１のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体はヒト及びカニクイザルＴ細胞に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化し、かつ抗体ＯＫＴ３、抗体ＵＣＨＴ１及び／又は抗体ＳＰ３４と同じエピトープに結合しない抗体。

【0292】

以下の実施例、図面及び配列は、本発明の理解を助けるために提供されるが、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順で改変がなされうる。

【0293】

配列の説明
配列番号０１ ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインの残基７７−９６のアミノ酸配列。
配列番号０２ ヒトＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのアミノ酸配列。
配列番号０３ 全長ヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列。
配列番号０４ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｈ１変異体１のアミノ酸配列。
配列番号０５ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｈ１変異体２のアミノ酸配列。
配列番号０６ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｈ２変異体１のアミノ酸配列。
配列番号０７ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｈ２変異体２のアミノ酸配列。
配列番号０８ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｈ２変異体３のアミノ酸配列。
配列番号０９ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｈ３のアミノ酸配列。
配列番号１０ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｌ１変異体１のアミノ酸配列。
配列番号１１ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｌ１変異体２のアミノ酸配列。
配列番号１２ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｌ２のアミノ酸配列。
配列番号１３ 抗体クローン６４５のＨＶＲ−Ｌ３のアミノ酸配列。
配列番号１４ 抗体クローン６４５の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列。
配列番号１５ 抗体クローン６４５の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列。
配列番号１６ ヒトＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１７ Ｆｃ（ホール）のアミノ酸配列。
配列番号１８ カニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１９ ヒトＣＤ３ｅ−ストーク−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２０ ヒトＣＤ３ｄ−ストーク−Ｆｃ（ホール）−Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２１ ヒトＣＤ３ｇＣ８５−ストーク−Ｆｃ（ホール）−Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２２ カニクイザルＣＤ３ｅ ストーク−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２３ カニクイザルＣＤ３ｄ ストーク−Ｆｃ（ホール）−Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２４ ヒトＣＤ３ｅ −１−２６−Ｆｃ（ノブ）Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２５ カニクイザルＣＤ３ｅ ５−２６−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２６ ヒトＣＤ３ｅ ５−２６−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２７ 全長カニクイザルＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列。
配列番号２８ カニクイザルＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸配列。
配列番号２９ カニクイザルＣＤ３イプシロンの残基６９−８８のアミノ酸配列。
配列番号３０ プライマーｒｂＨＣｆｉｎａｌ．ｕｐのヌクレオチド配列。
配列番号３１ プライマーｒｂＨＣｆｉｎａｌ．ｄｏのヌクレオチド配列。
配列番号３２ プライマーｒｂＬＣｆｉｎａｌ．ｕｐのヌクレオチド配列。
配列番号３３ プライマーｒｂＬＣｆｉｎａｌ．ｄｏのヌクレオチド配列。

【図面の簡単な説明】

【0294】

【図1】ヒト及びカニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）融合ポリペプチドの概略図。

【図2】ＳＤＳ−Ｐａｇｅ Ｇｅｌ（複数）：４−１２％ Ｂｉｓ／ＴｒｉｓＡ）１ − Ｍａｒｋ １２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ − ヒトＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）還元型Ｂ）１ − ＨｉＭａｒｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ − ＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）非還元型Ｃ）１ − Ｍａｒｋ １２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ − カニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）還元型；３ − カニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）非還元型；

【図3】Ａ）ヒト及びカニクイザルＣＤ３ｅストークＦｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｄ−ストーク−Ｆｃ（ホール）融合ポリペプチド、Ｂ）ヒトＣＤ３ｅストークＦｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｇＣ８５−ストーク−Ｆｃ（ホール）融合ポリペプチド、Ｃ）ヒトＣＤ３ｅ−１−２６−Ｆｃ（ノブ）Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）、ヒト及びカニクイザルＣＤ３ｅ ５−２６−Ｆｃ（ノブ）Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）融合ポリペプチドの概略図。

【図4】代表的なＳＤＳ−Ｐａｇｅ Ｇｅｌ（複数）：４−１２％ Ｂｉｓ／ＴｒｉｓＡ）１ − Ｍａｒｋ １２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ − ヒトＣＤ３ｅ ストークＦｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｄ−ストーク−Ｆｃ（ホール）還元型；Ｂ）１ − ＨｉＭａｒｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ − ヒトＣＤ３ｅ ストークＦｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｄ−ストーク−Ｆｃ（ホール）非還元型；

【図5】ヒトＴリンパ球の増殖のグラフ表示

【図6】試験した抗体がヒトＴ細胞を活性化する能力を評価するためのカルシウムフラックスアッセイ（９６ウェルフォーマット）Ａ）結合した抗ＣＤ３抗体の架橋を伴わないカルシウムフラックスアッセイＢ）感度を改善するために結合した抗ＣＤ３抗体の架橋を伴うカルシウムフラックスアッセイ

【図7】試験した抗体がヒトＴ細胞を活性化する能力を評価するためのカルシウムフラックスアッセイ（３８４ウェルフォーマット）Ａ）結合した抗ＣＤ３抗体の架橋を伴わないカルシウムフラックスアッセイＢ）感度を改善するために結合した抗ＣＤ３抗体の架橋を伴うカルシウムフラックスアッセイ

【図8】生成したｍＡｂ対抗ＣＤ３対照抗体（ＳＰ３４−２）のヒトＴ細胞への結合の比較

【図9】生成したｍＡｂ対抗ＣＤ３対照抗体（ＳＰ３４−２）のカニクイザルＴ細胞への結合の比較

【0295】

材料及び方法
実施例１
Ａ）第一の免疫化キャンペーンのための組換えヒトＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）及びカニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）の調製
第一の免疫化キャンペーンのために、ＣＤ３ｇ鎖と融合したＣＤ３ｅを含むヒト及びカニクイザル組換えタンパク質が産生された。ヒトＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ（配列番号１６）及びカニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ（配列番号１８）は、グリシン−セリンリンカー（（Ｇ４Ｓ）５）によって連結されているＣＤ３ｅ及びＣＤ３ｇの外部ドメインがＦｃ（ホール）と同時発現されたＣ末端Ａｖｉタグを有するＦｃ（ノブ）に融合した組換えタンパク質である（配列番号１７）（図１）。

【0296】

分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を対応する哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生される。細胞に対応する発現ベクターを１：１の比率（「ベクター抗原−Ｆｃ（ホール）」：「ベクター抗原−Ｆｃ（ノブ）」）でトランスフェクトする。

【0297】

ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、血清を含まないＣＤ ＣＨＯ培養液中で浮遊状態で培養する。５００ｍｌの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に、４００万個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種する。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予熱した２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地と交換する。発現ベクターをＣＤ ＣＨＯ培地２０ｍｌ中で最終量２００μｇのＤＮＡと混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液の添加後、１５秒間ボルテックスし、続いて室温で１０分間インキュベートする。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振とうフラスコに移し、５％ＣＯ_２雰囲気のインキュベーターで３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション時間後、１６０ｍｌのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養する。

【0298】

トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１を添加する。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離による精製のために上清を集め、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを添加し、４℃に保つ。

【0299】

分泌されたタンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製される。

【0300】

アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を４０ｍＭの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードする。非結合タンパク質は、少なくとも１０カラム容量の平衡緩衝液で洗浄することによって除去される。２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０まで２０カラム容積にわたって直線的なｐＨ勾配で標的タンパク質を溶出する。続いて１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０でカラムを洗浄する。

【0301】

０．５Ｍリン酸ナトリウムの１／１０を添加することにより、タンパク質溶液を中和する。標的タンパク質を、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するｐＨ７．４の２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードする前に濃縮する。

【0302】

精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定される。抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー（ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ^ＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による染色によって分析する（図２Ａから２Ｃ）。製造業者の指示（４−１２％トリス−アセテートゲル又は４−１２％ビス−トリス）に従って、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）プレキャストゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用する。抗体試料の凝集物含有量を、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ７．３のランニング緩衝液中、２５℃で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析する。

【0303】

１Ｂ）免疫化から生じるＩｇＧの特徴付けのための組換えヒトＣＤ３ｅ−ストーク−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｄ−ストーク−Ｆｃ（ホール）、ヒトＣＤ３ｅ−ストーク−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｇＣ８５−ストーク−Ｆｃ（ホール）、カニクイザルＣＤ３ｅ ストーク−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｄ−ストーク−Ｆｃ（ホール）、ヒトＣＤ３ｅ−１−２６ − Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）、ヒトＣＤ３ｅ ５−２６ − Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）及びカニクイザルＣＤ３ｅ ５−２６ − Ｆｃ（ノブ）Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）の調製

【0304】

免疫化によって生成されたＣＤ３ｅに対する抗体を特徴付けるために、幾つかの組換えタンパク質が産生された（図３Ａから３Ｃ）。ヒトＣＤ３ｅ−ストーク−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｄ−ストーク−Ｆｃ（ホール）（配列番号１９／配列番号２０）、ヒトＣＤ３ｅ−ストーク−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｇＣ８５−ストーク−Ｆｃ（ホール）（配列番号１９／配列番号２１）及びカニクイザルＣＤ３ｅ ストーク−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３ｄ−ストーク−Ｆｃ（ホール）（配列番号２２／配列番号２３）は、Ｆｃ（ホール）に融合したＣＤ３ｄ又はＣＤ３ｇの何れかの細胞外ドメインと同時発現されたＣ末端Ａｖｉタグを有するＦｃ（ノブ）に融合したストーク領域を含むＣＤ３ｅの完全な外部ドメインを有する組換えタンパク質である。ヒトＣＤ３ｅ−１−２６ − Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）（配列番号２４／配列番号１７）、ヒトＣＤ３ｅ ５−２６ − Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）（配列番号２６／配列番号１７）及びカニクイザルＣＤ３ｅ ５−２６ − Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）（配列番号２５／配列番号１７）はＦｃ（ホール）と同時発現されたＦｃ（ノブ）へのペプチド融合体である。ヒトＣＤ３ｅ−１−２６ − Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）は成熟ＣＤ３ｅの最初の２６アミノ酸を含むが、一方ヒト及びカニクイザルＣＤ３ｅ ５−２６ − Ｆｃ（ノブ）Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）は成熟ＣＤ３ｅのアミノ酸残基５−２６のペプチド融合体である。

【0305】

分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を対応する哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生される。細胞に対応する発現ベクターを１：１の比率（「ベクター抗原−Ｆｃ（ホール）」：「ベクター抗原−Ｆｃ（ノブ）」）でトランスフェクトする。

【0306】

ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、血清を含まないＣＤ ＣＨＯ培養液中で浮遊状態で培養する。５００ｍｌの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に、４００万個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を播種する。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予熱した２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地と交換する。発現ベクターをＣＤ ＣＨＯ培地２０ｍｌ中で最終量２００μｇのＤＮＡと混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液の添加後、１５秒間ボルテックスし、続いて室温で１０分間インキュベートする。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振とうフラスコに移し、５％ＣＯ_２雰囲気のインキュベーターで３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション時間後、１６０ｍｌのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１を添加する。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離による精製のために上清を集め、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを添加し、４℃に保つ。

【0307】

分泌されたタンパク質は、上述されるようにプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製される。

【0308】

精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定される。抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー（ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ^ＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による染色によって分析する。製造業者の指示（４−１２％トリス−アセテートゲル又は４−１２％ビス−トリス）に従って、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）プレキャストゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用する（図３Ａ及び３Ｂ）。抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニンモノヒドロクロライド、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニング緩衝液中、２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析する。

【0309】

更に、以下のヒト及びカニクイザルＣＤ３ｅペプチドが、新規抗体のエピトープの精製のために生成された：
ａ）ビオチン−リンカー−ヒトＣＤ３ｅアミノ酸１−２２
ｂ）ヒトＣＤ３ｅアミノ酸１−２２−リンカー−ビオチン

ｃ）ビオチン−リンカー−カニクイザルＣＤ３ｅアミノ酸１−２２
ｄ）カニクイザルＣＤ３ｅアミノ酸１−２２−リンカー−ビオチン

ｅ）ビオチン−リンカー−ヒトＣＤ３ｅアミノ酸７７−９６（配列番号０１）
ｆ）ヒトＣＤ３ｅアミノ酸７７−９６（配列番号０１）−リンカー−ビオチン

ｇ）ビオチン−リンカー−カニクイザルＣＤ３ｅアミノ酸６９−８８（配列番号２９）
ｈ）カニクイザルＣＤ３ｅアミノ酸６９−８８（配列番号２９）−リンカー−ビオチン

【0310】

これらの４つのペプチドは、（別段の記載がない場合）全ての可能なエピトープへの接近可能性を可能にするために、スクリーニングアッセイにおいて両方の変異体の混合物として使用されるＮ又はＣ末端ビオチンの何れかと共に合成され、例えばビオチン化末端が抗体から１つのエピトープをブロックする場合、同じペプチドの他のビオチン変異体はこの抗体の結合を可能にするであろう。

【0311】

実施例２
ウサギの免疫化
第一の免疫化キャンペーン
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．のＮＺＷウサギを免疫化に使用した。

【0312】

組換えヒト及びカニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉタンパク質を、濃度１ｍｇ／ｍｌのＫ_３ＰＯ_４緩衝液ｐＨ７．０に溶解し、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）と安定したエマルションの生成まで混合（１：１）した。３匹のウサギに、２．４ｍｌのエマルジョンの皮内（ｉ．ｄ．）注射を行い、続いて１週間間隔で各々１．２ｍｌの第２の筋肉内（ｉ．ｍ．）及び第３の皮下（ｓ．ｃ．）注射を行った。３週間後に１．２ｍｌの第４の筋肉内注射を行い、続いて４週間間隔で更に１．２ｍｌの２回の皮下及び筋肉内注射を行った。カニクイザル組換えタンパク質を１回目、２回目、４回目及び６回目に、ヒト組換えタンパク質を３回目及び５回目の免疫化に使用した。

【0313】

各動物の１０ｍｌの末梢全血試料を、３回目、４回目、５回目及び６回目の注射の４日後に収集し、ＦＡＣＳにおける単一細胞選別のために使用した。各動物の更なる０．５ｍｌの血清を同時に収集し、ヒト／カニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ特異的抗体応答の測定に使用した。

【0314】

３匹のウサギの第２群は、上記免疫化スケジュールに従って、４×１０^７の濃縮された初代カニクイザル／ヒトＴ細胞（下記参照）で免疫した。カニクイザルのインビトロで増殖させたＴ細胞を１回目、２回目、４回目及び６回目に使用し、健常ドナーのＰＢＬから濃縮されたヒト初代Ｔ細胞を３回目及び５回目の免疫化に使用した。各動物の１０ｍｌの末梢全血試料を、３回目、４回目、５回目及び６回目の注射の４〜６日後に収集し、ＦＡＣＳにおける単一細胞選別のために使用した。各動物の更なる０．５ｍｌの血清を同時に収集し、ヒト／カニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ特異的抗体応答の測定に使用した。

【0315】

抗体応答
免疫化に対する抗体応答は、Ｍａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）上で１ウェルあたり２．５μｇの組換えヒト／カニクイザルＣＤ３ｇ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ｅ−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉを４℃で一晩４℃でインキュベートしたＥＬＩＳＡを用いた血清の連続希釈によって決定した。検出のために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に連結したヤギ抗ウサギＩｇＧを１：１６０００希釈で使用した。ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質、沈殿性テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、すぐに使用できる溶液（Ｒｏｃｈｅ）を可視化するために使用した。１ＮのＨＣｌで反応を停止させ、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅで４５０／６９０ｎｍで測定した。

【0316】

免疫化のための抗原としての初代ヒトＴ細胞の生成
初代ヒトＴ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＴ細胞エンリッチメントカクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、６人の健常ヒトドナーの全血２００ｍｌから製造業者の指示に従って単離した。得られたＴ細胞の品質及び細胞数を、細胞計数装置ＸＴ−１８００ ｉＶＥＴ（Ｓｙｓｍｅｘ）によって確認した（表４）。ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を検出するＢＤからのＴｒｉＴｅｓｔを用いたＦＡＣＳ分析を、得られたＴ細胞の質及び純度の分析に用いた（表５）。更に、これらのＴ細胞の生存率をＰＩ（ヨウ化プロピジウム）ＦＡＣＳ染色によって評価し、全試料において９９．６％超の生存細胞であった。免疫化までの保存のために、Ｔ細胞を、シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）装置によって測定された細胞数を用いて４．６×１０^７及び１．１５×１０^７の細胞として液体窒素中で個別に各ドナーについて凍結させた。

【0317】

カニクイザルＴリンパ球の調製及びインビトロでの増殖
リコール細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた密度勾配遠心分離によってカニクイザル血液（Ｃｏｖａｎｃｅ）から単離した。簡潔に述べると、１０ｍｌのヘパリン添加血液を同量のＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、希釈血液の５ｍｌのアリコートを１５ｍｌのファルコンチューブ中の５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上に重層した。室温で８００×ｇで４５分間遠心分離した後（連続的に）、リンパ球含有画分を回収し、プールし、リンパ球集団の純度を高めるために第２の勾配遠心分離に供した。このために、プールされた画分約６ｍｌを１８ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、希釈した細胞懸濁液の６ｍｌアリコートを１５ｍｌファルコンチューブ中のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ３ｍｌの上に重層した。室温で８００×ｇで３０分間遠心分離した後（連続的に）、リンパ球を採取し、プールした。ＰＢＳで洗浄した後、リンパ球を、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１×抗生物質−抗真菌剤を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に６．０Ｅ＋０５細胞／ｍｌで再懸濁した（培地及びサプリメントはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）。細胞を、２０μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、加湿雰囲気中３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。その後、培地を交換し、細胞を１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１×抗生物質−抗真菌剤及び２０Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で９日間培養した。この培養期間中、２−３日ごとにＩＬ−２含有培地を交換した。細胞生存率及び細胞数を培養期間を通してモニターし、インビトロで拡大したカニクイザルＴリンパ球のＣＤ３発現を、抗ＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＳＰ３４；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いたフローサイトメトリーによって確認した。インビトロで増殖したＴリンパ球（生存率＞８０％）を採取し、ＰＢＳで洗浄し、１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）に再懸濁した。細胞のアリコートを液体窒素中に貯蔵した。

【0318】

第二の免疫化キャンペーン
カニクイザルＴリンパ球の調製及びインビトロでの増殖
リコール細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた密度勾配遠心分離によってカニクイザル血液（Ｃｏｖａｎｃｅ）から単離した。簡潔に述べると、１０ｍｌのヘパリン添加血液を同量のＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、希釈血液の９−１０ｍｌのアリコートを１５ｍｌのファルコンチューブ中の５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上に重層した。室温で８００×ｇで４５分間遠心分離した後（連続的に）、リンパ球含有画分を回収し、プールし、リンパ球集団の純度を高めるために第２の勾配遠心分離に供した。このために、おおよそプールされた画分をＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈された初期体積まで希釈し、希釈した細胞懸濁液の９−１０ｍｌアリコートを１５ｍｌファルコンチューブ中のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ５ｍｌの上に重層した。室温で８００×ｇで３０分間遠心分離した後（連続的に）、リンパ球を採取し、プールした。ＰＢＳで洗浄した後、リンパ球を、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１×抗生物質−抗真菌剤を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に６．０Ｅ＋０５細胞／ｍｌで再懸濁した（培地及びサプリメントはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）。細胞を、２０μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）の存在下、加湿雰囲気中３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。その後、培地を交換し、細胞を１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１×抗生物質−抗真菌剤及び２０Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で９日間培養した。この培養期間中、２−３日ごとにＩＬ−２含有培地を交換した。細胞生存率及び細胞数を培養期間を通してモニターし、インビトロで拡大したカニクイザルＴリンパ球のＣＤ３発現を、抗ＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＳＰ３４；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いたフローサイトメトリーによって確認した。インビトロで増殖したＴリンパ球（生存率＞９０％）を採取し、ＰＢＳで洗浄し、１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）に再懸濁した。細胞のアリコートを液体窒素中に貯蔵した。

【0319】

ヒトＴリンパ球の調製及びインビトロでの増殖
リンパ球をＬｅｕｋｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、２２７ ２８８）を用いた密度勾配遠心分離によって健常なドナーの末梢血から単離した。簡潔に述べると、ヘパリン添加血液を３倍容量のＰＢＳで希釈し、希釈した血液の２５ｍｌアリコートを５０ｍｌのＬｅｕｋｏｓｅｐチューブに重層した。室温で８００×ｇで１５分間遠心分離した後（連続的に）、リンパ球含有画分を回収し、ＰＢＳで洗浄し、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１×抗生物質−抗真菌剤を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に１．０Ｅ＋０６細胞／ｍｌで再懸濁した（培地及びサプリメントはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）。細胞を、Ｔ１７５フラスコ中に１０μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、加湿雰囲気中３７℃、５％ＣＯ２で２日間培養した。その後、培地を交換し、細胞を１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１×抗生物質−抗真菌剤及び２０Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で更に７日間培養した。この培養期間中、細胞を２−３日ごとに１．０Ｅ＋０６細胞／ｍｌに分割され、ＩＬ−２含有培地を交換した。細胞生存率及び細胞数を培養期間を通してモニターし（図５）、インビトロで拡大したヒトＴリンパ球のＣＤ３発現を、抗ＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＶ９）を用いたフローサイトメトリーによって確認した。インビトロで増殖したＴリンパ球（生存率＞９０％）を採取し、ＰＢＳで洗浄し、１．０Ｅ＋０７細胞／ｍｌで凍結培地（１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＣＳ）に再懸濁した。細胞のアリコートを液体窒素中に貯蔵した。

【0320】

免疫化
３匹のウサギを、Ｔ細胞について濃縮されたカニクイザル及びヒトＰＢＬで免疫した（上述されるように）。各免疫化のために、凍結した細胞を解凍し、計数し、遠心分離によって凍結培地から分離し、注射用の適切な容量のＰＢＳに再懸濁した。各ウサギは、０日目にＰＢＳに再懸濁した６×１０^７個のカニクイザルＰＢＬの１回の皮内適用を受けた；その後７日目及び１４日目にそれぞれ４×１０^７個のカニクイザルＰＢＬの１回の筋肉内投与及び１回の皮下投与を行い、２１日目に最初の出血を行った。

【0321】

各々が３−５×１０^７個のＰＢＬの３回の追加免疫化のために、起源の種及び投与経路を交互に入れ替えた：動物は７週目と２０週目にヒトＰＢＬの２回の筋肉内投与を受け、１１週目にカニクイザルＰＢＬの１回の皮下投与を受けた。

【0322】

追加免疫化の各々の２１日後及び５−７日目に血液（推定総血液量の１０％）を採取した。ＦＡＣＳによる力価測定に用いられた血清を調製し、末梢単核球を単離し、Ｂ細胞クローニング法において抗原特異的Ｂ細胞の供給源として用いた（実施例３）。

【0323】

実施例３
Ｂ細胞クローニング
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離は
３匹のウサギ（実施例「ウサギの免疫化」に記載）を血液源として使用した。哺乳動物ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、製造者の仕様に従って密度遠心分離前に、全血を含むＥＤＴＡを１×ＰＢＳ（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）で２倍に希釈した。ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄した。

【0324】

ＥＬ−４ Ｂ５培地
１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）、２ｍＭのグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＰＡＮ（登録商標））を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び０．０５ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）

【0325】

マクロファージ／単球の枯渇
滅菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）を使用して、非特異的接着によってマクロファージ及び単球を枯渇させた。各ウェルは、最大で４ｍｌの培地で、免疫化されたウサギからの６×１０^６個のＰＢＭＣになるまで充填され、インキュベーター内で３７℃で１時間結合させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を抗原パニング工程に使用した。

【0326】

プレートのコーティング
タンパク質パンニングのために、滅菌ストレプトアビジン被覆６−ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ、Ｂｅｒｎｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＣＤ３ｅタンパク質変異体（表６参照）を用いて室温で３時間コーティングした。各タンパク質変異体を別々にコーティングした。ヒト表面ＣＤ３細胞上でのパンニングを可能にするために、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含まない滅菌細胞培養６ウェルプレートに播種し、直ちに遠心分離した。培養の１−４時間後、コンフルエントな細胞単層が生成された。パンニングの前に、これらの６ウェルプレートを滅菌ＰＢＳで３回慎重に洗浄した。

【0327】

ヒトＣＤ３ｅタンパク質変異体に対するＢ細胞の濃縮
抗原特異的末梢Ｂ細胞の濃縮のために、ヒトＣＤ３ｅタンパク質変異体でコーティングされた、又はヒトＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞で覆われた６ウェル組織培養プレートに、培地４ｍｌ当たり最大で６×１０^６個のＰＢＬを播種し、５％ＣＯ２下で３７℃で１時間結合させた。その後、１×ＰＢＳでウェルを慎重に１−２回洗浄することによって、非接着細胞を除去した。残りの粘着性細胞を、５％ＣＯ２下３７℃で１０分間、トリプシンにより脱離した。トリプシン処理をＥＬ−４ Ｂ５培地で停止させた。免疫蛍光染色まで細胞を氷上に保った。

【0328】

免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を単細胞選別に使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞をＰＢＳ中で抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートし、暗所で４℃で４５分間インキュベートした。染色後、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳ中に再懸濁し、直ちにＦＡＣＳ分析に供した。ＦＡＣＳ分析の前に、５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を添加して、死細胞と生存細胞とを区別した。

【0329】

コンピュータとＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＡｒｉａを単細胞分別に使用した。

【0330】

Ｂ細胞培養
ウサギＢ細胞の培養は、Zubler et al. (1985)により記載されたものと類似の方法により調製された。簡潔には、単一選別されたウサギＢ細胞を、Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ細胞（１：１０００００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ）、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）、５％ウサギ胸腺細胞上清（ｃｈａｒｇｅ ＴＳＮ−Ｍ１３（１０２４２）、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、Ｂｅｒｎｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びγ線照射マウスＥＬ−４−Ｂ５胸腺腫細胞（２．５×１０^４／ウェル）を含有するＥＬ−４ Ｂ５培地を２００μｌ／ウェル含む９６ウェルプレート中で、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で７日間培養した。Ｂ細胞培養の上清をスクリーニングのために除去し、残りの細胞を直ちに回収し、１００μｌのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で−８０℃で凍結した。

【0331】

ＶドメインのＰＣＲ増幅及び配列決定
全ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ８／９６ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０７０９．４、７４０６９８）を製造者のプロトコールに従って用いて調製した。全ての工程は、ｅｐＭｏｔｉｏｎ ５０７５液体ハンドリングシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で行った。ＲＮＡを６０μｌのＲＮａｓｅを含まない水を用いて溶出した。６μｌのＲＮＡを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １８０８０−４００）及びオリゴｄＴプライマーを製造業者の指示に従って使用して逆転写反応によってｃＤＮＡを生成した。４μｌのｃＤＮＡを用いてＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２３４４−０４０）により免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を、重鎖についてはプライマーｒｂＨＣｆｉｎａｌ．ｕｐ及びｒｂＨＣｆｉｎａｌ．ｄｏを使用し、軽鎖についてはプライマーｒｂＬＣｆｉｎａｌ．ｕｐ及びｒｂＬＣｆｉｎａｌ．ｄｏを使用して（配列番号３０から３３）最終体積５０μｌ中で増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りであった：９４℃で５分間ホットスタート；９４℃で２０秒、７０℃で２０秒、６８℃で４５秒、及び６８℃で７分間最終延長の３５サイクル。

【0332】

５０μｌのＰＣＲ溶液８μｌを４８ Ｅ−Ｇｅｌ ２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇ８００８−０２）にロードした。陽性ＰＣＲ反応物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０６０９２５０）を用いて製造業者のプロトコールに従って取り除き、５０μｌの溶出緩衝液中で溶出させた。重鎖についてはｒｂＨＣｆｉｎａｌ．ｕｐ及びｒｂＨＣｆｉｎａｌ．ｄｏを使用し、軽鎖についてはｒｂＬＣｆｉｎａｌ．ｕｐ及びｒｂＬＣｆｉｎａｌ．ｄｏを使用して（配列番号３０から３３）、精製ＰＣＲ産物１２μｌを両方向に直接配列決定した。

【0333】

ウサギモノクローナル抗体及びウサギ／マウスキメラ抗体の組換え発現。
ウサギモノクローナル抗体の組換え発現のために、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、オーバーハングクローニング法によりｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングした（RS Haun et al., Biotechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256）。

【0334】

ウサギカッパ又はガンマ定常領域をコードする線状化発現プラスミド及びＶＬ又はＶＨインサートを、オーバーラッピングプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。

【0335】

精製されたＰＣＲ産物を、一本鎖オーバーハングを生成するＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした。ｄＣＴＰ添加により反応を停止させた。

【0336】

次の工程では、プラスミド及びインサートは結合され、部位特異的組換えを誘導するｒｅｃＡとともにインキュベートされた。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。翌日、増殖したコロニーを採取し、プラスミドの調製、制限分析及びＤＮＡ配列決定によって正しい組換えプラスミドについて試験した。

【0337】

抗体発現のために、単離したＨＣ及びＬＣプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過的に同時トランスフェクトし、上清を１週間後に回収した。

【0338】

実施例４
ヒト及びカニクイザルＴ細胞を用いた機能活性アッセイ（Ｃａ Ｆｌｕｘ）
ＣＤ３媒介カルシウムフラックスアッセイの確立
抗ＣＤ３ ｍＡｂの機能活性をスクリーニングするために、ＣＤ３陽性（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１）及びＣＤ３陰性（Ｊｕｒｋａｔ ＲＴ３−Ｔ３．５）ヒトＴ細胞株を用いてカルシウムフラックスアッセイを確立した。アッセイは、９６ウェルフォーマット（二次スクリーニング）又は３８４ウェルフォーマット（一次ハイスループットスクリーニング）において行った。

【0339】

９６ウェルフォーマット
ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞又はＣＤ３陰性Ｊｕｒｋａｔ ＲＴ３−Ｔ３．５を、ウェルあたり５０μｌの無血清培地（ＲＰＭＩ １６４０／２ｍＭのグルタミン／１ｍＭのピルビン酸ナトリウム／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／０．１ｍＭのＮＥＡＡ中２００，０００細胞で黒壁透明底９６ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）中に播種した。細胞にカルシウム感受性色素（ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｃａｌｃｉｕｍ ５ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）をロードした。色素の貯蔵溶液を製造業者の指示に従って調製した。使用直前にプロペネシドを添加し、５０μｌ／ウェルの希釈色素を細胞に添加した（プロベネシドの最終濃度は２．５ｍＭ／ウェルであろう）。効率的なローディングのために、細胞を暗所で室温で２時間色素と共にインキュベートした。続いて、２０μｌのウサギ抗ＣＤ３ｍＡｂ（ウサギＢ細胞上清）又はキメラＶ９ｍＡｂ、ウサギ免疫グロブリン定常領域及びヒト化抗ＣＤ３ ｍＡｂ Ｖ９の可変領域からなるキメラ抗ＣＤ３抗体の連続希釈物を添加することによって細胞を刺激した。非特異的ポリクローナルウサギＩｇＧは陰性対照として役割を果たした。抗ＣＤ３誘導カルシウムフラックスの動力学を、３０秒の時間間隔で７．５−１０分間、蛍光（４８５ｎｍ ｅｘ．／５３０ｎｍ ｅｍ．）を測定することによってモニターした。キメラＶ９ ｍＡｂによって誘導されたカルシウムフラックスを図６Ａに示す。このデータは、このアッセイが、最小濃度約３７ｎｇ／ｍｌでアゴニスト抗ＣＤ３ ｍＡｂの検出を可能にすることを示している（アッセイ中の最終ｍＡｂ濃度：６．２ｎｇ／ｍｌ；シグナル−ノイズ比＞２）。キメラＶ９ ｍＡｂは、ＣＤ３陰性Ｊｕｒｋａｔ ＲＴ３−Ｔ３．５細胞においてではなく、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞においてのみカルシウム動員を誘導し、その作用のＣＤ３依存性を実証した。同様に、細胞を非特異的ウサギＩｇＧで処理した場合、カルシウムフラックスは観察されなかった。

【0340】

アッセイの感度を増加させるために、ＣＤ３結合ｍＡｂを細胞の表面で架橋するために追加の工程が導入された。従って、上記のように抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ウサギＢ細胞上清又はキメラＶ９ ｍＡｂ）で細胞を刺激し、初期ＣＤ３媒介カルシウムフラックスを７．５−１０分間モニターした。その後、２０μｌのＦｃ特異的ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ｃ＝７．５μｇ／ｍｌ；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加することによりＣＤ３結合ｍＡｂを架橋させ、蛍光（（４８５ｎｍ ｅｘ．／５３０ｎｍ ｅｍ．）を更に７．５−１０分間記録した。図６Ｂに示すように、二次抗ウサギ抗体による細胞表面結合抗ＣＤ３ ｍＡｂ（キメラＶ９）の架橋は、初期シグナルと比較して改善されたシグナル対ノイズ比を有する付加的なカルシウムフラックスを誘導する。このアッセイの改変は、アッセイの感度を改善し、わずか約１２ｎｇ／ｍｌの濃度（アッセイにおける最終ｍＡｂ濃度：２ｎｇ／ｍｌ）で抗ＣＤ３ ｍＡｂの検出を可能にする。

【0341】

３８４ウェルフォーマット
ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞又はＣＤ３陰性Ｊｕｒｋａｔ ＲＴ３−Ｔ３．５を、ウェルあたり２５μｌの無血清培地（ＲＰＭＩ １６４０／２ｍＭのグルタミン／１ｍＭのピルビン酸ナトリウム／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／０．１ｍＭのＮＥＡＡ中１００，０００細胞で黒壁透明底３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に播種した。細胞にカルシウム感受性色素（ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｃａｌｃｉｕｍ ５ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）をロードした。色素の貯蔵溶液を製造業者の指示に従って調製した。使用直前にプロペネシドを添加し、２５μｌ／ウェルの希釈色素を細胞に添加した（プロベネシドの最終濃度は２．５ｍＭ／ウェルであろう）。効率的なローディングのために、細胞を暗所で室温で２時間色素と共にインキュベートした。続いて、１０μｌのウサギ抗ＣＤ３ｍＡｂ（ウサギＢ細胞上清）又はキメラＶ９ｍＡｂ、ウサギ免疫グロブリン定常領域及びヒト化抗ＣＤ３ ｍＡｂ Ｖ９の可変領域からなるキメラ抗ＣＤ３抗体の連続希釈物を添加することによって細胞を刺激した。非特異的ポリクローナルウサギＩｇＧは陰性対照として役割を果たした。抗ＣＤ３誘導カルシウムフラックスの動力学を、３０秒の時間間隔で７．５−１０分間、蛍光（４８５ｎｍ ｅｘ．／５３０ｎｍ ｅｍ．）を測定することによってモニターした。キメラＶ９ ｍＡｂによって誘導されたカルシウムフラックスを図７Ａに示す。これらのデータは、このアッセイが、最小濃度約２５ｎｇ／ｍｌでアゴニスト抗ＣＤ３ ｍＡｂの検出を可能にすることを示している（アッセイ中の最終ｍＡｂ濃度：４．２ｎｇ／ｍｌ；シグナル−ノイズ比＞２）。キメラＶ９ ｍＡｂは、ＣＤ３陰性Ｊｕｒｋａｔ ＲＴ３−Ｔ３．５細胞においてではなく、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞においてのみカルシウム動員を誘導しており、ＣＤ３依存性を実証した。同様に、細胞を非特異的ウサギＩｇＧ（アイソタイプ対照）で処理した場合、カルシウムフラックスは観察されなかった。

【0342】

アッセイの感度を増加させるために、ＣＤ３結合ｍＡｂを細胞の表面で架橋するために追加の工程が導入された。従って、上記のように抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ウサギＢ細胞上清又はキメラＶ９ ｍＡｂ）で細胞を刺激し、初期ＣＤ３媒介カルシウムフラックスを７．５−１０分間モニターした。その後、２０μｌのＦｃ特異的ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ｃ＝７．５μｇ／ｍｌ；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加することによりＣＤ３結合ｍＡｂを架橋させ、蛍光（（４８５ｎｍ ｅｘ．／５３０ｎｍ ｅｍ．）を更に７．５−１０分間記録した。図７Ｂに示すように、二次抗ウサギ抗体による細胞表面結合抗ＣＤ３ ｍＡｂ（キメラＶ９）の架橋は、抗ＣＤ３ｍＡｂの低濃度で改善されたシグナル対ノイズ比を有する付加的なカルシウムフラックスを誘導する。このアッセイの改変は、アッセイの感度を改善し、わずか約１０ｎｇ／ｍｌの濃度（アッセイにおける最終ｍＡｂ濃度：１．７ｎｇ／ｍｌ）で抗ＣＤ３ ｍＡｂの検出を可能にする。

【0343】

実施例５
ヒト及びカニクイザルＣＤ３タンパク質並びにペプチドへの結合
抗ＣＤ３抗体のヒト及びカニクイザルＣＤ３タンパク質並びにペプチドへの結合をＥＬＩＳＡによって決定した。ビオチン化標的タンパク質及びペプチドを、３８４ウェルのストレプトアビジン被覆マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ；ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、ＤＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１９７４９９８／ＭＣ１０９９）上、ＤＰＢＳ（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、ＤＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ０４３６５００）中２５μｌ／ウェルで４℃で一晩インキュベートすることにより固定化した。標的濃度は、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で固定化されたカニクイザルＣＤ３ペプチド−１−２２及びヒトＣＤ３ペプチド７７−９６を除いて、表８に記載の全てのタンパク質及びペプチドについて２５０ｎｇ／ｍｌであった。使用したペプチドは、リンカーを介してペプチドのＮ末端又はＣ末端の何れかに結合したビオチンとともに生成された。標的結合ＥＬＩＳＡのために、Ｎ及びＣ末端ビオチン化ペプチドをマイクロプレート上での固定化のために１：１の比で混合し（表８）、別々に使用した（表８）。１Ｘ ＰＢＳ（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１６６６７８９）中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＵＳＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２０６０５）を用いた３回の洗浄工程の後、組換え抗ＣＤ３抗体（２５μｌ／ウェル、１Ｘ ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸フリー、Ｒｏｃｈｅ、＃１０７３５０７８００１）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）が添加され、オービタルシェーカーを室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液（９０μｌ／ウェル）による３回の洗浄工程が続いた。抗体は、室温で１時間、１Ｘ ＰＢＳ（ｗ／０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１：５０００に希釈した、ペルオキシダーゼ結合型、種特異的抗ウサギＩｇＧ、ロバ由来のＦ（ａｂ’）２断片、ＧＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＡ ９３４０）により検出された。検出抗体を洗浄緩衝液で４回の洗浄工程により除去し、ＴＭＢ基質（ＴＭＢ溶液、Ｒｏｃｈｅ）の添加によってシグナルを発色させた。吸光度を、一定時間間隔後にＥＸ３７０ｎｍ／ＥＭ４９２ｎｍで読み取った。

【0344】

結合ＥＬＩＳＡからの結果は、クローン５９６及びクローン６４５が、それぞれ、アミノ酸７７−９６（ヒトＣＤ３ｅ）及び６９−８８（カニクイザルＣＤ３ｅ）からなるエピトープ領域において、ヒト及びカニクイザルＣＤ３ｅに結合することを示している。

【0345】

ＦＡＣＳに基づく細胞結合研究：ヒト及びカニクイザルの増殖型Ｔ細胞への結合
生成した抗ＣＤ３抗体の細胞結合を評価するために、ヒト及びカニクイザルの増殖型Ｔ細胞を用いたＦＡＣＳに基づく結合アッセイを実施した。簡潔には、凍結したＴ細胞（実施例２）を解凍し、遠心分離によって凍結培地から分離し、Ｊｕｒｋａｔ細胞培地に２×１０６細胞／ｍｌで懸濁した。５０μｌの細胞アリコートを抗ＣＤ３抗体の連続希釈物（ＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液中１０μｇ／ｍｌ−０．０１μｇ／ｍｌ）と共に４℃で１時間インキュベートした。ＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞はその起源に応じて、４℃で１時間、ＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液中に１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ３４７３２Ａ）又は抗マウスＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ６５Ｅ１−１）又は抗ヒトＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０１３）により染色された。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のＭＦＩシグナルを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した。

【0346】

ＦＡＣＳに基づく細胞結合研究の結果は、クローン４５０、クローン６２７及びクローン６４５は、抗ＣＤ３参照抗体（ＳＰ３４−２＝ ＣＨ２５２７及びＨ２Ｃ）に匹敵してカニクイザルＴ細胞に結合し、一方ＯＫＴ３及びＵＣＨＴ１抗ＣＤ３参照抗体はカニクイザルＴ細胞に結合しないことを示している（図８及び図９）。

【0347】

実施例６
結合エピトープの特徴付け
Ｎ及びＣ末端ビオチン化ヒト及びカニクイザルＣＤ３ペプチドへの抗ＣＤ３抗体クローン６４５の結合を、上記のようにＥＬＩＳＡによって決定した（実施例５）。

【0348】

結合ＥＬＩＳＡからの結果は、クローン６４５が、Ｃ末端の融合ビオチンを介してストレプトアビジン被覆マイクロプレート上に固定化されたヒトＣＤ３ ７７−９６ペプチドに結合しないことを示す。しかし、クローン６４５は、Ｎ末端で固定化される場合同じペプチドに結合し、並びにビオチン融合の部位に関係なく両方のカニクイザルＣＤ３ペプチド６９−８８に結合する。

【0349】

実施例８
抗ＣＤ３ｅ抗体の結合親和性ＫＤ値
ヒト及びカニクイザルＣＤ３ｅに対するクローン６４５抗体の結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴によって調べた。捕捉系（１０μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ断片特異的；注文コード：１１１−００５−０４６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の約２０００共鳴単位（ＲＵ）をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを用いてｐＨ５．０でＣＭ４チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００５−３４）に結合させた。固定化のためのランニング緩衝液は、ＨＢＳ−Ｎ ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００６−７０）であった。追跡される動力学アッセイのために、ランニング及び希釈緩衝液はＨＢＳ−Ｐ ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００６−７１）とした。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回刺激した。クローン６４５抗体は、１μｇ／ｍｌの溶液を１０μｌ／分の流速で６０秒間注入することによって捕捉した。会合は、溶液中の様々な濃度のヒトＣＤ３ｅ（ストーク）Ｆｃ−Ｋｎｏｂ−ＣＤ３ｄ（ストーク）ＦｃＨｏｌｅ又はカニクイザルＣＤ３ｅ（ストーク）Ｆｃ−Ｋｎｏｂ−ＣＤ３ｄ（ストーク）ＦｃＨｏｌｅの注入を、１３５０ｎＭで開始し、続いて１回１：１．５希釈し、更に１：３希釈して、３０μｌ／分の流速で１８０秒間の注入によって測定された。解離相を最高３００秒間モニターし、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによってトリガーした。表面を、１０μｌ／分の流速で６０秒間、グリシンｐＨ１．７溶液の２回の連続注入で洗浄することによって再生した。バルク屈折率の差は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ表面から得られた応答を差し引くことによって補正した。ブランク注入もまた減算される（＝ダブルリファレンス）。ＫＤ及び他の動力学パラメーターの計算のために、ラングミュアの１：１モデルを使用した。

【0350】

ヒト及びカニクイザル標的、ｈｕＣＤ３ｅ（ストーク）Ｆｃ−Ｋｎｏｂ−ＣＤ３ｄ（ストーク）ＦｃＨｏｌｅ及びｃｙＣＤ３ｅ（ストーク）Ｆｃ−Ｋｎｏｂ−ＣＤ３ｄ（ストーク）ＦｃＨｏｌｅと相互作用するクローン６４５の表面プラズモン共鳴測定。この表は、単一測定から得られた値を示す（ｋａ：会合速度；ｋｄ：解離速度；ＫＤ：親和性）。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]