特許 6738316 粘度を低下させるためのＴＲＥＭ−１抗体の部位特異的変異誘発

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6738316

(24)【登録日】2020年7月21日

(45)【発行日】2020年8月12日

(54)【発明の名称】粘度を低下させるためのＴＲＥＭ−１抗体の部位特異的変異誘発

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20200730BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20200730BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200730BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200730BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20200730BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20200730BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20200730BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C12N15/13

   A61K39/395 N

   A61P29/00 101

   A61P19/02

   A61P1/04

   C12P21/08

【請求項の数】25

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2017-502703(P2017-502703)

(86)(22)【出願日】2015年7月17日

(65)【公表番号】特表2017-522325(P2017-522325A)

(43)【公表日】2017年8月10日

(86)【国際出願番号】EP2015066501

(87)【国際公開番号】WO2016009086

(87)【国際公開日】20160121

【審査請求日】2018年7月13日

(31)【優先権主張番号】14177547.8

(32)【優先日】2014年7月17日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】14194893.5

(32)【優先日】2014年11月26日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】395018066

【氏名又は名称】ノヴォ ノルディスク アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】アネデ・ヘンリクセン

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン・ケアゴー

(72)【発明者】

【氏名】ヴィベケ・ヴェストファール・ステニケ

(72)【発明者】

【氏名】シャロデ・ヴィーベア

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１２０５５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０７２８７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Pharmaceutical Sciences, 2010年，Vol.99, No.3，p.1152-1168

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ １／０４

Ａ６１Ｐ １９／０２

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＲＥＭ−１に結合することができる抗体またはそのフラグメントであって、配列番号２の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３および、配列番号３の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、但し、ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸２７でのグルタミンを含有する；ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸３２でのアラニンを含有する；ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸３２でのセリンを含有する；ＶＬ ＣＤＲ３がアミノ酸９７でのセリンを含有する；ＶＬ ＣＤＲ３がアミノ酸９７でのグルタミンを含有する；ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸２７でのグルタミンを含有し、かつＶＬ ＣＤＲ３がアミノ酸９７でのグルタミンを含有する；ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸２７でのグルタミンを含有し、かつＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸３２でのアラニンを含有する；ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸３２でのアラニンを含有し、かつＶＬ ＣＤＲ３がアミノ酸９７でのグルタミンを含有する；ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸２７でのグルタミンを含有し、かつＶＬ ＣＤＲ３がアミノ酸９７でのセリンを含有する；またはＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸２７でのグルタミンを含有し、ＶＬ ＣＤＲ１がアミノ酸３２でのアラニンを含有し、かつＶＬ ＣＤＲ３がアミノ酸９７でのグルタミンを含有する、抗体またはそのフラグメント。

【請求項2】

配列番号２のＶＨを含むＶＨおよび配列番号３のＶＬの変異体を含むＶＬを含み、ここで、該ＶＬ変異体が、アミノ酸２７でのグルタミン；アミノ酸３２でのアラニン；アミノ酸３２でのセリン；アミノ酸９７でのセリン；アミノ酸９７でのグルタミン；アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸９７でのグルタミン；アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸３２でのアラニン；アミノ酸３２でのアラニンおよびアミノ酸９７でのグルタミン；アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸９７でのセリン；またはアミノ酸２７でのグルタミン、アミノ酸３２でのアラニン、およびアミノ酸９７でのグルタミンを含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項3】

ＶＬ変異体が、アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸９７でのセリンまたはグルタミンを含む、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項4】

ＶＬ変異体が、アミノ酸２７およびアミノ酸９７の両方でのグルタミンを含む、請求項２または３に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項5】

配列番号２の配列のＶＨ、および配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１４からなる群から選択される配列のＶＬを含む、請求項１−４のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項6】

ＶＬ変異体が配列番号５のＶＬである、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項7】

配列番号２の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および配列番号３の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、但し、ＶＨ ＣＤＲ２が、アミノ酸５７でのセリン、アミノ酸５９でのチロシン、またはその組み合わせを含む、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。

【請求項8】

配列番号２のＶＨの変異体を含むＶＨ、および配列番号３のＶＬを含むＶＬを含む、請求項７に記載の抗体またはそのフラグメントであって、該ＶＨ変異体が、アミノ酸５７でのセリン、アミノ酸５９でのチロシン、またはその組み合わせを含む、抗体またはそのフラグメント。

【請求項9】

配列番号３の配列のＶＬ、および配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択される配列のＶＨを含む、請求項８に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項10】

ＴＲＥＭ−１に結合することができる抗体またはそのフラグメントであって、配列番号２の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および配列番号３の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＶＨ ＣＤＲ２が、アミノ酸５７でのセリン；アミノ酸５９でのチロシン；またはアミノ酸５７でのセリンおよびアミノ酸５９でのチロシンを含み、および、ＶＬ ＣＤＲ１またはＶＬ ＣＤＲ３が、アミノ酸２７でのグルタミン；アミノ酸３２でのアラニン；アミノ酸３２でのセリン；アミノ酸９７でのセリン；アミノ酸９７でのグルタミン；アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸９７でのグルタミン；アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸３２でのアラニン；アミノ酸３２でのアラニンおよびアミノ酸９７でのグルタミン；アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸９７でのセリン；またはアミノ酸２７でのグルタミン、アミノ酸３２でのアラニン、およびアミノ酸９７でのグルタミンを含む、抗体またはそのフラグメント。

【請求項11】

配列番号２のＶＨの変異体を含むＶＨおよび配列番号３のＶＬの変異体を含むＶＬを含み、ここで、該ＶＨ変異体が、アミノ酸５７でのセリン；アミノ酸５９でのチロシン；またはアミノ酸５７でのセリンおよびアミノ酸５９でのチロシンを含み、および、該ＶＬ変異体が、アミノ酸２７でのグルタミン；アミノ酸３２でのアラニン；アミノ酸３２でのセリン；アミノ酸９７でのセリン；アミノ酸９７でのグルタミン；アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸９７でのグルタミン；アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸３２でのアラニン；アミノ酸３２でのアラニンおよびアミノ酸９７でのグルタミン；アミノ酸２７でのグルタミンおよびアミノ酸９７でのセリン；またはアミノ酸２７でのグルタミン、アミノ酸３２でのアラニン、およびアミノ酸９７でのグルタミンを含む、請求項１０に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項12】

ＶＬ変異体が、アミノ酸２７でのグルタミン、およびアミノ酸９７でのセリンまたはグルタミンを含む、請求項１１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項13】

配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１４からなる群から選択される配列のＶＬ、および配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１６からなる群から選択される配列のＶＨを含む、請求項１０または１１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項14】

ＶＨが配列番号１５のＶＨを含み、ＶＬが配列番号５のＶＬを含む、請求項１１または１３に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項15】

ＶＬ変異体が配列番号９または配列番号１０のＶＬである、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項16】

ＴＲＥＭ−１に結合することができる抗体またはそのフラグメントであって、ＶＬおよびＶＨを含む、ここで、該ＶＬは、配列番号１４の軽鎖のＶＬであり、該ＶＨは、配列番号２および配列番号１６からなる群から選択される重鎖のＶＨである、抗体またはそのフラグメント。

【請求項17】

定常領域を含む、請求項１−１６のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項18】

定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項１７に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項19】

８０ｍｇ／ｍｌの濃度で５ｃＰ未満の粘度を有することを特徴とする、請求項１−１８のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項20】

請求項１−１９のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項21】

その必要のある対象における自己免疫疾患または慢性炎症の治療における使用のための
、請求項１−１９のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

自己免疫疾患が、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、ループス腎炎、および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される、請求項２１に記載の抗体またはそのフラグメントまたは医薬組成物。

【請求項23】

請求項１−１９のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項24】

請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。

【請求項25】

好適な条件下で請求項２４に記載の細胞を培養することを含む、ＴＲＥＭ−１に結合することができる抗体またはそのフラグメントを製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＴＲＥＭ−１ｍＡｂ、および、ｍＡｂ溶液の粘度を低下させ、標的への親和性を保持するための、ＴＲＥＭ−１ｍＡｂ自己相互作用あるいはＴＲＥＭ−１ｍＡｂとＴＲＥＭ−１との相互作用のいずれかに関する、特定の負荷電もしくは非荷電アミノ酸の変異に関するものであり、本発明は、これらの抗体の治療用途および医薬品用途への使用に関するものである。

【0002】

本発明の配列表
配列番号１は、野生型（ｗｔ）ヒトＴＲＥＭ−１のアミノ酸配列を表している。
配列番号２は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の重鎖のアミノ酸配列を表している（ＷＯ２０１３／１２０５５３のｍＡｂ０１７０）。
配列番号３は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表している（ＷＯ２０１３／１２０５５３のｍＡｂ０１７０）。
配列番号４は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３１７、Ｅ２７Ｑ、Ｅ９７Ｓ）。
配列番号５は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３１８、Ｅ２７Ｑ、Ｅ９７Ｑ）。

【0003】

配列番号６は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３１９、Ｅ９７Ｓ）。
配列番号７は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３２０、Ｅ９７Ｑ）。
配列番号８は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３２１、Ｅ２７Ｑ）。
配列番号９、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３２２、Ｆ３２Ａ）。
配列番号１０は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３２３、Ｆ３２Ｓ）。

【0004】

配列番号１１は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の重鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３２４、Ａ５９Ｙ）。
配列番号１２は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の重鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３２５、Ｎ５７Ｓ）。
配列番号１３は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の重鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３２６、Ａ５９Ｙ、Ｎ５７Ｓ）。
配列番号１４は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３３０、Ｆ３２Ａ、Ｅ２７Ｑ、Ｅ９７Ｑ）。
配列番号１５は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の重鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３３２、Ａ５９Ｙ；０３３２は、ＨＣとしての配列番号１５と、ＬＣとしての配列番号５との組み合わせである、表１）。

【0005】

配列番号１６は、ヒト化ＴＲＥＭ−１抗体の重鎖のアミノ酸配列を表している（ｍＡｂ０３３３、Ａ５９Ｙ；０３３３は、ＨＣとしての配列番号１６と、ＬＣとしての配列番号１４との組み合わせである、表１）。
配列番号１７は、全長ｃＴＲＥＭ−１のアミノ酸配列を表している。
配列番号１８は、ｍＡｂ０１７０のＦａｂ領域の重鎖を表している。
配列番号１９は、ｍＡｂ０１７０のＦａｂ領域の軽鎖を表している。

【背景技術】

【0006】

背景
ＴＲＥＭ−１は、単球、マクロファージ、および好中球上に発現される活性化受容体である。これらの細胞は、炎症を引き起こすサイトカインおよび他のメディエーターの放出により、慢性炎症性疾患において中心的役割を果たす。疾病の重症度と相関して、ＴＲＥＭ−１ｍＲＮＡおよび蛋白質の発現は、ＲＡおよびＩＢＤを患っている患者において増加し、ＴＲＥＭ−１陽性細胞は炎症部位に蓄積する。活性化した好中球により主に発現されるペプチドグリカン認識蛋白質１（ＰＧＬＹＲＰ１）は、ＴＲＥＭ−１のリガンドであり、結合により、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達を媒介する。

【0007】

インビトロにおいて、ＴＲＥＭ−１の会合は、ＴＮＦ、ＩＬ−８、および単球走化性プロテイン１を含む炎症促進性サイトカインの分泌を誘発する。加えて、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達は、多数のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と協力し、さらに炎症促進性のシグナルを強化する。次に、これが、ＴＲＥＭ−１の発現を増加させ、炎症を増強させる悪循環を引き起こす。ＴＬＲが、ＲＡおよびＩＢＤなどの慢性炎症性疾患の発症および進行の一因であることを示す証拠が増えている。

【0008】

ＷＯ２０１３／１２０５５３は、ヒトおよびカニクイザル両方のＴＲＥＭ−１機能を阻害する、ヒト化抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂを開示している。しかしながら、抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂの粘度プロファイルが、＞５０ｍｇ／ｍｌで製剤を生産するための製造過程を妨げ得、臨床での最適用量設定を制限し得る。蛋白質治療薬の高投与量（数ｍｇ／ｋｇ）が、十分な臨床効果を達成するためにしばしば必要とされ、これらの治療薬の大多数が皮下投与で投与されるために、結果として、当該治療薬の患者の自己投与は＜１．５ｍＬの量に制限される（Shire et al., J. Pharm. Sci. 2004, 93, 1390-1402）。患者の自己投与に適した高濃度蛋白質製剤の開発は、蛋白質の製剤化により得られる溶液が高粘度となる場合の製造および送達にとって一般的な障害である。

【0009】

ｍＡｂの電荷分布が、ｍＡｂ溶液の粘度挙動への影響に関して研究されてきている(Ydav et al., Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 791-802)。また、希釈溶液中で持続する弱い非特異的電荷相互作用は、濃縮ｍＡｂ溶液の粘度に影響することが示されてきている（Connolly et al., Biophys. J., 2012, 103, 69-78.）。ｍＡｂ溶液の粘度を減少させる改善策は、直接的な電荷−電荷分子間相互作用を破壊する部位特異的電荷スワップ変異(Ydav et al., Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 791-802)、あるいは塩または対イオンの添加(Liu et al., J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1928-1940; Yadav et al., J. Pharm. Sci. 2010, 99, 1152-1168; Yadav et al., J. Pharm. Sci. 2012, 101, 998-1011; Kanai et al., J. Pharm. Sci. 2008, 97, 4219-4227)を導入している。塩および対イオンの添加は、しかしながら、投与された溶液の高浸透圧性の点で、患者にとって有害な影響をもたらし得る。

【0010】

ＷＯ２０１３／１２０５５３により開示されたヒト化抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂ０１７０のＣＤＲの部位特異的変異によって作成されたＴＲＥＭ−１抗体が、本明細書において開示されている。開示される抗体は、直接的なｍＡｂの分子間電荷−電荷自己相互作用を妨げないが、好ましい粘度プロファイルを有し、標的結合特性を維持する。好ましい粘度プロファイルにより、治療用途および医薬品用途において必要不可欠であり得る高濃度での製剤の生産が可能になる。これらの抗体は、敗血症または関節リウマチ、乾癬性関節炎および炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患を患う個体のクオリティー・オブ・ライフに大きな影響を与え得る。

【発明の概要】

【0011】

概要
本発明の主な局面は、単量体のｍＡｂに期待される範囲の粘度プロファイルを有し、ＷＯ２０１３／１２０５５３のｍＡｂ０１７０と同程度に強力にＴＲＥＭ−１の機能を遮断する、抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂに関する。本発明の変異体ｍＡｂの有利な粘度プロファイルに加えて、当該変異体はＴＲＥＭ−１受容体に受容体活性化作用を示さない。

【0012】

本発明のある局面は、ＴＲＥＭ−１に結合して遮断することができる抗体またはそのフラグメントであって、８０ｍｇ／ｍＬの濃度で、５ｃＰ未満の粘度、好ましくは４ｃＰ未満の粘度を有することを特徴とする、抗体またはそのフラグメントに関する。

【0013】

当該抗体またはそのフラグメントは、本明細書に記載されるように、配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域の１つ以上の負荷電残基が非荷電アミノ酸残基で置換されている、配列番号３の変異体を含んでもよい。

【0014】

当該抗体またはそのフラグメントは、配列番号３の位置３２のフェニルアラニンが、アミノ酸残基グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニンから選択されるアミノ酸、好ましくは、アラニン、グリシン、セリン、バリンおよびロイシンから選択されるアミノ酸に変異している、さらに好ましくは配列番号３のＦ３２がアラニンまたはセリンに変異している、配列番号３の変異体を含んでもよい。

【0015】

当該抗体またはそのフラグメントは、配列番号２の残基Ｙ３２、Ｒ５２、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｎ５７、Ａ５９、Ｍ１０２、Ｉ１０４およびＲ１０６、または配列番号３の残基Ｆ３２、Ｄ３３、Ｙ３４、Ｙ５３、Ｒ５４、Ｄ９８のいずれか１つ（「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異）が、他のアミノ酸、例えば天然のアミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基で置換されている配列番号２の変異体を含んでよい。

【0016】

本発明のさらなる局面は、配列番号１のＴＲＥＭ−１に特異的に結合して遮断することができる抗体またはそのフラグメントであって、かつ、配列番号２または配列番号３の「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異、「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」変異および「チャージパッチ」変異からなる群（表１）から選択される、配列番号２もしくは配列番号３またはその両方の変異体を含む、抗体またはそのフラグメントに関する。

【0017】

本発明の抗体またはそのフラグメントのある実施形態において、配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域の１つ以上の負荷電残基が、非荷電アミノ酸残基で置換されている。ある実施形態において、配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域の負荷電残基が、非荷電アミノ酸残基で置換されている。

【0018】

ある実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、配列番号３の「チャージパッチ」残基Ｄ１、Ｄ３０、Ｄ３３、Ｄ７４、Ｄ９８、Ｅ２７、Ｅ９７のいずれか１つが、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異している配列番号３の変異体を含む。ある実施形態において、配列番号３の「チャージパッチ」残基Ｄ１、Ｄ３０、Ｄ３３、Ｄ７４、Ｄ９８、Ｅ２７、Ｅ９７の２つ以上が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異している。

【0019】

ある実施形態において、配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域のＥ２７およびＥ９７の１つが、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸などの、非荷電アミノ酸残基で置換されている。例として、配列番号３のＥ２７が未変異のままで、Ｅ９７が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸に、さらに好ましくはセリンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸に、変異していてよい。あるいは、配列番号３のＥ９７が未変異のままで、Ｅ２７が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸で、さらに好ましくはセリンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸で、置換されていてよい。

【0020】

ある実施形態において、配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域のＥ２７およびＥ９７の両方が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸などの、非荷電アミノ酸残基で置換されている。例として、配列番号３のＥ２７がグルタミンに変異しており、配列番号３のＥ９７が、グリシン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸で、さらに好ましくはセリンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸で、置換されていてよい。

【0021】

さらなる局面において、本発明は、配列番号２の残基Ｙ３２、Ｒ５２、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｎ５７、Ａ５９、Ｍ１０２、Ｉ１０４およびＲ１０６、または配列番号３の残基Ｆ３２、Ｄ３３、Ｙ３４、Ｙ５３、Ｒ５４、Ｄ９８のいずれか１つ（「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異）が、他のアミノ酸、例えば天然のアミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基で置換されている配列番号２の変異体を含む抗体またはそのフラグメントを提供する。

【0022】

本発明の抗体またはそのフラグメントのある実施形態において、配列番号２の残基Ａ５９およびＮ５７の少なくとも１つが、あるアミノ酸残基、例えば天然のアミノ酸、好ましくは、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸、さらに好ましくはセリンまたはチロシンに変異している。例として、配列番号２のＡ５９が未変異のままで、Ｎ５７が他のアミノ酸残基、例えば天然のアミノ酸、好ましくは、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸、さらに好ましくはセリンまたはチロシンに変異していてよい。あるいは、配列番号２のＮ５７が未変異のままで、配列番号２のＡ５９が他のアミノ酸残基、例えば天然のアミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸、さらに好ましくはセリンまたはチロシンに変異していてよい。さらなる実施形態において、配列番号２のＡ５９およびＮ５７の両方が、他のアミノ酸残基、例えば天然のアミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸、さらに好ましくはセリンまたはチロシンに変異している。

【0023】

本発明のさらなる局面は、「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」アミノ酸残基における配列番号３への部位特異的変異導入、例えば、配列番号３のＰｈｅ残基のＡｌａまたはＳｅｒによる置換によって得られる改良された前臨床評価値に関し、これにより配列番号１のヒトＴＲＥＭ−１への親和性と同じカニクイザルＴＲＥＭ−１へのｍＡｂ親和性が得られる。

【0024】

本発明は、従って、「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」アミノ酸残基である、配列番号３のＦ３２が、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンおよびシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基で置換されている抗体またはそのフラグメントを提供する。

【0025】

本発明のさらなる局面は、（例えば、上述したように）配列番号１のヒトＴＲＥＭ−１に対する親和性と同じカニクイザルＴＲＥＭ−１へのｍＡｂ親和性を達成するためのｍＡｂ−ＴＲＥＭ−１接触面における配列番号２への部位特異的変異の導入と、（例えば上述したように）配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域の負荷電残基の非荷電アミノ酸残基への置換との組み合わせにより獲得される、改良された粘度特性と改良された前臨床評価値の組み合わせ効果に関する。

【0026】

本発明の上述の局面のいずれかに従い、
ｉ）配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域の少なくとも１つの負荷電残基が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異している；および
ｉｉ）配列番号２の残基Ｙ３２、Ｒ５２、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｎ５７、Ａ５９、Ｍ１０２、Ｉ１０４およびＲ１０６、または配列番号３の残基Ｆ３２、Ｄ３３、Ｙ３４、Ｙ５３、Ｒ５４、Ｄ９８（「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異）の少なくとも１つの残基が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、およびトリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異している抗体またはそのフラグメントが提供される。

【0027】

ある実施形態において、
ｉ）配列番号３のＥ２７およびＥ９７の１つまたは両方が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異している；および
ｉｉ）配列番号２のＡ５９およびＮ５７の１つまたは両方が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基、さらに好ましくはセリンまたはチロシンに変異している、
抗体またはそのフラグメントが提供される。

【0028】

本発明はさらに、配列番号４〜１６のいずれかに記載の配列を含む、抗体またはそのフラグメントに関する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂ変異体の粘度プロファイルと、その指数曲線の適合度（exponential curve fit）を示している。

【図2】図２は、ＰＧＮおよび（Ａ）組換えＰＧＬＹＲＰ１または（Ｂ）活性化好中球により発現されたＰＧＬＹＲＰ１で刺激された、ヒトＴＲＥＭ−１レポーター細胞株（ＢＷＺ’３６／ｈＴＲＥＭ−１）におけるヒトＴＲＥＭ−１シグナル伝達を、ｍＡｂ０１７０変異体が阻害する能力を示している（Ｎドナーの平均）。

【図3】図３は、ＰＧＮおよび組換えＰＧＬＹＲＰ１で刺激されたカニクイザルＴＲＥＭ−１レポーター細胞株（ＴＥ４２６．２７）におけるカニクイザルＴＲＥＭ−１シグナル伝達を、ｍＡｂ０１７０変異体が阻害する能力を示している。

【図4】図４は、ＰＧＮおよび組換えＰＧＬＹＲＰ１で刺激された低酸素性Ｍ２マクロファージから放出されたＴＮＦａを、ｍＡｂ０１７０変異体が阻害する能力を示している。

【図5】図５は、低酸素性Ｍ２マクロファージからのＴＮＦ放出を、プレートに結合したｍＡｂ０１７０変異体が誘導する、アゴニストとしての能力を示している。ＭＡｂ１２７８（Ｒ＆Ｄ）を、ポジティブコントロールとして用いた。

【図6】図６は、ｍＡｂ１７０と比較した、抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂ変異体の流体力学半径を示している。

【発明を実施するための形態】

【0030】

詳細な説明
ＴＲＥＭ−１は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインと、明らかなシグナリングモチーフを持たない短い細胞質側末端を含む、２３４個のアミノ酸からなる、膜貫通蛋白質である。ＴＲＥＭ−１は活性化されると、ＩＴＡＭ含有シグナリングアダプター蛋白質、ＤＡＰ１２と会合する。下流のシグナル伝達には、ＮＦＡＴ転写因子の活性化が含まれ得、炎症促進性のサイトカイン生産の増加を引き起こす。

【0031】

本発明は、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合し、その機能を遮断することができる抗体に関連する。本発明の抗体は、ＴＲＥＭ−１の活性化および下流のシグナル伝達を減少させる／遮断することにより、ＴＲＥＭ−１の機能を遮断し得る。

【0032】

本発明に従う抗体は、ＴＲＥＭ−１を直接的または間接的に遮断する、いくつかの異なるメカニズムの１つ、またはその組み合わせを用いて、ＴＲＥＭ−１を遮断し得る。例えば、本発明の抗体は、ＴＲＥＭ−１の天然のリガンドであるペプチドグリカン認識蛋白質１（ＰＧＬＹＲＰ１）がＴＲＥＭ−１と機能複合体を形成することを妨げてもよく、および／または、本発明の抗体は、それぞれのＴＲＥＭ−１分子が二量体または多量体を形成することを妨げることによって、ＴＲＥＭ−１を遮断してもよい。ＴＲＥＭ−１の二量体化または多量体化は、ＴＲＥＭ−１二量体ではその接触面に存在するＴＲＥＭ−１の一部に結合し、これによりそれぞれのＴＲＥＭ−１分子が互いに会合するのを妨げることができるＴＲＥＭ−１抗体によって、減少または妨げられ得る。

【0033】

ＴＲＥＭ−１二量体化または多量体化は、ＴＲＥＭ−１とそのリガンドとの相互作用に干渉するＴＲＥＭ−１抗体によって、減少され得る、あるいは妨げられ得る。本発明に従う抗体は、ＰＧＬＹＲＰ１により誘導されるＴＲＥＭ−１の活性化を妨げ得る。ＰＧＬＹＲＰ１は、高度に保存された、シグナルペプチドおよびペプチドグリカン結合ドメインからなる１９６個のアミノ酸の長い蛋白質であり、好中球で発現され、好中球の活性化の際に放出される。本発明に従う抗体は、骨髄系細胞からの炎症性サイトカインの放出を減少させる。本発明に従う抗体は、本明細書に記載されるように、マクロファージ、好中球、滑膜組織細胞および／またはレポーター細胞からのＴＮＦ、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６および／またはＩＬ−８の放出を遮断し得る。

【0034】

本発明の抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１および、ヒトとは異なる種由来のＴＲＥＭ−１の両方に結合することができる。本明細書で用いられる「ＴＲＥＭ−１」という用語は、従って、任意の好適な生物に由来し得る、ＴＲＥＭ−１のいずれの天然型も包含する。例えば、本明細書に記載される用いられるＴＲＥＭ−１は、脊椎動物のＴＲＥＭ−１であり得、例えば哺乳動物のＴＲＥＭ−１、例えば霊長類（例えばヒト、チンパンジー、カニクイザル、またはアカゲザル）；げっ歯類（例えばマウスまたはラット）；ウサギ類（例えばウサギ）、または偶蹄類（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、またはラクダ）由来のＴＲＥＭ−１であり得る。好ましくは、ＴＲＥＭ−１は配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）である。ＴＲＥＭ−１は、例えば、好適な細胞内で翻訳後プロセシングを受けたＴＲＥＭ−１蛋白質などの、ＴＲＥＭ−１の成熟型であってよい。このような成熟ＴＲＥＭ−１蛋白質は、例えば、グリコシル化されていてもよい。ＴＲＥＭ−１は、全長ＴＲＥＭ−１蛋白質であってもよい。

【0035】

本発明の抗体は、Ｂリンパ球の単一クローンに、直接的にまたは間接的に由来するという意味で、モノクローナル抗体であり得る。ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、ＷＯ２０１３／１２０５５３の実施例に記載される方法を用いて、生産、選別および精製され得る。手短に言えば、ＴＲＥＭ−１またはＴＲＥＭ−１／ＴＲＥＭ−３ノックアウト（ＫＯ）マウスなどの好適なマウスを、ＴＲＥＭ−１、ＴＲＥＭ−１発現細胞、またはその両方の組み合わせにより、免疫化すればよい。

【0036】

本発明の抗体は、本発明に従うモノクローナル抗体の混合物であるという意味において、ポリクローナル抗体であり得る。

【0037】

ハイブリドーマ上清の一次スクリーニングは、直接ＥＬＩＳＡまたはＦＭＡＴを用いて行われ得、二次スクリーニングは、フローサイトメトリーを用いて行われ得る。陽性のハイブリドーマ上清は、その後レポーター遺伝子アッセイで選別され得る。

【0038】

抗体は、原核細胞または真核細胞で組換え発現され得る。原核細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得る。真核細胞は、酵母、昆虫、哺乳類細胞であり得、例えば、霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、またはアカゲザル）、げっ歯類（例えばマウスまたはラット）、ウサギ類（例えばウサギ）、または偶蹄類（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、またはラクダ）である生物に由来する細胞であり得る。好適な哺乳動物細胞株には、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＨＥＬＡ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＴＲＥＭ−１抗体はまた、当業者に知られる他の方法、例えばファージディスプレイまたは酵母ディスプレイによって、生産されてもよい。

【0039】

抗体は、生産されると、例えば全長ＴＲＥＭ−１またはその変異体への結合に関して、ＷＯ２０１３／１２０５５３の実施例に記載される方法を用いて選別することができる。

【0040】

本発明の機能性ＴＲＥＭ−１抗体は、特異的にＴＲＥＭ−１に結合できる抗体で、ＴＲＥＭ−１の遮断または刺激のいずれかにより、ＴＲＥＭ−１の活性化および下流のシグナル伝達に影響を与える抗体であり、本明細書において、それらは「機能性ＴＲＥＭ−１抗体」と呼ばれる。機能性ＴＲＥＭ−１抗体を同定する方法には、（ａ）ＴＲＥＭ−１、シグナル伝達蛋白質およびレポーター構築物を発現する第一の細胞を培養すること；（ｂ）第一の細胞をＴＲＥＭ−１調節物質（modifying agent）と培養した際に、当該細胞の活性を測定すること；（ｃ）（ｂ）の共培養をＴＲＥＭ−１抗体と接触させること；および（ｄ）第一の細胞の活性が、（ｂ）で測定された活性より小さい、あるいは大きいことを測定することが、含まれる。

【0041】

（ａ）の「第一の細胞」は、造血起源の細胞であってよく、例えば骨髄系細胞、例えばＴ細胞であってよい。（ａ）のシグナル伝達蛋白質は、ＴＲＥＭ−１と複合体を形成することができる任意のシグナル伝達蛋白質であってよい。好適なシグナル伝達蛋白質には、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＴＣＲζ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃ受容体、またはそれらの一部が含まれる。（ａ）のレポーター構築物は、シグナル伝達蛋白質経由で活性化され、認識可能なシグナルを産生できる、任意の構築物であってよい。好適なレポーター構築物には、転写因子およびレポーター遺伝子が含まれる。シグナル伝達蛋白質は、ＮＦＡＴおよびＮＦｋＢからなる群から選択される転写因子を経由して伝達することができる。レポーター遺伝子は、当該第一の細胞において天然に発現されていない遺伝子であり、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）またはクロラムフェニコール転移酵素をコードする遺伝子であり得るが、これらに限定されない。当該第一の細胞は、当業界でよく知られる方法を用いて、転写因子およびレポーター遺伝子で形質導入され得る。

【0042】

実施例に記載された「ＢＷＺ／ｈＴＲＥＭ−１レポーター細胞」および「ＴＥ４２６．２７レポーター細胞」は、「第一の細胞」の一例である。

【0043】

（ｂ）の調節物質は、ＴＲＥＭ−１リガンドまたは活性化好中球であってよい。（ｃ）の「ＴＲＥＭ−１抗体」は、ＴＲＥＭ−１特異的ハイブリドーマ上清または精製抗体であってよい。（ｄ）で測定される活性は、レポーター構築物によって生産されるシグナルである。これらのシグナル伝達の例は、ＮＦＡＴ駆動ＬａｃＺ（β−ラクタマーゼルシフェラーゼ）生産によって引き起こされる発光である。

【0044】

本方法は、ＴＲＥＭ−１遮断抗体の同定のために調整され得る。ＴＲＥＭ−１遮断抗体を同定する方法には、（ａ）ＴＲＥＭ−１、シグナル伝達蛋白質およびレポーター構築物を発現する第一の細胞を培養すること；（ｂ）第一の細胞が活性化された好中球と培養された際に、当該細胞の活性を測定すること；（ｃ）第一の細胞と活性化された好中球の共培養を、ＴＲＥＭ−１抗体と接触させること；（ｄ）第一の細胞の活性が、（ｂ）で測定された活性よりも小さいことを測定すること、が含まれる。

【0045】

本方法はまた、ＴＲＥＭ−１刺激抗体を同定するように調整され得る。ＴＲＥＭ−１刺激抗体を同定する方法には、（ａ）ＴＲＥＭ−１、シグナル伝達蛋白質およびレポーター構築物を発現する第一の細胞を培養すること；（ｂ）第一の細胞の活性を測定すること；（ｃ）当該細胞とＴＲＥＭ−１抗体とを接触／培養させること；および（ｄ）第一の細胞の活性が、（ｂ）で測定された活性よりも大きいことを測定すること、が含まれる。

【0046】

本発明は、本明細書に開示される、遮断抗体を同定する方法によって同定され得るＴＲＥＭ−１遮断抗体に関する。上記および実施例に記載される方法を用いて試験する場合、本発明に従う抗体は、５０μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば４０μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば３０μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば２０μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば１０μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば５μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば１μｇ／ｍｌより低い濃度で、第一の細胞の活性を、５０％、例えば６０％、例えば７０％、例えば８０％、例えば９０％、例えば９５％、例えば１００％減少させることができる。本発明に従う抗体は、第一の細胞の活性を完全に消失させることができるものであってもよい。上記および実施例に記載される方法を用いて試験する場合、本発明に従う抗体は、１μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば０．９μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば０．８μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば０．７μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば０．６μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば０．５μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば０．４μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば０．３μｇ／ｍｌより低い濃度、例えば０．２μｇ／ｍｌより低い濃度で、第一の細胞の活性を消失させることができる。

【0047】

本発明はまた、本明細書で開示された方法以外の手段によって同定され得るＴＲＥＭ−１遮断抗体に関する。

【0048】

本明細書の「抗体」という用語は、特異的に抗原（ＴＲＥＭ−１）またはその一部に結合することができる、生殖系列免疫グロブリン配列に由来する、蛋白質のことを指す。当該用語には、任意のクラスまたはアイソタイプの全長抗体（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＹ）、およびその任意の単鎖またはフラグメントが含まれる。抗原、またはその一部に特異的に結合する抗体は、その抗原、またはその一部に排他的に結合してもよく、あるいは、限られた数の相同な抗原、またはその一部に結合してもよい。全長抗体はたいてい、少なくとも４つのポリペプチド鎖：ジスルフィド結合により相互接続した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。医薬上特別に関心のある免疫グロブリンサブクラスの１つは、ＩｇＧファミリーである。ヒトにおいて、ＩｇＧクラスは、その重鎖定常領域の配列に基づき、４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に細分され得る。軽鎖は、その配列組成の違いに基づき、κおよびλの２つのタイプに分けることができる。ＩｇＧ分子は、２つ以上のジスルフィド結合により連結した２つの重鎖と、１つのジスルフィド結合により１つの重鎖にそれぞれ結合した２つの軽鎖から成る。重鎖は、１つの重鎖可変領域（ＶＨ）と、最大３つの重鎖定常（ＣＨ）領域：ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含んでよい。軽鎖は、１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）と１つの軽鎖定常領域（ＣＬ）を含んでよい。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分することができ、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域の間に散在している。ＶＨおよびＶＬ領域は、一般的に、３つのＣＤＲと４つのＦＲから成り、Ｎ末端からＣ末端へ以下の順番で並んでいる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の超可変領域は、抗原と相互作用できる［結合］ドメインを形成し、一方、抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体および古典的補体システムの第一成分（Ｃ１ｑ）を含むが、これらに限定されない、宿主組織または因子への結合を媒介し得る。

【0049】

本発明の抗体は、単離されていてもよい。「単離された抗体」という用語は、抗体が生産された環境中の他の成分から分離および／または回収された、および／または、抗体が生産された環境中に存在する成分の混合物から精製された抗体のことを指す。

【0050】

抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって実行され得ることが示されているように、抗体の特定の抗原結合フラグメントは、本発明の文脈において好適であり得る。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書に記載される、ＴＲＥＭ−１などの抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）Ｓ、Ｆｖ（一般的に、抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（scFv; 例えば、Bird et al., Science 1988; 242:42S-426;および Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883参照）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（一般的にＶＨおよびＣＨＩドメイン）、およびｄＡｂ（一般的にＶＨドメイン）フラグメント；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、およびＶ−ＮＡＲドメイン；単鎖ＶＨおよび単鎖ＶＬを含む一価の分子；ミニボディ（minibodies）、ダイアボディ（diabodies）、トライアボディ（triabodies）、テトラボディ（tetrabodies）、およびカッパーボディ（kappa bodies）(例えば、Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57参照）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに１つ以上の単離されたＣＤＲまたは機能性パラトープ（単離されたＣＤＲもしくは抗原結合残基またはポリペプチドが会合または共に連結されて機能性抗体フラグメントを形成し得る）が含まれる。様々なタイプの抗体フラグメントが、例えばHolliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; WO2005040219、並びに公開されたU.S. Patent Applications 20050238646および20020161201において記載または概説されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる従来技術を用いて獲得され得、当該フラグメントは、完全な抗体と同じ方法での有用性について選別され得る。

【0051】

本発明の抗体は、ヒト抗体あるいはヒト化抗体であってよい。本明細書で用いられる「ヒト抗体」の用語は、フレームワーク領域の少なくとも一部および／またはＣＤＲ領域の少なくとも一部がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図されている。（例えば、ヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有してもよい。）さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来してもよい。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、インビトロのランダム変異もしくは部位特異的変異により導入された、あるいはインビボの体細胞変異により導入された変異）。

【0052】

このようなヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってよい。このようなヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから獲得されたＢ細胞を不死化細胞に融合した細胞などの、ハイブリドーマによって生産され得る。

【0053】

ヒト抗体は、ヒト生殖系列配列の選択に基づき構築された配列ライブラリーから単離され得、さらに天然および合成の配列多様性を有して多様化され得る。

【0054】

ヒト抗体は、インビトロのヒトリンパ球の免疫化と、それに続くリンパ球のエプスタイン・バーウイルスによる形質転換によって調製され得る。

【0055】

「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾型を指し、例えばヒト抗体と、別の物質または抗体との複合体である。

【0056】

本明細書で用いられる「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する１つ以上の配列（ＣＤＲ配列またはその一部）を含むヒト/非ヒトキメラ抗体を指す。ヒト化抗体は、従って、少なくともレシピエントの超可変領域の残基が、例えばマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種由来抗体（ドナー抗体）であって、所望の特異性、親和性、配列組成および機能性を有する抗体の、超可変領域の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。これらの修飾の一例は、1つ以上のいわゆる逆突然変異の導入であり、これらは一般的にドナー抗体に由来するアミノ酸残基である。抗体のヒト化は、当業者に知られる組換え技術を用いて実行され得る（例えば、Benny K. C. Loによって編集されたAntibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248参照）。軽鎖および重鎖可変ドメイン両方に対する好適なヒトレシピエントフレームワークは、例えば、配列または構造相同性により同定され得る。あるいは、定型的なレシピエントフレームワークが、例えば、構造、生物物理学的、および生化学的特性の知識に基づき、用いられてもよい。レシピエントフレームワークは、生殖系列由来、あるいは成熟抗体配列由来であり得る。ドナー抗体由来のＣＤＲ領域は、ＣＤＲ移植により移植され得る。ＣＤＲを移植したヒト化抗体は、ドナー抗体由来のアミノ酸残基の再導入（逆突然変異）がヒト化抗体の特性に有益な影響を有する、決定的なフレームワーク位置の同定により、例えば親和性、機能性および生物物理学的特性について、さらに最適化され得る。ドナー抗体に由来する逆突然変異に加えて、ヒト化抗体は、ＣＤＲまたはフレームワーク領域における生殖系列残基の導入、免疫原性エピトープの除去、部位特異的変異誘発、親和性成熟などによって、改変され得る。

【0057】

さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改善するように行われる。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインを含むであろうし、そのＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に一致し、かつ、そのＦＲ残基の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ残基である。ヒト化抗体はまた、場合により、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を含み得る。

【0058】

「ヒト化抗体誘導体」という用語は、ヒト化抗体の任意の修飾型を指し、例えば、ヒト化抗体と、別の物質または抗体との複合体である。

【0059】

本明細書で用いられる「キメラ抗体」という用語は、軽鎖および重鎖の遺伝子が、一般的に遺伝子操作により、異なる種を起源とする免疫グロブリン可変領域および定常領域から、構築された抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントは、ヒト定常セグメントとつながり得る。

【0060】

抗体のフラグメント結晶化可能領域（「Ｆｃ領域」/「Ｆｃドメイン」）は、抗体のＮ末端領域であり、定常ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体、並びにいくつかの補体系蛋白質と相互作用し得る。Ｆｃ領域は、抗体が免疫系と相互作用できるようにする。本発明のある局面において、抗体は、ＦＣ領域内に修飾を含むように改変されてよく、一般的に、例えば、数ある中で、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、蛋白質安定性および／または抗原依存性細胞傷害活性、またはその欠如などの、１つ以上の機能特性を変化させる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾されてもよく（例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に取り付けられ得る）、またはそのグリコシル化を変化させるように、修飾されてよく、再び抗体の１つ以上の機能性特性を変化させるように修飾されてよい。ＩｇＧ１抗体は、特定のＦｃ受容体の親和性の減少をもたらす変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａ）および、Ｃ１ｑ媒介補体結合の減少をもたらす変異（Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ）（ＥＵインデックスに従った残基番号）の１つ以上、場合により全てを含む、修飾Ｆｃドメインを保有してもよい。

【0061】

本発明の抗体のアイソタイプは、ＩｇＧであってよく、例えばＩｇＧ１、例えばＩｇＧ２、例えばＩｇＧ４であってよい。必要に応じて、抗体のクラスは既知の技術により、「スイッチ」されてよい。例えば、元々ＩｇＭ分子として生産された抗体が、ＩｇＧ抗体にクラススイッチされてよい。クラススイッチ技術はまた、あるＩｇＧサブクラスを、別のＩｇＧサブクラスへ変換するために用いられ得る：ＩｇＧ１からＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４；ＩｇＧ２からＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４；またはＩｇＧ４からＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２。異なるＩｇＧサブクラス由来の領域の組み合わせによる、定常領域キメラ分子の作成のための抗体改変もまた、実行され得る。

【0062】

ある実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域が修飾され、ヒンジ領域のシステイン残基の数が変わり、例えば、増加または減少する。本手法は、例えばBodmer et al により、U.S. Patent No. 5,677,425に、さらに記載されている。

【0063】

定常領域は、抗体を安定化させるため、例えば二価抗体が２つの一価のＶＨ−ＶＬフラグメントに分かれるリスクを減らすために、修飾され得る。例えば、ＩｇＧ４定常領域において、重鎖間のヒンジ部でのジスルフィド結合形成を安定化させるために、残基Ｓ２２８（ＥＵインデックスに従う残基番号）はプロリン（Ｐ）残基に変異され得る（例えば、Angal et al., Mol Immunol. 1995; 30: 105-8参照）。

【0064】

抗体またはそのフラグメントはまた、その相互性決定領域（ＣＤＲ）に関して規定されてもよい。本明細書で用いられる場合、「相補性決定領域」または「超可変領域」という用語は、抗原結合に関連するアミノ酸残基が存在する抗体の領域を指す。超可変性またはＣＤＲの領域は、抗体可変ドメインのアミノ酸アライメントにおいて最も可変性が高い領域として同定され得る。ＣＤＲ同定には、Ｋａｂａｔデータベースなどのデータベースを用いることができ、ＣＤＲは、例えば、軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５９（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）と、重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）とを含むと規定される; (Kabat et al. 1991;Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)、あるいは、ＣＤＲは、「超可変ループ」由来の残基（軽鎖可変ドメインの残基２６−３３（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917）と規定され得る。一般的に、本領域のアミノ酸残基の番号付けは、上記のKabat et al.に記載された方法によって行われる。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔ残基」および「Ｋａｂａｔに従った」なとのフレーズは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに対するこの番号付けシステムのことを指す。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク（ＦＲ）またはＣＤＲに対する短縮、または挿入に対応する、より少ない、またはさらなるアミノ酸を含んでよい。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲＨ２の残基５２の後にアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔに従った残基５２ａ、５２ｂおよび５２ｃ）を含んでよく、重鎖ＦＲ残基８２の後に、挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従った、残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。所与の抗体に対して、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けがされた配列を用いて、抗体の配列相同性領域でのアライメントにより、残基のＫａｂａｔ番号付けを行うことができる。

【0065】

「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書で規定されるＣＤＲ内に存在しないＶＨまたはＶＬアミノ酸残基のことを指す。

【0066】

ｍＡｂ０１７０抗体は、配列番号２に示す可変重鎖配列と、配列番号３に示す可変軽鎖配列を有する。本発明の抗体は、当該可変重鎖配列および／または当該可変軽鎖配列を含み得る。ｍＡｂ０１７０抗体は、配列番号２のアミノ酸３１−３５、５０−６８、および１０１−１１０と、配列番号３のアミノ酸２４−３８、５４−６０および９３−１０１で示されるＣＤＲ配列を有する。

【0067】

本発明に従った抗体の重鎖は、配列番号２のアミノ酸３１−３５（ＴＹＡＭＨ）のＣＤＲ１配列を含んでよく、これらのアミノ酸の１つは、異なるアミノ酸で置換されていてよい。

【0068】

本発明に従った抗体の重鎖は、配列番号２のアミノ酸５０−６８（ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ）のＣＤＲ２配列を含んでよく、これらのアミノ酸の１つ、２つまたは３つは、異なるアミノ酸で置換されていてよい。

【0069】

本発明に従った抗体の重鎖は、配列番号２のアミノ酸１０１−１１０（ＤＭＧＱＲＲＱＦＡＹ）のＣＤＲ３配列を含んでよく、これらのアミノ酸の１つ、２つまたは３つは、異なるアミノ酸で置換されていてよい。

【0070】

本発明に従った抗体の軽鎖は、配列番号３のアミノ酸２４−３８（ＲＡＳＥＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ）のＣＤＲ１配列を含んでよく、これらのアミノ酸の１つ、２つまたは３つは、異なるアミノ酸で置換されていてよい。

【0071】

本発明に従った抗体の軽鎖は、配列番号３のアミノ酸５４−６０（ＲＡＳＮＬＥＳ）のＣＤＲ２配列を含んでよく、これらのアミノ酸の１つまたは２つは、異なるアミノ酸で置換されていてよい。

【0072】

本発明に従った抗体の軽鎖は、配列番号３のアミノ酸９３−１０１（ＱＱＳＮＥＤＰＹＴ）のＣＤＲ３配列を含んでよく、これらのアミノ酸の１つまたは２つは、異なるアミノ酸で置換されていてよい。

【0073】

ｍＡｂ０１７０抗体は、配列番号２に示した重鎖配列と、配列番号３に示した軽鎖配列とを有する。本発明の抗体は、当該重鎖配列または当該軽鎖配列を含んでもよい。本発明の抗体の重鎖または軽鎖のいずれか、あるいは両方が、ｍＡｂ１０７０の変異体であってよい。ｍＡｂ０１７０抗体は、配列番号２のアミノ酸３１−３５、５０−６８、および１０１−１１０、および配列番号３のアミノ酸２４−３８、５４−６０、および９３−１０１で示されるＣＤＲ配列を有する。本発明の抗体は、これらのＣＤＲ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含んでもよい。

【0074】

本発明に従った抗体の重鎖は、配列番号２のアミノ酸１０１−１１０（ＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ）のＣＤＲＨ３配列を含んでよく、これらのアミノ酸の１つ、２つまたは３つは、異なるアミノ酸で置換されていてよい。

【0075】

「抗原」（Ａｇ）という用語は、Ａｇを認識する抗体（Ａｂ）を生産する免疫適格性の脊椎動物の免疫化に用いられる分子のことを指す。本明細書では、Ａｇは、より広義に用いられ、Ａｂにより特異的に認識される標的分子を含むように広く意図され、従って、免疫化プロセス、あるいは、例えばＡｂ作成のために用いられるファージディスプレイなどの他のプロセスで用いられる、当該分子のフラグメントまたは模倣物を含む。

【0076】

本明細書で用いられる、「エピトープ」という用語は、抗体（Ａｂ）などの「抗原結合ポリペプチド」とその対応する抗原（Ａｇ）間の分子相互作用という文脈で、規定される。一般的に、「エピトープ」は、Ａｂが特異的に結合するＡｇ上の範囲または領域、すなわちＡｂと物理的接触をしている範囲または領域を指す。物理的接触は、ＡｂおよびＡｇ分子間の原子に対する様々な基準（例えば、２−６Åの、例えば３Åの、例えば４Åの、例えば５Åの距離によるカットオフ；または溶媒露出度）を通して規定され得る。蛋白質エピトープは、Ａｂへの結合に直接関与しているＡｇのアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）と、Ａｂへの結合に直接関与していない他のアミノ酸残基、例えば、Ａｂにより効果的に遮断されたＡｇのアミノ酸残基、すなわちＡｂの「溶媒排除表面」および／または「フットプリント」内のアミノ酸残基とを含み得る。

【0077】

本明細書で用いられるエピトープという用語は、特異的にＴＲＥＭ−１抗体に結合する、ＴＲＥＭ−１の任意の特定の領域の結合領域の両方のタイプを含む。ＴＲＥＭ−１は、多くの異なるエピトープを含んでよく、成熟したＴＲＥＭ−１立体構造中で互いに近くに位置する、１つ以上の非隣接アミノ酸から成る立体構造エピトープと、ＴＲＥＭ−１に共有結合する分子構造から、全体あるいは一部が成る翻訳後エピトープ、例えば炭水化物群を含んでよいが、これらに限定されない。

【0078】

所与の抗体（Ａｂ）／抗原（Ａｇ）ペアのエピトープは、様々な実験的および計算的エピトープマッピング法を用いて、様々なレベルの詳細さで、記載および特徴付けされ得る。実験的方法には、当業界で知られる方法である、変異誘発、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素重水素交換質量分析法（ＨＸ−ＭＳ）および様々な競合結合方法が含まれる。それぞれの方法は独自の原則に依存しているため、エピトープの記述は、決定された方法と密接に繋がっている。従って、用いられたエピトープマッピング法によって、所与のＡｂ／Ａｇペアのエピトープは、異なって記載され得る。

【0079】

最も詳細なレベルにおいて、ＡｇとＡｂ間の相互作用のエピトープは、Ａｇ−Ａｂ相互作用に存在する原始的接触を規定する空間的座標、並びにそれらの結合熱力学への相対的寄与についての情報により記載され得る。より詳細でないレベルにおいて、エピトープは、ＡｇとＡｂ間の原始的接触を規定する空間的座標により特徴づけられ得る。さらに詳細でないレベルにおいて、エピトープは、例えばＡｂ：Ａｇ複合体における原子間の距離、または原子の溶媒露出度などの特定の基準により規定される、エピトープが含むアミノ酸残基によって規定され得る。よりさらに詳細でないレベルにおいて、エピトープは、例えば他のＡｂとの競合結合により、機能を通じて特徴付けられ得る。エピトープはまた、他のアミノ酸による置換が、ＡｂとＡｇ間の相互作用の特徴を変化させるであろうアミノ酸残基を含むものとして、より一般的に規定され得る。

【0080】

ＦａｂフラグメントなどのＡｂと、そのＡｇとの複合体の空間的座標により規定されるＸ線由来結晶構造の文脈において、エピトープという用語は、特記しない限り、または文脈と矛盾しない限り、本明細書において、Ａｂの重原子（すなわち非水素原子）から、例えば４Åの距離内に重原子を有することにより特徴付けられるＴＲＥＭ−１残基として、具体的に規定される。

【0081】

使用するエピトープマッピングの方法に依存して、エピトープの記述および規定は様々なレベルの詳細さで得られることから、同じＡｇ上の異なるＡｂに対するエピトープの比較は同様に、様々なレベルの詳細さで行われ得るということになる。

【0082】

例えばＸ線構造から規定される、アミノ酸レベルで記載されるエピトープは、同一のアミノ酸残基のセットを含む場合、同一であると言われる。少なくとも１つのアミノ酸をエピトープが共有している場合、エピトープは重複していると言われる。エピトープがアミノ酸残基を共有していない場合、エピトープは独立（特有）であると言われる。

【0083】

エピトープはまた、野生型ヒトＴＲＥＭ−１に対する抗体の結合動態を、予想されるエピトープ中にアラニン変異を有するヒトＴＲＥＭ−１変異体に対する結合動態と比較することによって、間接的に規定され得る。アミノ酸残基がアラニン残基で置換されているヒトＴＲＥＭ−１の変異体に対する抗体の親和性の減少、または結合の抑制は、変異したアミノ酸が、当該抗体と野生型ヒトＴＲＥＭ−１との相互作用に寄与していることを示す。本手法は、ネガティブなエピトープの同定を提供する。本方法は、蛋白質ミスホールディングまたはアンホールディングが相互作用の抑制と同様の結果を与え得ることから、エピトープを効果的に規定するという点で受け入れられる。本解析は、交差反応する抗体が存在する場合、オルソロガスな標的蛋白質（例えば、カニクイザルＴＲＥＭ−１）の機能獲得型突然変異の比較解析により、補完され得る。当該比較は、例えばカニクイザルＴＲＥＭ−１と交差反応しない抗体と、交差反応する抗体とのエピトープの違いを規定するだろう。

【0084】

エピトープの間接的な同定はまた、野生型抗原（ＴＲＥＭ−１）の変異体への、抗体（または抗体フラグメント）の結合を測定することにより、提供され得る。抗体またはそのフラグメントが、例えばカニクイザルではなくヒトＴＲＥＭ−１に結合する場合、および当該抗体またはそのフラグメントが、カニクイザルＴＲＥＭ−１のヒト化変異体にある程度結合できる場合、当該再結合は、置換されたアミノ酸残基が抗体の、抗原との相互作用にとって重要であることを示す。同様に、ヒトＴＲＥＭ−１と比較してカニクイザルＴＲＥＭ−１に弱い結合を有する抗ヒトＴＲＥＭ−１抗体（またはそのＦａｂフラグメント）の、カニクイザルＴＲＥＭ−１のヒト化変異体に対する親和性の増加は、結合エピトープを構成する残基の同定についての情報を提供し得る。

【0085】

任意の所与の交差反応する抗体の同一の変異の効果は、可能性のある蛋白質ミスホールディング（両抗体への結合の抑制）と、ヒトＴＲＥＭ−１の相互作用の損失（一方の抗体には結合し、他方の抗体への結合は抑制される）との区別を可能にし、交差反応しない抗体と、交差反応する抗体とのアミノ酸レベルでのエピトープの違いについての情報を明確に与える。

【0086】

本発明の抗体は、例えば表面プラズモン共鳴を用いて決定されるように、ヒトＴＲＥＭ−１の変異体に結合することができる。

【0087】

本発明の抗体は、例えば表面プラズモン共鳴を用いて決定されるように、カニクイザルＴＲＥＭ−１の変異体に結合することができる。

【0088】

本発明の抗体は、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合することができる抗体であって、ヒトＴＲＥＭ−１の（ｉ）Ａ２１、Ｔ２２、Ｋ２３、Ｌ２４、Ｔ２５、Ｅ２６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、および（ｉｉ）Ａ４９、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｑ５２、Ｋ５３、Ａ５４、Ｗ５５、Ｑ５６、Ｉ５７、Ｉ５８、Ｒ５９、Ｄ６０、Ｇ６１、Ｅ６２、Ｍ６３、Ｐ６４、Ｋ６５、Ｔ６６、Ｌ６７、Ａ６８、Ｃ６９、Ｔ７０、Ｅ７１、Ｒ７２、Ｐ７３、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｎ７６、Ｓ７７、Ｈ７８、Ｐ７９、Ｖ８０、Ｑ８１、Ｖ８２、Ｇ８３、Ｒ８４、Ｉ８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、および（ｉｉｉ）Ｃ１１３、Ｖ１１４、Ｉ１１５、Ｙ１１６、Ｑ１１７、Ｐ１１８およびＰ１１９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基と特異的に結合することができる抗体であってよい。

【0089】

本発明の抗体は、例えばＨＸ−ＭＳまたはＸ線回折を用いて決定されるように、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のアミノ酸Ｃ３８−Ｆ４８を含むポリペプチドに特異的に結合することができる抗体であってよい。

【0090】

本発明の抗体は、例えばＨＸ−ＭＳまたはＸ線回折を用いて決定されるように、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のアミノ酸残基Ｄ３８、Ｖ３９、Ｋ４０、Ｃ４１、Ｄ４２、Ｙ４３、Ｔ４４およびＬ４５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全て、および、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のＥ４６、Ｋ４７およびＦ４８からなる群から選択されるアミノ酸残基の１つ、２つ、または全てを含むエピトープを有してもよい。

【0091】

本発明の抗体は、例えばＴＲＥＭ−１の変異体および表面プラズモン共鳴を用いて決定されるように、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のＤ４２、Ｅ４６、Ｄ９２およびＨ９３からなる群から選択されるアミノ酸残基の１つ、２つ、３つ、または全てを含むエピトープを有してもよい。

【0092】

本発明の抗体は、ＴＲＥＭ−１の変異体および表面プラズモン共鳴を用いて決定されるように、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のうち、少なくともアミノ酸残基Ｅ４６および／またはＤ９２を含むエピトープを有してもよい。

【0093】

本発明の抗体は、さらに、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のＬ３１、Ｉ８６およびＶ１０１からなる群から選択されるアミノ酸残基の１つ、２つ、または全てを含んでもよい。

【0094】

本発明の抗体は、例えば、ＨＸ−ＭＳまたはＸ線回折を用いて決定されるように、カニクイザルＴＲＥＭ−１（配列番号１７）のアミノ酸残基Ｅ１９−Ｌ２６を含むポリペプチドに特異的に結合することができる抗体であってよい。

【0095】

本発明の抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１に特異的に結合することができる抗体であって、当該抗体のエピトープが、配列番号１のＶ３９、Ｋ４０、Ｃ４１、Ｄ４２、Ｙ４３、Ｌ４５、Ｅ４６、Ｋ４７、Ｆ４８からなる群から選択されるアミノ酸残基の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または全てを含む抗体であってよい。

【0096】

本発明の抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１に特異的に結合することができる抗体であって、当該抗体のエピトープが配列番号１のＤ４２を含む抗体であってよい。本発明の抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１に特異的に結合することができる抗体であって、当該抗体のエピトープが配列番号１のＥ４６を含む抗体であってよい。当該抗体のエピトープは、配列番号１のＶ３９、Ｃ４１、Ｄ４２、Ｙ４３、Ｌ４５を含んでもよい。当該抗体のエピトープは、配列番号１のＥ４６、Ｋ４７およびＡ４９を含んでもよい。当該抗体のエピトープはさらに、配列番号１のＦ４８を含んでもよい。

【0097】

用語「パラトープ」の定義は、視点を反転させることにより、「エピトープ」の上述の定義に由来するものである。従って、「パラトープ」という用語は、抗原が特異的に結合する、すなわち、抗原と物理的接触を行う、抗体上の範囲または領域のことを指す。

【0098】

Ｆａｂフラグメントなどの抗体とその抗原との複合体の空間的座標により規定されるＸ線由来結晶構造の文脈において、、パラトープという用語は、特記しない限り、または文脈と矛盾しない限り、本明細書において、ＴＲＥＭ−１の重原子（すなわち非水素原子）から４Åの距離内に重原子を有することにより特徴付けられる抗体残基として、具体的に規定される。

【0099】

所与の抗体（Ａｂ）／抗原（Ａｇ）ペアのエピトープおよびパラトープは、通例の方法で同定され得る。例えば、エピトープの一般的な位置は、抗体が、ＴＲＥＭ−１ポリペプチドの異なるフラグメントまたは変異体に結合する能力を評価することによって、決定され得る。抗体と接触するＴＲＥＭ−１内の特異的アミノ酸（エピトープ）および、ＴＲＥＭ−１と接触する抗体内の特異的アミノ酸（パラトープ）はまた、通例の方法を用いて決定され得る。例えば、抗体および標的分子が組み合わされ得、Ａｂ：Ａｇ複合体が結晶化され得る。当該複合体の結晶構造が決定され、抗体とその標的の間の相互作用の特異的部位の同定に用いられ得る。

【0100】

同じ抗原に結合する抗体は、共通抗原に同時に結合する能力に関して特徴づけることができ、「競合結合」／「ビニング（binning）」に供し得る。本文脈において、「ビニング」という用語は、同じ抗原に結合する抗体をグループ分けする方法のことを指す。抗体の「ビニング」は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーなどの標準的技術に基づくアッセイにおいて、共通抗原への２つの抗体の競合結合に基づき得る。

【0101】

抗体の「ビン（bin）」は、参照抗体を用いて規定される。第二の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合できない場合、当該第二の抗体は参照抗体と同じ「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体と第二の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合し、「競合抗体」となる。第二の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合できる場合、当該第二の抗体は別の「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体と第二の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合せず、「非競合抗体」となる。

【0102】

抗体「ビニング」は、エピトープについて直接の情報を与えない。競合抗体、すなわち、同じ「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープ、重複するエピトープ、または別々のエピトープさえ有し得る。後者は、抗原上のエピトープに結合する参照抗体が、第二の抗体が抗原上のエピトープに接触するのに必要な空間を占める場合である（立体障害）。非競合抗体は、一般的に、別々のエピトープを有する。

【0103】

本発明の抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１への結合において、ｍＡｂ０１７０と競合し得る。本発明の抗体は、カニクイザルＴＲＥＭ−１への結合において、ｍＡｂ０１７０と競合し得る。言い換えれば、本発明の抗体は、ｍＡｂ０１７０と同じ「ビン」に属し得る。

【0104】

本明細書の「結合親和性」という用語は、２つの分子間（例えば、抗体あるいはそのフラグメントと、抗原の間）の、非共有結合性の相互作用の強度の測定値のことを指す。「結合親和性」という用語は、一価の相互作用（固有活性）を述べるために用いられる。

【0105】

例えば、抗体またはそのフラグメントと抗原となどの、２つの分子間の一価の相互作用による結合親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の決定により定量され得る。次に、Ｋ_Ｄは、例えばＳＰＲ法により、複合体の形成および解離の動態を測定することにより、決定され得る。一価の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋ_ａ（またはｋ_ｏｎ）、および解離速度定数ｋ_ｄ（またはｋ_ｏｆｆ）と呼ばれる。Ｋ_Ｄは、式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａにより、ｋ_ａおよびｋ_ｄと関連している。

【0106】

上述の規定に従い、異なる分子相互作用に関連する結合親和性、例えば所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較は、それぞれの抗体/抗原複合体に対するＫ_Ｄ値の比較により比較されてよい。

【0107】

本発明の抗体は、表面プラズモン共鳴を用いて決定されるように、１×１０^−７Ｍ以下、１×１０^−８Ｍ以下、または１×１０^−９Ｍ以下、または１×１０^−１０Ｍ以下、１×１０^−１１Ｍ以下、１×１０^−１２Ｍ以下または１×１０^−１３Ｍ以下の親和性（Ｋ_Ｄ）でヒトＴＲＥＭ−１と結合し得る。本発明の抗体は、表面プラズモン共鳴を用いて決定されるように、１×１０^−７Ｍ以下、１×１０^−８Ｍ以下、または１×１０^−９Ｍ以下、または１×１０^−１０Ｍ以下、１×１０^−１１Ｍ以下、１×１０^−１２Ｍ以下または１×１０^−１３Ｍ以下の親和性（Ｋ_Ｄ）で、カニクイザルＴＲＥＭ−１に結合し得る。

【0108】

本明細書における「結合特異性」という用語は、抗体またはそのフラグメントなどのある分子と、単一の排他的抗原との、あるいは限られた数の非常に相同な抗原（またはエピトープ）との相互作用を指す。対照的に、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合できる抗体は、類似しない分子に結合できない。本発明に従う抗体は、Ｎｋｐ４４、ナチュラルキラー細胞ｐ４４関連蛋白質に結合できない可能性がある。

【0109】

相互作用の特異性、および平衡結合定数の値は、よく知られている方法によって、直接的に決定され得る。リガンド（例えば抗体）が、その標的に結合する能力を評価するための標準的アッセイは、当業界で知られており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー解析が含まれる。抗体の結合動態および結合親和性はまた、当業界で知られる標準的アッセイ、例えばＳＰＲにより評価され得る。

【0110】

競合結合アッセイは、抗体の標的への結合を、当該標的の別のリガンド、例えば別の抗体による標的への結合と比較することで、行われ得る。

【0111】

別の局面において、本発明は、本発明の分子、例えば、本明細書に記載のＴＲＥＭ−１抗体、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞を含む、組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、本発明の１つ以上のＴＲＥＭ−１抗体を含み、医薬上許容される担体と共に処方される医薬組成物を提供する。

【0112】

従って、本発明の１つの目的は、０．２５ｍｇ／ｍｌから２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、例えば１０から２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する当該ＴＲＥＭ−１抗体を含む医薬製剤を提供することであり、当該製剤は、ｐＨ２．０から１０．０、例えばｐＨ４．０から８．０を有する。当該製剤は、さらに、緩衝系、防腐剤、等張化剤、キレート剤、安定剤および／または界面活性剤の１つ以上、並びにそれらの様々な組み合わせを含んでもよい。医薬組成物における防腐剤、等張剤、キレート剤、安定剤および界面活性剤の使用は、当業者によく知られている。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照することができる。

【0113】

ある実施形態において、医薬製剤は水性製剤である。当該製剤は、一般的に水溶液または懸濁液であるが、コロイド、分散、エマルジョン、および多相の物質もまた含んでよい。「水性製剤」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として規定される。同様に、「水性水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む水溶液として規定され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として規定される。

【0114】

別の実施形態において、医薬製剤は、凍結乾燥製剤であり、使用に先立ち、医師または患者が、これに溶剤および／または希釈液を添加する。

【0115】

さらなる局面において、医薬製剤は、抗体の水溶液とバッファーとを含み、抗体は、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で存在し、当該製剤は約２．０から１０．０のｐＨ、例えば４．０から８．０のｐＨを有する。

【0116】

本発明のＴＲＥＭ−１抗体およびこれらの抗体を含む医薬組成物は、次のような炎症性疾患の治療に用いられてもよい：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、過敏性腸症候群、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、Ｉ型糖尿病、グレーブス病、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性心筋炎、川崎病、冠動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、全身性強皮症、変形性関節症、アトピー性皮膚炎、白斑、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、アレルギー、喘息および、急性または慢性炎症のいずれかの結果の他の自己免疫疾患。

【0117】

本発明のＴＲＥＭ−１抗体は、炎症性腸疾患を患う個体の治療に用いるのに好適であり得る。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、口から肛門までの消化管の任意の部分に影響を及ぼし、様々な症状を引き起こし得る。ＩＢＤは主に、腹痛、下痢（血性であってもよい）、嘔吐、または体重減少を引き起こすが、発疹、関節炎、目の炎症、疲労および集中力の欠如などの消化管の外側の合併症もまた引き起こし得る。ＩＢＤの患者は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とクローン病（ＣＤ）の、２つのクラスに分けることができる。ＣＤは一般的に回腸と結腸に影響を与え、腸のあらゆる領域に影響を与え得るが、しばしば非連続的である（疾病の病巣は腸全体に広がる）。ＵＣは、常に直腸（結腸の）に影響を与え、より連続的である。ＣＤにおいて、炎症は貫膜性であり、膿瘍、瘻孔および狭窄をもたらすが、ＵＣにおいて、炎症は一般的に粘膜に限定される。クローン病の薬学的または外科的治癒は知られていないが、ＵＣを患っている一部の患者は、結腸の外科的除去により治癒できる。治療の選択肢は、症状を制御すること、寛解を維持すること、再発を防止することに制限されている。臨床における炎症性疾患の有効性は、臨床検査およびクオリティー・オブ・ライフアンケートに基づくスコアリングスケールである、ＣＤのクローン病活性指数（ＣＤＡＩ）スコアの減少として測定され得る。動物モデルにおいて、有効性は、体重の増加、および便の硬さ、体重、および便中の血液の組み合わせである疾病活性指数（ＤＡＩ）の増加によってもまた、主に測定される。

【0118】

本発明のＴＲＥＭ−１抗体は、関節リウマチを有する個体の治療における使用に好適であり得る。関節リウマチ（ＲＡ）は、全身とはいかないまでも、ほぼ全身に影響する全身性疾病であり、関節炎の最も一般的な形式の１つである。関節リウマチは、関節の炎症を特徴とし、痛み、硬直、温感、発赤および腫脹を引き起こす。この炎症は、炎症細胞が関節に浸潤した結果であり、これらの炎症細胞は骨や軟骨を分解し得る酵素を放出する。その結果、当該炎症は、生理的効果の中でも特に、重篤な骨および軟骨の損傷につながり、また関節の劣化や激しい痛みにつながり得る。影響を受けた関節は、その形や配置を失い、その結果痛みや運動の喪失に至り得る。

【0119】

当業界で知られる、関節リウマチの動物モデルがいくつか存在する。例えば、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて、マウスはヒト関節リウマチに類似した炎症性関節炎を発症する。ＣＩＡは、ＲＡと同様の免疫学的および病理学的な特徴を有するため、潜在的なヒト抗炎症化合物を選別する好適なモデルとなる。本モデルの有効性は、関節腫脹の減少により測定される。臨床でのＲＡにおける有効性は、関節腫脹、赤血球沈降速度、Ｃ反応性タンパク質レベルおよび、抗シトルリン化蛋白質抗体などの血清因子のレベルの組み合わせとして測定される、患者の症状を減少させる能力により測定される。

【0120】

本発明のＴＲＥＭ−１抗体は、乾癬を有する個体の治療における使用に好適であり得る。乾癬は、相当な不快感を引き起こし得る、皮膚のＴ細胞媒介炎症性疾患である。乾癬は、現在のところ治療法がない疾病であり、全ての年齢の人々に発症する。軽度の乾癬の個体はしばしば、外用薬でその疾病を制御し得るが、世界中の１００万人を超える患者が、紫外線治療または全身性免疫抑制療法を必要としている。残念ながら、紫外線照射の不便さと危険性、および治療を繰り返すことによる毒性が、それらの長期間の使用を制限している。その上、患者はたいてい乾癬を再発し、いくつかの症例では免疫抑制療法中止後、すぐにリバウンドする。ＣＤ４＋Ｔ細胞の移植に基づく、最近開発された乾癬のモデルは、ヒト乾癬の多くの点を模倣しており、従って乾癬の治療において使用するのに好適な化合物の同定に用いられ得る（Davenport et al., Internat. Immunopharmacol 2:653-672, 2002）。本モデルの有効性は、皮膚病変の減少により、採点システムを用いて測定される。同様に、患者における有効性は、皮膚病変の減少により測定される。

【0121】

本発明のＴＲＥＭ−１抗体は、乾癬性関節炎の個体の治療における使用に好適であり得る。乾癬性関節炎（ＰＡ）は、乾癬の患者のサブセットで生じる炎症性関節炎の一種である。これらの患者において、皮膚の病態／症状は、関節リウマチでみられるのと同様の関節腫脹が伴う。ＰＡは、落屑を伴った、斑状の、膨らんだ、赤い、皮膚の炎症の領域を特徴とする。乾癬はしばしば、肘および膝の先端、頭皮、へそ、および生殖器部分または肛門の周辺に発症する。乾癬を有する患者のおよそ１０％はまた、関節の随伴性の炎症を発症する。

【0122】

本明細書で用いられる「治療」という用語は、それを必要とする任意のヒトまたは他の動物対象の医学療法を指す。当該対象は、当該治療の使用が、当該ヒトまたは他の動物対象の健康に有益であることを示す、仮の診断または確定診断を下した医師または獣医師によって身体診察をうけると予想される。当該治療のタイミングと目的は、対象の健康の減少などの多くの因子に従い、個人によって異なってよい。従って、当該治療は、予防的、緩和的、対症的、および／または根治的であってよい。

【0123】

本発明に関して、予防的、緩和的、対症的および／または根治的治療は、本発明の別々の局面を表し得る。

【0124】

本発明の抗体は、例えば静脈内に、例えば筋肉内に、例えば皮下になど、非経口的（parenterally）に投与され得る。あるいは、本発明の抗体は、非経口的ではない経路（non-parenteral route）で、例えば経口的に、または局所的に投与され得る。本発明の抗体は予防的に投与されてもよい。本発明の抗体は治療的に投与されてもよい（要求に応じて）。

【0125】

本発明の第一の局面において、配列番号３（ｍＡｂ０１７０の可変軽鎖）のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域の負荷電残基の置換は、ｍＡｂの粘度に影響を与えることが観察された。本発明の当該第一の局面において、本発明のｍＡｂは、重鎖および軽鎖を有するｍＡｂ０１７０の変異体であって、ｍＡｂ０１７０の軽鎖、つまり配列番号３が、配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域の負荷電残基が非荷電残基で置換される変異を含む変異体である。従って、本発明のある局面は、配列番号３の残基Ｄ１、Ｄ３０、Ｄ３３、Ｄ７４、Ｄ９８、Ｅ２７、Ｅ９７のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基で置換することを含む、ｍＡｂ０１７０の変異体に関する。言い換えれば、本発明の興味深い実施形態は、重鎖として配列番号２（またはその変異体）を含み、軽鎖として配列番号３の変異体を含む、抗体またはそのフラグメントであって、配列番号３の残基Ｄ１、Ｄ３０、Ｄ３３、Ｄ７４、Ｄ９８、Ｅ２７、Ｅ９７のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせが、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異している抗体またはそのフラグメントに関する。これらの変異は、「チャージパッチ」変異と呼べるであろう。好ましい実施形態において、配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域のＥ２７およびＥ９７の少なくとも１つまたは両方が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸などの、非荷電アミノ酸残基で置換されている。好ましい実施形態において、配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域のＥ２７が、グルタミンに変異し、Ｅ９７が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸、さらに好ましくはセリンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。さらなる実施形態において、Ｅ２７は未変異のままであり、Ｅ９７はグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸、さらに好ましくはセリンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。別の実施形態において、残基Ｅ９７は未変異のままであり、Ｅ２７はグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸、さらに好ましくはセリンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

【0126】

本発明の別の局面は、Ｆａｂ−Ｆａｂ二量体が、パラトープ領域における相互作用に起因して形成されるという知見に基づいている。ｍＡｂは２つのＦａｂを含むため、ｍＡｂは多量体化することができ、粘度特性に影響を与え得ると想定された。従って、本発明の別の局面は、配列番号２のＦａｂ−Ｆａｂ相互作用領域（つまり、ｍＡｂ０１７０の可変重鎖領域）の残基を変異させて、Ｆａｂ−Ｆａｂ二量体化を減らすことに関する。これらの変異は、「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異と呼ばれる。従って、本発明のある局面は、配列番号２の残基Ｙ３２、Ｒ５２、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｎ５７、Ａ５９、Ｍ１０２、Ｉ１０４およびＲ１０６、または配列番号３の残基Ｆ３２、Ｄ３３、Ｙ３４、Ｙ５３、Ｒ５４、Ｄ９８のいずれか１つを、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基で置換することに関する。言い換えれば、本発明の興味深い実施形態は、配列番号２の変異体を含む抗体またはそのフラグメントであって、配列番号２の残基Ｙ３２、Ｒ５２、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｎ５７、Ａ５９、Ｍ１０２、Ｉ１０４およびＲ１０６、または配列番号３の残基Ｆ３２、Ｄ３３、Ｙ３４、Ｙ５３、Ｒ５４、Ｄ９８(「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異)のいずれか１つが、他のアミノ酸、例えば天然のアミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基で置換されている抗体またはそのフラグメントに関する。好ましくは、配列番号２の残基Ａ５９およびＮ５７の少なくとも１つが、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基、さらに好ましくはセリンまたはチロシンに変異している。ある実施形態において、Ａ５９は未変異のままであり、Ｎ５７はグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基、さらに好ましくはセリンまたはチロシンに変異している。別の実施形態において、Ｎ５７は未変異のままであり、Ａ５９はグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異している。少なくとも１つの実施形態において、Ａ５９およびＮ５７の両方がグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基、さらに好ましくはセリンまたはチロシンに変異している。

【0127】

興味深い実施形態において、ｉ）配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域の少なくとも１つの負荷電残基が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異しており、ｉｉ）配列番号２の残基Ｙ３２、Ｒ５２、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｎ５７、Ａ５９、Ｍ１０２、Ｉ１０４およびＲ１０６、または配列番号３の残基Ｆ３２、Ｄ３３、Ｙ３４、Ｙ５３、Ｒ５４、Ｄ９８(「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異)の少なくとも１つの残基が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、およびトリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異している。

【0128】

好適な実施形態において、配列番号３のＥ２７およびＥ９７の１つまたは両方が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変異しており、配列番号２のＡ５９およびＮ５７の１つまたは両方が、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基、さらに好ましくはセリンまたはチロシンに変異している。

【0129】

本発明のさらなる局面は、ＴＲＥＭ−１の配列番号１の位置Ｙ９０のＡｌａ置換が、配列番号３のＴＲＥＭ−１への親和性を改善したという知見に基づいている。Ｙ９０は、配列番号３のフェニルアラニン残基と相互作用することが見出された。Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用を改善するための配列番号３の変異は、Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用変異と呼ばれる。本発明の当該局面のある実施形態において、配列番号３の位置３２のフェニルアラニンは、アミノ酸残基グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニンから選択される、好ましくはアラニン、グリシン、セリンバリンおよびロイシンから選択されるアミノ酸に変異している。興味深い実施形態において、配列番号３のＦ３２は、アラニンまたはセリンに変異している。

【0130】

配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３におけるチャージパッチ変異は、流体力学半径（Ｒｈ）を減少させたが、Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用領域の変異は、Ｒｈを増加させた（図６）。「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」部位の変異はＲｈに影響を与えず、粘度への効果はほとんどなかった（図６および１、表３Ｃおよび３Ｅ）。

【表1】

【0131】

ｍＡｂ０１７０変異体について、粘度をＤＬＳまたはマイクロレオロジーにより決定し、「チャージパッチ」変異と「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異の両方が粘度を減少させることを示した。チャージパッチ変異Ｅ２７ＱおよびＥ９７Ｑを含むｍＡｂ変異体０３１８が、最低の粘度を有することが分かった。

【0132】

ヒトＴＲＥＭ−１−ＦｃおよびカニクイザルＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対するｍＡｂ０１７０変異体の結合動態を、それぞれ決定した。ｍＡｂ０１７０変異体は全て、ヒトＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対して同様の親和性を有することがわかった。興味深いことに、ｍＡｂ変異体である「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」変異を含む配列番号９は、カニクイザルＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対し親和性が増加していることが分かった（表２）。

【表2】

【0133】

ＴＲＥＭ−１に対する親和性の改善と低い粘度との両方を有する実施形態において、配列番号９由来の変異を、配列番号５の変異と組み合わせ、配列番号１４由来の軽鎖を作成し、配列番号１４由来の軽鎖の変異をさらに、配列番号１６の重鎖の変異と組み合わせた。カニクイザルＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対する親和性の増加は、組み合わされた配列番号１４の変異を含むｍＡｂ変異体で保持され、当該変異は、ヒトＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対する親和性に悪影響を与えなかった。従って、「チャージパッチ」変異および「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」変異の両方を含む実施形態、並びに「チャージパッチ」変異および「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異の両方を含む実施形態、並びに「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異および「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」変異の両方を含む実施形態、および「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異、「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」変異および「チャージパッチ」変異を含む実施形態が、本発明によって想定される。

【表3A】

【表3B】

【表3C】

【表3D】

【表3E】

【0134】

本発明の、非限定的な実施形態には、以下がさらに含まれる：
１．配列番号１のＴＲＥＭ−１に結合して遮断することができる抗体またはそのフラグメントであって、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、５ｃＰ未満の粘度、例えば４ｃＰ未満の粘度、好ましくは３ｃＰ未満の粘度を有することを特徴とする、抗体またはそのフラグメント（粘度対蛋白質濃度の条件を決定する方法は、従来の方法であるか、本明細書に記載された方法である。）

【0135】

２．ＴＲＥＭ−１に結合して遮断することができる抗体またはそのフラグメントであって、８０ｍｇ／ｍＬの濃度で、５ｃＰ未満の粘度、好ましくは４ｃＰ未満の粘度を有することを特徴とする、抗体またはそのフラグメント（粘度対蛋白質濃度の条件を決定する方法は、従来の方法であるか、本明細書に記載された方法である。）

【0136】

３．配列番号１に対して、０．５ｎＭより小さいＫＤ、例えば０．４ｎＭより小さいＫＤ、好ましくは０．３ｎＭより小さいＫＤを有し、ＴＲＥＭ−１の機能を遮断する、実施形態１または２に従う抗体またはそのフラグメント。

【0137】

４．配列番号１への結合に対し、ｍＡｂ０１７０と競合的に結合し、以下の粘度プロファイルを有する、抗体またはそのフラグメント：
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、５ｃＰ未満の粘度、例えば４ｃＰ未満の粘度、好ましくは３ｃＰ未満の粘度を有する、抗体またはその抗体の抗体フラグメント：または
（ｂ）８０ｍｇ／ｍＬの濃度で、５ｃＰ未満の粘度、好ましくは４ｃＰ未満の粘度を有する、抗体またはその抗体の抗体フラグメント。

【0138】

５．配列番号２の「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異を有し、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合して遮断することができる抗体またはそのフラグメント。

【0139】

６．「チャージパッチ」変異を有する、例えば配列番号３のＣＤＲ１およびＣＤＲ３の負荷電残基の少なくとも１つが非荷電残基で置換されている、配列番号１のＴＲＥＭ−１に特異的に結合して遮断することができる抗体またはそのフラグメント。

【0140】

７．負荷電アミノ酸が、水素結合パートナーを形成できるアミノ酸残基で置換されている、例えば、ＡｓｐおよびＧｌｕ残基のＡｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒのいずれかへ変異している、本発明の実施形態のいずれか１つに従う抗体またはそのフラグメント。

【0141】

８．ｍＡｂ０１７０と比較して低い粘度を有するが、尚０．５ｎＭよりも小さい配列番号１に対するＫ_Ｄを有する、本発明の実施形態のいずれか１つに従う抗体またはそのフラグメント。

【0142】

９．特異的「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」に関連する、配列番号２および／または３の非荷電アミノ酸を、サイズまたは水素結合能が変更されたアミノ酸で置換することにより、ｍＡｂ０１７０と比較して粘度が低く、０．５ｎＭよりも小さい配列番号１に対するＫ_Ｄと、０．６ｎＭよりも小さい配列番号１７に対するＫ_Ｄとを有する、本発明の実施形態のいずれか１つに従う抗体またはそのフラグメント。

【0143】

１０．配列番号１のＴＲＥＭ−１に特異的に結合して遮断することができ、かつ、配列番号２もしくは配列番号３の変異体、またはその両方を含み、当該変異体が、配列番号２または配列番号３の「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異、「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」変異および「チャージパッチ」変異からなる群から選択される、本発明の実施形態のいずれか１つに従う抗体またはそのフラグメント。

【0144】

１１．「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」変異を含む、例えば配列番号３のＰｈｅ残基がＡｌａまたはＳｅｒで置換されている、、本発明の実施形態のいずれか１つに従う抗体またはそのフラグメント。

【0145】

１２．配列番号１への結合に対して配列番号２または３と競合し、かつ、配列番号１のアミノ酸残基Ｄ３８、Ｖ３９、Ｋ４０、Ｃ４１、Ｄ４２、Ｙ４３、Ｔ４４およびＬ４５のうち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは全て、およびアミノ酸残基Ｅ４６、Ｋ４７、Ｆ４８のうち、１つ、２つまたは全てを含むエピトープを有する、本発明の実施形態のいずれか１つに従う抗体またはそのフラグメント。

【0146】

１３．結合に対して配列番号３と競合し、配列番号３の位置２７および９７のグルタミン酸（Ｅ）残基の１つまたは両方がセリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）に変異している、例えばＥ２７Ｑ、Ｅ９７Ｓを有する、例えばＥ２７およびＥ９７の両方がグルタミンに変異している、あるいはＥ２７は未変異のままであり、Ｅ９７はＳに変異している（Ｅ２７、Ｅ９７Ｓ）、またはＥ２７は未変異のままであり、Ｅ９７はＱに変異している（Ｅ２７、Ｅ９７Ｑ）、またはＥ９７は未変異のままであり、Ｅ２７はＱまたはＳに、さらに好ましくはＱに変異している（Ｅ２７、Ｅ９７Ｑ）ＬＣを含む、本発明の実施形態のいずれかに従う抗体またはそのフラグメント。

【0147】

１４．配列番号３を含み、位置３２のフェニルアラニン（Ｆ３２）が、例えばＡ（ｍＡｂ０３２２）またはＳ（ｍＡｂ０３２３）に変異している、本発明の実施形態のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。

【0148】

１５．配列番号２を含み、残基Ｎ５７および残基Ａ５９の１つまたは両方が変異している、例えば残基Ａ５９がチロシンに変異している、あるいは残基Ｎ５７がセリンに変異している、あるいは残基Ｎ５７がセリンに変異し、かつ残基Ａ５９がチロシンに変異している、実施形態のいずれか１つに従う抗体またはそのフラグメント。

【0149】

１６．特異的Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用に関連する非荷電アミノ酸が、サイズまたは水素結合能が変更されたアミノ酸で置換されている、例えば、アラニン（Ａ）またはアスパラギン（Ｎ）が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐのいずれか１つで置換されている、配列番号２の変異体を含む抗体またはそのフラグメント。

【0150】

１７．結合に対して配列番号３と競合し、配列番号３の位置２７および９７のグルタミン酸（Ｅ）残基の１つまたは両方がセリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）に変異している、例えばＥ２７およびＥ９７の両方がグルタミンに変異している（３１８）、あるいはＥ２７は未変異のままでありＥ９７はＳに変異している（Ｅ２７、Ｅ９７Ｓ）、あるいはＥ２７は未変異のままでありＥ９７はＱに変異している（Ｅ２７、Ｅ９７Ｑ）、あるいはＥ９７は未変異のままでありＥ２７はＱまたはＳに、さらに好ましくはＱに変異している（Ｅ２７、Ｅ９７Ｑ）、配列番号３の変異体を含む、抗体またはそのフラグメント。

【0151】

１８．配列番号２と結合を競合し、残基Ｎ５７および残基Ａ５９の１つまたは両方が変異している、例えば残基Ａ５９がチロシンに変異している、あるいは残基Ｎ５７がセリンに変異している、あるいは残基Ｎ５７がセリンに変異し、かつ残基Ａ５９がチロシンに変異している、配列番号２の変異体を含む、抗体またはそのフラグメント。

【0152】

１９．配列番号４を含む抗体またはそのフラグメント。

【0153】

２０．配列番号５を含む抗体またはそのフラグメント。

【0154】

２１．配列番号６を含む抗体またはそのフラグメント。

【0155】

２２．配列番号７を含む抗体またはそのフラグメント。

【0156】

２３．配列番号８を含む抗体またはそのフラグメント。

【0157】

２４．配列番号９を含む抗体またはそのフラグメント。

【0158】

２５．配列番号１０を含む抗体またはそのフラグメント。

【0159】

２６．配列番号１１を含む抗体またはそのフラグメント。

【0160】

２７．配列番号１２を含む抗体またはそのフラグメント。

【0161】

２８．配列番号１３を含む抗体またはそのフラグメント。

【0162】

２９．配列番号１４を含む抗体またはそのフラグメント。

【0163】

３０．配列番号１５を含む抗体またはそのフラグメント。

【0164】

３１．配列番号１６を含む抗体またはそのフラグメント。

【0165】

３２．配列番号４−１６のいずれか１つを含む抗体またはそのフラグメント。

【0166】

３３．実施形態１−３２のいずれかにおいて規定される抗体を含む、組成物。

【0167】

３４．医薬として使用するための、例えば実施形態１−３２に記載される、本発明の抗体。

【0168】

３５．炎症性疾患または自己免疫疾患から選択される疾病の治療に用いるための、例えば実施形態１−３２に記載される、本発明の抗体。

【0169】

３６．疾病が、関節リウマチおよび炎症性腸疾患からなる群から選択される、実施形態３５に記載の抗体。

【0170】

３７．炎症性疾患または自己免疫疾患からなる群から選択される疾病の治療のための医薬を製造するための、例えば実施形態１−３２のいずれかに記載される、本発明の抗体の使用。

【0171】

３８．疾病が、関節リウマチおよび炎症性腸疾患からなる群から選択される、実施形態３５に記載の使用。

【0172】

３９．本発明の抗体（例えば実施形態１−３２のいずれか１つの抗体）、本発明の抗体を含む組成物、または本発明の抗体を含む医薬を投与することを含む、炎症性疾患または自己免疫疾患から選択される疾病を治療する方法。

【実施例】

【0173】

実施例１：ｍＡｂ０１７０変異体の流体力学半径および粘度
ＷＯ２０１３／１２０５５３のｍＡｂ０１７０の流体力学半径は、期待（５−６ｎｍ）よりも大きいことがわかった（９−１０ｎｍ）。流体力学半径は、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（Wyatt Inc.）で、９６穴プレート装置を用いて、動的光散乱分析により決定した。用いたプレートは、Ｃｏｒｎｉｎｇ３５４０アッセイプレート（Corning）だった。総サンプル量は、およそ２０μＬで、温度はｍＡｂ０１７０変異体に対しては２５℃で維持した（図６）。

【0174】

可変軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３のチャージパッチ変異は、Ｒｈを、単量体のｍＡｂに対して期待されるレベルにまで減少させたが、Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用領域の変異は、Ｒｈを増加させたように見えた。Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用部位の変異は、Ｒｈに影響を与えなかった。

【0175】

ｍＡｂ０１７０変異体０３１７、０３１８、０３１９、０３２０、０３２１、０３２２、０３２３、０３２４、０３２５、０３２６および０３３０について、ＤＬＳにより粘度を決定した。流体力学半径は、Corning 3540の底面が透明な、黒色未処理ポリスチレンマイクロプレート、およびPhosphorex Inc.の、平均直径２０６．５ｎｍ（カタログ番号１０６）の単純なポリスチレンナノ粒子を用いて、Wyatt DynaPro Platereaderで測定した。蛋白質サンプルをCorning 3540プレートに移し、上部のシールでカバーした。当該サンプルを遠心分離にかけ、蛋白質サンプルの流体力学半径をWyatt DynaPro DLSプレートリーダーで測定した。各ウェルに０．５μＬポリスチレンビーズを加え、ピペッティングでゆっくり混合した。プレートを再度遠心分離にかけ、ビーズの流体力学半径をWyatt DynaPro DLSプレートリーダーで測定した。

【0176】

蛋白質サンプルの粘度は、以下のように計算した。
粘度（蛋白質）＝（流体力学半径（ビーズ、測定値）×粘度（バッファー））／流体力学半径（ビーズ、実際）
粘度（蛋白質）は、計算された蛋白質溶液の粘度であり、流体力学半径（ビーズ、測定値）は、蛋白質溶液中のポリスチレンビーズの測定された流体力学半径であり、粘度（バッファー）は、バッファーの粘度であり、流体力学半径（ビーズ、実際）はビーズの実際の平均直径である[He et al., Anal Biochem, 399, 141-143, 2010]。

【0177】

ｍＡｂ０１７０変異体０３３２および０３３３について、マイクロレオロジーによって粘度を決定した。レオロジー解析のため、３０Ｇ Novofineニードルが接続された２５０μｌのHamilton LT シリンジ (Hamilton-Bonaduz Inc)を用いた。シリンジは、プラットフォームに固定された特注のアルミニウムホルダー内に設置した。シリンジのプランジャーは、TAXTPlus Texture Analyzerによって動かされ、予め決定した注入スピードでのプランジャー上で得られた力を測定した。各サンプルを、異なる３つの注入スピードで試験した。クロスヘッドスピードおよび測定した力を用いて、それぞれ、ずり速度とずり応力を計算した。粘度は、ずり速度との関係で以下のように表現され得る：
η_蛋白質＝τ_Ｗ／γ＝（ΔＰＤ／４Ｌ）／（（３２Ｑ）／（πＤ^３））
η_蛋白質は、蛋白質溶液の粘度であり、γは見かけのずり速度であり、τ_Ｗはずり応力であり、Ｐはプランジャーを動かすことにより得られる圧力であり、Ｑはキャピラリーニードルを通過する流体の容積流量であり、ＤおよびＬはそれぞれ、キャピラリーの内径および長さである(Allahham et al., 2004; Intl J Pharm 270, 139-148)。粘度、η_蛋白質を、既知のＤ、ＬおよびＱの値、および測定したＰの値から計算した。

【0178】

当該解析は、「チャージパッチ」変異および「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異が粘度を減少させることを示した（図１）。チャージパッチ変異Ｅ２７ＱおよびＥ９７Ｑを含むｍＡｂ変異体配列番号５は、最低の粘度を有することが分かった。

【0179】

実施例２：ｍＡｂ０１７０変異体の動態
ヒトＴＲＥＭ−１−ＦｃおよびカニクイザルＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対するｍＡｂ０１７０変異体の結合動態を、それぞれ決定した。結合研究は、表面プラズモン共鳴によりリアルタイムで分子間相互作用を測定するProteOn Analyzer (BioRad)で行われた。実験は２５℃で行い、サンプルはサンプル室にて１５℃で保管した。ProteOnにより報告されるシグナル（ＲＵ、応答ユニット）は、６つの平行なフローセル内の個々のセンサーチップ表面上の質量に直接相関している。BiacoreヒトまたはマウスＦｃ捕捉キット由来の抗ヒトＦｃモノクローナルまたは抗マウスＦｃポリクローナル抗体は、製造業者の説明書に従い、ＧＬＭセンサーチップのフローセル上に水平方向に固定化した。捕捉抗体の最終的な固定化レベルは、各実験においておおよそ２６００−６０００ＲＵであった。精製モノクローナルマウス抗ｈＴＲＥＭ−１抗体または組換発現抗ｈＴＲＥＭ−１抗体の捕捉を、抗体をランニングバッファー（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ０、１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）に５−１０ｎＭになるように希釈し、その後６０秒間、３０μＬ／ｍｉｎで垂直方向に注入することによって行い、固定化された抗Ｆｃ抗体のみを有する全てのフローセルに隣接した参照インタースポット（interspot）を作成した。この結果、一般的に、試験抗体の最終捕捉レベルはおおよそ１００−３００ＲＵとなり、分析物（抗原）のＲｍａｘ値は３０−９０ＲＵとなった。ｈＴＲＥＭ−１またはｃＴＲＥＭ−１蛋白質の結合は、水平方向にフローセル全体に分析物（抗原）を注射することによって行い、参照インタースポットへの結合に対する異なる捕捉抗ＴＲＥＭ−１抗体への結合の比較解析を可能にした。ｈＴＲＥＭ−１またはｃＴＲＥＭ−１蛋白質は、１．２−１００ｎＭになるまでランニングバッファーに１：３に連続的に希釈し、２５０秒間１００μＬ／ｍｉｎで注入し、６００秒間で解離させた。ＧＬＭ表面は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７および５０ｍＭ ＮａＯＨの１００μＬ／ｍｉｎでの２回の１８秒間の注入により、分析物の各注入サイクルの後に再生させた。当該再生ステップは、固定化された捕捉抗体表面から抗ＴＲＥＭ−１抗体およびあらゆる結合ＴＲＥＭ−１蛋白質を除去し、次の相互作用サンプルペアのそれに続く結合を可能にした。再生手順は、チップ表面から、直接固定化された抗Ｆｃ捕捉抗体は除去しなかった。

【0180】

抗体および抗原間の結合親和性は、複合体の形成および解離の動態を測定することにより決定される、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の決定により、定量した。ｋａ（会合速度）およびｋｄ（解離速度）などの、一価の複合体の会合および解離に対応する速度定数は、データ解析のためのProteOn評価ソフトウェアを用いて、１：１Langmuirモデルに適合したデータによって、検索した。Ｋ_Ｄは、式Ｋ_Ｄ＝ｋｄ／ｋａによって、ｋａおよびｋｄと関係している。

【0181】

結合曲線は、データ解析の前に、ダブルリファレンス（捕捉抗ＴＲＥＭ−１抗体に対する、参照表面シグナル、並びにブランクバッファー注入の減算）により処理した。これにより、装置ノイズ、バルクシフト、およびサンプル注入時のドリフトの補正が可能となった。

【0182】

ｍＡｂ０１７０変異体は全て、ヒトＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対し、ｍＡｂ０１７０と同様の親和性を有することが分かった。興味深いことに、ｍＡｂ０３２２などの「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」変異を含むｍＡｂ変異体は、カニクイザルＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対する親和性が増加した（表２）。

【0183】

実施例３：ｍＡｂ０３３０およびｍＡｂ０３３３の動態および粘度
カニクイザルＴＲＥＭ−１に対して改善された親和性を有し、かつ低い粘度を有するｍＡｂを作成するために、配列番号９由来の変異を、ｍＡｂ０１７０変異体の中で最も低い粘度を有することがわかっている配列番号５の変異、および粘度に対して適度な効果を有することが分かっている配列番号１１と組み合わせた。カニクイザルＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対する親和性の増加は、変異の組み合わせを含むｍＡｂ変異体（ｍＡｂ０３３０およびｍＡｂ０３３３）において保持され、当該変異は、ヒトＴＲＥＭ−１−Ｆｃに対する親和性に影響を与えなかった。ｍＡｂ０３３０およびｍＡｂ０３３３の粘度は、ＷＯ２０１３／１２０５５３のｍＡｂ０１７０と比較して著しく減少した（図１）。

【0184】

実施例４：ＢＷＺ’３６／ｈＴＲＥＭ−１安定細胞株の培養
ＢＷＺ／ｈＴＲＥＭ−１レポーター細胞を、１０％ＦＣＳ(Cat# 16140-071, Gibco, New York, USA)、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ(Cat# 15070-06, Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Cat #11360, Gibco)、５μＭ−２ＭＥ(Cat# 31350-010, Gibco)および２ｍＭＬ−グルタミン(Cat # 25030, Gibco)を補った、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０(Cat# 11835, Gibco, Carlsbad CA, USA)で培養した。特別なプレートやコーティングは必要としなかった。１０ｍｌＶｅｒｓｅｎｅ(Cat # 15040, Gibco)を加えて細胞を剥がし、その後細胞をチューブに移して、５分間１２００ｒｐｍで遠心分離し、フェノールレッドを含まない新鮮なＲＰＭＩ １６４０で洗浄した。これらの細胞は、その後、アッセイまたはさらなる増殖のための再培養において使用できる状態となった。

【0185】

実施例５：ｍＡｂ０１７０変異体の機能性特徴解析
抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂ０１７０変異体がヒトＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害する能力を、Ｂｉｏｘｅｌｌにより提供されたレポーター細胞株（ＢＷＺ’３６／ｈＴＲＥＭ−１）を用いて決定した。レポーター細胞株を、ｍＡｂと培養する前に、組換えタンパク質、または活性化好中球により発現された蛋白質のいずれかとして、ＰＧＮおよびＴＲＥＭ−１リガンドＰＧＬＹＲＰ１で刺激した。変異体がＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害する能力は、臨床的に意義のあることであり、ＷＯ２０１３／１２０５５３のｍＡｂ０１７０と同等であることが分かった（図２ＡおよびＢ）。

【0186】

同様に、カニクイザルＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害する能力を、最低の粘度を有する３つのｍＡｂ０１７０変異体について調べ、２つの変異体のカニクイザルＴＲＥＭ−１に対する親和性が増加していることが観察された。確立されたレポーター細胞株ＴＥ４２６．２７を用いた本アッセイにおいて、ｍＡｂ変異体とＷＯ２０１３／１２０５５３のｍＡｂ０１７０について同様の能力が観察された（図３）。

【0187】

また、当該ｍＡｂ変異体の、健常ドナー由来の初代細胞からのＴＮＦａの放出を遮断する能力を評価した。本アッセイでは、単球を低酸素状態下でＭ２マクロファージに分化させてＴＲＥＭ−１発現を増加させ、ｍＡｂと培養する前にＰＧＮおよび組換えＰＧＬＹＲＰ１で活性化させた。当該ｍＡｂ変異体は、低酸素性Ｍ２マクロファージからのＴＲＥＭ−１媒介ＴＮＦα放出を阻害する上で、０１７０と同程度に強力であることが分かった（図４）。

【0188】

実施例６：Ｆａｂ０１７０−Ｆａｂ０１７０複合体の結晶構造
ｍＡｂ０１７０分子が特異的な自己相互作用により相互作用する能力を、Ｆａｂ０１７０−Ｆａｂ０１７０結晶構造の結晶解析により評価した。
材料：１０ｍＭリン酸塩、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌからなり、蛋白質濃度８．５ｍｇ／ｍＬでｐＨ７．４のバッファー中のｍＡｂ０１７０のＦａｂ領域（配列番号１８および配列番号１９）。
方法：ｍＡｂ０１７０のＦａｂ領域を、ハンギングドロップ蒸気拡散実験において、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、２００ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４からなる０．５ｍＬのリザーバーに対する、２μＬのリザーバー溶液と混合した２μＬの蛋白質溶液からなる液滴の平衡化により、結晶化した。結晶は、２μＬの３５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４からなるドロップに移行され、直径０．２ｍｍのリソループ（litholoop）(Molecular Dimensions Limited)にマウントし、液体窒素でフラッシュ冷却した。

【0189】

Ｘ線回折データを、１００Ｋで操作したCryo-streamを用いて、MAXLAB 911-2, Lund University, Swedenにて収集した。生のデータ画像を、ＸＤＳプログラムパッケージを用いて、指数付けをし、積分して、スケーリングした(Kabsch, Acta Crystallogr. D66, 133-144 (2010))。結晶の空間群はＰ２（１）２（１）２（１）であり、単位格子パラメーターは、ａ＝６２．４Å、ｂ＝１１０．９Å、ｃ＝１５８．４Åであった。データは分解能２．４０Åまで収集した。構造を、CCP4i program suite (Potterton et al., Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003))で実行されるように、Phenix software (Adams et al., Acta Crystallogr. D66, 213−221 (2010))を用いた分子置換により、解析した。検索モデルは、ｐｄｂエントリー１ＡＤ０．ｐｄｂ由来の重鎖（８５％同一性）と、ｐｄｂエントリー２ＱＲＧ由来の軽鎖（９４％同一性）の構造であった。構造の精密化は、CCP4i program suiteのRefmac5 (Murshudov et al., Acta Crystallogr. D53, 240-255 (1997))を用いて実行した。Coot version 7 (Emsley et al., Acta Crystallogr. D66, 486-501 (2010))を、手動による構造の再構築と検証に用いた。

【0190】

結果および考察
ｍＡｂ１７０Ｆａｂ領域の結晶構造は、非対称単位の４つのＦａｂ分子を含んでいた（重鎖はＡおよびＣと表示し、軽鎖はＢおよびＤと表示した）。Ｆａｂ分子は、１つのＦａｂ分子の抗原結合領域が、別のＦａｂ分子の抗原結合領域と相互作用することにより、二量体としてひとまとめになっていた。配列番号１９由来の最後のシステインは重鎖の配列番号１８由来のＣｙｓとジスルフィド結合していることが期待されたが、結晶構造中にこれを含めて精密化することはできなかった。当該範囲に過度の２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃ電子密度の存在が示唆されたため、ジスルフィド結合はＦａｂ分子のサブセットに存在する可能性がある。非対称単位における鎖Ａの配列番号１８由来の残基Ｇ２６、Ｋ７８−Ｎ７９、Ｉ１０４−Ｒ１０５およびＳ１３８−Ｅ１４１、および、非対称単位の他のＦａｂ分子の配列番号１８の鎖Ｃ由来のＥ１、Ｇ２６−Ｆ２７、Ｍ１０２−Ｒ１０５、Ｓ１３６−Ｅ１４１、Ｓ１９５−Ｋ２００には、有意なシグマａ重み付け２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度は存在しなかった。有意なシグマａ重み付け２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度はまた、鎖Ｄの配列番号１９由来の残基Ｄ３０−Ｙ３４でにも存在しなかった。これらの残基は、結晶構造に含まれなかったが、ＷＯ２０１３／１２０５５３に開示されたヒト化抗ＴＲＥＭ−１ ｍＡｂ０１７０結晶構造に由来するｍＡｂ０１７０フラグメント結晶構造との重ね合わせによる、Ｆａｂ−Ｆａｂ界面の分子間相互作用解析には含まれた。

【0191】

ｍＡｂ０１７０Ｆａｂフラグメント構造の品質パラメーターは、構造全体のＲ−ｆａｃｔｏｒ＝２４％およびＦｒｅｅ Ｒ−ｆａｃｔｏｒ＝３０％を示した。全体の相関係数は０．９３であり、diffraction-component precision index、ＤＰＩ＝０．３Å（Cruickshank, Acta Crystallogr. D55, 583-601 (1999)）であった。構造中の結合距離の、理想結合距離との平均二乗偏差＝０．０２５Åである、理想結合角との平均二乗偏差＝２．３２６°であった(Engh and Huber, Acta Crystallogr. A47, 392-400 (1991))。

【0192】

分子間距離の解析は、分子間距離のカットオフ値４Åにより、ＣＣＰ４プログラム一式のプログラムＮＣＯＮＴ(Potterton et al., Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003))を用いて、実行した（表４）。当該解析により、配列番号２由来のアミノ酸残基Ｎ５７およびＡ５９が、結晶構造のＦａｂ−Ｆａｂ相互作用に関連するアミノ酸群に属することが示された。

【表4】

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]