特許 6738345 糖尿病の治療および分析に使用される修飾インシュリンに対する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6738345

(24)【登録日】2020年7月21日

(45)【発行日】2020年8月12日

(54)【発明の名称】糖尿病の治療および分析に使用される修飾インシュリンに対する抗体

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20200730BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20200730BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20200730BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20200730BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 N

   A61K45/00

   A61P3/10

   A61K39/00 ZZNA

【請求項の数】16

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2017-547121(P2017-547121)

(86)(22)【出願日】2016年3月11日

(65)【公表番号】特表2018-511047(P2018-511047A)

(43)【公表日】2018年4月19日

(86)【国際出願番号】GB2016050678

(87)【国際公開番号】WO2016146979

(87)【国際公開日】20160922

【審査請求日】2019年3月7日

(31)【優先権主張番号】1504297.1

(32)【優先日】2015年3月13日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】512316611

【氏名又は名称】クイーン マリー ユニバーシティ オブ ロンドン

(74)【代理人】

【識別番号】100101281

【弁理士】

【氏名又は名称】辻永 和徳

(72)【発明者】

【氏名】ニジム アフバ

(72)【発明者】

【氏名】ポジーリ パオロ

(72)【発明者】

【氏名】ステロロ ロッキィ

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−０９０９０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０３１５９０４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１２９９３４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０１５３９５７９（ＣＮ，Ａ）

【文献】 Peter Achenbach et al.，Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes，The Journal of Clinical Investigation，２００４年，vol. 114, no. 4，589-597

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含む、被検者の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を診断するための方法：
酸化的翻訳後修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすること；
ここで、サンプル中の酸化的翻訳後修飾インシュリンに対する抗体の存在は被検者のＴ１Ｄを示す。

【請求項2】

該修飾インシュリンが非酵素グリケーション、または活性酸素種（ＲＯＳ）によって修飾されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

該ＲＯＳがスーパーオキシドラジカル（Ｏ_２・⁻）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、ヒドロキシル・ラジカル（・ＯＨ）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、一酸化窒素（ＮＯ・）およびペルオキシニトライト（ＯＮＯＯ⁻）から成るグループから選ばれることを特徴とする請求項２に記載の方法。

【請求項4】

該酸化的翻訳後修飾インシュリンが酸化的翻訳後修飾インシュリンのフラグメントである、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。

【請求項5】

インシュリン鎖Ｂが、２１−３０残基の１以上で酸化的翻訳後修飾されている、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

インシュリン鎖ＢのＰｈｅ２４および／またはＴｙｒ２６が酸化されている、請求項５記載の方法。

【請求項7】

サンプルが血液または血清であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の方法。

【請求項8】

修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在がＥＬＩＳＡ分析を使用して決定されることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の方法。

【請求項9】

被検者が糖尿病と診察されていないことを特徴とする請求項１から３、７または８のいずれか１項記載の方法。

【請求項10】

Ｔ１Ｄが成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）である、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。

【請求項11】

被検者が２型糖尿病と診察されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。

【請求項12】

被検者がインシュリン自己抗体（ＩＡＡ）、ＩＣＡ、ＧＡＤＡ、ＩＡ２Ａおよび／またはＺｎＴ８Ａを持っていないことを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。

【請求項13】

以下を含む、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡと診断された被検者の、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する際に治療薬の治療有効性を決定するための方法：
ｉ）被検者へ治療薬を適用する前に被検者から得られた第１のサンプル中の修飾インシュリンに対する抗体のレベルを決定すること；
ｉｉ）被験者へ治療薬を適用した後に被験者から得られた第２のサンプル中の修飾インシュリンに対する抗体のレベルを決定すること；および
ｉｉｉ）第１のサンプルと第２のサンプル中の、修飾インシュリンに対する抗体のレベルを比較すること；
ここで、第１のサンプルと比較された時に第２のサンプル中の修飾インシュリンに対する抗体のレベルの減少は、治療薬の治療有効性を示す。

【請求項14】

必要とされる被験者のＴ１Ｄの治療方法において使用するためのＴ１Ｄに対する治療薬であって、
酸化的翻訳後修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルがテストされており；
サンプル内の酸化的翻訳後修飾インシュリンに対する抗体の存在が識別されている。

【請求項15】

請求項１記載の被検者の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を診断するための方法に使用されるキットであって、被検者からのサンプル中の酸化的翻訳後修飾インシュリンに対する抗体の存在を決定するための試薬を含むキット。

【請求項16】

被検者のＴ１ＤがＬＡＤＡである、請求項１５記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）のためのバイオマーカーに関する。本発明は、特にＴ１Ｄの診断、および薬へのＴ１Ｄを有する患者のレスポンスを予言する方法におけるそのようなバイオマーカーの使用に関する。

【0002】

発明の背景
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、膵臓中のインシュリンを生むβ細胞の破壊の結果としての、インシュリンの不足を特徴とする症状である。自己免疫は、β細胞をターゲットとする多くの自己抗体の産生に結びつく優勢なエフェクター機構であると考えられる。Ｔ１Ｄは、主として小児および４０歳未満の成人に起こる。Ｔ１Ｄに利用可能な有効な療法は現在ない。

【0003】

酸化ストレスは、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の病原論の重大なプレーヤーかもしれない。高血糖および炎症を起こした膵島に侵入する代謝的に活性な免疫細胞の大きな流入は、β−細胞微環境の内でのハイ・レベルの反応的なオキシダント種（ＲＯＳ）の形成に帰着することがある。生産されることが知られている重要なＲＯＳとしては、スーパーオキシドラジカル（Ｏ_２・−）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、ヒドロキシル・ラジカル（・ＯＨ）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、一酸化窒素（ＮＯ・）、ペルオキシニトライト（ＯＮＯＯ−）、および高血糖の結果としてのグリケーション由来のオキシダントがある。ハイ・レベルのＲＯＳはβ−細胞自己タンパク質の酸化的翻訳後修飾（ｏｘＰＴＭ）およびネオエピトープ、すなわち以前に免疫系に存在していないエピトープの形成を導くことが有り、したがって、免疫寛容を回避し、自己免疫を生成する。ベータ−細胞特異性抗原への自己免疫を引き起こすことにおけるＲＯＳの影響は、大部分は未知のままである。Ｔ１Ｄにおけるインシュリンに対する耐性のブレークダウンの理由は、ここまでミステリーのままだった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

３０年以上前に、インシュリン自己抗体（ＩＡＡ）がＴ１Ｄを有する被検者の中にあるという証拠がサイエンス（Ｐａｌｍｅｒら、科学２２２：１３３７、１９８３年）中で公表された。ＩＡＡはＴ１Ｄの確立しているマーカーで、この疾病の予測に使用されることができる。しかしながら、それらは、新しく診断されたＴ１Ｄを有する患者の半分のみ、成人して診断された場合には、より少数の患者においてのみ検知される。さらに、ＩＡＡタイターは疾病の進行中に変動することが知られている。したがって、Ｔ１Ｄを診断するために使用することができる他のバイオマーカーの必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

発明の要約
発明者は、未変性のインシュリンではなく、活性酸素種（ＲＯＳ）によって修飾インシュリンに１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の免疫反応が向けられるかもしれないことを驚くべきことに発見した。発明者は、Ｔ１Ｄのためのバイオマーカーとして、修飾インシュリンの抗体を使用することができることをさらに見いだした。特には、患者の中の修飾インシュリンに対する抗体の存在を、Ｔ１Ｄを診断するために使用することができる。

【0006】

第１の態様では、本発明は、以下を含む、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の診断方法を提供する：
修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすること；
ここで、サンプル中の修飾インシュリンに対する抗体の存在は被検者のＴ１Ｄを示す。

【発明を実施するための形態】

【0007】

発明の詳細な記述
第１の態様では、本発明はＴ１Ｄを診断する方法に関する。言いかえれば、本発明は、被検者がＴ１Ｄを持っているかどうか判断する方法、またはＴ１Ｄのための試験法に関する。本発明の方法は分析法と記述することもできる。

【0008】

発明者は、新しい発病したＴ１Ｄを持った患者を診断するために発明の第１の態様の方法を使用することができることを見いだした。したがって、方法は、Ｔ１Ｄを持っているとの疑いをかけられる被験者からのサンプルに対して典型的に実行される。被検者は、Ｔ１Ｄの１以上の徴候、たとえば多渇症（多渇）、多尿症（多尿、頻尿）、多食症（食欲亢進）、減量、疲労および糖尿病性ケトアシドーシス（吐き気、嘔吐、腹痛、迅速な深いため息（ｒａｐｉｄ ｄｅｅｐ ｓｉｇｈｉｎｇ）、漸進的な鈍麻および意識消失）の１つ以上の徴候を示していてもよい。方法は、Ｔ１Ｄのためにインシュリンまたは他の治療薬（例えばワクチン（例えば経口インシュリン、吸入されたインシュリンなど）または免疫抑制剤として適用された免疫治療薬（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）で以前に治療されていない被験者からのサンプルに対して典型的に実行される。

【0009】

本発明の第１の態様の方法は修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすることを含んでいる。ここに使用されるような「修飾インシュリン（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ）」は酸化的翻訳後修飾インシュリン（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ： ｏｘＰＴＭ ｉｎｓｑｕｌｉｎ）を指す。「修飾インシュリン」、「ｏｘＰＴＭインシュリン」という用語は交換可能に使用される。

【0010】

インシュリンは、非酵素的グリケーションにより、または活性酸素種（ＲＯＳ）により、またはアルデヒドを含む反応、またはそれらの組み合わせによりｏｘＰＴＭインシュリンに修飾されることができる。ＲＯＳによって修飾されたインシュリンは本明細書ではＲＯＳ−ＩＮＳと呼ばれる。グリケーションによって修飾されたインシュリンはＧＬＹ−ＩＮＳまたはＧｌｙｃ ＩＮＳと呼ばれる。

【0011】

活性酸素種としては、例えばスーパーオキシドラジカル（Ｏ_２・−）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）、遷移金属イオン（例えば第一鉄、第二鉄、第一銅または第二銅塩）と組み合わされた脂質ヒドロペルオキシド、ヒドロキシル・ラジカル（・ＯＨ）（これは遷移金属イオン（例えば第一鉄、第二鉄、第一銅または第二銅塩）と組み合わされた過酸化水素による生物系でしばしば生成される）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜臭素酸（ＨＯＢｒ）、一酸化窒素（ＮＯ・）、二酸化窒素（ＮＯ_２・）、ペルオキシニトリット（ＯＮＯＯ・）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。当該技術分野での何人かの研究者は用語「反応的な窒素種」（例えばＮＯ・）および「反応的な塩素種」（たとえばＨＯＣｌ）をＲＯＳのサブグループと区別するために使用する。しかし、この明細書では、我々はその最も広い意味で用語ＲＯＳを使用している。

【0012】

グリケーションは、グルコース、リボース、または他の糖によって典型的に引き起こされる。インシュリンも、アルデヒド（例えばマロンアルデヒドおよび／または４−ヒドロキシノネナールを）含む反応によって化学的に修飾することができる。典型的には、修飾インシュリンは、活性酸素種（ＲＯＳ）によって翻訳後に修飾される。本発明の実施態様では、ＲＯＳは、典型的に次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）またはヒドロキシル・ラジカル（・ＯＨ）である。好ましくは、ＲＯＳはヒドロキシル・ラジカル（・ＯＨ）である。

【0013】

いくつかの実施態様では、修飾インシュリンは酸化されたインシュリンである。
酸化されたインシュリンは活性酸素種（ＲＯＳ）によって翻訳後に修飾されたインシュリンである。いくつかの実施態様では、酸化されたインシュリンはジオキシダイズドインシュリンまたはトリオキシダイズドインシュリンである。

【0014】

インシュリンはＡ鎖とＢ鎖のタンパク質二量体である（図２Ｂを参照）。いくつかの実施態様では、インシュリンＢ鎖は酸化によって修飾される。インシュリンＢ鎖は、位置１〜３０での少なくとも１つ以上の残基で修飾されることができる。インシュリンＢ鎖は、残基１−１３（ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥ）の１つ以上、残基１４−２１（ＡＬＹＬＶＣＧＥ）の１つ以上、および／または残基２１−３０（ＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ）の１つ以上で修飾されることができる。いくつかの実施態様では、インシュリンＢ鎖は残基１−１３（ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥ）の１つ以上で修飾されている。他の実施態様では、インシュリンＢ鎖は残基１４−２１（ＡＬＹＬＶＣＧＥ）の１つ以上で修飾されている。他の実施態様では、インシュリンＢ鎖は残基２１−３０（ＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ）の１つ以上で修飾されている。

【0015】

いくつかの実施態様では、修飾インシュリンは、Ｂ鎖のＨｉｓ５、Ｃｙｓ７、Ｔｙｒ１６、Ｐｈｅ２４および／またはＴｙｒ２６でＲＯＳによって修飾される。いくつかの実施態様では、Ｈｉｓ５、Ｃｙｓ７および／またはＰｈｅ２４が、・ＯＨおよび／またはＨＯＣｌで修飾される。いくつかの実施態様では、Ｔｙｒ１６および／またはＴｙｒ２６がＨＯＣｌによって修飾される。ある実施態様では、Ｂ鎖のＨｉｓ５、Ｃｙｓ７、Ｔｙｒ１６、Ｐｈｅ２４および／またはＴｙｒ２６が酸化される。いくつかの実施態様では、修飾インシュリンは、Ｂ鎖のＨｉｓ５、Ｃｙｓ７、Ｔｙｒ１６、Ｐｈｅ２４および／またはＴｙｒ２６で酸化される。

【0016】

いくつかの実施態様では、修飾インシュリンは、Ｂ鎖のＨｉｓ５、Ｃｙｓ７、Ｔｙｒ１６、Ｐｈｅ２４ Ｔｙｒ２６の１つ以上で酸化する。いくつかの実施態様では、修飾インシュリンはＢ鎖のＨｉｓ５で酸化される。いくつかの実施態様では、修飾インシュリンはＢ鎖のＣｙｓ７で酸化される。いくつかの実施態様では、修飾インシュリンはＢ鎖のＴｙｒ１６で酸化される。いくつかの実施態様では、修飾インシュリンはＢ鎖のＰｈｅ２４で酸化される。いくつかの実施態様では、修飾インシュリンはＢ鎖のＴｙｒ２６で酸化される。

【0017】

いくつかの実施態様では、修飾インシュリンは酸化、塩素化、グリケーション、カルボキシメチレーション、ホルミル化および／またはリボシル化によって修飾される。修飾インシュリンは、酸化されたインシュリン、塩素化されたインシュリン、グリケート化インシュリン、カルボキシメチル化インシュリン、ホルミル化インシュリンおよび／またははリボシル化（ｒｉｂｏｓｙｌａｔｅｄ）インシュリンであることができる。

【0018】

修飾インシュリンは、適切にはグリケーションにより翻訳後修飾されてもよい。いくつかの実施態様では、グリケーションはリボシル化である。好ましくは、グリケーションは、リボース、好適にはＤ−リボースによって引き起こされる。

【0019】

いくつかの実施態様では、インシュリンＢ鎖はグリケーションによって修飾される。インシュリンＢ鎖は、残基１−１３（ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥ）の１つ以上、残基１４−２１（ＡＬＹＬＶＣＧＥ）の１つ以上、および／または残基２１−３０（ＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ）の１つ以上で修飾されることができる。いくつかの実施態様では、インシュリンＢ鎖は残基１−１３（ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥ）の１つ以上で修飾される。他の実施態様では、インシュリンＢ鎖は残基１４−２１（ＡＬＹＬＶＣＧＥ）の１つ以上で修飾される。他の実施態様では、インシュリンＢ鎖は残基２１−３０（ＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ）の１つ以上で修飾される。

【0020】

いくつかの実施態様では、修飾インシュリンはＢ鎖のＰｈｅ１および／またはＬｙｓ２９でグリケート化される。いくつかの実施態様では、修飾インシュリンはＮ末端で糖化される。Ｎ末端はＢ鎖のＮ末端であることができる。Ｂ鎖のＮ末端はＰｈｅ１であることができる。

【0021】

いくつかの実施態様では、Ｎ末端はリボシル化によって修飾される。いくつかの実施態様では、修飾インシュリンはＢ鎖のリシン残基で糖化されている。Ｂ鎖のリシン残基はＬｙｓ２９であることができる。いくつかの実施態様では、Ｎ末端はリボシル化によって修飾される。

【0022】

ここに使用される用語「修飾インシュリン」は、修飾インシュリンのフラグメント、つまりＲＯＳ、または非酵素のグリケーションまたは本明細書に記載された他の方法によって修飾されたインシュリンのフラグメントを含んでいる。ＲＯＳによって修飾されたそのようなフラグメントは、「ＲＯＳ−ｆＩＮＳ」として言及される。したがって、本発明は修飾インシュリンまたはそのフラグメントに対する、抗体の存在または不在のために被検者からのサンプルをテストすることを含んでいる。修飾インシュリンのフラグメントは、たとえばマトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）またはＲＯＳでのインシュリンの分裂によって生成することができ、さらに追加のＲＯＳによって修飾されることができる。

【0023】

方法は修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすることを含んでいる。テストされる抗体は被検者の中にある修飾インシュリンに対する自己抗体である。抗体は、典型的に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）アイソタイプまたはＩｇＭまたはＩｇＡアイソタイプである。１つの実施態様では、抗体はＩｇＧである。

【0024】

サンプルは、修飾インシュリンに対する自己抗体を含むことがある被検者からの任意のサンプルである。典型的には、サンプルは血液、血清または血漿のサンプルである。好ましい実施態様では、サンプルは血液または血清のサンプルである。

【0025】

修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在は任意の適切な方法または分析によって決定することができる。サンプル中の自己抗体を測定するために使用することができる利用可能な広範囲の異なるタイプの免疫測定法がある。典型的には、そのような抗体の存在または不在は、ＥＬＩＳＡ分析またはウェスタンブロッティングのような抗体−抗原結合に基づいた分析を使用して決定される。典型的なＥＬＩＳＡ分析では、抗原は表面へ付着される。修飾インシュリンのフラグメントの例は、以下の表１に示される。したがって、本発明では、例えばＲＯＳ−ＩＮＳのような修飾インシュリン、または修飾インシュリンのフラグメント、たとえばＲＯＳによって修飾されたインシュリンのフラグメント（ＲＯＳ−ｆＩＮＳ）が表面へ付着される。その後、特異性抗体（第１の抗体）が表面に適用され、抗原に結合する。本発明では、抗体は患者から取られたサンプル内にある。したがって、サンプルは方法のこのステップで表面に適用される。二次抗体（第２の抗体）が加えられ、それは第１の抗体に結合する。第２の抗体は酵素に結合し、次いで酵素の基体を含んでいる物質が加えられる。後の反応は検知できる信号、典型的には基体の色変化を生成する。信号の強さは第一の抗体の量を示す。検知できる信号が色変化である場合、分光計は色の強度に対する定量値を与えるためにしばしば使用される。

【0026】

１つの実施態様では、本発明の第１の態様に従う分析は、次のものを含む：
修飾インシュリンと被検者からのサンプルとを接触させること；
抗修飾インシュリン抗体に結合する標識抗体を加え、複合体を形成すること；および
抗修飾インシュリン抗体と標識抗体の間の複合体の形成を検知する；
ここで、前記複合体の検知は被検者内のＴ１Ｄを示す。

【0027】

本発明で使用されるＥＬＩＳＡ分析のような抗体抗原結合分析は、修飾インシュリン（例えばＲＯＳ−ＩＮＳ）を、被験者から得られたサンプル中の抗体の目標として使用して行うことができる。そのような分析では、修飾インシュリンは例えばＲＯＳ、たとえばＨＯＣｌ、ＯＮＯＯ−、・ＯＨまたはリボースを使用して、化学的修飾によって修飾インシュリンを生成することにより、抗体目標として調製することができる。適切なＥＬＩＳＡ分析では、サンプル（例えば血液、血清サンプル）からの自己抗体に結合するために、ＥＬＩＳＡプレートはベートとして修飾インシュリンで覆われる。その後、サンプルは任意に加えられたバッファーと共にＥＬＩＳＡプレートに加えられる。その後、任意に、反応しないタンパク質を、修飾インシュリンで覆われていないＥＬＩＳＡプレートの全ての表面をブロックするために加えることができる。その後、酵素（たとえばホースラディシュ・ペルオキシダーゼ）を加えることができる。酵素は、典型的にサンプルからの抗体に結合するための抗ヒトＩｇＧ抗体に結合される。最後に、基体（例えば色素形成基質、たとえば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）が、加えられる。その後、活性は、たとえば光電密度（ＯＤ）の測定のような適切な方法を使用して決定することができる。あるいは、適切な方法として、蛍光発生または電気化学発光なリポーターを使用することができる。修飾インシュリンにふさわしいＥＬＩＳＡ分析は、実施例に述べられる。

【0028】

他の修飾インシュリンにふさわしい分析は以下を含む：ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術に基づき、様々な抗原（例えば異なる修飾を受けたインシュリン）の同時分析を許容する、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ から利用可能な多重分析；
多重ビーズに基づいた流動細胞計測法（例えばＢＤ（登録商標）の血球計算ビーズ・アレイ）（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ：ＣＢＡ）；およびたとえばＢｉａｃｏｒｅから利用可能な、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいたシステム。

【0029】

本発明のいくつかの実施態様では、被検者からのサンプルはコントロールまたは対照試料と比較される。対照試料は、典型的にはＴ１Ｄに苦しんでいないと知られている被験者（例えば健康なコントロール被験者）から取られたサンプルである。しかしながら、対照試料は、さらにたとえばＴ１Ｄの徴候を示すがＴ１Ｄの臨床上の証拠を示されない個人からのものであることができる。対照試料は２型糖尿病の患者からのものでありえる。

【0030】

さらなる実施態様では、参照の陽性および／または陰性の対照試料が使用される。他の実施態様では、非変性のインシュリン（つまり修飾されていないインシュリン）がコントロールとして使用される。他の実施態様では、非変性のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはＲＯＳ修飾されたＢＳＡまたはＨＳＡが、コントロール抗原として使用される。別の実施態様では、コントロール抗原はめんどり卵リゾチーム（ＨＥＬ）である。

【0031】

本明細書に記載された本発明の第１の態様の方法、および本発明の他の態様の方法では、修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在は、コントロールまたは対照試料、典型的には修飾インシュリンに対する抗体を含まないと知られている対照試料との比較によって決定することができる。被験者からのサンプルが、修飾インシュリンまたはそのフラグメントに対する抗体を対照試料と比較して著しく高いレベルで含む場合には、被験者中の修飾インシュリンに対する抗体の存在が確認される。反対に、被験者からのサンプルが、修飾インシュリンまたはそのフラグメントに対する抗体を対照試料と比較して著しく高いレベルで含まない場合には、被験者中の修飾インシュリンに対する抗体の不在が確認される。修飾インシュリンまたはそのフラグメントに対する抗体の存在は、たとえばサンプル対対照試料での抗体の量の有意差を見つけることにより決定することができる。
既知の統計的検定、たとえばＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和テスト（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ ｒａｎｋ ｓｕｍ）またはマン・ホイットニー検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔ）を使用することができる。

【0032】

被験者は典型的に人間の被験者である。しかしながら、本発明の方法は、さらに獣医学の分野に使用されることができる。したがって、動物の糖尿病を診断するために使用することができ、典型的に哺乳類、例えば、コンパニオン・アニマル（たとえば猫と犬）、農業的動物（たとえば馬、雌牛、ブタおよび羊）、あるいは他の哺乳動物（たとえばハツカネズミ、ネズミ、ウサギまたは猿）に使用することができる。

【0033】

本発明の方法は、先に被検者から得られたサンプルに対して典型的に実行される。このように、サンプル採取は典型的には本発明の方法の一部を形成しない。また、本発明の方法は、被検者から得られたサンプルに対して実行される。本発明のいくつかの実施態様では、しかしながら、方法はさらにサンプルを採取することを含み、たとえば血液サンプルの採取、または任意の引き続く血液サンプルからの血清サンプルの調製を含む。

【0034】

Ｔ１Ｄに関連した主な自己抗体としては、インシュリン自己抗体（ＩＡＡ）、膵島細胞抗体（ＩＣＡ）、グルタミン酸脱炭酸酵素自己抗体（ＧＡＤＡ）およびインシュリノーマ−関連−２自己抗体（ＩＡ−２Ａ）を含んでいる。ＩＡＡは、Ｔ１Ｄの中の重要な診断・予後のツールになっていたが、ＩＡＡの診断鋭敏度は高くない（約５０％）。ＩＣＡは、およそ７０％の新しく発病したＴ１Ｄのコーカサス人の患者で検知された。診断に続いて、ＩＣＡ度数は減少し、患者の１０％未満は、１０年後でも依然ＩＣＡを発現する。Ｔ１Ｄの発病者の約６０％はＧＡＤＡを発現する。ＩＡ−２ＡおよびＩＡ−２ＢＡは１型糖尿病の新しい発病者の６０％以上で観察される。亜鉛輸送体−８（ＺｎＴ８）は、Ｔ１Ｄにおける新規の自己抗原であると最近確認された。ＺｎＴ８（ＺｎＴ８ａ）への自己抗体はＴ１Ｄの新しい発病者の最大８０％で検知された。

【0035】

発明者は、インシュリンとの自動反応性が一部分、β−細胞微環境の中にあるオキシダントによるインシュリンの酸化的翻訳後修飾（ｏｘＰＴＭ）に起因する新抗原によることを示した。

【0036】

したがって、ＩＡＡ、ＩＣＡ、ＧＡＤＡ、ＩＡ２ＡまたはＺｎＴ８Ａには陰性のテスト結果が出る患者を診断するためにそれを使用することができるので、本発明はＴ１Ｄの改善された診断のための新たな方法を提供する。

【0037】

従って、１つの実施態様では、本発明は、被検者が検知できるレベルのＩＡＡ、ＩＣＡ、ＧＡＤＡ、ＩＡ２Ａおよび／またはＺｎＴ８Ａを発現しない場合における、Ｔ１Ｄを診断する方法を提供する。

【0038】

自己抗体の存在または不在を決定するテストは当該技術技術で知られている。
これらはラジオバインディングアッセイ（ＲＢＡ）、放射免疫定量法（ＲＩＡ）、電気的化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）分析（ＥＣＬ−ＩＡＡ）およびＥＬＩＳＡを含んでいる。

【0039】

本発明の第１の態様の方法は、被検者のＴ１Ｄの診断方法を与える。したがって、本発明の方法は、Ｔ１Ｄを治療する方法と共に使用することができる。

【0040】

従って、本発明の第１の態様は、さらに以下を含む、必要のある被検者において１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を治療する方法まで及ぶ：
修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすること；
サンプル中の修飾インシュリンに対する抗体の存在を識別すること；および
被検者へのＴ１Ｄのための治療薬を適用すること。

【0041】

治療薬は、典型的にインシュリン、ワクチンとして適用される免疫治療薬（例えば経口インシュリン、吸入インシュリンなど）、または免疫抑制剤である。最も典型的には、治療薬はインシュリンである。

【0042】

本発明のこの実施態様は、さらに以下を含む、必要とする患者における１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療方法において使用される治療薬まで及ぶ：
修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすること；
サンプル中の修飾インシュリンに対する抗体の存在を識別すること；および
患者へＴ１Ｄのための治療薬を適用すること。

【0043】

本発明のこの実施態様はさらに、以下を含む方法により、その必要のある被検者のＴ１Ｄの治療のための医薬品の製造における、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療薬の使用に及ぶ：
修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすること；
サンプル中の修飾インシュリンに対する抗体の存在を識別すること；および
患者へＴ１Ｄのための治療薬を適用すること。

【0044】

２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は通常成人で診断される代謝異常であり、不十分な量のインシュリンを生産するか、身体が高い血糖レベルに帰着するインシュリン抵抗性を発現することを特徴とする。Ｔ２Ｄに対する治療法はない。しかし、症状は運動と薬剤を通じて管理することができる。外因性のインシュリンをとる必要は通常ない。

【0045】

Ｔ２Ｄ薬剤の例としては、ビグアニド（たとえばメトホルミン）、酵素抑制因子（たとえばアンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）およびアルファ−グルコシダーゼ阻害剤）、スルホニル尿素（たとえばグリブライド、グリピジド、グリメピリド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびトラザミド）、メグリチニド（ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅｓ）（たとえばレパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ））、チアゾリジンジオン（たとえばトログリタゾロン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびロジグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ））およびインシュリンとインシュリンのアナログ（たとえばリスプロ（ｌｉｓｐｒｏ））がある。

【0046】

自己免疫は典型的にＴ２Ｄに関係していないが、Ｔ２Ｄと診断された人々の最大２５％は高いレベルの自己抗体を有する。Ｔ２Ｄの幾分かの人々は、糖尿病薬剤に無反応になり、糖尿病をコントロールするためにＴ１Ｄ患者の場合でのようにインシュリンを必要とする。症状が１型糖尿病になる前に２型糖尿病として始まるので、糖尿病のこの形式は、成年期の潜伏した自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）またはタイプ１．５糖尿病として知られている。第２の態様では、本発明は、以下を含む、被検者の成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）を診断する方法を提供する：
修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすること；
ここで、サンプル中の修飾インシュリンに対する抗体の存在は被検者のＬＡＤＡを示す。

【0047】

本発明の第２の態様の方法は、Ｔ２Ｄを持つことが知られている被験者からのサンプルに対して典型的に実行される。従って、本発明の第２の態様の１つの実施態様では、被検者はＴ２Ｄを持っているか、またはＴ２Ｄを持っていたと診断される。別の実施態様では、被検者は、たとえば多渇症（多渇）、多尿症（頻尿）、多食症（食欲亢進）、減量および疲労の１つ以上の徴候を示すので、Ｔ２Ｄを持っているとの疑いをかけられる。

【0048】

第２の態様の実施態様では、サンプルは血液または血清のサンプルである。別の実施態様では、インシュリンは、ＲＯＳよって翻訳後に修飾される。ＲＯＳは、典型的に次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）またはヒドロキシル・ラジカル（・ＯＨ）である。好ましくは、ＲＯＳはヒドロキシル・ラジカル（・ＯＨ）である。

【0049】

別の実施態様では、インシュリンはグリケーションによって修飾される。好ましくは、グリケーションはリボースによって引き起こされる。

【0050】

本発明の第２の態様の方法は、被検者のＬＡＤＡの診断を与える。したがって、方法はＬＡＤＡを治療する方法と共に使用することができる。

【0051】

従って、本発明の第２の態様は、さらに以下を含む、必要のある被検者において成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）を治療する方法まで及ぶ：
修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすること；
サンプル中の修飾インシュリンに対する抗体の存在を識別すること；および
被検者へＬＡＤＡのための治療薬を適用すること。

【0052】

治療薬は典型的にインシュリン、ワクチンとしての免疫療法薬剤（例えば経口インシュリン、吸入されたインシュリンなど）または免疫抑制剤として適用される。
最も典型的には、治療薬はインシュリンである。

【0053】

本発明のこの実施態様は、さらに必要とする患者で成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）を治療する以下を含む方法において使用されるための、ＬＡＤＡの治療薬に及ぶ：
修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすること；
サンプル中の修飾インシュリンに対する抗体の存在を識別すること；および
被検者へＬＡＤＡのための治療薬を適用すること。

【0054】

本発明のこの実施態様はさらに、以下を含む方法により必要のある被検者のＬＡＤＡの治療のための医薬品の製造における、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）の治療薬の使用に及ぶ：
修飾インシュリンに対する抗体の存在または不在に関して被検者からのサンプルをテストすること；
サンプル中の修飾インシュリンに対する抗体の存在を識別すること；および
被検者へＬＡＤＡのための治療薬を適用すること。

【0055】

第３の態様では、本発明は、ｏｘＰＴＭインシュリンに関連した疾病を治療するための治療薬の治療の効能を決定する方法を提供する。

【0056】

第３の態様の実施態様では、その病気はＴ１Ｄである。別の実施態様では、その病気はＬＡＤＡである。

【0057】

第３の態様によれば、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬の治療有効性は、以下のように決定される：
ｉ）被検者へ治療薬を適用する前に被検者から得られた、第１のサンプル中の修飾インシュリンに対する抗体のレベルを決定すること；
ｉｉ）被検者へ治療薬を適用した後に被検者から得られた、第２のサンプル中の修飾インシュリンに対する抗体のレベルを決定すること；および
ｉｉｉ）１番目と２番目サンプル間の修飾インシュリンに対する抗体のレベルを比較すること；
ここで、第１のサンプルと比較された時に第２のサンプル中の修飾インシュリンに対する抗体のレベルの減少は、治療薬の治療有効性を示す。

【0058】

いくつかの実施態様では、方法は、さらに被検者から１番目および第２のサンプルを得て、被検者への治療薬を適用するステップを含んでいる。従って、本発明の第３の態様の１つの実施態様では、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬の治療有効性は、以下により決定される：
ｉ）被検者から第１のサンプルを得ること；
ｉｉ）第１のサンプル中の修飾インシュリンに対する抗体のレベルを決定すること；
ｉｉｉ）被検者への治療薬を適用すること；
ｉｖ）被検者から第２のサンプルを得ること；
ｖ）第２のサンプル中の修飾インシュリンに対する抗体のレベルを決定すること；および
ｖｉ）１番目と２番目サンプル間の修飾インシュリンに対する抗体のレベルを比較すること；
ここで、第１のサンプルと比較された時の第２のサンプル中の修飾インシュリンに対する抗体のレベルの減少は、治療薬の治療有効性を示す。

【0059】

ここに使用されるように、用語「治療薬」は被検者に適用された時に所望の生物学的または薬学的結果を提供する化合物を指す。
Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬の例としては、インシュリン、ワクチンとしての免疫療法薬剤（例えば経口インシュリン、吸入されたインシュリンなど）または免疫抑制剤として適用されるが、これらに制限されない。

【0060】

本発明の第３の態様の方法は、被検者がそのような糖尿病薬剤（つまりＴ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬）に応答するかどうかを識別するための方法である。「糖尿病薬剤に応答する」とは、糖尿病薬剤による治療に応答することをいう。言いかえれば、患者の中のＴ１Ｄの症状の重症度を低下させて、血糖、ＨｂＡ１ｃおよびＣペプチドによって測定されるようなグルコース制御を改善することをいう。糖尿病薬剤による治療に対する反応は、糖尿病薬剤による治療前後に血糖コントロールを評価することにより決定することができる。

【0061】

本発明の第３の態様の方法は、以前に治療されたか、現在１つ以上の糖尿病薬剤で治療されている被検者からのサンプルに対して典型的に実行される。この態様では、本発明は、患者が１つ以上の糖尿病薬剤（つまりＴ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬）による療法に応答するかどうかをモニターする方法に関する。

【0062】

本発明の第３の態様の方法は、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療するために患者が治療薬に応答するかどうかの指標を与える。したがって、本発明の第３の態様は、さらにＴ１ＤまたはＬＡＤＡの治療（つまり、被検者へのＴ１ＤまたはＬＡＤＡのための治療薬を適用すること）のために治療薬で患者を治療するステップを含む方法を包含する。治療薬は典型的にインシュリン、ワクチンとしての免疫療法薬、または免疫抑制剤である。

【0063】

本発明のすべての態様中で、治療法は人間または動物の被験者に行うことができる。また、人間用の医薬および獣医学における薬剤の使用に及ぶ。Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬は、「治療上有効な量」で被検者に好ましくは適用される。これは、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡの１つ以上の徴候を改善するか、除去するか、防ぐか、および／または被検者に有益性を示すのに十分な量をいう。ここに使用されるように、「治療」は人間または非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）に役立つことができるあらゆる処方を含んでいる。その治療は既存の症状に関してあるか、または予防的（予防的治療）であることができてもよい。治療は、典型的に、「その必要のある」、すなわちＴ１ＤまたはＬＡＤＡに罹患している患者に適用される。

【0064】

この実施態様では、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬がインシュリンである場合には静脈内投与されるが、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬を患者に適切なルート、たとえば経口（バッカルまたは舌下腺を含む）、経鼻的、局所的（経皮的を含む）、非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮内を含む）によって供される。Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬は、薬学の技術において既知の方法、たとえば医薬品組成物を形成するために無菌条件の下でキャリアーまたは補形薬と治療薬を混合することにより、調剤することができる。従って、１つの実施態様では、被検者は、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療するための治療薬および１つ以上のキャリアーおよび／または添加剤を含む医薬品組成物が投与される。

【0065】

Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療する治療薬は、１つ以上の他の治療上活性な薬と共同して適用することができる。従って、本発明のこの実施態様に従う使用のための医薬品組成物は、Ｔ１ＤまたはＬＡＤＡを治療するための治療薬に加えて、１つ以上の他の治療上活性な薬をさらに含んでもよい。

【0066】

本発明での使用のためのＴ１ＤまたはＬＡＤＡの治療薬および／または医薬品組成物の投与量は、たとえば使用される具体的な治療薬、年齢および患者の疾病段階に依存して広い範囲間に変わり、医師は最終的に使用される適切な量を決定するだろう。

【0067】

投与は適切な回数で繰り返すことができる。
副作用が発現する場合、投与量および／または投与頻度は通常の医療実績に従って低減することができる。

【0068】

第４の態様では、本発明は被検者のＴ１ＤまたはＬＡＤＡを診断するためにキットを提供する。キットは修飾インシュリンに対する抗体の存在を決定するための１つ以上の試薬を含む。キットは、包装され、ラベルが貼られ、たとえばキットの必要な要素を含む箱または包装容器内に提供される。また診断キットの使用についての指示を含むことができる。

【0069】

いくつかの例では、本発明のキットはＴ１ＤまたはＬＡＤＡを発現する被検者の危険を予言するのに役立つことができる。

【0070】

本発明は、例示のみのために提示される以下の例によりさらに記述される。例において、以下の図が参照される。

【図面の簡単な説明】

【0071】

【図1】ゲル電気泳動法および３Ｄ蛍光による非変性および修飾インシュリンの分析。Ａ： 反応的なオキシダントによって修飾されたインシュリン（ＩＮＳ）、リボースによるグリケーション（Ｇｌｙｃ ＩＮＳ）、・ＯＨ（・ＯＨ−ＩＮＳ）、またはＨＯＣｌ（ＨＯＣｌ−ＩＮＳ）の硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）および非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）分析。分子量マーカー（ｋＤａ）の位置は左のパネルに示される。非変性ＰＡＧＥは、より遅い可動性の２本のバンドの出現により、リボースによるグリケーション後のインシュリンの可動性の明瞭な低下を示した。ＨＯＣｌおよび・ＯＨ−ジェネレーティング・システムへのインシュリンの暴露は、追加のより遅い可動性バンドの出現、および切断を示唆するライン全体を通してのタンパク質のスメアを引き起こした。Ｂ： グリケーション、ＨＯＣｌおよび・ＯＨによって修飾されたインシュリンおよび非変性のインシュリンの三次元蛍光プロフィール。ＨＯＣｌまたはリボースでのインシュリンの修飾は、図中の垂直および水平の線および図中の数字によって示されたＥｍｍａｘおよびＥｘｍａｘ波長の本質的な変化に帰着した。・ＯＨでの修飾は自然蛍光の損失に帰着し、非変性の分子の集合を示唆する光散乱の増加を示した。

【0072】

【図2】質量分析による非変性および修飾インシュリンの分析Ａ： 未変性のおよびＲＯＳにより修飾されたインシュリンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。非変性のインシュリンは、ｍ／ｚ ５，８０７．６５ｄａにピークを示した；リボースによるグリケーションの後、４つの追加のピークが１３２Ｄａの質量差で現われ、これらはモノ−、ジ、トリ、およびテトラ−グリケート化インシュリンフォームに対応する。ＨＯＣｌへの暴露は、未変性のフォームと比較してより低いｍ／ｚで追加のピークを発現し、これは分解産物の形成がオキシダントとの反応によって引き起こされたことを示す。ｍ／ｚ ５，８２４（＋１６）のピークは・ＯＨで修飾されたインシュリンについて示された。非変性のインシュリンと・ＯＨ−インシュリンの間の質量差は１６Ｄａであり、これは１つの酸化に相当する。Ｂ： ＲＯＳ修飾インシュリンのＭＳ／ＭＳの分析は次のことを示した：・ＯＨとＨＯＣｌにより引き起こされた主な酸化的変化は、Ｂ鎖のＨｉｓ５、Ｃｙｓ７およびＰｈｅ２４を含んでいた（上および左側のボックス「未知の酸化＋１３４ Ｄａ（Ｃ）」。さらに、ＨＯＣｌでの処理は、Ｔｙｒ１６およびＴｙｒ２６上の塩素種の生成を引き起こした（右側ボックス、「３−クロロチロシン、３，５−ジクロロチロシン」）。一方、リボースによる主な修飾は、Ｂ鎖のＮ末端Ｐｈｅ１およびＬｙｓ２９を含む。斜線部分は免疫優勢のエピトープＢ９：２３を示す（下側、左側ボックス「カルボキシメチル、ホルミル、リボース」）。

【0073】

【図3】非変性および修飾インシュリンへのＴ１Ｄ血清の結合：Ａ：Ｔ１ＤまたはＴ２Ｄに罹患した患者、および健全者のコントロールからの血清サンプルによってインシュリンに結合するＥＬＩＳＡ。非変性（ＮＴ−ＩＮＳ）およびリボース（ＧＬＹ−ＩＮＳ）、ＨＯＣｌ（ＨＯＣｌ−ＩＮＳ）およびＯＨ（・ＯＨ−ＩＮＳ）によって修飾されたＲＯＳインシュリン（ＲＯＳ−ＩＮＳ）に対する反応性は、Ｔ２Ｄおよび健全なコントロールと比較して、Ｔ１Ｄにおいて著しくより高かった（ｐ＜０．００１）。ＲＯＳ−ＩＮＳに対する結合は、Ｔ１Ｄにおいて非変性のＩＮＳによりも著しく高かった（ｐ＜０．０００１）；ＲＯＳ−ＩＮＳに対する結合は、インスリン療法の後でも非変性のものより高いままだった（Ｐ＜０．００１）。診断時、および診断後６−１２か月の結合が示される。Ｂ：非変性およびＲＯＳ−ＩＮＳに対する結合がウエスタンブロットで調べられた。非変性のインシュリン、および・ＯＨ−ＩＮＳおよびＨＯＣｌ−ＩＮＳのより小さな可動性フラグメントのスメアに結合するより強い強度が観察された。ＧＬＹ−ＩＮＳへの結合は見られなかった。Ｃ：ＥＬＩＳＡによるヒドロキシル・ラジカル修飾されたインシュリンへの血清の結合血清結合は、ヒドロキシル・ラジカル・ジェネレーティング・システムの中で使用される二価金属によるインシュリン六量体化にものを除外するために、インシュリンは、Ｈ_２Ｏ_２がない状態でＣｕＣｌ_２（４．５ ｍＭ）に暴露されて、Ｈ２Ｏ２（９ ｍＭのみに暴露された場合と比較されたか、またはフェントン反応（ＣｕＣｌ_２＋Ｈ_２Ｏ_２）によるヒドロキシル・ラジカル・ジェネレーティング・システムと比較された。Ｃｕ_２^＋の存在下でのインシュリンのインキュベーションは、Ｈ_２Ｏ_２が存在する状態でののみ反応を増加させ、増加したＥＬＩＳＡ結合へのフェントン反応の関与が確認された。

【0074】

【図4】グルコース制御と年齢と、非変性および修飾インシュリンとの関係Ａ：１型糖尿病患者からのサンプルの非変性および修飾インシュリンへの結合は、グルコース制御（たとえば空腹時血漿グルコースおよびＨｂＡ１ｃの指数と関係がなかった（０．０７＜ρ＜０．１６、Ｐ＞０．１３２）。Ｂ：非変性およびグリケート化されたＩＮＳは、年齢と逆の関係を示した（それぞれρ＝−０．２０、Ｐ＝０．０３１、Ｐ＝０．０２９およびρ＝ −０．２１）；年齢による差は、２つの他のＲＯＳ−ＩＮＳでは見られなかった（−０．１４＜ρ＜−０．０８およびＰ＞０．１３０）。

【0075】

【図5】非変性のインシュリン（ＮＴ−ＩＮＳ）およびｏｘＰＴＭ−ＩＮＳへの１型糖尿病血清の結合（Ａ） １型糖尿病の患者、２型糖尿病の患者および健全なコントロールからの血清サンプルによるインシュリンに結合するＥＬＩＳＡ ２型糖尿病および健全なコントロールと比較して、ＮＴ−ＩＮＳおよびｏｘＰＴＭ−ＩＮＳとの反応は、１型糖尿病の人々からのサンプルにおいて著しくより高かった（ｐ＜０．００１）。１型糖尿病の患者からのサンプル中において、ｏｘＰＴＭ−ＩＮＳへの結合はＮＴ−ＩＮＳに対するよりも著しく高かった（ｐ＜０．０００１）。（Ｂ） ＩＡＡのレベルは、１型糖尿病の患者および健康な生徒の同じグループの中のＲＢＡによって評価された。（Ｃ−Ｅ）インスリン療法前後での、ＥＬＩＳＡによる（Ｃ）ＮＴ−ＩＮＳ（ｐ＜０．０００１）および（Ｄ）ＨＯＣｌ−ＩＮＳ（ｐ＝０．００７）に結合する抗体の期間変化、および（Ｅ）ＲＢＡ（ｐ＜０．０００１）によって評価されたインスリン抗体の期間変化

【0076】

【図6】ｏｘＰＴＭ−ＩＮＳへの血清結合特異性 非変性のインシュリン（ＮＴ−ＩＮＳ）の非存在下での、ｏｘＰＴＭ−ＩＮＳと１型糖尿病血清サンプルのプレインキュベーションは、ｏｘＰＴＭ−ＩＮＳへの結合が強く抑制され、ｏｘＰＴＭ−ＩＮＳに特異的な抗原結合部位の存在を示した。データはｏｘＰＴＭ−ＩＮＳの例として、・ＯＨにより修飾されたインシュリンについて示された。

【0077】

実施例
例１ − ＲＯＳによるインシュリンの修飾
発明者は、反応的なオキシダント（たとえばヒドロキシル・ラジカル（・ＯＨ）、（酸化塩素酸（ＨＯＣｌ）、およびリボースに暴露されたインシュリンおよび非変性のインシュリン両方への反応に関して、発病初期のＴ１Ｄ患者のコホートをテストした。その後、構造の修飾は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）、３Ｄ蛍光および質量分析（ＭＳ）によって分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、ＲＯＳでの修飾インシュリン（ＲＯＳ−ＩＮＳ）および非変性のインシュリンは、可動性の有意差は無く５ｋＤａの領域に移動したが、５ｋＤａメジャーバンドの上のスメア（ｓｍｅａｒ）がＲＯＳ−ＩＮＳで観察された（図１Ａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。非変性ＰＡＧＥ（ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ）では、非変性および修飾インシュリンの間の差が現われた。リボースによるグリケーションの後、２本の追加のバンドとインシュリン・バンドの位置の明瞭なシフトが現れ、これらはすべてより遅い可動性を示す。インシュリンの・ＯＨ−ジェネレーティング・システムおよびＨＯＣｌへの暴露は、タンパク質のスメアと共に、追加のより遅い可動性バンドを発現した。これらの全体のラインは切断を示唆する（図１Ａ、非変性ＰＡＧＥ）。

【0078】

その後、ＲＯＳ修飾のインシュリンの構造変化への影響を決定するために、発明者は、上で非変性およびＲＯＳ−ＩＮＳに関する３Ｄ蛍光プロフィール研究を行なった（図１Ｂ）。ある自家蛍光（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）は、最大励起 Ｅｘｍａｘ＝２７９ｎｍおよび最大放射Ｅｍｍａｘ＝３１８ｎｍで非変性のインシュリンにおいて検知できた。それはチロシン残基に帰することができる。リボースでのインシュリンの修飾は、３２６および４５２ｎｍへのＥｘｍａｘおよびＥｍｍａｘの本質的なシフトに帰着し、ＨＯＣｌでの修飾はＥｘｍａｘ＝３３６およびＥｍｍａｘ＝４３１ｎｍに帰着した。それは、インシュリン構造の変化を意味する。・ＯＨでの修飾は、非変性の分子の集合を示唆する光散乱の増加および蛍光の損失に帰着した。

【0079】

その後、非変性および修飾インシュリンは高分解能質量分析（ＭＳ）によって分析された。非変性のインシュリンは、インシュリンの分子量に対応するｍ／ｚ ５，８０７．６５Ｄａでピークを示した。リボースによるグリケーションの後、４つの追加のピークが、インシュリンへのリボース分子のモノ−、ジ−、トリおよびテトラグリシル化を示す１３２Ｄａの質量差で現われた。ＨＯＣｌへの暴露は、非変性の形体に比較してより低いｍ／ｚで追加のピークの発現を引き起こした。これは分解産物の形成がオキシダントとの反応によって引き起こされたことを示す。ｍ／ｚ ５，８２４（＋１６）のピークは、・ＯＨにより修飾されたインシュリンについて示された。非変性のインシュリンと・ＯＨ−インシュリンとの間の質量差は１６Ｄａだった。これは１つの酸化に相当する（図２Ａ）。

【0080】

ＭＳ／ＭＳ分析は、主な酸化的変化がＢ鎖において、Ｐｈｅ１およびＬｙｓ２９（グリケーション）、Ｈｉｓ５、Ｃｙｓ７、Ｐｈｅ２４（・ＯＨとＨＯＣｌ）、Ｔｙｒ１６およびＴｙｒ２６（ＨＯＣｌ）で起きていることを示唆した（図２Ｂ、表１）。インシュリンのグリケーションがＢ鎖のＮ末端Ｐｈｅ１および Ｌｙｓ２９を含んでいることを示す従来の研究と観察結果は相関する。同様により中央での酸化は、Ｔｒｙ１６と２６、Ｐｈｅ２４とＣｙｓ１９を変化の好ましい部位とする前の報告書とも相関する。

【0081】

表１：インシュリンＢ鎖のＭＳ／ＭＳの分析。表は、ペプチドＢ：１−１３（ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥ）、Ｂ：１４−２１（ＡＬＹＬＶＣＧＥ）およびＢ：２１−３０（ＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ）に関する主な酸化的翻訳後修飾（ＰＴＭｓ）を示す。変更はＡ鎖では検知されなかった。下線を付した残基は、関連する酸化ＰＴＭの位置を示す。

【0082】

【表1】

【0083】

例２ − Ｔ１Ｄ患者からの血清中の非変性およびＲＯＳ−ＩＮＳに結合する抗体
Ｔ１Ｄ患者からの血清中の非変性とＲＯＳ−ＩＮＳに結合する抗体を比較するために、非変性およびＲＯＳ−ＩＮＳはＥＬＩＳＡの目標として使用された。コントロールとして、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者と、健康な被験者からのサンプルが使用された。外因性のインシュリンに対する抗体による干渉を回避するために、インスリン療法が始められる前のＴ１Ｄ患者の平均年齢は１３．９０±０．７７年とした（表２）。非変性とＲＯＳ−ＩＮＳとの反応性は、Ｔ１Ｄ患者のそれぞれ３４％および７９％であり、非変性のインシュリン、ＨＯＣｌ−ＩＮＳおよび・ＯＨ−ＩＮＳへの結合についての平均±ＳＤ ＯＤはそれぞれ０．２２±０．１３、０．３５±０．１４および０．３９±０．１４であった（図３Ａ）。ＨＯＣｌおよび・ＯＨ−ＩＮＳへの結合は、非変性のインシュリンへの結合と比較して著しく高かった（Ｐ＜０．０００１）。逆に、グリケート化されたインシュリンは、非変性のインシュリンと比較して結合の著しい減少を示した（Ｐ＝０．０１８、０．２２±０．１３ ｖｓ ０．１６±０．０８）。ＨＯＣｌおよび・ＯＨ−ＩＮＳの結合は、Ｔ２Ｄおよび健康な被験者よりＴ１Ｄ血清においてより高かった（Ｐ＜０．０００１）。Ｔ２Ｄでは、非変性のインシュリン、糖化されたＩＮＳ、ＨＯＣｌ−ＩＮＳ、および・ＯＨ−ＩＮＳに対して、それぞれ４％、０％、３％および２８％を測定した。健康な個人では、３％の結合が非変性およびＲＯＳ−ＩＮＳの両方に観察された（表３）。Ｔ１Ｄを持った患者の中のＨＯＣｌ−ＩＮＳへの自己抗体結合の感度および特異性は、健全なコントロールと比較してそれぞれ７９．３１％および９７．１４％だった。またＴ２Ｄと比較してそれぞれ６５．５２％および９６．３４％だった。しかしながら、・ＯＨ−ＩＮＳへの反応性はＴ１Ｄの患者ではＴ２Ｄ患者と比較して低い特異性を有し、７６．７２％および７１．９５％の感度および特異性を有していた。興味深いことには、外因性のインシュリンによる処理は、ＲＯＳ−ＩＮＳに結合する長期間での抗体中の有意差を引き起こさなかった（Ｐ＞０．０９２）が、非変性のインシュリンへの結合はわずかに（ＯＤ ０．１８８±０．１１対０．２１８±０．１２；Ｐ＝０．０１１）増加した。恐らく外因性のインシュリンに対する免疫反応が誘発されたのだろう。全体として、６−１２か月の時間枠では、ＲＯＳ−ＩＮＳへの結合は、非変性のＩＮＳによりも著しく高いままだった（Ｐ＜０．０００１；図３Ａ）。

【0084】

ｏｘＰＴＭによって引き起こされた構造のネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅｓ）よりも修飾されたアミノ酸に結合する可能性を除去するために、コントロール抗原への反応のテストが行われた（表３）。従って、我々は、結合がＣｕ_２＋にインシュリンを暴露することによる・ＯＨ−ジェネレーティング・システムに使用される二価金属によるインシュリン六量体化による可能性を除外した。したがって、抗修飾インシュリンの免疫の認識は特異的で、ｏｘＰＴＭによって引き起こされたインシュリンネオエピトープに向けられた。その後、ウエスタンブロット解析が、ＥＬＩＳＡで最も強い結合を示した一連の血清サンプルについて行なわれた。非変性のインシュリンについては、５ｋＤａの領域中のフラグメントへの結合は明白だった。しかし、これはグリケーションの後に失われた。・ＯＨ−ＩＮＳおよびＨＯＣｌ−ＩＮＳへの結合はより強く、非変性のＩＮＳより遅い可動性を有する拡散されたフラグメントに向けられた（図３Ｂ）。ウエスタンブロット解析はＥＬＩＳＡ結果を確認し、異なるＲＯＳジェネレーティング・システムによって引き起こされた新エピトープの内因性の特異性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）の存在を示唆した。健全なコントロールからの血清サンプルはインシュリン・フォーマットのうちのどれにも結合しなかった（データは示されない）。

【0085】

表２：研究された個体群の臨床および生化学的特徴。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）および健全なコントロールの性別、年齢および代謝パラメータ。データは平均値±標準誤差である。

【0086】

【表2】

【0087】

表３：未変性およびＲＯＳ−ＩＮＳへの結合
健康な被験者の９７．５パーセンタイルより上のＥＬＩＳＡ ＯＤレベルは、上がったと定義された。コントロール２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）および健康な個人と比較して、非変性および反応的なオキシダント（ＲＯＳ−ＩＮＳ）によって修飾されたインシュリンへの結合は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）においてより高かった（Ｐ＜０．００１）。Ｔ２Ｄにおいては、・ＯＨ（・ＯＨ−ＩＡＡ）により修飾されたインシュリンへの結合は、健康な被験者よりも高く、Ｔ１Ｄより低かった。血清中のＲＯＳインシュリンへの結合が、所定の修飾アミノ酸への特異的結合に帰することができた可能性を除去するために、我々は無関係の非変性およびＲＯＳ修飾されためんどり卵リゾチーム（ＨＥＬ）を結合用の目標抗原として使用してテストした。すべてのグループの中で、抗グリケート化された、および・ＯＨ−修飾ＨＥＬの抗体は非変性のＨＥＬ抗体より低かった。一方、ＨＯＣｌで修飾されたＨＥＬへの結合だけが、非変性のＨＥＬより高い傾向があった。

【0088】

【表3】

【0089】

例３ − グルコース制御と年齢と、未変性およびＲＯＳ−ＩＮＳの関係
他のＲＯＳ抗原に示されるように（Ｓｔｒｏｌｌｏ、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ、２０１３年３月、Ｖａｙら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ ２０００年１１月）、診断時の抗非変性−ＩＮＳ（ａｎｔｉ−ｎａｔｉｖｅ−ＩＮＳ）およびＲＯＳ−ＩＮＳの両方のレベルは、血糖またはＨｂＡ１ｃと関連していなかった（０．０７＜ρ＜０．１６およびＰ＞０．１３２；図４Ａ）。従って、Ｖａｒｄｉら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ、１９８８年１０月）によって実証されるように、抗非変性の−ＩＮＳは、年齢と逆相関する（ρ＝ −０．２０、Ｐ＝０．０３１）が、抗−ＲＯＳ−ＩＮＳについては年齢とは相関が無かった（−０．１４＜ρ＜−０．０８およびＰ＞０．１３０、図４Ｂ）。興味深いことには、小標本サイズに限られるが、発明者はＴ１Ｄに関係していると知られていたＤＲＢ１＊０３またはＤＲＢ１＊０４とＨＬＡとの明瞭な関連を見つけられなかった（表４）。ＨＬＡ特異性が抗−ＲＯＳ−ＣＩＩに関係していたとのこの結果は発明者の従来の研究（Ｓｔｒｏｌｌｏら、２０１３年３月）と反対である。

【0090】

表４：ＨＬＡ−ＤＲＢ１および抗−ＲＯＳ−ＩＮＳ反応性。抗−ＲＯＳ−ＩＮＳは１型糖尿病の中のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子型と関係がない。完全なＤＲ分類は９０タイプの１型糖尿病被検者に利用可能だった。ＤＲＢ１^＊Ｘは、ＤＲＢ１^＊０４、ＤＲＢ１^＊０３と等しくない。

【0091】

【表4】

【0092】

例４ − Ｔ１Ｄ患者とコントロールの個人におけるＲＯＳ−ＩＮＳへの抗体結合
Ｔ１Ｄ患者とコントロールの個人におけるＲＯＳ−ＩＮＳへの抗体結合
１型糖尿病の個人からの血清中の非変性のインシュリン対ＲＯＳ−ＩＮＳに結合する抗体を評価するために、非変性のインシュリンおよびＲＯＳ−ＩＮＳは、ＥＬＩＳＡの目標として使用された。コントロールとして、健康な生徒および成人のグループからのサンプルが使用された。外因性のインシュリンに対する抗体に対する干渉を回避するために、患者がインスリン療法を始める前の、１型糖尿病（平均±ＳＥ年齢１３．９０±０．７７年）の患者からのサンプルが、診断時に得られた（表４）。ＨＯＣｌ（ＨＯＣｌ−ＩＮＳ）および・ＯＨ−ＩＮＳの修飾されたインシュリンへの結合は、非変性のインシュリンに結合するより著しく高かった。１型糖尿病の患者の非変性のインシュリンおよびＲＯＳ−ＩＮＳへの反応は３０％および８４％と測定された。非変性のインシュリン、ＨＯＣｌ−ＩＮＳ、・ＯＨ−ＩＮＳへの結合についてのメジアン吸光度はそれぞれ、０．０４３±０．０１２、０．１８３±０．０１２および０．２３１±０．０１３だった（ｐ＜０．０００１、図５ａ）。グリケート化されたインシュリンへの結合は、非変性のインシュリンに比較して著しく低い（吸光度０．００７±０．００６、ｐ＜０．０００１、データは示されない）。コントロール抗原ＨＥＬおよびｏｘＰＴＭ−ＨＥＬの抗体は、１型糖尿病患者の参加者のの５％および３．５％のみに存在していた（データは示されない）。ＨＯＣｌ−ＩＮＳおよび・ＯＨ−ＩＮＳへの結合は、２型糖尿病および健康な個人の参加者からの血清よりも１型糖尿病の参加者からの血清においてより高かった（ｐ＜０．０００１）。１型糖尿病の患者の中のＲＯＳ−ＩＮＳ反応の感度および特異性は、健康な生徒と比較してそれぞれ８４％および９９％であり、また２型糖尿病の患者と比較してそれぞれ６６％および９９％だった。

【0093】

血清反応が、糖尿病の臨床的発症の時の同化作用の変質（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）によった可能性を除外するため、１型糖尿病の６９人の患者での結合がインスリン療法の後に長期間評価された（図５ｃ−ｅ）。インスリン療法は、非変性のインシュリンへの結合のわずかな増加を引き起こした（メジアン吸光度、０．０４０±０．０１４、対、０．０８３±０．０２６；ｐ＜０．０００１）、およびＨＯＣｌ−ＩＮＳ（メジアン吸光度、０．１８７±０．０１９、対、０．２６２±０．０２４；ｐ＝０．００７）への結合も増加したが、・ＯＨ−ＩＮＳでは増加しなかった（データは示されない）。
全体として、ＲＯＳ−ＩＮＳへの結合は非変性のインシュリンに対するよりも著しく高いままだった（ｐ＜０．０００１）。三回のイントラアッセイＣＶは、＜８％（平均４％、ｎ＝１０）だった。イントラアッセイＣＶは、非変性のインシュリンおよびＲＯＳ−ＩＮＳ（ｎ＝１２）についてそれぞれ＜１０％（平均６％）および＜１３％（平均６％）だった。

【0094】

表５：個体群の臨床・生化学的特徴。
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）および健全なコントロールの性別、年齢および代謝パラメータ。データは平均±標準誤差である。

【0095】

【表5】

【0096】

ＲＯＳ−ＩＮＳ ＥＬＩＳＡとラジオバインディングアッセイ（ＲＢＡ）の間の比較も行なわれた。診断時、ＲＯＳ−ＩＮＳ（・ＯＨ−ＩＮＳおよび／またはＨＯＣｌ−ＩＮＳ）と、ＲＢＡでのＩＡＡの反応は、１型糖尿病の参加者の８４％および６１％と測定された（図５ａ−ｂ）。ＲＯＳ−ＩＮＳ抗体の感度は、特異性は両方の分析で９９％だった一方、ＲＢＡによって測定されたＩＡＡについては８４％対６１％だった（ｐ＝０．０００１）。ＥＬＩＳＡによるＲＯＳ−ＩＮＳ抗体とＲＢＡによるＩＡＡは、１型糖尿病個人の５０％で共存した。しかし、ＲＯＳ−ＩＮＳ抗体は、ＩＡＡネガティブだった参加者のさらに３４％で検知することができた。全体として、ＲＢＡポジティブの参加者の８２．７％はさらにＥＬＩＳＡでＲＯＳ−ＩＮＳポジティブだった。その一方でＲＢＡポジティブだった１７．３％はＥＬＩＳＡでＲＯＳネガティブだった。ＲＢＡによるＩＡＡおよびＲＯＳ−ＩＮＳ抗体ＥＬＩＳＡの組み合わせの測定は、新しい発病の１型糖尿病の参加者の９５％までインシュリン自己免疫の検知を上げた。

【0097】

例５ − ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットの組み合わせによるＲＯＳへの抗体結合特異性
競争的置換分析（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｓｓａｙ）は非変性のインシュリンまたはＲＯＳ−ＩＮＳのいずれかとプレインキュベートされた血清によって、ＲＯＳ−ＩＮＳへの血清結合特異性を評価するために行なわれた（図６）。１型糖尿病血清が非変性のインシュリンの過剰量でプレインキュベートされた時、顕著な置換は生じなかった。また、直接結合ＲＯＳ−ＩＮＳと比較して、競合アッセイは２５％低い吸光度を示した。対照的に、ＲＯＳ−ＩＮＳ（・ＯＨ−ＩＮＳまたはＨＯＣｌ−ＩＮＳ）の過剰量で血清がプレインキュベートされた時、結合の大きな低下（平均で８８％の吸光度の低下）を示し、抗体特異性が主としてＲＯＳ−ＩＮＳにあることを示した。その後、ウエスタンブロット解析は、ＥＬＩＳＡで最も強い結合を示した一連の血清サンプルで行なわれた。非変性のインシュリンに対応するフラグメントへの弱い結合は明白だった。しかし、これはグリケーションの後に失われた。・ＯＨ−ＩＮＳおよびＨＯＣｌ−ＩＮＳへの結合はより強く、非変性のインシュリンより遅い可動性を有する拡散されたフラグメントの方へ向けられた。健全なコントロールからの血清サンプルはインシュリン・フォーマットのうちのどれにも結合しなかった（データは示されない）。臨床徴候でＲＯＳインシュリンに結合する抗体の関係も評価された。非変性のインシュリンおよびＲＯＳ−ＩＮＳへの１型糖尿病の個人からのサンプルの結合は、代謝制御の指数（たとえば空腹時血漿グルコースおよびＨｂＡ１ｃ）とは、診断時または代謝の代償の後に無関係だった（−０．０３＜ρ＜０．１６およびｐ＞０．１３２）。また空腹時Ｃペプチド、インシュリン必要性または年齢にも無関係だった（−０．０７＜ρ＜−０．０１およびｐ＞０．９１６）。表５を参照。

【0098】

材料と方法
生体外の化学的修飾：
ＰＢＳの中のヒト組み換えのインシュリン（１ｍｇ／ｍｌ）は、次のシステムで３７℃で一晩インキュベートされた：
（１） ２ｍｏｌ／ｌのリボース（シグマ、Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、英国）；
（２） ９ミリモル／ｌ ＨＯＣｌ（ＢＤＨ、オックスフォード、英国）；
（３） フェントン反応によりヒドロキシル・ラジカル（・ＯＨ）を生成するために、４．５ミリモル／ｌのＣｕＣｌ_２（シグマ）、および９ミリモル／ｌのＨ_２Ｏ_２（シグマ）が使用された。
めんどり卵リゾチーム（ＨＥＬ；シグマ）も上記のように修飾され、コントロール抗原として使用された。インシュリンの修飾は、２０％還元ナトリウム・ドデシル硫酸塩−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、および２０％の非変性のＰＡＧＥと、引き続くＣｏｏｍａｓｓｉｅ（シグマ）での染色でモニターされた。

【0099】

３次元（３Ｄ）蛍光：
３−Ｄ走査蛍光スペクトルはＨｉｔａｃｈｉ Ｆ−４５００分光蛍光計（Ｔｏｋｙｏ、日本）を使用して得られた。サンプルは、凝集物質を除去するために走査に先立って簡潔に遠心分離機にかけられた。同時励起（２００−８００ｎｍ）および放射（２００−８００ｎｍ）スペクトルが記録された。

【0100】

質量分析：
サンプルはＳｔａｇｅＴｉｐＣ１８で脱塩され、ポジティブの線形モードで、質量範囲ｍ／ｚ、２，０００から２５，０００までの範囲で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析された。サンプルのアリコートはＤＴＴで還元され、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、Ｇｅｒｍａｎｙ）で消化され、ＳｔａｇｅＴｉｐＣ１８によって脱塩され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＭＳ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ（ＭＳ／ＭＳ）分析およびナノ・エレクトロスプレイ・イオン化タンデム型質量分析（ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）に供された。

【0101】

血清サンプル：
血清サンプルは免疫療法糖尿病（ＩＭＤＩＡＢ）グループの参加センターから得られた。
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の個人は、アメリカ糖尿病協会による基準により診断され、ほとんどの場合、診断はグルタミン酸脱炭酸酵素、インシュリンまたはチロシンホスファターゼ抗体への陽性によって確認された；他の主な慢性病の患者が除外された。インスリン療法が始められる前に、Ｔ１Ｄサンプルは診断時に集められた。２型糖尿病（ｎ＝８２）および健康な個人（ｎ＝６８）からの血清は、対照群として使用された。このプロジェクトは、ＩＭＤＩＡＢ調査の枠内のキャンパス大学・バイオ−メディコの倫理委員会によって承認された。患者または親によって署名された説明と同意を得て、タイプ１の糖尿病の研究をした。

【0102】

ＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡは目標として修飾インシュリン、非変性のインシュリンまたはＨＥＬを使用して行なわれた。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｌｏｎｄｏｎ、英国）は、４℃で一晩、０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩バッファーｐＨ ９．６中の修飾蛋白質または天然蛋白質の１０μｇ／ｍｌでコートされた。その後、プレートは、ＰＢＳで３回洗われた。０．５％のトゥイーンＰＢＳ中の５％のＢＳＡで２時間ブロックした後に、０．５％のトゥイーンＰＢＳ中の５％のＢＳＡ中の１：２００で薄められた血清サンプルの１００μｌが各ウエルに加えられ、室温で２時間インキュベーションされた。その後、プレートは、ＰＢＳと０．１％のトゥイーンで洗われ、次いでＰＢＳで３回洗われた。抗ヒトＩｇＧホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ） − 共役抗体（シグマ）は、０．５％のトゥイーンＰＢＳの中の５％のＢＳＡの中の１：１，０００稀釈液に加えられ、さらに２時間インキュベーションされた。ＥＬＩＳＡプレートは洗われ、１００ミリモル／ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中の１００μｇ／ｍｌ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基体（シグマ）が加えられた。続いて、反応は１ｍｏｌ／ｌの硫酸で止められた。光電密度（ＯＤ）は、ＧＥＮｉｏｓプレート・リーダおよびＭａｇｅｌｌａｎソフトウェア（Ｔｅｃａｎ、Ｒｅａｄｉｎｇ、英国）を使用して、４５０ｎｍで測定された。ＨＥＬおよびｏｘＰＴＭ−ＨＥＬについて得られたＥＬＩＳＡ吸光度は、非変性のインシュリンおよびｏｘＰＴＭ−ＩＮＳの吸光度から引かれる背景コントロールとしてそれぞれ使用された。さらに、分析のフラクチュエーションを制御するため、同じプレート上の個々のサンプルに関し、インシュリン、ｏｘＰＴＭ−ＩＮＳ、ＨＥＬおよびｏｘＰＴＭ−ＨＥＬへの結合がテストされた。分析はそれぞれ既知のポジティブまたはネガティブの対照試料を含んでいた。同じ個人（インスリン療法の前およびインスリン療法の後）から得られた長期間のサンプルは、同じプレート上でテストされた。健康な個人の第９９パーセンタイル以上のｏｘＰＴＭ−ＩＮＳ抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡカットオフとして定義された。競合的なＥＬＩＳＡはｏｘＰＴＭ−ＩＮＳへの血清の結合特異性を評価するために行なわれた。競合的なＥＬＩＳＡは、血清サンプルをコートされたＥＬＩＳＡプレートに加える前に、１０μｇ／ｍｌの非変性のインシュリンまたは競合としてのｏｘＰＴＭ−ＩＮＳを加えたか加えないで、２時間または一晩プレ−インキュベートしたことを除いて、上記と同じ方法で行われた。

【0103】

ラジオバインディングアッセイ（ＲＢＡ）：
ＩＡＡは改良された放射免疫沈降法分析を使用して、ＲＢＡによって測定された。簡潔には、２０μｌの血清がヒト１２５−Ｉインシュリンが存在する状態で４℃で２日間、インキュベートされた。その後、免疫複合体は５０％のプロテインＡ／Ｇ−セファロースを使用して沈降された。何回かの洗浄の後、結合した１２５−Ｉインシュリンはベータ・カウンターで測定された。以下のように定義したインデックスにより、結果は示された：
（サンプルｃｐｍ − 陰性の標準コントロールｃｐｍ）／（陽性の標準コントロールｃｐｍ − 陰性の標準コントロールｃｐｍ）
インデックス＞０．００２の血清サンプルは、陽性であると考えられた。陽性の分析限界は、＞１５０の健康なコントロール血清の９９番目のパーセンタイル値により計算された。この分析は２０１２年に膵島自己抗体標準化熟達ワークショップ（Ｉｓｌｅｔ Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）で４６％の感度および１００％の特異性を達成した。

【0104】

ウェスタンブロット：
ＰＡＧＥは、上に記述されるように行われ、標準プロトコルによりニトロセルロースへ移された。薄膜は５％の粉乳粉末（Ｍａｒｖｅｌ）の中で２時間ブロックされ、次いで血清サンプルは５％のｍｅｒｖｅｌで１：１０００に希釈され、４℃で一晩インキュベーションされた。０．５％のトゥイーン−ＰＢＳ中で５分間、２回洗った後に、薄膜は５％のＭｅｒｖｅｌ中の抗−ＩｇＧ ＨＲＰ（シグマ）の１：１０００希釈液中で１時間インキュベートされた。その後、薄膜は０．５％のトゥイーン−ＰＢＳ中で１０分間、２回洗った後に、ＰＢＳ中で１０分間洗い、１ｍｌのＬｕｍｉｎａｔａ Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ（シグマ）とインキュベートした。バンドはＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｅシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、アメリカ）を使用して検知された。

【0105】

ＨＬＡ遺伝子型決定：
ＨＬＡ型判定はＳｔｒｏｌｌｏら（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２０１３年３月）に先に記載されたように、特異性プライマーを使用したＰＣＲとシーケンス特異性オリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションを使用して行なわれた。

【0106】

統計分析：
統計分析は、プリズム・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、アメリカ）およびＳＰＳＳ １９（ＩＢＭ，アメリカ））を使用して行なわれた。グループ間の自己抗体のレベルの差はマン・ホイットニー検定によってテストされた。抗体結合の長期間での変化はペアードｔ−検定によってＴ１Ｄを持った５４の患者で評価されたか、またはデータが通常分布しなかった場合、ペアードウィルコクソン検定によって評価された。抗非変性、ＲＯＳ−ＩＮＳおよびＨＥＬ抗体のレベルが健康な個人の９７．５パーセンタイルより上の場合に、上がったと定義された。ピアソンの相関テストはＲＯＳ−ＩＮＳおよび非変性のＩＮＳとの反応と代謝制御の間の関連性を評価するために使用された。高いインシュリン自己抗体の存在と遺伝子型との間の関連性を評価するために、オッズ比（ＯＲ）が計算され、９５％のＣＩｓで報告された。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]