特許 6739106 自己免疫疾患の治療用ペプチド断片

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6739106

(24)【登録日】2020年7月27日

(45)【発行日】2020年8月12日

(54)【発明の名称】自己免疫疾患の治療用ペプチド断片

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/88 20060101AFI20200730BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20200730BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200730BHJP

   C12N 15/60 20060101ALI20200730BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200730BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200730BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200730BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20200730BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20200730BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20200730BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20200730BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200730BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20200730BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/88ZNA

   C12N5/0784

   C12N5/10

   C12N15/60

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   A61P37/06

   A61K38/43

   A61K38/10

   A61K35/76

   A61K48/00

   A61K35/15 Z

【請求項の数】10

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2017-530804(P2017-530804)

(86)(22)【出願日】2016年7月20日

(86)【国際出願番号】JP2016071224

(87)【国際公開番号】WO2017018288

(87)【国際公開日】20170202

【審査請求日】2019年5月22日

(31)【優先権主張番号】特願2015-150344(P2015-150344)

(32)【優先日】2015年7月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504147254

【氏名又は名称】国立大学法人愛媛大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】日浅 陽一

(72)【発明者】

【氏名】八木 専

(72)【発明者】

【氏名】阿部 雅則

(72)【発明者】

【氏名】池田 宜央

(72)【発明者】

【氏名】山下 政克

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５１３７６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０４８７６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０４／００１４２４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ６１Ｋ ３５／００−３５／７６８

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

炭酸脱水素酵素Ｉ（ＣＡＩ）のアミノ酸配列の第５８位〜第７３位のアミノ酸配列から成るペプチド断片。

【請求項3】

請求項１に記載のペプチド断片を含有する自己免疫疾患の治療又は予防用医薬組成物

【請求項4】

経口投与用である、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

請求項１に記載のペプチド断片に特異的な寛容原性抗原提示細胞。

【請求項6】

制御性樹状細胞である、請求項５に記載の寛容原性抗原提示細胞。

【請求項7】

請求項５又は６に記載の寛容原性抗原提示細胞を含む自己免疫疾患の治療又は予防用医薬組成物。

【請求項8】

請求項１に記載のペプチド断片をコードするポリヌクレオチド。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項10】

請求項９に記載のベクターを組み込んだ形質転換体。

【請求項11】

請求項１０に記載の形質転換体を含む自己免疫疾患の治療又は予防用医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

自己免疫疾患の治療に関する技術が開示される。

【背景技術】

【0002】

クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腸管における免疫機構の破綻により特徴づけられる疾患である。詳細な病因等は未だ明らかとされていないが、共生細菌、様々な微生物生産物、及び食品に対する過剰な自然免疫及び獲得免疫反応が原因の一つ考えられている。

【0003】

微小環境における免疫調節は、局所のホメオスタシスを維持するために定常的に微調整される必要がある。このような調整は、部位（例えば消化管環境）に特異的であり、微生物への慢性的な曝露により誘導されると考えられている。樹状細胞は、この調節を制御する上で重要な役割を担っている。樹状細胞は、最も強力でかつ効果的な抗原提示細胞であり、初期免疫反応の誘導に関与している。また、樹状細胞は免疫寛容の形成にも重要な役割を果たしている。免疫寛容のメカニズムは完全には解明されていないが、樹状細胞がＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞をＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞に分化させることにより、末梢においてＴ細胞による免疫寛容を誘導することが報告されている（非特許文献１参照）。

【0004】

特許文献１には、炎症性腸疾患を含む自己免疫疾患の治療に炭酸脱水素酵素Ｉ（ＣＡＩ）及びそれでパルスした寛容原性抗原提示細胞を用いることが提案されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】ＷＯ２０１１／０４８７６６

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｆｕｊｉｔａ Ｓら（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１１０：３７９３−８０３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、自己免疫疾患等を含む疾患の治療に有効な新たな手段を提供すること等を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＣＡＩの特定のペプチド断片が炎症性腸疾患の経口免疫療法に有効であること、及び当該ペプチド断片でパルスして得られた寛容原性抗原提示細胞が炎症性腸疾患の治療に有効であること等を見出した。斯かる知見に基づき、更なる研究と検討を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。

【0009】

１．ペプチド断片
１−１．
炭酸脱水素酵素Ｉ（ＣＡＩ）のアミノ酸配列の第４６位〜第７３位のアミノ酸配列、第１６０位〜第１８１位のアミノ酸配列、又は第２３５位〜第２６１位のアミノ酸配列を含み、３５アミノ酸残基以下であるアミノ酸配列から成るペプチド断片。
１−２．
ＣＡＩがヒト又はマウス由来である、１−１に記載のペプチド断片。
１−３．
１−１又は１−２に記載のペプチド断片を含有する医薬組成物。
１−４．
自己免疫疾患の治療又は予防用である、１−３に記載の医薬組成物。
１−５．
自己免疫疾患が炎症性腸疾患である、１−４に記載の医薬組成物。
１−６．
経口投与用又は注腸投与用である、１−３〜１−５のいずれかに記載の医薬組成物。 １−７．
経口投与用である、１−６に記載の医薬組成物。

【0010】

２．寛容原性抗原提示細胞
２−１．
１−１又は１−２に記載のペプチド断片に特異的な寛容原性抗原提示細胞。
２−２．
制御性樹状細胞である、２−１に記載の寛容原性抗原提示細胞。
２−３．
２−１又は２−２に記載の寛容原性抗原提示細胞を含む医薬組成物。
２−４．
自己免疫疾患の治療又は予防用である、２−３に記載の医薬組成物。
２−５．
自己免疫疾患が炎症性腸疾患である、２−４に記載の医薬組成物。
２−６．
腹腔内投与用である、２−３〜２−５のいずれかに記載の医薬組成物。
２−７．
１−１又は１−２に記載のペプチド断片で寛容原性抗原提示細胞をパルスすることを含む、２−１に記載の抗原提示細胞を製造する方法。

【0011】

３．ポリヌクレオチド等
３−１．
１−１又は１−２に記載のペプチド断片をコードするポリヌクレオチド。
３−２．
３−１のポリヌクレオチドを含むベクター。
３−３．
３−２のベクターを組み込んだ形質転換体。
３−４．
１−１又は１−２に記載のペプチド断片を発現する、３−３に記載の形質転換体。
３−５．
乳酸菌である、３−３又は３−４に記載の形質転換体。
３−６．
３−３〜３−５に記載の形質転換体を含む医薬組成物。
３−７．
自己免疫疾患の治療又は予防用である、３−６に記載の医薬組成物。
３−８．
自己免疫疾患が炎症性腸疾患である、３−７に記載の医薬組成物。
３−９．
経口投与用である、３−６〜３−８のいずれかに記載の医薬組成物。
３−１０．
３−３〜３−５のいずれかに記載の形質転換体を培養することを含む、１−１又は１−２に記載のペプチド断片を製造する方法。

【0012】

４−１．
１−１又は１−２に記載のペプチド断片、１−３に記載に医薬組成物、２−１又は２−２に記載の寛容原性抗原提示細胞、或いは２−３に記載の医薬組成物を自己免疫疾患の治療が必要な患者に投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
４−２．
投与が経口投与である、４−１に記載の方法。
４−３．
自己免疫疾患の治療又は予防における使用のための１−１又は１−２に記載のペプチド断片。
４−４．
自己免疫疾患の治療又は予防用の医薬組成物の製造における使用のための１−１又は１−２に記載のペプチド断片。

【発明の効果】

【0013】

炎症性腸疾患に代表される自己免疫疾患の有効な治療手段が提供される。好適な一実施形態において、比較的簡便、低コストで製造でき、非侵襲的な自己免疫疾患の治療手段が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入腸炎マウスから取り出した腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）と候補ペプチド、ＣＡＩタンパク質またはＫＬＨを共培養し、ＩＬ−１７産生能を評価した結果を示す。縦軸はＩＬ−１７濃度（ｐｇ／ｍｌ）であり、横軸は候補ペプチドの添加量（μＭ）である。

【図2】成熟樹状細胞（上段）及び制御性樹状細胞（下段）において発現している分子マーカーを測定した結果を示す。成熟樹状細胞と比較して、制御性樹状細胞は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現濃度が低いことが確認された。

【図3】ＣＡＩペプチドでパルスしたＲｅｇ−ＤＣによる大腸炎の治療効果を評価した結果を示す。（Ａ）は、試験のレジメを示す。（Ｂ）は、処置を受けたモデルマウスの体重変化を示す。（Ｃ）は、処置を受けたモデルマウスから摘出した大腸の写真を示す。（Ｄ）は、処置を受けたマウスから摘出した大腸の長さを示す。（Ｅ）は、各マウスの大腸組織片を染色した結果を示す。（Ｆ）は、組織像を評価した結果を示す。

【図4】処置を受けた腸炎モデルのＭＬＮ細胞における転写因子及び炎症性サイトカイン発現を測定した結果を示す。（Ｂ）はｍＲＮＡの発現を測定した結果であり、（Ｃ）は、炎症性サイトカイン産生量をＥＬＩＳＡで測定した結果である。

【図5】処置を受けた腸炎モデルの大腸における転写因子及び炎症性サイトカイン発現を測定した結果を示す。（Ｂ）は、ｍＲＮＡの発現を測定した結果であり、（Ｃ）は、炎症性サイトカイン産生量をＥＬＩＳＡで測定した結果である。

【図6】ＣＡＩペプチド及びＣＡＩスクランブルペプチドでパルスしたＲｅｇ−ＤＣによる大腸炎の治療効果を評価した結果を示す。（Ａ）は、試験のレジメを示す。（Ｂ）は、処置を受けたモデルマウスの体重変化を示す。（Ｃ）は、処置を受けたモデルマウスを開腹した写真を示す。（Ｄ）は、処置を受けたモデルマウスの糞便の写真を示す。（Ｅ）は、処置を受けたモデルマウスから摘出した大腸の写真を示す。（Ｆ）は、処置を受けたマウスから摘出した大腸の長さを測定した結果を示す。（Ｇ）は、各マウスの大腸組織片を染色した結果を示す。（Ｈ）は、組織像を評価した結果を示す。

【図7】Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}でＣＤ１０３^＋樹状細胞及びＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞を誘発した結果を示す。（Ａ）及び（Ｂ）は、ＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞を測定した結果を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞を測定した結果を示す。

【図8】処置を受けた腸炎モデルマウスのＭＬＮから単離したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖能を測定した結果を示す。

【図9】ＣＡＩ５８−７３ペプチドの経口投与による大腸炎の治療効果を評価した結果を示す。（Ａ）は、試験のレジメを示す。（Ｂ）は、処置を受けたモデルマウスの体重変化を示す。（Ｃ）は、処置を受けたモデルマウスから摘出した大腸の写真を示す。（Ｄ）は、処置を受けたマウスから摘出した大腸の長さを測定した結果を示す。（Ｅ）は、各マウスの大腸組織片を染色した結果を示す。（Ｆ）は、組織像を評価した結果を示す。（Ｇ）は、処置を受けたモデルマウスの体重変化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

「炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）」は、細胞質に存在し、二酸化炭素の水和反応を可逆的に触媒する酵素である。マウスＣＡＩのアミノ酸配列を配列番号１に示し、ヒトＣＡＩのアミノ酸配列を配列番号２に示す。マウスＣＡＩのアミノ酸配列とヒトＣＡＩのアミノ酸配列との同一性は７８．２％である。

【0016】

ペプチド断片は、自己免疫疾患の治療又は予防に有効である限り、ＣＡＩの任意のペプチド断片であり得る。一実施形態において、好ましいペプチド断片は、ＣＡＩのアミノ酸配列の第４６位〜第７３位のアミノ酸配列、第１６０位〜第１８１位のアミノ酸配列（配列番号５）、又は第２３５位〜第２６１位のアミノ酸配列（配列番号６）を含む。好適な一実施形態において、好ましいペプチド断片は、ＣＡＩのアミノ酸配列の第４６位〜第７３位のアミノ酸配列を含み、より好ましくはＣＡＩのアミノ酸配列の第５８位〜７３位のアミノ酸配列（配列番号４）、又は第４６位〜第７２位のアミノ酸配列（配列番号３）を含む。

【0017】

ペプチド断片の長さは、自己免疫疾患の治療又は予防に有効である限り特に制限されず、任意に設定することができる。一実施形態において、ペプチド断片の長さは、４０アミノ酸残基以下、３５アミノ酸残基以下、３０アミノ酸残基以下、２５アミノ酸残基以下、又は２０アミノ酸残基以下である。

【0018】

一実施形態において、ペプチド断片は、ＣＡＩのアミノ酸配列の第４６〜第７２位、第５８〜７３位、第１６０位〜第１８１位のアミノ酸配列、又は第２３５位〜第２６１位のアミノ酸配列のみから成り、好ましくはＣＡＩのアミノ酸配列の第５８〜７３位のアミノ酸配列のみから成る。

【0019】

ペプチド断片は、自己免疫疾患の治療又は予防に有効である限り、他の物質（例えば、免疫寛容能を高める物質、又は免疫寛容能を有する物質等）との融合タンパク質であってもよい。

【0020】

ペプチド断片の由来は、自己免疫疾患の治療又は予防に有効である限り任意であり、治療又は予防対象に応じて適宜選択することができる。一実施形態において、ペプチド断片の由来は、マウス又はヒトであり、好ましくはヒトである。

【0021】

特定のアミノ酸配列から成るペプチド断片には、当該アミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列が包含される。ここで、一定以上の同一性とは、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上である。

【0022】

アミノ酸配列の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツール（例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェア）を用いて計算することができる。例えば、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、及びLambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）にして、他の各種パラメータもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列の同一性の値（％）を算出することができる。

【0023】

自己免疫疾患とは、自己抗原に対して免疫応答が起こることにより発症する疾患である。一実施形態において、自己免疫疾患は炎症性腸疾患であり、症性腸疾患には、潰瘍性大腸炎及びクローン病等が含まれる。

【0024】

ＣＡＩのペプチド断片は、ＣＡＩのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列の情報を基に周知の遺伝子工学的手法又は化学合成によって製造することができる。例えば、ＣＡＩの塩基配列情報に基づいて、適宜プライマーを設計し、発現ベクターを作製して、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞等の宿主細胞に導入し、発現させることによりＣＡＩのペプチド断片を得ることができる。ＣＡＩは、セルフリータンパク質合成システムを利用して調製することもできる（Ｍａｄｉｎ Ｋら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９−６４）。ペプチド断片の化学合成方法としては、例えば、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法等を挙げることができる。

【0025】

ペプチド断片の投与経路は、自己免疫疾患の治療又は予防に有効である限り任意であり適宜選択することができる。例えば、ペプチド断片の投与経路は、経口投与、鼻腔内投与、注腸投与、気道内投与、皮下投与、又は血管内（静脈内）投与等とすることができる。一実施形態において、好ましい投与経路は経口投与又は注腸投与であり、より好ましくは経口投与である。

【0026】

ペプチド断片の投与形態は、自己免疫疾患の治療又は予防に有効である限り任意であり適宜選択することができる。例えば、ペプチド断片は、医薬組成物の形態で投与することができる。医薬組成物の剤形は任意であり、投与経路等に応じて適宜設定することができる。ペプチド断片を含有する医薬組成物の剤形は、例えば、カプセル剤、錠剤、座剤、注射剤、シロップ剤、顆粒剤、又は粉霧剤等とすることができる。医薬組成物は、その剤形及び投与経路等に応じて、任意の賦形剤、安定化剤、又はｐＨ調整剤等と組み合わせることができる。

【0027】

一実施形態において、ペプチド断片は、それを発現する（又は、発現し得る）微生物の状態で投与することもできる。微生物としては、ＣＡＩの断片ペプチドを発現可能であり、ヒトへの投与（例えば、経口投与）に適している限り特に制限されないが、例えば、乳酸菌、又は大腸菌等を挙げることができる。微生物は、生菌であっても死菌であってもよい。一実施形態において、微生物は死菌であることが好ましい。

【0028】

ペプチド断片の投与回数は、自己免疫疾患の治療又は予防に有効である限り、特に制限されず、任意に設計することができる。例えば、ペプチド断片は、一回投与であっても、継続的又は断続的な投与であってもよい。ペプチド断片の投与頻度は、例えば、単回投与、１日１回投与、１週間に１〜４回投与の他、１か月〜３か月毎に１回などの間歇的投与も選択できる。投与期間は、例えば、１日、１週間、１カ月、２〜３ヶ月、半年、１年、２〜５年、又は１０年等とすることができる。

【0029】

ペプチド断片の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる限り等に制限されず、症状、性別、年齢、体重等に応じて適宜設定することができる。１回あたりの投与量は、例えば、０．０１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で設定することができる。ペプチド断片は、有効成分として、それ単独で投与されてもよいが、自己免疫疾患又は他の疾患の治療又は予防に有効な他の成分との組み合わせで投与されても良い。

【0030】

上記のペプチド断片を用いて、自己免疫疾患の治療又は予防に有効な寛容性抗原提示細胞を得ることができる。具体的には、寛容性抗原提示細胞をＣＡＩのペプチド断片でパルスすることにより、自己免疫疾患の治療又は予防に有効な寛容性抗原提示細胞（即ち、ＣＡＩのペプチド断片に特異的な寛容性抗原提示細胞）を得ることができる。

【0031】

寛容原性抗原提示細胞は当該技術分野において知られる任意の手法で取得することができる。例えば、寛容原性抗原提示細胞である制御性樹状細胞は、自己免疫疾患の患者の骨髄細胞を採取し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、及びヒト形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）の存在下で約８日間培養し、超高純度ＬＰＳの存在下で約２４時間刺激することにより調製することができる。また、患者の末梢血を採取し、当業者周知の方法で単核球画分を分離、採取し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、及びヒト形質転換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）の存在下で約８日間培養し、超高純度ＬＰＳの存在下で約２４時間刺激することにより寛容原性抗原提示細胞を調製することができる。このようにして調製した制御性樹状細胞は、共刺激分子を発現している樹状細胞を除去することにより純度を高めることができる。

【0032】

ペプチド断片による寛容原性抗原提示細胞のパルスは、ペプチド断片の存在下で寛容原性抗原提示細胞を培養することにより行うことができる。培養条件は特に制限されないが、例えば、５〜２０μＭのペプチド断片の存在下で約２４時間、５％ＣＯ_２、３７℃の培養という条件を例示することができる。

【0033】

ペプチド断片でパルスした寛容原性抗原提示細胞の患者への投与は、免疫細胞を利用した細胞治療方法として当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、細胞は、血管内（静脈内）に投与される。また、投与は、一時的に行われてもよいし、持続的又は断続的に行われてもよい。投与頻度は、例えば、単回投与、１週間に１〜４回投与、１か月〜３か月毎に１回の投与などを採用することができる。

【0034】

ペプチド断片でパルスした寛容原性抗原提示細胞の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等に応じて適宜決定することができる。投与量は、例えば、免疫寛容の程度、患者の血中における抗原特異的な制御性樹状細胞及び／又は制御性Ｔ細胞の数、あるいは自己免疫疾患の治療効果若しくは予防効果を指標として設定することができる。例えば、１回の細胞の投与量は、１×１０^６細胞〜１×１０^１０細胞の範囲から選択することができる。パルスした寛容原性抗原提示細胞は、シクロスポリン、タクロリムス等の免疫抑制剤等の他の薬剤と共に投与されてもよい。

【0035】

自己免疫疾患の治療又は予防には、上記ペプチド断片でパルスした寛容原性抗原提示細胞の他、当該ペプチド断片に特異的な制御性Ｔ細胞を用いることもできる。このような制御性Ｔ細胞は、例えば、次の工程により調製することができる。（１）寛容原性抗原提示細胞及びナイーブＴ細胞を調製する工程。（２）ペプチド断片で寛容原性抗原提示細胞をパルスする工程。（３）パルスした寛容原性抗原提示細胞とナイーブＴ細胞を接触させて制御性Ｔ細胞を誘導する工程。

【0036】

ナイーブＴ細胞は、末梢血または、脾臓細胞から、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞単離キット及びＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、製造者のマニュアルに従って単離することができる。ナイーブＴ細胞の純度は、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）ラベル抗ＣＤ４モノクローナル抗体及びフィコエリトリン（ＰＥ）ラベル抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析により確認することができる。

【0037】

パルスした制御性樹状細胞による制御性Ｔ細胞の誘導は、例えば、１ｍＬのＲＰＭＩ培地中、５×１０^６個のナイーブＴ細胞を、５×１０^５個の制御性樹状細胞と共に７日間培養することで得ることができる。このようにして得られる制御性Ｔ細胞を用いた自己免疫疾患の治療又は予防は、上述の寛容原性抗原提示細胞を用いた自己免疫疾患の治療又は予防と同様に行うことができる。

【0038】

上記断片ペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドが有する塩基配列は、ＣＡＩをコードする天然の塩基配列と一致していても良いし、それを発現させる宿主細胞等との関係で適宜変異（例えば、コドン使用頻度の最適化）が施されていてもよい。このようなポリペプチドを用いることにより、効率的に上記断片ペプチドを製造することができる。

【0039】

ポリヌクレオチドの状態は特に限定されず、例えば、単離されたものであっても、ベクター内に組み込まれたものであってもよい。ベクターの構造、由来、及び用途等は特に限定されない。例えば、ベクターは、プラスミドベクター、又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、又はレトロウイルス）であり得る。また、ベクターは、例えば、クローニング用ベクター又は発現用ベクターであり得る。発現用ベクターとしては、大腸菌、又は放線菌等の原核細胞用のベクター、或いは、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞等の真核細胞用のベクターを挙げることができる。ポリヌクレオチドは、任意の修飾が施されていてもよく、例えば、５'末端側に適宜シグナルペプチドをコードする塩基配列が付加されていてもよい。

【0040】

上記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、及び、上記ポリヌクレオチドで形質転換された形質転換体が提供される。このような宿主細胞及び形質転換体は、当該技術分野に公知の任意の手法を用いて得ることができる。宿主細胞の種類は、任意であり特に制限されない。例えば、宿主細胞は酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞などの真核細胞、並びに大腸菌、乳酸菌、及び放線菌等の原核細胞であり得る。宿主細胞及び形質転換体は、上記ペプチド断片を発現していてもよく、発現していなくてもよい。

【0041】

一実施形態において、宿主細胞又は形質転換体は、上記ペプチド断片を発現していることが好ましい。このような宿主細胞又は形質転換体は、上記ペプチド断片と同様に自己免疫疾患の治療又は予防に使用することができる。また、宿主細胞又は形質転換体は、それを培養することによって、上記ペプチド断片を製造するために使用することもできる。

【実施例】

【0042】

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。

【0043】

統計解析
全ての個々の実験のデータは平均値±標準偏差（ＳＤ）で示す。必要に応じて、スチューデントｔ検定、多重比較のためにターキークレイマーによって分析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意差ありとした。すべての統計分析は、ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳインターナショナル）で計算した。

【0044】

実施例１：ＣＡＩペプチドの同定
ＣＡＩペプチドはＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩ拘束性のある抗原を選択する。それら候補ペプチドに対する抗原の免疫反応を評価するために、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入腸炎マウスから取り出した腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）と候補ペプチド、ＣＡＩタンパク質またはＫＬＨを共培養し、ＩＬ−１７産生能を評価した。

【0045】

（１）マウス
以下すべての実験おいて特定病原体未感染条件下で交配されたＣＢ−１７ ＳＣＩＤとＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ、ＩＡ−ＩＥ）８−１２週の雌マウスを使用した（日本クレア株式会社）。全てのマウスは２２℃、湿度５５％と１２時間昼／夜リズムの条件下にて愛媛大学で通常の実験動物飼料を与えて維持管理を行った。動物はランダムに実験群に割り当てた。実験プロトコルは愛媛大学動物委員会の承認を得て、グッドラボラトリープラクティスガイドラインに従って実行された。

【0046】

（２）マウスＣＡＩペプチドエピトープの同定と調整
ＣＡＩタンパク質の全２６１アミノ酸配列のうち１０−３０ｍｅｒのペプチドの中から親水性の高い配列、２次構造の中のターン構造の多い配列、糖付加のない配列、及びリン酸付加のない配列を指標に選択し、これらに加えて、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｉｎｄｅｘを用いてＴ細胞エピトープとなりうる配列を探索した（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，ＪＢら（１９８８） ＥＭＢＯ Ｊ． ７： ９３−１００）（Ｓｅｔｔｅ，Ａら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８６： ３２９６−３００）。その結果、ＣＡＩペプチドＫＰＬＳＩＳＹＮＰＡＴＡＫＥＩＶＮＶＧＨＳＦＨＶＩＦＤ（アミノ酸４６−７２；配列番号３）、ＫＥＩＶＮＶＧＨＳＦＨＶＩＦＤＤ（アミノ酸５８−７３；配列番号４）、ＫＶＬＤＡＬＮＳＶＫＴＫＧＫＲＡＰＦＴＮＦＤ（アミノ酸１６０−１８１；配列番号５）、ＥＧＥＰＡＶＰＶＬＳＮＨＲＰＰＱＰＬＫＧＲＴＶＲＡＳＦ（アミノ酸２３５−２６１；配列番号６）が選択された。以上のペプチド全てはＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ社によって合成された。

【0047】

（３）マウスＣＡＩの調整
ＣＡＩは以前に報告された方法（Ｙａｍａｎｉｓｈｉ，Ｈら （２０１２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８８， ２１６４−２１７２）に従って調整した。マウスＣＡＩ ｃＤＮＡ（以下ｍＣＡＩという）を以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させた。フォアード；ＡＴＧＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡ（配列番号７）
リバース；ＣＣＴＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＣ ＴＧ（配列番号８）

【0048】

増幅させたＤＮＡは、ＰｓｈＡＩ及びＢａｍＨＩサイトでプラスミドｐＥＴ４５ｂ（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ社）に挿入し、Ｎ末端に６個のＨｉｓからなるタグを有するｍＣＡＩを発現するｐＥＴ−ｍＣＡ１−Ｈｉｓ６コンストラクトを構築した。構築したコンストラクトは、サイクルシークエンス法により確認した。Ｈｉｓ−ＣＡ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、金属（Ｎｉ２＋）アフィニティクロマトグラフィにより精製後、ＰＢＳ中で透析することによりイミダゾールを除去した。ＥｎｄＴｒａｐｒｅｄカラム（ＨｙｇｌｏｓＧｍｂＨ社）を用いてエンドトキシンを除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲルをＤｅｅｐ Ｐｕｒｐｌｅ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で染色した。ゲルイメージをＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＴＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で分析し、タンパク質の純度を計算した。

【0049】

（４）腸炎モデルの作成
以前の報告と同様にマウスに腸炎を誘発させた（Ｋｊｅｌｌｅｖ，Ｓら（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：１３４１−５４）。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＫｉｔとＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞からＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を分離した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞（３×１０^５／マウス）をＣ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウスへ腹腔内投与した。

【0050】

（５）ＩＬ−１７産生能によるエピトープスクリーニング
腸炎誘発したマウスから４週後に腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を摘出した。ＭＬＮ細胞（５×１０^５）は、９６穴プレート内でＣＡＩ、ＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）またはＣＡＩペプチドと７２時間、５％ＣＯ_２、３７℃で共培養した。培養上清中のＩＬ−１７濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて分析した。

【0051】

（６）結果
ＣＡＩを添加すると０．５μＭまで用量依存的にＩＬ−１７産生が上昇したが、ＫＬＨではＩＬ−１７産生の変化は観察されなかった。４つの候補ペプチドの中で３つのペプチド（アミノ酸４６−７２、アミノ酸５８−７３、アミノ酸１６０−１８１）は１０μＭまで用量依存的にＩＬ−１７産生を誘導した。（図１）。

【0052】

実施例２：樹状細胞の表現型
（１）樹状細胞の調製
成熟樹状細胞はＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄細胞（２×１０^６）をマウス顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬ）と８日間培養し、次に２４時間超高純度のリポ多糖類（ＬＰＳ、１μｇ／ｍＬ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）で刺激して作製した。制御性樹状細胞（Ｒｅｇ−ＤＣ）はＢＡＬＢ／ｃマウスから摘出した骨髄細胞（２×１０^６）をマウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、マウスインターロイキン−１０（ＩＬ−１０、２０ｎｇ／ｍＬ）、ヒト成長要因−β１（ＴＧＦ−β１、２０ｎｇ／ｍＬ）と８日間培養し、次に２４時間超高純度のＬＰＳで刺激して作製した。以上のサイトカインは全て和光純薬工業から入手した。続いてＲｅｇ−ＤＣはフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でラベルされた抗ＣＤ４０（３／２３）、ＣＤ８０（１６−１０ＡＩ）、ＣＤ８６（ＧＬ１）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で４℃、３０分間染色した。抗ＦＩＴＣ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、ＣＤ４０^＋ＣＤ８０^＋ＣＤ８６^＋細胞（全細胞のおよそ２０％）をＡｕｔｏＭＡＣＳで排除した。

【0053】

（２）樹状細胞マーカーの検出
樹状細胞は、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ｍＡｂ（２．４Ｇ２）でＦｃレセプターをブロッキングした後、抗ＣＤ１１ｃｍＡｂ（ＨＬ３）、抗ＣＤ８０ｍＡｂ、抗ＣＤ８６ｍＡｂ、抗ＣＤ４０ｍＡｂ、抗Ｉ−Ａ／Ｉ−ＥｍＡｂ（２Ｇ９）、及び抗Ｈ−２ＫｄｍＡｂ（ＡＭＳ−３２．１）を用いて染色した。アイソタイプ適合のｍＡｂをコントロールとして使用した。以上の抗体は全てＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から入手した。蛍光染色はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して処理した。ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．５ （Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）を利用し、フローサイト法で求めた蛍光強度を分析した。

【0054】

（３）結果
結果を図２に示す。成熟樹状細胞と比較して、Ｒｅｇ−ＤＣは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現濃度が低かった。
実施例３：ＣＡＩ ５８−７３パルスＲｅｇ−ＤＣによる大腸炎の治療
（１）ＣＡＩ、ＣＡＩペプチドパルスＲｅｇ−ＤＣの調製
実施例２と同様の方法により調製したＲｅｇ−ＤＣを洗浄、再懸濁させ、ＣＡＩ（６μｇ／ｍＬ）、又はＣＡＩペプチド（１０μＭ）と２４時間、５％ＣＯ_２、３７℃で共培養し、ＣＡＩでパルスしたＲｅｇ−ＤＣｓ（Ｒｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡＩ）、ＣＡＩペプチドでパルスしたＲｅｇ−ＤＣｓ（Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ４６−７２}，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ １６０−１８１}，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ２３５-２６１}）を作成した。

【0055】

（２）樹状細胞による腸炎モデルの治療
実施例１と同様に腸炎を誘発し、同時にそれぞれＲｅｇ−ＤＣｓ_ＣＡＩ，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ４６−７２}，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ １６０−１８１}，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ２３５-２６１}（１×１０^６／ｍｏｕｓｅ）（各ｎ＝８）を腹腔内投与した。移植日を０日目とした。樹状細胞の代わりに０．２ｍＬのＰＢＳを投与したマウスをＰＢＳ群とした。

【0056】

（３）腸炎の評価
レジメを図３Ａに示す。１週間毎に体重変化の評価、２８日目に安楽死させ大腸長を測定し、組織学的評価をした。大腸は、細胞移植の４週間後に安楽死させたマウスから採取した。横行結腸を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。組織薄片をＨ＆Ｅ又は過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。組織切片中の炎症の程度は、報告されている方法に従って評価した（ＫｊｅｌｌｅｖＳら（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：１３４１−５４）。組織像は、以下の１）〜４）の基準に従ってスコア付けした。
１）炎症の重症度：０無し；１軽度のリンパ球浸潤；２中等度のリンパ球浸潤、又は局所の陰窩変性；３重度の炎症、又は複数個所の陰窩変性、及び／又はびらん
２）炎症の程度：０無し；１粘膜；２粘膜下層；３貫壁性
３）粘液量：０通常；１微量の粘液減少；２中等度の粘液減少、又は局所的な粘液欠如；３重度の粘液減少；４完全な粘液欠如
４）上皮細胞増殖の程度：０無し；１細胞数又は陰窩長の穏やかな増加；２中等度又は局所の顕著な増加；３顕著な増加
組織学的スコアは、４つの個別のパラメータの総和として計算した。

【0057】

（４）結果
Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスは、ＰＢＳ投与マウスより移入後の４週目の体重が増加した（Ｐ＜０．０１）（図３Ｂ）。Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスはＰＢＳ投与マウス（Ｐ＜０．０１）、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ４６−７２}投与マウス，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ １６０−１８１}投与マウス，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ２３５-２６１}投与マウス（Ｐ＜０．０５）より、腸管長が長かった（図３Ｃ、３Ｄ）。また、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスはＰＢＳ投与マウス、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ４６−７２}投与マウス，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ １６０−１８１}投与マウス，Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ２３５-２６１}投与マウスと比較して糞便は固く、腸管腫大はみられなかった（図３Ｃ）。Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスは、腸炎の組織学的病勢（炎症性細胞浸潤、上皮増殖、粘液減少、杯状細胞の減少）を有意に改善していた（図３Ｅ、３Ｆ）。

【0058】

実施例４：腸炎モデルのＭＬＮ細胞における転写因子および炎症性サイトカイン発現
（１）転写因子のｍＲＮＡ発現測定
実施例３と同様にして作製したＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}またはＰＢＳを投与した腸炎モデルマウスから得た１×１０^６個のＭＬＮをＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ（キアゲン社）を用いてホモジナイズした。全ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉキット（キアゲン社）により抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して、１０μｇのＲＮＡから生成した。ＭＬＮのＦｏｘｐ３、及びレチノイン酸関連オーファン受容体ガンマｔ（ＲＯＲγＴ）のｍＲＮＡの発現は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現をコントロールとして、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。相対的発現量は以前報告された方法に従って計算した（ＴｏｋｕｍｏｔｏＹら（２００７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１２０−７）。

【0059】

（２）炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定
全ＲＮＡは、上記（１）と同様に生成させ、ＭＬＮのＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＴＧＦ−βのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ａ２（ＡＬＤＨ１ａ２）の量的ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎｓ遺伝子発現分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使って計測した。ＡＬＤＨ１ａ２プライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した（Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｍｍ００５０１３１２−ｍ１）。

【0060】

（３）ＥＬＩＳＡによる炎症性サイトカイン産生量の測定
実施例３と同様にして作製したＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}またはＰＢＳを投与した腸炎モデルマウスから得た１×１０^６個のＭＬＮ細胞を、２５ｎｇ／ｍＬのホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）（シグマケミカル社）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（シグマケミカル社）の存在下、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ、 ＨＥＰＥＳ、２ＭＥ、ペニシリン、ストレプトマイシン； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で７２時間、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。培養上清中のＩＬ−６、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、及び単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）濃度をサイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、製造者のマニュアルに従って測定した。また、上清中のＩＬ−１７濃度をＥＬＩＳＡキットにて測定した。

【0061】

（４）結果
結果を図４に示す。Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスのＭＬＮではＦｏｘｐ３、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０（Ｐ＜０．０１）とＡＬＤＨ１ａ２（Ｐ＜０．０５）の発現が、ＰＢＳ投与マウスより有意に高かった（図４Ａ）。Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスは、ＰＢＳ投与マウスよりＭＬＮのＩＬ−１７ＡとＲＯＲγｔの発現が有意に低かった（Ｐ＜０．０１）（図４Ａ）。また、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスのＭＬＮは、ＰＢＳ投与マウスのＭＬＮよりＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γとＭＣＰ−１の産生が低かった（Ｐ＜０．０１）（図４Ｂ）。この結果は、Ｒｅｇ−ＤＣｓＣＡＩ _{５８−７３}を投与することにより炎症が起きにくい環境が生じることを示唆する。

【0062】

実施例５：腸炎モデルの大腸における転写因子および炎症性サイトカイン発現
（１）転写因子のｍＲＮＡ発現測定
実施例３と同様にして作製したＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}またはＰＢＳを投与した腸炎モデルマウスから採取した大腸をＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒを用いてホモジナイズした。全ＲＮＡは実施例４と同様にして生成し、Ｆｏｘｐ３、ＲＯＲγＴのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。

【0063】

（２）炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現測定
全ＲＮＡは、上記（１）と同様に生成させ、大腸のＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びＡＬＤＨ１ａ２のｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。

【0064】

（３）Ｅｘ Ｖｉｖｏ培養大腸の炎症性サイトカイン産生量の測定
実施例３と同様にして作製したＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}またはＰＢＳを投与した腸炎モデルマウスから横行結腸１ｃｍ切片を採取し、便を除去した後、滅菌されたＰＢＳで３回洗浄した。実施例４と同様に培養し、サイトカインを測定した。

【0065】

（４）結果
Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスの大腸では、ＰＢＳ投与マウスと比較してＲＯＲγｔの発現は減少し（Ｐ＜０．０１）、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０（Ｐ＜０．０１）とＡＬＤＨ１ａ２（Ｐ＜０．０５）の発現が増加した（図５Ａ）。大腸のＩＬ−１７Ａの発現は、３つのグループの間に差はなかった（図５Ａ）。ＰＢＳ投与マウスと比較してＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスで、大腸のＩＬ−１７とＴＮＦ−αの産生は低かった（Ｐ＜０．０５）（図５Ｂ）。この結果は、Ｒｅｇ−ＤＣｓＣＡＩ _{５８−７３}を投与することにより、炎症が起きにくい環境が生じることを示唆する。

【0066】

実施例６：ＣＡＩ ５８−７３スクランブルペプチドパルスＲｅｇ−ＤＣによる大腸炎の治療
（１）ＣＡＩ ５８−７３スクランブルペプチドの調製
ＣＡＩ５８−７３由来で相同性を持たず、モチーフ、抗原予測部位を持たないスクランブルペプチド（ＥＨＤＫＧＤＨＶＳＶＦＮＩＩＦＶ（アミノ酸５８−７３；配列番号４））を作成した（表２）。

【0067】

（２）Ｒｅｇ−ＤＣの調製とパルス
Ｒｅｇ−ＤＣは、実施例１に記載の方法に準じて調製した。実施例３と同様に、Ｒｅｇ−ＤＣｓをＣＡＩ５８−７３ぺプチド（１０μＭ）、またはスクランブルペプチド（１０μＭ）と２４時間、５％ＣＯ_２、３７℃で共培養し、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ５８−７３}、スクランブルペプチドでパルスしたＲｅｇ−ＤＣｓ（Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ｓｃｒａｍｂｌｅ}）を作成した。細胞は２回洗浄した後にＰＢＳで再懸濁し、腸炎誘発０日目にそれぞれ１×１０^６細胞を腹腔内投与した。

【0068】

（３）腸炎モデルの作成及び樹状細胞による治療
腸炎モデルは、実施例１に記載の方法に従って作成した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞と共に、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得たＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ Ｓｃｒａｍｂｌｅ}を、それぞれ１×１０^６細胞／マウス（各ｎ＝８）となるように腹腔内投与した。樹状細胞の代わりにＰＢＳを投与したマウスをＰＢＳ群（ｎ＝８）とした。

【0069】

（４）腸炎の評価
レジメを図６Ａに示す。マウスの体重測定、マウスから採取した大腸の長さの測定、大腸炎の組織学的評価を、実施例３と同様に行った。

【0070】

（５）結果
Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスでは、ＰＢＳ投与マウス（Ｐ＜０．０５）やＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ｓｃｒａｍｂｌｅ}投与マウス（Ｐ＜０．０１）より体重増加がみられた（図６Ｂ）。Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスと比較してＰＢＳ投与マウスとＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ｓｃｒａｍｂｌｅ}投与マウスでは大腸が腫大し（図６Ｃ）、糞便は水様性下痢になっていた（図６Ｄ）。ＰＢＳ投与マウスとＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ｓｃｒａｍｂｌｅ}投与マウスよりＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスで大腸の長さは長かった（Ｐ＜０．０１）（図６Ｅ、６Ｆ）。Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスはＰＢＳ投与マウス、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ｓｃｒａｍｂｌｅ}投与マウスと比して腸炎の組織学的病勢を有意に改善した（図６Ｇ、６Ｈ）。
実施例７：Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}によるＣＤ１０３^＋樹状細胞及びＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞の誘導
ＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞はＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞を誘発し、免疫寛容を誘導すると報告されている。

【0071】

（１）マウスＭＬＮ及び大腸の調製
実施例３と同様にして作製したＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ｓｃｒａｍｂｌｅ}またはＰＢＳを投与した腸炎モデルマウスから得た１×１０^６個のＭＬＮ細胞を採取し、２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシンの存在下にＲＰＭＩ１６４０培地で７２時間、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。大腸はポリエチレンチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使って粘膜面が表になるよう裏返し、ＰＢＳで洗浄し、粘液を１ｍＭ ジチオスレイトール（シグマケミカル社）で除去した。腸上皮を３０ｍＭ ＥＤＴＡで除去し、５％ＣＯ_２、３７℃条件下で９０分間、５％のＦＣＳ／ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内で７２ｕ／ｍＬのタイプＩＶコラゲナーゼ（シグマケミカル社）と１５０μｇ デオキシリボヌクレアーゼＩ（ロシュ社）で消化した。消化した組織は、セルストレーナー（１００μｍと４０μｍナイロン；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に通し、ＤＭＥＭで洗浄した。

【0072】

（２）ＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞とＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞測定
腸炎誘発４週間後のＭＬＮ細胞または大腸の固有層細胞を、ＦｃＲをブロックした後に、抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）抗体と抗ＣＤ１０３（Ｍ２９０）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で染色した。Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞の割合を測定するために、ＭＬＮ細胞と大腸の固有層細胞を９６穴プレート内で２００μｌ ＲＰＭＩ１６４０で培養し、培養細胞は抗マウス／ラット Ｆｏｘｐ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使って染色し、フローサイトメトリーで分析した。データは実施例２と同様に分析した。

【0073】

（３）結果
結果を図７に示す。Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスのＭＬＮと大腸のＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞とＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の数はＰＢＳ投与マウスとＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ｓｃｒａｍｂｌｅ}投与マウスと比して有意に多かった（Ｐ＜０．０１）（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ）。

【0074】

実施例８：Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３} のＣＡＩ ５８−７３特異的制御性Ｔ細胞誘導能
（１）抗原提示細胞の調整
腸炎モデルマウスに投与したＲｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}によるペプチド特異的制御性Ｔ細胞の誘導について解析した。２４時間ＣＡＩ ５８−７３でパルスし３０Ｇｙで照射を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いた。

【0075】

（２）マウスＭＬＮの調製
Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウス、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ｓｃｒａｍｂｌｅ}投与マウス、またはＰＢＳ投与マウスの腸炎誘発２８日目のＭＬＮ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を単離した。

【0076】

（３）抗原特異的免疫応答の解析
１×１０^５細胞のＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞と１×１０^５個のＡＰＣとで３７℃／５％ＣＯ_２の条件下にてＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体下または非存在下で、９６時間共培養した。最後の１８時間前に［３Ｈ］−チミジン（１．０ｍＣｉ／ｍＬ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を加えて、セルハーベスター（Ｌａｂｏ Ｍａｓｈ； Ｆｕｔａｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ社）を使ってハーベストした。シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ ６５００；ベックマン社）を使って増殖能を計測した。結果はカウント・パー・ミニッツ（ｃｐｍ）として表し、ｃｐｍのレベルはＣＤ３抗体とＣＤ２８抗体で刺激しないＣＤ４^＋Ｔ細胞のチミジンの取り込みを基準としてスティミュレーションインデックス（ＳＩ）で示した。

【0077】

（４）結果
Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ５８−７３}投与マウスのＭＬＮのＣＤ４^＋Ｔ細胞からＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を除去すると、ＣＡＩ ５８−７３に対しより強いＴ細胞増殖能を示した（図８）。また、Ｒｅｇ−ＤＣｓ_{ＣＡＩ ｓｃｒａｍｂｌｅ}投与マウス、ＰＢＳ投与マウスではＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞除去によるＣＡＩ ５８−７３に対するＴ細胞増殖能の増加はみられなかった（図８）。

【0078】

実施例９：ＣＡＩ ５８−７３ペプチド経口投与による大腸炎の治療
（１）腸炎モデルに対する抗原の経口投与による治療法
過去の報告（Ｆａｒｉａ，ＡＭら（２００３）．Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ：２０：１３５−４５）に従い、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスに飲料水としてＣＡＩ ５８−７３溶液を５日間（−７日目から−２日目まで）連日投与した。個別にケージに入れたマウスは、４．５±０．５ｍＬ／日のＣＡＩ ５８−７３またはＣＡＩ スクランブルペプチドを混ぜたＰＢＳを摂取した。１群のマウスの平均消費量は５．０±０．５ｍＬ／日であり、１日当りのＣＡＩ ５８−７３ペプチドまたはＣＡＩ スクランブルペプチド投与量の合計は、平均消費量（５ｍＬ／日）を基礎として計算した。ペプチド換算の投与量は、ＣＡＩ ５８−７３ペプチド及びＣＡＩ スクランブルペプチド共に０．０２ｍｇ／日であった。ボトル内のＰＢＳはコンタミネーションを避けるため１日に２回交換し、計５日間連続投与した。ＣＡＩ ５８−７３ペプチド、ＣＡＩ スクランブルペプチドまたはＰＢＳ経口投与７日後（第０日目）に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞（３×１０^５細胞／マウス）を腹腔内投与した。また、同様な実験を実施例２で同定したペプチドとスクランブルペプチドを用いて比較検討した。

【0079】

（２）評価
レジメを図９Ａに示す。マウスの体重測定、マウスから採取した大腸の長さの測定、大腸炎の組織学的評価を、実施例３と同様に行った。

【0080】

（３）結果
ＣＡＩ ５８−７３ペプチドの経口投与はＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞移入腸炎モデルマウスの病態を有意に改善した。ＣＡＩ ５８−７３ペプチドを投与したマウスの体重は、ＰＢＳを投与したマウスと比較して有意に増加した（Ｐ＜０．０５）（図９Ｂ）。また、ＰＢＳを投与したマウスと比較して、ＣＡＩ ５８−７３ペプチドを投与したマウスの大腸長は有意に長かった（Ｐ＜０．０５）（図９Ｃ、９Ｄ）。ＣＡＩ ５８−７３ペプチドを投与したマウスは、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して組織学的病勢が有意に低かった（図９Ｅ、９Ｆ）。また、３つのペプチド（ＣＡＩ ４６−７２、ＣＡＩ ５８−７３、ＣＡＩ １６０−１８１）を投与したマウスの体重は、スクランブルペプチドを投与したマウスと比較して有意に増加した（Ｐ＜０．００１）（図９Ｇ）

【0081】

以上の結果から、ＣＡＩ ５８−７３ペプチドでパルスしたＲｅｇ−ＤＣが腸炎モデルマウス病勢の進行を抑制すること、ＣＡＩ ５８−７３ペプチドでパルスしたＲｅｇ−ＤＣがＭＬＮや大腸において、Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞を誘導し、炎症性サイトカインを減少させることが示された。また、ＣＡＩ ５８−７３でパルスしたＲｅｇ−ＤＣは生体内でＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞とＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を誘導することが示された。これらの結果から、ＣＡＩ ５８−７３が炎症性腸疾患の主要な標的であることが示された。更に、ＣＡＩ ５８−７３ペプチドの経口投与は、炎症性腸疾患モデルマウスにおいて腸炎抑制効果を示した。以上よりＣＡＩ ５８−７３を標的とした免疫療法が炎症性腸疾患に対する新しい治療法となることが強く示唆された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]