特許 6740372 クロシン系化合物及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6740372

(24)【登録日】2020年7月28日

(45)【発行日】2020年8月12日

(54)【発明の名称】クロシン系化合物及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07H 13/04 20060101AFI20200730BHJP

   C07H 13/06 20060101ALI20200730BHJP

   A61K 31/7024 20060101ALI20200730BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20200730BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20200730BHJP

   A61K 36/18 20060101ALI20200730BHJP

【ＦＩ】

   C07H13/04

   C07H13/06

   A61K31/7024

   A61P25/28

   A61P25/00

   A61K36/18

【請求項の数】10

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2018-556352(P2018-556352)

(86)(22)【出願日】2017年3月16日

(65)【公表番号】特表2019-514916(P2019-514916A)

(43)【公表日】2019年6月6日

(86)【国際出願番号】CN2017076911

(87)【国際公開番号】WO2017185900

(87)【国際公開日】20171102

【審査請求日】2018年10月25日

(31)【優先権主張番号】201610284974.6

(32)【優先日】2016年4月29日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】512000260

【氏名又は名称】ジナン・ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】Ｊｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100112737

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 考晴

(74)【代理人】

【識別番号】100136168

【弁理士】

【氏名又は名称】川上 美紀

(74)【代理人】

【識別番号】100196117

【弁理士】

【氏名又は名称】河合 利恵

(72)【発明者】

【氏名】シンシェン ヤオ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ユ

(72)【発明者】

【氏名】ダン チャン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ニ

(72)【発明者】

【氏名】シウチ バオ

(72)【発明者】

【氏名】リン リ

(72)【発明者】

【氏名】ツァイシア チャン

(72)【発明者】

【氏名】ハオ ガオ

(72)【発明者】

【氏名】ユアンペン チェン

【審査官】 前田 憲彦

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１１−１８０９０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−０５９８９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０１４１０８２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０９４７４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／１２９４４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−１９５７７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１７２４３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０６１５７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Helvetica Chimica Acta，１９７９年，62(6)，p.1944-1951

【文献】 Helvetica Chimica Acta，１９７５年，58(7)，p.2233-2236

【文献】 REGISTRY(STN)[online]，2005.06.29[検索日 2019.08.14]CAS登録番号 853234-63-6

【文献】 REGISTRY(STN)[online]，1984.11.16[検索日 2019.08.14] CAS登録番号 55750-86-2

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ １３／００

Ａ６１Ｋ ３１／００

Ａ６１Ｋ ３６／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の構造式を有するクロシン系化合物またはその薬学的に許容される塩。

【化1】

【化2】

【請求項2】

請求項１に記載の化合物の、神経変性疾患の予防および治療のための医薬品の製造への使用。

【請求項3】

前記神経変性疾患は、血管性認知症、血管性認知障害、アルツハイマー病、記憶喪失、脳組織変性疾患症候群、またはコリン作動性神経変性疾患を含む、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

請求項１に記載の化合物と、他のクロシン系化合物を含む組成物であって、前記他のクロシン系化合物が以下の化合物である組成物。

【化3】

【化4】

【請求項5】

請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬品組成物。

【請求項6】

漢方薬クチナシを原材料とし、エタノール、メタノールまたは水を用いて、異なる抽出回数と時間で熱抽出または超音波抽出する方法により抽出し、抽出液を減圧濃縮してクチナシの全抽出物を得ることを含む、請求項１に記載の化合物の製造方法。

【請求項7】

クチナシの全抽出物を適量の水で溶解し、遠心分離し、上清をマクロポーラス吸着樹脂オープンカラムクロマトグラフィーにより、水および／または３０％〜９５％エタノールで適量のベッド容量を溶出して、溶出液を収集し、クチナシクロシンの活性成分を減圧濃縮し、さらに種々のカラムクロマトグラフィーで分離する、請求項６に記載の製造方法。

【請求項8】

４倍量の６０％エタノールで、１回あたり２時間で３回加熱還流する、請求項６に記載の製造方法。

【請求項9】

水で溶出した後、３０％、５０％、７０％、９５％のエタノールで順に溶出し、各勾配で４つのベッド容量で溶出し、７０％エタノール溶液を減圧濃縮してクチナシクロシンの活性成分を得る、請求項７に記載の製造方法。

【請求項10】

前記カラムクロマトグラフィーは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＯＤＳオープンカラムクロマトグラフィー、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０オープンカラムクロマトグラフィー、およびＰｒｅ−ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーを含む、請求項７に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はクロシン系化合物、及びそのアルツハイマー病の予防・治療における関連薬理学的応用に関する。

【背景技術】

【0002】

クロシン（ｃｒｏｃｉｎｓ）は構造が特別な水溶性のカロテノイドであり、クロセチン（ｃｒｏｃｅｔｉｎ）及びその異なるグリコシル基と結合してなる糖エステルを含み、サフラン（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）及びクチナシ（Ｇａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ Ｅｌｌｉｓ）における共有色素成分である。伝統的な応用において、サフランはヨーロッパやアジアで婦人科良薬として広く使用され、クチナシ黄色色素は、天然着色剤として使用される。近年、サフラン粗抽出液（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ． Ｅｘｔｒａｃｔｓ：ＣＳＥ）、クチナシ黄色色素及びモノマー成分であるクロシンビスゲンチオビオシド（ｃｒｏｃｉｎ−１）、クロセチン（ｃｒｏｃｅｔｉｎ）が中枢神経系保護（非特許文献１〜４を参照）、心血管系・脳血管系保護（非特許文献５，６を参照）、及び悪性腫瘍の拮抗（非特許文献７〜９を参照）などの面で高効率、低毒性の薬理学的活性を示すことが、多くの研究により表明された。

【0003】

アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）は記憶障害、認知障害、及び人格変化を特徴とする老化に伴う進行性の神経変性疾患である。ＡＤは、老人性認知症の最も一般的なタイプであり、ＡＤ患者の初期症状は記憶喪失であり、方向力、理解力、判断力及び記憶力の低下に進展し、患者の後期は全面的な衰退状態になり、知能は完全に失われ、運動や言語の障害がますます明らかになり、最終的に二次感染と不全で死亡することが多い。

【0004】

世界的な老年化の激化につれて、ＡＤの発生率が年々急速に増加され、各国、特に発展途上国の社会及び人々に重い経済的、家族的な負担をもたらす。１９０６年、ドイツの医者Ａｌｚｈｅｉｍｅｒが始めてこの疾患を記述してから今までの１００年以上、国際的に、この疾患を治療する方法と医薬品がないと認められている。ここから分かるように、理想的な治療薬が存在しない場合、抗アルツハイマー薬のスクリーニング及び研究開発は、非常に広い市場の見通しと深い社会的意義を有する。

【0005】

ＡＤの顕著な病理学的特徴は、大脳皮質及び海馬の細胞外のアミロイドβ蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ β−ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａβ）及び細胞内の凝集するｔａｕタンパク質の絡み合いである。現在、多数の学者は、Ａβの大量沈着がＡＤ発症の直接の原因で、この過程において主に炎症及び酸化ストレスのような病理的変化が存在すると考えている。多数の研究により、酸化ストレスがＡＤ発生・進展の重要なメカニズムであることが確認されている。従って、抗酸化損傷を標的とすることがＡＤ予防・治療の有効な手段を見出す重要なルートとなっている。

【0006】

グルタミン酸は、大脳皮質及び海馬部の内因性神経伝達物質である。正常な生理学的条件下で、グルタミン酸は中枢神経系のシナプス伝達を調節し、学習、記憶、運動、認知及び発育を含む正常な脳のすべての機能に関与する。しかしながら、病理学的条件下では、様々な理由によりグルタミン酸含有量が増加し、受容体が過度に活性化されるため、ニューロン損傷を引き起こし、神経毒性を生じる。異常グルタミン酸がアルツハイマー病、脳虚血及び統合失調症を含む多くの神経学的疾患の病因学及び病態生理学において、重要な役割を果たすことが多くの研究によって発見された。従って、グルタミン酸の神経毒性に拮抗することにより、神経保護の役割を果たすことができる（非特許文献１０を参照）。

【0007】

ＣＳＥは、優れた体外酸化防止作用及びＡβ原繊維形成の阻害作用を有し、主色素ｃｒｏｃｉｎ−１が低い用量でＡβ原繊維の形成を阻害することができ、サフラン及びその色素がヒト脳におけるＡβ凝集・沈殿を阻害する可能性があり、ＡＤの予防・治療に係る活性を有することを示す（非特許文献２を参照）。Ｃｒｏｃｉｎ−１はグルタチオン（ＧＳＨ）含有量を増加させ、脂質過酸化物形成を阻害し、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を保持することによってＰＣ−１２細胞を保護することができる（非特許文献１１を参照）。

【0008】

動物実験では、ＣＳＥ（３０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇ）で実験における正常ラットの学習及び記憶能力を改善することができ、ラットのプリンによる記憶障害を効果的に阻害することができる（非特許文献１２を参照）。サフランをカプセル剤にして、軽度・中等度のＡＤの臨床第ＩＩ期治療に使用したところ、２２週間におけるランダム二重盲検試験では、サフランカプセルが陽性医薬品であるドネペジルと同じ治療効果を有し、医薬品の不良反応が陽性薬剤と明らかな差異がなく、嘔吐の副作用は弱まった（非特許文献３を参照）。中等度・重度のＡＤの臨床第ＩＩ期治療に使用したところ、実験群の患者が３０ｍｇ／日で、対照群が陽性対照薬メマンチンを３０ｍｇ／日で服用した結果、実験群が対照群と同じ治療効果を生み出し、且つ明らかな不良反応がないことを示した（非特許文献４を参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋａｒａｋａｎｉ Ａ．−Ｍ．，ＲｉａｚｉＧ．，Ｍａｈｍｏｏｄ Ｇ．−Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｒｃｉｎ ｏｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ １Ｎ／４Ｒ ｈｕｍａｎ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｉｒａｎｉａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１５，１８（５），４８５−９２．

【非特許文献2】Ｐａｐａｎｄｒｅｏｕ Ｍ．−Ａ．，Ｋａｎａｋｉｓ Ｃ．−Ｄ．，Ｐｏｌｉｓｓｉｏｕ Ｍ．−Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ａｍｙｌｏｉｄ−β Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｓｔｉｇｍａｓ Ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｒｏｃｉｎ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６，５４（２３），８７６２−８７６８．

【非特許文献3】Ａｋｈｏｎｄｚａｄｅｈ Ｓ．，Ｓａｂｅｔ Ｍ．−Ｓ．，Ｈａｒｉｒｃｈｉａｎ Ｍ．−Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ２２−ｗｅｅｋ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｌｄ−ｔｏ−ｍｏｄｅｒａｔｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１０，２０７（４），６３７−６４３．

【非特許文献4】Ｆａｒｏｋｈｎｉａ Ｍ．，Ｓｈａｆｉｅｅ Ｓ．−Ｍ．，Ｉｒａｎｐｏｕｒ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．Ｗｉｔｈ ｍｅｍａｎｔｉｎｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｔｏ ｓｅｖｅｒｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ［Ｊ］．Ｈｕｍａｎ Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１４，２９（４），３５１−３５９．

【非特許文献5】Ｚｈｅｎｇ Ｙ．−Ｑ．，Ｌｉｕ Ｊ．−Ｘ．，Ｗａｎｇ Ｊ．−Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｒｏｃｉｎ ｏｎ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ＿ｎｉｔｒａｔｉｖｅ ｉｎｊｕｒｙ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓ ａｆｔｅｒ ｇｌｏｂａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７，１１３８，８６−９４．

【非特許文献6】Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ Ｓ．，Ｓａｓａｋｉ Ｙ．，Ｇｉｄｄｉｎｇｓ Ｊ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｃｅｔｉｎ，ａ Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｆｒｏｍ Ｇａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ Ｅｌｌｉｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｓｔｒｏｋｅ−ｐｒｏｎｅ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１４，２８（９），１３１５−１３１９．

【非特許文献7】Ｓｈｅｎｇｙｕ ＤＯＮＧ， Ｆｕｍｅｉ ＬＩＵ， Ｘｉａｎｇｙｏｎｇ ＬＩ； ＣＮＥ２細胞の増殖と移動に対するクロシンの阻害作用［Ｊ］；湖北民族学院刊行物・医学版；２０１３、３０（２）、６〜１２．（董盛宇，劉付梅，李祥勇．藏紅花素対ＣＮＥ２細胞的増殖及移動抑制作用［Ｊ］．湖北民族学院学報・医学版．２０１３，３０（２），６−１２．）

【非特許文献8】Ｘｉｎｘｉｎｇ ＷＡＮＧ，Ｚｈｅｎｇｈｏｎｇ ＹＵ， Ｓｈｕｌｕ ＳＨＩなど；クロシンのヒト肺腺癌ＳＰＣ−Ａ１細胞への増殖抑制効果及びメカニズムの研究［Ｊ］；臨床腫瘍学会雑誌．２０１３，１８（４），２９５−２９９．（王新星，于正洪，侍述碌等．藏紅花素対人肺腺癌ＳＰＣ−Ａ１細胞的増殖抑制作用及机制研究［Ｊ］．臨床腫瘍学誌．２０１３，１８（４），２９５−２９９．）

【非特許文献9】Ｆｕｘｉｏｎｇ ＣＨＥＮ，Ｊｉａ ＴＡＯ，Ｓｕｉ ＨＵＡＮＧなど；ＥＢウイルス感染の小児におけるＩＭ及びＥＢＶ−ＡＨＳの臨床研究及びウイルス感染特性［Ａ］；中国医師会、中国医師会小児科会；第１７回全国医学会全国小児科学会編集（第１巻）［Ｃ］；中国医師会、中国医師会小児科会；２０１２：１．（陳福雄，陶佳，黄穗等．児童ＥＢ病毒感染相関ＩＭ和ＥＢＶ−ＡＨＳ的臨床研究和病毒感染特征［Ａ］．中国医学会、中国医学会小児科学分会．中国医学会第十七次全国小児科学会編纂（上册）［Ｃ］．中国医学会、中国医科小児科分会：，２０１２：１．）

【非特許文献10】Ｌａｕ Ａ．，Ｔｙｍｉａｎｓｋｉ Ｍ．．Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２０１０，４６０（２），５２５−５４２．

【非特許文献11】Ｏｃｈｉａｉ Ｔ．，Ｏｈｎｏ Ｓ．，Ｓｏｅｄａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｃｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｒａｔ ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｙｃｔｏｍａ（ＰＣ−１２）ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｔｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ａ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００４，３６２（１），６１−６４．

【非特許文献12】Ｐｉｔｓｉｋａｓ Ｎ．，Ｓａｋｅｌｌａｒｉｄｉｓ Ｎ． Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ ｍｅｍｏｒｙ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｔａｓｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ［Ｊ］．Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００６，１７３（１），１１２−１１５．

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は以下の発明に関する。
［１］一般式（Ｉ）で示されるクロシン系化合物またはその薬学的に許容される塩。

【化1】

ここで、１３〜１４位の二重結合の立体配置はトランスＥまたはシスＺであり、
Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ独立に、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、グリコシル基およびキナ酸基を表し、
キナ酸の基本構造は、

【化2】

であり、
これらの中で、１，３，４，５，７位のヒドロキシル基は、水素が除去された後に異なるキナ酸基を形成することができ、例えば、よくある３位、５位が以下のように表される。

【化3】

前記グリコシル基は、グルコース基、ゲンチオビオース基、キシロシル、ガラクトシル、マンノシル、アラビノース、ラムノシル、リボシル、リソソシルおよびキシラニルであり、
前記グリコシル基の数が０〜２であり、
前記グリコシル基のヒドロキシ基は、サクシノイル基、カフェオイル基、クマロイル基、シンナモイル基、ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｎＣＯ、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）ｎＣＯのようなアシル化基によってアシル化されてよく、
前記キナ酸基の３，４，５位のヒドロキシル基は、スクシニル基、カフェオイル基、クマロイル基、シンナモイル基、ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｎＣＯ、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）ｎＣＯのようなアシル化基によってアシル化されてよく、
キナ酸基の１位のカルボキシル基は、メチルエステル化またはエチルエステル化されてよく、
その中、前記一般式（Ｉ）の化合物は以下の化合物を含まない。

【化4】

【化5】

【0011】

［２］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であり、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がキナ酸基である。

【0012】

［３］前記項［２］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

【化6】

【0013】

［４］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がシスＺ立体配置であり、Ｒ_１がＨ、グルコース基又はキナ酸基であり、Ｒ_２がＨ、グルコース基またはキナ酸基である。

【0014】

［５］前記項［４］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

【化7】

【0015】

［６］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であり、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がグルコース基又はＨである。

【0016】

［７］前記項［６］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

【化8】

【0017】

［８］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２はＣＨ_２ＣＨ_３である。

【0018】

［９］前記項［８］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

【化9】

【0019】

［１０］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、キシロシルであり、Ｒ_２がＨである。

【0020】

［１１］前記項［１０］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

【化10】

【0021】

［１２］以下の構造式で示されるクロシン系化合物である。

【化11】

【0022】

［１３］前記項［１］〜前記項［１２］のいずれか１項に記載の化合物の、神経変性疾患を予防および治療するための医薬品の製造への使用である。

【0023】

［１４］前記神経変性疾患は、血管性認知症、血管性認知障害、アルツハイマー病、記憶喪失、脳組織変性疾患症候群、またはコリン作動性神経変性疾患を含む、［１３］項に記載の使用である。

【0024】

［１５］前記項［１］〜前記項［１２］のいずれか１項に記載の化合物と、他のクロシン系化合物を含む組成物であって、前記他のクロシン系化合物が以下の化合物である組成物である。

【化12】

【化13】

【0025】

［１６］前記項［１］〜前記項［１２］のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬品組成物である。

【0026】

［１７］漢方薬クチナシを原材料とし、エタノール、メタノールまたは水を用いて、異なる抽出回数と時間で熱抽出または超音波抽出する方法により抽出し、抽出液を減圧濃縮してクチナシの全抽出物を得ることを含む、前記項［１］〜前記項［１２］のいずれか１項に記載の化合物の製造方法である。

【0027】

［１８］クチナシの全抽出物を適量の水で溶解し、遠心分離し、上清をマクロポーラス吸着樹脂オープンカラムクロマトグラフィーにより、水および／または３０％〜９５％エタノールで適量のベッド容量を溶出して、溶出液を収集し、クチナシクロシンの活性成分を減圧濃縮し、さらに種々のカラムクロマトグラフィーで分離する、前記項［１７］に記載の製造方法である。

【0028】

［１９］４倍量の６０％エタノールで、１回あたり２時間で３回加熱還流する、前記項［１７］に記載の製造方法である。

【0029】

［２０］水で溶出した後、３０％、５０％、７０％、９５％のエタノールで順に溶出し、各勾配で４つのベッド容量で溶出し、７０％エタノール溶液を減圧濃縮してクチナシクロシンの活性成分を得る、前記項［１８］に記載の製造方法である。

【0030】

［２１］前記カラムクロマトグラフィーは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＯＤＳオープンカラムクロマトグラフィー、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０オープンカラムクロマトグラフィー、およびＰｒｅ−ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーを含む、前記項［１８］に記載の製造方法である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本願の発明者らは、複数の化学手段を通じて漢方薬のクチナシから、一般式（Ｉ）による新型のクロシン系化合物を抽出し、様々な分光法によって同定し、これらのクロシン系化合物が中枢神経系に優れた保護効果を有することを細胞実験により証明した。

【化14】

【0032】

各置換基の定義は、上述のとおりである。
第一組の好ましい化合物において、１３〜１４位がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がキナ酸基である。
ここで、Ｒ_１がＧｌｃ−（１→６）−Ｇｌｃ（ゲンチオビオース基）であり、Ｒ_２が３−カフェオイルキナ酸−４−オキシである場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂ（ＧＪ−１と略称する）が得られる。

【化15】

【0033】

ここで、Ｒ_１がゲンチオビオース基であり、Ｒ_２が３−カフェオイルキナ酸−５−オキシである場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｃ（ＧＪ−２と略称する）が得られる。

【化16】

【0034】

第二組の好ましい化合物において、１３〜１４位がシスＺ立体配置であり、Ｒ_１がＨ、グルコース基またはキナ酸基であり、Ｒ_２がグルコース基またはキナ酸基である。
ここで、Ｒ_１がゲンチオビオース基であり、Ｒ_２が３−カフェオイルキナ酸−４−オキシである場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｄ（ＧＪ−３と略称する）が得られる。

【化17】

【0035】

ここで、Ｒ_１が３−カフェオイルキナ酸−４−オキシであり、Ｒ_２がゲンチオビオース基である場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｅ（ＧＪ−４と略称する）が得られる。

【化18】

【0036】

ここで、Ｒ_１がＨ、Ｒ_２はゲンチオビオース基である場合、化学名が１３Ｚ−クロセチン−８′−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドである新しい化合物（ＧＪ−５と略称する）が得られる。

【化19】

【0037】

第三組の好ましい化合物において、１３〜１４位がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がグルコース基又はＨである。
ここで、Ｒ_１が６−Ｏ−トランス−シナポイルゲンチオビオース基であり、Ｒ_２がゲンチオビオース基である場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｇ（ＧＪ−６と略称する）が得られる。

【化20】

【0038】

ここで、Ｒ_１が６−Ｏ−トランス−シナポイルゲンチオビオース基であり、Ｒ_２がＨである場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｆ（ＧＪ−７と略称する）が得られる。

【化21】

【0039】

第四組の好ましい化合物において、１３〜１４位がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２はＣＨ_２ＣＨ_３である。
ここで、Ｒ_１がゲンチオビオース基であり、Ｒ_２がＣＨ_２ＣＨ_３である場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｈ（ＧＪ−８と略称する）が得られる。

【化22】

【0040】

第五組の好ましい化合物がｎｅｏｃｒｏｃｉｎＩ（ＧＪ−９と略称する）である。

【化23】

【0041】

第六組の好ましい化合物において、１３〜１４位がトランスＥ立体配置であり、Ｒ_１がグルコース基、キシロシルであり、Ｒ_２がＨである。
ここで、Ｒ_１がＨ、Ｒ_２がキシロシル−（１→６）−グルコース基である場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｊ（ＧＪ−１０と略称する）が得られる。

【化24】

【0042】

また、一般式（Ｉ）の範囲での以下の表１に示す化合物は既知なものである。

【表1】

【実施例】

【0043】

実施例１：クチナシからのクロシン成分の抽出分離
クチナシの乾燥・成熟した果実４０．０ｋｇを採取し、適切な粉砕の後、４倍量の６０％エタノールで加熱還流して３回抽出した。毎回２時間かけて行った。抽出液を合わせて減圧下で溶媒を除去して、クチナシ全部抽出物として６．２ｋｇ（収率１５．５％）を得た。抽出物を適量の水に溶解して遠心分離し、上清をマクロポーラス樹脂オープンカラムのクロマトグラフィー（２０．０×９０ｃｍ）を行った。４倍のベッド容量の水、３０％、５０％、７０％、９５％のエタノールで勾配溶出し、各溶出液を回収し、それぞれ減圧下で溶媒を回収して、約４．５ｋｇの水の溶出と３０％エタノールの溶出を組合わせたものを得、７１０．０ｇの５０％エタノールで溶出されたものを得、１５０．０ｇの７０％エタノールで溶出されたものを得、１１２．０ｇの９５％エタノールで溶出されたものを得た。７０％エタノールで溶出されたものがクチナシクロシン活性成分であった。
７０％エタノール溶出成分１５０ｇがシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ７×６０ｃｍ）、クロロホルム−メタノール−水９９：１〜６：４：０．８による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１１（４９．１ｍｇ）、ＧＪ−１２（１３６．５ｍｇ）、ＧＪ−１３（７．０ｇ）をそれぞれ析出させた。
シリカゲルサブフラクションＦｒ．９をＯＤＳカラムクロマトグラフィー、メタノール−水３０％−７０％による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１９（５４５．１ｍｇ）を析出させ、ＨＰＬＣ、６０％メタノール−水による溶出により化合物ＧＪ−２０（２６５．７ｍｇ）を得、ＨＰＬＣ、６８％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−１（１２０．０ｍｇ）、およびＧＪ−３とＧＪ−４との混合物１０４．８ｍｇ（１：２で混合）を得た。さらに、水（０．３％ＴＥＡＡ）：アセトニトリル＝５５：４５により化合物ＧＪ−３とＧＪ−４を分離した。
シリカゲルサブフラクションＦｒ．７をＯＤＳカラムクロマトグラフィー、メタノール−水４０％−８０％による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１１（１６．０ｍｇ）を析出させ、ＨＰＬＣ、５５％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−２（６．３ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、４２％アセトニトリル−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、ＧＪ−１３（８．０ｍｇ）、化合物ＧＪ−５（１６．０ｍｇ）を得た。
シリカゲルサブフラクションＦｒ．８をＯＤＳカラムクロマトグラフィー、メタノール−水５５％−６５％による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１６（１４３．７ｍｇ）を析出させ、ＨＰＬＣ、５５％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−６（５９．１ｍｇ）、ＧＪ−２（２１．９ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、６８％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−１（４００．９ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、３２％アセトニトリル−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、ＧＪ−１７（１．８ｍｇ）、ＧＪ−１８（３．５ｍｇ）を得た。
シリカゲルサブフラクションＦｒ．６をＯＤＳカラムクロマトグラフィー、メタノール−水５０％−９０％による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１５（３１５．７ｍｇ）を析出させ、ＨＰＬＣ、６０％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−１０（１０．０ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、６５％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、ＧＪ−９（２．０ｍｇ）、ＧＪ−７（６６．２ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、７０％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、ＧＪ−８（１０．０ｍｇ）を得た。

【0044】

得られた化合物の構造は表２−１および表２−２に示すとおりである。

【表2-1】

【表2-2】

【0045】

得られた化合物の物性データは以下の通りである。
化合物ＧＪ−１：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ １０１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ９８９．３６４２［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_４８Ｈ_６１Ｏ_２２，９８９．３６５４），化合物ＧＪ−１の分子式がＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３３（５．３２），４５８（５．２８），３３１（４．６８），２５３（４．５２）ｎｍ；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ９６８，１０６１，１２２４，１２６８，１５７６，１６１０，１６９４，２９２０，３４０１ｃｍ^−１；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【0046】

化合物ＧＪ−２：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ １０１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ９８９．３６４６［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_４８Ｈ_６１Ｏ_２２，９８９．３６５４），化合物ＧＪ−２の分子式がＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３１（４．６３），４５７（４．５６），３３１（４．１２），２４９（３．８５）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０６４，１２３０，１２７９，１６０２，１６９８，２９２１，３４１７ｃｍ^−１；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【0047】

化合物ＧＪ−３：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ １０１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ １０１１．３４７１［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２Ｎａ，１０１１．３４７４），化合物ＧＪ−３の分子式がＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４２９（５．０４），４５３（４．９９），３２４（４．６８），２５１（４．０４）ｎｍ；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ９６９，１０６２，１２２９，１２７７，１６０７，１６９３，２９２０，３３６８ｃｍ^−１；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【0048】

化合物ＧＪ−４：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ １０１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ １０１１．３４７１［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２Ｎａ，１０１１．３４７４），化合物ＧＪ−４の分子式がＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４２９（５．０４），４５３（４．９９），３２４（４．６８），２５１（４．０４）ｎｍ；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ９６９，１０６２，１２２９，１２７７，１６０７，１６９３，２９２０，３３６８ｃｍ^−１；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【0049】

化合物ＧＪ−５：赤色アモルファス粉末，ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ ６７５［Ｍ＋Ｎａ］^＋，ｍ／ｚ １３２７［２Ｍ＋Ｎａ］^＋，化合物ＧＪ−１４の分子量が６５２であると推定する。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：６７５．２６１７［Ｍ＋Ｎａ^＋］（算出値：６７５．２６２９），化合物ＧＪ−１４の分子式がＣ_３２Ｈ_４４Ｏ_１４であることを確認した。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【0050】

化合物ＧＪ−６：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ １２０５［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ １１８３．４４７９［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_５５Ｈ_７５Ｏ_２８，１１８３．４４４５），化合物ＧＪ−６の分子式がＣ_５５Ｈ_７４Ｏ_２８であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３４（５．２２），４５９（５．１７），３３０（４．７８），２４２（４．６５）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０５９，１１１９，１２２５，１２７３，１６１０，１７０１，２９２０，３３８５ｃｍ^−１；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【0051】

化合物ＧＪ−７：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ ８８１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ８８１．３１８８［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_４３Ｈ_５４Ｏ_１８Ｎａ，８８１．３２０８），化合物ＧＪ−７の分子式がＣ_４３Ｈ_５４Ｏ_１８であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３０（５．３３），４５４（５．２８），３２６（４．８０），２４２（４．７８）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ ９７２，１０６９，１１７９，１２２７，１２８４，１６１０，１６９７，２９２２，３３９１ｃｍ^−１；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【0052】

化合物ＧＪ−８：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ ７０３［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７０３．２９０４［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_３４Ｈ_４８Ｏ_１４Ｎａ，７０３．２９４２），化合物ＧＪ−８の分子式がＣ_３４Ｈ_４８Ｏ_１４であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３０（４．６４），４５６（４．５９），３２２（３．８４），２５７（３．９５）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０７４，１２２９，１６９７，２９２５，３４００ｃｍ^−１；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【0053】

化合物ＧＪ−９：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ ６５９［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ６５９．２６５７［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_３２Ｈ_４４Ｏ_１３Ｎａ，６５９．２６８０），化合物ＧＪ−９の分子式がＣ_３２Ｈ_４４Ｏ_１３であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３８（４．６３），４６２（４．６０），３２８（３．９０），２６１（３．９４）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０７１，１５１５，１６９４，２９２１，３２７７ｃｍ^−１；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【0054】

化合物ＧＪ−１０：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ ６４５［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ６４５．２５１９［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_３１Ｈ_４２Ｏ_１３Ｎａ，６４５．２５２３），化合物ＧＪ−１０の分子式がＣ_３１Ｈ_４２Ｏ_１３であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４２８（４．５６），４５３（４．５０），３２０（４．１１），２５７（４．１０）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０７２，１２３０，１７００，２９２４，３４１６ｃｍ^−１；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

【表3】

【0055】

実施例２：クチナシにおけるクロシン単体のＨ_２Ｏ_２及びＬ−グルタミン酸誘発ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞傷害モデルにおける神経保護効果

【0056】

２．１ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞培養法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞をＤＭＥＭ培地（５体積％ウシ胎児血清を含む）で培養し、５％ＣＯ_２を含むインキュベーター内で３７℃で培養し、３〜４日ごとに継代した。実験は、対数増殖期細胞を取って行った。

【0057】

２．２ 過酸化水素損傷モデルスクリーニング法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を９６ウェルプレートに５×１０^３の濃度で接種し、２４時間続いて培養し、Ｈ_２Ｏ_２を含む医薬品液体培地１００μＬを９６ウェルプレートに加えて、Ｈ_２Ｏ_２の最終濃度を４００μＭにし、医薬品の最終濃度を１０μＭ、１μＭおよび０．１μＭにして各濃度について平行の３つのウェルを設定し、培養を２４時間続けた。２４時間後、上清を吸引し、１００μＬのＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、インキュベーションを４時間続け、上清を吸引した。各ウェルに１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、１０分間振とうし、５７０ｎｍの波長を選択して、マイクロプレートリーダーで吸光度値^［１２］を測定する。（有効率％＝（ＯＤ_医薬品−ＯＤ_モデル）／（ＯＤ_{コントラスト}−ＯＤ_モデル）＊１００）、スクリーニング結果を表４に示す。

【表4】

【0058】

２．３ Ｌ−グルタミン酸損傷モデルスクリーニング法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を９６ウェルプレートに５×１０^３の濃度で接種し、２４時間続いて培養し、Ｌ−グルタミン酸を含む医薬品液体培地１００μＬを９６ウェルプレートに加えて、Ｌ−グルタミン酸の最終濃度を１６０ｍＭにし、医薬品の最終濃度を１０μＭ、１μＭおよび０．１μＭにして各濃度について平行の３つのウェルを設定し、培養を２４時間続けた。２４時間後、上清を吸引し、１００μＬのＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、インキュベーションを４時間続け、上清を吸引した。各ウェルに１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、１０分間振とうし、５７０ｎｍの波長を選択して、マイクロプレートリーダーで吸光度値［非特許文献１３を参照］を測定する。（有効率％＝（ＯＤ_医薬品−ＯＤ_モデル）／（ＯＤ_{コントラスト}−ＯＤ_モデル）＊１００）、スクリーニング結果を表５に示した。

【表5】

【0059】

実験結果によれば、化合物ＧＪ−１〜ＧＪ−１０のいずれがＨ_２Ｏ_２誘発ＳＹ５Ｙ細胞損傷モデルにおいて良好な保護を示し、化合物ＧＪ−６、ＧＪ−１０、ＧＪ−８がさらに優れた保護作用を示した。化合物ＧＪ−１〜ＧＪ−１０のいずれがＬ−グルタミン酸誘発ＳＹ５Ｙ細胞損傷モデルにおいても良好な保護を示し、化合物ＧＪ−１、ＧＪ−６、ＧＪ−７、ＧＪ−１０、ＧＪ−９、ＧＪ−８がさらに優れた保護作用を示した。上記の実験結果から、異なる損傷モデルにおける各化合物の有効性は異なり、これはＨ_２Ｏ_２誘発損傷のメカニズムが酸化ストレスであるが、Ｌ−グルタミン酸誘発損傷のメカニズムが興奮性アミノ酸によって興奮毒性損傷が引き起こされ、化合物が異なるメカニズムによって損傷保護を発揮することが知られる。