特許 6741580 単一バイアルのワクチン製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6741580

(24)【登録日】2020年7月29日

(45)【発行日】2020年8月19日

(54)【発明の名称】単一バイアルのワクチン製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20200806BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20200806BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20200806BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20200806BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20200806BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20200806BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20200806BHJP

   C12N 15/00 20060101ALN20200806BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/00 G

   A61K9/19

   A61K47/10

   A61K47/26

   A61K39/39

   A61K47/44

   A61K47/24

   !C12N15/00ZNA

【請求項の数】33

【全頁数】92

(21)【出願番号】特願2016-543698(P2016-543698)

(86)(22)【出願日】2014年12月29日

(65)【公表番号】特表2017-502962(P2017-502962A)

(43)【公表日】2017年1月26日

(86)【国際出願番号】US2014072615

(87)【国際公開番号】WO2015103167

(87)【国際公開日】20150709

【審査請求日】2017年12月21日

(31)【優先権主張番号】61/922,761

(32)【優先日】2013年12月31日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508296509

【氏名又は名称】インフェクシャス ディズィーズ リサーチ インスティチュート

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100062144

【弁理士】

【氏名又は名称】青山 葆

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100165892

【弁理士】

【氏名又は名称】坂田 啓司

(72)【発明者】

【氏名】クリストファー・ビー・フォックス

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・エス・ベドビック

(72)【発明者】

【氏名】ルシアン・バーンズ・ザ・フィフス

(72)【発明者】

【氏名】ライアン・エム・クレイマー

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン・ジー・リード

【審査官】 横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５０６０２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５１６８５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１４３３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１５８９７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J Contr Release., 2013 Nov, Vol.172, p.1-24

【文献】 Colloids Surf B: Biointerfaces, 2010, Vol.75, p.123-32

【文献】 J Contr Release., 2013.12.22, Vol.177, p.20-26

【文献】 低温生物工学会誌, 2001, Vol.47 No.1, p.46-51

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ９／００

Ａ６１Ｋ ４７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

代謝可能な油、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）およびケーキ形成性賦形剤を含む熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物であって、該組成物は、グリセロールを含まない水中油乳剤製剤の凍結乾燥により形成され、ケーキの形態であり、再構成すると水中油乳剤を形成し、ケーキ形成性賦形剤が、（１）マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せ；または、（２）トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である、組成物。

【請求項2】

ケーキ形成性賦形剤が、水中油乳剤製剤中で約１０％（ｗ／ｖ）または水中油乳剤製剤中で約５％（ｗ／ｖ）の濃度のトレハロースである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ケーキ形成性賦形剤が、マンニトールとトレハロースの組合せであり、水中油乳剤製剤中のマンニトールが約０.１％（ｗ／ｖ）であり、かつ、水中油乳剤製剤中のトレハロースが約５％（ｗ／ｖ）であるか、または、水中油乳剤製剤中のマンニトールが約２.５％（ｗ／ｖ）であり、かつ、水中油乳剤製剤中のトレハロースが約２.５％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

組成物が、約８℃ないし約６０℃の温度で、少なくとも１ヵ月間熱安定性である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

組成物が、約８℃ないし約６０℃の温度で、少なくとも３ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、または、少なくとも１２ヵ月間、熱安定性である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

組成物が、約２５℃で少なくとも１ヵ月間、約３７℃で少なくとも１ヵ月間、または、約５０℃で少なくとも１ヵ月間、熱安定性である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

組成物が、（ｉ）美しい（elegant）ケーキ、または、（ｉｉ）請求項４ないし６のいずれか一項に記載のいずれかの条件で保管したときに、目視検査により褐変を示さないケーキの形態である、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

組成物の熱安定性が、（ａ）凍結乾燥組成物の再構成に先立ち判定される、（ｂ）凍結乾燥組成物の再構成の後に判定される、または、（ｃ）再構成時に形成される水中油乳剤の成分のアッセイにより判定される、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

熱安定性が、凍結乾燥組成物の再構成に先立ち、ケーキの縮み、割れおよび／または褐変を観察することにより判定される、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

熱安定性が、凍結乾燥組成物の再構成の後に、再構成時に形成される水中油乳剤のクリーム化の検査により判定される、請求項８に記載の組成物。

【請求項11】

再構成時の水中油乳剤が、Ｚ平均粒径約２００ｎｍ未満の粒径を有する、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

さらにアジュバントを含む、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

アジュバントが、代謝可能な油である、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

代謝可能な油が、スクアレン、合成スクアレン、ブドウ種子油、オリーブ油または合成イソプレノイドである、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

アジュバントが、ＴＬＲ４アゴニストである、請求項１２に記載の組成物。

【請求項16】

ＴＬＲ４アゴニストが、ＭＰＬ、３ｄ−ＭＰＬまたは合成ＧＬＡである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

合成ＧＬＡアジュバントが、下記の構造を有する、請求項１６に記載の組成物：

【化1】

式中、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｃ_１１−Ｃ_２０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_９−Ｃ_２０アルキルである。

【請求項18】

Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６が、Ｃ_１１アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４が、Ｃ_９アルキルである、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

再構成時に形成される水中油乳剤中のアジュバントの濃度が、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中のアジュバントの濃度の約２５％以下の破壊を示す、請求項１２ないし１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

さらに抗原を含む、請求項１ないし１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

抗原が、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、または病原体である、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

再構成時に形成される水中油乳剤中の抗原の濃度が、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中の抗原の濃度の約２５％以下の破壊を示す、請求項２０または２１に記載の組成物。

【請求項23】

代謝可能な油が、スクアレン、合成スクアレン、ブドウ種子油、オリーブ油または合成イソプレノイドである、請求項１ないし２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

代謝可能な油が、スクアレンである、請求項１ないし２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

さらに界面活性剤を含む、請求項１ないし２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

界面活性剤がプルロニックＦ６８である、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

さらに抗酸化剤を含む、請求項１ないし２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項28】

抗酸化剤がビタミンＥである、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

請求項１ないし２８のいずれか一項に記載の組成物を含む単一バイアルであって、組成物がバイアルの中に含まれる、単一バイアル。

【請求項30】

ワクチン組成物の保管方法であって、請求項１ないし２８のいずれか一項に記載の組成物を、約２５℃ないし約６０℃で、少なくとも１ヵ月間保管することを含み、ワクチン製剤が熱安定性である、方法。

【請求項31】

熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物の生成方法であって、水中油乳剤を凍結乾燥して熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物を形成する段階を含み、凍結乾燥前の水中油乳剤が、グリセロールを含まず、代謝可能な油、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、および、ケーキ形成性賦形剤を含み、ケーキ形成性賦形剤が、（ａ）マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せ；または、（ｂ）トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖であり、ワクチン組成物が、ケーキの形態であり、再構成すると水中油乳剤を形成する、方法。

【請求項32】

対象の免疫応答を刺激するための、請求項１ないし２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

使用前に水中油乳剤に再構成される、請求項３２に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、概して、医薬およびワクチン製剤の分野に関する。

【0002】

関連特許出願への相互参照
本願は、２０１３年１２月３１日に出願された米国仮出願番号６１／９２２,７６１に優先権を主張し、その全体を引用により本明細書の一部とする。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
次世代の合理的に設計されたワクチンアジュバントは、結核、ＨＩＶおよびマラリアを含む挑戦的な疾患に対するワクチンの開発における重要なブレイクスルーである。しかしながら、これらの新しいアジュバントは、長期の安定性を確保するために、コールドチェーン管理も要する。これは、かかるワクチンの世界的実施に、重大な財務的かつ技術的障壁をもたらす。さらに、コールドチェーン管理は、電力供給が損なわれ得る自然災害の際には保証されない。ワクチンなどのタンパク質を含有する医薬の凍結乾燥は、有効期間の延長および熱ストレスへの耐性向上のために、一般的に用いられる方法であり（Kasper et al., 2013, Eur J Pharm Biopharm. 2013 Oct;85(2):162-9; Wang et al, Int J Pharm, 203:1-60）、複数の市販のワクチンが凍結乾燥品として流通している（PATH, and Working in Tandem Ltd, 2012, Summary of stability data for licensed vaccines, Seattle, WA）。マラリアや結核などの複雑な細胞免疫が介在する疾患のための開発中の新しいワクチンは、免疫応答を効果的に増強および形成するために、アジュバント成分を必要とし得る（Reed et al., 2009, Trends Immunol, 30:23-32）。しかしながら、ワクチン抗原にアジュバントを添加すると、成分間での複数の相互作用が起こり得る、より複雑な製剤となる。従って、アジュバントを加えたワクチンにおける長期の安定性の維持は、ワクチン開発者に重大な挑戦を与え得る。そのため、いくつかのアジュバント含有ワクチンは、別添えのアジュバントバイアルと患者の枕元で混合した後に投与される（US Food and Drug Administration, 2012, Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee Meeting）。さらに、既存の凍結乾燥ワクチンは、いずれも凍結乾燥製剤中にアジュバントを含有しない（PATH, and Working in Tandem Ltd, 2012, Summary of stability data for licensed vaccines, Seattle, WA）。実際に、アルミニウム塩または水中油乳剤などの、承認されたヒト用ワクチンにおいて既に使用されているアジュバント製剤は、凍結乾燥が特に困難であり得る（Clausi et al, 2008, J Pharm Sci, 97:2049-2061; Rossi et al., 2007, Role of Lipid Excipients in Modifying Oral and Parenteral Drug Delivery: Basic Principles and Biological Examples, pp 88-123, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken NJ）。タンパク質、弱毒生または死菌ウイルスまたは細菌を含有するワクチンの凍結乾燥は常法であるが、今日まで、アジュバントを含有する臨床用ワクチン候補の凍結乾燥および熱安定性の解析に成功したという報告は存在しない（PATH, and Working in Tandem Ltd, 2012, Summary of stability data for licensed vaccines, Seattle, WA）。スクアレン乳剤中の炭疽菌の防御抗原の凍結乾燥は報告されているが、再構成された系の熱安定性と生物物理学的特徴解析の記載は含まれなかった（Ivins et al., 1995, Vaccine, 13:1779-1784）。臨床用に承認されたワクチンアジュバント（例えば、アラム（alum）、水中油乳剤および／またはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ））の複雑な性質は、凍結乾燥されたアジュバント含有ワクチンの開発に、実質的なハードルをもたらす。

【0004】

コールドチェーン管理を必要としないアジュバント含有ワクチンの開発は、新しいワクチンの世界的実施のコストおよび技術的ハードルを、特に資源に乏しい状況において、有意に下げるであろう。従って、持続する温度で化学的に安定であり、ワクチン抗原に対する免疫応答を誘起する能力を保持する、熱安定性のアジュバント含有ワクチンへの要望がある。本明細書に記載する通り、本発明は、これらの要望に応え、他の関連する利点を提案するものである。

【0005】

あらゆる目的のために、本明細書で引用する全ての刊行物、特許および特許出願の全体を、引用により本明細書の一部とする。

【発明の概要】

【0006】

簡単な発明の概要
ある態様では、代謝可能な油およびケーキ形成性賦形剤を含む熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物であって、ケーキの形態であり、再構成すると水中油乳剤を形成し、ケーキ形成性賦形剤が、（１）マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せ；または、（２）トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である、組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、抗原および／またはアジュバントをさらに含む。

【0007】

ある態様では、有効量の抗原、代謝可能な油およびケーキ形成性賦形剤を含む熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物であって、ケーキの形態であり、再構成すると水中油乳剤を形成し、ケーキ形成性賦形剤が、（１）マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せ；または、（２）トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である、組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、アジュバントをさらに含む。

【0008】

別の態様では、有効量のアジュバント、代謝可能な油およびケーキ形成性賦形剤を含む熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物であって、ケーキの形態であり、再構成すると水中油乳剤を形成し、ケーキ形成性賦形剤が、（１）マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せ；または、（２）トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である、組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、抗原をさらに含む。

【0009】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である。

【0010】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せである。

【0011】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、水中油乳剤製剤の凍結乾燥により形成され、水中油乳剤製剤は、約１％（ｗ／ｖ）以下のグリセロールを含む。

【0012】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、水中油乳剤製剤は、約０.５％（ｗ／ｖ）以下のグリセロールを含む。

【0013】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、水中油乳剤製剤は、グリセロールを含まない。

【0014】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、水中油乳剤製剤の凍結乾燥により形成され、ケーキ形成性賦形剤は、水中油乳剤製剤中で約１０％（ｗ／ｖ）の濃度であるトレハロースである。

【0015】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、水中油乳剤製剤の凍結乾燥により形成され、ケーキ形成性賦形剤は、水中油乳剤製剤中で約５％（ｗ／ｖ）の濃度であるトレハロースである。

【0016】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、水中油乳剤製剤の凍結乾燥により形成され、ケーキ形成性賦形剤は、マンニトールとトレハロースの組合せであり、水中油乳剤製剤中で、水中油乳剤製剤中のマンニトールは約０.１％（ｗ／ｖ）の濃度であり、水中油乳剤製剤中のトレハロースは、約５％（ｗ／ｖ）の濃度である。

【0017】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、水中油乳剤製剤の凍結乾燥により形成され、ケーキ形成性賦形剤は、マンニトールとトレハロースの組合せであり、水中油乳剤製剤中のマンニトールは約２.５％（ｗ／ｖ）の濃度であり、水中油乳剤製剤中のトレハロースは、約２.５％（ｗ／ｖ）の濃度である。

【0018】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、水中油乳剤製剤は、グリセロールを含まない。

【0019】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約８℃ないし約６０℃の温度で、少なくとも１ヵ月間、熱安定性である。

【0020】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約８℃ないし約６０℃の温度で、少なくとも３ヵ月間、熱安定性である。

【0021】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約８℃ないし約６０℃の温度で、少なくとも６ヵ月間、熱安定性である。

【0022】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約８℃ないし約６０℃の温度で、少なくとも１２ヵ月間、熱安定性である。

【0023】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約２５℃で、少なくとも１日間、熱安定性である。

【0024】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約２５℃で、少なくとも１週間、熱安定性である。

【0025】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約２５℃で、少なくとも１ヵ月間、熱安定性である。

【0026】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約３７℃で、少なくとも１日間、熱安定性である。

【0027】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約３７℃で、少なくとも１週間、熱安定性である。

【0028】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約３７℃で、少なくとも１ヵ月間、熱安定性である。

【0029】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約５０℃で、少なくとも１日間、熱安定性である。

【0030】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約５０℃で、少なくとも１週間、熱安定性である。

【0031】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約５０℃で、少なくとも１ヵ月間、熱安定性である。

【0032】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、約３０℃ないし約５０℃で、少なくとも１日間、少なくとも１週間、または、少なくとも１ヵ月間、熱安定性である。

【0033】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、美しい（elegant）ケーキの形態である。

【0034】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、本明細書に記載のいずれの温度および期間の条件で保管したときにも、目視検査により褐変を示さないケーキの形態である。

【0035】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物の熱安定性は、凍結乾燥組成物の再構成に先立ち判定される。

【0036】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、ケーキの形態および熱安定性は、ケーキの縮み、割れおよび／または褐変を観察することにより判定される。

【0037】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、熱安定性は、凍結乾燥組成物の再構成の後に判定される。

【0038】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、熱安定性は、再構成時に形成される水中油乳剤のクリーム化の検査により判定される。

【0039】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、組成物は、水中油乳剤製剤の凍結乾燥により形成され、再構成時に形成される水中油乳剤中の抗原またはアジュバントの濃度は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中の抗原またはアジュバントの濃度の約２５％以下の破壊を示す。

【0040】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、熱安定性は、再構成時に形成される水中油乳剤の成分のアッセイにより判定される。

【0041】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、再構成された乳剤は、Ｚ平均粒径（Z-Average diameter）約２００ｎｍ未満の粒径を有する。

【0042】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、抗原は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸または病原体である。

【0043】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、アジュバントは、代謝可能な油である。いくつかの実施態様では、代謝可能な油は、スクアレン、合成スクアレン、ブドウ種子油、オリーブ油または合成イソプレノイドである。

【0044】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、アジュバントは、ＴＬＲ４アゴニストである。いくつかの実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、ＭＰＬ、３ｄ−ＭＰＬまたは合成ＧＬＡである。いくつかの実施態様では、合成ＧＬＡアジュバントは、下記の構造を有する：

【化1】

式中、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｃ_１１−Ｃ_２０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_９−Ｃ_２０アルキルである。いくつかの実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｃ_１１アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_９アルキルである。

【0045】

本明細書に記載の組成物のいくつかの実施態様では、代謝可能な油は、スクアレン、ミネラルオイル、ブドウ種子油、合成スクアレンまたは合成イソプレノイドである。

【0046】

いくつかの実施態様では、組成物は、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、卵黄レシチン（egg PC）、レチシン（lethicin）、ツイーンまたはこれらの組合せをさらに含む。

【0047】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物は、界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、界面活性剤は、プルロニックＦ６８である。いくつかの実施態様では、組成物は、抗酸化剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、抗酸化剤はビタミンＥである。

【0048】

別の態様では、本明細書に記載の熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物を含む単一バイアルが提供され、組成物はバイアルの中に含まれる。

【0049】

別の態様では、本明細書に記載の熱安定性ワクチン組成物の保管方法であって、組成物を約８℃ないし約６０℃で、または、約２５℃ないし約６０℃で、少なくとも１ヵ月保管することを含み、ワクチン製剤が熱安定性である、方法が提供される。

【0050】

別の態様では、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物の生成方法であって、水中油乳剤を凍結乾燥して熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物を形成する段階を含み、水中油乳剤が、（１）抗原、（２）代謝可能な油、および、（３）ケーキ形成性賦形剤を含み、ケーキ形成性賦形剤が、（ａ）マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せ；または、（ｂ）トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖であり、ワクチン組成物が、ケーキの形態であり、再構成すると水中油乳剤を形成する、方法が提供される。

【0051】

別の態様では、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物の生成方法であって、水中油乳剤を凍結乾燥して熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物を形成する段階を含み、水中油乳剤が、（１）アジュバント、（２）代謝可能な油、および、（３）ケーキ形成性賦形剤を含み、ケーキ形成性賦形剤が、（１）マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せ；または、（２）トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖であり、ワクチン組成物が、ケーキの形態であり、再構成すると水中油乳剤を形成する、方法が提供される。

【0052】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である。

【0053】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せである。

【0054】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、凍結乾燥前の水中油乳剤は、約１％（ｗ／ｖ）以下のグリセロールを含む。

【0055】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、凍結乾燥前の水中油乳剤は、約０.５％（ｗ／ｖ）以下のグリセロールを含む。

【0056】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、凍結乾燥前の水中油乳剤は、グリセロールを含まない。

【0057】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、凍結乾燥前の水中油乳剤中で約１０％（ｗ／ｖ）の濃度のトレハロースである。

【0058】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、凍結乾燥前の水中油乳剤中で約５％（ｗ／ｖ）の濃度の５％（ｗ／ｖ）トレハロースである。

【0059】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、マンニトールとトレハロースの組合せであり、凍結乾燥前の水中油乳剤中のマンニトールは約０.１％（ｗ／ｖ）であり、凍結乾燥前の水中油乳剤中のトレハロースは、約５％（ｗ／ｖ）である。

【0060】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、マンニトールとトレハロースの組合せであり、凍結乾燥前の水中油乳剤中のマンニトールは約２.５％（ｗ／ｖ）であり、凍結乾燥前の水中油乳剤中のトレハロースは、約２.５％（ｗ／ｖ）である。

【0061】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、凍結乾燥前の水中油乳剤は、グリセロールを含まない。

【0062】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、組成物は、約８℃ないし約６０℃の温度で、少なくとも１ヵ月間、熱安定性である。

【0063】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、組成物は、少なくとも３ヵ月間、熱安定性である。

【0064】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、組成物は、少なくとも６ヵ月間、熱安定性である。

【0065】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、組成物は、少なくとも１２ヵ月間、熱安定性である。

【0066】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、組成物は、約２５℃で、少なくとも１ヵ月間、熱安定性である。

【0067】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、組成物は、約３７℃で、少なくとも１ヵ月間、熱安定性である。

【0068】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、組成物は、約５０℃で、少なくとも１ヵ月間、熱安定性である。

【0069】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、凍結乾燥の段階は、単一バイアル中で実施される。

【0070】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、再構成時の水中油乳剤は、Ｚ平均粒径約２００ｎｍ未満の粒径を有する。

【0071】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、再構成時の水中油乳剤は、Ｚ平均粒径約１００ｎｍ未満の粒径を有する。

【0072】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、再構成時の水中油乳剤中の抗原および／またはアジュバントの濃度は、凍結乾燥前の水中油乳剤中の抗原および／またはアジュバントの濃度と比較して、約２５％以下の破壊を示す。

【0073】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、凍結乾燥された組成物は、ケーキの形態である。

【0074】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、熱安定性は、凍結乾燥組成物の再構成に先立ち判定される。

【0075】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、凍結乾燥組成物は、ケーキの形態であり、熱安定性は、ケーキの縮みまたは褐変を観察することにより判定される。

【0076】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、熱安定性は、凍結乾燥組成物の再構成の後に判定される。

【0077】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、熱安定性は、再構成時の水中油乳剤のクリーム化の検査により判定される。

【0078】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、熱安定性は目視により判定される。

【0079】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、熱安定性は、再構成時の水中油乳剤の成分のアッセイにより判定される。

【0080】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、乳剤は、単一バイアル中で凍結乾燥される。

【0081】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、再構成された乳剤は、Ｚ平均粒径約２００ｎｍ未満の粒径を有する。

【0082】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、凍結乾燥前の水中油乳剤は、抗原およびアジュバントを含む。

【0083】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、抗原は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸または病原体である。

【0084】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、アジュバントは、代謝可能な油である。本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、代謝可能な油のアジュバントは、スクアレン、合成スクアレン、ブドウ種子油、オリーブ油または合成イソプレノイドである。

【0085】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、抗原は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸または病原体である。

【0086】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、アジュバントは、ＴＬＲ４アゴニストである。いくつかの実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、ＭＰＬ、３ｄ−ＭＰＬまたは合成ＧＬＡである。いくつかの実施態様では、合成ＧＬＡアジュバントは、下記の構造を有する：

【化2】

式中、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｃ_１１−Ｃ_２０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_９−Ｃ_２０アルキルである。いくつかの実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｃ_１１アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_９アルキルである。

【0087】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、代謝可能な油は、スクアレン、ミネラルオイル、ブドウ種子油、合成スクアレンまたは合成イソプレノイドである。

【0088】

いくつかの実施態様では、ワクチン組成物は、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、卵黄レシチン、レチシン、ツイーンまたはこれらの組合せをさらに含む。

【0089】

いくつかの実施態様では、ワクチン組成物は、界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、界面活性剤は、プルロニックＦ６８である。いくつかの実施態様では、ワクチン組成物は、抗酸化剤（例えば、ビタミンＥ）をさらに含む。

【0090】

別の態様では、対象の免疫応答の刺激方法であって、（ａ）本明細書に記載の熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物のいずれかを、水中油乳剤に再構成すること；および、（ｂ）乳剤を対象に投与することを含み、それにより、対象の免疫応答を刺激する方法が提供される。いくつかの実施態様では、免疫応答は、非特異的免疫応答である。いくつかの実施態様では、免疫応答は、抗原特異的免疫応答である。いくつかの実施態様では、水中油乳剤は、皮内または経口で投与される。いくつかの実施態様では、組成物はＧＬＡを含む。いくつかの実施態様では、哺乳動物はヒト、イヌまたはウシである。

【0091】

本明細書に記載の様々な実施態様の１つ、複数、または全ての特徴を組み合わせて、本発明の他の実施態様を形成し得ることが理解されるべきである。本発明のこれらおよび他の態様は、当業者に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0092】

図面の簡単な説明

【図1】図１は、５％ｗ／ｖトレハロースにおける２％ｖ／ｖＳＥの凍結乾燥が、乳剤の特徴を保持することを示す。図１Ａ）凍結乾燥前（左）、凍結乾燥時（中央）、凍結乾燥ケーキの再構成後（右）の乳剤の外観。図１Ｂ）粒径体積分布は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定した。

【0093】

【図2】図２は、凍結乾燥が、３７℃での乳剤の物理的およびｐＨ安定性と、９０℃での化学的安定性とを顕著に改善したことを示す。図２Ａ）２５℃（上図）または３７℃（下図）で経時的に保管した際の、凍結乾燥前の液体乳剤（黒四角）および再構成された凍結乾燥乳剤（黒丸）における、粒径。図２Ｂ）２５℃（上図）または３７℃（下図）で経時的に保管した際の、凍結乾燥前の液体乳剤（黒四角）および再構成された凍結乾燥乳剤（黒丸）における、ｐＨ。図２Ｃ）９０℃の増進された分解条件で経時的に保管した際の、乳剤中の成分量。液体乳剤における、卵由来フォスファチジルコリン（液体egg-PC；黒丸）、スクアレン（液体スクアレン；黒三角）およびα−トコフェロール（液体α−トコフェロール；黒ひし形）のパーセント（％）は、再構成された凍結乾燥乳剤における卵由来フォスファチジルコリン（凍結乾燥したegg-PC；黒四角）、スクアレン（凍結乾燥したスクアレン；黒逆三角）およびα−トコフェロール（凍結乾燥したα−トコフェロール；白丸）と比較して、迅速な成分濃度の変化を示す。

【0094】

【図3】図３は、１５００時間に渡って定期的に再構成された、２５℃、３７℃、５０℃、６０℃、および９０℃で保管中の凍結乾燥乳剤における、物理化学的変化を示す。図３Ａ）２５℃（黒丸）、３７℃（黒四角）、５０℃（黒三角）、６０℃（黒逆三角）または９０℃（白丸）で経時的に保管され、再構成された凍結乾燥乳剤の粒径。図３Ｂ）２５℃（黒丸、３７℃（黒四角、５０℃（黒三角）、６０℃（黒逆三角）または９０℃（白丸）で経時的に保管され、再構成された凍結乾燥乳剤のｐＨ。図３Ｃ）２５℃（黒丸）、３７℃（黒四角）、５０℃（黒三角）、６０℃（黒逆三角）または９０℃（白丸）で経時的に保管された、凍結乾燥乳剤のケーキの幅の割合。図３Ｄ）ケーキの幅の縮みによって測定されるメルトバック（Melt-back）は、安定性がストレスを受ける条件の６０℃で凍結乾燥乳剤を保管した際の粒径と、逆の相関関係にあった。

【0095】

【図4】図４は、賦形剤の選択が、再構成後の乳剤の維持に影響を与えることを示す。図４Ａ）各賦形剤を有する製剤の多分散指数（ＰｄＩ）。図４Ｂ）各賦形剤を有する乳剤の粒径（ｎＭ）。左から右へ、ＳＥ（バルク原料（Bulk Material））、トレハロース（凍結乾燥前）、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトース、ラクツロース、リボース、デキストラン４０,０００、ＰＥＧ３３５０、マンニトール、スタキオース、ソルビトール、ジピコリン酸（０.５％）、ニコチン酸（０.５％）、およびプロリンである。

【0096】

【図5】図５は、５％（ｗ／ｖ）トレハロース、リボース、マンニトールまたはプロリンにおける、再構成された２％（ｖ／ｖ）油のＳＥの、製剤およびケーキの特徴を示す。図５Ａ）凍結乾燥乳剤のケーキの像。図５Ｂ）トレハロースおよびマンニトールによって再構成された凍結乾燥乳剤のクリーム化の比較。矢印はクリーム化を示す。図５Ｃ）ＤＬＳによって測定された粒径体積分布。

【0097】

【図6】図６は、賦形剤の選択および化学的構造が、ケーキの熱安定性に影響を与えることを示す。図６Ａ）代表的な製剤の融解転移を示す、融点装置のサーモグラム。図６Ｂ）各賦形剤内の、ケーキの開始点およびＴｍ温度。

【0098】

【図7】図７は、乳剤のサイズの安定性は、ケーキの形態および熱誘導メルトバックへの感受性に依存することを示す。図７Ａ）粒径の安定性は、増量剤のタイプおよび使用した増量剤の濃度に依存する。５％デキストロース（黒四角）、５％スクロース（黒ひし形）、５％マルトース（黒逆三角）、５％トレハロース（黒丸）、および１５％ラクトース（黒三角）賦形剤におけるＳＥ。図７Ｂ）粒径増加速度は、転移温度、すなわち増量剤の特性と相関している。点線は、安定性がストレスを受ける温度である９０℃を示す。

【0099】

【図8】図８は、マンニトールとクラス１賦形剤を含む製剤が、乳剤を破壊することなく、ケーキの熱安定性を大幅に増加させたことを示す。０.２％または５％マンニトールを伴って、またはマンニトールなしのいずれかで、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、またはスクロースを含む、５％（ｗ／ｖ）製剤における、２％（ｖ／ｖ）油を用いたＳＥ間のケーキＴｍの比較。

【0100】

【図9】図９は、液体（左）、凍結乾燥（中央）および再構成（右）のＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥのバイアルの代表的な像を示す。バイアルは、ストレスなし（上段）または５０℃で３０日間のストレスあり（下段）であった。

【0101】

【図10】図１０は、図中の標識で示す通り、ＩＤ９３および／またはＧＬＡ−ＳＥを含有する液体のサンプル並びに凍結乾燥および再構成したサンプルの粒子の特徴解析を示す。図１０Ａ）ＤＬＳ実験によるＺ平均粒径、図１０Ｂ）ＤＬＳ実験による多分散指数（ＰｄＩ）、図１０Ｃ）ナノ粒子軌跡解析法によるゼータ電位測定、および、図１０Ｄ）ナノ粒子軌跡解析法による粒子濃度測定。黒いバーは、ストレスのないサンプルを表し（即ち、４℃で３０日間保管）、白いバーは５０℃で３０日間のストレスを受けたサンプルを表す。

【0102】

【図11】図１１は、同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ液体（レーン１および３）並びに凍結乾燥および再構成したサンプル（レーン２および４）を染色した還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。サンプルは、ストレスなし（レーン１および２）または５０℃で３０日間のストレスあり（レーン３および４）であった。比較用に、ストレスのないＧＬＡ−ＳＥおよびＩＤ９３を示す（各々、レーン５および６）。

【0103】

【図12】図１２は、ＩＤ９３および／またはＧＬＡ−ＳＥを含有する液体のサンプル並びに凍結乾燥および再構成したサンプルを示す。図１２Ａ）ＧＬＡ、図１２Ｂ）ＤＭＰＣ、および図１２Ｃ）スクアレン濃度を、逆相ＨＰＬＣ解析の標準曲線から決定した。図１２Ｄ）成分ＤＭＰＣ、スクアレンおよびＧＬＡを示す代表的なクロマトグラム。黒いバーは、ストレスのないサンプルを表し、白いバーは５０℃で３０日間のストレスを受けたサンプルを表す。

【0104】

【図13】図１３は、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥が、熱ストレスによる生物学的活性の損失を防止したことを示す。１ヵ月間４℃または５０℃に曝された、塩水または、液体、液体の同一バイアル、もしくは、凍結乾燥した同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥで、マウスを免疫した。図１３Ａ）血液のＢおよびＴ細胞数を、免疫化の１８時間後に測定した。図１３Ｂ）ＩＤ９３特異的血清抗体力価を、最初の免疫化から３週間後に測定した。図１３Ｃ）脾臓におけるＩＤ９３特異的ＣＤ４Ｔ細胞の頻度を、インビトロでのＩＤ９３による再刺激後のサイトカイン産生を分析することにより、最後の免疫化から１ヵ月後に評価した。

【0105】

【図14】図１４は、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ免疫化マウスにおける、エアロゾル化した結核菌の攻撃および数え上げを示す。最後の免疫化の１ヵ月後に、動物を低用量のエアロゾル化した結核菌で攻撃した。図１４Ａ）肺および図１４Ｂ）脾臓における細菌の負荷を３週間後に決定した。データは、マウスＮ＝５−７匹／群の平均＋ｓ．ｄ．として示す。同様の結果の２回の実験の一方からのデータを示す。＊、＊＊、＊＊＊および＊＊＊＊は、塩水に対してＰ＜０．０５、０．０１、０．００１および０．０００１を各々示す。ｎ．ｓ．：塩水に対して有意ではない。４℃および５０℃のサンプル間の統計学的比較を示す。

【0106】

【図15】図１５は、５０℃で３０日間のストレス後の、凍結乾燥および再構成したＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥの同時凍結乾燥製剤を示す。０日および３０日の時点について、２連のサンプルを示す。

【0107】

【図16】図１６は、再構成したＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤のクマシー染色還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。レーン当たり、１μｇのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥを負荷した。

【0108】

【図17】図１７は、再構したＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤のＤＬＳ粒径を示す。図１７Ａ）強度による粒径分布（直径）。図１７Ｂ）Ｚ平均粒径。図１７Ｃ）多分散指数（ＰｄＩ）。エラーバーは、ｎ＝４の測定の平均値に対して１つの標準偏差を表している。

【0109】

【図18】図１８は、再構成したＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤のＤＬＳゼータ電位（ｍＶ）を示す。エラーバーは、ｎ＝４の測定の平均値に対して１つの標準偏差を表している。

【0110】

【図19】図１９は、再構成したＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤における、ＨＰＬＣによって得られたＳＬＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは、ｎ＝３の測定の平均値に対して１つの標準偏差を表している。

【0111】

【図20】図２０は、二連の、凍結乾燥したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥサンプルのケーキ形成、並びに凍結乾燥後に４℃、２５℃、および３７℃で保管した０時間目（凍結乾燥直後）および１ヵ月目に、再構成した後の乳剤の外観を示す。４℃で保管したサンプルは、２−８℃の通常のコールドチェーン保管の条件下で保管されたコントロールの凍結乾燥乳剤に相当する。ケーキは、褐変の所見がなく、白色の、わずかに縮んだ外観を示し、再構成された乳剤は、再構成後１時間または２４時間において、クリーム化していない。

【0112】

【図21】図２１は、４℃、２５℃、および３７℃で３ヵ月保管後の、二連の、凍結乾燥したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ製剤の安定性の特徴を示す。図２１Ａ）ケーキは、崩壊または変色のさらなる徴候を示さず、再構成したサンプルは、再構成後２４時間までは、クリーム化することなく、乳剤の外観を維持した。図２１Ｂ）表は、再構成された乳剤の、ＤＬＳ実験によるＺ平均粒径、ＤＬＳ実験による多分散指数、ｐＨおよびＧＬＡ濃度を示す。エラーバーは、ｐＨについては２つのバイアルの平均値、ＤＬＳサイズおよびＰＤＩ測定については２つのバイアル×３つの希釈×３つの測定の平均値、に対する１つのＳＤを表す。再構成されたＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤中の、ＨＰＬＣによって得られたＧＬＡ濃度（μｇ／ｍＬ）。エラーバーは、ｎ＝３の平均値に対して１つの標準偏差を表す。データによると、いずれの保管温度の再構成後でも、再構成された乳剤の粒径、多分散、またはｐＨにおいて、明らかな増加を示していない。図２１Ｃ）は、再構成されたＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤のクマシー染色還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。レーン当たり、１μｇのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥを負荷した。９８ｋＤのバンドの存在は、ＩＤ９３ポリペプチドの明らかな分解がないことを示す。図２１Ｄ）乳剤成分スクアレンおよびＤＭＰＣのＨＰＬＣによるトレース。ＨＰＬＣ解析は、追加のピークまたはピークの広がりが出現していないことにより証明されるように、試験したいずれの温度においても、ＤＭＰＣ乳剤成分またはスクアレンの明らかな分解が見られないことを示す。図２１Ｅ）は、再構成されたＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤中の、ＨＰＬＣによって得られたＧＬＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは、ｎ＝３の測定の平均値に対して１つの標準偏差を表す。３ヵ月目に、再構成された乳剤サンプルは、４℃および２５℃において、ほとんど明らかなＧＬＡの損失を示さない（ＧＬＡは、４℃サンプル中に５１μｇ／ｍｌ（１０２％）、２５℃サンプル中に４６μｇ／ｍｌ（９２％）である）。３７℃のサンプルは、３ヵ月目で、４２μｇ／ｍｌ（８４％）であり、いくらかのＧＬＡ濃度の損失の傾向を示している可能性がある。

【0113】

【図22】図２２は、４℃、２５℃、および３７℃で６ヵ月保管後の、二連の、凍結乾燥したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ製剤の安定性の特徴を示す。４℃で保管したサンプルは、２−８℃の通常のコールドチェーン保管の条件下で保管された対照の凍結乾燥乳剤に相当する。図２２Ａ）ケーキは、崩壊または変色のさらなる徴候を示さず、再構成したサンプルは、再構成後２４時間までは、クリーム化することなく、乳剤の外観を維持した。図２２Ｂ）表は、再構成された乳剤の、ＤＬＳ実験によるＺ平均粒径、ＤＬＳ実験による多分散指数、ｐＨおよびＧＬＡ濃度を示す。エラーバーは、ｐＨについては２つのバイアルの平均値、ＤＬＳサイズおよびＰＤＩ測定については２つのバイアル×３つの希釈×３つの測定の平均値、に対する１つのＳＤを表す。再構成されたＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤中の、ＨＰＬＣによって得られたＧＬＡ濃度（μｇ／ｍＬ）。エラーバーは、ｎ＝３の平均値に対して１つの標準偏差を表す。表は、再構成され、６ヵ月間に渡って保管されたサンプルにおいて、ｐＨが生理的範囲内である７.２１−７.４９に維持されていることを示す。図２２Ｃ）は、再構成されたＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤のクマシー染色還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。レーン当たり、１μｇのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥを負荷した。９８ｋＤのバンドの存在は、９８ｋＤのバンドの追加のバンドまたは本バンドの広がりが出現していないことにより証明されるように、６ヵ月目に、ＩＤ９３ポリペプチドの明らかな分解がないことを示す。図２２Ｄ）乳剤成分スクアレンおよびＤＭＰＣのＨＰＬＣによるトレース。ＨＰＬＣ解析は、追加のピークまたはピークの広がりが出現していないことにより証明されるように、試験したいずれの温度においても、これらの乳剤成分の明らかな分解が見られないことを示す。図２２Ｅ）は、再構成されたＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤中の、ＨＰＬＣによって得られたＧＬＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは、ｎ＝３の測定の平均値に対して１つの標準偏差を表す。６ヵ月目に、４℃および２５℃のサンプルは、明らかなＧＬＡの損失を示さないが（ＧＬＡは、４℃サンプル中に４７μｇ／ｍｌ（９４％）、２５℃サンプル中に４２μｇ／ｍｌ（８４％）である）、３７℃保管のサンプルは、２５μｇ／ｍｌ（８４％）であり、最初のＧＬＡ濃度の、約５０％の損失を示す。

【0114】

【図23】図２３は、４℃、２５℃、および３７℃で９ヵ月保管後の、二連の、凍結乾燥したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ製剤の安定性の特徴を示す。４℃で保管したサンプルは、２−８℃の通常のコールドチェーン保管の条件下で保管された対照の凍結乾燥乳剤に相当する。図２３Ａ）ケーキは、崩壊または変色のさらなる徴候を示さず、再構成したサンプルは、再構成後２４時間までは、クリーム化することなく、乳剤の外観を維持した。図２３Ｂ）表は、ＤＬＳ実験によるＺ平均粒径、ＤＬＳ実験による多分散指数、ｐＨおよびＧＬＡ濃度を示す。エラーバーは、ｐＨについては２つのバイアルの平均値、ＤＬＳサイズおよびＰＤＩ測定については２つのバイアル×３つの希釈×３つの測定の平均値、に対する１つのＳＤを表す。再構成されたＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤中の、ＨＰＬＣによって得られたＧＬＡ濃度（μｇ／ｍＬ）。エラーバーは、ｎ＝３の平均値に対して１つの標準偏差を表す。表は、再構成され、９ヵ月間に渡って保管されたサンプルにおいて、ｐＨが生理的範囲内である７.１９−７.５３に維持されていることを示す。図２３Ｃ）は、再構成されたＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤のクマシー染色還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。レーン当たり、１μｇのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥを負荷した。９８ｋＤのバンドの存在は、９８ｋＤのバンドの追加のバンドまたは本バンドの広がりが出現していないことにより証明されるように、９ヵ月目に、ＩＤ９３ポリペプチドの明らかな分解がないことを示す。図２３Ｄ）乳剤成分スクアレンおよびＤＭＰＣのＨＰＬＣによるトレース。ＨＰＬＣ解析は、追加のピークまたはピークの広がりが出現していないことにより証明されるように、試験したいずれの温度においても、乳剤成分の明らかな分解が見られないことを示す。図２３Ｅ）は、再構成されたＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤中の、ＨＰＬＣによって得られたＧＬＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは、ｎ＝３の測定の平均値に対して１つの標準偏差を表す。９ヵ月目に、４℃および２５℃のサンプルは、明らかなＧＬＡの損失を示さないが（ＧＬＡは、４℃サンプル中に４０μｇ／ｍｌ（８０％）、２５℃サンプル中に４０μｇ／ｍｌ（８０％）である）、３７℃保管のサンプルは、９ヵ月間の保管後に、最初のＧＬＡ濃度の約６９％の損失（１５μｇ／ｍｌ）を示す。

【0115】

【図24】図２４は、４℃、２５℃、および３７℃で１２ヵ月保管後の、二連の、凍結乾燥したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ製剤の安定性の特徴を示す。４℃で保管したサンプルは、２−８℃の通常のコールドチェーン保管の条件下で保管された対照の凍結乾燥乳剤に相当する。図２４Ａ）ケーキは、崩壊または変色のさらなる徴候を示さず、再構成したサンプルは、再構成後２４時間までは、クリーム化することなく、乳剤の外観を維持した。図２４Ｂ）表は、ＤＬＳ実験によるＺ平均粒径、ＤＬＳ実験による多分散指数、ｐＨおよびＧＬＡ濃度を示す。エラーバーは、ｐＨについては２つのバイアルの平均値、ＤＬＳサイズおよびＰＤＩ測定については２つのバイアル×３つの希釈×３つの測定の平均値、に対する１つのＳＤを表す。再構成されたＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤中の、ＨＰＬＣによって得られたＧＬＡ濃度（μｇ／ｍＬ）。エラーバーは、ｎ＝３の平均値に対して１つの標準偏差を表す。表は、再構成され、１２ヵ月間に渡って保管されたサンプルにおいて、ｐＨが生理的範囲内である７.１５−７.４８に維持されていることを示す。図２４Ｃ）は、再構成されたＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥ同時凍結乾燥製剤のクマシー染色還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。レーン当たり、１μｇのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥを負荷した。９８ｋＤのバンドの存在は、９８ｋＤのバンドの追加のバンドまたは本バンドの広がりが出現していないことにより証明されるように、１２ヵ月目に、ＩＤ９３ポリペプチドの明らかな分解がないことを示す。

【0116】

【図25】図２５は、凍結乾燥直後（０日目）または５０℃３０日間保管後に試験した、ケーキ形成性賦形剤としてのグリセロールの添加または除去、乳剤中の油のパーセンテージの変化、ＧＬＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の範囲にわたる等張化剤としての２％Trisの含有、の凍結乾燥乳剤に対する影響を示す。図２５Ａは、０.５％グリセロールｖ／ｖを含む製剤（With Glycerolと表示）と比較して、凍結乾燥乳剤製剤が全て、生分解性油であるスクアレンの濃度を増やして（２−１０％ｖ／ｖ）、０.５％グリセロールを除くと（No Glycerolと表示）、５０℃３０日間後でさえも、さらなるケーキの縮みまたは目に見える変色がなく、凍結乾燥時に美しいケーキを形成したことを示す。グリセロールを含むケーキは、凍結乾燥直後（０日目）および５０℃保管後３０日目のいずれにおいても、わずかに縮んで押し下げられており、５０℃で保管したサンプルは５０℃保管後３０日目にケーキ構造のさらなる（縮み）または崩壊を示す。図２５Ｂおよび図２５Ｃ）は、いずれの製剤においても、５０℃で３０日間の保管後に、粒径（Z-Average nm）図２５Ｂ、および多分散（ＰＤＩ）図２５Ｃのどちらにおいても、目立った差異がないことを示し、全ての製剤は再構成後に、およそ２００ｎｍの、または２００ｎｍより小さい粒径を示す。図２５Ｄ）は、０.５％ｖ／ｖグリセロールの存在が、凍結乾燥製剤におけるＧＬＡアジュバントの安定性に影響を与えることを示す。様々な濃度のスクアレン（２％−１０％ｖ／ｖ）を含む凍結乾燥製剤は、様々な濃度のＧＬＡアジュバントを含んだ。０時間目の濃度を、凍結乾燥製剤を３０日間５０℃で保管後に獲得したＧＬＡの濃度と比較した。データは、５０℃で１ヵ月保管後、グリセロールを含まない凍結乾燥製剤（NO Glycerolと表した）は全て、ＧＬＡの最初の濃度の８５％より高い値を示した一方、グリセロールを含む凍結乾燥製剤は、ＧＬＡ濃度の８０％を超える損失を示すことを、表す。

【0117】

【図26】図２６は、ＧＬＡ−ＳＥ乳剤を熱保護する能力を評価した４つの凍結乾燥製剤を示しており、評価した全ての凍結乾燥製剤はグリセロールを欠いている。図２６−３１において、アジュバント、ＧＬＡの濃度は、凍結乾燥ケーキの再構成後の、より再現性のあるＧＬＡ濃度の定量を可能にするために、ＧＬＡ−ＳＥ乳剤中で１００ｎｇ／ｍｌまで上昇させた。製剤は、凍結乾燥後０時間（凍結乾燥直後）、１週間（１ｗｋ）、２週間（２ｗｋ）、１ヵ月（１ｍｏ）および３ヵ月（３ｍｏ）において、４℃、２５℃、３７℃、および５０℃で示された時間保管したサンプルに対し、再構成後のケーキ形成、外観、クリーム化を評価した。図２６Ａ）５％トレハロース単独（グリセロールなし）、図２６Ｂ）５％ｗ／ｖトレハロース、０.１％ｗ／ｖマンニトール、図２６Ｃ）２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトール、図２６Ｄ）１０％ｗ／ｖトレハロース。データは、グリセロールを欠いた、または有さない、試験した全ての凍結乾燥製剤が、いずれの時間においても（凍結乾燥後、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約１ヵ月間、または少なくとも約３ヵ月間）または試験したいずれの温度においても（少なくとも約４℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約３７℃、および少なくとも約５０℃）、凍結乾燥ケーキが変色または褐変しない、美しいケーキ形成に適していたことを、示す。全てのケーキはまた、崩壊または縮みまたは変色を、ほとんどまたは全く示さず、再構成時にクリーム化しない乳剤を形成した。

【0118】

【図27】図２７は、各凍結乾燥製剤について、凍結乾燥成分を添加する前の凍結乾燥前乳剤（ケーキ形成性賦形剤（バー上にPre Lyoと表示）、凍結乾燥成分を添加した直後のＧＬＡ−ＳＥ乳剤（バー上にLyoと表示）、および凍結乾燥後の再構成後のＧＬＡ−ＳＥ剤（０と表示、あるいは表示がなければ各凍結乾燥製剤セットの３番目のバー）の比較を示しており、バーの各セットの下に、５％トレハロース単独（グリセロールなし）、５％トレハロースｗ／ｖ、０.１％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトールと示す。凍結乾燥製剤の初期の比較では、凍結乾燥製剤は各製剤との間に目立った差異は示さず、約２００ｎｍ未満のＺ平均粒径の粒径、多分散により測定される明らかな凝集体の欠如、生理的なｐＨ、およびＧＬＡの明らかな欠失がないこと（初期の量の９０％よりも多い値）を含む、適切な再構成された乳剤の特徴を有した。

【0119】

【図28】図２８は、４℃（バー１）、２５℃（バー２）、３７℃（バー３）、および５０℃（バー４）で、特定の製剤に対し、１週間（１ｗｋ）保管された、様々な単一バイアルＧＬＡ−ＳＥ凍結乾燥製剤（ケーキ形成性賦形剤を含む乳剤）を示しており、バーの各セットの下に、５％トレハロース単独（グリセロールなし）、５％トレハロースｗ／ｖ、０.１％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトールと示す。サンプルを再構成し、粒径（Ｚ平均粒径、ｎｍ）、凝集機能としての多分散（ＰＤＩ）、ｐＨ、およびＧＬＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を分析した。図２８Ａ）４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、約２００ｎｍ未満の所望のサイズの粒径を示し、図２８Ｂ）４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、多分散により測定した明らかな凝集体の所望の欠如を示し、図２８Ｃ）４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、所望の生理的なｐＨを示した。図２８Ｄ）凍結乾燥ケーキとして保管され、ＧＬＡ−ＳＥ乳剤として再構成された際、ＧＬＡの最初の濃度と比較して、ＧＬＡの明らかな欠損は、全てにおいて見られない（およそ１０５−９５％の範囲の値）。

【0120】

【図29】図２９は、３７℃（バー３）、および５０℃（バー４）で、特定の凍結乾燥製剤に対し、２週間（２ｗｋ）保管された、様々な単一バイアルＧＬＡ−ＳＥ凍結乾燥製剤（ケーキ形成性賦形剤を含む乳剤）を示しており、バーの各セットの下に、５％トレハロース単独（グリセロールなし）、５％トレハロースｗ／ｖ、０.１％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトールと示す。サンプルを再構成し、粒径（Ｚ平均粒径、ｎｍ）、凝集機能としての多分散（ＰＤＩ）、ｐＨ、およびＧＬＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を分析した。図２９Ａ）は、３７℃および５０℃の温度で２週間保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、再構成時に、約２００ｎｍ未満の所望のサイズの粒径を示すＧＬＡ−ＳＥ乳剤を形成したことを表し、図２９Ｂ）は、３７℃および５０℃の温度で２週間保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、再構成時に、多分散により測定した明らかな凝集体の所望の欠如を示すＧＬＡ−ＳＥ乳剤を形成したことを表し、図２９Ｃ）は、３７℃および５０℃の温度で２週間保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、再構成時に、約ｐＨ７.０の所望の生理的なｐＨを示すＧＬＡ−ＳＥ乳剤を形成したことを表す。図２９Ｄ）全てのＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥製剤は、３７℃または５０℃で、２週間、凍結乾燥ケーキとして保管され、ＧＬＡ−ＳＥ乳剤を形成するように再構成された際、ＧＬＡの最初の濃度に対し、ＧＬＡの明らかな欠損を示さない（およそ１０５％−９５％の範囲の値）。

【0121】

【図30】図３０は、４℃（バー１）、２５℃（バー２）、３７℃（バー３）、および５０℃（バー４）で、特定の凍結乾燥製剤に対し、１ヵ月間（１ｍｏ）保管された、様々な単一バイアルＧＬＡ−ＳＥ凍結乾燥製剤（ケーキ形成性賦形剤を含む乳剤）を示しており、バーの各セットの下に、５％トレハロース単独（グリセロールなし）、５％トレハロースｗ／ｖ、０.１％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトールと示す。サンプルを再構成し、粒径（Ｚ平均粒径、ｎｍ）、凝集機能としての多分散（ＰＤＩ）、ｐＨ、およびＧＬＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を分析した。図３０Ａ）は、４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、約２００ｎｍ未満の所望のサイズの粒径を示したことを表し、図３０Ｂ）は、４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが多分散により測定した明らかな凝集体の所望の欠如を示したことを表し、図３０Ｃ）は、４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが 所望の生理的なｐＨを示したことを表した。図３０Ｄ）全てのＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥製剤は、４℃−５０℃の範囲の温度で、１ヵ月間、凍結乾燥ケーキとして保管され、ＧＬＡ−ＳＥ乳剤を形成するように再構成された際、ＧＬＡの最初の濃度に対し、ＧＬＡの明らかな欠損を示さない（およそ１０５％−９４％の範囲の値）。

【0122】

【図31】図３１は、４℃（バー１）、２５℃（バー２）、３７℃（バー３）、および５０℃（バー４）で、特定の凍結乾燥製剤に対し、１ヵ月間（１ｍｏ）保管された、様々な単一バイアルＧＬＡ−ＳＥ凍結乾燥製剤（ケーキ形成性賦形剤を含む乳剤）を示しており、バーの各セットの下に、５％トレハロース単独（グリセロールなし）、５％トレハロースｗ／ｖ、０.１％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトール、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトールと示す。サンプルは再構成され、粒径（Ｚ平均粒径、ｎｍ）、凝集機能としての多分散（ＰＤＩ）、ｐＨ、およびＧＬＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を分析した。図３１Ａ）は、４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、約２００ｎｍ未満の所望のサイズの粒径を示したことを表し、図３１Ｂ）は、４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、多分散により測定した明らかな凝集体の所望の欠如を示したことを表し、図３１Ｃ）は、４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、少なくとも約ｐＨ７.０の所望の生理的なｐＨを示したことを表す。

【発明を実施するための形態】

【0123】

発明の詳細な説明
ある態様では、本発明は、（１）代謝可能な油および（２）ケーキ形成性賦形剤を含む熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物を提供する。熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物は、さらに、抗原および／またはアジュバントを含む場合がある。いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せである。いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である。いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である。いくつかの実施態様では、組成物は、水中油乳剤製剤の凍結乾燥により形成され、凍結乾燥前または再構成時の水中油製剤は、約１％（ｗ／ｖ）以下のグリセロールまたは約０.５％（ｗ／ｖ）以下のグリセロールを含むか、または、グリセロールを含まない。いくつかの実施態様では、組成物はケーキの形態であり、再構成時に水中油乳剤を形成する。いくつかの実施態様では、組成物は単一バイアル中で保管される。

【0124】

当業者に理解される通り、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物、凍結乾燥ワクチン組成物、凍結乾燥熱安定性ケーキ、および凍結乾燥ケーキの用語は、本明細書中で互換的に使用される。この用語は、一般的に、生物分解可能な油または代謝可能な油、および／または、１種またはそれ以上の抗原、および／または、１種またはそれ以上のアジュバント、並びに、本発明のケーキの産生に使用されるケーキ形成性賦形剤を含む、凍結乾燥された水中油安定乳剤を表す。熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物を再構成すると、本発明の所望の特徴、即ち、約２００ｎｍ以下の平均粒径、約７.４の生理的ｐＨ、凍結乾燥前の当初の水中油製剤中の各有効成分（抗原、アジュバントなど）の濃度の約２５％以上の各有効成分濃度の損失がないこと、または、対象の免疫応答を誘導または刺激するのに適する各有効成分（抗原、アジュバントなど）の有意な分解または変性がないこと、を有する液体の水中油乳剤が形成される。

【0125】

本明細書に示される通り、凍結乾燥ワクチン組成物は、熱安定性である。例えば、組成物は、約８℃ないし約６０℃で安定である。そのような組成物は、さらに、適する賦形剤、例えば、バッファー、酸、塩基、糖、希釈剤、保存料などの医薬的に許容し得る賦形剤（担体）を含み得、それらは、当分野で周知であり、本明細書に記載されている。また別の態様では、本発明は、本明細書に記載の熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物の生成方法を提供する。

【0126】

いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物を乳剤に再構成し、その乳剤を対象に投与することを含む、対象の免疫応答を刺激する方法を提供する。いくつかの実施態様では、乳剤は、水中油乳剤である。いくつかの実施態様では、免疫応答は、非特異的免疫応答である。いくつかの実施態様では、免疫応答は、抗原特異的免疫応答である。本明細書に記載の免疫応答を刺激する方法、または、再構成された本明細書に記載の熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物は、単独で、または、他の常套の処置方法（例えば、化学療法剤）と組み合わせて使用できる。

【0127】

いくつかの実施態様では、本明細書における「約」の数値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする変動を含む（かつ、記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。

【0128】

定義
本明細書に記載の本発明の態様および実施態様は、態様および実施態様を「含む」、それらから「なる」およびそれらから「本質的になる」ものを含むことが理解される。

【0129】

「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、家畜、競技用動物、愛玩動物（ネコ、イヌ、ウマなど）、霊長類、マウスおよびラットも含むが、これらに限定されない。

【0130】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形の「ある（a）」、「ある（an）」および「その（the）」は、文脈が明確に否定しない限り、複数への言及を含む。

【0131】

ケーキ形成性賦形剤およびケーキ形成性増量剤は、本明細書において互換的に使用される。ケーキ形成性賦形剤は、液体の安定な水中油乳剤製剤に、凍結乾燥に先立ち添加され、凍結乾燥後にケーキをもたらす物質を表す。凍結乾燥されたケーキを再構成すると、本発明のワクチンを含む薬学的に活性な薬剤の送達に適する安定な乳剤が形成される。本明細書で使用するとき、ケーキ形成性賦形剤は、凍結乾燥されたケーキの再構成時に乳剤を壊さない物質である。

【0132】

本明細書で使用される賦形剤は、製造工程、または、非限定的に凍結乾燥を含む薬学的に活性な薬剤の保管または出荷のための充填仕上げ工程において含まれる、そして、完成した医薬の工程において含まれる、薬学的に活性な薬剤以外の物質を表す。

【0133】

凍結乾燥賦形剤は、本明細書で使用するとき、適するケーキ構造の形態または製剤に貢献する、凍結乾燥工程において含まれる薬学的に活性な薬剤以外の物質を表し得る。凍結乾燥賦形剤は、増量剤、緩衝化剤または可溶化剤を含み得る。

【0134】

一般的な技法
本発明の実施には、特記しない限り、当業者の技能の範囲内にある通常の分子生物学、組換えＤＮＡ、生化学および化学の技法を用いる。そのような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., 米国特許第４,６８３,１９５号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); および in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照されたい。

【0135】

凍結乾燥ワクチン組成物の特徴
本明細書において、抗原および／またはアジュバントを含む熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物が提供される。本発明は、水中油乳剤製剤は、凍結乾燥され、保管され、維持され、約８℃ないし約６０℃の温度に曝されることができ、再構成されると、１つまたはそれ以上を有し得る乳剤を形成すると説明する：（１）クリーム化を示さないこと、（２）生理的な７.４に近い所望のｐＨを維持すること、（３）ほとんど、またはまったく凝集せずに、約２００ｎｍ未満のＺ平均粒径を有する粒子を維持すること、（４）凍結乾燥前の当初の水中油乳剤製剤の約２５％以上の有効成分濃度の損失、または、各有効成分（例えば、抗原、アジュバント）の有意な分解または変性がないこと、および、（５）対象の免疫応答を誘導または刺激するのに適していること。

【0136】

これらの凍結乾燥製剤はケーキ形成性賦形剤を含み、これは、（ａ）マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖との組合せ；（ｂ）トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖；（ｃ）ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖を含む。これらの熱安定性製剤は、この技術に対する改良であり、先進国の多くにおけるコールドチェーン保管の管理の維持の失敗による、年に５０％を越えるワクチン製剤の損失を、有意に低減し得る。コールドチェーン保管の管理は、the Centers for Disease Control, CDC, および the US Federal Drug Agency (UAFDA) により、http://www.vac-stragecdcpDF.pdf で説明されている。さらに、発展途上国の多くの地域で、２５℃より高い外界温度が生じるので、本明細書に記載の熱安定性ワクチン製剤は、２５℃の外界温度より高い温度で保管され、曝され、維持され得る。

【0137】

ある態様では、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物の望ましい熱安定性の特徴は、長期の安定性；短い再構成時間；保管後のケーキの外観が、凍結乾燥直後のケーキの外観と同等に維持されること；溶液の特性、タンパク質の構造または立体構造を含む元の投与形の特徴が、再構成時に維持されること；および、粒径および粒子の分布を含むいくらかの望ましい特徴を、凍結乾燥された組成物が有することである（Frank Kofi Bedu-Addo in Understanding Lyophilization Development. Pharmaceutical Technology）。熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物のさらなる望ましい特徴には、以下を含む特徴の１つまたはそれ以上が含まれ得る：コールドチェーン保管製品に典型的な８℃を越える温度での長期安定性；短い再構成時間；８℃以上での保管、暴露または維持後のケーキの外観が、凍結乾燥直後のケーキの外観と実質的に同様に維持されること；ワクチンの有効成分（有効成分は、抗原の濃度および／または立体構造およびアジュバントの濃度を含むが、これらに限定されない）の元の投与形の特徴が維持され（元の濃度または機能のプラスまたはマイナス２５％）、再構成時に溶液の性質、タンパク質（含まれる場合）の構造または立体構造が維持されること；および、少なくとも約２００ｎｍを超えない、または、約２００ｎｍの平均粒径および粒子の分布。

【0138】

ある実施態様では、熱安定性ケーキは、本明細書で使用するとき、抗原および／またはアジュバントを含むさらなる本発明の有効成分を、適する本発明のケーキ形成性賦形剤の存在下で含み得、保管または輸送中に典型的なコールドチェーン保管温度の２℃−８℃を超える温度で保管または暴露されるときに、ワクチン水中油乳剤の所望の特徴を示す、本発明の水中油安定乳剤（ＳＥ）を、単一バイアルで凍結乾燥することから産生されるケーキを表す。

【0139】

ある実施態様では、熱安定性ワクチンは、本明細書で使用するとき、本発明の熱安定性ケーキ／熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物を再構成することから産生されるワクチン組成物を表す。また、本明細書で使用するとき、熱安定性ワクチンは、熱安定性ワクチンに再構成される安定性凍結乾燥／ケーキ組成物も表し得る。

【0140】

熱安定性の評価
本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物の熱安定性は、凍結乾燥状態で、再構成前に、または、再構成後に評価できる。本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物の熱安定性は、目視検査により、および／または、本明細書で提供される１またはそれ以上のアッセイを利用して、評価できる。これらのアッセイは、凍結乾燥および再構成後の乳剤、抗原および／またはアジュバントの完全性の評価を提供できる。

【0141】

本明細書に記載の熱安定性のアッセイおよび観察は、凍結乾燥時に、凍結乾燥の１時間後に、凍結乾燥の６時間後に、凍結乾燥の１２時間後に、凍結乾燥の２４時間後に、凍結乾燥の３６時間後に、凍結乾燥の４８時間後に、凍結乾燥の１週間後に、凍結乾燥の２週間後に、凍結乾燥の１ヵ月後に、凍結乾燥の２ヵ月後に、凍結乾燥の３ヵ月後に、凍結乾燥の４ヵ月後に、凍結乾燥の６ヵ月後に、凍結乾燥の１２ヵ月後またはそれ以降に実施できる。アッセイおよび観察を実施する前に、凍結乾燥組成物を８℃より高い温度で、例えば、約２５℃以上、約３７℃以上、約５０℃以上、または、約６０℃の温度で、維持、保管または暴露できる。

【0142】

本明細書に記載の熱安定性のアッセイおよび観察は、凍結乾燥組成物の再構成時に、再構成時に即座に、再構成の１時間後に、再構成の６時間後に、再構成の１２時間後に、再構成の２４時間後に、再構成の３６時間後に、再構成の４８時間後に、または、再構成の１週間後に実施できる。再構成の前に、そして、アッセイおよび観察を実施する前に、凍結乾燥組成物を８℃より高い温度で、例えば、約２５℃以上、約３７℃以上、約５０℃以上、または、約６０℃の温度で、維持、保管または暴露できる。

【0143】

当業者は、本発明は、先進国または発展途上国における外界温度により近く接近する温度で保管および／または出荷できる凍結乾燥ワクチン組成物を提供するように設計されており、従って、いくつかの実施態様では、凍結乾燥組成物は、約８℃以上、例えば、約２５℃以上、約３７℃以上、約５０℃以上または約６０℃の温度または複数の温度の組合せで維持、保管、または暴露されることを理解するであろう。

【0144】

いくつかの実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物の熱安定性は、再構成前に目視観察により評価される。他の実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物の熱安定性は、再構成後に、１つまたはそれ以上のアッセイ、例えば、生物物理学的および生化学的アッセイを利用して、評価される。

【0145】

いくつかの実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物の熱安定性は、再構成後に目視観察により評価される。他の実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物の熱安定性は、再構成後に、１つまたはそれ以上のアッセイ、例えば、生物物理学的および生化学的アッセイを利用して、評価される。

【0146】

ある実施態様では、水中油乳剤製剤の凍結乾燥により得られる凍結乾燥ケーキの色と堅さを観察できる。いくつかの実施態様では、本明細書で言及されるケーキは、凍結乾燥過程から生じる多孔性のスポンジ構造様の物質である；または、ケーキは、凍結と乾燥の過程後に残っている固体の内容物である。いくつかの実施態様では、ケーキの外観は、海綿状のケーキ、きれいな（lovely）ケーキおよび美しい（elegant）ケーキと説明できる。いくつかの実施態様では、ケーキの割れ、崩壊（縮みまたはバイアル側面からの剥離、ケーキ上面の沈下またはわずかな凹み、または、ケーキの総体積の減少とも説明できる）、および／または、ケーキの変色または退色または褐変について、目視検査できる。いくつかの実施態様では、ケーキは、美しいケーキ、白色のケーキ、美しい白色のケーキ、海綿状の白色のケーキ、体積が増えた白色のケーキ、褐色のケーキ、褐変しているケーキまたは縮んでいる／縮んだケーキと分類できる。いくつかの実施態様では、退色または褐変は、本明細書で使用するとき、還元糖（例えばラクトースおよびマルトース）を含有する製剤であって、８℃以上の温度、例えば、２５℃、３７℃および／または６０℃でケーキを凍結乾燥および保管した際に、メイラード反応または糖の還元を経て、元のケーキの退色が起こり、視覚的に黄色ないし茶色ないし褐色のケーキになったものを表す。いくつかの実施態様では、凍結乾燥時にケーキが形成されない場合、得られる組成物は、透明なフィルム、厚いフィルム、厚い白色のフィルム、または、凝固した泡状物と特徴づけられる。いくつかの実施態様では、本発明の望ましいケーキは、上記の典型的なコールドチェーン保管の２℃−８℃を超える、または、約８℃以上の温度にケーキを暴露、保管または維持した後に、望ましい凍結乾燥ワクチン製剤の特徴を示すケーキを表す（"Excipients used in lyophilization of small molecules" Ankit Bahetia, Lokesh Kumarb, Arvind K. Bansal, J. Excipients and Food Chem. 1 (1) 2010; 41-54.）。

【0147】

いくつかの実施態様では、凍結乾燥により生じたケーキの融点（Ｔｍ）を測定する。

【0148】

いくつかの実施態様では、凍結乾燥組成物の再構成後に乳剤の粒径を評価する。例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して乳剤の粒径を評価できる。いくつかの実施態様では、これを凍結乾燥前の乳剤の粒径と、例えば凍結乾燥前の液体の安定な乳剤の状態で、比較する。いくつかの実施態様では、乳剤の粒径を凍結乾燥前の粒径と比較しない。本明細書におけるいくつかの実施態様では、粒径は、液体の凍結乾燥組成物のＺ平均粒径（Z-Aved）を測定することにより決定される。特定の実施態様では、約８℃以上の温度で維持、保管または暴露された凍結乾燥組成物を再構成した液体の乳剤が、Ｚ平均粒径約２００ｎＭ未満、約１９０ｎＭ未満、約１８０ｎＭ未満、約１７０ｎＭ未満、約１６０ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１４０ｎＭ未満、約１３０ｎＭ未満、約１２０ｎＭ未満、約１１０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、または約６０ｎｍ未満の粒径を有するとき、熱安定性組成物が示される。特定の実施態様では、再構成された乳剤は、Ｚ平均粒径約１００ｎＭないし約２００ｎＭの範囲の粒径を有する。

【0149】

いくつかの実施態様では、凍結乾燥組成物の再構成後に多分散指数（ＰｄＩ）を評価する。例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用してＰｄＩを評価できる。いくつかの実施態様では、これを凍結乾燥前の液体の乳剤のＰＤＩと、例えば凍結乾燥前の液体の安定な乳剤の状態で、比較する。

【0150】

ある実施態様では、凍結乾燥組成物の再構成後にゼータ電位を評価する。例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用してゼータ電位を評価できる。いくつかの実施態様では、これを凍結乾燥前のゼータ電位と、例えば凍結乾燥前の液体の安定な乳剤の状態で、比較する。

【0151】

いくつかの実施態様では、凍結乾燥組成物の再構成後に乳剤のｐＨを評価する。いくつかの実施態様では、これを凍結乾燥前のｐＨと、例えば凍結乾燥前の液体の安定な乳剤の状態で、比較する。

【0152】

いくつかの実施態様では、凍結乾燥組成物の再構成後に乳剤のクリーム化を評価する。

【0153】

いくつかの実施態様では、凍結乾燥組成物の再構成時に、抗原、アジュバントおよび／または凍結乾燥組成物の他の成分の％変質または％破壊を評価する。いくつかの実施態様では、成分の化学的分解があれば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して評価する。ある例示的な実施態様では、スクアレン、ＤＭＰＣおよびＧＬＡの化学的分解をＲＰ−ＨＰＬＣにより監視する。他の実施態様では、再構成時に、凍結乾燥組成物のワクチンのタンパク質抗原の分解があれば、ゲルをベースとするクマシー染色を使用して評価する。本明細書で提供される熱安定性組成物は、約８℃以上の温度で維持された熱安定性凍結乾燥組成物の再構成後に、約２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の抗原および／またはアジュバントまたは他の成分の分解、損失または破壊を示すものである。

【0154】

熱安定性の特徴
ある態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約８℃以上で熱安定性である。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約９℃以上、約１０℃以上、約１１℃以上、約１２℃以上、約１３℃以上、約１４℃以上、約１５℃以上、約１６℃以上、約１７℃以上、約１８℃以上、約１９℃以上、約２０℃以上、約２５℃以上、約３０℃以上、約３２℃以上、約３５℃以上、約３７℃以上、約４０℃以上、約４２℃以上、約４５℃以上、約５０℃以上、約６０℃以上で熱安定性である。他の実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約８℃ないし約２５℃、約２５℃ないし約３７℃、約３７℃ないし約５０℃、約２５℃ないし約５０℃、約８℃ないし約３７℃、約８℃ないし約５０℃、約８℃ないし約６０℃で熱安定性である。ある例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約２５℃で熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約３７℃で熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約５０℃で熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約６０℃で熱安定性である。

【0155】

いくつかの実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約８℃以上で、少なくとも１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも７ヵ月間、少なくとも８ヵ月間、少なくとも９ヵ月間、少なくとも１０ヵ月間、少なくとも１１ヵ月間、少なくとも１年間、少なくとも１.５年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、および、少なくとも５年間、熱安定性である。ある例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約８℃以上で熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約８℃以上で、少なくとも３ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約８℃以上で、少なくとも６ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約８℃以上で、少なくとも１２ヵ月間熱安定性である。ある実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約８℃以上で無期限に熱安定性である。

【0156】

いくつかの実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約２５℃以上で、少なくとも１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも７ヵ月間、少なくとも８ヵ月間、少なくとも９ヵ月間、少なくとも１０ヵ月間、少なくとも１１ヵ月間、少なくとも１年間、少なくとも１.５年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、および、少なくとも５年間、熱安定性である。ある例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、２５℃より高い温度で、少なくとも１ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、２５℃より高い温度で、少なくとも３ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、２５℃より高い温度で、少なくとも６ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、２５℃より高い温度で、少なくとも１２ヵ月間熱安定性である。ある実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、２５℃より高い温度で、無期限に熱安定性である。

【0157】

いくつかの実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約３７℃以上で、少なくとも１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも７ヵ月間、少なくとも８ヵ月間、少なくとも９ヵ月間、少なくとも１０ヵ月間、少なくとも１１ヵ月間、少なくとも１年間、少なくとも１.５年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、および、少なくとも５年間、熱安定性である。ある例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、３７℃より高い温度で、少なくとも１ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、３７℃より高い温度で、少なくとも３ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、３７℃より高い温度で、少なくとも６ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、３７℃より高い温度で、少なくとも１２ヵ月間熱安定性である。ある実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、３７℃より高い温度で、無期限に熱安定性である。

【0158】

いくつかの実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、約５０℃以上で、少なくとも１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも７ヵ月間、少なくとも８ヵ月間、少なくとも９ヵ月間、少なくとも１０ヵ月間、少なくとも１１ヵ月間、少なくとも１年間、少なくとも１.５年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、および、少なくとも５年間、熱安定性である。ある例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、５０℃より高い温度で、少なくとも１ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、５０℃より高い温度で、少なくとも３ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、５０℃より高い温度で、少なくとも６ヵ月間熱安定性である。他の例示的な実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、５０℃より高い温度で、少なくとも１２ヵ月間熱安定性である。ある実施態様では、本明細書で提供される凍結乾燥ワクチン組成物は、５０℃より高い温度で、無期限に熱安定性である。

【0159】

熱安定性ワクチン組成物において使用するための賦形剤および物質
抗原および／またはアジュバントを含む熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、ケーキ形成性賦形剤、ケーキ形成性増量剤、緩衝化剤、可溶化剤、等張化剤、界面活性剤および／または乳化剤などのさらなる物質および／または賦形剤を含む。

【0160】

賦形剤
本発明の賦形剤は、単一で、または、ケーキ形成性賦形剤、ケーキ形成性増量剤、増量剤、緩衝化剤、可溶化剤、等張化剤、浸透圧調節剤（tonicifying agent）、界面活性剤、乳化剤、抗菌剤および／または崩壊温度調節剤（collapse temperature modifier）を含むがこれらに限定されない他の賦形剤と組み合わせて、使用し得る。

【0161】

いくつかの実施態様では、賦形剤は、製造工程、または、非限定的に凍結乾燥を含む薬学的に活性な薬剤の保管または出荷のための充填仕上げ工程において含まれる、そして、完成した医薬の工程において含まれる、薬学的に活性な薬剤以外の物質である。

【0162】

いくつかの実施態様では、賦形剤は、凍結乾燥後にケーキをもたらす、凍結乾燥前の液体の安定な水中油乳剤製剤に添加される物質である。

【0163】

ワクチン製剤および／または凍結乾燥に適する賦形剤は、当分野で知られており（例えば、Bahetia et. al., 2010: J. Excipients and Food Chem.:1 (1)41-54, Grabenstein JD. ImmunoFacts: Vaccines and Immunologic Drugs - 2012 (37th revision). St Louis, MO: Wolters Kluwer Health, 2011 and, by Vaccine 参照）、ケーキ形成性賦形剤、ケーキ形成性増量剤、増量剤、緩衝化剤、可溶化剤、等張化剤、浸透圧調節剤、界面活性剤、乳化剤、抗菌剤、および／または、崩壊温度調節剤を含む。現在承認されているワクチンにおける賦形剤のリストを、the Centers for Disease Control から見出すことができ（インターネットで cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/downloads/appendices/B/excipient-table-2.pdf., September 2013, "Vaccine Excipient & Media Summary. Excipients Included in U.S. Vaccines, by Vaccine" を参照）、それは、スクロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、デキストロース、リン酸カリウム、プラスドンＣ（plaＳＤone C）、無水ラクトース、微結晶セルロース、ポラクリリン（polacrilin）カリウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロースアセテートフタレート、アルコール、アセトン、ヒマシ油、ＦＤ＆Ｃ黄色＃６アルミニウムレーキ色素、ヒト血清アルブミン、ウシ胎児血清、重炭酸ナトリウム、ヒト−二倍体線維芽細胞培養物（ＷＩ−３８）、ダルベッコ改変イーグル培地、水酸化アルミニウム、塩化ベンゼトニウム、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、グリセリン、アスパラギン、クエン酸、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸鉄アンモニウム、ラクトース、硫酸アルミニウムカリウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、ペプトン、ウシ抽出物、チメロサール（痕跡量）、変法ミューラーおよびミラー培地、ベータ−プロピオラクトン、チメロサール（多回投与バイアルのみ）、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸カリウム、塩化カリウム、グルタミン酸カリウム、塩化カルシウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、硫酸ネオマイシン、ポリミキシンＢ、卵タンパク質、ラクトアルブミン加水分解物および硫酸ネオマイシンを、非限定的に含む。

【0164】

ケーキ形成性賦形剤／ケーキ形成性増量剤
いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、凍結乾燥後にケーキをもたらす、凍結乾燥前の液体の安定な水中油乳剤製剤に添加される物質である。凍結乾燥されたケーキの再構成時に、本発明のワクチンを含む薬学的に活性な薬剤の送達に適する水中油安定乳剤が形成される。

【0165】

いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、ケーキの再構成時に乳剤を壊さない物質である。

【0166】

いくつかの実施態様では、本発明のためのケーキ形成性賦形剤（増量剤とも呼ばれる）として有用な物質は、糖質／糖、または、糖アルコールと組み合わせた糖質／糖を含む。本明細書に開示されるいくつかの実施態様では、糖質／糖、または、糖アルコールと組み合わせた糖質／糖は、増量剤またはケーキ形成性賦形剤として有用である。これは、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、スタキオース、フルクトース、ラクツロース、グルコース、および、場合によりグリセロール、ソルビトール、および／またはマンニトールを含むが、これらに限定されない。

【0167】

いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、マンニトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、スタキオース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖の組合せである。

【0168】

いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、ソルビトールと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、スタキオース、フルクトースおよびラクツロースからなる群から選択される糖の組合せである。

【0169】

いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、トレハロース、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である。

【0170】

いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、ラクトース、ラフィノースおよびラクツロースからなる群から選択される糖である。

【0171】

いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、グリセロールの非存在下の、糖、または、糖アルコールと組み合わせた糖である。他の実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、約１％ｗ／ｖ未満のグリセロール、約０.５％未満のグリセロール、または、約０.１％未満のグリセロールの存在下の、糖、または、糖アルコールと組み合わせた糖である。

【0172】

いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は糖であり、糖は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約０.０１％ｗ／ｖないし約２０％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖの濃度範囲で、または、約５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖの濃度範囲で存在する。いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約５％ｗ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、約０.０１％ｗ／ｖ、約０.０２％ｗ／ｖ、約０.０３％ｗ／ｖ、約０.０４％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖ、約０.０６％ｗ／ｖ、約０.０７％ｗ／ｖ、約０.０８％ｗ／ｖ、約０.０９％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖ、約０.２％ｗ／ｖ、約０.３％ｗ／ｖ、約０.４％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖ、約０.６％ｗ／ｖ、約０.７％ｗ／ｖ、約０.８％ｗ／ｖ、約０.９％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約３％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖ、約６％ｗ／ｖ、約７％ｗ／ｖ、約７.５％ｗ／ｖ、約８％ｗ／ｖ、約９％ｗ／ｖ、約１０％ｗ／ｖ、約１１％ｗ／ｖ、約１２％ｗ／ｖ、約１３％ｗ／ｖ、約１４％ｗ／ｖ、約１５％ｗ／ｖ、約１６％ｗ／ｖ、約１７％ｗ／ｖ、約１８％ｗ／ｖ、約１９％ｗ／ｖ、または約２０％ｗ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、約１％ｗ／ｖ未満のグリセロール、約０.５％未満のグリセロール、約０.１％未満のグリセロールの存在下で提供されるか、または、グリセロールの非存在下で提供される（％グリセロールは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中のグリセロール濃度を表す）。

【0173】

いくつかの例示的な実施態様では、ケーキ形成性賦形剤はトレハロースであり、トレハロースは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約０.０１％ｗ／ｖないし約２０％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖの濃度範囲で、または、約５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖの濃度範囲で存在する。いくつかの実施態様では、トレハロースは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約５％ｗ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、トレハロースは、約０.０１％ｗ／ｖ、約０.０２％ｗ／ｖ、約０.０３％ｗ／ｖ、約０.０４％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖ、約０.０６％ｗ／ｖ、約０.０７％ｗ／ｖ、約０.０８％ｗ／ｖ、約０.０９％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖ、約０.２％ｗ／ｖ、約０.３％ｗ／ｖ、約０.４％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖ、約０.６％ｗ／ｖ、約０.７％ｗ／ｖ、約０.８％ｗ／ｖ、約０.９％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約３％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖ、約６％ｗ／ｖ、約７％ｗ／ｖ、約７.５％ｗ／ｖ、約８％ｗ／ｖ、約９％ｗ／ｖ、約１０％ｗ／ｖ、約１１％ｗ／ｖ、約１２％ｗ／ｖ、約１３％ｗ／ｖ、約１４％ｗ／ｖ、約１５％ｗ／ｖ、約１６％ｗ／ｖ、約１７％ｗ／ｖ、約１８％ｗ／ｖ、約１９％ｗ／ｖ、または約２０％ｗ／ｖの濃度で存在する。ケーキ形成性賦形剤がトレハロースであるいくつかの実施態様では、トレハロースは、約１％ｗ／ｖ未満のグリセロール、約０.５％未満のグリセロール、約０.１％未満のグリセロールの存在下で提供されるか、または、グリセロールの非存在下で提供される（％グリセロールは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中のグリセロール濃度を表す）。

【0174】

いくつかの例示的な実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、糖アルコールと組み合わせた糖である。そのような実施態様では、糖は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約０.０１％ｗ／ｖないし約２０％ｗ／ｖの濃度範囲で存在し、糖アルコールは、約０.０１％ｗ／ｖないし約２０％ｗ／ｖの濃度範囲で存在する。いくつかの実施態様では、糖は、糖アルコールと組み合わされて存在し、糖は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約０.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖの濃度範囲で、または、約５％ｗ／ｖで存在し、糖アルコールは、約０.０１％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約０.１％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約０.０５％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約０.１％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖの濃度範囲で、または、約０.１％ｗ／ｖで存在する。いくつかの実施態様では、糖は、糖アルコールと組み合わされて存在し、ここで、糖は、約０.０１％ｗ／ｖ、約０.０２％ｗ／ｖ、約０.０３％ｗ／ｖ、約０.０４％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖ、約０.０６％ｗ／ｖ、約０.０７％ｗ／ｖ、約０.０８％ｗ／ｖ、約０.０９％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖ、約０.２％ｗ／ｖ、約０.３％ｗ／ｖ、約０.４％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖ、約０.６％ｗ／ｖ、約０.７％ｗ／ｖ、約０.８％ｗ／ｖ、約０.９％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約３％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖ、約６％ｗ／ｖ、約７％ｗ／ｖ、約７.５％ｗ／ｖ、約８％ｗ／ｖ、約９％ｗ／ｖ、約１０％ｗ／ｖ、約１１％ｗ／ｖ、約１２％ｗ／ｖ、約１３％ｗ／ｖ、約１４％ｗ／ｖ、約１５％ｗ／ｖ、約１６％ｗ／ｖ、約１７％ｗ／ｖ、約１８％ｗ／ｖ、約１９％ｗ／ｖ、または約２０％ｗ／ｖの濃度で存在し、糖アルコールは、約０.０１％ｗ／ｖ、約０.０２％ｗ／ｖ、約０.０３％ｗ／ｖ、約０.０４％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖ、約０.０６％ｗ／ｖ、約０.０７％ｗ／ｖ、約０.０８％ｗ／ｖ、約０.０９％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖ、約０.２％ｗ／ｖ、約０.３％ｗ／ｖ、約０.４％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖ、約０.６％ｗ／ｖ、約０.７％ｗ／ｖ、約０.８％ｗ／ｖ、約０.９％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約１.５％、約２％ｗ／ｖ、約２.５％、約３％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖ、約６％ｗ／ｖ、約７％ｗ／ｖ、約７.５％ｗ／ｖ、約８％ｗ／ｖ、約９％ｗ／ｖ、約１０％ｗ／ｖ、約１１％ｗ／ｖ、約１２％ｗ／ｖ、約１３％ｗ／ｖ、約１４％ｗ／ｖ、約１５％ｗ／ｖ、約１６％ｗ／ｖ、約１７％ｗ／ｖ、約１８％ｗ／ｖ、約１９％ｗ／ｖ、または約２０％ｗ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、糖アルコールと組み合わせた糖は、約１％ｗ／ｖ未満のグリセロール、約０.５％未満のグリセロール、約０.１％未満のグリセロールの存在下で提供されるか、または、グリセロールの非存在下で提供される（％グリセロールは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中のグリセロール濃度を表す）。

【0175】

いくつかの例示的な実施態様では、ケーキ形成性賦形剤は、マンニトールと組み合わせたトレハロースである。そのような実施態様では、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中のトレハロースは、約０.０１％ｗ／ｖないし約２０％ｗ／ｖの濃度範囲で存在し、マンニトールは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に約０.０１％ｗ／ｖないし約２０％ｗ／ｖの濃度範囲で存在する。いくつかの実施態様では、トレハロースは、マンニトールと組み合わされて存在し、トレハロースは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約０.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約２.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖの濃度範囲で、または、約５％ｗ／ｖで存在し、マンニトールは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約０.０１％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約０.１％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖないし約０.０５％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖないし約０.１％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖないし約１％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約１０％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約７.５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖないし約２.５％ｗ／ｖの濃度範囲で、または、約０.１％ｗ／ｖで存在する。いくつかの実施態様では、トレハロースは、マンニトールと組み合わされて存在し、ここで、トレハロースは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約０.０１％ｗ／ｖ、約０.０２％ｗ／ｖ、約０.０３％ｗ／ｖ、約０.０４％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖ、約０.０６％ｗ／ｖ、約０.０７％ｗ／ｖ、約０.０８％ｗ／ｖ、約０.０９％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖ、約０.２％ｗ／ｖ、約０.３％ｗ／ｖ、約０.４％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖ、約０.６％ｗ／ｖ、約０.７％ｗ／ｖ、約０.８％ｗ／ｖ、約０.９％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約３％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖ、約６％ｗ／ｖ、約７％ｗ／ｖ、約７.５％ｗ／ｖ、約８％ｗ／ｖ、約９％ｗ／ｖ、約１０％ｗ／ｖ、約１１％ｗ／ｖ、約１２％ｗ／ｖ、約１３％ｗ／ｖ、約１４％ｗ／ｖ、約１５％ｗ／ｖ、約１６％ｗ／ｖ、約１７％ｗ／ｖ、約１８％ｗ／ｖ、約１９％ｗ／ｖ、または約２０％ｗ／ｖの濃度で存在し、マンニトールは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約０.０１％ｗ／ｖ、約０.０２％ｗ／ｖ、約０.０３％ｗ／ｖ、約０.０４％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖ、約０.０６％ｗ／ｖ、約０.０７％ｗ／ｖ、約０.０８％ｗ／ｖ、約０.０９％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖ、約０.２％ｗ／ｖ、約０.３％ｗ／ｖ、約０.４％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖ、約０.６％ｗ／ｖ、約０.７％ｗ／ｖ、約０.８％ｗ／ｖ、約０.９％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約１.５％、約２％ｗ／ｖ、約２.５％、約３％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖ、約６％ｗ／ｖ、約７％ｗ／ｖ、約７.５％ｗ／ｖ、約８％ｗ／ｖ、約９％ｗ／ｖ、約１０％ｗ／ｖ、約１１％ｗ／ｖ、約１２％ｗ／ｖ、約１３％ｗ／ｖ、約１４％ｗ／ｖ、約１５％ｗ／ｖ、約１６％ｗ／ｖ、約１７％ｗ／ｖ、約１８％ｗ／ｖ、約１９％ｗ／ｖ、または約２０％ｗ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、マンニトールと組み合わせたトレハロースは、約１％ｗ／ｖ未満のグリセロール、約０.５％未満のグリセロール、約０.１％未満のグリセロールの存在下で提供されるか、または、グリセロールの非存在下で提供される（％グリセロールは、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中のグリセロール濃度を表す）。

【0176】

他の実施態様では、本発明のためのケーキ形成性賦形剤として有用な物質は、任意のアミノ酸を含む。本発明において増量剤として例示的なアミノ酸は、純粋な分子としての、または製剤化された、アルギニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、メチオニン、システイン、プロリンおよびヒスチジンを、単独で、または組み合わせて、含む。

【0177】

他の実施態様では、増量剤は、デキストランおよびポリエチレングリコールなどのポリマーを含む。

【0178】

緩衝化剤
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、緩衝化剤を含む。本発明における賦形剤として有用な緩衝化剤には、トリス酢酸、トリス塩基、トリス塩酸、リン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酒石酸、リン酸ナトリウム、塩化亜鉛、アルギニン、およびヒスチジンが含まれる。いくつかの実施態様では、緩衝化剤には、塩酸、水酸化ナトリウム、およびメグルミンなどのｐＨ調節剤が含まれる。

【0179】

可溶化剤
いくつかの実施態様では、適する可溶化剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、アルファシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）などの錯体形成性の賦形剤が含まれる。界面活性剤は、また、ポリソルベート８０およびツイーンなどの可溶化性の賦形剤としても含まれ得る。他の可溶化剤として当分野で知られている共溶媒も使用し得、それには、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、イソプロピルアルコール、ジクロロメタン、エタノールおよびアセトンが含まれる。

【0180】

本発明における賦形剤として使用するための浸透圧調節剤には、グリセロール、塩化ナトリウム、スクロース、マンニトールおよびデキストロースが含まれる。崩壊温度調節剤には、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、フィコールおよびゼラチンが含まれる。抗菌剤には、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、エチルパラベン、チメロサールが含まれる。

【0181】

等張化剤
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、等張化剤を含む。いくつかの実施態様では、等張化剤はグリセロールである。ある特定の実施態様では、等張化剤は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中または再構成時の水中油乳剤中に、約０.３６％ｖ／ｖの濃度で存在する。

【0182】

界面活性剤
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、界面活性剤を含む。いくつかの実施態様では、界面活性剤はプルロニックＦ６８である。いくつかの実施態様では、界面活性剤は、約１００：１（油：界面活性剤）の割合で存在する。いくつかの実施態様では、界面活性剤は、約０.０１８％ｗ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、界面活性剤は、約０.０００１％ｗ／ｖ、約０.０００５％ｗ／ｖ、約０.００１％ｗ／ｖ、約０.００５％ｗ／ｖ、約０.０１％ｗ／ｖ、約０.０１１％ｗ／ｖ、約０.０１２％ｗ／ｖ、約０.０１３％ｗ／ｖ、約０.０１４％ｗ／ｖ、約０.０１５％ｗ／ｖ、約０.０１６％ｗ／ｖ、約０.０１７％ｗ／ｖ、約０.０１８％ｗ／ｖ、約０.０１９％ｗ／ｖ、約０.０２％ｗ／ｖ、約０.０３％ｗ／ｖ、約０.０４％ｗ／ｖ、約０.０５％ｗ／ｖ、約０.０６％ｗ／ｖ、約０.０７％ｗ／ｖ、約０.０８％ｗ／ｖ、約０.０９％ｗ／ｖ、約０.１％ｗ／ｖ、約０.２％ｗ／ｖ、約０.３％ｗ／ｖ、約０.４％ｗ／ｖ、約０.５％ｗ／ｖ、約０.６％ｗ／ｖ、約０.７％ｗ／ｖ、約０.８％ｗ／ｖ、約０.９％ｗ／ｖ、または約１％ｗ／ｖの濃度で存在する。本明細書に記載の百分率および割合は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤または再構成時の水中油乳剤における割合および百分率を表す。

【0183】

乳化剤
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、乳化剤を含む。いくつかの実施態様では、乳化剤は、１、２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。いくつかの実施態様では、乳化剤はレシチンである。いくつかの実施態様では、乳化剤は、約１：５（乳化剤：油）の割合で存在する。いくつかの実施態様では、乳化剤は、約０.３８％ｗ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、乳化剤は、約０.００２％ｗ／ｖ、約０.００５％ｗ／ｖ、約０.０１０％ｗ／ｖ、約０.０１５％ｗ／ｖ、約０.０２０％ｗ／ｖ、約０.０２５％ｗ／ｖ、約０.０３０％ｗ／ｖ、約０.０３５％ｗ／ｖ、約０.０４０％ｗ／ｖ、約０.０４５％ｗ／ｖ、約０.０５０％ｗ／ｖ、約０.０５５％ｗ／ｖ、約０.０６０％ｗ／ｖ、約０.０６５％ｗ／ｖ、約０.０７０％ｗ／ｖ、約０.０７５％ｗ／ｖ、約０.０８０％ｗ／ｖ、約０.０８５％ｗ／ｖ、約０.０９０％ｗ／ｖ、約０.０９５％ｗ／ｖ、約０.１０％ｗ／ｖ、約０.１５％ｗ／ｖ、約０.２０％ｗ／ｖ、約０.２５％ｗ／ｖ、約０.３０％ｗ／ｖ、約０.３５％ｗ／ｖ、約０.４０％ｗ／ｖ、約０.４５％ｗ／ｖ、約０.５０％ｗ／ｖ、約０.５５％ｗ／ｖ、約０.６０％ｗ／ｖ、約０.６５％ｗ／ｖ、約０.７０％ｗ／ｖ、約０.７５％ｗ／ｖ、約０.８０％ｗ／ｖ、約０.８５％ｗ／ｖ、約０.９０％ｗ／ｖ、約０.９５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約３％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖ、約６％ｗ／ｖ、約７％ｗ／ｖ、約７.５％ｗ／ｖ、約８％ｗ／ｖ、約９％ｗ／ｖ、または、約１０％ｗ／ｖの濃度で存在する。本明細書に記載の百分率および割合は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤または再構成時の水中油乳剤における割合および百分率を表す。

【0184】

熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物において使用するためのアジュバント
本明細書で提供される発明のいくつかの態様では、本明細書に記載の組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン）は、アジュバントを含む。いくつかの実施態様では、アジュバントは、単独で、例えば、治療剤の使用のために提供される。他の実施態様では、アジュバントは、抗原と組み合わせて提供される。免疫応答を改変する組成物において使用するためのアジュバントは、当分野で周知である。例えば、本明細書に記載の組成物において使用するためのアジュバントは、免疫賦活性アジュバント、送達アジュバント、無機アジュバントまたは有機アジュバントの１種またはそれ以上を含み得る。本明細書に記載の組成物において使用するためのアジュバントの非限定的な例は、とりわけ、Barouch D.H., 2008, Nature, 455(7213):613-9; Morrow et al., 2008, AIDS, 22(3):333-8; および McGeary et al., 2003, Peptide Sci., 9(7):405-18l に見出され得る。

【0185】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン）において使用されるアジュバントは、免疫賦活性アジュバントである。免疫賦活性アジュバントは、例えば、サイトカイン、ＴＬＲリガンドまたは微生物の毒素などの、免疫系に対して直接作用するアジュバントであり得る。本明細書におけるいくつかの実施態様では、アジュバントは、サイトカインアジュバントである。１種またはそれ以上のサイトカインが、本明細書に記載の組成物において、単独のアジュバントとして、または、１種またはそれ以上のさらなるアジュバントと組み合わせて、好適であり得る。適するサイトカインには、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ）、ケモカイン、コロニー刺激因子、または、腫瘍壊死因子が含まれる。いくつかの実施態様では、インターフェロンは、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩ型ＩＦＮまたはＩＩＩ型ＩＦＮである。いくつかの実施態様では、インターフェロンは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、または、ＩＦＮ−λ、および、これらからのサブタイプ（例えば、ＩＦＮ−λ、ＩＦＮ−λ２およびＩＦＮ−λ３）である。いくつかの実施態様では、サイトカインは、インターロイキンである。本明細書に記載の組成物におけるアジュバントとして使用できるインターロイキンの非限定的な例には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５およびＩＬ−３６が含まれる。いくつかの実施態様では、サイトカインはケモカインである。いくつかの実施態様では、ケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカインである。本明細書に記載の組成物におけるアジュバントとして使用できるＣＣケモカインの非限定的な例には、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、およびＣＣＬ２８が含まれる。本明細書に記載の組成物におけるアジュバントとして使用できるＣＸＣケモカインの非限定的な例には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、およびＣＸＣＬ１７が含まれる。いくつかの実施態様では、サイトカインはコロニー刺激因子である。いくつかの実施態様では、コロニー刺激因子は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）である。いくつかの実施態様では、サイトカインは、腫瘍壊死因子である。本明細書に記載の組成物におけるアジュバントとして使用できる腫瘍壊死因子ファミリータンパク質の非限定的な例には、ＴＮＦ−αおよび４−１ＢＢＬが含まれる。

【0186】

いくつかの実施態様では、免疫賦活性アジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド（例えば、ＴＬＲアゴニスト）である。１種またはそれ以上のＴＬＲリガンドが、本明細書に記載の組成物において、単独のアジュバントとして、または、１種またはそれ以上のさらなるアジュバントと組み合わせて、好適であり得る。ＴＬＲは、多数の感染性病原体の内部または表面に存在し得るものなどの様々な保存された微生物の分子構造について宿主細胞に早期の認識能力を与える、自然免疫系の細胞表面膜貫通型受容体を含む（例えば、Armant et al., 2002 Genome Biol. 3(8):reviews3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996 Science 272:50; Medzhitov et al., 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol. 14:129; Lien et al. 2003 Nat. Immunol. 4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda et al., 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda et al. 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho et al., 2004 Microbes Infect. 6:1388; Datta et al., 2003 J. Immunol. 170:4102）。

【0187】

自然免疫系を介する免疫反応の開始を強化するＴＬＲに媒介されるシグナル伝達の誘導は、細胞表面のＴＬＲに結合するＴＬＲアゴニスト（即ち、ＴＬＲリガンド）により実行され得る。例えば、リポ多糖類（ＬＰＳ）は、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４を介するＴＬＲアゴニストであり得る（Tsan et al., 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Physiol. 286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206)；ポリ（イノシン−シチジン）（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）は、ＴＬＲ３を介するＴＬＲアゴニストであり得る（Salem et al., 2006 Vaccine 24:5119）；ＣｐＧ配列（非メチル化シトシン−グアノシンを含有するオリゴデオキシヌクレオチドまたは「ＣｐＧ」ジヌクレオチドモチーフ、例えば、ＣｐＧ７９０９、Cooper et al., 2005 AIDS 19:1473；ＣｐＧ１０１０１、Bayes et al. Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer et al. Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer et al., 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48:2314; Deng et al., 2004 J. Immunol. 173:5148）は、ＴＬＲ９を介するＴＬＲアゴニストであり得る（Andaloussi et a., 2006 Glia 54:526; Chen et al., 2006 J. Immunol. 177:2373）；ペプチドグリカンは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ６アゴニストであり得る（Soboll et al., 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol. 174:1566）；３Ｍ００３（４−アミノ−２−（エトキシメチル）−α,α−ジメチル−６,７,８,９−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４,５−ｃ］キノリン−１−エタノール水和物、分子量３１８Ｄａ、3M Pharmaceuticals, St. Paul, MNより、関連化合物３Ｍ００１および３Ｍ００２の供給源でもある；Gorden et al., 2005 J. Immunol. 174:1259）は、ＴＬＲ７アゴニスト（Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591）および／またはＴＬＲ８アゴニスト（Johansen 2005）であり得る；フラゲリンは、ＴＬＲ５アゴニストであり得る（Feuillet et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487）；プロフィリンは、ＴＬＲ１１アゴニストであり得る（Hedhli et al., 2009, Vaccine, 27(16):2274-87）；リポペプチドは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ６アゴニストであり得る（Gao et al., 2013, Vaccine, 31(26):2796-803）；そして、Ｃ型肝炎抗原は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ９を介してＴＬＲアゴニストとして作用し得る（Lee et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans et al., 2005 Hepatol. 42:724）。他のＴＬＲアゴニストが知られており（例えば、Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol. 171:5198）、本明細書に記載の実施態様のいずれかに従って使用し得る。

【0188】

例えば、そして背景として（例えば、米国特許第６,５４４,５１８号参照）、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（「ＣｐＧ」）を含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、全身および粘膜の経路で投与されると、アジュバントであると知られている（ＷＯ９６／０２５５５、ＥＰ４６８５２０、Davis et al., J. Immunol, 1998. 160(2):870-876; McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6）。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略号である。免疫刺激におけるＣＧモチーフの中心的役割は、Krieg, Nature 374, p546 1995 により解明された。詳細な分析は、ＣＧモチーフはある種の配列の文脈中に存在しなければならず、そのような配列は細菌のＤＮＡ中で一般的であるが、脊椎動物のＤＮＡにはまれであることを示した。免疫賦活性配列は、しばしば、プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジンであるが（ここで、ジヌクレオチドＣＧモチーフはメチル化されていない）、他の非メチル化ＣｐＧ配列が免疫賦活性であると知られており、本発明のある種の実施態様で使用され得る。ＣｐＧは、ワクチンに製剤化されるとき、遊離溶液中で遊離抗原と共に投与され得るか（ＷＯ９６／０２５５５；McCluskie and Davis, 前出）、または、抗原に共有結合するか（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１６２４７）、または、水酸化アルミニウムなどの担体と共に製剤化される（例えば、Davis et al. 前出, Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8）。

【0189】

いくつかの実施態様では、本発明のアジュバントとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、少なくとも３個、より好ましくは少なくとも６個またはそれ以上のヌクレオチドで隔てられている２個またはそれ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間はホスホロジチオエート、または、より好ましくはホスホロチオエート結合であるが、雑多なヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを含め、ホスホジエステルおよび他のヌクレオチド間結合が本発明の範囲内にある。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートの製造方法は、米国特許第５,６６６,１５３号、第５,２７８,３０２号およびＷＯ９５／２６２０４に記載されている。

【0190】

好ましいオリゴヌクレオチドの例は、以下の刊行物に開示される配列を有する；本明細書で開示されるある種の実施態様について、配列は、好ましくはホスホロチオエートで改変されたヌクレオチド間結合を含む：（１）ＣＰＧ７９０９: Cooper et al., "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults." AIDS, 2005 Sep 23;19（14）:1473-9；（２）ＣｐＧ１０１０１: Bayes et al., "Gateways to clinical trials." Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 2005 Apr;27(3):193-219; および（３）Vollmer J., "Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9." Expert Opinion on Biological Therapy. 2005 May; 5(5): 673-682。

【0191】

代替的なＣｐＧオリゴヌクレオチドは、上記の刊行物に記載の好ましい配列の変異体を含み得、それは、重要ではないヌクレオチド配列の置換、挿入、欠失および／または付加を有する点で異なる。本発明のある種の実施態様で利用されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当分野で知られるいかなる方法により合成してもよい（例えば、ＥＰ４６８５２０）。好都合には、そのようなオリゴヌクレオチドは、自動合成機を利用して合成し得る。オリゴヌクレオチドは、典型的には、デオキシヌクレオチドである。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート、または、より好ましくはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステルも本発明で企図する実施態様の範囲内にある。異なるヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドも企図され、例えば、ホスホロチオエートとホスホジエステルの混合である。オリゴヌクレオチドを安定化する他のヌクレオチド間結合も使用し得る。

【0192】

ある種の実施態様では、アジュバントはＴＬＲ４アゴニストである。いくつかの実施態様では、本発明の組成物で使用されるＴＬＲ４アゴニストは、米国特許出願公開第２００７／０２１０１７号、第２００９／０４５０３３号、第２０１０／０３７４６６号および第２０１０／０３１０６０２号明細書（これらの全体を引用により本明細書の一部とする）に記載されているものなどの、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）を含む。

【0193】

例えば、ある種の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：

【化3】

［式中、
Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｌ_５およびＬ_６は、同一であるかまたは異なり、独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または−（ＣＨ_２）−であり；
Ｌ_７、Ｌ_８、Ｌ_９およびＬ_１０は、同一であるかまたは異なり、独立して、存在しないか、または、−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｙ_１は酸の官能基であり；
Ｙ_２およびＹ_３は、同一であるかまたは異なり、独立して、−ＯＨ、−ＳＨまたは酸の官能基であり；
Ｙ_４は、−ＯＨまたは−ＳＨであり；
Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_５およびＲ_６は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｃ_８−１３アルキルであり；そして、
Ｒ_２およびＲ_４は、同一であるかまたは異なり、独立して、Ｃ_６−１１アルキルである］
を有する合成ＧＬＡアジュバントまたはその医薬的に許容し得る塩である。

【0194】

合成ＧＬＡ構造のいくつかの実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｃ_１０アルキルであり；そして、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_８アルキルである。ある種の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｃ_１１アルキルであり；そして、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_９アルキルである。

【0195】

例えば、ある種の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：

【化4】

を有する合成ＧＬＡアジュバントである。

【0196】

特定の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｃ_１１−Ｃ_２０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_１２−Ｃ_２０アルキルである。

【0197】

別の特定の実施態様では、ＧＬＡは、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６がＣ_１１アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４がＣ_１３アルキルである、上記の式を有する。

【0198】

別の特定の実施態様では、ＧＬＡは、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６がＣ_１０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４がＣ_８アルキルである、上記の式を有する。

【0199】

別の特定の実施態様では、ＧＬＡは、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６がＣ_１１−Ｃ_２０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４がＣ_９−Ｃ_２０アルキルである、上記の式を有する。ある種の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６はＣ_１１アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４はＣ_９アルキルである。

【0200】

ある種の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：

【化5】

を有する合成ＧＬＡアジュバントである。

【0201】

上記のＧＬＡ構造のある種の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６はＣ_１１−Ｃ_２０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４はＣ_９−Ｃ_２０アルキルである。ある種の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６はＣ_１１アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４はＣ_９アルキルである。

【0202】

ある種の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：

【化6】

を有する合成ＧＬＡアジュバントである。

【0203】

上記のＧＬＡ構造のある種の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６はＣ_１１−Ｃ_２０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４はＣ_９−Ｃ_２０アルキルである。ある種の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６はＣ_１１アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４はＣ_９アルキルである。

【0204】

ある種の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：

【化7】

を有する合成ＧＬＡアジュバントである。

【0205】

上記のＧＬＡ構造のある種の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６はＣ_１１−Ｃ_２０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４はＣ_９−Ｃ_２０アルキルである。ある種の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６はＣ_１１アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^４はＣ_９アルキルである。

【0206】

ある種の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：

【化8】

を有する合成ＧＬＡアジュバントである。

【0207】

ある種の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：

【化9】

を有する合成ＧＬＡアジュバントである。

【0208】

ある種の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：

【化10】

を有する合成ＧＬＡアジュバントである。

【0209】

別の実施態様では、本発明の組成物で使用されるアジュバントは、弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ）である。ＡＬＤは、リピドＡより少ないか、または異なる有害作用を示すように改変または構築された、リピドＡ様分子である。これらの有害作用には、発熱性、局所的シュワルツマン反応性、および、ニワトリ胚５０％致死量アッセイ（ＣＥＬＤ５０）で評価される毒性が含まれる。本発明に従って有用なＡＬＤには、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）および３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）が含まれる。ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡは公知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。例えば、モノホスホリルリピドＡおよびその製造を開示する、１９８４年３月１３日発行の Ribi ImmunoChem Research, Inc. に譲渡された米国特許第４,４３６,７２７号を参照されたい。Myersらの米国特許第４,９１２,０９４号および再審査証明書（Ｂ１）米国特許第４,９１２,０９４号も Ribi ImmunoChem Research, Inc. に譲渡され、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびその製造方法を例示する。

【0210】

いくつかの実施態様では、イミダゾキノリンおよび他の免疫応答修飾物質などの応答修飾物質が当分野で知られており、本明細書で開示されるある種の実施態様において、これらもアジュバントとして含まれ得る。ある種の好ましいイミダゾキノリン免疫応答修飾物質には、非限定的な例として、レシキモド（resiquimod）（Ｒ８４８）、イミキモドおよびガーディキモド（Hemmi et al., 2002 Nat. lmmunol. 3:196; Gibson et al., 2002 Cell. Immunol. 218:74; Gorden et al., 2005 J. lmmunol. 174:1259）が含まれる；これらおよび他のイミダゾキノリン免疫応答修飾物質は、適切な条件下で、本明細書に記載のＴＬＲアゴニスト活性も有し得る。他の免疫応答修飾物質は、核酸をベースとする二重ステムループ免疫修飾物質（ｄＳＬＩＭ）である。本明細書に開示される実施態様のいくつかでの使用が企図されるｄＳＬＩＭの具体例は、Schmidt et al., 2006 Allergy 61:56; Weihrauch et al. 2005 Clin Cancer Res. 11(16):5993-6001; Modern Biopharmaceuticals, J. Knaeblein (Editor). John Wiley & Sons, December 6, 2005.（１８３〜２００頁で議論されているｄＳＬＩＭ）およびMologen AG (Berlin, FRG: [オンラインで８／１８／０６に検索、mologen.com/English/04.20-dSLIM.shtmlでインターネットを参照]）に見出すことができる。

【0211】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物中で使用されるアジュバントは、細菌または植物に由来する多糖体である。単独で、または１種またはそれ以上のさらなるアジュバントと共に本明細書に記載の組成物中で使用できる、多糖体をベースとするアジュバントの非限定的な例には、グルカン類（例えば、ベータグルカン類）、デキストラン類（例えば、硫酸化およびジエチルアミノエチル−デキストラン類）、グルコマンナン類、ガラクトマンナン類、レバン類、キシラン類、フルクタン類（例えば、イヌリン）、キトサン、エンドトキシン類（例えば、リポ多糖）、バイオブラン（biobran）ＭＧＮ−３、アクチニディア・エリアンタ（Actinidia eriantha）由来の多糖類、エルデキソマー（eldexomer）およびそれらの変形物が含まれる。

【0212】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物中で使用されるアジュバントは、プロテアソームまたはそのサブユニットである。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物中で使用されるアジュバントは、リジンコアの周囲に集合した同一または異なる抗原性ペプチド配列を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物中で使用されるアジュバントは、毒素（例えば、細菌性毒素）である。いくつかの実施態様では、毒素は、大腸菌、コレラ菌、百日咳菌およびパラ百日咳菌からなる群から選択される１種またはそれ以上の細菌に由来する。

【0213】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン）中で使用されるアジュバントは、送達用アジュバントである。送達用アジュバントは、アジュバントとして働くことができ、かつ／または、抗原を送達できる。単独で、または１種またはそれ以上のさらなるアジュバントと共に本明細書に記載の組成物中で使用できるアジュバントの非限定的な例には、鉱物塩（例えば、リン酸カルシウム）、乳剤（例えば、水中のスクアレン）、リポソーム（例えば、ＤＰＰＣ：コレステロールリポソーム）、ビロソーム（例えば、免疫強化再構成インフルエンザビロソーム）およびミクロスフェアが含まれる。

【0214】

ある種の本明細書で開示される実施態様に従って使用するための他のアジュバントには、ブロック共重合体または生物分解性ポリマーが含まれる。これらは、関連分野の当業者によく知られているであろう重合性化合物のクラスを表す。本明細書に記載の組成物に含まれ得るブロック共重合体または生物分解性ポリマーの例には、プルロニック^{（登録商標）}Ｌ１２１（BASF Corp., Mount Olive, NJ；例えば、Yeh et al., 1996 Pharm. Res. 13:1693；米国特許第５,５６５,２０９号を参照されたい）、ＣＲＬ１００５（例えば、Triozzi et al., 1997 Clin Canc. Res. 3:2355）、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ−（Ｄ,Ｌ−ラクチド−コ−グリコシド）（ＰＬＧ）、および、ポリ：Ｃが含まれる。（例えば、Powell and Newman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, New York を参照されたい）

【0215】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン）中で使用されるアジュバントは、有機アジュバントである。有機アジュバントは、生物に由来するアジュバントまたは化学的に炭素を含むアジュバントであり得る。いくつかの実施態様では、アジュバントは、微生物の細胞壁に由来するペプチド（例えば、ムラミルジペプチドおよびその変異体）である。いくつかの実施態様では、アジュバントは、トレハロース６,６'−ジミコール酸またはその変異体である。Schweneker et al., 2013, Immunobiology, 218(4):664-73 を参照されたい。いくつかの実施態様では、アジュバントはステアリルチロシンである。

【0216】

ＱＳ２１、および、同様の効果を与え、本明細書でＱＳ２１模倣物と称される構造的に関連する化合物を含む、サポニン類およびサポニン模倣物（例えば、米国特許第５,０５７,５４０号；ＥＰ０３６２２７９Ｂ１；ＷＯ９５／１７２１０を参照されたい）、トマチンなどの植物アルカロイド、サポニン、ポリソルベート８０、Span 85 およびステアリルチロシンなど（しかし、これらに限定されない）の界面活性剤、イミダゾキノリン免疫応答修飾物質、および二重ステムループ免疫修飾物質（ｄＳＬＩＭ、例えば、Weeratna et al., 2005 Vaccine 23:5263）は、本明細書に記載の実施態様のいくつかに従って、アジュバントとして使用し得る。

【0217】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物中で使用されるアジュバントは、サポニンまたはサポニン模倣物である。サポニン類を含む界面活性剤は、例えば、米国特許第６,５４４,５１８号；Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996 Phytomedicine 2:363-386）、米国特許第５,０５７,５４０号、Kensil, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55、およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１で教示されている。Quil A（サポニン）の画分を含む免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる粒子状構造は、溶血性であり、ワクチンの製造に使用されてきた（Morein, B., ＥＰ０１０９９４２Ｂ１）。これらの構造はアジュバント活性を有すると報告された（ＥＰ０１０９９４２Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１）。溶血性サポニン類のＱＳ２１およびＱＳ１７（Quil AのＨＰＬＣ精製画分）は、強力な全身性アジュバントとして記載され、その製造方法は、米国特許第５,０５７,５４０号およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１に開示されている。ＱＳ２１は、シャボンノキ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来する、ＨＰＬＣ精製された非毒性画分を含み得る。ＱＳ２１の製造は、米国特許第５,０５７,５４０号に記載されている。（米国特許第６,９３６,２５５号、第７,０２９,６７８号および第６,９３２,９７２号も参照されたい。）これらの文献には、全身性ワクチンの強力なアジュバントとして作用するＱＳ７（Ｑｕｉｌ−Ａの非溶血性画分）の使用も記載されている。ＱＳ２１の使用は、さらに、Kensil et al.(1991. J. Immunology 146:431-437）に記載されている。ＱＳ２１とポリソルベートまたはシクロデキストリンの組合せも知られている（ＷＯ９９／１０００８）。ＱＳ２１およびＱＳ７などのQuilAの画分を含む粒子性アジュバントの系は、ＷＯ９６／３３７３９およびＷＯ９６／１１７１１に記載されている。全身性ワクチン接種の研究で使用されてきた他のサポニン類には、カスミソウ属（Gypsophila）およびサボンソウ属（Saponaria）などの他の植物種に由来するものが含まれる（Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992）。

【0218】

いくつかの実施態様では、アジュバントは、例えば、Iscotec (Stockholm, Sweden) おおびCSL Ltd. (Parkville, Victoria, Australia）から購入可能なサポニン由来のISCOMATRIX^{（登録商標）}を含む、ＩＳＣＯＭＳとして知られる「免疫刺激複合体」（例えば、米国特許第６,８６９,６０７号、第６,８４６,４８９号、第６,０２７,７３２号、第４,９８１,６８４号）である。

【0219】

エスチンは、本明細書に開示の実施態様のアジュバント組成物において使用するための、サポニンに関連する他の界面活性剤である。エスチンは、マロニエ、セイヨウトチノキ（Aesculus hippocastanum）の種子に生じるサポニンの混合物として、Merck index（第１２版：登録３７３７）に記載されている。クロマトグラフィーおよび精製による（Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)）、そして、イオン交換樹脂による（Erbring et al., 米国特許第３,２３８,１９０号）その単離が記載されている。エスチンの画分（アエスチン（aescin）としても知られる）が精製され、生物学的に活性であると示された（Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August;44(8): 1454-1464)）。ジギトニンはもう１つの界面活性剤であり、これもMerck index（第１２版、登録３２０４）にサポニンとして記載されており、ジキタリス（Digitalis purpurea）の種子に由来し、Gisvold et al., J. Am. Pharm.Assoc., 1934, 23, 664; and Rubenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621 に記載の方法に従って精製される。

【0220】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン）に用いられるアジュバントは、無機アジュバントである。無機アジュバントは、一般的に、例えば鉱物塩、乳剤、およびリン酸カルシウムのような、炭素をベースとしないアジュバントであり得る。本明細書で企図される鉱物塩アジュバントは、限定されないが、リン酸アルミニウムや水酸化アルミニウムのようなアルミニウムをベースとする化合物を含む。本明細書で使用するとき、リン酸カルシウムアジュバントは、限定されないが、オルトリン酸（ＰＯ４３−）、メタリン酸（ＰＯ３−）、またはピロリン酸（Ｐ２Ｏ７４−）と共にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を含む。

【0221】

また前述したように、本明細書に記載の組成物において使用されるアジュバントの１種は、一般的には「アラム」と呼ばれる、アルミニウムアジュバントであってもよい。アラムアジュバントは、以下に基づいている：オキシ水酸化アルミニウム；ヒドロキシリン酸アルミニウム；または様々な専売の塩（proprietary salt）。アラムアジュバントを用いるワクチンは、破傷風株、ＨＰＶ、Ａ型肝炎、不活化ポリオウイルス、および本明細書に記載の他の抗原に対するワクチンを含み得る。アラムアジュバントは、良好な安全記録があり、抗体応答を増強し、抗原を安定化し、大量生産が比較的簡単であるため、有利である。（Edelman 2002 Mol. Biotechnol. 21:129-148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect. Dis. 2:370-383.）。

【0222】

いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、アジュバントを含む。いくつかの実施態様では、アジュバントはＴＬＲ４アゴニストである。いくつかの実施態様では、アジュバントは、約０.５μｇ／ｍＬないし約１２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、アジュバントは、約０.５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、または約１００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、アジュバントは、本明細書に記載のＭＰＬまたはＧＬＡである。いくつかの実施態様では、アジュバントは、約０.５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１１ｍｇ／ｍＬ、または約１２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

【0223】

本明細書に記載のある種の組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物）において使用するための好適なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); Merck アジュバント 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2およびその誘導体（SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); AddaVax (InvivoGen); MF59 (Norvartis); AS03 (GlaxoSmithKline); AS01B (GlaxoSmithKline); AS02A (GlaxoSmithKline)などの市販のアジュバントを含む。

【0224】

本明細書で提供されるいくつかの実施態様は、１種のアジュバントと、そのアジュバントと異なる少なくとももう１種のアジュバントを含む組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物）を含む。例えば、本明細書で提供される組成物は、ＧＬＡとＧＬＡ以外の第二のアジュバントとを含んでもよい。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される組成物は、２種、３種、４種、または５種のアジュバントを含む。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される組成物は、２種のアジュバントを含む。

【0225】

本明細書に記載のアジュバントは、ヒト（例えば、ヒト患者）、非ヒト霊長類、哺乳類または認識された免疫系を持つ別の高等真核生物などの対象に投与される場合、免疫応答の効力や寿命を変化させる（すなわち、統計的に有意に増加または減少させる、および、ある種の実施態様では、増強または増加させる）ことができるアジュバントを含む。（例えば、 Powell and Newman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, New Yorkを参照）。本明細書で開示されるある種の実施態様において、ＧＬＡ、所望の抗原、および場合により１種またはそれ以上のアジュバントが、所望の抗原に対する免疫応答を変化させる、例えば、誘発または増強することができる。

【0226】

熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物において使用するための抗原
いくつかの実施態様では、熱安定性ワクチン組成物は、宿主において、抗原に対する免疫活性または免疫応答を、誘発または増強するために使用される。

【0227】

いくつかの実施態様では、抗原は、自己免疫抗原、アレルゲン、または癌の抗原のように、宿主において、すでに存在していてもよく、ワクチン組成物は安定な乳剤のみを含んでもよく、投与されるとすでに対象に存在している抗原に対する免疫活性を誘発または増強するアジュバントを、場合により含んでもよい。本明細書で使用するとき、すでに宿主に存在する抗原に対する免疫応答を誘発する熱安定性凍結乾燥乳剤およびアジュバントを含むワクチン組成物の投与は、単独療法である。

【0228】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載のワクチン組成物は、１種またはそれ以上の抗原を含む。

【0229】

当該組成物を作成および使用するための、本明細書に記載の組成物および方法のある種の実施態様で使用するための抗原は、対象における免疫反応性の誘起または増強が望まれる任意の標的エピトープ、分子（生体分子を含む）、分子複合体（生体分子を含有する分子複合体を含む）、細胞内集合体、細胞または組織であり得る。頻繁に、抗原の用語は、関心のあるポリペプチド抗原を表す。しかしながら、抗原は、本明細書で使用するとき、関心のあるポリペプチド抗原をコードする組換えコンストラクト（例えば、発現コンストラクト）も表し得る。ある種の好ましい実施態様では、抗原は、感染、癌、自己免疫疾患、アレルギー、喘息または抗原特異的免疫反応の刺激が望ましいか、または有利である他の状態と関連する感染性病原体および／またはエピトープ、生体分子、細胞または組織であり得るか、または、これらに由来し得るか、または、これらと免疫学的に交差反応性であり得る。

【0230】

いくつかの実施態様では、抗原は、対象の免疫活性を、所望のレベルで誘発または増強するのに十分ないずれの濃度で存在してもよい。いくつかの実施態様では、抗原は、約０.１μｇ／ｍＬないし約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬないし約５０μｇ／ｍＬ、約２.５μｇ／ｍＬないし約５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬないし約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬないし約５０μｇ／ｍＬ、０.１μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、約２.５μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬないし約２５μｇ／ｍＬ、０.１μｇ／ｍＬないし約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬないし約１０μｇ／ｍＬ、約２.５μｇ／ｍＬないし約１０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬないし約１０μｇ／ｍＬ、０.１μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬ、約２.５μｇ／ｍＬないし約５μｇ／ｍＬ、０.１μｇ／ｍＬないし約２.５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬないし約２.５μｇ／ｍＬ、または約０.１μｇ／ｍＬないし約１μｇ／ｍＬの濃度範囲で存在してもよい。提供された濃度は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤中、または、再構成時の水中油乳剤中のいずれかにおける抗原の濃度を表す。

【0231】

ある種の実施態様では、本発明書に記載の組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物）は、ヒトまたは他の哺乳動物の病原体に対して免疫反応を誘起できる抗原または抗原組成物を含み、その抗原または抗原組成物は、ウイルスに由来する組成物、例えばＨＩＶ−１由来（ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０など）、ヒトヘルペスウイルス、例えばｇＤまたはその誘導体、または、最初期タンパク質、例えばＨＳＶ１またはＨＳＶ２のＩＣＰ２７、サイトメガロウイルス（（特にヒト）（例えば、ｇＢまたはその誘導体）、ロタウイルス（弱毒生ウイルスを含む）、エプスタイン・バーウイルス（例えばｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐＩ、ＩＩおよびＩＥ６３）、または、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原またはその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス由来、または、パラミクソウイルスなどの他のウイルス性病原体由来：呼吸器多核体ウイルス（例えば、ＦおよびＧタンパク質またはその誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８など）、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス（生きている、または不活性化されたウイルス全体、分割したインフルエンザウイルス、卵またはＭＤＣＫ細胞で増殖させたもの、または、インフルエンザのビロソーム全体（Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920 に記載）、または、その精製または組換えタンパク質、例えば、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡまたはＭタンパク質、またはこれらの組合せ）を含み得る。

【0232】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物）は、ヒトまたは他の哺乳動物の病原体に対して免疫反応を誘起できる抗原または抗原組成物を含有し、その抗原または抗原組成物は、１種またはそれ以上の細菌性病原体、例えば、淋菌（N. gonorrhea）および髄膜炎菌（N. meningitidis）を含むナイセリア属の種（例えば、莢膜の多糖類およびそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン）；化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）（例えば、Ｍタンパク質またはその断片、Ｃ５Ａプロテアーゼ、リポテイコ酸）、ストレプトコッカス・アガラクチア（S. agalactiae）、ミュータンス菌（S. mutans）：軟性下疳菌（H. ducreyi）；カタル球菌（Branhamella catarrhalis）としても知られる、M. カタラーリス（catarrhalis）を含むモラクセラ属の種（例えば、高および低分子量アドヘシンおよびインベイシン）；百日咳菌（B. pertussis）（例えば、パータクチン、百日咳毒素またはその誘導体、線維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）、B. パラパータシス（parapertussis）およびB. ブロンキセプチカ（bronchiseptica）を含むボルデテラ属の種；結核菌（M. tuberculosis）（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、ＢまたはＣ）、M. ボビス（bovis）、らい菌（M. leprae）、M. アビウム（avium）、ヨーネ菌（M. paratuberculosis）、M. スメグマチス（smegmatis）を含むマイコバクテリウム属の種；L. ニューモフィラ（pneumophila）を含むレジオネラ属の種；毒素原性大腸菌（enterotoxic E. coli）（例えば、定着因子、易熱性毒素またはその誘導体、耐熱性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌（enterohemorragic E. coli）、腸管病原性大腸菌（enteropathogenic E. coli）（例えば、志賀毒素様毒素またはその誘導体）を含むエシェリキア属の種；コレラ菌（V. cholera）を含むビブリオ属の種（例えば、コレラ毒素またはその誘導体）；S. ソネイ（sonnei）、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）、S. フレックスネリ（flexnerii）を含むシゲラ属の種；エンテロコリチカ菌（Y. enterocolitica）（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、ペスト菌（Y. pestis）、Y. シュードツベルクローシス（pseudotuberculosis）を含むエルシニア属の種；ジェジュニ菌（C. jejuni）（例えば、毒素、アドへシンおよびインベイシン）およびC. コリ（coli）を含むカンピロバクター属の種；チフス菌（S. typhi）、パラチフス菌（S. paratyphi）、S. コレレスイス（choleraesuis）、腸炎菌（S. enteritidis）を含むサルモネラ属の種；L. モノサイトゲネス（monocytogenes）を含むリステリア属の種；ピロリ菌（H. pylori）（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含むヘリコバクター属の種；緑膿菌（P. aeruginosa）を含むシュードモナス属の種；黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）を含むスタフィロコッカス属の種；フェカリス菌（E. faecalis）、フェシウム菌（E. faecium）を含むエンテロコッカス属の種；C. テタニ（tetani）（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、C. ボツリヌム（botulinum）（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）、C. ディフィシル（difficile）（例えば、クロストリジウム毒素ＡまたはＢおよびその誘導体）を含むクロストリジウム属の種；炭疽菌（B. anthracis）（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）を含むバチルス属の種；ジフテリア菌（C. diphtheriae）（例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体）を含むコリネバクテリウム属の種；ライム病菌（B. burgdorferi）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. ガリニ（garinii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. アフゼリ（afzelii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. アンデルソニ（andersonii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. ヘルムシ（hermsii）を含むボレリア属の種；E. エクイ（equi）を含むエーリキア属の種およびヒト顆粒球エーリキア症の物質；R. リケッチイ（rickettsii）を含むリケッチア属の種；トラコーマクラミジア（C. trachomatis）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、肺炎クラミジア（C. pneumoniae）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、オウム病クラミジア（C. psittaci）を含むクラミジア属の種；L. インターロガンス（interrogans）を含むレプトスピラ属の種；梅毒トレポネーマ（T. pallidum）（例えば、微量外膜タンパク質（rare outer membrane proteins））、T. デンティコラ（denticola）、T. ヒオディセンテリア（hyodysenteriae）を含むトレポネーマ属の種；または他の細菌性病原体に由来する組成物を含み得る。

【0233】

ある種の実施態様では、明細書に記載の組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物）は、ヒトまたは他の哺乳動物の病原体に対して免疫反応を誘起できる抗原または抗原組成物を含有し、その抗原または抗原組成物は、１種またはそれ以上の寄生生物、例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）を含むプラスモジウム属の種；トキソプラズマ原虫（T. gondii）（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含むトキソプラズマ属の種；赤痢アメーバ（E. histolytica）を含むエントアメーバ属の種；ネズミバベシア（B. microti）を含むバベシア属の種；クルーズトリパノソーマ（T. cruzi）を含むトリパノソーマ属の種；ランブル鞭毛虫（G. lamblia）を含むジアルジア属の種；森林型熱帯リーシュマニア（L. major）を含むリーシュマニア属の種；P. カリニ（carinii）を含むニューモシスチス属の種；腟トリコモナス（T. vaginalis）を含むトリコモナス属の種；または、哺乳動物に感染できる蠕虫類、例えば：（ｉ）線虫症（蟯虫（Enterobius vermicularis）、回虫（Ascaris lumbricoides）、鞭虫（Trichuris trichuria）、アメリカ鉤虫（Necator americanus）、ズビニ鉤虫（Ancylostoma duodenale）、バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）、マレー糸状虫（Brugia malayi）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、メジナ虫（Dracanculus medinensis）、旋毛虫（Trichinella spiralis）および糞線虫（Strongyloides stercoralis）を含むが、これらに限定されない）；（ｉｉ）吸虫症（マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、メコン住血吸虫（Schistosoma mekongi）、肝吸虫（Opisthorchis sinensis）、肺吸虫（Paragonimus sp）、肝蛭（Fasciola hepatica）、ファスキオラ・マンガ（Fasciola magna）、ファスキオラ・ギガンチカ（Fasciola gigantica）を含むが、これらに限定されない）；および（ｉｉｉ）条虫症（無鉤条虫（Taenia saginata）および有鉤条虫（Taenia solium）を含むが、これらに限定されない）に由来する組成物を含み得る（例えば、John, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge's Medical Parasitology-9^th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis' Parasitology for Veterinarians-8^th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphia 参照）。従って、ある種の実施態様は、シストソーマ属の種、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、および／または、日本住血吸虫に由来する抗原、または、酵母、例えば、C. アルビカンス（albicans）を含むカンジダ属の種；C. ネオフォルマンス（neoformans）を含むクリプトコッカス属の種に由来する抗原を含むワクチン組成物を企図し得る。

【0234】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物は、結核菌群のマイコバクテリウム属の種の異種ポリペプチドを少なくとも２つ含む。結核菌群のマイコバクテリウム属の種は、結核を引き起こすと伝統的に考えられている種、並びに、ＡＩＤＳ患者などの免疫不全の患者において結核および胚疾患を引き起こす日和見的および環境的なマイコバクテリウム属の種、例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（Mtb）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、またはマイコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobacterium africanum）、カルメット・ゲラン桿菌（BCG）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare）、マイコバクテリウム・セラツム（Mycobacterium celatum）、マイコバクテリウム・ゲナベンス（Mycobacterium genavense）、マイコバクテリウム・ヘモフィルム（Mycobacterium haemophilum）、マイコバクテリウム・カンサシ（Mycobacterium kansasii）、マイコバクテリウム・シミエ（Mycobacterium simiae）、マイコバクテリウム・バカエ（Mycobacterium vaccae）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobacterium fortuitum）、およびマイコバクテリウム・スクロフラセウム（Mycobacterium scrofulaceum）を含む（例えば、 Harrison's Principles of Internal Medicine, volume 1, pp. 1004-1014 and 1019-1020参照）。マイコバクテリウム属の種由来の抗原の配列は、容易に利用可能である。例えば、結核菌の配列は、Cole et al., Nature 393:537 (1998）で見つけることができ、Wellcome Trust, Sanger Institute and Institut Pasteurによって維持されているものなどのウェブサイトにおいて、見つけることができる。

【0235】

本明細書に記載の組成物で使用し得る他の結核菌の特異的抗原は、例えば、Ｔｈ Ｒａ１２、Ｔｂ Ｈ９、Ｔｂ Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ１４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２およびｈＴＣＣ１である（ＷＯ９９／５１７４８）。結核菌のタンパク質には、少なくとも２個、好ましくは３個の結核菌のポリペプチドが大型タンパク質に融合している融合タンパク質およびその変異体も含まれる。ある種の実施態様では、融合タンパク質には、Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩを含む（ＷＯ９９１５１７４８）が含まれる。使用し得る他の抗原には、ＵＳ２０１０／０１２９３９１およびＷＯ２００８／１２４６４７に記載の、抗原、抗原の組み合わせ、および融合タンパク質が含まれる。

【0236】

ある種の実施態様では、本明細書に記載の組成物は、２つまたはそれ以上の共有結合した結核菌抗原、またはその免疫原性フラグメントの組み合わせを含む、単離された融合タンパク質を含む。ここでは、抗原は、Ｒｖ０１６４、Ｒｖ０４９６、Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３０２０、Ｒｖ３４７８、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、Ｒｖ１７３８、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３８１０、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ２８６６、Ｒｖ３８７６、Ｒｖ００５４、Ｒｖ０４１０、Ｒｖ０６５５、Ｒｖ０８３１、Ｒｖ１００９、Ｒｖ１０９９、Ｒｖ１２４０、Ｒｖ１２８８、Ｒｖ１４１０、Ｒｖ１５６９、Ｒｖ１７８９、Ｒｖ１８１８、Ｒｖ１８６０、Ｒｖ１８８６、Ｒｖ１９０８、Ｒｖ２２２０、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ２６２３、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３０４４、Ｒｖ３３１０、Ｒｖ３８８１、Ｒｖ０５７７、Ｒｖ１６２６、Ｒｖ０７３３、Ｒｖ２５２０、Ｒｖ１２５３、Ｒｖ１９８０、Ｒｖ３６２８、Ｒｖ１８８４、Ｒｖ３８７２、Ｒｖ３８７３、Ｒｖ１５１１、Ｒｖ３８７５、および前述の配列のいずれかに少なくとも９０％の相同性のある抗原からなる群から選択される。

【0237】

ある種の実施態様では、本明細書に記載の組成物は、抗原Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０およびＲｖ１８１３または、抗原の組み合わせに少なくとも９０％の相同性のある配列を含む、ＩＤ９３融合タンパク質を含む。別の実施態様では、組成物は、抗原の配列が結核菌由来である、抗原Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０およびＲｖ１８１３を含む、ＩＤ９３融合タンパク質を含む。別の実施態様では、ＩＤ９３融合タンパク質は、配列番号１に記載の配列、または、当該配列に少なくとも９０％の相同性のある配列を含む。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、配列番号２に記載の配列、または、当該配列に少なくとも９０％の相同性のある配列を含む。いくつかの実施態様では、治療用ワクチンは、マイコバクテリウム属の抗原Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６２０およびＲｖ１８１３の組み合わせまたはこの抗原の組み合わせに少なくとも９０％の相同性のある配列を含む、融合タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、マイコバクテリウム属の抗原Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６２０およびＲｖ１８１３は、結核菌抗原Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６２０およびＲｖ１８１３である。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、配列番号３または４に記載の配列、または、配列番号３または４に少なくとも９０％の相同性のある配列を含む。いくつかの実施態様では、抗原Ｒｖ１８１３は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、抗原Ｒｖ３６２０は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、抗原Ｒｖ２６０８は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、抗原Ｒｖ３６１９は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。当業者であれば、１つまたはそれ以上のＮ末端アミノ酸（シグナル配列など）を削除できることを理解するであろう。これらの配列は、ＵＳ８,４８６,４１４に記載されており、これを引用により本明細書の一部とする。

【0238】

いくつかの実施態様では、本組成物は、Ｍｔｂタンパク質ファミリーに属する病原性関連（Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０）または潜伏期関連（Ｒｖ１８１３）の４つの抗原を含むＩＤ９３融合タンパク質、または同タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、本内容は米国特許出願公開第２０１０／０１２９３９１に記載されている（特に、全体を引用により本明細書の一部とする）。

【0239】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物はクラミジア属の抗原を含む。クラミジア属の抗原には、例えば、高分子量タンパク質（High Molecular Weight Protein）（ＨＷＭＰ）（ＷＯ９９／１７７４１）、ＯＲＦ３（ＥＰ３６６４１２）、および推定膜タンパク質（putative membrane proteins）（Ｐｍｐｓ）が含まれる。組成物の他のクラミジア属の抗原は、ＷＯ９９１２８４７５に記載の群から選択できる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物は、肺炎球菌（S. pneumoniae）を含むストレプトコッカス属の種（例えば、莢膜の多糖類およびそのコンジュゲート、ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ＰｄＢ、ストレプトリジン、コリン結合タンパク質）およびタンパク質抗原のニューモリシン（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）、および、その変異体の解毒誘導体（ＷＯ９０／０６９５１；ＷＯ９９／０３８８４）に由来する抗原を含む。他の細菌の抗原は、インフルエンザ菌（H. influenzae）Ｂ型（例えばＰＲＰおよびそのコンジュゲート）、莢膜非保有のインフルエンザ菌を含むヘモフィルス属の種に由来し、例えばＯＭＰ２６、高分子量アドへシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質Ｄおよびフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド（米国特許第５,８４３,４６４号）またはその多コピー変異体もしくは融合タンパク質である。

【0240】

Ｂ型肝炎表面抗原の誘導体は、当分野で周知であり、とりわけ、欧州特許出願ＥＰ−Ａ４１４３７４；ＥＰ−Ａ−０３０４５７８およびＥＰ１９８４７４に記載のＰｒｅＳ１、Ｐａｒｓ２Ｓ抗原を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物は、ＨＩＶ−１抗原、ｇｐ１２０、特にＣＨＯ細胞で発現されたものを含む。さらなる実施態様では、組成物は、上記定義のｇＤ２ｔを含む。

【0241】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物は、陰部疣贅の原因と考えられているヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１およびその他）、および、子宮頚癌の原因であるＨＰＶウイルス（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびその他）に由来する抗原を含む。いくつかの実施態様では、組成物は、Ｌ１粒子またはカプソメア、および、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１タンパク質のＥ６、Ｅ７、Ｌ１およびＬ２から選択される１種またはそれ以上の抗原を含む融合タンパク質を含む、陰部疣贅の予防または治療用ワクチンである。ある種の融合タンパク質の形態は、ＷＯ９６／２６２７７に開示のＬ２Ｅ７およびＧＢ９７１７９５３.５（ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５２８５）に開示のタンパク質Ｄ（１／３）−Ｅ７を含む。いくつかの実施態様では、組成物は、ＨＰＶ１６または１８抗原を含む、ＨＰＶ子宮頸感染または癌の予防または治療用ワクチンである。例えば、Ｌ１またはＬ２抗原の単量体、または、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と共に与えられるＬ１またはＬ２抗原、ＶＬＰまたはカプソメア構造中に単独で与えられるＬ１単独のタンパク質である。そのような抗原、ウイルス様粒子およびカプソメアは、それら自体知られている。例えば、ＷＯ９４／００１５２、ＷＯ９４／２０１３７、ＷＯ９４／０５７９２およびＷＯ９３／０２１８４参照。

【0242】

さらなる初期タンパク質は、単独で、または融合タンパク質として含まれ得、例えば、Ｅ７、Ｅ２または好ましくはＦ５であり；いくつかの実施態様は、Ｌ１Ｅ７融合タンパク質を含むＶＬＰを含む（ＷＯ９６／１１２７２）。いくつかの実施態様では、ＨＰＶ１６抗原は、タンパク質Ｄ担体と融合した初期タンパク質Ｅ６またはＦ７を含み、ＨＰＶ１６由来のタンパク質Ｄ−Ｅ６またはＥ７融合体を形成するか、またはそれらの組合せを含み；または、Ｅ６またはＥ７のＬ２との組合せを含む（ＷＯ９６／２６２７７）。あるいは、ＨＰＶ１６または１８の初期タンパク質Ｅ６およびＥ７は、単一の分子、好ましくはタンパク質Ｄ−Ｅ６／Ｅ７融合体中に与えられ得る。そのような組成物（例えば、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物）は、場合により、ＨＰＶ１８由来のＥ６およびＥ７タンパク質の一方または両方を、好ましくはタンパク質Ｄ−Ｅ６またはタンパク質Ｄ−Ｅ７融合タンパク質またはタンパク質ＤＥ６／Ｅ７融合タンパク質の形態で含有し得る。本発明の組成物は、さらに、他のＨＰＶ株由来の、好ましくは株ＨＰＶ３１または３３由来の抗原を含み得る。

【0243】

本発明の組成物は、さらに、マラリアを引き起こす寄生生物に由来する抗原を含み得る。例えば、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodia falciparum）からの抗原は、ＲＴＳ,ＳおよびＴＲＡＰを含む。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２部分の４個のアミノ酸を介してＢ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に連結している、熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の実質的に全てのＣ末端部分を含むハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、英国特許出願番号９１２４３９０.７の優先権を主張する国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１（ＷＯ９３／１０１５２として公開）に開示されている。酵母で発現されると、ＲＴＳはリポタンパク質粒子として産生され、ＨＢＶのＳ抗原と同時発現されると、ＲＴＳ,Ｓとして知られる混合粒子を産生する。

【0244】

ＴＲＡＰ抗原は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５（ＷＯ９０／０１４９６として公開）に記載されている。本発明のある実施態様は、抗原性調製物が、ＲＴＳ,ＳおよびＴＲＡＰ抗原の組合せを含むマラリアワクチンである。多段階のマラリアワクチンの成分の候補であると見込まれる他のマラリア原虫の抗原は、熱帯熱マラリア原虫のＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、シクエストリン（Sequestrin）、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７１２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびプラスモジウム属の種におけるこれらの類似体である。

【0245】

本明細書に開示するある種の実施態様は、例えば結核菌またはらい菌または他のマイコバクテリウム属などのアクチノバクテリア；サルモネラ属、ナイセリア属、ボレリア属、クラミジア属またはボルデテラ属のメンバーなどの細菌；単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、呼吸器多核体ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびサイトメガロウイルスなどのウイルス；ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２などのＨＩＶ；C.アルビカンス、C. グラブラタ（glabrata）、C. クルセイ（krusei）、C. ルシタニアエ（lusitaniae）、C. トロピカリス（tropicalis）およびC. パラプローシス（parapsilosis）などのカンジダ属の種を含む、アスペルギルス属、ブラストミセス属、コクシジオイデス属およびニューモシスチス属または酵母などの真菌；原生動物などの寄生生物、例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）および卵形マラリア原虫（P. ovale）を含むプラスモジウム属の種；またはアカントアメーバ属、赤痢アメーバ、アンギオストロンギルス属、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、クリプトスポリジウム属、アンシロストーマ属、赤痢アメーバ、大腸アメーバ（Entamoeba coli）、エントアメーバ・ディスパー（Entamoeba dispar）、エントアメーバ・ハルトマンニ（Entamoeba hartmanni）、エントアメーバ・ポレキ（Entamoeba polecki）、バンクロフト糸状虫、ジアルジア属およびリーシュマニア属の１種またはそれ以上などの他の寄生生物を含む、細菌、ウイルスまたは真菌などの少なくとも１種の感染性病原体に由来する抗原を企図する。

【0246】

例えば、ボレリア属の種に由来する抗原を含む組成物の実施態様では、抗原は、核酸、病原体に由来する抗原または抗原調製物、組換え的に産生されたタンパク質またはペプチドおよびキメラの融合タンパク質を含み得る。そのような抗原の１つはＯｓｐＡである。ＯｓｐＡは、宿主細胞におけるその生合成のために脂質付加された形態にある完全長成熟タンパク質（Ｌｉｐｏ−ＯｓｐＡ）であり得るか、または、非脂質付加誘導体であり得る。そのような非脂質付加誘導体は、インフルエンザウイルスの非構造タンパク質（ＮＳ１）の最初の８１個のＮ末端アミノ酸および完全なＯｓｐＡタンパク質を有する非脂質付加ＮＳ１−ＯｓｐＡ融合タンパク質を含み、そして、もう１つのＭＤＰ−ＯｓｐＡは、３個の追加的Ｎ末端アミノ酸を有するＯｓｐＡの非脂質付加形態である。

【0247】

本明細書に記載の感染性病原体による感染を有するか、有するリスクがあると疑われる対象を同定するための組成物および方法は、当分野で知られている。

【0248】

例えば、細菌の結核菌は、結核（ＴＢ）を引き起こす。この細菌は通常は肺を攻撃するが、腎臓、脊椎および脳も攻撃できる。適正に処置されなければ、ＴＢ疾患は、致死的であり得る。この疾患は、感染した人がくしゃみまたは咳をすると、一人の人から他人に空気中で広がる。２００３年には、１４,０００を超えるＴＢの症例が合衆国で報告された。

【0249】

結核は、一般的に長期の抗生物質治療の使用により制御できるが、そのような処置は、疾患の拡散を防止するには十分ではなく、起こり得る抗生物質耐性株の選択に関する懸念が存在する。感染した個体は、いくらかの期間にわたり、無症状であるが伝染性であり得る。加えて、処置計画に伴う服薬遵守は決定的であるが、患者の行動を監視するのは困難である。いくらかの患者は処置の過程を完遂せず、このことは、効果のない処置および薬剤耐性の発展を導き得る（例えば、米国特許第７,０８７,７１３号）。

【0250】

現在、生きている細菌によるワクチン接種が、結核に対する保護的免疫を誘導するのに最も有効な方法である。この目的で用いられる最も一般的なマイコバクテリアは、マイコバクテリウム・ボビスの非病原性株であるカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）である。しかしながら、ＢＣＧの安全性と有効性は論争の源であり、合衆国などのいくつかの国は、公衆にワクチン接種していない。診断は、一般的に皮膚の試験を使用して行われ、それは、ツベルクリンＰＰＤ（タンパク質精製した誘導体）への皮内曝露を伴う。抗原特異的Ｔ細胞の反応は、注射の４８ ７２時間後までに注射部位に測定可能な硬結をもたらし、そのことが、マイコバクテリアの抗原への曝露を示す。しかしながら、感受性および特異性はこの試験の問題であり、ＢＣＧでワクチン接種された個体は、感染した個体と区別できない（例えば、米国特許第７,０８７,７１３号）。

【0251】

マクロファージは結核菌免疫の主要なエフェクターとして作用すると示されてきたが、Ｔ細胞は、そのような免疫の支配的な誘導因子である。結核菌感染に対する保護におけるＴ細胞の必須の役割は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に伴うＣＤ４Ｔ細胞の枯渇による、ＡＩＤＳ患者における結核菌の頻発により例示説明される。マイコバクテリア反応性のＣＤ４Ｔ細胞は、ガンマ−インターフェロン（ＩＦＮ−ガンマ）の強力な生産者であると示され、次いで、マウスでマクロファージの抗マイコバクテリア作用を誘発すると示された。ヒトにおけるＩＦＮ−ガンマの役割はあまりはっきりしていないが、研究は、１,２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３が、単独で、または、ＩＦＮ−ガンマもしくは腫瘍壊死因子−アルファと共に、ヒトマクロファージを活性化し、結核菌の感染を阻害すると示した。さらに、ＩＦＮ−ガンマがヒトマクロファージを刺激し、１,２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３を作ると知られている。同様に、ＩＬ−１２は、結核菌感染に対する耐性の刺激において役割を果たすと示された。結核菌感染の免疫学を概観するには、Chan and Kaufmann, in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press. Washington, D.C. (1994) を参照せよ。

【0252】

結核を診断するための、または、結核に対する保護的免疫を誘導するための既存の化合物および方法は、１種またはそれ以上のマイコバクテリアのタンパク質の少なくとも１つの免疫原性部分を含むポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の使用を含む。そのようなポリペプチドまたはＤＮＡ配列を含む診断キットおよび適する検出試薬は、患者および生物学的サンプルにおけるマイコバクテリア感染の検出に使用し得る。そのようなポリペプチドに対する抗体も提供されている。加えて、そのような化合物は、マイコバクテリア感染に対する免疫化のために、本明細書に記載の組成物に製剤化し得る（米国特許第６,９４９,２４６号および第６,５５５,６５３号）。

【0253】

マラリアは、世界の大部分で１９６０年代に排除されたが、この疾患は依然として存続し、既存の薬物に耐性のある、疾患の新しい系統が現れている。マラリアは、９０を超える国で主要な公衆衛生問題である。マラリアの９割はサハラ以南のアフリカで起こる。世界の人口の３分の１以上がリスクにあり、毎年３億５千万ないし５億人がマラリアに感染する。４５００万人の妊婦が、この年にマラリアにかかるリスクにある。既に感染した個体のうち、１００万人以上の感染者が、予防可能な疾患により毎年死亡する。これらの死亡者の大部分は、アフリカの子供である。

【0254】

マラリアは、通常、感染したメスのハマダラカ属の蚊に人が噛まれるときに伝染する。伝染するには、その蚊は、既にマラリアに感染した人から血を吸うことにより、感染していなければならない。マラリアは、寄生生物に起因し、この疾患の臨床的症状には、発熱およびインフルエンザ様の病気、例えば、悪寒、頭痛、筋肉痛および疲労が含まれる。これらの症状は、悪心、嘔吐および下痢を伴い得る。マラリアは、赤血球の喪失のために、貧血および黄疸も引き起こし得る。あるタイプのマラリア、熱帯熱マラリア原虫による感染は、迅速に処置されなければ、腎不全、てんかん、精神錯乱、昏睡および死亡を引き起こし得る。

【0255】

個体におけるマラリアのインビトロの診断方法は知られており、個体から採取した組織または体液を分子またはポリペプチド組成物と接触させることを含み、該分子またはポリペプチド組成物は、熱帯熱マラリア原虫の感染活性から得られるタンパク質の１つまたはそれ以上のＴエピトープの全部または一部を有する１つまたはそれ以上のペプチド配列を含み、接触は、該組成物と組織または体液中に存在し得る抗体との間でインビトロの免疫反応が起こり、形成された抗原−抗体複合体のインビトロ検出を可能にする条件下で行う（例えば、米国特許第７,０８７,２３１号参照）。

【0256】

組換え熱帯熱マラリア原虫（３Ｄ７）ＡＭＡ−１外部ドメインの発現および精製は、記載された。過去の方法は、天然分子のフォールディングとジスルフィド架橋を保持する、高度に精製されたタンパク質を産生した。組換えＡＭＡ−１は、診断試薬として、また、抗体産生において、そして、マラリアを予防するワクチンとして単独で、またはその一部として使用するためのタンパク質として、有用である。（米国特許第７,０２９,６８５号）

【0257】

感受性の哺乳動物の宿主の血漿に感染後に分泌されるタンパク質またはタンパク質の断片である、種特異的な三日熱マラリア原虫のマラリアペプチド抗原をコードするポリヌクレオチド、並びに、これらの抗原に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体が、当分野で記載された。ペプチド抗原、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体は、マラリアを診断するために、また、三日熱マラリア原虫が感染の原因の種であるか否かを判定するために使用されるアッセイで利用される（米国特許第６,７０６,８７２号）。また、感受性の哺乳動物の宿主の血漿に感染後に分泌されるタンパク質またはタンパク質の断片である、種特異的な三日熱マラリア原虫のマラリアペプチド抗原、並びに、これらの抗原に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体も報告された。ペプチド抗原、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体は、マラリアを診断するために、また、三日熱マラリア原虫が感染の原因の種であるか否かを判定するために使用されるアッセイで利用される（例えば、米国特許第６,２３１,８６１号参照）。

【0258】

組換え熱帯熱マラリア原虫（３Ｄ７）ＡＭＡ−１外部ドメインは、天然分子のフォールディングとジスルフィド架橋を保持する、高度に精製されたタンパク質を産生する方法によっても発現された。組換えＡＭＡ−１は、診断試薬として、抗体産生において使用するために、そしてワクチンとして、有用である（米国特許第７,０６０,２７６号）。同様に知られているのは、天然分子のフォールディングとジスルフィド架橋を保持する組換え熱帯熱マラリア原虫（３Ｄ７）ＭＳＰ−１_４２の発現および精製である。組換えＭＳＰ−１_４２は、診断試薬として、抗体産生において使用するために、そしてワクチンとして、有用である（米国特許第６,８５５,３２２号）。

【0259】

従って、ヒトのマラリア感染を検出し、マラリア感染性の病原体に感染を有するか、または有するリスクにあると疑われる対象を同定するための診断方法は、これらおよび関連する開示により知られている。特に、例えば、血液サンプルを、３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（ＡＰＡＤ）、基質（例えば、乳酸塩または乳酸）およびバッファーを含有する試薬と合わせる。この試薬は、マラリア寄生生物により産生される独特の解糖酵素の存在を検出するように設計されている。この酵素は、原虫性乳酸脱水素酵素（ＰＬＤＨ）として知られている。ＰＬＤＨは、上記の試薬を使用して、宿主のＬＤＨと容易に区別される。試薬と寄生された血液サンプルの組合せは、ＡＰＡＤの減少をもたらす。しかしながら、ＡＰＡＤは、宿主ＬＤＨによって減少しない。次いで、ＡＰＡＤの減少は、分光的、蛍光定量的、電気泳動的または比色定量的分析を含む様々な技法により検出され得る。前述の方法におけるＡＰＡＤの減少の検出は、マラリア感染のポジティブな指標を提供する（例えば、米国特許第５,１２４,１４１号）。マラリア診断の他の方法論では、熱帯熱マラリア原虫抗原ＧＬＵＲＰに由来する特徴的なアミノ酸配列を含むポリペプチドが、そのポリペプチドに対して生成されたか、またはそれに反応性である特異的抗体により、試験サンプル中に認識される。（米国特許第５,２３１,１６８号）

【0260】

リーシュマニア症は、インド亜大陸、アフリカおよびラテンアメリカで頻繁に流行する広範な寄生虫症であり、世界保健機構のワクチン開発の優先事項である。様々な疾患の複合物として、リーシュマニア属の寄生生物は、内部の器官の致死的な感染並びに深刻な皮膚病を引き起こす。リーシュマニア症の最も破滅的な形態の１つは、鼻および口の醜い感染である。リーシュマニア症の症例数は増加しており、現在多くの地域で制御不能である。リーシュマニア症は、また、いくつかの先進国でも、特に南ヨーロッパでＨＩＶ感染の結果として増えている。利用可能な薬物は毒性であり、高価であり、長期にわたる毎日の注射を必要とする。

【0261】

リーシュマニア属は、免疫系のマクロファージまたは白血球細胞に生息する原生動物の寄生生物である。この寄生生物は、小型吸血昆虫（スナバエ）の噛みつきにより伝染し、それらはこの惑星の広大な地域に生息するので、制御し難い。

【0262】

内臓リーシュマニア症は、この疾患の３つの症状のうち、最も危険である。約５００,０００件の内蔵型（カラアザールまたは「致命的病気」）の新しい症例が毎年生じると見積もられている。２億人を超える人々が、現在、内臓リーシュマニア症にかかるリスクにある。内臓リーシュマニア症の症例の９０パーセント以上が、インド、バングラディシュ、スーダン、ブラジルおよびネパールで生じる。死亡の殆どは子供で生じる。皮膚型の者は、しばしば、永久に外見を損なわれる。

【0263】

リーシュマニア属の感染は診断し難く、典型的には、組織生検標本の病理組織学的分析を必要とする。しかしながら、いくつかの血清学的および免疫学的診断アッセイが開発された。（米国特許第７,００８,７７４号；Senaldi et al., (1996) J. Immunol. Methods 193:9 5; Zijlstra, et al., (1997) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91:671 673; Badaro, et al., (1996) J. Inf. Dis. 173:758 761; Choudhary, S., et al., (1992) J. Comm. Dis. 24:32 36; Badaro, R., et al., (1986) Am. J. Trop. Med. Hyg. 35:72 78; Choudhary, A., et al., (1990) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84:363 366; and Reed, S. G., et al., (1990) Am. J. Trop. Med. Hyg. 43:632 639）。前鞭毛虫は、代謝産物を培養培地に放出し、条件培地を産生する。これらの代謝産物は、宿主にとって免疫原性である。Schnur, L. F., et al., (1972) Isrl. J. Med. Sci. 8:932 942; Sergeiev, V. P., et al., (1969) Med. Parasitol. 38:208 212; El-On, J., et al., (1979) Exper. Parasitol. 47:254 269; and Bray, R. S., et al., (1966) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60:605 609；米国特許第６,８４６,６４８号、米国特許第５,９１２,１６６号；米国特許第５,７１９,２６３号；米国特許第５,４１１,８６５号参照）。

【0264】

いくつかの実施態様では、抗原は、ＵＳ２００９／００４１７９８、ＵＳ２００９／０２９１０９９、ＵＳ８,４１０,２５８、ＵＳ８,２３１,８８１、およびＷＯ２０１２／０６４６５９に記載のリーシュマニア属の抗原であり、これらを引用により本明細書の一部とする。いくつかの実施態様では、抗原は、少なくともリーシュマニア属のステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＴ）ポリペプチド配列およびリーシュマニア属の非特異的ヌクレオシドヒドロラーゼ（ＮＨ）ポリペプチド配列を含む、融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、リーシュマニア属のＮＨポリペプチド配列は、ドノバン・リーシュマニア（L. donovani）、幼児リーシュマニア（L. infantum）および森林型熱帯リーシュマニア（L. major）のリーシュマニア属のＮＨ配列に、少なくとも９０％の相同性のある配列の、少なくとも免疫原性部分を含む。いくつかの実施態様では、リーシュマニア属のＮＨポリペプチド配列は、配列番号１、３および５からなる群から選択される配列、または当該配列に少なくとも９０％の相同性のある配列の、少なくとも免疫原性部分を含む。いくつかの実施態様では、リーシュマニア属のＳＭＴポリペプチド配列は、ドノバン・リーシュマニア、幼児リーシュマニアおよび森林型熱帯リーシュマニアの、リーシュマニア属のＳＭＴ配列に少なくとも９０％の相同性のある配列の、少なくとも免疫原性部分を含む。いくつかの実施態様では、リーシュマニア属のＳＭＴポリペプチド配列は、配列番号７、９および１１からなる群から選択される配列、または当該配列に少なくとも９０％の相同性のある配列の、少なくとも免疫原性部分を含む。いくつかの実施態様では、融合ポリペプチドは、配列番号１３で規定されるアミノ酸配列、または当該配列に少なくとも９０％の相同性のある配列を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の配列は、ＷＯ２０１２／０６４６５９およびＵＳ２０１２０１１４６８８で提供され、これらを引用により本明細書の一部とする。

【0265】

世界中で約４千万人の人々が、ＡＩＤＳを引き起こすウイルスであるＨＩＶに感染している。約３百万人の人々が毎年この疾患により死亡し、彼らの９５パーセントが発展途上国にいる。毎年、５百万人近い人々がＨＩＶに感染する。現在、サハラ以南のアフリカが最高の疾患の負担を有するが、それは急速にインド、中国およびロシアなどの他の国々に広がっている。流行は少数者集団で最も急速に広がっている。合衆国では、９５０,０００件を超えるＡＩＤＳの症例が１９８１年から報告されてきた。ＡＩＤＳは、最も生産的な年齢の人々を襲う。女性は、生物学的理由および社会的理由の両方で、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの高いリスクを有する。

【0266】

ＡＩＤＳは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に起因し、それは、身体の免疫系の細胞を殺し、損ない、感染およびある種の癌と闘う身体の能力を次第に破壊する。ＨＩＶは、感染した相手と保護されない性交を行うことにより、最も一般的に拡散する。この問題の最も確固たる解決は、ウイルスの拡散を防ぐことである。安全で有効な入手可能なＨＩＶワクチンの作成は、この目標を達成する１つの方法である。世界中で、有効な予防を利用できるのは、ＨＩＶ感染の高いリスクにある人の５人に１人より少ない。

【0267】

ＨＩＶ感染の診断方法は知られており、ウイルス培養、患者の試料からの決定的な核酸配列のＰＣＲ、および、患者の血清中の抗ＨＩＶ抗体の存在についての抗体試験によるものを含む（例えば、米国特許第６,９７９,５３５号、第６,５４４,７２８号、第６,３１６,１８３号、第６,２６１,７６２号、第４,７４３,５４０号参照）。

【0268】

本明細書に開示のある種の他の実施態様によると、組成物および使用方法は、癌細胞に由来する抗原を含み得、癌の免疫療法的処置に有用であり得る。例えば、組成物には、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌または黒色腫用のものなどの腫瘍拒絶抗原に用途があり得る。例示的な癌または癌細胞由来の抗原には、ＭＡＧＥ１、３およびＭＡＧＥ４または他のＭＡＧＥ抗原、例えば、ＷＯ９９／４０１８８に開示のもの、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹＥｏｓ１としても知られている）、ＳＡＧＥおよびＨＡＧＥ（ＷＯ９９／５３０６１）またはＧＡＧＥ（Robbins and Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p. 293）が含まれる。これらの非限定的な癌抗原の例は、黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌などの幅広い腫瘍のタイプで発現される。例えば、米国特許第６,５４４,５１８号参照。

【0269】

本明細書に記載の組成物に使用するのに適する他の腫瘍特異的抗原には、腫瘍特異的または腫瘍関連ガングリオシド、例えば、ＧＭ_２およびＧＭ_３またはタンパク質を有するそれらのコンジュゲートが含まれるがこれらに限定されない；または、抗癌免疫反応を誘起または増強するためのＧＬＡワクチン組成物において使用するための抗原は、多くの癌の処置に有用な、自己ペプチドホルモン、例えば、全長のゴナドトロピンホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ、ＷＯ９５／２０６００）（短い１０アミノ酸長のペプチド）であり得る。他の実施態様では、前立腺抗原、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ（例えば、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998）、ＰＳＭＡ、または、好ましい実施態様ではプロスターゼ（Prostase）として知られる抗原が使用される。（例えば、Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3114-3119；ＷＯ９８／１２３０２；米国特許第５,９５５,３０６号；ＷＯ９８／２０１１７；米国特許第５,８４０,８７１号および第５,７８６,１４８号；ＷＯ００／０４１４９）。他の前立腺特異的抗原は、ＷＯ９８／１３７４１８およびＷＯ／００４１４９から知られている。他のものは、ＳＴＥＡＰである（PNAS 96 14523 14528 7-12 1999）。

【0270】

本発明に関して有用な他の腫瘍関連抗原には、Ｐｌｕ−１（J Biol. Chem 274 (22) 15633 -15645, 1999）、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ（Salomon et al Bioessays 199, 21:61-70, U.S. Pat. No. 5,654,140）およびＣｒｉｐｔｉｎ（米国特許第５,９８１,２１５号）が含まれる。加えて、ワクチンに特に関連が深い抗原は、また、チロシナーゼおよびサバイビンを含む。

【0271】

本明細書で開示される癌抗原を含む組成物に関する実施態様は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現または他の癌特異的または癌関連抗原などの腫瘍関連抗原の発現を特徴とする癌に対して有用であり得る。

【0272】

癌を有するか、または有するリスクにあると疑われる対象における癌の診断は、広範な当分野で受け入れられた方法論のいずれかを伴い得、それは、臨床像、癌の進行度、癌の種類および他の要因を含む様々な要因によって変動し得る。癌の診断の例には、患者の試料（例えば、血液、皮膚生検、他の組織生検、外科手術標本など）の病理組織学的、組織細胞化学的、免疫組織細胞化学的および免疫病理組織学的検査、定義された遺伝子（例えば、核酸）マーカーのＰＣＲ試験、循環している癌関連抗原またはそのような抗原を有する細胞についての、または、定義された特異性の抗体についての血清学的試験、または、当業者に周知の他の方法論が含まれる。例えば、米国特許第６,７３４,１７２号；第６,７７０,４４５号；第６,８９３,８２０号；第６,９７９,７３０号；第７,０６０,８０２号；第７,０３０,２３２号；第６,９３３,１２３号；第６,６８２,９０１号；第６,５８７,７９２号；第６,５１２,１０２号；第７,０７８,１８０号；第７,０７０,９３１号；ＪＰ５−３２８９７５； Waslylyk et al., 1993 Eur. J Bioch. 211(7):18 参照。

【0273】

本発明のある種の実施態様に従う組成物および方法は、自己免疫疾患の予防または治療にも使用し得、それは、宿主または対象の免疫系が、「自己」の組織、細胞、生体分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、プロテオリピド、脂質、糖脂質、核酸、例えばＲＮＡおよびＤＮＡ、オリゴ糖、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなど、および、対象の細胞および組織の他の分子成分）またはエピトープ（例えば、特異的な免疫学的に定義される認識構造、例えば、抗体の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＴ細胞受容体ＣＤＲにより認識されるもの）に向けられる免疫反応を有害に媒介する疾患、症状または障害を含む。

【0274】

従って、自己免疫疾患は、細胞または抗体と関連する異常な免疫反応を特徴とし、それは、いずれの場合でも、正常な自己組織に対するものである。哺乳動物の自己免疫疾患は、一般的に２つの異なるカテゴリーの一方に分類できる：細胞に媒介される疾患（即ち、Ｔ細胞）または抗体に媒介される障害。細胞に媒介される自己免疫疾患の非限定的な例には、多発性硬化症、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、１型糖尿病（若年発症糖尿病）および自己免疫性網膜ぶどう膜炎が含まれる。抗体に媒介される自己免疫障害には、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（またはＳＬＥ）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性喘息、クリオグロブリン血症、血栓性血小板減少性紫斑病、原発性硬化性胆管炎および悪性貧血が含まれるが、これらに限定されない。関連する抗原：全身性エリテマトーデスは、低分子リボ核タンパク（ｓｎＲＮＰ）である；グレーブス病は、サイロトロピン受容体、サイログロブリンおよび甲状腺上皮細胞の他の成分である（Akamizu et al., 1996; Kellerman et al., 1995; Raju et al., 1997; and Texier et al., 1992）；天疱瘡は、カドヘリン様天疱瘡抗原、例えば、デスモグレイン３および他の接着分子である（Memar et al., 1996: Stanley, 1995; Plott et al., 1994; and Hashimoto, 1993）；そして、血栓性血小板減少性紫斑病は、血小板の抗原である。（例えば、米国特許第６,９２９,７９６号；Gorski et al. (Eds.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch and Lipsky, P.E. (Eds.) Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation (Curr. Top. Microbiol. and Immunol.) 2001, Springer, NY.参照）

【0275】

自己免疫は、１型糖尿病、多発性硬化症、ループス、関節リウマチ、強皮症および甲状腺疾患を含む８０種を超える異なる疾患において役割を果たす。罹患率の活発な定量的評価は、殆どの自己免疫性疾患について行われていない。１９９０年代の後期に行われた最新の研究は、自己免疫疾患は合衆国で第３番目に多い主要な疾病であり；そして、最も多い自己免疫疾患は、８５０万人を超えるアメリカ人を冒していることを明らかにしている。現在のこの疾患の罹患率の見積りは、合衆国の人口の５ないし８パーセントの範囲にある。殆どの自己免疫疾患は、偏って女性を冒す。女性は、自己免疫疾患にかかる可能性が男性よりも２.７倍高い。女性は、より自己免疫疾患に罹りやすい；男性は、女性よりも高いレベルのナチュラルキラー細胞活性を有すると思われる。（Jacobsen et al, Clinical Immunology and Immunopathology, 84:223-243, 1997.）

【0276】

自己免疫疾患は、免疫系が自己組織を非自己と錯誤し、不適当な攻撃を開始するときに生じる。身体は、様々な方法で自己免疫疾患に冒され得、例えば、腸（クローン病）および脳（多発性硬化症）を含む。自己抗体が自己細胞または自己組織を攻撃し、それらの機能を損ない、その結果、自己免疫疾患を引き起こすこと、および、自己抗体が、自己免疫疾患の実際の発症（例えば、臨床徴候および症状の出現）に先立ち、患者の血清中に検出され得ることが知られている。従って、自己抗体の検出は、自己免疫疾患の存在または発症リスクの早期の発見または認識を可能にする。これらの知見に基づき、様々な自己抗原に対する自己抗体が発見され、自己抗原に対する自己抗体は臨床試験で測定されてきた（例えば、米国特許第６,９１９,２１０号、第６,５９６,５０１号、第７,０１２,１３４号、第６,９１９,０７８号）。一方、他の自己免疫の診断は、関連する代謝物（例えば、米国特許第４,６５９,６５９号）または免疫反応性（例えば、米国特許第４,６１４,７２２号および第５,１４７,７８５号、第４,４２０,５５８号、第５,２９８,３９６号、第５,１６２,９９０号、第４,４２０,４６１号、第４,５９５,６５４号、第５,８４６,７５８号、第６,６６０,４８７号）の検出を含み得る。

【0277】

ある種の実施態様では、本発明の組成物は、腎臓透析の対象、化学療法および／または放射線療法の対象、臓器移植患者などを含む、高齢者および／または免疫抑制者の処置において特に適用可能である。そのような個体は、一般的に、ワクチンに対する免疫反応の減少を示し、従って、本発明の組成物の使用は、これらの対象で達成される免疫反応を増強させ得る。

【0278】

他の実施態様では、本発明の組成物で使用される抗原は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの症状の予防および処置用の、細菌感染（例えば、肺炎球菌）に起因するか、またはそれにより悪化するものなどの呼吸器疾患に関連する抗原を含む。ＣＯＰＤは、慢性気管支炎および／または肺気腫の患者における不可逆的または部分的に可逆的な気道閉塞の存在により、生理学的に定義される（Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121）。ＣＯＰＤの悪化は、しばしば細菌（例えば、肺炎球菌）感染に起因する（Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336-63）。

【0279】

熱安定性組成物に使用するための油
ある種の実施態様は、油を含む本明細書に記載の組成物を企図し、それは、いくつかのそのような実施態様において、アジュバント活性に貢献し得、他のそのような実施態様において、医薬的に許容し得る担体または賦形剤を付加的または代替的に提供し得る。如何なる数の適する油も知られており、本開示に基づく組成物に含めるために選択し得る。そのような油の例には、例示的に、限定ではなく、スクアレン、合成スクアレン、ミネラルオイル、ブドウ種子油、合成イソプレノイド、オリーブ油、コレステロールおよびマンニド（mannide）モノオレエートが含まれる。

【0280】

本明細書で企図される油は、乳剤系で用いられてもよく、また当該乳剤系は乳剤アジュバントと呼ばれる。乳剤アジュバントには、水中油、油中水、または水中油中水（water-in-oil-in-water）の混合物が含まれる。理論に縛られることなく、このような乳剤アジュバントは、抗原をゆっくりと放出させ、免疫系の継続的な刺激を提供することで、機能し得る。ある種の乳剤アジュバントは、限定されないが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、および３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）などの免疫賦活性アジュバントを含む他のアジュバントのための、送達系として使用することもできる。アジュバント組成物を製剤化するための、単一または多相の乳剤系を含むある種の乳剤系が記載されてきた。水中油乳剤アジュバントそれ自体が、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（ＥＰ０３９９８４３Ｂ）、水中油乳剤と他の活性物質（active agent）との組み合わせもまたワクチンのアジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）。油中水乳剤（米国特許第５,４２２,１０９号；ＥＰ０４８０９８２Ｂ２）および、水中油中水乳剤（米国特許第５,４２４,０６７号；ＥＰ０４８０９８１Ｂ）などの、他の油の乳剤アジュバントが記載されている。

【0281】

本発明で使用する油乳剤アジュバントは、天然または合成であってよく、無機または有機であってよい。無機および有機の油の例は、当業者には容易に明らかであろう。特定の実施態様では、本発明の組成物（例えば、熱安定性の凍結乾燥ワクチン）は、水中油の乳剤を含み、ここでは、アジュバントは油相に組み込まれる。水中油組成物をヒトへの投与に適したものにするために、乳剤系の油相は好ましくは代謝可能な油を含む。代謝可能な油という用語の意味は、当分野でよく知られている。代謝可能な（Metabolizable）という用語は、「代謝によって変換可能である」として定義され得る（Dorland's illustrated Medical Dictionary, W. B. Saunders Company, 25th edition (1974)）。油は、レシピエントに対して毒性がなく、代謝によって変換可能である、いずれの植物油（plant oil）、植物油（vegetable oil）、魚油、動物油または合成油であってもよい。ナッツ（例えばピーナッツ油）、種子、穀物は、植物油（vegetable oil）の一般的な供給源である。合成油もまた、使用可能である。

【0282】

例えば、スクアレン（２,６,１０,１５,１９,２３−ヘキサメチル−２,６,１０,１４,１８,２２−テトラコサヘキサエン）は、サメ肝油において大量に検出され、オリーブ油、小麦胚芽油、米ぬか油、および酵母において少量検出される不飽和油であり、本発明での使用に特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロールの生合成の中間体であるという事実のおかげで、代謝可能な油である（Merck index, 10th Edition, entry no. 8619）。主体となる発明に従い有用な、実例的な代謝可能な油には、スクアレン、大豆油、ごま油およびカプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（MIGLYCOL 810 oil）が含まれるが、これらに限定されない。ある実施態様では、代謝可能な油にはスクアレンが含まれる。別の実施態様では、代謝可能な油には、酵母由来スクアレンまたは酵母由来の関連イソプレノイド構造体のような、１種またはそれ以上の酵母由来イソプレノイドが含まれる。

【0283】

いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、約０.０１％ないし５％ｖ／ｖ、約０.０１％ないし４％ｖ／ｖ、約０.０１％ないし３％ｖ／ｖ、約０.０１％ないし２％ｖ／ｖ、約０.０１％ないし１％ｖ／ｖ、または約０.０１％ないし０.５％ｖ／ｖの濃度で存在する、代謝可能な油を含む。いくつかの実施態様では、代謝可能な油は、約０.０１％ｖ／ｖ、約０.０５％ｖ／ｖ、約０.１％ｖ／ｖ、約０.５％ｖ／ｖ、約１％ｖ／ｖ、約１.５％ｖ／ｖ、約２％ｖ／ｖ、約２.５％ｖ／ｖ、約３％ｖ／ｖ、約３.５％ｖ／ｖ、約４％ｖ／ｖ、約４.５％ｖ／ｖ、約５％ｖ／ｖ、約６％ｖ／ｖ、約７％ｖ／ｖ、約８％ｖ／ｖ、約９％ｖ／ｖ、約１０％ｖ／ｖ、約１１％ｖ／ｖ、約１２％ｖ／ｖ、約１３％ｖ／ｖ、約１４％ｖ／ｖ、約１５％ｖ／ｖ、約１６％ｖ／ｖ、約１７％ｖ／ｖ、約１８％ｖ／ｖ、約１９％ｖ／ｖまたは約２０％ｖ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、代謝可能な油は、約２％ｖ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様では、代謝可能な油は、１％ｖ／ｖ未満の濃度で存在する。記載される百分率は、凍結乾燥前の水中油乳剤製剤または再構成時の水中油乳剤における百分率を表す。

【0284】

安定な水中油乳剤中で検出される油滴のサイズは、好ましくは、１ミクロン未満であり、実質的には３０ないし６００ｎｍの範囲であってよく、好ましくは実質的には直径３０ないし５００ｎｍであってよく、最も好ましくは実質的には直径１５０ないし５００ｎｍであってよく、特に光子相関分光法によって測定される場合には直径約１５０ｎｍであってよい。この点で、８０％の数の油滴が好ましい範囲内であるべきであり、さらに好ましくは９０％を超える数の油滴が、最も好ましくは９５％を超える数の油滴が、規定される大きさの範囲内である。

【0285】

乳剤の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）は、界面活性剤の親水力または親油力の推定を可能にする。両親媒性分子のＨＬＢは、一般的に次のように計算される：
ＨＬＢ＝（２Ｏ×親水性部の重量）／（両親媒性分子の重量）

【0286】

ＨＬＢは、０（最も親油性の分子）〜２０（最も親水性の分子）の範囲の値であり得る。界面活性剤の化学的組成により（注目すべき例としては、メトキシ基またはアルケン酸化物の付加）、この推定は変化し得、ＨＬＢ値を有する領域が増えてもよい（例えば、ＬＵＴＲＯＬ Ｆ６８^{（登録商標）}は、２９のＨＬＢを有する）。界面活性剤を混合すると、混合物のＨＬＢは、各界面活性剤のＨＬＢを、その重量比のバランスで合算した値である：
ＨＬＢ＝（界面活性剤ＸのＨＬＢ×界面活性剤Ｘの重量）＋（界面活性剤ＹのＨＬＢ×界面活性剤Ｙの重量）／（界面活性剤Ｘの重量＋界面活性剤Ｙの重量）

【0287】

本発明に従い作成された乳剤のある実施態様では、乳剤の最終ＨＬＢは、約９ないし約１２であり、好ましくは約９.５ないし約１１.５であり、さらに好ましくは約１０ないし約１１.５である。いくつかの実施態様では、乳剤のＨＬＢは約１０.５ないし約１１.０である。水中油乳剤を作成する方法は、当業者にはよく知られている。一般的に、本方法は、油相に、ＰＢＳ／ツイーン８０^{（登録商標）}溶液のような好適な界面活性剤を混合し、その後ホモジナイザーを用いて均質化することを含む。例えば、混合物を１回、２回、またはそれ以上、シリンジの針を通過させることを含む方法は、少量の液体を均質化するのに適しているであろう。同様に、マイクロフルイダイザー（M110S microfluidics machine、最大５０パス、２分間の最大入力圧力６bar（出力圧力は約８５０bar）において）による乳化過程は、より少量の乳剤または大量の乳剤を生産するために調整できるであろう。この調整は、必要な直径の油滴の調製が達成されるまで、結果として生じた乳剤の測定を含む実験を繰り返し行うことによって、達成され得るであろう。

【0288】

医薬上の熱安定性組成物の使用
別の態様では、本明細書に記載の、再構成された熱安定性のワクチン組成物を、対象に投与することを含む、対象において免疫応答を刺激する方法が、本明細書で提供される。本方法は、さらに、投与前に、熱安定性凍結乾燥ワクチン組成物を水中油乳剤に再構成する段階を含んでもよい。

【0289】

従って、本発明は、宿主、患者、対象、または細胞培養物において、免疫反応を増強または誘起するのに有用である。患者は、感染症、癌、例えば乳癌、または自己免疫疾患に苦しんでいてもよく、正常（即ち、検出可能な疾患および／または感染がない）であってもよい。「細胞培養物」は、免疫適格性の細胞または単離された免疫系の細胞（Ｔ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞および樹状細胞を含むがこれらに限定されない）を含む任意の調製物である。そのような細胞は、当業者に周知の様々な技法のいずれかにより単離し得る（例えば、フィコール・ハイパック密度遠心分離）。細胞は、癌に苦しむ患者から単離されたものでもよく（しかし、その必要はない）、処置後に患者に再導入されてもよい。

【0290】

投与経路
本発明は、感染症、癌、または自己免疫疾患のような症状の、ワクチン接種、治療、および予防のための方法および組成物を対象とする。本発明の方法は、注射（parenteral）および非注射（non-parenteral）投与を含む、投与経路を含む。非注射投与経路には、経口、口腔内、舌下、局所、経皮、眼、耳、鼻、直腸、および膣の経路が含まれるが、これらに限定されない。注入可能な方法には、注射の投与経路、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄内、髄腔内、脳室内、動脈内および他の注射経路が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、所定の期間にわたる、抗原および／またはアジュバントの、制御放出、遅延放出、または持続放出を提供し得る、組成物を企図する。

【0291】

製剤
製剤は、当業者に知られており、錠剤、コーティング錠、チュアブル錠、発泡錠、ペレット、カプセル、シロップ、坐剤、注射製剤、および生理的液体中で不溶性である媒体における活性物質の分散物、あるいは、抗原および／またはアジュバントの放出物が、機械的、化学的、または酵素的活性による製剤の分解後に放出される製剤を含むが、これらに限定されない。

【0292】

本発明が、本明細書に開示された特定の製剤、製造工程、および物質に限定されず、そのような製剤、製造工程、および物質は多少変化してもよいことは、理解されるべきである。

【0293】

キットおよび医薬上の包装
ある種の実施態様で企図されるのは、また、本明細書に記載のワクチン組成物を含むキットであり、それは、１個またはそれ以上の容器中に提供され得る。ある実施態様では、ワクチン組成物の全成分は、単一の容器中に一緒に存在するが、本発明の実施態様は、そのように限定されることを意図せず、２個またはそれ以上の容器も企図する。

【0294】

そのようなキットの実施態様による容器は、任意の適するコンテナ、容器、バイアル、アンプル、チューブ、カップ、箱、瓶、フラスコ、ジャー、ディッシュ、単一ウェルまたは複数ウェルの器具のウェル、リザーバー、タンクなど、または、本明細書に開示の組成物を入れ、保管し、かつ／または、輸送し、そして、内容物を取り出すために組成物に接近し得る他の装置であり得る。典型的には、そのような容器は、意図する用途に適合し、そこからの含まれる内容物の回収が容易に達成できる材料でできている。そのような容器の好ましい例には、ガラスおよび／またはプラスチックの、密閉された、または再密閉可能なチューブおよびアンプルが含まれ、これには、ニードルおよびシリンジを使用する内容物の取り出しに適合するゴムの隔壁または他の密閉手段を有するものが含まれる。そのような容器は、例えば、ガラス製または化学的に適合するプラスチックまたは樹脂製であり得、それは、容器からの物質の効率的な回収を可能にし、かつ／または、例えば紫外線または極端な温度などの分解条件から、または、微生物汚染を含む望まれない汚染から物質を保護する材料でできているか、または、それで被覆されていてよい。容器は、好ましくは、無菌であるか、または滅菌可能であり、本明細書に記載のワクチン組成物および／または免疫アジュバント組成物および／または抗原および／または組換え発現コンストラクトなどを懸濁または溶解するのに使用され得るような、いかなる担体、賦形剤、溶媒、媒体などとも適合する材料でできていてもよい。

【0295】

本発明は、次の実施例を参照することにより、さらに詳細に理解されるであろう。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例および実施態様は、単に例示を目的とするものであることは理解される。上述の様々な実施態様は、さらなる実施態様を提供するために組み合わせることができる。これらを考慮した様々な修正や変更は、前述の説明から当業者には明らかであろうし、本出願の精神および範囲内に含まれるものであり、添付の特許請求の範囲内に収まるものである。

【実施例】

【0296】

実施例１:単一および複数の賦形剤系における、凍結乾燥ワクチン乳剤製剤および安定性
ワクチンに使用される水中油安定乳剤（ＳＥ）の凍結乾燥が望まれていた。全ての地上に関連する温度においてコールドチェーンを維持する必要性を低減または排除する熱安定性ワクチンのシステムを開発するために、凍結乾燥時に熱安定性の美しいケーキを形成する、かつ／または、再構成時に乳剤の完全性を保つ賦形剤の能力を調べた。

【0297】

材料および方法
製剤および凍結乾燥
以前に記載されたスクアレン含有安定乳剤（ＳＥ）（ＥＭ００１; Fox et al., 2012, Influenza and Other Respiratory Viruses, in press）を、最終濃度２.０％スクアレン（ｖ／ｖ）で凍結乾燥させ（最初の１０％製剤から、目標最終注入濃度に希釈）、全充填量を１.０ｍｌとした。賦形剤濃度は、質量百分率（％ｗ／ｖ）として報告し、乳剤濃度は、スクアレン油相の容量百分率（％ｖ／ｖ）として報告した。マルトース、Ｄ−（−）−リボース、Ｄ−（−）−フルクトース、ラクトース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；ｍｗ３,３５０Ｄａ）、ラクツロース、ニコチン酸、Ｄ（＋）−ラフィノース五水和物、２,６−ピリジンジカルボン酸、およびＬ−プロリンは、Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo）から購入した。ＵＳＰグレードのＤ（＋）−マンニトールおよびＤ（＋）−トレハロース二水和物、およびＮＦグレードのスクロースおよびラクトース一水和物、デキストラン（ｍｗ４０,０００Ｄａ）は、Spectrum Chemical (New Brunswick, NJ）から購入した。Ｄ（＋）−マンノース、スタキオース水和物、およびＵＳＰグレードデキストロース一水和物は、Thermo Scientific (Waltham, MA）から購入した。サンプルは、Barnstead/Thermolyne (Dubuque IA) E-Pure D4631 filtration systemに続いて、20 nm Whatman (Maidstone, Kent, UK) Anotop plus filterによって、脱イオン化および濾過した、様々な濃度で水に溶解させた上述の賦形剤を用いて、製剤化した。再構成時に極端なｐＨシフトが生じる製剤（５.０未満または７.０を超える）は、凍結乾燥前に、ＮａＣｌおよびＮａＯＨを用いて、ｐＨ５.５に再度製剤化した。凍結乾燥は、VirTis (Gardiner, NY) AdVantage 2.0 EL-85卓上凍結乾燥機を用いて行った。凍結乾燥の方法は、４℃から−４０℃への１０時間の凍結段階と、−１５℃での徐冷段階とを含む、熱処理スケジュールを用いた。最初の乾燥期間（１００ｍＴｏｒｒにおける）は、−４０℃から２５℃まで１８.３時間続いた。最後に、５０ｍＴｏｒｒにおける第二の乾燥期間は２５℃で９時間行われた。全てのサンプルを、５００ｍＴｏｒｒにおける大気中で栓をし、アルミニウムキャップで封をして、使用するまで４℃で保管した。

【0298】

再構成
再構成に先立ち、ケーキを、美しい白色のケーキ（ケーキが、白色で、充填された体積とほぼ同じ体積であり、均一の格子を有するように見えることを意味する）、フィルム、あるいは美しい白色のケーキとは異なる何か、のいずれかに、視覚的に特徴づけた。全てのサンプルを、２０ｎｍで濾過した水（上述）を用いて再構成し、全ての成分が可溶化するまで、あるいは３分が経過するまでの、どちらか早い方まで、ゆっくりとかき混ぜた。再構成に続いて、製剤を、乳白色の乳剤（凍結乾燥前の製剤と同様に見える）またはその他と記述し、乳白色の乳剤からの差異を記録した。その後、各製剤のアリコートを、室温で１時間静置し、クリーム化と呼ばれる、表面上の厚い、白色の相の徴候を、視覚的に評価した。各製剤のｐＨも、Mettler-Toledo (Columbus, OH) MP225p ｐＨメーターを用いて、検査した。

【0299】

融点の測定
凍結乾燥製剤の融点を、Stanford Research Systems (Sunnyvale, CA) OptiMelt 自動融点システム（automated melting point system）を用いて、三連（triplicate）で評価した。各融解キャピラリーをケーキに一度差し込み、物質が底に安定するまで詰め固めた。融解は、１分間に１℃の傾斜率で、２７℃〜２００℃で行った（典型的には、一度融解が完了すると切り離される）。

【0300】

代替的な融点測定法には、融点イメージング装置（imaging melting point apparatus）の利用が包含された。様々な賦形剤による凍結乾燥ＳＥのバイアルを、上述のように、三連で融解した。融解転移は、不透明なケーキの透明な液体への融解として観察され、イメージ中のサンプルの光強度を低下させた。開始点（onset point）は、融解転移の始まり（融解直前のケーキ変化の開始）における、ケーキ容積の最初の顕著な減少として、視覚的に推定し、ケーキの中間融点（Ｔｍ）は、ケーキが、完全な固体と完全な融解ケーキとの間でピクセル強度の半分を失う温度として、決定した。同様に、ケーキが、ピクセル強度（融解転移の開始時および終了時に対して正規化したもの）の２５および７５パーセントを損失した温度を、融解範囲の指標として、算出した。

【0301】

水分の測定
５％トレハロース含有凍結乾燥ケーキの水分含量は、Denver Instruments (Bohemia, NT) Coulometric Karl Fischer Titrator (Model 270) を用いて、２回の独立した凍結乾燥実行後の、凍結乾燥ＳＥ（２％油を用いた５％トレハロースのＳＥ）バイアルを２連（duplicate）で用いて、特徴解析した。滴定測定は中程度の攪拌速度で行い、１５秒の終点持続時間と、０.０５の終点の傾きを伴った。サンプルは、Riedel-de-Haens Hydranal AG Solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo）を用いて再構成し、秤量した溶液を滴定装置に注入した。本装置を用いた水分含量の質量測定に続いて、水分のパーセンテージを、％ｗ／ｗとして算出した。

【0302】

粒径およびゼータ電位
乳剤の粒径、多分散（ＰｄＩ）、およびゼータ電位を、Malvern (Worcestershire, UK) Nano-ZS による動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて、評価した。測定は、概して以前に記載された通りに行った（Fox et al., 2011, Pharmaceutical Development and Technology, 16(5):511-519）。簡単に述べると、全てのＤＬＳサイズ測定は、２０ｎｍで濾過した水（上述）への１０^−２希釈液中で行い、単一アリコートにおいて三連で評価した。ゼータ電位測定のために、同一のアリコートを、三連測定と、２０〜４０回の測定期間の自動ソフトウエア測定を用いて評価した。

【0303】

高速液体クロマトグラフィー
スクアレン、ＤＭＰＣ、およびＧＬＡの化学的分解を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってモニターした。Agilent 1200 (Santa Clara, CA)およびESA Biosciences Corona Charged Aerosol Detector (CAD; Chelmsford, MA)を、Waters Atlantics C18 μm culumn (4.6mm × 250mm; Milford, MA) と共に用いた。Fox et al., 2008, Colloids and Sufaces B: Biointerfaces, 65:98-105 を参照。移動相Ａは、１％酢酸と一緒に７５：１５：１０（ｖ／ｖ／ｖ）メタノール：クロロホルム：水、および２０ｍＭ酢酸アンモニウムを含有し、移動層Ｂは、２０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび１％酢酸と一緒に、５０：５０（ｖ／ｖ）メタノール：クロロホルムを含有した。サンプルは、再構成サンプルを、１：２０で移動相Ｂに希釈することにより、調製した。９μｌの注入を、４５分間の、カラム温度３０℃の、移動相Ａの１００％から１０％の直線勾配で用いた。使用した全ての溶媒はＨＰＬＣグレードであった。

【0304】

再構成の選別
２％ＳＥと、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトース、ラクツロース、デキストラン、ＰＥＧ、マンニトール、スタキオース、ソルビトール、およびプロリンをそれぞれ５％含む製剤を、３.１に記載されたように、作成した。ジピコリン酸およびニコチン酸による製剤もまた作成したが、溶解性の制約のために、０.５％で製剤化した。各製剤を、上述のように、再構成した。サンプルは、上述のように、ケーキの外観、クリーム化、粒径、ゼータ電位、ＰｄＩ、およびｐＨに従い、特徴解析した。

【0305】

ケーキの安定性の選別
５％化合物のサブセットの融点を、上述のように評価した。これらの化合物には、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、マンノース、フルクトース、ラクツロース、ラフィノース、リボース、スタキオース、マンニトール、およびプロリンが含まれた。追加調査として、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、またはスクロースを５％で含む製剤を、０.２％または５％マンニトールおよび２％ＳＥで作成した。これらの製剤を、上述のように、ケーキの融解、クリーム化、ｐＨ、ＰｄＩおよび粒径に従い、評価した。

【0306】

安定性の増進（accelerated stability）の特徴解析
５％トレハロース中で凍結乾燥したＳＥのバイアルを、２５、３７、５０、６０、および９０℃で保管し、１５００時間にわたり、あるいは完全な欠陥が観察されるまで、定期的に再構成した。サンプルを、各時点で、ＤＬＳ、ｐＨ、ＨＰＬＣ、およびケーキの外観によって、特徴解析した。非凍結乾燥ＳＥを、比較のために、同様に特徴解析した。より安定したシステムを開発するために、高いケーキ融点を示すと同定された製剤を、さらに増進した安定性の特徴解析のために選択した。製剤には、５％デキストロース、マルトース、スクロースおよびトレハロースが含まれた。１５％ラクトースを含む実験的な製剤もまた、含まれた。これらの製剤の安定性の増進を、これら全ての製剤における変化を捉えるために、９０℃で上述のように特徴解析した。

【0307】

結果
トレハロース中のＳＥの凍結乾燥
凍結乾燥製剤においてトレハロースが広範囲に使用されているため、乳剤の凍結乾燥の実現可能性を調べる目的で、トレハロース含有製剤を評価した。凍結乾燥後、５％トレハロースおよび２％ｖ／ｖスクアレンＳＥを含むケーキは、０.３％ｗ／ｗの水分含量および良好な再構成溶解性を有する、わずかに縮んだ白色のケーキを生み出した（図１Ａ）。再構成した乳剤は、非凍結乾燥製剤と、視覚的に同様に見えた。再構成時に、０.０２のＰｄＩの上昇とともに、平均粒径２１ｎｍの増加が観察された（図１Ｂ）。凍結乾燥および再構成は、ｐＨを変化させなかった。これらの結果は、凍結乾燥および再構成の後に、乳剤が保持されることについての、最初の推定を提供した。

【0308】

トレハロース中のＳＥの安定性の増進の特徴解析
トレハロース中のＳＥの凍結乾燥および再構成の成功に続いて、凍結乾燥および非凍結乾燥ＳＥの安定性を、凍結乾燥が乳剤の安定性を改善したかどうかを判定するために、評価した。再構成した凍結乾燥ＳＥの粒径（図２Ａ）およびｐＨ（図２Ｂ）に基づくと、凍結乾燥製剤は、２５℃および３７℃において、液体製剤よりも安定であった。これらの温度では、化学的組成における有意な変化は、液体または再構成した凍結乾燥ＳＥには、観察されなかった。凍結乾燥はまた、液体製剤において組成上の変化を誘導するのに必要な、高温での乳剤の化学的安定性を高めた（図２Ｃ）。特に、α-トコフェロール、スクアレン、および卵由来フォスファチジルコリン（egg-PC）は、液体製剤と比較して、凍結乾燥製剤において、全て保護されていた。さらに、油分離性の指標である、分離油相は、検出されなかった。このように、油が本システム内で再分布する、あるいは別の相に入る様子が見られなかったため、再構成後に粒子は乳剤のまま存在した。

【0309】

一次欠陥メカニズム（primary failure mechanism）の決定
トレハロースを上回って凍結乾燥ＳＥの安定性を促進させるために、一次欠陥メカニズムを測定するための研究が、本メカニズムを阻害する次世代の製剤を選択する意図で、行われた。凍結乾燥ＳＥを、２５、３７、５０、６０および９０℃の温度範囲で、最大１,５００時間、または、製剤が特性の限界を越えて機能を失うまで、保管した（図３）。凍結乾燥乳剤は、５０℃を超えると、はるかに安定性が低下した。最初に観察された変化は、ケーキのメルトバックと同時に生じた粒径の増加であった（図３Ａおよび図３Ｃ）。ｐＨの大きな変化は、粒子がサイズにより機能を失って初めて生じ始め（図３Ｂ）、それゆえに、一次欠陥メカニズムとは考えられなかった。このように、乳剤の成分濃度（図２Ｃ）およびｐＨ（図３Ｂ）は、最初に変化せず、本メカニズムは本来コバレント（covalent）ではないと仮定された。しかしながら、ケーキのメルトバックは、経時的に、粒径の増加と直接相関した（図３Ｄ）。ケーキのメルトバックは粒径の増加よりも速く起こったように思われたため、ケーキのメルトバック耐性は、ストレス条件下で、乳剤の粒径の安定性を維持するための重大な特質であった。

【0310】

ＳＥ再構成のための賦形剤の選別
推定された欠陥メカニズムに基づき、乳剤の特徴を保持し、メルトバック耐性のある化合物を同定するために、賦形剤の選別を行った（表１、図４）。賦形剤は、再構成後の、ケーキの構造および乳剤の特徴の維持によって、４つのクラスに分類した。これらのクラスの代表的なデータを、図５に示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0311】

クラス１賦形剤は、様々なケーキの形態を持つ白色のケーキを形成し、凍結乾燥後の乳剤の特徴は有意に変化させなかった（表１、図４Ａ−Ｂ）。このクラスには、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、フルクトース、およびラクツロースが含まれた。再構成した乳剤の粒径は、２００ｎｍより小さく、１時間ではクリーム化は観察されず、ＰｄＩは０.２５未満であった。ゼータ電位は−９ｍＶから、−１５ないし−２５ｍＶに減少した。ｐＨは、５.４から６.２に変化した。代表的なクラス１製剤である、５％トレハロースにおける凍結乾燥ＳＥのケーキの外観は、わずかに縮んでいたが許容可能であった（図５Ａ）。クリーム化は、２４時間以内には観察されず（図５Ｂ）、粒度分布は１５０ｎｍより下で、均質なままであった（図５Ｃ）。

【0312】

クラス２賦形剤のリボースは、凍結乾燥の際にはケーキを形成せず、代わりにフィルムを形成したが（図５Ａ）、乳剤は許容可能な粒径、ＰｄＩ、ゼータ電位、およびｐＨで再構成された（表１、図４Ａ−Ｂ）。

【0313】

クラス３の賦形剤は、良好なケーキを形成したが、再構成後に乳剤が破壊された（表１、図４、および図５）。再構成された粒径は、２００ｎｍを超え、ＰｄＩ値は大きく、０.５９ないし０.９３であった。ｐＨと、結果的にゼータ電位が、このグループ内で大きく異なった。凍結乾燥中に、ＰＥＧおよびマンニトール含有製剤で観察されたｐＨの大きな変化が生じた。凍結乾燥前のｐＨは５.５に調整されていた。大きな粒径と高い多分散性から予想されるように、クラス３の賦形剤は、再構成後にクリーム化を引き起こした（表１、図５Ｂ）。

【0314】

クラス４の賦形剤は、ケーキを形成せず、クラス３の化合物と同様に乳剤が破壊されたが、これらの製剤はクリーム化するのではなく、完全に再構成しなかった（表１、図４、および図５）。これらの賦形剤はそれぞれ、高いＰｄＩ値を伴う大きなＳＥ粒子と、４.３ないし５.１のｐＨをもたらした。ジピコリン酸およびニコチン酸は、極めて水に不溶性であり、これらの製剤は他の製剤の１０％の質量濃度で生産されることになった。このことは、これらの賦形剤による不十分な乳剤の維持の要因であるかもしれない。

【0315】

ケーキ熱安定性についての単一賦形剤の構造上の選別
代替の凍結乾燥賦形剤を同定した後、ケーキ形成性賦形剤の選択のために、ケーキの熱安定性を評価した。これは、より高い融点とより優れたメルトバック耐性を持つ賦形剤を同定する方法として、採用した（表２）。クラス１の賦形剤は、即時（開始温度の２７℃以下を意味する）から７８℃の範囲の、最低の開始点を有した。中間融点は、３６℃から９４℃の範囲であった。クラス３賦形剤は、９０℃を超える開始点を有し、全て１００℃を超える中間融点を有した。マンニトールは、１６０.１℃を中心とする、狭い融点範囲と、最大のケーキ安定性を示した。代表的な、ケーキ融解サーモグラムを、図６Ａに示す。ケーキの開始点および融点に基づく賦形剤の比較を、図６Ｂに示す。単糖類は、多糖類の賦形剤と比較して、はるかに低い融点を有することが明らかとなった。

【表2】

【0316】

製剤安定性に対するケーキ熱安定性の影響
ケーキ融点と熱安定性との相関を評価するために、異なる融点を持つ様々な糖においてＳＥの粒径増加速度を９０℃で評価した。広範囲の異なる融点を持つ、デキストロース、スクロース、マルトース、トレハロースの５％製剤、およびラクトースの１５％製剤の、安定性の違いを調べた（図７）。１５％ラクトース製剤は、５％ラクトース製剤よりも高い融点を有すると同定され、その融点が９０℃のストレス負荷的保管温度（stress strage temperature）を十分に超えるために、選択された。デキストロースは、最も低い融点を有することが観察され、最も速く粒径が増加した（図７Ａ）。スクロース、マルトースおよびトレハロースは、中間の融点を有し、中間の融解速度を示した。ケーキの融点が製剤において上昇するにつれて、粒径の増加は減少し、１５％ラクトースが最も高い融点と最も低い粒径増加速度を有した。さらに、この保管温度より高いＴｍを持つサンプルと、それより低いＴｍを持つサンプルの間で、粒子増加速度の分岐が見られ（図７Ｂ）、このことは、ケーキのメルトバックが、一次的な熱分解の欠陥メカニズムであることに対して、さらなる証拠を提供した。

【0317】

ケーキ熱安定性についての賦形剤の組み合わせの選別
マンニトールがケーキ熱安定性を増加させるという観察により（表２）、様々なクラス１賦形剤が、乳剤を維持するが、より優れたケーキ安定性を持つ製剤を生産する試みで、マンニトールと組み合わされた（表３、図８）。クラス１賦形剤は、マンニトール存在下で、乳剤の粒径の増加を減少させた。０.２％ｗ／ｖマンニトールの添加は、粒径またはＴｍを上昇させなかった。５％ｗ／ｖマンニトールは、ケーキのＴｍを大きく上昇させたが、乳剤の粒径およびＰｄＩを増加させ、同時にｐＨを低下させた。

【表3】

【0318】

実施例２：凍結乾燥されたアジュバント含有結核ワクチンの安定性
結核（ＴＢ）に対して唯一の承認されたワクチンであるウシ型弱毒結核菌ワクチン（ＢＣＧ）は、ヒトで１９２１年に最初に使用され、小児における播種性結核の発生率を低下させるのに有効であった。しかしながら、ＢＣＧは、青年および成人の肺結核の予防には効果がないと立証された（Checkley et al., 2011, Trends Pharmacol Sci, 32:601-606; Rowland et al., 2011, Expert Rev Vacceines, 10:645-658; Anderson et al., 2005, Nat Rev Microbiol, 3:656-662）。結核に対する効力６０％の仮想的な新しいワクチンの実用化の影響を数学的にモデル化したところ、２０５０年までに発生率の８０％の減少が予想されている（Abu-Raddad et al., 2009, PNAS, 106:13980-13985）。従って、ＢＣＧにより誘起された免疫を追加免疫するか、または、ＢＣＧを代替する、新しい結核ワクチンに対して緊急の必要性がある。結核菌（Ｍｔｂ）に対する防御免疫は、ＣＤ４Ｔ細胞によるＴＮＦおよびＩＦＮ−γの両方の産生を必要とする（Flynn et al., 2001, Annu Rev Immunol, 19:93-129; Cooper A.M., Annu Rev Immunol; 27:393-422）。４つのＭｔｂタンパク質、即ち、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３２６０およびＲＶ２６０８からなる、ＩＤ９３と呼ばれる組換え融合タンパク質抗原が開発された。これらの成分のタンパク質は、ＴＢ感染またはＢＣＧ免疫されたドナーのいずれからのヒトＴ細胞によっても認識されると同定され、水中スクアレン安定乳剤（ＧＬＡ−ＳＥ）中に製剤化された合成ＴＬＲ４アゴニストグルコピラノシル脂質アジュバントなどの強いＴＨ１応答を誘導するアジュバントと組み合わせると、マウスおよびモルモットモデルにおいて、Ｍｔｂ攻撃に対して保護的である（Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med, 2:53ra74; Bertholet et al., 2008, J Immunol, 181:7948-7947）。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥは、現在、ヒトのボランティアにおいてフェーズＩ安全性試験中である。

【0319】

ＩＤ９３およびＧＬＡ−ＳＥは、両方とも、継続的なコールドチェーン管理下で保管されると、１年以上安定であった。これらの条件下では、タンパク質濃度、ＧＬＡ濃度、粒径または物理的外観に変化は観察されなかった。安定性の観察は、４℃で分解に至る時間が推定されることなく、進行した。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの安定性は、他のワクチンと同等であったが、継続的コールドチェーン管理の必要性を減じるために、ワクチン熱安定性の上昇が望まれた。高温でのワクチン安定性を改善するためのひとつのアプローチは、ワクチンの抗原成分を凍結乾燥し、使用時にアジュバントと混合することであった。しかしながら、これはアジュバントのコールドチェーン管理を必要とし、ワクチン接種の技術的負担を高めた。この問題を克服するために、抗原ＩＤ９３とＧＬＡ−ＳＥアジュバントの両方の単一バイアル（「同一バイアル化（covialed）」と呼ばれる）が開発された。

【0320】

方法と材料
サンプルの調製および凍結乾燥
Ｍｔｂ遺伝子Ｒｖ３６１９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３６２０およびＲｖ２６０８を含むＩＤ９３タンデム型融合タンパク質の構築、発現および精製は、以前に説明されている（Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med, 2:53ra74）。簡潔に述べると、ＩＤ９３融合タンパク質を大腸菌に発現させ、ＤＥＡＥおよびQ Sepharose カラムでのクロマトグラフィーにより変性条件下で精製し、４−２０％Ｔｒｉｓグリシンゲル（Invitrogen）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＧＬＡ（ＰＨＡＤとしても知られる）は、Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL）から購入した。１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含むＧＬＡ−ＳＥは、以前に記載された方法に従って製剤化した（Orr et al., 2013 J Control Release 172:190-200; Anderson et al., 2010 Colloids Surf B: Biointerfaces 75:123-32）。簡潔に述べると、緩衝化した水相（ポロクサマー１８８およびグリセロールを含むリン酸アンモニウムバッファーｐＨ５.１）および油相（７０℃での超音波処理によりスクアレンに分散させたＤＭＰＣおよびＧＬＡ）を混合し、次いで、Microfluidics M110P (Newton, MA) を、３０,０００ｐｓｉで１２回のパスで使用して、混合物を微小流動化（microfluidizing）することにより、ＧＬＡ−ＳＥ乳剤を産生した。乳剤中の成分濃度は、１０％ｖ／ｖスクアレン、１.９％ｗ／ｖフォスファチジルコリン、０.１％ｗ／ｖポロクサマー１８８、２.３％ｗ／ｖグリセロールおよび２５ｍＭリン酸アンモニウムバッファーからなった。ＧＬＡ−ＳＥを、使用するための所定の濃度に希釈した。

【0321】

ＧＬＡ−ＳＥアジュバント含有ワクチンを分析するために、液体および凍結乾燥サンプルを、３ｍＬガラスバイアル中に、１.５ｍＬの充填量で調製した。ＩＤ９３（５μｇ／ｍＬ）＋ＧＬＡ−ＳＥ（５０μｇ／ｍＬ、総オイル２％）を含む同一バイアルサンプルを、２０ｍＭトロメタミン（Ｔｒｉｓ）中、ｐＨ８.０で調製した（Coler et al., 2011, PLoS One, 6, e16333）。別々にバイアルに入れたＩＤ９３またはＧＬＡ−ＳＥを、同一バイアルサンプルの２倍の濃度で調製し（１０μｇ／ｍＬＩＤ９３または１００μｇ／ｍＬＧＬＡ、総オイル４％ＧＬＡ−ＳＥ）、注射の前に１：１で混合した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルを１００μｇ／ｍＬ ＩＤ９３で調製し、分析を促進した。凍結乾燥したサンプルは、安定化剤として５％（ｗ／ｖ）Ｄ−トレハロース無水物も含み、これをVirTis (Gardiner, NY) AdVantage 2.0 EL-85 卓上凍結乾燥機を使用して凍結乾燥した。凍結乾燥の方法は、４℃から−４０℃への１０時間の凍結段階および−１５℃での徐冷段階を含む熱処理スケジュールを利用した。最初の乾燥期間（１００ｍＴｏｒｒにおける）は、−４０℃から２５℃まで１８時間続いた。最後に、５０ｍＴｏｒｒにおける第二の乾燥期間は２５℃で９時間行われた。全てのサンプルを、５００ｍＴｏｒｒにおける大気中で栓をし、アルミニウムキャップで封をして、使用するまで４℃で保管した。注射に先立ち、熱ストレスのサンプルを５０℃で３０日間保温し、ストレスなしのサンプルを４℃で保管した。

【0322】

ＳＬＡ−ＳＥアジュバント含有ワクチンの分析用に、凍結乾燥したサンプルを、３ｍＬガラスバイアル中に、１.５ｍＬ充填量で調製した。２％（ｖ／ｖ）油ＳＥ、５０μｇ／ｍＬ ＳＬＡ、１００μｇ／ｍＬ ＩＤ９３、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０および５％（ｗ／ｖ）トレハロースを含む同一バイアルサンプルを調製した。VirTis (Gardiner, NY) AdVantage 2.0 EL-85 卓上凍結乾燥機を使用して、サンプルを凍結乾燥した。凍結乾燥の方法は、４℃から−４０℃への１０時間の凍結段階および−１５℃での徐冷段階を含む熱処理スケジュールを利用した。最初の乾燥期間（１００ｍＴｏｒｒにおける）は、−４０℃から２５℃まで１８時間続いた。最後に、５０ｍＴｏｒｒにおける第二の乾燥期間は２５℃で９時間行われた。全てのサンプルを、５００ｍＴｏｒｒにおける大気中で栓をし、アルミニウムキャップで封をして、使用するまで４℃で保管した。注射に先立ち、熱ストレスのサンプルを５０℃で３０日間保温し、ストレスなしのサンプルを４℃で保管した。バイアルを２連で（ＡおよびＢと表す）特徴解析した。サンプルの再構成は、１.５ｍＬの濾過したＨ２Ｏで行った。

【0323】

還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１.２５％β−メルカプトエタノールを添加した Life Technologies (Grand Island, NY) NuPAGE LDS サンプルバッファーを使用して還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、９０℃で１５分間インキュベートした。１μｇ／レーンのＩＤ９３を使用して、１８０Ｖで６５分間、Life Technologies Novex 4-20% アクリルアミドトリス-グリシンプレキャストゲルカセット中でサンプルを走らせた。Life Technologies SimplyBlue SafeStain を使用してゲルを終夜染色し、脱色、乾燥および画像化した。ImageJ software (NIH) (Schneider et al., 2012, Nat Methods, 9:671-675）を使用して、バンドの強さを比較した。

【0324】

粒子の分析
粒径、多分散およびゼータ電位の測定を、以前に記載された通りに（Fox et al., 2008, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 65:98-105）、Malvern (Worcestershire, UK) Nano-ZSを使用して、20 nm Whatman (Maidstone, Kent, UK) Anotop plus filterで濾過された超純水で１００倍希釈後に行った。４０５ｎｍレーザーおよびHamamatsu Orca Flash 2.8 CMOS カメラ（Hamamatsu, JP）を備えたNanoSight LM10 (Amesbury, UK）で、ナノ粒子軌跡解析法を実施した。サンプルを、２０ｎｍ濾過超純水に３段階で１：１０５に希釈した。希釈の誤差をなくすために、各サンプルを４回独立して希釈し、分析した。最適化したシャッターと出力の設定で、各サンプルで９０秒のビデオを記録した。カメラヒストグラムのゲーティングは、感度を最高にするように調節した。NanoSight NTA 2.3 ソフトウェア（Wiltshire, UK）を標準モードで使用して、データ分析を実施した。

【0325】

アジュバントの化学的完全性
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を以前に記載の通りに使用して（Fox et al., 2008, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 65:98-105）、スクアレン、ＤＭＰＣ、ＧＬＡおよびＳＬＡの濃度を監視した。Agilent 1200 (Santa Clara, CA) およびESA Biosciences Corona Charged Aerosol Detector (CAD; Chelmsford, MA）を、Waters (Milford, MA) Atlantics C18 5 μm カラム (4.6 mm x 250 mm）と共に使用した。移動相Ａは、７５：１５：１０（ｖ／ｖ／ｖ）メタノール、クロロホルムおよび水を、２０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび１％酢酸と共に含んだ。移動相Ｂは、５０：５０（ｖ／ｖ）メタノールおよびクロロホルム、２０ｍＭ酢酸アンモニウム、および１％酢酸を含んだ。サンプルを移動相Ｂへの希釈（１：２０）により調製し、９μＬを３０℃のカラムに注入し、４５分間かけて１００％から１０％への移動相Ａの勾配での溶離を使用した。標準曲線は、検出器の製造業者が推奨する通り、二次多項式にフィットさせ、サンプル濃度を内挿法により決定した。

【0326】

動物および免疫化
６−８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを Charles River から購入し、特定病原体不在条件で維持した。感染後、動物を動物バイオセーフティレベル３の封じ込めで管理した。上記のワクチン調製物１００μＬの筋肉内注射により、マウスを３週間の間隔で３回免疫した。ＢＣＧ免疫には、５ｘ１０４ＣＦＵ（Pasteur 系統、Sanofi Pasteur）を、最初のサブユニットの免疫化の時に、皮内に一度注射した。

【0327】

血液細胞の計数
免疫化の１８時間後にマウス（Ｎ＝５／群）から末梢血を採取した。全血をＣＤ９０.２（クローン５３−２.１）およびＣＤ１９（クローン６Ｄ５）で染色した。Sphero AccuCount Rainbow Particles (Spherotech, Lake Forest, IL) を、製造業者の指示に従って添加した。細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。１０６までの事象を、四レーザーのLSRFortessa フローサイトメーター（BD Biosciences）に集めた。データを FlowJo で分析した。血液１マイクロリットル当たりのＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ９０.２＋Ｔ細胞の絶対数を、製造業者の指示に従って算出した。

【0328】

抗体反応
マイクロテイナ（microtainer）血清採集チューブ（VWR International, West Chester, PA）に後眼窩血を集め、遠心分離することにより、免疫化の２１日後にマウスの血清（Ｎ＝５／群）を調製した。各血清サンプルを抗体捕捉ＥＬＩＳＡにより分析した。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡプレート（Nunc, Rochester, NY）を、０.１Ｍ重炭酸バッファー中の１μｇ／ｍｌ組換え抗原で被覆し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロックした。次いで、ＰＢＳ／ツイーン２０での洗浄後に、連続的な順番で、連続希釈した血清サンプル、抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ−ＨＲＰ（全てSouthern Biotech, Birmingham, AL）およびＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２（Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）をプレートに添加した。プレートを４０５ｎｍで分析した（ELX808, Bio-Tek Instruments Inc, Winooski, VT）。

【0329】

細胞内サイトカイン染色
最後の免疫化から１ヵ月後に、各群５匹の動物から脾細胞を単離した。Red Blood Cell Lysis Buffer (eBioscience）を使用して赤血球を溶解し、ＲＰＭＩ１６４０および１０％ＦＢＳに再懸濁した。細胞を２ｘ１０６個／ウェルで９６ウェルプレートに播き、培地またはＩＤ９３（１０μｇ／ｍＬ）で１時間、３７℃で刺激した。GolgiPlug (BD Biosciences）を添加し、細胞をさらに７時間３７℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、ＣＤ１６／３２（クローン２.４Ｇ２）に対する抗体の存在下で、ＣＤ４（クローンＧＫ１.５）、ＣＤ８（クローン５３−６.７）およびＣＤ４４（クローンＩＭ７）に対する蛍光色素標識抗体（BioLegend and eBioscience）で、２０分間４℃で表面染色した。細胞を洗浄し、Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences）で、２０分間、室温で透過処理した。細胞をPerm/Wash（BDBiosciences）で２回洗浄し、ＩＦＮ−γ（クローンＸＭＧ−１.２）、ＩＬ−２（ＪＥＳ６−５Ｈ４）、ＴＮＦ（ＭＰ６−ＸＴ２２）、ＣＤ１５４（クローンＭＲ１）、ＩＬ−５（クローンＴＲＦＫ５）およびＩＬ−１７Ａ（クローンＴＣ１１−１８Ｈ１０.１）に対する蛍光色素標識抗体（BioLegend and eBioscience）で、２０分間室温で細胞内染色した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。１０６までの事象を、四レーザーのLSRFortessa フローサイトメーター（BD Biosciences）に集めた。データをFlowJoで分析した。細胞に、シングレット＞リンパ球＞ＣＤ４＋ＣＤ８−＞ＣＤ４４＋＞サイトカイン陽性でゲートをかけた。

【0330】

結核菌エアロゾル攻撃および数え上げ
最後の免疫化から４週間後に、肺に５０ないし１００個の細菌を送達するように設定されたGlasCol エアロゾル発生装置を使用して、マウス（ｎ＝７／群）を結核菌Ｈ３７Ｒｖ（ATCC No. 35718; American Type Culture Collection）に空気感染させた。送達された細菌の量を確認するために、さらに感染毎に３匹の非免疫動物を１日後に安楽死させ、肺における細菌の負荷を数え上げた。攻撃の３週間後に、感染したマウスから肺を回収し、組織を０.１％ＰＢＳ−ツイーン８０中でホモジナイズし、細菌の増殖のために５倍連続希釈で７Ｈ１０寒天プレート（Molecular Toxicology）に播くことにより、防御を測定した。３７℃、５％ＣＯ２で１４ないし２１日間インキュベートした後に、細菌のコロニーを計数した。

【0331】

統計の方法
細菌の負荷を、log10 変換により標準化した。細菌の負荷、サイトカイン産生、血液細胞数、および抗体力価における統計的有意差を、Prism 5 (GraphPad Software）を使用するボンフェローニ（Bonferroni）多項比較検定による一元配置分散分析を使用して決定した。

【0332】

結果
ＧＬＡ−ＳＥアジュバント含有ワクチン製剤の物理化学的特徴解析
この同一バイアル化したアジュバント含有ワクチンの凍結乾燥の方法を開発した。凍結乾燥の際に、白色の部分的に縮んだケーキが形成され、水での再構成後、乳剤が再形成され、凍結乾燥前乳剤と同様に見えた（図９、上段）。液体または凍結乾燥したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥを５０℃で３０日間保温することにより、凍結乾燥により熱ストレスに対する安定性を高める可能性を評価した。熱ストレス後、ストレスのないサンプル（図９、上段）と比較して、サンプルの品質に目に見える変化は観察されなかった（図９、下段）。再構成されたサンプルは、乳剤の外観を維持し、凍結乾燥したケーキは、さらなる崩壊または変色の兆候を示さなかった。

【0333】

粒子の特徴は、粒径がインビボでのワクチンの輸送の速度およびメカニズムを決定するため、有効なワクチンの開発に決定的である。製品の最終的な滅菌濾過を可能にするために、２００ｎｍ未満の粒径を維持するのが望ましい；加えて、粒径＜２００ｎｍは、リンパ節に迅速に接近できる（Bachmann et al., 2010, Nature Rev Immunol, 10:787-796）。同一バイアル化または同一バイアル化したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥および再構成が、ＩＤ９３の生物物理学的特性、粒径、濃度、多分散および全体的なゼータ電位を変えるか否かを評価するために、ＧＬＡ−ＳＥ、同一バイアルＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥおよび凍結乾燥した同一バイアルＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥを試験した。混合後に測定された粒子の特徴は、ＧＬＡ−ＳＥの粒子濃度はＩＤ９３と比較して５桁高いので、ＧＬＡ−ＳＥの貢献を主に反映した。ＩＤ９３とＧＬＡ−ＳＥの同一バイアル化は、ＧＬＡ−ＳＥ単独と比較して、粒径に影響を与えなかった（両ケースで８０ｎｍ）（図１０Ａ）。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥およびその後の再構成は、測定の誤差範囲内である約１０ｎｍの小さい増加をもたらした。ＩＤ９３は、Ｚ平均粒径約７０ｎｍの多分散の凝集体を形成した。ＩＤ９３単独の熱ストレスは、観察される平均粒径を低下させた；しかしながら、これは統計学的に有意ではなかった（ｐ＞０.０５）（図１０Ａ）。ＧＬＡ−ＳＥ単独またはＩＤ９３との組合せの熱ストレスは、試験したどのプラットフォームでも、粒径または濃度に影響しなかった（図１０Ａおよび図１０Ｄ）。ＧＬＡ−ＳＥは、低い多分散値に反映される通り、均一性の高い溶液であった（図１０Ｂ）。ＩＤ９３に観察される多分散の程度は大幅に高いが、ＩＤ９３とＧＬＡ−ＳＥの混合物は、ＧＬＡ−ＳＥの全体的な多分散が低い特徴を保持し、ＩＤ９３とＧＬＡ−ＳＥ粒子の相対的割合を反映した。重要なことに、凍結乾燥および再構成したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥは、この均一な粒径を保持した。熱ストレスへの暴露は、液体または凍結乾燥のフォーマットで、ＩＤ９３、ＧＬＡ−ＳＥまたは同一バイアル化したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの多分散に影響しなかった。ＩＤ９３およびＧＬＡ−ＳＥは両方とも、現在の配置で、全体的な亜陰性ゼータ電位を有する。この２つを混合すると、平均ゼータ電位−１３ｍＶとなり、それは凍結乾燥により影響を受けなかった（図１０Ｃ）。熱ストレスに際して、より陰性のゼータ電位が全てのＧＬＡ−ＳＥ含有サンプルに見られた；しかしながら、この変化は凍結乾燥したＩＤ９３＋ＧＬＡ＿ＳＥについてのみ統計的に有意であった（ｐ＜０.０２５）。全体的なＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥および再構成は、凍結乾燥されていないＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥと比較して、物理化学的特徴を変化させない。ＩＤ９３の物理化学的特徴は、長期間の高温への暴露により有意に影響を受けたが、ＧＬＡ−ＳＥは受けなかった。

【0334】

同一バイアル化、凍結乾燥および熱ストレスがＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの化学的完全性にどのように影響するかを評価するために、ＳＤＳ ＰＡＧＥによりＩＤ９３濃度を、そして、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ＧＬＡ、スクアレンおよびＤＭＰＣ（後者の２つは、安定乳剤の主成分であった）濃度を評価した。５μｇ／ｍＬではＩＤ９３をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出できないため、１００μｇ／ｍＬのＩＤ９３を含有するサンプルを評価した。１００μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬのＩＤ９３を含有する同一バイアル化したサンプルは、液体、凍結乾燥および熱ストレス条件下で、粒径、粒子濃度、ゼータ電位およびＧＬＡ分解プロフィールに関して同様に振る舞うと判明した。ＧＬＡ−ＳＥは、おそらくＳＤＳによる乳剤粒子の破壊のため、不明瞭なスメアとして流れ、染色後に可視であった。同一バイアル化したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥および再構成は、ＩＤ９３濃度の５−１０％の減少をもたらし、それは再構成時の希釈によると予測され、ＩＤ９３の実質的な加水分解は起こらなかったことを示した（図１１）。５０℃、１ヵ月間の熱ストレスへの暴露後に、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ中に存在するＩＤ９３に劇的な減少があった。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、タンパク質をこの分解に対して耐性にし、液体サンプルおよび凍結乾燥サンプルに、ストレスのないサンプルと比較して、熱ストレス後にそれぞれ６％および９０％のＩＤ９３のバンド強度が観察された（図１１）。従って、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、ＩＤ９３タンパク質を熱ストレスにより誘導される分解から保護した。

【0335】

予想された通り、ＧＬＡ−ＳＥを１：１でＩＤ９３と混合した後、最初の濃度の約半分のＧＬＡ、ＤＭＰＣおよびスクアレンが測定され、凍結乾燥および再構成後にこれらの物質は失われなかった（図１２Ａ）。液体ＧＬＡ−ＳＥの熱ストレスへの暴露は、ＧＬＡ濃度の５０％の損失をもたらした（ｐ＜０.００１）。これは、ＩＤ９３との同一バイアル化により、熱ストレス後に検出可能なＧＬＡがない程度まで悪化した（図１２Ａ）。この感受性の増強は、ＧＬＡ−ＳＥ単独と比較して、同一バイアル化したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥのｐＨがより塩基性であるためであり得る。このＧＬＡの損失は、同一バイアル化したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥により改善され、約５０％のＧＬＡが、熱ストレスを受けた凍結乾燥ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの再構成後に回復した（図１２Ｄ）。ＤＭＰＣまたはスクアレン濃度は熱ストレスに影響されなかったので、ＧＬＡ−ＳＥの主な熱に不安定な成分はＧＬＡであった（図１２Ｂ−Ｄ）。総合すると、これらのデータは、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの２種の活性成分が、凍結乾燥により熱誘導性分解から保護されたことを示す。

【0336】

全体的に見て、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、同一バイアル化したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの化学的および生物物理学的特性を再構成時に保持する、白色ないしオフホワイト色のケーキをもたらした。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの熱ストレスへの暴露は、ＩＤ９３およびＧＬＡの両方の有意な損失をもたらした。同一バイアル化したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、これらの熱ストレスによる損失を大いに改善し、このアプローチがこのワクチン候補のコールドチェーン管理の必要性を低減または排除し得ることを示す。

【0337】

ワクチンの免疫原性およびＧＬＡ−ＳＥアジュバント含有ワクチン製剤の効力
熱ストレスがＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの生物学的活性にどのように影響するかを判定するために、そして、凍結乾燥が有害な影響を改善するか否かを判定するために、液体抗原とアジュバント（液体）の別個のバイアル、抗原およびアジュバントの混合物（液体同一バイアル）または同時凍結乾燥した抗原およびアジュバント（凍結乾燥同一バイアル）として保管されたＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥまたは塩水で、マウスを免疫した。免疫化に先立ち、免疫化物質を、４℃（即ち、ストレスなし）または５０℃（即ち、熱ストレスあり）で、１ヵ月間保管した。免疫後、ＢおよびＴ細胞は抗原と遭遇すると流入領域リンパ節へ戻るので（Shiow et al., 2006, Nature, 440:540-544）、循環しているＢおよびＴ細胞の血液からの一過性の喪失があった。この一過性のリンパ球減少は、抗原提示細胞と同族のリンパ球との効果的な相互作用に必要な過程においてリンパ球が一次的にリンパ節に捕捉されるので、リンパ節シャットダウンと呼ばれる。ＧＬＡ−ＳＥアジュバントはこの効果を増大させ、このことはその優れたアジュバント活性の一部を説明し得る。ストレスのない液体ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥによる免疫は、血液からのＢおよびＴ細胞の両方の劇的な喪失を誘起した（図１３Ａ）。液体ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥに５０℃で１ヵ月間ストレスを与えると、この効果は減少し、ＧＬＡの活性が熱ストレスにより損なわれたことを示唆する。ストレスのない液体同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥは、液体ワクチンと同じくらい効率的にリンパ節シャットダウンを誘導したが、この液体同一バイアルの物質は、おそらく検出可能なＧＬＡの損失を反映して、リンパ節シャットダウンの程度が顕著に減少したように、熱ストレスにより一層影響を受けた（図１３Ａ）。凍結乾燥した同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥは、液体の物質と同程度に、一過性のリンパ球減少症を誘起したが、液体同一バイアルの物質と異なり、この効果は凍結乾燥した同一バイアルのワクチンの熱ストレスにより損なわれなかった。これらのデータは、ＧＬＡ−ＳＥアジュバントの生物学的活性は、熱ストレスに感受性であり、これは、ＩＤ９３抗原との同一バイアル化により悪化することを示唆した。重要なことに、このパラメーターから読み取れる通り、凍結乾燥は、同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥに熱ストレスの損傷に対する耐性を与えた。

【0338】

ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの生物学的活性に対する熱ストレスおよび凍結乾燥の影響をより詳細に調べるために、免疫化後のＩＤ９３特異的抗体の力価を評価した。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥによる免疫化は、ＩｇＧ２ｃ産生に傾いている、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ｃの混合された応答を誘起した。これは、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥによりもたらされる、ＩＦＮ−γに支配されるＣＤ４Ｔ細胞応答を反映するものであった。熱ストレスへの暴露は、液体ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥが測定可能な抗体力価を誘起する能力を有意に損なった（図１３Ｂ）。これは、おそらく、熱ストレス時のＩＤ９３タンパク質の分解に起因した（図１１）。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥを同一バイアル化することは、ワクチンを４℃で保管したときに抗体応答の規模を変化させなかったが、これは、熱ストレスに起因する抗体誘導能力の損失を防止するには十分ではなかった。逆に、凍結乾燥した同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥは、規模およびＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃの傾きにおいてストレスのない液体の物質と同様の強い抗体応答を誘起し、これは熱ストレスにより損なわれなかった（図１３Ｂ）。

【0339】

ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦおよびＩＬ−２を産生するＩＤ９３特異的ＣＤ４Ｔ細胞（即ち、ＴＨ１細胞）を誘導することにより、結核菌に対して防御した。熱ストレスへの暴露は、これらのサイトカインのいずれの産生によっても測定される通り、液体ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥによる３回目の免疫化の後、ＩＤ９３特異的ＴＨ１細胞の頻度をほぼ５０％まで減らした（図１３Ｃ）。ＩＤ９３タンパク質の分解にも拘わらず、ストレスを受けた液体ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥに対するＴＨ１応答が維持されたことは、おそらく、熱暴露後の免疫原性ペプチドおよび残存ＧＬＡの存在を反映した。液体ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの同一バイアル化は、４℃で保管するとＴＨ１応答の規模をわずかに増大させたが、熱ストレスへの暴露は、液体の単一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥがそのような応答を誘起する能力を完全に除去した。凍結乾燥した同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥは、液体ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥで産生されるものと同様のレベルまで、ＴＨ１応答を誘導した。重大なことに、液体または液体の同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥとは異なり、凍結乾燥した同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥは、熱ストレス後にＩＤ９３特異的ＴＨ１細胞を誘起する能力を十分に保持した（図１３Ｃ）。未変性のＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥでの免疫化で誘起されるＩＤ９３特異的ＣＤ４Ｔ細胞は、専らＴＨ１細胞であり、再刺激の際にＩＬ−５（ＴＨ２）またはＩＬ−１７（ＴＨ１７）を産生しないことは、以前に決定された（Orr et al, 2013, Eur J Immunol.）。同一バイアル化、凍結乾燥および／または熱ストレスへの暴露は、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥによる、検出可能なＩＬ−５またはＩＬ−１７産生により測定されるＴＨ２またはＴＨ１７細胞のいずれの誘導も増強しなかった。刺激後のＣＤ１５４の産生は、サイトカイン産生に拘わらず、ＣＤ４Ｔ細胞活性化の全般的なマーカーであると提唱された（Frentsch et al, 2005, Nat Med, 11:1118:1124）。全ての場合で、ＣＤ１５４発現レベルは、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦの両方のそれを密接に写し、ＴＨ１プログラミングからの逸脱がなかったことをさらに示す。全体的に見て、初期のリンパ球が血液から出て行くことの障害（図１３Ａ）は、その後のＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン接種に対する抗体（図１３Ｂ）およびＣＤ４Ｔ細胞応答（図１３Ｃ）の両方の損失と強く相関する。

【0340】

熱ストレス、同一バイアル化および凍結乾燥がＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの防御効力にどのように影響するかを評価するために、免疫化したマウスを、低用量のエアロゾル化した結核菌で攻撃した。３週間後、液体ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥで免疫された動物は、肺および脾臓における細菌負荷の減少により測定される通り、塩水で免疫された動物と比較して、有意に結核菌に対して防御された（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。液体ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥに別々に熱ストレスをかけることは、おそらくこの免疫化により誘起される残存ＩＤ９３特異的ＴＨ１応答を反映して、この防御効力を損なわなかった（図１３Ｃ）。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの同一バイアル化は、４℃で保管したとき、防御効力を損なわなかったが、液体の同一バイアル化したワクチンは、熱ストレスに暴露されると、全ての防御効力を喪失した。同一バイアル化したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は防御効力を維持し、最も重要なことに、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、熱ストレスによる防御効力の喪失を排除した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。

【0341】

抗原とナノ乳剤アジュバントの同時凍結乾燥および再構成は、ワクチンの物理化学的特徴を有意に変更しなかった。再構成の際、抗原およびＴＬＲ４アゴニストＧＬＡ、並びにスクアレン油の濃度は、出発物質のそれと実質的に相違しなかった。長期にわたる熱ストレスへの暴露は、液体の同一バイアルまたは同時凍結乾燥ワクチンのいずれの物理的特徴にもほとんど影響しなかった；しかしながら、熱への暴露は、抗原およびＴＬＲ４アゴニストの化学的分解を導いたが、アジュバントのスクアレンまたはリン脂質成分の化学的分解は導かなかった。同時凍結乾燥は、このＴＬＲ４アゴニストの損失を部分的に保護した。

【0342】

熱ストレスによるＧＬＡの損失は、実験動物に投与された場合のワクチンの免疫応答および防御効力の減損を強く予言するものであった。この関係は完全に線形ではなかったが、液体サンプルにおけるＧＬＡの減少は、免疫化後のＩＤ９３特異的ＣＤ４Ｔ細胞の頻度の減少をもたらした。熱ストレスを受けた液体同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥにおけるＧＬＡの完全な損失は、ＣＤ４Ｔ細胞誘導の喪失と合致した。逆に、液体サンプルにおけるＩＤ９３タンパク質の分解は、ＣＤ４Ｔ細胞応答の規模にはほとんど影響しなかった。理論に縛られることは望まないが、これは、おそらく、熱ストレスを受けたサンプルに、Ｔ細胞応答を引き起こすのに必要な免疫優性ペプチドが保持されていたためであろう。一方、熱に誘導されたＩＤ９３の分解は、ワクチンに対する抗体応答の規模を有意に損なった。ＩＤ９３特異的抗体の多くが、構造依存的であり得る。さらに、残存する抗体応答は、優先的にＩｇＧ１であり、ＧＬＡの損失がＩｇＧ２ｃの傾きを引き起こしたことを示す。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの同時凍結乾燥は、熱ストレスに誘導されるＩＤ９３特異的抗体応答の喪失を大きく防止し、これは、タンパク質の構造がこの過程により保護されたことを示す。このことは、熱ストレスに対する抗原の保護は、防御効力をＴ細胞に依存するＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥなどのワクチンよりも、防御効力を抗体応答に依存するワクチンにとって、より重要なパラメーターであることを示唆し得る。実際に、熱ストレスを受けた別のバイアルに入れられた液体ワクチンは、エアロゾル化したＭｔｂによる実験的攻撃に対してある程度の防御効力を保持した。熱ストレスに直面して、凍結乾燥によりＧＬＡ濃度を保持する能力、ＴＨ１誘導の保持、および防御効力の維持の間に、明確な関係がある。

【0343】

ＳＬＡ−ＳＥアジュバント含有ワクチン製剤の物理化学的特徴解析
同一バイアル化したＳＬＡ−ＳＥアジュバント含有ＩＤ９３ワクチンの凍結乾燥の方法を開発した。凍結乾燥の際に、白色の部分的に縮んだケーキが形成され、水での再構成後、乳剤が再形成された（図１５）。凍結乾燥により熱ストレスに対する安定性が高まる可能性を、凍結乾燥したＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥサンプルを２連で（ＡおよびＢ）、５０℃で３０日間保温することにより評価した。熱ストレス後、ストレスのないサンプル（図１５；０日間Ａおよび０日間Ｂ）と比べて、サンプルの品質に目に見える変化は観察されなかった（図１５；３０日間Ａおよび３０日間Ｂ）。再構成されたサンプルは、乳剤の外観を維持し、再構成の２４時間後にクリーム化を示さず、凍結乾燥したケーキは、さらなる崩壊または変色の兆候を示さなかった。

【0344】

同一バイアル化、凍結乾燥および熱ストレスがＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥの化学的完全性にどのように影響するかを評価するために、再構成された製剤におけるＩＤ９３濃度をＳＤＳ ＰＡＧＥにより評価した（図１６）。１μｇ／ｍＬＩＤ９３を含む再構成されたサンプルを、各レーンに載せた。ＩＤ９３は、試験した全てのサンプルにおいて、９８ｋＤａのバンドとして観察された。ストレスを受けた同一バイアルのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥの凍結乾燥および再構成は、ストレスを受けた同一バイアルのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥと比較して、ＩＤ９３の実質的な加水分解をもたらさなかった（図１６）。従って、ＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、熱ストレスにより誘導される分解からＩＤ９３タンパク質を保護した。

【0345】

凍結乾燥および再構成した同一バイアルのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥの熱ストレスがこのアジュバント含有ワクチンの生物物理学的特性を変更するか否かを評価するために、ストレスまたは非ストレス条件下で、凍結乾燥した同一バイアルのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥの粒径、濃度、多分散および全体的なゼータ電位を調べた。凍結乾燥および再構成した同一バイアルのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥの熱ストレスは、ストレスなしの同一バイアルのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥと比較して、粒径または多分散の凝集体（図１７Ａ−Ｃ）またはゼータ電位（図１８）を有意に変更しなかった。凍結乾燥および再構成した同一バイアルのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥと同様に、凍結乾燥および再構成した同一バイアルのＩＤ９３＋ＳＬＡ−ＳＥの熱ストレスは、ＳＬＡの約５０％の回復をもたらした（図１９）。

【0346】

実施例３：凍結乾燥ワクチン乳剤製剤および長期安定性
同一バイアル化したＧＬＡ−ＳＥアジュバント含有ＩＤ９３ワクチンの凍結乾燥の方法を開発した。長期安定性を評価した製剤は、実施例１で記述した製剤と同一であり、２％ｖ／ｖスクアレン、０.４％ｗ／ｖＤＭＰＣ、０.０２％ｗ／ｖポロクサマー１８８、０.５％ｗ／ｖグリセロール、および５ｍＭリン酸アンモニウムに、２０ｍＭトロメタミンおよび５％ｗ／ｖトレハロース存在下で凍結乾燥したＩＤ９３ポリペプチドを加えたものから成るＧＬＡ−ＳＥ製剤であった。凍結乾燥時に、白色の、部分的に縮んだケーキが形成され、水による再構成後に、乳剤は、目に見えるクリーム化の徴候なく、再形成された（図２０）。凍結乾燥によって熱ストレスに対する安定性を増加させる可能性を、凍結乾燥したＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの二連のサンプル（ＡおよびＢ）を４℃、２５℃、および３７℃で保温することによって評価した。

【0347】

３ヵ月間の安定性データ
３ヵ月間、４℃、２５℃、および３７℃で保管することによって、ケーキの外観、または再構成時に好適な乳剤を形成する能力において、開始時（time zero）と比較して変化は見られない（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。凍結乾燥したケーキは、崩壊または変色のさらなる徴候を示さず、再構成したサンプルは、再構成後２４時間までは、クリーム化することなく、乳剤の外観を維持した。

【0348】

凍結乾燥したアジュバント含有ワクチンＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの生物物理学的特性を、粒径（Z-Aved nm）および多分散（ＰＤＩ）に関して、４℃、２５℃、および３７℃で保管したサンプルについて３ヵ月目に調べた。３ヵ月目に、製剤は、３７℃までの保管温度のいずれにおいても、粒径または凝集体において、顕著な変化を示さなかった（図２１Ｂ）。

【0349】

同一バイアル化、凍結乾燥および熱ストレスが、４℃、２５℃、および３７℃で３ヵ月間保管した凍結乾燥乳剤において、ＩＤ９３ポリペプチドの化学的完全性にどのように影響を与えるかを評価するために、再構成された製剤をＳＤＳ ＰＡＧＥで調べた（図２１Ｃ）。レーン当たり、１μｇ／ｍＬ ＩＤ９３を含む再構成されたサンプルを、負荷した。ＩＤ９３は、試験した全てのサンプルにおいて、９８ｋＤａのバンドとして観察された。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥および再構成は、ＩＤ９３ポリペプチドの実質的な加水分解をもたらさない。それゆえ、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、ＩＤ９３タンパク質を、熱ストレスにより誘導される分解から保護する。

【0350】

ＳＥ製剤の化学的完全性を、ＨＰＬＣによって評価し、ＤＭＰＣおよびスクアレンについて分析した。図２１Ｄの結果は、水中油乳剤のどちらの成分の損失も分解も示していない。

【0351】

４℃、２５℃および３７℃で保管した凍結乾燥ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ製剤におけるアジュバントの濃度を評価した（図２１Ｅ）。データは、いずれの保管温度でも、３ヵ月目において、最初の濃度の５０μｇ／ｍｌからＧＬＡの顕著な損失はなかったことを示している。

【0352】

６ヵ月間の安定性データ
６ヵ月間、４℃、２５℃、または３７℃で保管することによって、ケーキの外観または再構成時に好適な乳剤を形成する能力において、開始時と比較して変化は見られない（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。凍結乾燥したケーキは、崩壊または変色のさらなる徴候を示さず、再構成したサンプルは、再構成後２４時間までは、クリーム化することなく、乳剤の外観を維持した。

【0353】

凍結乾燥したアジュバント含有ワクチンＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの生物物理学的特性を、粒径（Z-Aved nm）および多分散（ＰＤＩ）に関して、４℃、２５℃、および３７℃で保管した凍結乾燥サンプルについて、６ヵ月目に調べた。６ヵ月目に、製剤は、３７℃までの保管温度のいずれにおいても、粒径または凝集体において、顕著な変化を示さなかった（図２２Ｂ）。

【0354】

同一バイアル化、凍結乾燥および熱ストレスが、４℃、２５℃、および３７℃で６ヵ月間保管後に、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ凍結乾燥乳剤において、ＩＤ９３ポリペプチドの化学的完全性にどのように影響を与えるかを評価するために、再構成された製剤をＳＤＳ ＰＡＧＥで調べた（図２２Ｃ）。レーン当たり、１μｇ／ｍＬ ＩＤ９３を含む再構成されたサンプルを、負荷した。ＩＤ９３は、試験した全てのサンプルにおいて、９８ｋＤａのバンドとして観察された。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥および再構成は、ＩＤ９３の実質的な加水分解をもたらさない。それゆえ、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、ＩＤ９３タンパク質を、熱ストレスにより誘導される分解から保護する。

【0355】

ＳＥ製剤の化学的完全性を、ＨＰＬＣによって評価し、ＤＭＰＣおよびスクアレンについて分析した。図２２Ｄの結果は、水中油乳剤のどちらの成分の損失も分解も示していない。

【0356】

４℃、２５℃および３７℃で保管した凍結乾燥ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ製剤におけるアジュバントの濃度を評価した（図２２Ｅ）。データは、６ヵ月目において、４℃または２５℃の保管温度で、最初の濃度の５０μｇ／ｍｌからＧＬＡの顕著な損失はなかったことを示しているが、３７℃の保管温度で、約５０％のＧＬＡの損失を示している。

【0357】

９ヵ月間安定性データ
９ヵ月間、４℃、２５℃、または３７℃で保管することによって、ケーキの外観または再構成時に好適な乳剤を形成する能力において、開始時と比較して変化は見られない（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。凍結乾燥したケーキは、崩壊または変色のさらなる徴候を示さず、再構成したサンプルは、再構成後２４時間までは、クリーム化することなく、乳剤の外観を維持した。

【0358】

凍結乾燥したアジュバント含有ワクチンＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの生物物理学的特性を、粒径（Z-Aved nm）および多分散（ＰＤＩ）に関して、４℃、２５℃、および３７℃で保管したサンプルについて、９ヵ月目に調べた。９ヵ月目に、製剤は、３７℃までの保管温度のいずれにおいても、粒径または凝集体において、顕著な変化を示さなかった（図２３Ｂ）。

【0359】

同一バイアル化、凍結乾燥および熱ストレスが、４℃、２５℃、および３７℃で９ヵ月間保管後に、ＩＤ９３ポリペプチドの化学的完全性にどのように影響を与えるかを評価するために、再構成された製剤をＳＤＳ ＰＡＧＥで調べた（図２３Ｃ）。レーン当たり、１μｇ／ｍＬ ＩＤ９３を含む再構成されたサンプルを、負荷した。ＩＤ９３は、試験した全てのサンプルにおいて、９８ｋＤａのバンドとして観察された。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥および再構成は、ＩＤ９３の実質的な加水分解をもたらさない。それゆえ、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、ＩＤ９３タンパク質を、熱ストレスにより誘導される分解から保護する。

【0360】

ＳＥ製剤の化学的完全性を、ＨＰＬＣによって評価し、ＤＭＰＣおよびスクアレンについて分析した。図２３Ｄの結果は、９ヵ月間保管後に、水中油乳剤のどちらの成分の損失も分解も示していない。

【0361】

４℃、２５℃および３７℃で保管した凍結乾燥ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ製剤におけるアジュバントの濃度を評価した（図２３Ｅ）。データは、４℃または２５℃において、最初の濃度の５０μｇ／ｍｌと比較して、ＧＬＡの顕著な損失はなかったことを示しているが、３７℃の保管温度で、６ヵ月目に見られたのと同様に、９ヵ月目において、約６９％のＧＬＡの損失を示している。

【0362】

１２ヵ月間安定性データ
１２ヵ月間、４℃、２５℃、または３７℃で保管することによって、ケーキの外観または再構成時に好適な乳剤を形成する能力において、開始時と比較して変化は見られない（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。凍結乾燥したケーキは、崩壊または変色のさらなる徴候を示さず、再構成したサンプルは、再構成後２４時間までは、クリーム化することなく、乳剤の外観を維持した。

【0363】

凍結乾燥したアジュバント含有ワクチンＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの生物物理学的特性を、粒径（Z-Aved nm）および多分散（ＰＤＩ）に関して、４℃、２５℃、および３７℃で保管したサンプルについて、１２ヵ月目に調べた。１２ヵ月目に、製剤は、３７℃までの保管温度のいずれにおいても、粒径または凝集体において、顕著な変化を示さなかった（図２４Ｂ）。

【0364】

同一バイアル化、凍結乾燥および熱ストレスが、４℃、２５℃、および３７℃で１２ヵ月間保管後に、ＩＤ９３ポリペプチドの化学的完全性にどのように影響を与えるかを評価するために、再構成された製剤をＳＤＳ ＰＡＧＥで調べた（図２４Ｃ）。レーン当たり、１μｇ／ｍＬ ＩＤ９３を含む再構成されたサンプルを、負荷した。ＩＤ９３は、試験した全てのサンプルにおいて、９８ｋＤａのバンドとして観察された。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥および再構成は、ＩＤ９３の実質的な加水分解をもたらさない。それゆえ、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの凍結乾燥は、１２ヵ月目において、ＩＤ９３タンパク質を、熱ストレスにより誘導される分解から保護する。

【0365】

４℃、２５℃および３７℃で保管した凍結乾燥ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥ製剤におけるアジュバントの濃度を評価した（図２３Ｅ）。データは、４℃または２５℃において、最初の濃度の５０μｇ／ｍｌと比較して、ＧＬＡの顕著な損失はなかったことを示しているが、３７℃の保管温度で、１２ヵ月目において、６９％のＧＬＡの損失を示している。

【0366】

実施例４：より高温での熱安定性が改善され、アジュバントの欠損がない、単一および多相の賦形剤系における、凍結乾燥ワクチン乳剤製剤および安定性
凍結乾燥および製剤化した水中油安定乳剤は、実施例１に記載の材料を使用し、実施例１に記載の方法に従って、調製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した水中油安定乳剤（ＳＥ）製剤の特性は、再構成され、実施例１に記載の通り、融点、水分測定、粒径およびゼータ電位、高速液体クロマトグラフィーによる化学分解、再構成選別、ケーキ安定性選別、および安定性の増進の特徴として、解析した。

【0367】

予備実験に基づき、グリセロールの等張化剤としての使用が、２５℃を超える温度での本発明の製剤の熱不安定性に寄与している可能性があると仮定された。本発明の製剤において等張化剤としてのグリセロールを取り除くと、３ヵ月より長い期間における２５℃を超える温度での熱安定性を高めるかどうかを判定するために、研究を行った。グリセロールの除去に加えて、本発明の改善された５０℃で熱安定性のある２.５％トレハロースおよび２.５％マンニトール凍結乾燥製剤中で凍結乾燥される場合の生分解性油（本実施例ではスクアレン）のパーセンテージを、熱安定性およびケーキの特徴について、実施例１に記載の方法により評価した。

【0368】

示した％のスクアレン（示した通り、２％から１０％ｖ／ｖのスクアレン）、０.４％ｗ／ｖＤＭＰＣ、０.０２％ｗ／ｖポロクサマー１８８、０.５％ｗ／ｖグリセロール、および５ｍＭリン酸アンモニウムの実施例１に記載のサンプルを、０.５％ｗ／ｖグリセロールを含めて、あるいは、グリセロール無しで、かつ追加の等張化剤としての２％ｖ／ｖＴｒｉｓを加えて、または加えずに、製剤化した。図２５Ａのデータは、０.５％ｖ／ｖグリセロールを含む製剤（With Glycerolと表示）が、凍結乾燥直後（０日目）および５０℃保管３０日目のどちらでも、わずかに縮んで押し下げられたケーキを形成したことと比較して、スクアレンの濃度を増やして（２−１０％ｖ／ｖ）、０.５％グリセロールを除くと（No Glycerolと表示）、５０℃で３０日目でさえも、ケーキの縮みまたは変色がなく、乳剤製剤は全て、凍結乾燥時に美しいケーキを形成したことを示している。製剤のクリーム化に関するケーキの再構成の比較は、目立った差異を示さなかった。

【0369】

図２５Ｂおよび図２５Ｃは、５０℃で３０日間保管後のいずれの製剤においても、（それぞれ）粒径（Z-Aved nm）および多分散（ＰＤＩ）のどちらにおいても、目立った差異がないことを示している。図２５Ｄは、０.５％ｖ／ｖグリセロールの存在が、アジュバントの安定性、製剤のＧＬＡに影響を与える証拠を提供する。生分解性油の量（２５−１０％）を増やして調製した乳剤製剤はどれも、ＧＬＡ濃度において、最初の濃度（バー上の０で表した開始時）を、凍結乾燥したバイアルを５０℃で３０日間保管後に再構成したサンプルと比較して、損失を示さない。グリセロール存在下で凍結乾燥した乳剤は、３０−４０％のＧＬＡの損失を示す。

【0370】

本データに基づくと、おそらく、本発明のワクチン製剤は、５０℃の温度に耐えるように凍結乾燥することが可能であり、それは、より美しいケーキを生産し、当業者が認識するように、それによってより優れた熱安定性を得るであろう。

【0371】

実施例５：より高温での熱安定性が改善され、アジュバントの欠損がない単一および複数の賦形剤系における、４つの凍結乾燥ワクチン乳剤製剤の開発および特徴解析、並びに、安定性
４つの凍結乾燥製剤について本明細書に記載のＧＬＡ−ＳＥ乳剤を熱保護する能力を評価した。全ての製剤は、等張化剤としてのグリセロールを含まなかった。開発および評価した製剤は、５％トレハロース単独（グリセロールなし）（図２６Ａ）、５％トレハロースｗ／ｖ、０.１％ｗ／ｖマンニトール（図２６Ｂ）、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトール）（図２６Ｃ）、および１０％ｗ／ｖトレハロース（図２６Ｄ）で、示された時間、示されたように４℃、２５℃、３７℃、および５０℃で保管されたサンプルについて、凍結乾燥後０時間（凍結乾燥直後）、１週間（１ｗｋ）、２週間（２ｗｋ）、１ヵ月間（１ｍｏ）および３ヵ月間（３ｍｏ）で、再構成後のケーキ形成、外観およびクリーム化を評価した。データの比較によって、５％トレハロースｗ／ｖ、０.１％ｗ／ｖマンニトールの全てのサンプルがきれいな白色のケーキを形成し（図２６Ｂ）、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトールが全ての保管温度で最も美しいケーキを形成したこと（図２６Ｃ）が示されている。５％トレハロースｗ／ｖ、０.１％ｗ／ｖマンニトール（図２６Ｂ）、２.５％ｗ／ｖトレハロース、２.５％ｗ／ｖマンニトール（図２６Ｃ）によって形成された美しいケーキは、当分野で知られるように、美しい構造を示す。本発明の凍結乾燥したＧＬＡ−ＳＥ乳剤からの、等張化剤としてのグリセロールの除去は、より美しいケーキ構造をもたらし、４℃、２５℃、３７℃、および５０℃の範囲にわたる温度で、１週間（１ｗｋ）、２週間（２ｗｋ）、１ヵ月間（１ｍｏ）および３ヵ月間（３ｍｏ）保管した場合に、構造上の完全性を維持する（図２６Ａ−Ｄ）。

【0372】

凍結乾燥製剤を全て、示されているように、４℃、２５℃、３７℃、および５０℃で、１週間（１ｗｋ）、２週間（２ｗｋ）、１ヵ月間（１ｍｏ）および３ヵ月間（３ｍｏ）、保管した。サンプルを、保管庫から取り出し、再構成し、図２７−３１に表されているように、再構成後に、粒径（Z-Aved nm）、多分散（ＰＤＩ）、ｐＨおよびＧＬＡ量について比較した。

【0373】

図２７は、各製剤についての、凍結乾燥成分を添加する前の凍結乾燥前乳剤（バー上にPre Lyoと表示）、凍結乾燥前のＧＬＡ−ＳＥ製剤（バー上にLyoと表示）、および凍結乾燥後の再構成後のＧＬＡ−ＳＥ製剤（０と表示）の比較を表す。製剤の最初の比較では、凍結乾燥製剤は各製剤間で目立った差異を示さず、約２００ｎｍ未満のＺ平均粒径の粒径、多分散により測定される明らかな凝集体の欠如、生理的なｐＨ、およびＧＬＡの明らかな損失がないことを含む、適切な再構成された乳剤の特徴を有した。

【0374】

図２８は、４℃（バー１）、２５℃（バー２）、３７℃（バー３）、および５０℃（バー４）で１週間（１ｗｋ）保管した、様々な単一バイアル凍結乾燥製剤を表す。サンプルを再構成し、粒径（Ｚ平均粒径、ｎｍ）、凝集機能としての多分散（ＰＤＩ）、ｐＨ、およびＧＬＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を分析した。図２８Ａのデータは、４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、約２００ｎｍ未満の所望のサイズの粒径（図２８Ａ）、多分散により測定した明らかな凝集体の欠如（図２８Ｂ）、および生理的なｐＨ（図２８Ｃ）を示したことを表している。凍結乾燥したケーキの平均粒径が、全ての製剤について５０℃で、他のサンプルと比較しておよそ４０％増加しているにもかかわらず、依然として所望の約２００ｎｍ未満以内であったことは、注目に値する。重要なことに、グリセロールを欠如させて試験した全ての製剤が、１週間、試験したいずれの温度で保管した後も、ＧＬＡの損失を示さなかった。

【0375】

図２９は、３７℃（バー３）および５０℃（バー４）で２週間（２ｗｋ）保管した、様々な単一バイアル凍結乾燥製剤を表す。サンプルを再構成し、粒径（Ｚ平均粒径、ｎｍ）、凝集機能としての多分散（ＰＤＩ）、ｐＨ、およびＧＬＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を分析した。図２９Ａのデータは、３７℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、約２００ｎｍ未満の所望のサイズの粒径（図２９Ａ）、多分散により測定した明らかな凝集体の欠如（図２９Ｂ）、および生理的なｐＨ（図２９Ｃ）を示したことを表している。凍結乾燥したケーキの平均粒径が、全ての製剤について５０℃で、１週間後に、他のサンプルと比較しておよそ４０％増加していたにもかかわらず、２週間目に変化していないように見え、依然として所望の約２００ｎｍ未満以内であったことは、注目に値する。重要なことに、グリセロールを欠如させて試験した全ての製剤が、１週間、試験したいずれの温度で保管した後も、ＧＬＡの損失を示さなかった。

【0376】

図３０は、４℃（バー１）、２５℃（バー２）、３７℃（バー３）、および５０℃（バー４）で１ヵ月間（１ｍｏ）保管した、様々な単一バイアル凍結乾燥製剤を表す。サンプルを再構成し、粒径（Ｚ平均粒径、ｎｍ）、凝集機能としての多分散（ＰＤＩ）、ｐＨ、およびＧＬＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を分析した。図３０Ａのデータは、４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、約２００ｎｍ未満の所望のサイズの粒径（図３０Ａ）、多分散により測定した明らかな凝集体の欠如（図３０Ｂ）、および生理的なｐＨ（図３０Ｃ）を示したことを表している。２.５％トレハロース、２.５％マンニトール製剤の平均粒径の１２０〜１７５ｎｍへの増加の傾向は注目されるが、平均粒径は依然として２００ｎｍより小さく、製剤はＧＬＡの損失を示さない。

【0377】

図３１は、４℃（バー１）、２５℃（バー２）、３７℃（バー３）、および５０℃（バー４）で１ヵ月間（１ｍｏ）保管した、様々な単一バイアル凍結乾燥製剤を表す。サンプルを再構成し、粒径（Ｚ平均粒径、ｎｍ）、凝集機能としての多分散（ＰＤＩ）、ｐＨ、およびＧＬＡ濃度（ｍｇ／ｍｌ）を分析した。図３１Ａのデータは、４℃−５０℃の範囲の温度で保管された４つの凍結乾燥製剤全てが、約２００ｎｍ未満の所望のサイズの粒径（図３１Ａ）、多分散により測定した明らかな凝集体の欠如（図３１Ｂ）、および生理的なｐＨ（図３１Ｃ）を示したことを表している。この実施例５のデータは、最大５０℃の温度で、１ヵ月以上にわたり保管された際に、５０℃での熱安定性を高めることを示すアジュバント（ＧＬＡ）を含む、水中油乳剤（ＳＥ）の単一バイアル凍結乾燥のための、さらなるリード候補製剤を提供する。

【0378】

本発明は、コールドチェーン保管の必要性を低減または除去することに特定の有用性を示す、抗原、単一アジュバント、複数アジュバント、またはこれらの任意の組み合わせのワクチン輸送に適した、水中油乳剤の単一バイアル凍結乾燥のために、多くの製剤を提供し、これらの製剤を当分野の水準に対して改良されたものにせしめる。

【0379】

SEQUENCES
任意のＨｉｓタグを有するＩＤ９３融合ポリペプチド（配列番号１）
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWAGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

【0380】

ＩＤ９３融合ポリペプチド（配列番号２）
MTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWAGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

【0381】

任意のＨｉｓタグを有するＩＤ８３融合ポリペプチド（配列番号３）
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

【0382】

ＩＤ８３融合ポリペプチド（配列番号４）
HLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

【0383】

Ｒｖ１８１３（配列番号５）
MITNLRRRTAMAAAGLGAALGLGILLVPTVDAHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACN

【0384】

Ｒｖ３６２０（配列番号６）
MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS

【0385】

Ｒｖ２６０８（配列番号７）
MNFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLF

【0386】

Ｒｖ３６１９（配列番号８）
MTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWA

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26-1】

【図26-2】

【図26-3】

【図26-4】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]