特許 6741597 幹細胞の安定性増進用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6741597

(24)【登録日】2020年7月29日

(45)【発行日】2020年8月19日

(54)【発明の名称】幹細胞の安定性増進用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20200806BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20200806BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20200806BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20200806BHJP

   C12N 1/04 20060101ALI20200806BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20200806BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/28

   A61K9/10

   A61K47/02

   A61K47/42

   C12N1/04

   C12N5/071

【請求項の数】6

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2016-569967(P2016-569967)

(86)(22)【出願日】2015年1月21日

(65)【公表番号】特表2017-521378(P2017-521378A)

(43)【公表日】2017年8月3日

(86)【国際出願番号】KR2015000595

(87)【国際公開番号】WO2016006782

(87)【国際公開日】20160114

【審査請求日】2017年1月24日

【審判番号】不服2019-8918(P2019-8918/J1)

【審判請求日】2019年7月3日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0085020

(32)【優先日】2014年7月8日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】516352954

【氏名又は名称】ラ ジョンチャン

【氏名又は名称原語表記】ＲＡ， Ｊｅｏｎｇ Ｃｈａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100185915

【弁理士】

【氏名又は名称】長山 弘典

(74)【代理人】

【識別番号】100090251

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 憲一

(72)【発明者】

【氏名】ラ ジョンチャン

(72)【発明者】

【氏名】ウ サンギュ

【合議体】

【審判長】 滝口 尚良

【審判官】 前田 佳与子

【審判官】 穴吹 智子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５１４９５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１０５２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２８１０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１９８１年，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１１１−１２３

【文献】 医学のあゆみ，１９９２年，Ｖｏｌ．１６１ Ｎｏ．６，ｐｐ．４１０−４１２

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

A61K 35/12-35/55,A01N 1/02, C12N 5/00-5/28

ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭｅｄＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）脂肪由来間葉系幹細胞；
ｉｉ）１０〜３０％（ｖ／ｖ）含量の血清；
ｉｉｉ）０．１〜１％（ｖ／ｖ）含量のアルブミン；及び
ｉｖ）生理食塩水、ハルトマン‐Ｄ溶液及びＰＢＳからなる群から選択される何れか１つ以上を含有し、
０．１〜１０℃で７２〜１２０時間、冷蔵保存安定性を有して、体内投与が可能な脂肪由来間葉系幹細胞を含む治療剤組成物。

【請求項2】

前記冷蔵保存温度の範囲は、０．１〜１０℃であることを特徴とする請求項１に記載の脂肪由来間葉系幹細胞を含む治療剤組成物。

【請求項3】

前記アルブミンの含量は、０．２〜０．５％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の脂肪由来間葉系幹細胞を含む治療剤組成物。

【請求項4】

前記幹細胞の濃度は、１．０×１０^５〜１．０×１０^９ｃｅｌｌ／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の脂肪由来間葉系幹細胞を含む治療剤組成物。

【請求項5】

請求項１〜４の何れか一項に記載の脂肪由来間葉系幹細胞を含む治療剤組成物を含有する細胞治療用注射製品。

【請求項6】

懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫黄還元剤、及び酸化防止剤からなる群より選択された一つ以上をさらに含有することを特徴とする請求項５に記載の細胞治療用注射製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、幹細胞の保存安定性を増進させることができる組成物に関し、より詳細には、血清または血漿を含有する幹細胞の冷蔵保存安定性を増進させるための組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、自己複製能を有し、且つ２つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞であって、全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、多分化能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）に分類できる。

【0003】

全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、一つの完全な個体に発生していくことができる全能性を有する細胞であって、卵子と精子の受精後８細胞期までの細胞がこの性質を有する。この細胞を分離して子宮に移植すると、一つの完全な個体に発生していくことができる。多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の種々の細胞と組織に発生することができる細胞であって、受精４〜５日後に形成される胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内側に位置した内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）に由来し、これを胚性幹細胞という。これは、種々の他の組織細胞に分化されるが、新しい生命体を形成することはできない。多分化能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、この細胞が含まれている組織及び器官に特異的な細胞にのみ分化できる幹細胞である。

【0004】

多分化能性幹細胞は、成体骨髄から最初に分離されてから（Ｙ．Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１８：４１，２００２）、他の様々な成体組織でも確認された（Ｃ．Ｍ．Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：５０２，２００２）。しかし、骨髄のような成体組織中の幹細胞は極めて少なく存在し、かかる細胞は分化誘導せずには培養し難い。そのため、特異的にスクリーンされた培地がないと、その細胞を培養することが困難である。すなわち、幹細胞を分離して体外で保存することが非常に難しいという欠点がある。

【0005】

最近、脂肪組織が多分化能性幹細胞の新しいソースであることが見出された（Ｂ．Ｃｏｕｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，３０１：１０１６，２００３；Ａ．Ｍｉｒａｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１０：３４９，２００４；Ｓ．Ｇｒｏｎｔｈｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８９：５４，２００１；Ｍ．Ｊ．Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，３２８：２５８、２００５）。脂肪抽出（脂肪吸引術（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ））により得られたヒト脂肪組織に未分化細胞群が含まれており、これが、インビトロで脂肪細胞、骨形成細胞、筋芽細胞及び軟骨芽細胞への分化能を有するということが報告された（Ｐ．Ａ．Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．７：２１１，２００１；Ａ．Ｍ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，３１５：２５５，２００４）。尚、脂肪組織由来細胞が筋再生能及び神経血管分化を促進する能力を有することが、動物モデル実験により明らかになっている。かかる脂肪組織は多量に抽出することができるという利点があるため、従来の欠点を補完する新しい幹細胞のソースとして注目されている。

【0006】

多量に獲得可能となった幹細胞は、通常、難病などの治療を含む医学分野及び美容、成形などを目的として幹細胞自体を注射する細胞治療剤としての利用が増えている傾向にある。

【0007】

細胞治療剤用の幹細胞は、培養後に直ちに患者に施術可能な場合には問題ないが、患者の状態によって幹細胞の施術時期の調節が必要な場合には、幹細胞を培養した後、長期間保存する必要がある。また、培養した幹細胞を、施術する場所へ長距離搬送する必要がある場合にも、幹細胞の安定した供給が必須である。そのために、５〜１０日程度の長期間にわたって幹細胞の高い生存率を維持する必要がある。現在、細胞を凍結せずに長期間維持する場合、細胞生存率が著しく低くなる問題がある。しかし、細胞凍結法は、解凍時における細胞生存率が著しく劣り、生物学的観点では、幹細胞としての機能性などの問題がある。また、凍結状態での搬送は冷蔵搬送に比べて難しいという欠点がある。

【0008】

現在、冷蔵状態で幹細胞を保存する従来技術として、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を冷蔵条件で生理食塩水に浮遊して保存する技術があるが、この場合、４８時間以上保存時に７０％以上の生存率を示しにくい。これを改善するためにスクロースやアルブミンを添加する場合、４８時間〜７２時間までは７０％以上の生存率を示し、保存安定性が向上することが確認された（韓国特許第２００８‐０１０３６３７号）。しかし、７２時間後に生存率が急激に減少するため、冷蔵条件（４℃）において細胞治療剤に含まれた幹細胞の生存率を長期間安定して高く維持させる保存安定性増進用組成物の開発が必要である。

【0009】

そこで、本発明者らは、長時間冷蔵保存する際にも幹細胞の生存率を高く維持させるために鋭意研究した結果、血清または血漿を含有する場合に、冷蔵状態における幹細胞の生存率が９日以上高く維持されることを見出し、本発明を成すに至った。ヒト血清を細胞培養のための培地組成物として用いた例はあるが（韓国特許第１０‐０３９４４３０号）、ヒト血清または血漿を含有する幹細胞の保存安定性増進用組成物については開示されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の目的は、５〜８０％（ｖ／ｖ）含量の血清または血漿を含有する幹細胞の冷蔵保存安定性増進用組成物を提供することにある。

【0011】

本発明の他の目的は、前記組成物を含有する細胞治療剤注射製品を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記の目的を達成するために、本発明は、５〜８０％（ｖ／ｖ）含量の血清または血漿を含有する幹細胞の冷蔵保存安定性増進用組成物を提供する。

【0013】

本発明は、また、前記組成物を含有する細胞治療剤注射製品を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】互いに異なる濃度（１０、２０、３０％）の自家血清及び０．３％のアルブミンを含有する保存剤で０．５ｘ１０^７の幹細胞を冷蔵保存し、０〜１４４時間までの保存時間による幹細胞の生存率を比較したグラフである。対照群としては、０．３％のアルブミンを含有する保存剤を使用した。

【図2】互いに異なる濃度（１０、２０、３０％）の自家血清及び０．３％のアルブミンを含有する保存剤で１．０×１０^７の幹細胞を冷蔵保存し、０〜１４４時間までの保存時間による幹細胞の生存率を比較したグラフである。対照群としては、０．３％のアルブミンを含有する保存剤を使用した。

【図3】互いに異なる濃度（１０、２０、３０％）の他家血清及び０．３％のアルブミンを含有する保存剤で０．５×１０^７の幹細胞を冷蔵保存し、０〜１４４時間までの保存時間による幹細胞の生存率を比較したグラフである。対照群としては、０．３％のアルブミンを含有する保存剤を使用した。

【図4】互いに異なる濃度（１０、２０、３０％）の他家血清及び０．３％のアルブミンを含有する保存剤で１．０×１０^７の幹細胞を冷蔵保存し、０〜１４４時間までの保存時間による幹細胞の生存率を比較したグラフである。対照群としては、０．３％のアルブミンを含有する保存剤を使用した。

【図5】幹細胞＃１の対照群（生理食塩水／０．３％のアルブミン）及びそれぞれ異なる条件の保存安定性増進用組成物の実験群（１〜６）の細胞数、生存率及び細胞サイズの変化を比較した結果である。

【図6】幹細胞＃２の対照群（生理食塩水／０．３％のアルブミン）及びそれぞれ異なる条件の保存安定性増進用組成物の実験群（１〜６）の細胞数、生存率及び細胞サイズの変化を比較した結果である。

【図7】細胞生存率に及ぶ保存剤ｐＨの影響を確認した結果である。

【図8】細胞生存率に及ぶ血清及び血漿の効果を比較した結果である。

【図9】細胞生存率に及ぶアルブミンの影響を確認した結果である。

【図10】細胞生存率に及ぶ血清濃度の効果を比較した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

特に定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練した当業者が通常的に理解しているものと同一の意味を有する。一般に、本明細書で用いられた命名法は、本技術分野において公知されていて通常的に用いられるものである。

【0016】

本発明では、血清または血漿を含有する幹細胞保存剤を用いる場合、冷蔵状態の幹細胞の生存率が９５％以上に維持されて、幹細胞の保存安定性が増進されることを見出した。本発明の血清または血漿を含有する幹細胞保存剤は、冷蔵状態の幹細胞の生存率を９日以上高く維持することができるため、細胞治療用幹細胞を安定して供給する際に有用である。

【0017】

本発明における用語「細胞治療剤注射製品」または「細胞治療剤」とは、組織の欠陥を治療するために、幹細胞を含有して非経口投与、すなわち注射の形態で欠陥部位またはその隣接部位に注射され、欠陥を矯正することができる医薬組成物を意味する。

【0018】

本発明における用語「賦形剤」とは、医薬組成物の薬理学的特性を示す有効成分以外に、所定の用量、重量を加えて取扱いを容易にするために添加したり、液体形態などの形態を維持するために添加したりする物質を意味するものであって、一般に、液体形態のための賦形剤として、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）、ハルトマン‐Ｄ溶液、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）などを使用しているが、その他の種々の組成を含むことができる物質を意味する。

【0019】

本発明における用語「脂肪組織由来幹細胞」とは、脂肪組織から分離した未分化幹細胞であって、その分離方法は次のとおりである。脂肪吸引術により得られる、生理食塩水に浮遊された脂肪含有懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を培養した後、培養容器に付着された幹細胞層をトリプシン処理して回収する方法や、スクレーパで掻き取って回収する方法により脂肪組織由来幹細胞を分離することができる。

【0020】

本発明の幹細胞は、下記のような方法により得ることができる。

【0021】

先ず、脂肪吸引術（Ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）により腹部脂肪から得られたヒト脂肪組織を分離してＰＢＳで洗浄し、組織を細切した後、コラーゲン分解酵素を添加したＤＭＥＭ培地を用いて分解してから、ＰＢＳで洗浄して遠心分離する。上清は除去し、ペレットはＰＢＳで洗浄した後、さらに遠心分離して、１００μｍのメッシュを用いて浮遊物を除去してからＰＢＳで洗浄する。ＤＭＥＭ（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＮＡＣ、０．２ｍＭのアスコルビン酸）培地で培養し、一晩経過後に培養容器に付着されていない細胞をＰＢＳで洗浄し、ケラチノサイト‐ＳＦＭ（ＦＢＳ、ＮＡＣ、アスコルビン酸、カルシウム、ｒＥＧＦ、インスリン、ｂＦＧＦ、及びヒドロコルチゾン）培地を２日毎に交換しながら継代培養して、脂肪組織由来間葉系幹細胞を分離することができる。その他にも、当業界に公知の方法により幹細胞を得ることができる。

【0022】

本発明の一実施例では、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を、１０〜５０％（ｖ／ｖ）の自家または他家ヒト血清及び０．３％のアルブミンが含まれた組成物、またはヒト血漿及び０．３％のアルブミンが含まれた組成物に浮遊させ、冷蔵（４℃）状態における時間による細胞サイズ、性状、細胞数及び生存率を分析した。

【0023】

したがって、本発明の一態様は、５〜８０％（ｖ／ｖ）の血清または血漿を含有する幹細胞の冷蔵保存安定性増進用組成物に関する。

【0024】

本発明において、前記血清の含量は１０〜５０％（ｖ／ｖ）であることが好ましく、血漿の含量は５〜５０％（ｖ／ｖ）であることが好ましいが、これに制限されるものではない。

【0025】

本発明の血清は、ヒトを含む哺乳類由来血清または血漿であることを特徴とする。また、同種由来の血清または血漿であることが好ましく、自家または他家血清または血漿が制限されずに使用できる。

【0026】

本発明において、前記冷蔵保存は、０．１〜１０℃の温度範囲で行うことが好ましいが、これに制限されるものではない。

【0027】

本発明において、アルブミン及び賦形剤をさらに含有することを特徴とする。前記アルブミンの含量は、０．１〜１％（ｖ／ｖ）であることが好ましく、０．２〜０．５％（ｖ／ｖ）であることがより好ましいが、これに制限されるものではない。また、前記賦形剤は、生理食塩水、ハルトマン‐Ｄ溶液及びＰＢＳからなる群から選択される何れか１つ以上であることが好ましいが、これに制限されるものではない。

【0028】

前記「ｖ／ｖ」は、生理食塩水に浮遊させた幹細胞の用量（体積パーセント）に、１〜８０％の血清及び０．１〜１％のアルブミンが添加されて総用量（体積パーセント）が１００％になることを意味する。

【0029】

本発明において、前記幹細胞の濃度は、１．０×１０^５〜１．０×１０^９ｃｅｌｌ／ｍｌであることが好ましく、より好ましくは１．０×１０^６〜１．０×１０^８ｃｅｌｌ／ｍｌであるが、これに制限されるものではない。

【0030】

本発明において、前記幹細胞は、脂肪、臍帯血、骨髄、筋肉、胎盤及び皮膚からなる群から選択されるものが好ましく、脂肪組織由来のものが最も好ましいが、これに制限されるものではない。また、前記幹細胞は、ヒトを含む哺乳類由来幹細胞であることを特徴とする。

【0031】

本発明の他の態様は、血清または血漿を含有する幹細胞の冷蔵保存安定性増進用組成物を含有する細胞治療剤注射製品に関する。

【0032】

本発明による注射製品は、患者の体質及び欠陥の種類に応じて、当業界に公知の通常の量を取って充填された注射の形態に製造されることができる。

【0033】

本発明による注射製品は、治療しようとする欠陥に隣接した部位または欠陥部位に注射されて用いられることができる。かかる方法により矯正できる欠陥としては、皺、伸展線、傷跡、皮膚陥凹、口唇形成不全、歯周欠陥、軟部組織欠陥、骨欠陥、やけど跡、皮膚潰瘍などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0034】

本発明において、前記細胞治療剤注射製品は、必要に応じて、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤などをさらに適宜添加することができる。

【実施例】

【0035】

以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないということは、当業界で通常の知識を有する者において自明である。

【0036】

実施例１：ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の分離及び培養
脂肪吸引術（Ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）により腹部脂肪から得られたヒト脂肪組織を分離し、ＰＢＳで洗浄した。組織を細切した後、Ｉ型コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ培地を用いて３７℃で２時間組織を分解させた。コラゲナーゼ処理された組織をＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、ペレットをＰＢＳで洗浄してから、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｍのメッシュで濾過して浮遊物を除去した後、ＰＢＳで洗浄し、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＮＡＣ（Ｎ‐ａｃｅｔｙｌ‐Ｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、０．２ｍＭのアスコルビン酸が添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。一晩経過後に付着されていない細胞をＰＢＳで洗浄し、５％のＦＢＳ、２ｍＭのＮＡＣ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、０．０９ｍＭのカルシウム、５ｎｇ／ｍｌのｒＥＧＦ、５μｇ／ｍｌのインスリン、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び７４ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを含有するケラチノサイト‐ＳＦＭ培地を２日毎に交換しながら継代培養して、脂肪組織由来間葉系幹細胞を分離した。

【0037】

実施例２：実験群の構成及び賦形剤毎のｐＨの測定
２‐１：実験群の構成
実施例１の方法により分離されたそれぞれ異なる４種の脂肪幹細胞を４℃で冷蔵保存し、冷蔵剤形の細胞治療剤注射製品に使用される幹細胞の生存率を分析した。

【0038】

【表1】

【0039】

分離された４種の脂肪幹細胞を用いて、表１のように実験群を構成した。０．３％のアルブミンが含まれた幹細胞対照群、０．３％のアルブミン＋１０％の自家血清が含まれた実験群、０．３％のアルブミン＋１０％の他家血清が含まれた実験群、０．３％のアルブミン＋２０％の自家血清が含まれた実験群、０．３％のアルブミン＋２０％の他家血清が含まれた実験群、０．３％のアルブミン＋３０％の自家血清が含まれた実験群、及び０．３％のアルブミン＋３０％の他家血清が含まれた実験群を構成し、生存率を分析した。

【0040】

２‐２：賦形剤毎のｐＨ値
本実施例では、幹細胞保存安定性増進用組成物の賦形剤のｐＨを分析した。

【0041】

ｐＨは、水素イオン濃度を数値化したものであって、一般の生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）は約５．５〜８．０の広いｐＨ範囲を示すため、生理食塩水にアルブミン及びヒト血清が添加された際のｐＨの変化をＰＢＳと比較した。正常の健康な状態のｐＨは、細胞、血液、体液などが弱アルカリ性を維持する場合である。

【0042】

ｐＨ分析の際には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＯｒｉｏｎ Ｓｔａｒ Ａ１１１を用いて、幹細胞保存安定性増進用組成物に含まれるアルブミンとヒト血清によるｐＨ変化を分析した。また、ｐＨは、測定温度の影響を受けるため、２０〜２４℃範囲の常温で測定した。

【0043】

【表2】

【0044】

その結果、表２に示すように、アルブミンのみが添加された場合に僅かに上昇したｐＨは、ヒト血清が添加されて弱アルカリ性のｐＨを維持することが確認できた。

【0045】

そこで、後述の実施例３では、０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊された幹細胞対照群、それぞれ１０、２０、３０％の自家ヒト血清と０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊された幹細胞実験群、それぞれ１０、２０、３０％の他家ヒト血清と０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊された幹細胞実験群として、生存力の分析を行った。

【0046】

実施例３：時間による幹細胞のサイズ及び性状の分析
実施例１の方法により分離された脂肪幹細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させ、それぞれ１０、２０、３０％の自家及び他家ヒト血清を添加して、実施例２の対照群及び実験群を構成した。

【0047】

各実験群の幹細胞を１．０×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で３ｃｃの注射器に充填した後、４℃で冷蔵保存して０、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後に、冷蔵剤形の細胞治療剤注射製品に使用される幹細胞のサイズ及び性状を分析した。

【0048】

３‐１：自家血清実験群
細胞１としては、０．５×１０^７の幹細胞を、０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させた対照群、及びそれぞれ１０、２０、３０％の自家血清／０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させた３つの幹細胞実験群を準備した。

【0049】

細胞２としては、１．０×１０^７の幹細胞を、０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させた対照群、及びそれぞれ１０、２０、３０％の自家血清／０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させた３つの幹細胞実験群を準備した。

【0050】

細胞１の対照群、３つの実験群、及び細胞２の対照群、３つの実験群の幹細胞を３ｃｃの注射器に充填した後、４℃で冷蔵保存して０、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後に、細胞のサイズ、性状、及び総細胞数を分析した。幹細胞の細胞数及びサイズは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＣｏｕｎｔｅｓｓ^ＴＭ自動セルカウンター（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて分析し、性状分析は目視確認した。

【0051】

【表3】

【0052】

【表4】

【0053】

【表5】

【0054】

【表6】

【0055】

その結果を、表３（細胞１の細胞数）、表４（細胞１のサイズ）、表５（細胞２の細胞数）、及び表６（細胞２のサイズ）に示す。

【0056】

表３〜６に示すように、対照群の細胞サイズの変化は、約１５〜２５％程度減少したのに対し、自家ヒト血清が含有された実験群の細胞サイズの変化は、約３〜１０％程度であって大きい変化がなかった。一方、細胞の性状は、対照群と実験群の全てにおいて変化が観察されず、対照群と実験群の総細胞数にも差がなかった。

【0057】

３‐２：他家血清実験群
細胞３としては、０．５×１０^７の幹細胞を、０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させた対照群、及びそれぞれ１０、２０、３０％の他家血清／０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させた３つの幹細胞実験群を準備した。

【0058】

細胞４としては、１．０×１０^７の幹細胞を、０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させた対照群、及びそれぞれ１０、２０、３０％の他家血清／０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させた３つの幹細胞実験群を準備した。

【0059】

細胞３の対照群、３つの実験群、及び細胞４の対照群、３つの実験群の幹細胞を３ｃｃの注射器に充填した後、４℃で冷蔵保存して０、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後に、細胞のサイズ、性状、及び総細胞数を分析した。幹細胞の細胞数及びサイズは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＣｏｕｎｔｅｓｓ^ＴＭ自動セルカウンター（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて分析し、性状分析は目視確認した。

【0060】

【表7】

【0061】

【表8】

【0062】

【表9】

【0063】

【表10】

【0064】

その結果を、表７（細胞３の細胞数）、表８（細胞３のサイズ）、表９（細胞４の細胞数）、及び表１０（細胞４のサイズ）に示す。

【0065】

表７〜１０に示すように、対照群の細胞サイズの変化は、約２０％程度減少したのに対し、他家ヒト血清が含有された実験群の細胞サイズの変化は、約３〜１０％程度であって大きい変化がなかった。一方、細胞の性状は、対照群と実験群の全てにおいて変化が観察されず、対照群と実験群の総細胞数にも差がなかった。

【0066】

実施例４：時間による幹細胞の生存率の分析
実施例３と同様の条件で、時間による幹細胞の生存率を分析した。

【0067】

分離された脂肪幹細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．３％のアルブミンが含まれた生理食塩水に浮遊させ、それぞれ１０、２０、３０％の自家及び他家ヒト血清を添加して、それぞれの対照群及び実験群を構成した。各実験群の幹細胞を１．０×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で３ｃｃの注射器に充填した後、４℃で冷蔵保存して０、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後に、冷蔵剤形の細胞治療剤注射製品に使用される幹細胞の生存率を分析した。幹細胞の生存率の測定は、細胞とトリパンブルー溶液を１：１で混合し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＣｏｕｎｔｅｓｓ^ＴＭ自動セルカウンター（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて分析した。

【0068】

その結果、ヒト血清を含有する組成物は、０．３％のアルブミンのみを含有する対照群に比べて、細胞数が大きく変化することなく高い生存率を示し、血清濃度が高いほど、生存率がより高く、且つ細胞の安定性維持期間も長くなることを確認した（図１、２、３及び４）。

【0069】

特に、３０％の血清を含有する幹細胞である実験群３は、１４４時間まで９８％以上の非常に高い細胞生存率を維持し、１０〜２０％の血清を含有する実験群でも、７２時間後まで９０％以上の生存率を示すことを確認した。また、自家血清実験群（図１及び２）と他家血清実験群（図３及び４）との間に、細胞の保存時間による生存率の効果の差はないことを確認した。

【0070】

したがって、ヒト血清による幹細胞の保存安定性増進において、１４４時間以上の長時間にわたって生存率が維持可能であり、自家血清と他家血清の効果には差がないことを確認した。

【0071】

実施例５：新しい実験群の構成
前記実施例において、自家血清と他家血清の間に効果の差がないことを確認した後、血清濃度及び血漿による細胞安定性の効果を調べるための実験群を構成した。

【0072】

対照群（ＳＡ：生理食塩水＋０．３％のアルブミン）と種々の血清濃度（１０〜５０％）または血漿（ＰＲＰ）で構成された６種の実験群を表１１に示し、９日までの細胞冷蔵保存安定性を測定した。

【0073】

【表11】

【0074】

５‐１：幹細胞
実施例１の方法により分離されたそれぞれ異なる２種の脂肪幹細胞を４℃で冷蔵保存し、冷蔵剤形の細胞治療剤注射製品に使用される幹細胞の生存率を分析した。

【0075】

各細胞を４．９×１０^８ｃｅｌｌｓ（１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを４９個準備）で準備した。第２継代細胞を解凍して（６．０×１０^６ｃｅｌｌｓを５個のＴ１７５フラスコに解凍）培養（第３継代に４．９×１０^７ｃｅｌｌｓを４９個のＴ１７５フラスコに培養）した後、第４継代目に回収（４．９×１０^８ｃｅｌｌｓ）して、充填して実験した。

【0076】

第４継代目に回収された細胞は、７個のチューブに７．０×１０^７ｃｅｌｌｓずつ分けて、表１１の７種の保存剤７ｍｌと混合した後、それぞれの実験群（保存剤）を時間毎（０、１、２、３、５、７、９日）に７個の３ｃｃ注射器に１ｍｌずつ充填した。０日目のサンプルついては直ちに細胞数、生存率、細胞サイズを測定し、それ以外のサンプルは、１、２、３、５、７、９日間冷蔵状態で保存した後、細胞数、生存率、細胞サイズをＣｅｄｅｘを用いて測定した。

【0077】

５‐２：血清及び血漿
血清を分離するために、抗凝固剤が入っていない採血チューブを用いて血液１０ｍｌを採取した後、冷蔵で１０分間立てて置いた。１０００ＲＣＦで１５分間遠心分離（ブレーキ０）してフィブリンを除去し、分離された上清である血清を回収した。回収された血清は１７００ｒｐｍで５分間遠心分離（ブレーキ０）した後、上清を回収して０．２μｍ注射器フィルターを用いて滅菌して準備した。

【0078】

血漿は、２０ｃｃ注射器に抗凝固剤２ｃｃを入れて採血した後、Ｄｒ．ＰＲＰ ｋｉｔで血漿と赤血球を１次分離し、３２００ｒｐｍで６分間遠心分離して血小板を凝縮して２次分離した。２次分離後、ＰＲＰ（血小板が含まれた血漿）とＰＰＰ（血小板が含まれていない血漿）が分離された状態で、１０ｃｃ注射器で上層のＰＰＰ４ｍｌをゆっくりと除去し、残りのＰＲＰ４ｍｌをよく混合して使用した。

【0079】

５‐３：賦形剤のｐＨ
実施例２‐２のように、それぞれの実験群毎に、幹細胞保存安定性増進用組成物の賦形剤のｐＨを分析した。

【0080】

ｐＨの分析は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＯｒｉｏｎ Ｓｔａｒ Ａ１１１を用いて、幹細胞保存安定性増進用組成物に含まれるアルブミンとヒト血清によるｐＨ変化を分析した。

【0081】

【表12】

【0082】

その結果、血清を添加した幹細胞保存安定剤の平均ｐＨ値が８．２と測定され、生理食塩水（ｐＨ＝７．３）に８．４％の炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）をｐＨ緩衝材（ｐＨ ｂｕｆｆｅｒ）として使用してｐＨを８．２と設定した。血漿の場合、その量が非常に少ないため、ｐＨ測定が不可能であった。

【0083】

実施例６：時間による幹細胞の細胞数、生存率、及びサイズの変化
実施例１の方法により分離された脂肪幹細胞をＰＢＳで洗浄した後、実施例５‐１の方法により細胞を準備した。２種の幹細胞に対して、表１１のように対照群及び６つの実験群を構成し、９日まで細胞数、生存率、及び細胞サイズを調べた。

【0084】

その結果、血清または血漿が含まれていない対照群（ＳＡ：生理食塩水＋０．３％のアルブミン）は、最大３日まで８０％程度の生存率を維持したが、１０％の血漿または１０％の血清が含まれた実験群は、対照群に比べて生存率が最大５０％以上増加する効果を確認した（図５及び図６）。

【0085】

血清の濃度が５０％である場合に最も高い細胞生存率を示したが、３０％の血清が含まれた実験群も、９日まで９０％以上の細胞生存率を示すことが確認できた（図５及び図６）。

【0086】

したがって、血清または血漿が含まれた保存剤を用いて幹細胞を冷蔵保存する場合、幹細胞の保存安定性を増進させ、細胞数、生存率、及び細胞サイズが変化することなく幹細胞を長期間保存することができることを確認した。

【0087】

実施例７：幹細胞保存安定剤の比較
実施例６において、幹細胞＃１（図５）及び幹細胞＃２（図６）の生存率を分析した結果、細胞１と細胞２の間には差がほとんどないことが確認されたため、この実施例では、細胞１に及ぶ安定剤毎の効果を比較した。

【0088】

幹細胞保存安定剤の影響要素のうちｐＨの影響を調べるために、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）をｐＨ緩衝材（ｐＨ ｂｕｆｆｅｒ）として使用し、安定剤のｐＨ値は８．２と設定した。その結果、対照群（ＳＡ：生理食塩水＋０．３％のアルブミン）における細胞生存期間は最大１日程度であった（図７）。したがって、ｐＨ値を８．２と設定した安定剤は、細胞の安定性増進に効果がないことが確認された。

【0089】

次に、血清と血漿の効果を比較した。１０％の血清または１０％の血漿が含まれた安定剤の場合、対照群に比べて生存率が最大５０％以上増加されたことが分かる。血清と血漿の差は大きくなく、類似する傾向の安定性を示すと確認された（図８）。

【0090】

安定剤に含まれたアルブミンの効果を確認するために、３０％の血清／生理食塩水と３０％の血清／ＳＡ（生理食塩水＋０．３％のアルブミン）を使用した場合の幹細胞保存安定性を調べた。その結果、０．３％のアルブミンが含まれた場合、より少し高い細胞安定性を示すことを確認した（図９）。しかし、９日まで２つの実験群の差が微小であるため、血清とアルブミンの混合が安定剤の効果に大きい影響は与えないことが分かった。

【0091】

したがって、保存安定剤の効果を増進させるための方法として、血清の濃度を増加させて幹細胞の保存安定性を比較した。血清／ＳＡ（生理食塩水＋０．３％のアルブミン）の実験群において、血清の濃度を１０、３０、５０％に増加させてから生存率を測定した結果、５０％の血清が含まれた安定剤が最も高い生存率を示した。また、１０％の血清が含まれた安定剤でも７日間８０％以上の生存率を維持し、３０％の血清が含まれた安定剤でも９日間９０％以上の非常に高い生存率を示すことを確認した（図１０）。これは、血清が、冷蔵状態の細胞の生存率を維持するのにおいて大きい役割をすることを意味する。

【産業上の利用可能性】

【0092】

本発明による幹細胞の冷蔵保存安定性増進用組成物は、幹細胞の性状、細胞数、及びサイズが変化することなく９０％以上の生存率を９日以上維持することができるため、細胞治療用幹細胞の長期間搬送や、優れた効果を有する細胞治療剤注射製品の製造にも有用である。

【0093】

以上、本発明の内容の特定部分を詳細に説明したが、当業界において通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施様態にすぎず、これによって本発明の範囲が制限されないということは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求範囲とそれらの等価物によって定義されるといえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】