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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6745905
(24)【登録日】2020年8月6日
(45)【発行日】2020年8月26日
(54)【発明の名称】ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体又はその溶媒和物の結晶
(51)【国際特許分類】
C07D 471/04 20060101AFI20200817BHJP
【ＦＩ】
C07D471/04 117Z
C07D471/04CSP
【請求項の数】7
【全頁数】37
(21)【出願番号】特願2018-553004(P2018-553004)
(86)(22)【出願日】2017年11月27日
(86)【国際出願番号】JP2017042437
(87)【国際公開番号】WO2018097295
(87)【国際公開日】20180531
【審査請求日】2018年12月27日
(31)【優先権主張番号】特願2016-229973(P2016-229973)
(32)【優先日】2016年11月28日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】503369495
【氏名又は名称】帝人ファーマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100123593
【弁理士】
【氏名又は名称】関根 宣夫
(72)【発明者】
【氏名】宮本 英俊
(72)【発明者】
【氏名】水野 剛志
(72)【発明者】
【氏名】鵜木 元
(72)【発明者】
【氏名】宮澤 佑貴
(72)【発明者】
【氏名】矢嶋 直樹
【審査官】
伊佐地 公美
(56)【参考文献】
【文献】
特許第６４００１９６（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】
特表２００６−５１６５６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１６−５３０２７４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角２θ＝５．３°、６．０°、６．７°、 １０．４°及び２０．８ °にピークを有する、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンの結晶。
【請求項2】
示差走査熱量分析における吸熱ピークの補外開始点温度が２７１℃である、請求項１に記載の結晶。
【請求項3】
粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角２θ＝５．２°、７．６°、８．４°、１０．５°、１５．２°、１６．９°、２０．１°、２１．０°、２３．３°及び２６．６°にピークを有する、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジンの結晶。
【請求項4】
示差走査熱量分析における吸熱ピークの補外開始点温度が２２５℃である、請求項３に記載の結晶。
【請求項5】
赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、波数１３６９ｃｍ−１、１４２４ｃｍ−１、１５０８ｃｍ−１、１５４５ｃｍ−１及び１５６６ｃｍ−１に特徴的な吸収ピークを有する、請求項３に記載の結晶。
【請求項6】
固体ＮＭＲスペクトル（１３Ｃ）において、１６３．４ｐｐｍ、１５７．６ｐｐｍ、１５５．５ｐｐｍ、１１７．８ｐｐｍ、８２．２ｐｐｍ、５６．１ｐｐｍ及び４２．３ｐｐｍに特徴的なピークを有する、請求項３に記載の結晶。
【請求項7】
固体ＮＭＲスペクトル（１５Ｎ）において、３１１．７ｐｐｍ、２３２．４ｐｐｍ、１６８．５ｐｐｍ、７９．５ｐｐｍ、５３．３ｐｐｍ、３２．９ｐｐｍ及び-４．３ｐｐｍに特徴的なピークを有する、請求項３に記載の結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ４及び／又はサイクリン依存性キナーゼ６（以下、「ＣＤＫ４／６」ともいう。）に対する阻害活性を有し、例えば関節リウマチ、動脈硬化症、肺線維症、脳梗塞症及び／若しくは癌の予防又は治療に有用なピリド［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体又はその溶媒和物の結晶に関する。【背景技術】
【0002】
ＣＤＫ４／６阻害剤は、癌、心血管障害、腎臓病、特定の感染症及び自己免疫疾患を含む異常細胞増殖が原因である様々な疾患を治療するために用いることができる。例えば関節リウマチ、動脈硬化症、肺線維症、脳梗塞症、癌の治療に有効であることが期待される。このような症例において、ＣＤＫ阻害を介した細胞周期、細胞増殖抑制が有効であることは以下のような技術的知見に基づく。【0003】
関節リウマチにおいては滑膜細胞の過増殖によるパンヌスの形成が知られており、ＣＤＫ４／６阻害剤を動物に投与することによって、改善されることが報告されている（非特許文献１）。また、関節リウマチ患者由来滑膜細胞においてはＣＤＫ４−サイクリンＤ複合体により、ＭＭＰ３産生も制御されており、ＣＤＫ４／６の活性を負に制御することにより、増殖だけではなく、ＭＭＰ３産生が抑制されることも報告されている（非特許文献２）。【0004】
以上の点より、ＣＤＫ４／６阻害剤は、関節リウマチに対して滑膜細胞増殖抑制効果とともに軟骨保護効果も期待できる。マウスの肺線維症のモデルにおいては、アデノウイルスベクタ−による細胞周期阻害蛋白質ｐ２１の発現誘導が有効であることが報告されている（非特許文献３）。
ラットの脳梗塞モデルにおいては、局所の虚血による神経細胞死に伴いサイクリンＤ１／ＣＤＫ４レベルが向上することが知られており、非選択的ＣＤＫ阻害剤であるフラボピリド−ルの投与により神経細胞死が抑制されることが報告されている（非特許文献４）。
【0005】
サイクリンＤ−ＣＤＫ４／６−ＩＮＫ４ａ−Ｒｂ経路は、癌の細胞増殖に有利となるようにいずれかの因子の異常、例えば機能的ｐ１６ＩＮＫ４aの欠失やサイクリンＤ１高発現、ＣＤＫ４高発現、機能的Ｒｂの欠失などがヒトの癌において高頻度に検出されている（非特許文献５）。これらは、いずれもＧ１期からＳ期への進行を促進する方向への異常であり、この経路が癌化又は癌細胞の異常増殖において重要な役割を担っていることは明らかである。【0006】
ＣＤＫ４／６阻害剤は、特にＣＤＫ４／６キナーゼ活性を活性化する遺伝子に異常がある腫瘍、例えばサイクリンＤの転座がある癌、サイクリンＤの増幅がある癌、ＣＤＫ４やＣＤＫ６の増幅又は過剰発現がある癌、ｐ１６不活性化がある癌に対して有効となり得る。また、その欠陥がサイクリンＤの存在量の増加をもたらすサイクリンＤの上流調節因子において遺伝子異常がある癌の治療に有用となり得、治療効果を期待することもできる。実際、ＣＤＫ４／６活性を阻害する化合物を合成する試みがなされ、当分野で多くの化合物が開示されており、乳癌をはじめとした複数の癌において臨床試験が実施されている（非特許文献６）。
【0007】
大部分の急性及び重篤な放射線療法や化学療法の毒性は、幹細胞及び前駆細胞への効果を通してである。ＣＤＫ４／６阻害剤により休止状態になった造血幹細胞及び前駆細胞は、放射線療法や化学療法による細胞毒性から防護される。阻害剤処理が止まった後、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、一時的休止期間から回復し、その後正常に機能するため、ＣＤＫ４／６阻害剤を用いた化学療法抵抗性は、著しい骨髄防護を提供すると期待される（非特許文献７）。【0008】
以上から、ＣＤＫ４／６阻害剤は、例えば関節リウマチ、動脈硬化症、肺線維症、脳梗塞症、癌の治療、骨髄防護に有用であり、特に関節リウマチ、癌の治療、骨髄防護に有効であることが期待される。ＣＤＫ４／６を含むＣＤＫ阻害剤としては特許文献１及び２が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】国際公開第２００３／０６２２３６号
【特許文献2】国際公開第２０１０／０２０６７５号
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Taniguchi, K等, Nature Medicine, 1999年, 第5巻, 760-767頁
【非特許文献2】Nonomura, Y 等, Arthritis & Rheumatology, 2006年7月, 第54巻, 第7号, 2074-83頁
【非特許文献3】Inoshima, I等, American Journal Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology, 2004年, 第286巻, L727-L733頁
【非特許文献4】Osuga, H等, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000年, 第97巻, 10254-10259頁
【非特許文献5】Weinberg, R, Science, 1991年, 第254巻, 1138-1146頁
【非特許文献6】Guha, M, Nature Biotechnology, 2013年3月, 第31巻, 第3号, 187頁
【非特許文献7】Johnson, S等, Journal of Clinical Investigation, 2010年, 第120巻, 第7号, 2528-2536頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明の目的は、優れたＣＤＫ４／６阻害活性を有する新規のピリド［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体又はその溶媒和物の結晶を提供することである。【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは上記目的で鋭意研究した結果、特定構造のピリド［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体が、特に優れたＣＤＫ４／６阻害活性を有することを見出した。さらに本発明者らは、それらの化合物の一部に、化学的に安定であり、かつ医薬原薬として適した構造の結晶が存在することを見出した。
【0013】
すなわち本発明は、式（Ｉ）で表される化合物又はその溶媒和物の結晶である。【化1】
【0014】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ１−３アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子またはオキソ基を表し（オキソ基の場合、Ｒ２は二重結合でピペラジン環に結合している。）、Ｌは単結合またはＣ１−３アルキレン基を表し、ＸはＣＨまたはＮを表す。【発明の効果】
【0015】
本発明により、優れたＣＤＫ４／６阻害活性を有し、例えば関節リウマチ、動脈硬化症、肺線維症、脳梗塞症及び／若しくは癌の予防薬又は治療薬として有用なピリド［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体又はその溶媒和物の結晶が提供される。本発明の結晶は、医薬品製造用原体として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図１は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＤ晶の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図2】図２は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＡ晶の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図3】図３は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジンのＡ晶の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図4】図４は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジンのＢ晶の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図5】図５は、（Ｒ）−Ｎ８−イソプロピル−６−（１−メトキシエチル）−Ｎ２−（５−（ピペラジン−１−イルメチル）ピリジン−２−イル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミンのＡ晶の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図6】図６は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＢ晶の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図7】図７は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのジメチルスルホキシド和物の結晶（Ｃ晶）の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図8】図８は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＩ晶の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図9】図９は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジンのＣ晶の粉末Ｘ線回折スペクトルである。
【図10】図１０は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＤ晶の赤外吸収スペクトルである。
【図11】図１１は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＡ晶の赤外吸収スペクトルである。
【図12】図１２は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのジメチルスルホキシド和物の結晶（Ｃ晶）の赤外吸収スペクトルである。
【図13】図１３は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＩ晶の赤外吸収スペクトルである。
【図14】図１４は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジンのＡ晶の赤外吸収スペクトルである。
【図15】図１５は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジンのＣ晶の赤外吸収スペクトルである。
【図16】図１６は、（Ｒ）−Ｎ８−イソプロピル−６−（１−メトキシエチル）−Ｎ２−（５−（ピペラジン−１−イルメチル）ピリジン−２−イル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミンのＡ晶の赤外吸収スペクトルである。
【図17-1】図１７は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＤ晶の固体ＮＭＲスペクトル（１３Ｃ）であり、図１７−１は６５００Ｈｚモード、図１７−２は１４０００Ｈｚモードを示す。
【図17-2】同上。
【図18】図１８は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＤ晶の固体ＮＭＲスペクトル（１５Ｎ）である。
【図19-1】図１９は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＡ晶の固体ＮＭＲスペクトル（１３Ｃ）であり、図１９−１は６５００Ｈｚモード、図１９−２は１４０００Ｈｚモードを示す。
【図19-2】同上。
【図20】図２０は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンのＡ晶の固体ＮＭＲスペクトル（１５Ｎ）である。
【図21-1】図２１は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジンのＡ晶の固体ＮＭＲスペクトル（１３Ｃ）であり、図２１−１は６５００Ｈｚモード、図２１−２は１４０００Ｈｚモードを示す。
【図21-2】同上。
【図22】図２２は、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジンのＡ晶の固体ＮＭＲスペクトル（１５Ｎ）である。
【図23-1】図２３は、（Ｒ）−Ｎ８−イソプロピル−６−（１−メトキシエチル）−Ｎ２−（５−（ピペラジン−１−イルメチル）ピリジン−２−イル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミンのＡ晶の固体ＮＭＲスペクトル（１３Ｃ）であり、図２３−１は６５００Ｈｚモード、図２３−２は１４０００Ｈｚモードを示す。
【図23-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明の結晶は、粉末Ｘ線回折スペクトル（ＸＲＤ）、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）、フーリエ変換赤外吸収スペクトル（以下「赤外吸収スペクトル」という。）及び／又は固体ＮＭＲスペクトル等によって特徴付けられる。これらの結晶の粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）スペクトルは特徴的なパターンを示し、それぞれの結晶は特異的な回折角２θの値を有する。これらの結晶は示差走査熱量分析（ＤＳＣ）においても、それぞれに特徴的な熱挙動を示す。これら結晶の赤外吸収スペクトルは、特徴的なパターンを示し、それぞれの結晶は特異的な波数の赤外吸収スペクトルを示す。これら結晶の１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルは特徴的なパターンを示し、それぞれの結晶は特異的な化学シフト（ｐｐｍ）を有する。また、これら結晶の１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルは特徴的なパターンを示し、それぞれの結晶は特異的な化学シフト（ｐｐｍ）を有する。【0018】
本発明は、前記式（Ｉ）で表される化合物の結晶であるが、以下、その好適な実施形態として、次の３化合物の９結晶について記載する。１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オン（以下、「化合物（ａ）」と表すこともある。）
１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジン−（以下、「化合物（ｂ）」と表すこともある。）
（Ｒ）−Ｎ８−イソプロピル−６−（１−メトキシエチル）−Ｎ２−（５−（ピペラジン−１−イルメチル）ピリジン−２−イル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン（以下、「化合物（ｃ）」と表すこともある。）
【0019】
化合物（ａ）のＤ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、２θ＝６．３°、６．６°、１１．６°、１６．９°及び２０．０°に特徴的なピークを有する。また、化合物（ａ）のＤ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、図１に示すパターンを有する。化合物（ａ）のＤ晶は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）において、補外開始点温度が２７７℃の吸熱ピークを有する。
化合物（ａ）のＤ晶は、ＫＢｒ錠剤法による赤外吸収スペクトルにおいて、７０３ｃｍ−１、８９６ｃｍ−１及び３４１８ｃｍ−１の波数で特徴的な吸収ピークを有する。また、化合物（ａ）のＤ晶は、図１０に示す赤外吸収スペクトルチャートを示す。
化合物（ａ）のＤ晶は、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、１３６．０ｐｐｍ、１１１．２ｐｐｍ、１０５．１ｐｐｍ、１０１．８ｐｐｍ、５２．７ｐｐｍ、４９．６ｐｐｍ、４２．９ｐｐｍ、２３．８ｐｐｍ、及び１８．５ｐｐｍの化学シフトを有する。また、化合物（ａ）のＤ晶は、図１７−１（６５００Ｈｚ)及び図１７−２（１４０００Ｈｚ）に示す１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
化合物（ａ）のＤ晶は、１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルにおいて２４８．６ｐｐｍ、２４５．７ｐｐｍ、２２９．２ｐｐｍ、２１４．５ｐｐｍ、１７４．３ｐｐｍ、８６．５ｐｐｍ、５４．７ｐｐｍ及び-１２．４ｐｐｍの化学シフトを有する。また、化合物（ａ）のＤ晶は、図１８に示す１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【0020】
化合物（ａ）のＡ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角２θ＝５．３°、７．３°、１０．３°、１５．１°及び１７．４°に特徴的なピークを有する。また、化合物（ａ）のＡ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、図２に示すパターンを有する。化合物（ａ）のＡ晶は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）において、補外開始点温度が２７７℃の吸熱ピークを有する。
化合物（ａ）のＡ晶は、ＫＢｒ錠剤法による赤外吸収スペクトルにおいて、８７４ｃｍ−１、１３３０ｃｍ−１、及び３３１４ｃｍ−１の波数で吸収ピークを有する。また、化合物（ａ）のＡ晶は、図１１に示す赤外吸収スペクトルチャートを示す。
化合物（ａ）のＡ晶は、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、１５４．７ｐｐｍ、１３８．８ｐｐｍ、１３３．６ｐｐｍ、１１３．２ｐｍ、１０１．６ｐｐｍ、１００．４ｐｐｍ、６７．４ｐｐｍ、５１．８ｐｐｍ、２６．６ｐｐｍ及び２３．３ｐｐｍの化学シフトを有する。また、化合物（ａ）のＡ晶は、図１９−１（６５００Ｈｚ)及び図１９−２（１４０００Ｈｚ）に示す１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
化合物（ａ）のＡ晶は、１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、２４３．６ｐｐｍ、８６．７ｐｐｍ、５６．７ｐｐｍ及び−１２．４ｐｐｍの化学シフトを有する。また、化合物（ａ）のＡ晶は、図２０に示す１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【0021】
化合物（ａ）のＢ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角２θ＝５．３°、６．０°、６．７°、１０．４°及び２０．８°に特徴的なピークを有する。また、化合物（ａ）のＢ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、図６に示すパターンを有する。化合物（ａ）のＢ晶は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）において、補外開始点温度が２７１℃の吸熱ピークを有する。
【0022】
化合物（ａ）のＣ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角２θ＝６．０ °、１０．０°、１３．７°、２０．３°及び２３．０° に特徴的なピークを有する。また、化合物（ａ）のＣ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、図７に示すパターンを有する。化合物（ａ）のＣ晶は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）において、補外開始点温度が１００℃及び２７８℃の吸熱ピークを有する。
化合物（ａ）のＣ晶は、ＫＢｒ錠剤法による赤外吸収スペクトルにおいて、８４０ｃｍ−１、９０４ｃｍ−１、９５５ｃｍ−１、１４９０ｃｍ−１、及び３２８１ｃｍ−１の波数で吸収ピークを有する。また、化合物（ａ）のＣ晶は、図１２に示す赤外吸収スペクトルチャートを示す。
【0023】
化合物（ａ）のＩ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角２θ＝５．２°、７．２°、９．５°、１４．５°、１６．５°、２０．９°、２５．０°及び２７．９°に特徴的なピークを有する。また、化合物（ａ）のＩ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、図８に示すパターンを有する。化合物（ａ）のＩ晶は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）において、補外開始点温度が２７２℃の吸熱ピークを有する。
化合物（ａ）のＩ晶は、ＫＢｒ錠剤法による赤外吸収スペクトルにおいて、１０８１ｃｍ−１及び１２６０ｃｍ−１の波数で吸収ピークを有する。また、化合物（ａ）のＩ晶は、図１３に示す赤外吸収スペクトルチャートを示す。
【0024】
化合物（ｂ）のＡ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角２θ＝５．２°、７．６°、８．４°、１０．５°、１５．２°、１６．９°、２０．１°、２１．０°、２３．３°及び２６．６°に特徴的なピークを有する。また、化合物（ｂ）のＡ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、図３に示すパターンを有する。化合物（ｂ）のＡ晶は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）において、補外開始点温度が２２５℃の吸熱ピークを有する。
化合物（ｂ）のＡ晶は、赤外吸収スペクトルにおいて、１３６９ｃｍ-１、１４２４ｃｍ-１、１５０８ｃｍ-１、１５４５ｃｍ-１及び １５６６ｃｍ-１の波数で吸収ピークを有する。また、化合物（ｂ）のＡ晶は、図１４に示す赤外吸収スペクトルチャートを示す。
化合物（ｂ）のＡ晶は、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、１６３．４ｐｐｍ、１５７．６ｐｐｍ、１５５．５ｐｐｍ、１１７．８ｐｐｍ、８２．２ｐｐｍ、５６．１ｐｐｍ及び４２．３ｐｐｍの化学シフトを有する。また、化合物（ｂ）のＡ晶は、図２１−１（６５００Ｈｚ)及び図２１−２（１４０００Ｈｚ）に示す１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
化合物（ｂ）のＡ晶は、１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、３１１．７ｐｐｍ、２３２．４ｐｐｍ、１６８．５ｐｐｍ、７９．５ｐｐｍ、５３．３ｐｐｍ、３２．９ｐｐｍ及び−４．３ｐｐｍの化学シフトを有する。また、化合物（ｂ）のＡ晶は、図２２に示す１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【0025】
化合物（ｂ）のＢ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角２θ＝５．２°、６．６°、８．１°、１５．２°、１５．９°、１６．２°、１８．８°、２０．５°、２０．８°及び２１．７°に特徴的なピークを有する。また、化合物（ｂ）のＢ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、図４に示すパターンを有する。化合物（ｂ）のＢ晶は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）において、補外開始点温度が２２１℃の吸熱ピークを有する。
【0026】
化合物（ｂ）のＣ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角２θ＝５．２°、７．６°、８．４°、１０．０°、１０．５°、１１．９°、１５．２°、１７．０°、 ２０．９°及び ２１．２°に特徴的なピークを有する。また、化合物（ｂ）のＣ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、図９に示すパターンを有する。化合物（ｂ）のＣ晶は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）において、補外開始点温度が２２３℃の吸熱ピークを有する。
【0027】
化合物（ｂ）のＣ晶は、ＫＢｒ錠剤法による赤外吸収スペクトルにおいて、１３６９ｃｍ−１、１４２４ｃｍ−１、１５０７ｃｍ−１、１５４６ｃｍ−１及び１５６６ｃｍ−１の波数で吸収ピークを有する。また、化合物（ｂ）のＣ晶は、図１５に示す赤外吸収スペクトルチャートを示す。【0028】
化合物（ｃ）のＡ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、２θ＝４．８、７．６、８．２、９．７、１５．３、１６．６、１９．１、１９．８、２２．４及び２６．２°に特徴的なピークを有する。また、化合物（ｃ）のＡ晶は、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、図５に示すパターンを有する。化合物（ｃ）のＡ晶は、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）において、補外開始点温度が１８２℃の吸熱ピークを有する。
【0029】
化合物（ｃ）のＡ晶は、ＫＢｒ錠剤法による赤外吸収スペクトルにおいて、１１１５ｃｍ−１、１４４６ｃｍ−１、１５０８ｃｍ−１、１５６０ｃｍ−１及び１６０１ｃｍ−１の波数で吸収ピークを有する。また、化合物（ｃ）のＡ晶は、図１６に示す赤外吸収スペクトルチャートを示す。化合物（ｃ）のＡ晶は、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、１６１．３ｐｐｍ、１５０．８ｐｐｍ、１３８．９ｐｐｍ、１２８．１ｐｐｍ、１０９．８ｐｐｍ、８２．７ｐｐｍ、４７．６ｐｐｍ、４２．５ｐｐｍ、４１．５ｐｐｍ、２４．５ｐｐｍ、及び２１．７ｐｐｍの化学シフトを有する。また、化合物（ｃ）のＡ晶は、図２３−１（６５００Ｈｚ)及び図２３−２（１４０００Ｈｚ）に示す１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルチャートを示す。
【0030】
化合物（ｃ）のＡ晶は、１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、２４２．８ｐｐｍ、２３３．８ｐｐｍ、２１９．０ｐｐｍ、１７１．７ｐｐｍ、８６．９ｐｐｍ、５４．９ｐｐｍ、１１．３ｐｐｍ及び-５．５ｐｐｍ の化学シフトを有する。また、化合物（ｃ）のＡ晶は、図２４に示す１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルチャートを示す。【0031】
ここで「特徴的なピーク」とは各々の結晶多形の粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて主に認められるピーク及び固有のピークを意味する。本発明の回折角で特定される結晶には、上記の特徴的なピーク以外のピークを認めるものも含まれる。【0032】
粉末Ｘ線回折スペクトルにおける回折角２θの位置および相対強度は測定条件によって多少変動しうるものであるため、２θがわずかに異なる場合であっても、適宜スペクトル全体のパターンを参照して結晶形の同一性は認定されるべきであり、かかる誤差の範囲の結晶も本発明に含まれる。２θの誤差としては、例えば、±０．５°、±０．２°が考えられる。すなわち、上記回折角で特定される結晶には、±０．２°から±０．５°の範囲で一致するものも含まれる。また、粉末Ｘ線回折スペクトルの測定条件（例えば、装置)に由来する誤差の範囲の結晶も本発明に含まれる。
【0033】
示差走査熱分析（ＤＳＣ）において、ピークの補外開始点温度とは、発熱または吸熱ピークの開始点の温度であり、外挿により求めた発熱または吸熱開始温度をいう。示差走査熱分析（ＤＳＣ）における発熱および吸熱ピークも測定条件によって多少変動しうる。誤差としては、例えば、±５℃、±２℃の範囲が考えられる。すなわち、上記ピークで特定される結晶は、±２℃から±５℃の範囲で一致するものも含まれる。【0034】
一般に、固体ＮＭＲスペクトルにおける化学シフトも、誤差が生じ得るものである。かかる誤差としては、例えば、±０．２５ｐｐｍ、典型的には、±０．５ｐｐｍの範囲である。すなわち、上記化学シフトで特定される結晶形は、±０．２５ｐｐｍから±０．５ｐｐｍの範囲で一致するものも含まれる。また、回転周波数や測定機器の相違により、ピーク強度が変化したり、ピークが出現又は消滅することがある。【0035】
一般に、赤外吸収スペクトルにおける吸収ピークも、誤差が生じ得るものである。かかる誤差としては、例えば、±２ｃｍ−１、典型的には、±５ｃｍ−１の範囲である。すなわち、上記波数で特定される結晶形は、±２ｃｍ−１から±５ｃｍ−１の範囲で一致するものも含まれる。【0036】
さらに、粉末Ｘ線回折スペクトル、示差走査熱分析（ＤＳＣ）、赤外吸収スペクトル、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル及び１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルのいずれについても、結晶の標準品、例えば本願実施例記載の方法により得られた各結晶の実測値と、本願記載の数値との差も、測定誤差として許容されうる。すなわち、かかる方法により算出された誤差範囲内で、回折角、吸熱および発熱ピーク、赤外吸収スペクトルまたは１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルおよび１５Ｎ固体ＮＭＲスペクトルが一致する結晶も本発明の結晶に含まれる。【実施例】
【0037】
以下、本開示に係る実施例を挙げて具体的に説明する。ただし、以下の実施例は本発明を限定するものではない。例えば、以下の実施例で例示する化合物の合成方法、精製方法及び結晶化方法は、本発明の結晶を得るための方法の例示であり、本発明の結晶が以下に開示する合成方法、精製方法及び結晶化方法によってのみ得られた結晶に限定されるものではない。【0038】
実施例の結晶に係る化合物及び合成の際に単離された新規化合物の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ又はＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフ／質量分析計）を用いる質量分析法により確認した。【0039】
１Ｈ−ＮＭＲについては、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＣＺ４００Ｓ（４００ＭＨｚ）を用いた。溶媒がＣＤＣｌ３の場合はテトラメチルシラン（０．０ｐｐｍ）を、ＤＭＳＯ−ｄ６の場合はジメチルスルホキシドのピーク（２．４９ｐｐｍ）を標準ピークとして用いた。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、ＣＤ３ＯＤ、またはＣＤＣｌ３）については、その化学シフト（δ：ｐｐｍ）およびカップリング定数（Ｊ：Ｈｚ）を示す。なお、以下の略号はそれぞれ次のものを表す。ｓ＝ｓｉｎｇｌｅｔ、ｄ＝ｄｏｕｂｌｅｔ、ｔ＝ｔｒｉｐｌｅｔ、ｑ＝ｑｕａｒｔｅｔ、ｂｒｓ＝ｂｒｏａｄ ｓｉｎｇｌｅｔ、ｍ＝ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ。【0040】
ＬＣ／ＭＳの結果については、各化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋の値（分子量実測値（Ｏｂｓ. ＭＳ）:すなわち化合物の分子質量［Ｍ］にプロトン［Ｈ］＋が付加した実測値）を示す。【0041】
実施例に係る結晶の粉末Ｘ線回折スペクトルは、以下の条件で測定した。装置：ブルカー・エイエックスエス製 Ｄ８ ＤＩＳＣＯＶＥＲ Ｗｉｔｈ ＧＡＤＤＳ ＣＳ、 線源：Ｃｕ・Ｋα、 波長：１．５４１８３８（１０−１０ｍ）、管電圧−管電流：４０ｋｖ−４０ｍＡ、入射側平板グラファイトモノクロメータ、コリメータφ３００μｍ、２次元ＰＳＰＣ検出器、スキャン３〜４０°
【0042】
実施例に係る視差走査熱量は、以下の条件で測定した。装置：パーキンエルマー製ＤＳＣ８０００、昇温速度：毎分１０℃、雰囲気：窒素、サンプルパン：アルミニウム、サンプリング：０．１秒、測定温度範囲：２５〜３００℃
【0043】
実施例に係る赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）は、日本薬局方の一般試験法に記載された赤外吸収スペクトル測定法の臭化カリウム錠剤法に従い、以下の条件で測定した。装置：サーモフィッシャーサイエンティフィック製 ＡＶＡＴＡＲ３２０ Ｎｉｃｏｌｅｔ ｉＳ５、測定範囲：４０００〜４００ｃｍ−１、分解能：４ｃｍ−１、積算回数：１６
【0044】
実施例に係る固体ＮＭＲスペクトルは、以下の条件で測定した。装置：ブルカー製 ＤＳＸ３００ＷＢ、測定核：１３Ｃ及び１５Ｎ、パルス繰り返し時間：５秒、パルスモード：ＣＰ／ＭＡＳ測定
【0045】
［実施例１］本実施例では、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オン（化合物（ａ））のＤ晶について説明する。
まず、化合物（ａ）の合成方法について説明する。
【0046】
＜化合物（ａ）−１の合成＞以下の化合物（ａ）−１で示されるメチル ５−ブロモ−２−メチルチオピリミジン−４−カルボキシレートの合成を行った。
【0047】
【化2】
【0048】
５−ブロモ−２−（メチルチオ）ピリミジン−４−カルボン酸（１１０ｇ、０．４４ｍｏｌ）のメタノール溶液（１．１Ｌ）を撹拌しながら０℃に冷却し、塩化チオニル（５０ｍＬ、０．６６ｍｏｌ）を滴下した。反応溶液をゆっくりと加熱し、加熱還流下で４時間反応させた。反応の完結をＬＣ／ＭＳとＴＬＣで確認し、反応溶液を室温で冷却した。揮発成分を減圧下で留去し、残渣を酢酸エチル（１Ｌ）に溶解させ、１０％炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）で３回、飽和食塩水（２００ｍＬ）で２回洗浄し、得られた有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、固体を濾別した後、濾液を減圧下で濃縮した。得られた粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物（８８ｇ、７５％）を得た。【0049】
＜化合物（ａ）−２の合成＞以下の化合物（ａ）−２で示される５−ブロモ−２−メチルチオピリミジン−４−カルバルデヒドの合成を行った。
【0050】
【化3】
【0051】
化合物（ａ）−１（２５ｇ、９５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液（３７５ｍＬ）を窒素雰囲気下で−７８℃に冷却し、撹拌した。この溶液に水素化ジイソブチルアルミニウム（８４ｍＬ、１４３ｍｍｏｌ、１．７Ｍトルエン溶液）を滴下し、−７８℃で４時間撹拌し、反応の完結をＴＬＣで確認後、−７８℃でメタノールを滴下して反応を停止させ、反応溶液をゆっくりと０℃まで昇温させた。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、セライトを通して吸引濾過した。濾液を飽和食塩水（２００ｍＬ）で２回洗浄し、得られた有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、固体を濾別した。濾液を濃縮することで、表題化合物（２５ｇ、粗体）を得た。この粗体は更に精製することなく次の反応に用いた。【0052】
＜化合物（ａ）−３の合成＞以下の化合物（ａ）−３で示される（Ｒ）−３−（４−ホルミル−２−メチルチオピリミジン−５−イル）−１−メチル−２−プロピニル ベンゾエートの合成を行った。
【0053】
【化4】
【0054】
ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（７．８３２ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（２．１２ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）との１，４−ジオキサン溶液（６０ｍｌ）を脱気およびアルゴン置換し、ジイソプロピルエチルアミン（２５．２９ｍＬ、１４５．１ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この反応溶液を室温で５分間撹拌し、化合物（ａ）−２と（５−ブロモ−２−メチルチオピリミジン−４−イル）メトキシメタノールの混合物（２６．０ｇ、粗体）の１，４−ジオキサン溶液（５０ｍＬ）を室温にて添加した後、（Ｒ）−１−メチループロパルギルベンゾエート（２３．３ｇ、１３３．９ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液（５５ｍＬ）をゆっくりと滴下し、反応溶液を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＬＣ／ＭＳで追跡し、反応が完結したら、反応混合物を酢酸エチル（４００ｍＬ）で希釈し、セライトを通して吸引濾過し、セライトを酢酸エチルで洗浄した。得られた濾液を減圧下で濃縮し、得られた粗体をそのまま次の反応に使用した。なお、化合物（ａ）−２と（５−ブロモ−２−メチルチオピリミジン−４−イル）メトキシメタノールの混合物の合成については、参考例１に記載する。
【0055】
（参考例１）化合物（ａ）−２と（５−ブロモ−２−メチルチオピリミジン−４−イル）メトキシメタノールの混合物の合成
【0056】
【化5】
【0057】
化合物（ａ）−２（２５ｇ、９５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（３７５ｍＬ）を窒素雰囲気下で−７８℃に冷却し、撹拌した。この溶液にジイソブチルアルミニウムヒドリド（８４ｍＬ、１４３ｍｍｏｌ、１．７Ｍトルエン溶液）を滴下し、−７８℃で４時間撹拌し、反応の完結をＴＬＣで確認後、−７８℃でメタノールを滴下して反応を停止させ、反応溶液をゆっくりと０℃まで昇温させた。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、セライトを通して吸引濾過した。濾液を飽和食塩水（２００ｍＬ）で２回洗浄し、得られた有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、固体を濾別した。濾液を濃縮することで、表題化合物の混合物（２５ｇ、粗体）を得た。この粗体は更に精製することなく次の反応に用いた。【0058】
＜化合物（ａ）−４の合成＞以下の化合物（ａ）−４で示される（Ｒ）−６−（１−（ベンゾイルオキシ）エチル）−２−（メチルチオ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−７−オキシドの合成を行った。
【0059】
【化6】
【0060】
化合物（ａ）−３（２６．０ｇ、７９．８ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２６０ｍｌ）にヒドロキシアミン・一塩酸塩（８．３１ｇ、１１９．６ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（９．８１ｇ、１１９．６ｍｍｏｌ）を室温にて加え、室温にて１６時間撹拌した。この反応溶液にエタノール（２５０ｍｌ）を追加し、さらに室温にて炭酸カリウム（２７．５ｇ、１９９．４ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、５０℃で３時間撹拌した。反応の進行をＬＣ／ＭＳで追跡し、反応が完結したら、反応混合物をセライトを通して吸引濾過し、セライトを酢酸エチル（１．０Ｌ）および少量のメタノールで洗浄した。得られた濾液を減圧下で濃縮し、得られた有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、固体を濾別した。得られた粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題の化合物（ａ）−４（１３．０ｇ、４８％）を得た。【0061】
化合物（ａ）−４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは次の通りであった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：９．０４（１Ｈ，ｓ），８．７９（１Ｈ，ｓ），８．１４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７７−７．４０（４Ｈ，ｍ），６．６６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．６５（３Ｈ，ｓ），１．７９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）
【0062】
＜化合物（ａ）−５の合成＞以下の化合物（ａ）−５で示される（Ｒ）−１−（８−クロロ−２−（メチルチオ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル）エチル ベンゾエート の合成を行った。
【0063】
【化7】
【0064】
化合物（ａ）−４（８．０ｇ、２３．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１３０ｍｌ）に塩化チオニル（５１ｍｌ、７０４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で０℃にて滴下し、反応溶液を室温にて１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）で追跡し、反応が完結したら反応溶液を減圧下で濃縮し、得られた有機相をアルミナカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（ａ）−５（３．２ｇ、３７％）を得た。【0065】
化合物（ａ）−５の１Ｈ−ＮＭＲの結果は次の通りであった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：９．１９（１Ｈ，ｓ），８．１６−８．１２（２Ｈ，ｍ），７．６８（１Ｈ，ｓ），７．６４−７．５８（１Ｈ，ｍ），７．５３−７．４６（２Ｈ，ｍ）， ６．２７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．７４（３Ｈ，ｓ），１．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）
【0066】
＜化合物（ａ）−６＞以下の化合物（ａ）−６で示される（Ｒ）−１−（８−（イソプロピルアミノ）−２−（メチルチオ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル）エチル ベンゾエートの合成
【0067】
【化8】
【0068】
化合物（ａ）−５（３．０６ｇ、８．５ｍｍｏｌ）とイソプロピルアミン（１８ｍＬ）の混合物を８０℃で１時間撹拌した後、反応溶液を室温まで冷却した。反応溶液を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。得られた有機相を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を留去して得られた粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することで、表題の化合物（ａ）−６（１．７８ｇ、収率５５％）を得た。【0069】
得られた化合物（ａ）−６の１Ｈ−ＮＭＲの結果は次の通りであった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ：９．２８（１Ｈ，ｓ），８．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．９９（１Ｈ，ｓ），５．３４（２Ｈ，ｓ），４．３２（１Ｈ，ｍ），２．６６（３Ｈ，ｓ），１．２５（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）
【0070】
＜化合物（ａ）−７の合成＞以下の化合物（ａ）−７で示される（Ｒ）−１−（８−（イソプロピルアミノ）−２−（メチルスルホニル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル）エチル ベンゾエートの合成を行った。
【0071】
【化9】
【0072】
化合物（ａ）−６（１．７８ｇ、４．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（４７ｍｌ）と水（４７ｍｌ）の混合溶液に０℃でオキソン（ペルオキシ一硫酸カリウム）（５．７２ｇ、９．３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで抽出し、得られた有機相を水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を留去して得られた粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することで、表題の化合物（ａ）−７（１．６１ｇ、収率８７％）を得た。ＬＣ／ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）＋＝４１５．０
【0073】
＜化合物（ａ）−８の合成＞以下の化合物（ａ）−８で示されるｔｅｒｔ−ブチル ４−（６−ニトロピリジン−３−イル）−３−オキソピペラジン−１−カルボキシレートの合成を行った。
【0074】
【化10】
【0075】
２−ニトロ−５−ブロモピリジン（１．０１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル ２−オキソ−４−ピペラジン−カルボキシレート（１．００ｇ、５．０ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（３．２６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサンに懸濁させ、３０分間窒素ガスをバブリングさせた。この懸濁液に、Ｘａｎｔｐｈｏｓ（４，５’−ビス(ジフェニルホスフィノ)−９，９’−ジメチルキサンテン）（２４６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）とトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（２２９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、加熱還流下で２時間撹拌した。反応溶液を室温で冷却した後、水と酢酸エチルを加え、セライトを通してろ過した。濾液の有機相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。得られた有機相を混合し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、固体を濾別し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題の化合物（ａ）−８（１．０８ｇ、６７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ:８．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），８．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ），４．３３（２Ｈ，ｓ），３．９３−３．８３（４Ｈ，ｍ），１．５１（９Ｈ，ｓ）
【0076】
＜化合物（ａ）−９の合成＞以下の化合物（ａ）−９で示されるｔｅｒｔ−ブチル ４−（６−アミノピリジン−３−イル）−３−オキソピペラジン−１−カルボキシレートの合成を行った。
【0077】
【化11】
【0078】
化合物（ａ）−８（１．０８ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）をエタノール（４５ｍＬ）とＴＨＦ（２２ｍＬ）に溶解させた。この溶液にパラジウム炭素（１０８ｍｇ）を加え、水素雰囲気下で２４時間撹拌した。反応溶液をセライトを通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して表題の化合物（ａ）−９（０．９２８ｇ、９５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），７．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ），６．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．５０（２Ｈ，ｂｒｓ），４．２４（２Ｈ，ｓ），３．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），３．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），１．５０（９Ｈ，ｓ）
【0079】
＜化合物（ａ）−１０の合成＞以下の化合物（ａ）−１０で示されるｔｅｒｔ−ブチル （Ｒ）−４−（６−（（６−（１−（ベンゾイロキシ）エチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−２−イル）アミノ）ピリジン−３−イル）−３−オキソピペラジン−１−カルボキシレートの合成を行った。
【0080】
【化12】
【0081】
化合物（ａ）−７（６２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）と化合物（ａ）−９（８８ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）をトルエン（０．３７５ｍｌ）中で６日間、１００℃にて撹拌した。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して表題化合物（０．００９２ｇ、１０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ）δ：１０．２７（１Ｈ，ｓ），９．２７（１Ｈ，ｓ），８．３３（２Ｈ，ｍ），８．０７（２Ｈ，ｍ），７．８６（１Ｈ，ｍ），７．７０（１Ｈ，ｍ），７．５８（３Ｈ，ｍ），７．００（１Ｈ，ｓ），６．５５（１Ｈ，ｄ），５．９８（１Ｈ，ｑ），４．２７（１Ｈ，ｍ），４．１１（２Ｈ，ｓ），３．７４（４Ｈ，ｍ），１．６８（３Ｈ，ｄ），１．４５（９Ｈ，ｓ），１．３０（６Ｈ，ｍ）
【0082】
＜化合物（ａ）の合成及び精製＞化合物（ａ）で示される１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オンの合成を行った。
【0083】
【化13】
【0084】
化合物（ａ）−１０（９．２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（０．３５ｍｌ）にとりフルオロ酢酸（０．１５ｍｌ）を室温にて加え、１時間撹拌した。反応溶液を濃縮乾固した後、テトラヒドロフラン（０．１５ｍｌ）とメタノール（０．１５ｍｌ）を加え、４Ｍ水酸化リチウム水溶液（０．０１８ｍｌ）加えた。反応溶液をギ酸にて中和した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して表題化合物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ：１０．１６（１Ｈ，ｓ），９．２６（１Ｈ，ｓ），８．３１（１Ｈ，ｍ），８．２９（１Ｈ，ｓ），７．８１（１Ｈ，ｍ），７．００（１Ｈ，ｓ），６．４２（１Ｈ，ｍ），５．１８（１Ｈ，ｄ），４．６３（１Ｈ，ｍ），４．２７（１Ｈ，ｍ），３．６５（２Ｈ，ｍ），３．４１（２Ｈ，ｓ），３．０５（２Ｈ，ｍ），１．３９（３Ｈ，ｄ），１．３０（６Ｈ，ｍ）
【0085】
＜化合物（ａ）のＤ晶の製造＞前述のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製された化合物（ａ）の溶液を濃縮して飽和化し、結晶を析出させた。これにより、化合物（ａ）のＤ晶を得た。
【0086】
＜化合物（ａ）のＤ晶の評価＞得られた結晶のＸＲＤを図１に示す。回折角２θ＝６．３°、６．６°、１１．６°、１６．９°及び２０．０°にピークが観測された。
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）における吸熱ピークは２７７℃であった。
得られた結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を図１０に示す。波数７０３ｃｍ−１、８９６ｃｍ−１及び３４１８ｃｍ−１にピークが観測された。
【0087】
得られた結晶の固体ＮＭＲスペクトル（１３Ｃ）を図１７−１（６５００Ｈｚ)及び図１７−２（１４０００Ｈｚ）に示す。化学シフト１３６．０ｐｐｍ、１１１．２ｐｐｍ、１０５．１ｐｐｍ、１０１．８ｐｐｍ、５２．７ｐｐｍ、４９．６ｐｐｍ、４２．９ｐｐｍ、２３．８ｐｐｍ及び１８．５ｐｐｍにピークが観測された。得られた結晶の固体ＮＭＲスペクトル（１５Ｎ）を図１８に示す。化学シフト２４８．６ｐｐｍ、２４５．７ｐｐｍ、２２９．２ｐｐｍ、２１４．５ｐｐｍ、１７４．３ｐｐｍ、８６．５ｐｐｍ、５４．７ｐｐｍ及び−１２．４ｐｐｍにピークが観測された。
【0088】
［実施例２］本実施例では、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オン（化合物（ａ））のＡ晶について説明する。
【0089】
＜化合物（ａ）のＡ晶の製造＞化合物（ａ）のＡ晶は、実施例１で得られた化合物（ａ）のＤ晶を変換させて製造した。
具体的には、Ｄ晶をＤ晶の５〜５０倍量のエタノールに懸濁させた後、反応溶液を６時間加熱撹拌し、次いで反応溶液を０℃で撹拌した後、析出物を濾取、乾燥して結晶を得た。
なお、溶媒量、加熱時間、撹拌条件、濾別までの時間は特に限定されないが、それらの条件が結晶の収率、化学純度、粒子径、粒度分布などに影響することがあるので、目的に応じて組み合わせて設定することが好ましい。濾取は通常の方法、例えば自然濾過、加圧濾過、減圧濾過、加熱乾燥、減圧加熱乾燥を用いることができる。
【0090】
＜化合物（ａ）のＡ晶の評価＞得られた結晶のＸＲＤを図２に示す。回折角２θ＝５．３°、７．３°、１０．３°、１５．１°及び１７．４°にピークが観測された。
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）における吸熱ピークは２７７℃であった。
得られた結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を図１１に示す。８７４ｃｍ−１、１３３０ｃｍ−１、及び３３１４ｃｍ−１にピークが観測された。
得られた結晶の固体ＮＭＲスペクトル（１３Ｃ）を図１９−１（６５００Ｈｚ)及び図１９−２（１４０００Ｈｚ）に示す。化学シフト１５４．７ｐｐｍ、１３８．８ｐｐｍ、１３３．６ｐｐｍ、１１３．２ｐｍ、１０１．６ｐｐｍ、１００．４ｐｐｍ、６７．４ｐｐｍ、５１．８ｐｐｍ、２６．６ｐｐｍ及び２３．３ｐｐｍにピークが観測された。
得られた結晶の固体ＮＭＲスペクトル（１５Ｎ）を図２０に示す。化学シフト２４３．６ｐｐｍ、８６．７ｐｐｍ、５６．７ｐｐｍ及び−１２．４ｐｐｍにピークが観測された。
【0091】
［実施例３］本実施例では、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリジル）ピペラジン−２−オン（化合物（ａ））のＢ晶について説明する。
【0092】
＜化合物（ａ）のＢ晶の製造＞実施例１におけるカラムクロマトグラフィーで使用した溶媒をジクロロメタン／メタノール＝２０／１に変えて精製された化合物（ａ）の溶液を濃縮して飽和化し、結晶を析出させた。これにより化合物（ａ）のＢ晶を得た。
【0093】
＜化合物（ａ）のＢ晶の評価＞得られた結晶のＸＲＤを図６に示す。回折角２θ＝５．３°、６．０°、６．７°、１０．４°及び２０．８°にピークが観測された。
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）における吸熱ピークは２７１℃であった。
【0094】
［実施例４］＜化合物（ａ）のC晶の製造＞
化合物（ａ）のD晶（９００ｍｇ）にジメチルスルホキシド（５．４ｍＬ）を加え、７０℃に加熱した。得られた溶液を４０℃に冷却した後、アセトニトリル（６．７５ｍＬ）を加え１５℃に冷却し、２時間撹拌した。得られた固体を濾過し、アセニトニトリル（２．５ｍＬ）で洗浄した後、４０℃で減圧乾燥し、ジメチルスルホキシド和物である表題化合物（９８６mｇ、９２％）を得た。
【0095】
＜化合物（ａ）のＣ晶の評価＞得られた結晶のＸＲＤを図７に示す。回折角２θ＝６．０ °、１０．０°、１３．７°、２０．３°及び２３．０°にピークが観測された。
示差走査熱量分析における吸熱ピークの補外開始点温度が１００℃及び２７８℃であった。
得られた結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を図１２に示す。波数８４０ｃｍ−１、９０４ｃｍ−１、９５５ｃｍ−１、１４９０ｃｍ−１、及び３２８１ｃｍ−１にピークが観測された。
【0096】
［実施例５］＜化合物（ａ）のI晶の製造＞
化合物（ａ）のA晶（５００ｍｇ）に水（１０ｍＬ）を加え、室温で４日間撹拌した。得られた固体を濾過し、３０℃で減圧乾燥し、表題化合物（４３２ｍｇ、８６％）を得た。
【0097】
＜化合物（ａ）のＩ晶の評価＞得られた結晶のＸＲＤを図８に示す。回折角２θ＝５．２°、７．２°、９．５°、１４．５°、１６．５°、２０．９°、２５．０°及び２７．９°にピークが観測された。
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）における吸熱ピークは２７２℃であった。
得られた結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を図１３に示す。波数１０８１ｃｍ−１及び１２６０ｃｍ−１にピークが観測された。
【0098】
［実施例６］本実施例では、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジン（化合物（ｂ））のＡ晶について説明する。
まず、化合物（ｂ）の合成方法について説明する。
【0099】
＜化合物（ｂ）−１の合成＞以下の化合物（ｂ）−１で示される（Ｒ）−Ｎ−イソプロピル−６−（１−メトキシエチル）−２−（メチルチオ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−８−アミンの合成を行った。
【0100】
【化14】
【0101】
化合物（ｂ）−１は、前述した化合物（ａ）−３、化合物（ａ）−４、化合物（ａ）−５及び化合物（ａ）−６と同様の手順によって合成した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ:９．２７（７Ｈ，ｓ），６．９４（１Ｈ，ｂｒｓ），６．９２（１Ｈ，ｓ），４．３０−４．２３（１Ｈ，ｍ），３．２９（３Ｈ，ｓ），２．６６（３Ｈ，ｓ），１．３８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．３２−１．２５（６Ｈ，ｍ）
【0102】
＜化合物（ｂ）−２の合成＞以下の化合物（ｂ）−２で示される（Ｒ）−Ｎ−イソプロピル−６−（１−メトキシエチル）−２−（メチルスルホニル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−８−アミンの合成
【0103】
【化15】
【0104】
化合物（ｂ）−１のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と水の混合溶液に０℃でオキソンを加え、室温にて１８時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで抽出し、得られた有機相を水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を留去して得られた粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することで、表題の化合物（ｂ）−２を得た。ＬＣ／ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）＋＝３２５．１０
【0105】
＜化合物（ｂ）−３の合成＞以下の化合物（ｂ）−３で示されるｔｅｒｔ−ブチル ４−（６−クロロピリダジン−３−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートの合成を行った。
【0106】
【化16】
【0107】
３，６−ジクロロピリダジン−（５．０１ｇ、３３．６ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチル ピペラジン−１−カルボキシレート（６．８８ｇ、３７．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（１１．７ｍＬ、５０．４ｍｍｏｌ）を添加して、８０℃で終夜撹拌した。反応溶液を室温に冷却し、水を加えた後、ジクロロメタンとメタノールの９５：５混合溶液（５０ｍＬ）で３回抽出した。混合した有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、固体を濾別した後、濾液を減圧下で濃縮した。得られた粗体をジエチルエーテルで洗浄することで、表題の化合物（ｂ）−３（７．０ｇ、７０％）を得た。【0108】
＜化合物（ｂ）−４の合成＞以下の化合物（ｂ）−４で示されるｔｅｒｔ−ブチル ４−（６−（（ジフェニルメチレン）アミノ）ピリダジン−３−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートの合成を実施した。
【0109】
【化17】
【0110】
化合物（ｂ）−３（５９．８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ベンゾフェノンイミン（４３．５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（９．２ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（２，２’-ビス（ジフェニルホスフィノ）−１,１’−ビナフチル）（１２．５ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（１３０．３ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍＬ）に懸濁させ、１００℃で終夜撹拌した。室温で冷却した後、反応溶液をセライトを通して濾過し、セライトを酢酸エチルで洗浄した。得られた濾液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、固体を濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、表題の化合物（ｂ）−４（６７ｍｇ、７６％）を得た。【0111】
＜化合物（ｂ）−５の合成＞以下の化合物（ｂ）−５で示されるｔｅｒｔ−ブチル ４−（６−アミノピリダジン−３−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートの合成を行った。
【0112】
【化18】
【0113】
化合物（ｂ）−４（６７ｍｇ、０．１５１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．７６ｍＬ）に溶解させ、クエン酸水溶液（０．３７８ｍＬ、０．７５５ｍｍｏｌ、２ｍｏｌ／Ｌ）を加えて室温で終夜撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍＬ）を加えて中和し、酢酸エチル（５ｍＬ）で２回抽出した。有機相を混合し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、固体を濾別した後、濾液を減圧下で濃縮した。得られた粗体をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（５ｍＬ）で洗浄することで、表題の化合物（ｂ）−５（０．３０ｇ、７１％）を得た。その他、本実施例に関連する化合物として、６−アミノピリジン−３−カルバルデヒドと、ｔｅｒｔ−ブチル ４−［（６−アミノピリジン−３−イル）メチル］ピペラジン−１−カルボキシレートの合成方法を参考例として以下に示す。
【0114】
＜化合物（ｂ）−６の合成＞化合物（ｂ）−６で示されるｔｅｒｔ−ブチル （Ｒ）−４−（６−（（８−（イソプロピルアミノ）−６−（１−メトキシエチル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−２−イル）アミノ）ピリダジン−３−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートの合成を行った。
【0115】
【化19】
【0116】
実施例１で合成した化合物（ａ）−５（７０８ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）と化合物（ｂ）−５（７３２ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（５．５ｍｌ）を１００℃にて３日間撹拌した。室温に戻した後、酢酸エチル（２０ｍｌ）とジクロロメタン（１００ｍｌ）で希釈し、飽和食塩水（９０ｍｌ）および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）で洗浄した後、分離した有機相を濃縮乾固し、シリカゲルカラムにて精製し、表題の化合物（ｂ）−６（５１０ｍｇ、４５％）を得た。【0117】
＜化合物（ｂ）の合成＞以下の化合物（ｂ）で表される１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジンの合成を行った。
【0118】
【化20】
【0119】
化合物（ｂ）−６（３３．２ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（０．４４ｍｌ）に室温でトリフルオロ酢酸（０．２ｍｌ）を加え、室温にて１時間撹拌した。得られた溶液を濃縮乾固し、さらにＨＰＬＣを用いて分取精製し、表題化合物（２３．８ｍｇ、８８％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ：１０．２４（１Ｈ，ｓ），９．２０（１Ｈ，ｓ），８．１６（１Ｈ，ｄ），７．３６（１Ｈ，ｄ），６．８６（１Ｈ，ｓ），６．３５（１Ｈ，ｄ），６．４２（１Ｈ，ｍ），４．２２（２Ｈ，ｍ），３．４３（４Ｈ，ｍ），３．２６（４Ｈ，ｍ），２．８１（３Ｈ，ｍ），１．３７（３Ｈ，ｄ），１．２６（６Ｈ，ｍ）
【0120】
＜化合物（ｂ）のＡ晶の製造＞ＨＰＬＣによって分取精製された化合物（ｂ）のＴＦＡ塩（トリフルオロ酢酸塩）を得た。次に得られたＴＦＡ塩を、水−ジクロロメタン中で撹拌した。次に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で水相をｐＨ８〜９の弱アルカリ性に調整し、有機相を分離した。その後、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて溶媒を留去し、結晶を得た。
【0121】
＜化合物（ｂ）のＡ晶の評価＞得られた結晶のＸＲＤを図３に示す。回折角２θ＝５．２°、７．６°、８．４°、１０．５°、１５．２°、１６．９°、２０．１°、２１．０°、２３．３°及び２６．６°にピークが観測された。
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）における吸熱ピークは２２５℃であった。
得られた結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を図１４に示す。波数１３６９ｃｍ−１、１４２４ｃｍ−１、１５０８ｃｍ−１、１５４５ｃｍ−１及び１５６６ｃｍ−１にピークが観測された。
得られた結晶の固体ＮＭＲスペクトル（１３Ｃ）を図２１−１（６５００Ｈｚ)及び図２１−２（１４０００Ｈｚ）に示す。化学シフト１６３．４ｐｐｍ、１５７．６ｐｐｍ、１５５．５ｐｐｍ、１１７．８ｐｐｍ、８２．２ｐｐｍ、５６．１ｐｐｍ及び４２．３ｐｐｍピークが観測された。
得られた結晶の固体ＮＭＲスペクトル（１５Ｎ）を図２２に示す。化学シフト３１１．７ｐｐｍ、２３２．４ｐｐｍ、１６８．５ｐｐｍ、７９．５ｐｐｍ、５３．３ｐｐｍ、３２．９ｐｐｍ及び-４．３ｐｐｍにピークが観測された。
【0122】
［実施例７］本実施例では、１−（６−（（６−（（１Ｒ）−１−メトキシエチル）−８−（イソプロピルアミノ）ピリド[３，４−ｄ]ピリミジン−２−イル）アミノ）−３−ピリダジル）ピペラジン（化合物（ｂ））のＢ晶について説明する。
【0123】
＜化合物（ｂ）のＢ晶の製造＞本実施例は、Ａ晶の製造の過程で析出したＴＦＡ塩に、テトラヒドロフラン（０．１５ｍｌ）とメタノール（０．１５ｍｌ）加え、４Ｍ水酸化リチウム水溶液（０．０１８ｍｌ）加えた。反応溶液をギ酸にて中和した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。これにより得られた化合物（ｂ）の溶液を濃縮して飽和化し、結晶を析出させた。これにより、化合物（ｂ）のＢ晶を得た。
【0124】
＜化合物（ｂ）のＢ晶の評価＞得られた結晶のＸＲＤを図４に示す。回折角２θ＝５．２°、６．６°、８．１°、１５．２°、１５．９°、１６．２°、１８．８°、２０．５°、２０．８°及び２１．７°にピークが観測された。
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）における吸熱ピークは、２２１℃であった。
【0125】
［実施例８]＜化合物（ｂ）のＣ晶の製造＞
化合物（ｂ）のＣ晶（１．１ｇ）にエタノール（１１ｍＬ）を加え、室温で終夜撹拌した。得られた固体を濾過し、４０℃で減圧乾燥し、表題化合物（９４５ｍｇ、８６％）を得た。
【0126】
＜化合物（ｂ）のC晶の評価＞得られた結晶のＸＲＤを図９に示す。回折角２θ＝５．２°、７．６°、８．４°、１０．０°、１０．５°、１１．９°、１５．２°、１７．０°、 ２０．９°及び ２１．２°にピークが観測された。
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）における吸熱ピークは２２３℃であった。
得られた結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を図１５に示す。波数１３６９ｃｍ−１、１４２４ｃｍ−１、１５０７ｃｍ−１、１５４６ｃｍ−１及び１５６６ｃｍ−１にピークが観測された。
【0127】
［実施例９］本実施例では、（Ｒ）−Ｎ８−イソプロピル−６−（１−メトキシエチル）−Ｎ２−（５−（ピペラジン−１−イルメチル）ピリジン−２−イル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン（化合物（ｃ））のＡ晶について説明する。
まず、化合物（ｃ）の合成方法について説明する。
【0128】
＜化合物（ｃ）−１の合成＞以下の化合物（ｃ）−１に示される６−アミノピリジン−３−カルバルデヒドの合成の合成を行った。
【0129】
【化21】
【0130】
６−アミノピリジン−３−カルボニトリル（１．９ｇ、１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１６０ｍＬ）に溶解させ、撹拌しながら−７８℃に冷却した。この溶液に−７８℃で水素化ジイソブチルアルミニウム（１０６．５ｍＬ、１．５Ｍトルエン溶液）をゆっくりと滴下し、撹拌しながら２０℃まで昇温した後、２時間撹拌を継続した。反応溶液に氷水（１００ｍＬ）を加えて反応を停止させ、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で３回抽出した。得られた有機相を混合した後、食塩水（１００ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾別した後、濾液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで粗精製し、表題化合物の粗体（１．７ｇ）を得た。この粗体はこれ以上精製せずに次の反応に用いた。
【0131】
＜化合物（ｃ）−２の合成＞以下の化合物（ｃ）−２に示されるｔｅｒｔ−ブチル ４−［（６−アミノピリジン−３−イル）メチル］ピペラジン−１−カルボキシレートの合成を行った。
【0132】
【化22】
【0133】
６−アミノピリジン−３−カルボニトリル（１．９ｇ、１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１６０ｍＬ）に溶解させ、撹拌しながら−７８℃に冷却した。この溶液に−７８℃で水素化ジイソブチルアルミニウム（１０６．５ｍＬ、１．５Ｍトルエン溶液）をゆっくりと滴下し、撹拌しながら２０℃まで昇温した後、２時間撹拌を継続した。反応溶液に氷水（１００ｍＬ）を加えて反応を停止させ、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で３回抽出した。得られた有機相を混合した後、食塩水（１００ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾別した後、濾液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで粗精製し、表題化合物の粗体（１．７ｇ）を得た。【0134】
次いで、得られた粗体（１．７ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチル ピペラジン−１−カルボキシレート（３．２ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解させ、室温で８時間撹拌した。この反応溶液にトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（８．８４ｇ、４０．９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。反応の進行はＬＣ／ＭＳで追跡し、反応終了後、飽和炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて反応を停止させ、酢酸エチル（５０ｍＬ）で３回抽出した。得られた有機相を混合し、食塩水（１００ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾別した後、濾液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで粗精製し、表題化合物（３．３ｇ、８１％）を得た。【0135】
＜化合物（ｃ）−３の合成＞以下の化合物（ｃ）−３で示される、ｔｅｒｔ−ブチル （Ｒ）−４−（（６−（（８−（イソプロピルアミノ）−６−（１−メトキシエチル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−２−イル）アミノ）ピリジン−３−イル）メチル）ピペラジン−１−カルボキシレートの合成を行った。
【0136】
【化23】
【0137】
実施例２で合成した化合物（ｂ）−２と化合物（ｃ）−２を化合物（ｂ）−６と同様の方法で合成し、表題の化合物（ｃ）−３の合成を行った。【0138】
＜化合物（ｃ）の合成＞以下の化合物（ｃ）で示される（Ｒ）−Ｎ８−イソプロピル−６−（１−メトキシエチル）−Ｎ２−（５−（ピペラジン−１−イルメチル）ピリジン−２−イル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミンの合成
【0139】
【化24】
【0140】
化合物（ｃ）−３を用いて実施例１の化合物（ａ）と同様にして表題化合物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ：９．０４（１Ｈ，ｓ），８．３４（１Ｈ，ｄ），８．２６（１Ｈ，ｓ），７．７４（１Ｈ，ｄｄ），６．８４（１Ｈ，ｓ），６．１４（１Ｈ，ｄ），４．４１（１Ｈ，ｍ），４．３３（１Ｈ，ｑ），３．４９ （２Ｈ，ｓ），３．４１（３Ｈ，ｓ），２．９１（４Ｈ，ｍ），２．４６（４Ｈ，ｂｒ），１．５０（３Ｈ，ｄ），１．３６（６Ｈ，ｍ）
【0141】
＜化合物（ｃ）のＡ晶の製造＞ＨＰＬＣによって分取精製された化合物（ｃ）の溶液を濃縮して飽和化し、結晶を析出させた。これにより、化合物（ｃ）のＡ晶を得た。
【0142】
＜化合物（ｃ）のＡ晶の評価＞得られた結晶のＸＲＤを図５に示す。回折角２θ＝４．８°、７．６°、８．２°、９．７°、１５．３°、１６．６°、１９．１°、１９．８°、２２．４°及び２６．２°にピークが観測された。
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）における吸熱ピークは、１８２℃であった。
得られた結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を図１６に示す。波数１１１５ｃｍ−１、１４４６ｃｍ−１、１５０８ｃｍ−１、１５６０ｃｍ−１及び１６０１ｃｍ−1にピークが観測された。
得られた結晶の固体ＮＭＲスペクトル（１３Ｃ）を図２３−１（６５００Ｈｚ)及び図２３−２（１４０００Ｈｚ）に示す。化学シフト１６１．３ｐｐｍ、１５０．８ｐｐｍ、１３８．９ｐｐｍ、１２８．１ｐｐｍ、１０９．８ｐｐｍ、８２．７ｐｐｍ、４７．６ｐｐｍ、４２．５ｐｐｍ、４１．５ｐｐｍ、２４．５ｐｐｍ、及び２１．７ｐｐｍにピークが観測された。
得られた結晶の固体ＮＭＲスペクトル（１５Ｎ）を図２４に示す。化学シフト２４２．８ｐｐｍ、２３３．８ｐｐｍ、２１９．０ｐｐｍ、１７１．７ｐｐｍ、８６．９ｐｐｍ、５４．９ｐｐｍ、１１．３ｐｐｍ及び-５．５ｐｐｍ にピークが観測された。
【0143】
［実施例１０］ヒトＣＤＫ４／サイクリン Ｄ３阻害活性評価化合物（ａ）、化合物（ｂ）および化合物（ｃ）について、ヒトＣＤＫ４／サイクリン Ｄ３阻害活性の評価を行った。
評価は、カルナバイオサイエンス株式会社から購入したアッセイキット（ＱＳ Ｓ Ａｓｓｉｓｔ ＣＤＫ４／Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３＿ＦＰキット）を用いて、化合物のＣＤＫ４／サイクリン Ｄ３阻害活性を測定した。本アッセイキットはモレキュラーデバイス社のＩＭＡＰテクノロジーに基づき、キナーゼによってリン酸化された蛍光基質がＩＭＡＰ結合試薬に結合することで引き起こされる蛍光偏光の変化を定量することにより、キナーゼ活性を測定するものである。
【0144】
キット添付の１０×アッセイバッファー又はキット添付と同組成の自家調製アッセイバッファーを各溶液調製に用いた。キット添付の１０×アッセイバッファーを精製水で１０倍希釈してアッセイバッファーを調製した。アッセイバッファーは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０及び２ｍＭ ジチオトレイトールからなる。試験化合物溶液は、試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で終濃度の１００倍に調製したのちに、アッセイバッファーで２５倍希釈して終濃度の４倍に調製した。ＡＴＰ／基質／Ｍｅｔａｌ溶液は、キット添付の５×ＡＴＰ／基質／Ｍｅｔａｌ溶液をアッセイバッファーで５倍希釈して調製した。酵素溶液は、キット添付のＣＤＫ４／サイクリン Ｄ３を終濃度の２倍になるようアッセイバッファーで希釈して調製した（ＣＤＫ４／サイクリン Ｄ３終濃度は、１２．５〜２５ｎｇ／ウェル）。検出試薬は、５×ＩＭＡＰ結合バッファーＡ及び５×ＩＭＡＰ結合バッファーＢを各々精製水で５倍希釈したのち、ＩＭＡＰ結合バッファーＡ：ＩＭＡＰ結合バッファーＢ＝８５：１５となるよう混合し、ここにＩＭＡＰ結合試薬を４００倍希釈になるよう添加して調製した。【0145】
３８４ウェルプレートに試験化合物溶液を５μＬ、ＡＴＰ／基質／Ｍｅｔａｌ溶液を５μＬ添加し、さらに酵素溶液又はアッセイバッファー１０μＬを添加後、混合して酵素反応を開始した。総反応液量は２０μＬ／ウェルであり、反応液組成は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｎＭ ＦＩＴＣ標識ペプチド基質（カルナバイオサイエンス）、１００μＭ ＡＴＰ、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１％ ＤＭＳＯ、１２．５〜２５ｎｇ／ウェル ＣＤＫ４／サイクリン Ｄ３とした。室温にて４５分間反応させたのちに、各ウェルに検出試薬を６０μＬ添加し、室温・遮光条件にてさらに３０分間反応させた。次いで、マイクロプレートリーダーを使用し、励起波長：４８５ｎｍ、測定波長：５３５ｎｍでの蛍光偏光を測定した。【0146】
酵素溶液を添加し、試験化合物溶液の代わりにＤＭＳＯを添加したときの酵素活性を１００％、酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加し、試験化合物溶液の代わりにＤＭＳＯを添加したときの酵素活性を０％として試験化合物の酵素活性阻害率を計算し、用量反応曲線にフィットさせてＣＤＫ４／サイクリン Ｄ３に対する５０％阻害濃度を計算した。その結果、各化合物のＣＤＫ４／サイクリン Ｄ３活性に対する阻害活性は、いずれもＩＣ５０値＜１０ｎＭであった。
【0147】
［実施例１１］ヒトＣＤＫ２／サイクリン Ａ２阻害活性の評価化合物（ａ）、化合物（ｂ）および化合物（ｃ）について、ヒトＣＤＫ２／サイクリン Ａ２阻害活性の評価を行った。カルナバイオサイエンス株式会社から購入したアッセイキット（ＱＳ Ｓ Ａｓｓｉｓｔ ＣＤＫ２／Ｃｙｃｌｉｎ Ａ２＿ＦＰキット）を用いて、化合物のＣＤＫ２／サイクリン Ａ２阻害活性を測定した。本アッセイキットはモレキュラーデバイス社のＩＭＡＰテクノロジーに基づき、キナーゼによってリン酸化された蛍光基質がＩＭＡＰ結合試薬に結合することで引き起こされる蛍光偏光の変化を定量することにより、キナーゼ活性を測定するものである。
【0148】
キット添付の１０×アッセイバッファーを精製水で１０倍希釈してアッセイバッファーを調製し、各溶液調製に用いた。アッセイバッファーは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０及び２ｍＭ ジチオトレイトールからなる。試験化合物溶液は、試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で終濃度の１００倍に調製したのち、アッセイバッファーで２５倍希釈して終濃度の４倍に調製した。ＡＴＰ／基質／Ｍｅｔａｌ溶液は、キット添付の５×ＡＴＰ／基質／Ｍｅｔａｌ溶液をアッセイバッファーで５倍希釈して調製した。酵素溶液は、キット添付のＣＤＫ２／サイクリン Ａ２を終濃度の２倍になるようアッセイバッファーで希釈して調製した（ＣＤＫ２／サイクリン Ａ２終濃度は、２．５ｎｇ／ウェル）。検出試薬は、５×ＩＭＡＰ結合バッファーＡを精製水で５倍希釈したものに、ＩＭＡＰ結合試薬を４００倍希釈になるよう添加して調製した。【0149】
３８４ウェルプレートに試験化合物溶液を５μＬ、ＡＴＰ／基質／Ｍｅｔａｌ溶液を５μＬ添加し、さらに酵素溶液又はアッセイバッファー１０μＬを添加し、混合して酵素反応を開始した。総反応液量は２０μＬ／ウェルであり、反応液組成は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｎＭ ＦＩＴＣ標識ペプチド基質（カルナバイオサイエンス）、３０μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１％ ＤＭＳＯ、２．５ｎｇ／ウェル ＣＤＫ２／サイクリン Ａ２とした。室温にて６０分間反応させたのちに、各ウェルに検出試薬を６０μＬ添加し、室温・遮光条件にてさらに３０分間反応させた。次いで、マイクロプレートリーダーを使用し、励起波長：４８５ｎｍ、測定波長：５３５ｎｍでの蛍光偏光を測定した。【0150】
酵素溶液を添加し、試験化合物溶液の代わりにＤＭＳＯを添加したときの酵素活性を１００％、酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加し、試験化合物溶液の代わりにＤＭＳＯを添加したときの酵素活性を０％として試験化合物の酵素活性阻害率を計算し、用量反応曲線にフィットさせてＣＤＫ２／サイクリン Ａ２に対する５０％阻害濃度を計算した。その結果、各化合物のＣＤＫ２／サイクリンＡ２活性に対する阻害活性は、１００ｎＭ≦ＩＣ５０値であった。
【0151】
［実施例１２］ヒトＣＤＫ６／サイクリン Ｄ３阻害活性の評価ＣＤＫ６／サイクリン Ｄ３阻害活性の測定は、Ｏｆｆ−ｃｈｉｐ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ（ＭＳＡ）法により行った。 ＭＳＡ法は、タンパク質の分子量や電荷の違いによって電気泳動時の移動度が異なることを利用して、分離する方法である。キナーゼ活性測定においては、キナーゼによりリン酸化された基質電荷の陰性への変化を電気泳動の原理で分離してリン酸化の程度を定量することにより、キナーゼ活性を測定するものである。
【0152】
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ジチオトレイトールからなるアッセイバッファーを各溶液調製に用いた。試験化合物溶液は、試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で終濃度の１００倍に調製したのち、アッセイバッファーで２５倍希釈して終濃度の４倍に調製した。ＡＴＰ／基質／Ｍｅｔａｌ溶液は、終濃度の４倍のものを調製した。酵素溶液は、終濃度の２倍のものを調製した。酵素濃度は、酵素活性によるシグナルと陽性対照化合物の阻害活性値をもとに、適切な終濃度を設定した。【0153】
３８４ウェルプレートに試験化合物溶液を５μＬ、ＡＴＰ／基質／Ｍｅｔａｌ溶液を５μＬ添加し、さらに酵素溶液又はアッセイバッファー１０μＬを添加、混合して酵素反応を開始した。総反応液量は２０μＬ／ウェルであり、反応液組成は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ジチオトレイトール、１０００ｎＭ ペプチド基質（ＤＹＲＫｔｉｄｅ−Ｆ）、３００μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１％ ＤＭＳＯ、設定した濃度のＣＤＫ６／サイクリン Ｄ３とした。室温にて５時間反応させたのち、各ウェルにターミネーションバッファー（ＱｕｉｃｋＳｃｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓｉｓｔ ＭＳＡ；カルナバイオサイエンス社製）を６０μＬ添加し、反応を停止させた。次いで、キャリパーライフサイエンス社のＬａｂＣｈｉｐ３０００を使用し、反応溶液中の基質ペプチドとリン酸化ペプチドを分離、定量した。キナーゼ反応は基質ペプチドピーク高さ（Ｓ）とリン酸化ペプチドピーク高さ（Ｐ）から計算される生成物比（Ｐ／（Ｐ＋Ｓ））にて評価した。【0154】
酵素溶液を添加し、試験化合物溶液の代わりにＤＭＳＯを添加したときの酵素活性を１００％、酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加し、試験化合物溶液の代わりにＤＭＳＯを添加したときの酵素活性を０％として、試験化合物の酵素活性阻害率を計算し、用量反応曲線にフィットさせてＣＤＫ６／サイクリン Ｄ３に対する５０％阻害濃度を計算した。その結果、各化合物のＣＤＫ６／サイクリン Ｄ３活性に対する阻害活性は、ＩＣ５０値＜１０ｎＭであった。
【産業上の利用可能性】
【0155】
本発明の化合物（Ｉ）の結晶は、医薬品製造用原体として用いることができる。