特許 6750010 抗ＨｔｒＡ１抗体及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6750010

(24)【登録日】2020年8月14日

(45)【発行日】2020年9月2日

(54)【発明の名称】抗ＨｔｒＡ１抗体及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20200824BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20200824BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20200824BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20200824BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20200824BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20200824BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20200824BHJP

   A61K 9/22 20060101ALI20200824BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20200824BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13

   C07K16/40ZNA

   C07K16/18

   C07K16/46

   A61P43/00 121

   A61P43/00 111

   A61K45/00

   A61P27/02

   A61P9/10

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K9/19

   A61K47/34

   A61K9/22

   C12P21/08

【請求項の数】38

【全頁数】137

(21)【出願番号】特願2018-521878(P2018-521878)

(86)(22)【出願日】2016年10月27日

(65)【公表番号】特表2019-506135(P2019-506135A)

(43)【公表日】2019年3月7日

(86)【国際出願番号】US2016059110

(87)【国際公開番号】WO2017075212

(87)【国際公開日】20170504

【審査請求日】2018年7月12日

(31)【優先権主張番号】62/411,113

(32)【優先日】2016年10月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/248,871

(32)【優先日】2015年10月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/345,669

(32)【優先日】2016年6月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ケリー， ロバート エフ．

(72)【発明者】

【氏名】キルヒホーファー， ダニエル ケー

(72)【発明者】

【氏名】ライ， ジョイス

(72)【発明者】

【氏名】リー， ジンウェイ ヴィー．

(72)【発明者】

【氏名】リャン， ウェイ−チーン

(72)【発明者】

【氏名】リーパリ， マイケル ティー．

(72)【発明者】

【氏名】ロイエット， ケリー エム．

(72)【発明者】

【氏名】サイ， タオ

(72)【発明者】

【氏名】ファン ローケレン カンパーニュ， メノ

(72)【発明者】

【氏名】ウー， ヤン

(72)【発明者】

【氏名】フー， ジャーメイン

【審査官】 斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１５−５０１１４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０９４３７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 C. CIFERRI，THE TRIMERIC SERINE PROTEASE HTRA1 FORMS A CAGE-LIKE INHIBITION COMPLEX WITH AN ANTI-HTRA1 ANTIBODY，BIOCHEMICAL JOURNAL，英国，２０１５年 ９月１８日，VOL: 472, NR: 2，PAGE(S): 169 - 181，ＵＲＬ，DOI: 10.1042/BJ20150601

【文献】 TIM CLAUSEN，HTRA PROTEASES: REGULATED PROTEOLYSIS IN PROTEIN QUALITY CONTROL，NATURE REVIEWS MOLECULAR CELL BIOLOGY，２０１１年 ２月１６日，VOL:12, NR:3，PAGE(S):152 - 162，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1038/nrm3065

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ Ｃ１２Ｐ Ａ６１Ｋ Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、以下の６つのＨＶＲ、
（ａ）ＤＳＥＸ１Ｈ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１（式中、Ｘ１がＭｅｔまたはＬｅｕである）、
（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＸ２ＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ２がＧｌｕまたはＡｓｐである）、
（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＸ３ＦＩＨ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ３がＧｌｕまたはＡｓｎである）、
（ｅ）ＡＴＳＸ４ＬＡＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ４が、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである）、及び
（ｆ）ＱＱＷＸ５ＳＸ６ＰＷＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ５がＳｅｒまたはＴｙｒであり、Ｘ６がＡｌａまたはＡｓｎである）を含む結合ドメインを含む、前記単離された抗体。

【請求項2】

（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１が、ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２が、ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３が、ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１が、ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２が、ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３が、ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項２に記載の抗体。

【請求項4】

前記ＶＨドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。

【請求項5】

前記抗体が、モノクローナル、ヒト化、またはキメラである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項6】

前記抗体が、ＨｔｒＡ１に結合する抗体断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項7】

前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される、請求項６に記載の抗体。

【請求項8】

前記抗体断片が、Ｆａｂである、請求項７に記載の抗体。

【請求項9】

前記Ｆａｂが、重鎖定常領域の上部ヒンジにトランケーションを含む、請求項８に記載の抗体。

【請求項10】

前記重鎖定常領域が、２２１位（ＥＵ番号付け）で終端する、請求項９に記載の抗体。

【請求項11】

前記抗体が、配列番号１６０の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項12】

前記抗体が、配列番号１５９の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項13】

前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項14】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。

【請求項15】

抗体の産生方法であって、請求項１４に記載の単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞を培養することと、前記抗体を前記宿主細胞または前記宿主細胞の培養培地から回収することと、を含む、前記方法。

【請求項16】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体を含み、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む、薬学的組成物。

【請求項17】

前記組成物が凍結乾燥されている、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項18】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体を含む、医薬。

【請求項19】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体とのＤ因子アンタゴニストの組み合わせを含む、医薬。

【請求項20】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体を含む、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害の治療における使用のための医薬。

【請求項21】

前記ＨｔｒＡ１関連障害または前記眼障害が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、またはポリープ状脈絡膜血管症である、請求項２０に記載の医薬。

【請求項22】

前記ＨｔｒＡ１関連障害または前記眼障害が、早期乾燥ＡＭＤ、中等度乾燥ＡＭＤ、または進行性乾燥ＡＭＤである、請求項２１に記載の医薬。

【請求項23】

前記進行性乾燥ＡＭＤが地図状萎縮である、請求項２２に記載の医薬。

【請求項24】

Ｄ因子アンタゴニストと組み合わせて使用するための、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の医薬。

【請求項25】

Ｄ因子アンタゴニストが抗Ｄ因子抗体である、請求項２４に記載の医薬。

【請求項26】

抗Ｄ因子抗体がランパリズマブである、請求項２５に記載の医薬。

【請求項27】

Ｄ因子アンタゴニストが順次に投与される、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬。

【請求項28】

ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害の治療のための医薬の製造における、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体の使用。

【請求項29】

前記ＨｔｒＡ１関連障害または前記眼障害が、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、またはポリープ状脈絡膜血管症である、請求項２８に記載の使用。

【請求項30】

前記ＨｔｒＡ１関連障害または前記眼障害が、早期乾燥ＡＭＤ、中等度乾燥ＡＭＤ、または進行性乾燥ＡＭＤである、請求項２９に記載の使用。

【請求項31】

前記進行性乾燥ＡＭＤが地図状萎縮である、請求項３０に記載の使用。

【請求項32】

医薬がＤ因子アンタゴニストを含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項33】

Ｄ因子アンタゴニストが抗Ｄ因子抗体である、請求項３２に記載の使用。

【請求項34】

抗Ｄ因子抗体がランパリズマブである、請求項３３に記載の使用。

【請求項35】

硝子体内に、眼内に、眼球内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、超脈絡膜に（ｓｕｐｅｒｃｈｏｒｏｉｄａｌｌｙ）、または局所に投与するための、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の医薬。

【請求項36】

前記医薬が、注射により硝子体内に投与するための、請求項３５に記載の医薬。

【請求項37】

前記医薬が、長時間作用型送達系により投与するための、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の医薬。

【請求項38】

前記長時間作用型送達系が、ＰＬＧＡベースの固体インプラントまたは埋め込み型ポート送達系である、請求項３７に記載の医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年１０月２５日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、５０４７４−１１７ＷＯ４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１０＿２５＿１６＿ＳＴ２５という名称であり、１１４，７７９バイトのサイズである。

【0002】

本発明は、概して、抗ＨｔｒＡ１抗体及びその使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

セリンプロテアーゼＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨｔｒＡ１）（ＰＲＳＳ１１；Ｃｌａｎ ＰＡ、ファミリー５１）は、ＨｔｒＡタンパク質の進化的に保存されたファミリーに属する。ヒトにおいて、ＨｔｒＡ１、ＨｔｒＡ３、及びＨｔｒＡ４は、同じドメイン構造：Ｎ末端ＩＧＦＢＰ様モジュール及びＫａｚａｌ様モジュール、トリプシン様フォールドを有するプロテアーゼドメイン、ならびにＣ末端ＰＤＺドメインを共有する。ＨｔｒＡ１の生理学的関連性は、家族性虚血性脳小血管疾患を引き起こすヒトの機能喪失変異の特定により確証されている。分子機構は、ＴＧＦβシグナル伝達の増大をもたらす、ＨｔｒＡ１によるＴＧＦβ阻害欠損を伴う。異常なＨｔｒＡ１発現による調節不全ＴＧＦβシグナル伝達は、恐らく、様々な細胞外マトリックス成分のＨｔｒＡ１媒介分解と併せて、またはマトリックスメタロプロテアーゼの上方調節を間接的に介して関節炎疾患にも寄与し得る。加えて、ヒト遺伝子研究は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の進行とＨｔｒＡ１転写レベルの増加をもたらすＨｔｒＡ１プロモーター領域におけるＳＮＰとの間の強い相関関係を特定した（例えば、Ｄｅｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：９８９−９９２，２００６及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：９９２−９９３，２００６を参照のこと）。

【0004】

ＡＭＤは、視力の重大な転帰を伴う中心網膜の進行性慢性疾患である。この疾患の後期発症は、先進工業国における失明の主な原因である。４０歳以上の白人人口の場合、早期ＡＭＤの有病率は、約６．８％と推定されており、進行性ＡＭＤの有病率は、約１．５％と推定されている。後期ＡＭＤの有病率は、加齢に伴い劇的に増加し、８０歳以降では約１１．８％にまで上昇する。２つのタイプのＡＭＤ、非滲出性（乾燥）ＡＭＤ及び滲出性（湿潤）ＡＭＤが存在する。より一般的な乾燥ＡＭＤは、中心網膜（斑）の下にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮及び肥大変化、ならびにＲＰＥ上の沈着物（ドルーゼン）を伴う。進行性乾燥ＡＭＤは、不可逆的失明を伴う、地図状萎縮（ＧＡ）を含む著しい網膜損傷をもたらし得る。さらに、乾燥ＡＭＤを有する患者は、湿潤形態に進行する場合があり、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）と呼ばれる異常血管が網膜下で発症し、体液及び血液を漏出させ、最終的には網膜内及び網膜下に失明に至る円板状の瘢痕をもたらす。

【0005】

結合親和性、安定性、及び阻害（遮断）活性等の特性が改善された抗ＨｔｒＡ１抗体、ならびにその治療的使用及び診断的使用が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、抗ＨｔｒＡ１抗体、ならびに治療及び診断目的のために抗ＨｔｒＡ１抗体を使用する方法を提供する。本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体は、非常に強力であり、ＨｔｒＡ１に対して高い結合親和性を有する。本発明の抗体の特性の改善により、本抗体が治療での使用に好適なものになる。

【0007】

一態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１エピトープに特異的に結合する単離された抗体を包含し、ＨｔｒＡ１エピトープは、Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、Ｐｈｅ１９４、及びＡｒｇ１９７からなる群から選択されるＨｔｒＡ１タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含み、アミノ酸番号付けは、ヒトＨｔｒＡ１前駆体タンパク質の番号付けを参照する。

【0008】

一実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７からなる群から選択されるＨｔｒＡ１タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含む。

【0009】

別の実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７からなる群から選択されるＨｔｒＡ１タンパク質の少なくとも２つのアミノ酸を含む。

【0010】

特定の一実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、ＨｔｒＡ１アミノ酸Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７を含む。

【0011】

別の実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、ＨｔｒＡ１アミノ酸Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７を含む。

【0012】

さらなる実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、ＨｔｒＡ１アミノ酸Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、Ｐｈｅ１９４、及びＡｒｇ１９７を含む。

【0013】

一態様では、本発明は、約５５０ｐＭ以下のＫＤでヒトＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨｔｒＡ１）に特異的に結合する単離された抗体を特色とする。いくつかの実施形態では、本抗体は、約４０ｐＭ〜約５５０ｐＭのＫＤでヒトＨｔｒＡ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、約４０ｐＭ〜約２５０ｐＭのＫＤでヒトＨｔｒＡ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、約５０ｐＭ〜約１２５ｐＭのＫＤでヒトＨｔｒＡ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、約１１０ｐＭのＫＤでヒトＨｔｒＡ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、約６０ｐＭのＫＤでヒトＨｔｒＡ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ）により測定される。いくつかの実施形態では、ＳＰＲは、本明細書（例えば、実施例の節）に記載されるように行われる。

【0014】

いくつかの実施形態では、前述の抗体のうちのいずれか１つは、ＨｔｒＡ１の活性を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本抗体は、１．５ｎＭ以下の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）でヒトＨｔｒＡ１（ｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ）のプロテアーゼドメインの活性を阻害する。いくつかの実施形態では、本抗体は、０．２５ｎＭ〜約０．５ｎＭのＩＣ５０でｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤの活性を阻害する。いくつかの実施形態では、本抗体は、約０．３ｎＭのＩＣ５０でｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤの活性を阻害する。いくつかの実施形態では、阻害活性は、インビトロでのＦＲＥＴに基づく遮断アッセイ測定である。いくつかの実施形態では、インビトロでのＦＲＥＴに基づく遮断アッセイは、Ｈ２−Ｏｐｔプローブ（例えば、配列番号１５２）の切断を含む。いくつかの実施形態では、インビトロでのＦＲＥＴに基づく遮断アッセイは、本明細書（例えば、実施例）に記載されるように行われる。

【0015】

上述の態様のいくつかの実施形態では、本抗体は、（ａ）ＤＳＥＸ_１Ｈ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１（式中、Ｘ_１がＭｅｔまたはＬｅｕである）、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＸ_２ＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_２がＧｌｕまたはＡｓｐである）、及び（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、（ａ）ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ_１ＦＸ_２（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１（式中、Ｘ_１がＬｙｓまたはＴｈｒであり、Ｘ_２がＴｈｒ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇである）、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＡＴＩＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、（ａ）ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＡＴＩＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４をさらに含む。

【0016】

上述の態様のいくつかの実施形態では、結合ドメインは、（ａ）ＲＡＳＳＳＶＸ_３ＦＩＨ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_３がＧｌｕまたはＡｓｎである）、（ｂ）ＡＴＳＸ_４ＬＡＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ_４が、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである）、及び（ｃ）ＱＱＷＸ_５ＳＸ_６ＰＷＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_５がＳｅｒまたはＴｙｒであり、Ｘ_６がＡｌａまたはＡｓｎである）をさらに含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、（ａ）ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３をさらに含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４をさらに含む。

【0017】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、（ａ）ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＡＴＩＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。

【0018】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＳＥＸ_１Ｈ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１（式中、Ｘ_１がＭｅｔまたはＬｅｕである）、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＸ_２ＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_２がＧｌｕまたはＡｓｐである）、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＸ_３ＦＩＨ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_３がＧｌｕまたはＡｓｎである）、（ｅ）ＡＴＳＸ_４ＬＡＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ_４が、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである）、及び（ｆ）ＱＱＷＸ_５ＳＸ_６ＰＷＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_５がＳｅｒまたはＴｙｒであり、Ｘ_６がＡｌａまたはＡｓｎである）を含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。

【0019】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、（ａ）ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＡＴＩＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。

【0020】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。

【0021】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、（ａ）ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＥＷＩＧ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、（ａ）ＮＩＶＶＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。

【0022】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。

【0023】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＳＹＩＭＳ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＹＩＳＮＧＧＧＴＴＹＹＳＤＴＩＫＧ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＱＮＦＲＳＤＧＳＳＭＤＹ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＫＳＦＭＨ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＬＡＳＫＬＥＳ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む結合ドメインを含む。

【0024】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、（ａ）ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。

【0025】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。

【0026】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、（ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、（ａ）ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＫＬＡＣＶＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＴＬＫＳＥＤＴＡＩＹＦＣＡＲ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＡＶＴＶＳＳ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、（ａ）ＮＩＶＶＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。

【0027】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。

【0028】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。

【0029】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、（ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。

【0030】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、（ｂ）配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む結合ドメインを含む。

【0031】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本抗体は、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラである。特定の実施形態では、本抗体は、モノクローナル、ヒト化、またはキメラである。

【0032】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本抗体は、ＨｔｒＡ１に結合する抗体断片である。いくつかの実施形態では、本抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、及び（Ｆａｂ’）_２断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本抗体断片は、Ｆａｂである。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、重鎖定常領域のヒンジ領域にトランケーションを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、重鎖定常領域の上部ヒンジにトランケーションを含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、２２１位（ＥＵ番号付け）で終端する。いくつかの実施形態では、２２１位のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）残基である。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１６０の重鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１５９の軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１６０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１５９の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、ＩｇＧ１ Ｆａｂである。

【0034】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態では、本抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、本抗体は、単一特異性抗体である。

【0035】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｄ因子に結合する第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＸ_１ＤＦＫＧ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）、（ｃ）ＥＧＧＶＸ_１Ｎ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（式中、Ｘ_１がＡｓｎまたはＳｅｒである）、（ｄ）ＩＴＳＴＸ_１ＩＸ_２Ｘ_３ＤＭＮ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ_２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ_３がＡｓｐまたはＳｅｒである）、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＸ_１ＳＬＰＹＴ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）を含む。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。

【0036】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１及びＤ因子の両方に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する第１の結合ドメイン、ならびに以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、Ｄ因子に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む。

【0037】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１及びＤ因子の両方に特異的に結合する単離された抗体を特色とし、本抗体は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する第１の結合ドメイン、ならびに（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、Ｄ因子に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む。

【0038】

上述の態様のいくつかの実施形態では、本発明は、ＨｔｒＡ１エピトープに特異的に結合する単離された抗体を包含し、ＨｔｒＡ１エピトープは、Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、Ｐｈｅ１９４、及びＡｒｇ１９７からなる群から選択されるＨｔｒＡ１タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含み、アミノ酸番号付けは、ヒトＨｔｒＡ１前駆体タンパク質の番号付けを参照する。

【0039】

一実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７からなる群から選択されるＨｔｒＡ１タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含む。

【0040】

特定の一実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、ＨｔｒＡ１アミノ酸Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７を含む。

【0041】

別の実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、ＨｔｒＡ１アミノ酸Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７を含む。

【0042】

さらなる実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、ＨｔｒＡ１アミノ酸Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、Ｐｈｅ１９４、及びＡｒｇ１９７を含む。

【0043】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体のうちのいずれかをコードする単離された核酸を特色とする。別の態様では、本発明は、本抗体を発現させるための単離された核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）を特色とする。別の態様では、本発明は、前述の核酸及び／またはベクターを含む宿主細胞を特色とする。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または２９３細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。

【0044】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体のうちのいずれかの産生方法であって、前述のベクター（例えば、発現ベクター）のうちのいずれかを含む宿主細胞を培養培地で培養することを含む、方法を特色とする。いくつかの実施形態では、本方法は、本抗体を宿主細胞または培養培地から回収することをさらに含む。

【0045】

別の態様では、本発明は、前述の抗体のうちのいずれか１つを含む組成物を特色とする。いくつかの実施形態では、本組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、本組成物は、薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、本組成物は、Ｄ因子結合アンタゴニストをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｄ因子結合アンタゴニストは、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）_２である。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＸ_１ＤＦＫＧ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）、（ｃ）ＥＧＧＶＸ_１Ｎ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（式中、Ｘ_１がＡｓｎまたはＳｅｒである）、（ｄ）ＩＴＳＴＸ_１ＩＸ_２Ｘ_３ＤＭＮ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ_２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ_３がＡｓｐまたはＳｅｒである）、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＸ_１ＳＬＰＹＴ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗原結合抗体断片は、ランパリズマブである。

【0046】

別の態様では、本発明は、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれか及びＤ因子アンタゴニストを含む併用療法を包含する。特定の一実施形態では、Ｄ因子アンタゴニストは、抗Ｄ因子抗体である。特定の一実施形態では、Ｄ因子アンタゴニストは、ランパリズマブである。特定の一実施形態では、抗Ｄ因子アンタゴニストは、連続して投与される。

【0047】

いくつかの態様では、前述の抗体のうちのいずれか１つは、薬剤として使用され得る。

【0048】

いくつかの態様では、前述の抗体のうちのいずれか１つは、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、またはポリープ状脈絡膜血管症である。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤは、早期乾燥ＡＭＤ、中等度乾燥ＡＭＤ、または進行性乾燥ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、進行性乾燥ＡＭＤは、地図状萎縮である。

【0049】

いくつかの態様では、前述の抗体のうちのいずれか１つは、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害の治療のための薬剤の製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害は、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、またはポリープ状脈絡膜血管症である。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤは、早期乾燥ＡＭＤ、中等度乾燥ＡＭＤ、または進行性乾燥ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、進行性乾燥ＡＭＤは、地図状萎縮である。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｄ因子結合アンタゴニストとの併用のために製剤化される。いくつかの実施形態では、Ｄ因子結合アンタゴニストは、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）_２である。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＸ_１ＤＦＫＧ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）、（ｃ）ＥＧＧＶＸ_１Ｎ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（式中、Ｘ_１がＡｓｎまたはＳｅｒである）、（ｄ）ＩＴＳＴＸ_１ＩＸ_２Ｘ_３ＤＭＮ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ_２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ_３がＡｓｐまたはＳｅｒである）、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＸ_１ＳＬＰＹＴ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗原結合断片は、ランパリズマブである。

【0050】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害の治療を必要とする対象におけるＨｔｒＡ１関連障害または眼障害の治療方法であって、前述の抗体のうちのいずれか１つの抗体の治療有効量を投与することを含む、方法を特色とする。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害は、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、またはポリープ状脈絡膜血管症である。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害または眼障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤは、早期乾燥ＡＭＤ、中等度乾燥ＡＭＤ、または進行性乾燥ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、進行性乾燥ＡＭＤは、地図状萎縮である。いくつかの実施形態では、本方法は、Ｄ因子結合アンタゴニストを投与することをさらに含む。

【0051】

別の態様では、本発明は、対象における網膜細胞または光受容細胞変性の阻害方法であって、対象に、前述の抗体のうちのいずれか１つの有効量を投与し、それにより網膜細胞または光受容細胞変性を阻害することを含む、方法を特色とする。

【0052】

別の態様では、本発明は、対象の眼におけるＨｔｒＡ１セリンプロテアーゼ活性の阻害方法であって、対象に、前述の抗体のうちのいずれか１つの有効量を投与し、それにより眼におけるＨｔｒＡ１セリンプロテアーゼ活性を阻害することを含む、方法を特色とする。いくつかの実施形態では、本方法は、Ｄ因子結合アンタゴニストを投与することをさらに含む。

【0053】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１関連障害または補体関連障害の治療を必要とする対象におけるＨｔｒＡ１関連障害または補体関連障害の治療方法であって、対象に、ＨｔｒＡ１結合アンタゴニスト及びＤ因子結合アンタゴニストの治療有効量を投与することを含む、方法を特色とする。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害または補体関連障害は、眼障害である。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症、角膜血管新生、及び網膜血管新生からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤは、早期乾燥ＡＭＤ、中等度乾燥ＡＭＤ、または進行性乾燥ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、進行性乾燥ＡＭＤは、地図状萎縮である。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１結合アンタゴニストは、抗ＨｔｒＡ１抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、及び（Ｆａｂ’）_２断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂである。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、重鎖定常領域の上部ヒンジにトランケーションを含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、２２１位（ＥＵ番号付け）で終端する。いくつかの実施形態では、２２１位のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）残基である。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１６０の重鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１５９の軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１６０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１５９の軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、ＩｇＧ１ Ｆａｂである。

【0054】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１関連障害または補体関連障害の治療を必要とする対象におけるＨｔｒＡ１関連障害または補体関連障害治療方法であって、対象に、前述の抗体のうちのいずれか１つの治療有効量及びＤ因子結合アンタゴニストの治療有効量を投与することを含む、方法を特色とする。

【0055】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｄ因子結合アンタゴニストは、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）_２である。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＸ_１ＤＦＫＧ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）、（ｃ）ＥＧＧＶＸ_１Ｎ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（式中、Ｘ_１がＡｓｎまたはＳｅｒである）、（ｄ）ＩＴＳＴＸ_１ＩＸ_２Ｘ_３ＤＭＮ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ_２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ_３がＡｓｐまたはＳｅｒである）、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＸ_１ＳＬＰＹＴ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗原結合断片は、ランパリズマブである。

【0056】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害または補体関連障害は、眼障害である。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症、角膜血管新生、及び網膜血管新生からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤは、早期乾燥ＡＭＤ、中等度乾燥ＡＭＤ、または進行性乾燥ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、進行性乾燥ＡＭＤは、地図状萎縮である。

【0057】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本抗体は、硝子体内、眼内、眼球内、強膜近傍、テノン嚢下、超脈絡膜（ｓｕｐｅｒｃｈｏｒｏｉｄａｌｌｙ）、局所、静脈内、筋肉内、皮内、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、腹腔内、腹腔、脳室内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼窩内、経口、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注射により、点眼薬により、埋め込みにより、注入により、持続注入により、標的細胞を直接浸す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリーム剤中で、または脂質組成物中で投与される。いくつかの実施形態では、本抗体は、硝子体内、眼内、眼球内、強膜近傍、テノン嚢下、超脈絡膜（ｓｕｐｅｒｃｈｏｒｏｉｄａｌｌｙ）、または局所投与される。いくつかの実施形態では、本抗体は、注射により硝子体内投与される。いくつかの実施形態では、本抗体は、点眼薬または軟膏により局所投与される。いくつかの実施形態では、本抗体は、長時間作用型送達系により投与される。特定の実施形態では、長時間作用型送達系は、ＰＬＧＡベースの固体インプラントまたは埋め込み型ポート送達系である。

【0058】

前述の態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。

【図面の簡単な説明】

【0059】

【図1A】酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）陽性ハイブリドーマクローンの大半が、ヒト（ｈｕ）及びマウス（ｍｕ）ＨｔｒＡ１プロテアーゼドメイン（ＰＤ）の両方に同様の反応性プロファイルを示したことを示すグラフである。これらのグラフは、示される７５のクローンの各々の６５０ｎｍ（ＯＤ_{６５０ｎｍ}）での光学密度を示す。このアッセイにおけるバックグラウンドシグナルは、０．０５ＯＤ_{６５０ｎｍ}未満であった。ヒト及びマウスＨｔｒＡ１プロテアーゼドメインは、９１％の相同性を共有した。

【図1B】酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）陽性ハイブリドーマクローンの大半が、ヒト（ｈｕ）及びマウス（ｍｕ）ＨｔｒＡ１プロテアーゼドメイン（ＰＤ）の両方に同様の反応性プロファイルを示したことを示すグラフである。これらのグラフは、示される７５のクローンの各々の６５０ｎｍ（ＯＤ_{６５０ｎｍ}）での光学密度を示す。このアッセイにおけるバックグラウンドシグナルは、０．０５ＯＤ_{６５０ｎｍ}未満であった。ヒト及びマウスＨｔｒＡ１プロテアーゼドメインは、９１％の相同性を共有した。

【図2A】ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ標識蛍光基質のＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介切断を阻害する示される抗ＨｔｒＡ１ハイブリドーマクローン上清の能力を決定するために使用された遮断アッセイの概略図である。

【図2B】１０の抗ＨｔｒＡ１ハイブリドーマクローン上清が、図２Ａ及び実施例１に記載の遮断アッセイを使用してヒトＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介基質切断を顕著に阻害したことを示すグラフである。これらのグラフは、示されるクローン由来のハイブリドーマ上清の平均蛍光シグナル（ミリ相対蛍光単位（ｍＲＦＵ）／分）を示す。馴化培地（ＣＭまたは馴化培地（ｃｏｎｄ．ｍｅｄｉｕｍ））中１０μｇ／ｍＬの抗体ＹＷ５０５．９４（「９４ ＩｇＧ」とも称される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０５５９９８号を参照のこと））は、このアッセイが培地による変化を示さないことを示すための陽性対照の役割を果たし、アッセイ時間にわたって安定している。緩衝液または培地は、陰性対照の役割を果たした。図２Ｃは、緩衝液、Ｅ培地（ＣＬＯＮＡＣＥＬＬ（商標）の栄養豊富な培地）、及び馴化培地についてのアッセイの初期結果及び最終結果を示す。１００％は、完全な阻害を示す。

【図2C】１０の抗ＨｔｒＡ１ハイブリドーマクローン上清が、図２Ａ及び実施例１に記載の遮断アッセイを使用してヒトＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介基質切断を顕著に阻害したことを示すグラフである。これらのグラフは、示されるクローン由来のハイブリドーマ上清の平均蛍光シグナル（ミリ相対蛍光単位（ｍＲＦＵ）／分）を示す。馴化培地（ＣＭまたは馴化培地（ｃｏｎｄ．ｍｅｄｉｕｍ））中１０μｇ／ｍＬの抗体ＹＷ５０５．９４（「９４ ＩｇＧ」とも称される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０５５９９８号を参照のこと））は、このアッセイが培地による変化を示さないことを示すための陽性対照の役割を果たし、アッセイ時間にわたって安定している。緩衝液または培地は、陰性対照の役割を果たした。図２Ｃは、緩衝液、Ｅ培地（ＣＬＯＮＡＣＥＬＬ（商標）の栄養豊富な培地）、及び馴化培地についてのアッセイの初期結果及び最終結果を示す。１００％は、完全な阻害を示す。

【図3A】ｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ（図３Ａ）またはｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ（図３Ｂ）による蛍光基質の切断を阻害する示されるハイブリドーマ上清の能力を示すグラフである。図３Ａでは、４０ｎＭのｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤを４０μＬのｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ：６０μＬのハイブリドーマ上清の比率で使用した。図３Ｂでは、２０ｎＭのｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤを４０μＬのｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ：６０μＬのハイブリドーマ上清の比率で使用した。抗体ＹＷ５０５．９４（「９４ ＩｇＧ」）は、陽性対照の役割を果たした。緩衝液及びＣＭは、陰性対照の役割を果たした。

【図3B】ｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ（図３Ａ）またはｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ（図３Ｂ）による蛍光基質の切断を阻害する示されるハイブリドーマ上清の能力を示すグラフである。図３Ａでは、４０ｎＭのｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤを４０μＬのｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ：６０μＬのハイブリドーマ上清の比率で使用した。図３Ｂでは、２０ｎＭのｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤを４０μＬのｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ：６０μＬのハイブリドーマ上清の比率で使用した。抗体ＹＷ５０５．９４（「９４ ＩｇＧ」）は、陽性対照の役割を果たした。緩衝液及びＣＭは、陰性対照の役割を果たした。

【図4A】ＦＲＥＴに基づく基質Ｈ２−ＯｐｔのＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介切断を阻害する精製抗ＨｔｒＡ１抗体クローンの能力を決定するために使用されたＦＲＥＴに基づく遮断アッセイの概略図である。

【図4B】精製抗体クローン１５Ｈ６、１９Ｂ１２、３Ａ５、１２Ａ５、及び２０Ｅ２がマウス（図４Ｂ）及びヒト（図４Ｃ）ＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介基質切断を阻害する能力を保持したことを示すグラフである。抗体添加なし（「抗体なし」）は、陰性対照の役割を果たし、抗体ＹＷ５０５．９４（「９４ ＩｇＧ」）は、陽性対照の役割を果たした。精製抗体を、５ｎＭ、５０ｎＭ、または５００ｎＭの濃度で添加した。１５ｎＭのｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｆｃを図４Ｂに提示されるアッセイに使用し、３ｎＭのｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｆｃを図４Ｃに提示されるアッセイに使用した。

【図4C】精製抗体クローン１５Ｈ６、１９Ｂ１２、３Ａ５、１２Ａ５、及び２０Ｅ２がマウス（図４Ｂ）及びヒト（図４Ｃ）ＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介基質切断を阻害する能力を保持したことを示すグラフである。抗体添加なし（「抗体なし」）は、陰性対照の役割を果たし、抗体ＹＷ５０５．９４（「９４ ＩｇＧ」）は、陽性対照の役割を果たした。精製抗体を、５ｎＭ、５０ｎＭ、または５００ｎＭの濃度で添加した。１５ｎＭのｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｆｃを図４Ｂに提示されるアッセイに使用し、３ｎＭのｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｆｃを図４Ｃに提示されるアッセイに使用した。

【図5A】示される精製ｍＩｇＧ抗体クローンがＦＲＥＴペプチド基質の全長ヒトＨｔｒＡ１（ｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬ）媒介切断を阻害することを示すグラフである。このグラフは、ＩｇＧ濃度の関数としての活性（ｍＲＦＵ／分）を示す。ｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬを５ｎＭの濃度で添加した。Ｃｉｆｆｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４７２（２）：１６９−８１に記載のＩｇＧ形式のＹＷ５０５．９４（「ＩｇＧ９４」）及びそのキメラ変異形（「ＩｇＧ９４−ｃｈ」）は、陽性対照の役割を果たした。各抗体クローンの半数阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。

【図5B】示される精製ｍＩｇＧ抗体クローンがＦＲＥＴペプチド基質の全長ヒトＨｔｒＡ１（ｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬ）媒介切断を阻害することを示すグラフである。このグラフは、ＩｇＧ濃度の関数としての活性（ｍＲＦＵ／分）を示す。ｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬを５ｎＭの濃度で添加した。Ｃｉｆｆｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４７２（２）：１６９−８１に記載のＩｇＧ形式のＹＷ５０５．９４（「ＩｇＧ９４」）及びそのキメラ変異形（「ＩｇＧ９４−ｃｈ」）は、陽性対照の役割を果たした。各抗体クローンの半数阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。

【図5C】示される精製ｍＩｇＧ抗体クローンがＦＲＥＴペプチド基質のｍｕＨｔｒＡ１−ＦＬ媒介切断を阻害することを示すグラフである。このグラフは、ＩｇＧ濃度の関数としての活性（ｍＲＦＵ／分）を示す。ｍｕＨｔｒＡ１−ＦＬを５ｎＭで添加した。ＩｇＧ９４及びＩｇＧ９４−ｃｈは、図５Ａ及び５Ｂの図の説明に記載されるように、陽性対照の役割を果たした。半数阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。

【図5D】示される精製ｍＩｇＧ抗体クローンがＦＲＥＴペプチド基質のｍｕＨｔｒＡ１−ＦＬ媒介切断を阻害することを示すグラフである。このグラフは、ＩｇＧ濃度の関数としての活性（ｍＲＦＵ／分）を示す。ｍｕＨｔｒＡ１−ＦＬを５ｎＭで添加した。ＩｇＧ９４及びＩｇＧ９４−ｃｈは、図５Ａ及び５Ｂの図の説明に記載されるように、陽性対照の役割を果たした。半数阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。

【図6A】抗体クローン１９Ｂ１２、２０Ｅ２、３Ａ５、１２Ａ５、及び１５Ｈ６の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列の配列アライメントを示す。

【図6B】抗体クローン１９Ｂ１２、２０Ｅ２、３Ａ５、１２Ａ５、及び１５Ｈ６の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列の配列アライメントを示す。

【図7A】ハイブリドーマ上清（「ｈｙｂ」）から精製されたか、または２９３細胞（「２９３」）から組換え発現されたｍＩｇＧ抗体クローン１５Ｈ６（図７Ａ）またはクローン１９Ｂ１２（図７Ｂ）を使用したＦＲＥＴに基づく遮断アッセイの結果を示すグラフである。これらのグラフは、抗体濃度（ｎＭ）の関数としてＶ_ｍａｘ（ｍＲＦＵ／分）をプロットする。３ｎＭのｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬを各アッセイに使用した。示される抗体クローンのＩＣ５０値も示す。

【図7B】ハイブリドーマ上清（「ｈｙｂ」）から精製されたか、または２９３細胞（「２９３」）から組換え発現されたｍＩｇＧ抗体クローン１５Ｈ６（図７Ａ）またはクローン１９Ｂ１２（図７Ｂ）を使用したＦＲＥＴに基づく遮断アッセイの結果を示すグラフである。これらのグラフは、抗体濃度（ｎＭ）の関数としてＶ_ｍａｘ（ｍＲＦＵ／分）をプロットする。３ｎＭのｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬを各アッセイに使用した。示される抗体クローンのＩＣ５０値も示す。

【図8A】ヒトコンセンサスκ１配列（図８Ａ）またはＶＨ１配列（図８Ｂ）と比較した、抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｍ１５Ｈ６、Ｈ１５Ｈ６．ｖ１、Ｈ１５Ｈ６．ｖ２、及びｈ１５Ｈ６．ｖ２．ＡＰＥＧ（本明細書で「ｈ１５Ｈ６．ｖ３」とも称される）のＶＬ（図８Ａ）及びＶＨ（図８Ｂ）のアミノ酸配列の配列アライメントを示す。ＨＶＲ配列を、抗体クローンの各々の示される囲みで区切っている。Ｋａｂａｔ定義に従うＨＶＲ配列には下線が引いてある。影付き囲み内の白色の文字で示される残基は、ヒトコンセンサスＶＨ１配列と抗ＨｔｒＡ１抗体クローンとの間で異なる残基を示す。

【図8B】ヒトコンセンサスκ１配列（図８Ａ）またはＶＨ１配列（図８Ｂ）と比較した、抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｍ１５Ｈ６、Ｈ１５Ｈ６．ｖ１、Ｈ１５Ｈ６．ｖ２、及びｈ１５Ｈ６．ｖ２．ＡＰＥＧ（本明細書で「ｈ１５Ｈ６．ｖ３」とも称される）のＶＬ（図８Ａ）及びＶＨ（図８Ｂ）のアミノ酸配列の配列アライメントを示す。ＨＶＲ配列を、抗体クローンの各々の示される囲みで区切っている。Ｋａｂａｔ定義に従うＨＶＲ配列には下線が引いてある。影付き囲み内の白色の文字で示される残基は、ヒトコンセンサスＶＨ１配列と抗ＨｔｒＡ１抗体クローンとの間で異なる残基を示す。

【図9A】ストレプトアビジンで捕捉されたビオチン化ヒトまたはマウスＨｔｒＡ１へのｍ１５Ｈ６またはｈ１５Ｈ６．ｖ１の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析の結果を示すグラフである。単一サイクル動態分析を用いた。これらのグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。ｈｕＨｔｒＡ１へのｍ１５Ｈ６ Ｆａｂの結合の結果を示す。各分析から決定されたＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図9B】ストレプトアビジンで捕捉されたビオチン化ヒトまたはマウスＨｔｒＡ１へのｍ１５Ｈ６またはｈ１５Ｈ６．ｖ１の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析の結果を示すグラフである。単一サイクル動態分析を用いた。これらのグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。ｍｕＨｔｒＡ１へのｍ１５Ｈ６ Ｆａｂの結合の結果を示す。各分析から決定されたＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図9C】ストレプトアビジンで捕捉されたビオチン化ヒトまたはマウスＨｔｒＡ１へのｍ１５Ｈ６またはｈ１５Ｈ６．ｖ１の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析の結果を示すグラフである。単一サイクル動態分析を用いた。これらのグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。ｈｕＨｔｒＡ１へのｈ１５Ｈ６．ｖ１の結合の結果を示す。各分析から決定されたＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図9D】ストレプトアビジンで捕捉されたビオチン化ヒトまたはマウスＨｔｒＡ１へのｍ１５Ｈ６またはｈ１５Ｈ６．ｖ１の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析の結果を示すグラフである。単一サイクル動態分析を用いた。これらのグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。ｈｕＨｔｒＡ１へのｈ１５Ｈ６．ｖ１の結合の結果を示す。各分析から決定されたＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図10A】マウス（図１０Ａ）またはヒト（図１０Ｂ）ＨｔｒＡ１への示されるｈ１５Ｈ６．ｖ１ Ｆａｂ変異形の結合についてのファージ競合ＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフである。これらのグラフは、ＨｔｒＡ１濃度（ｎＭ）の関数としての結合ファージ（ＯＤ_{４５０ｎｍ}）を示す。

【図10B】マウス（図１０Ａ）またはヒト（図１０Ｂ）ＨｔｒＡ１への示されるｈ１５Ｈ６．ｖ１ Ｆａｂ変異形の結合についてのファージ競合ＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフである。これらのグラフは、ＨｔｒＡ１濃度（ｎＭ）の関数としての結合ファージ（ＯＤ_{４５０ｎｍ}）を示す。

【図11A】マウス（図１１Ａ）またはヒト（図１１Ｂ）ＨｔｒＡ１への抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２及びＨＶＲ−Ｌ３ ＬＣ−Ｗ９１Ｌ及びＬＣ−Ｗ９１Ｙ変異形の結合を比較するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示すグラフである。使用された抗体は、Ｆａｂ形式であった。各分析から決定されたＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図11B】マウス（図１１Ａ）またはヒト（図１１Ｂ）ＨｔｒＡ１への抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２及びＨＶＲ−Ｌ３ ＬＣ−Ｗ９１Ｌ及びＬＣ−Ｗ９１Ｙ変異形の結合を比較するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示すグラフである。使用された抗体は、Ｆａｂ形式であった。各分析から決定されたＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図12A】ｈｕＨｔｒＡ１への抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２（親）及びＶＬ９４位の示される変異形（すなわち、ＬＣ−Ｎ９４Ａ ＬＣ−Ｐ９５（ＡＰ）、ＬＣ−Ｎ９４Ｅ ＬＣ−Ｐ９５（ＥＰ）、ＬＣ−Ｎ９４Ｑ ＬＣ−Ｐ９５（ＱＰ）、及びＬＣ−Ｎ９４Ｓ ＬＣ−Ｐ９５（ＳＰ））の結合を比較するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示すグラフである。使用された抗体は、Ｆａｂ形式であった。このグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。

【図12B】図１２Ａに示されるＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を要約する表である。

【図13A】ｈｕＨｔｒＡ１への抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２（親）ならびにＶＨ５５位及び／または５６位の示される変異形（すなわち、ＨＣ−Ｄ５５Ａ ＨＣ−Ｇ５６（ＡＧ）、ＨＣ−Ｄ５５Ｅ ＨＣ−Ｇ５６（ＥＧ）、ＨＣ−Ｄ５５Ｓ ＨＣ−Ｇ５６（ＳＧ）、及びＨＣ−Ｄ５５ ＨＣ−Ｇ５６Ａ（ＤＡ））の結合を比較するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示すグラフである。使用された抗体は、Ｆａｂ形式であった。このグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。

【図13B】図１３Ａに示されるＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を要約する表である。

【図14A】ｈｕＨｔｒＡ１への抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２（「親」）ならびにＶＬ９４位及びＶＨ５５位及び／または５６位の示される組み合わせ変異形の結合を比較するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示すグラフである。ＡＰ＿ＥＧ：ＬＣ−Ｎ９４Ａ ＬＣ−Ｐ９５ ＨＣ−Ｄ５５Ｅ ＨＣ−Ｇ５６（「ｈ１５Ｈ６．ｖ２．ＡＰＥＧ」及び「ｈ１５Ｈ６．ｖ３」とも称される）。ＥＰ＿ＥＧ：ＬＣ−Ｎ９４Ｅ ＬＣ−Ｐ９５ ＨＣ−Ｄ５５Ｅ ＨＣ−Ｇ５６。ＱＰ＿ＥＧ：ＬＣ−Ｎ９４Ｑ ＬＣ−Ｐ９５ ＨＣ−Ｄ５５Ｅ ＨＣ−Ｇ５６。ＳＰ＿ＥＧ：ＬＣ−Ｎ９４Ｓ ＬＣ−Ｐ９５ ＨＣ−Ｄ５５Ｅ ＨＣ−Ｇ５６。

【図14B】図１４Ａに示されるＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を要約する表である。

【図14C】ＨｔｒＡ１の活性を阻害するｈ１５Ｈ６．ｖ２ ＩｇＧ、ｈ１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ、ならびにＶＬ９４位及びＶＨ５５位及び／または５６位の示される組み合わせ変異形の能力を試験するＦＲＥＴに基づく遮断アッセイの結果を示すグラフである。このグラフは、ｌｏｇ抗体濃度（Ｍ）の関数として最大活性パーセントをプロットする。

【図14D】図１４Ｃの試験された抗体クローンの各々のＩＣ５０値を示す表である。

【図15A】ヒトコンセンサスκ４配列（図１５Ａ）またはＶＨ３配列（図１５Ｂ）と比較した、抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｍ１９Ｂ１２及びｈ１９Ｂ１２．ｖ１のＶＬ（図１５Ａ）及びＶＨ（図１５Ｂ）のアミノ酸配列の配列アライメントを示す。ＨＶＲ配列を、抗体クローンの各々の示される囲みで区切っている。Ｋａｂａｔ定義に従うＨＶＲ配列には下線が引いてある。影付き囲み内の白色の文字で示される残基は、ヒトコンセンサスＶＨ１配列と抗ＨｔｒＡ１抗体クローンとの間で異なる残基を示す。

【図15B】ヒトコンセンサスκ４配列（図１５Ａ）またはＶＨ３配列（図１５Ｂ）と比較した、抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｍ１９Ｂ１２及びｈ１９Ｂ１２．ｖ１のＶＬ（図１５Ａ）及びＶＨ（図１５Ｂ）のアミノ酸配列の配列アライメントを示す。ＨＶＲ配列を、抗体クローンの各々の示される囲みで区切っている。Ｋａｂａｔ定義に従うＨＶＲ配列には下線が引いてある。影付き囲み内の白色の文字で示される残基は、ヒトコンセンサスＶＨ１配列と抗ＨｔｒＡ１抗体クローンとの間で異なる残基を示す。

【図16A】ヒトまたはマウスＨｔｒＡ１への抗体クローンｍ１９Ｂ１２またはｈ１９Ｂ１２．ｖ１の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示すグラフである。単一サイクル動態分析を用いた。これらのグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。ｈｕＨｔｒＡ１へのｍ１９Ｂ１２ Ｆａｂの結合の結果を示す。各分析のＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図16B】ヒトまたはマウスＨｔｒＡ１への抗体クローンｍ１９Ｂ１２またはｈ１９Ｂ１２．ｖ１の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示すグラフである。単一サイクル動態分析を用いた。これらのグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。ｍｕＨｔｒＡ１へのｍ１９Ｂ１２ Ｆａｂの結合の結果を示す。各分析のＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図16C】ヒトまたはマウスＨｔｒＡ１への抗体クローンｍ１９Ｂ１２またはｈ１９Ｂ１２．ｖ１の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示すグラフである。単一サイクル動態分析を用いた。これらのグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。ｈｕＨｔｒＡ１へのｈ１９Ｂ１２．ｖ１ Ｆａｂの結合の結果を示す。各分析のＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図16D】ヒトまたはマウスＨｔｒＡ１への抗体クローンｍ１９Ｂ１２またはｈ１９Ｂ１２．ｖ１の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示すグラフである。単一サイクル動態分析を用いた。これらのグラフは、時間（秒）の関数としての応答単位（ＲＵ）を示す。ｈｕＨｔｒＡ１へのｈ１９Ｂ１２．ｖ１ Ｆａｂの結合の結果を示す。各分析のＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、各グラフ内のテキストとして示す。

【図17】親和性成熟についてのｈ１５Ｈ６．ｖ２のＨＣ及びＬＣ ＨＶＲのＮＮＫディープスキャニング変異誘発のために使用されるファージパニング戦略を概説する概略図である。

【図18A】選別された試料における所与の位置での所与の変異の頻度を選別されていない試料における全く同じ変異の頻度と分けることによって計算された示されるＶＨ（図１８Ａ）またはＶＬ（図１８Ｂ）のＨＶＲ位置での変異の濃縮比のｌｏｇ２のヒートマップを示す。例示の変異の濃縮比をヒートマップに示す。

【図18B】選別された試料における所与の位置での所与の変異の頻度を選別されていない試料における全く同じ変異の頻度と分けることによって計算された示されるＶＨ（図１８Ａ）またはＶＬ（図１８Ｂ）のＨＶＲ位置での変異の濃縮比のｌｏｇ２のヒートマップを示す。例示の変異の濃縮比をヒートマップに示す。

【図19】ｈ１５ｖ６．ｖ２のＶＨ及びＶＬのＮＮＫライブラリ及び／またはランダム化ソフトライブラリ由来の選別されていない試料と比較して選別された試料において濃縮されたと特定される変異を示す表である。

【図20】示される親和性成熟Ｆａｂ抗体変異形クローンの結合のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析の結果を示す表である。この分析から得られた各親和性成熟抗体変異形クローンのＫ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、及びＫＤを、ｈ１５Ｈ６．ｖ２及びｈ１５Ｈ６．ｖ２．ＡＰＥＧ（ｈ１５Ｈ６．ｖ３とも称される）と比較して示す。

【図21A】親和性成熟変異形抗ＨｔｒＡ１抗体クローンのＶＬ（図２１Ａ）及びＶＨ（図２１Ｂ）のアミノ酸配列の配列アライメントを示す。

【図21B】親和性成熟変異形抗ＨｔｒＡ１抗体クローンのＶＬ（図２１Ａ）及びＶＨ（図２１Ｂ）のアミノ酸配列の配列アライメントを示す。

【図22A】ＦＲＥＴに基づくＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイにおいて評定されたＨｔｒＡ１の活性を阻害するための示される親和性成熟変異形抗ＨｔｒＡ１ Ｆａｂ抗体クローンの結果を要約する表である。この表は、３つの独立した実験、ならびに平均及び標準偏差（ＳｔＤｅｖ）からの結果を示す。これらの実験は、速度（ＲＦＵ／秒）分析を用いた。

【図22B】図２２Ａに示される組換えＨｔｒＡ１を使用したＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイの結果からの例示のプロットを示すグラフである。アッセイ条件は、４００ｐＭのＨｔｒＡ１、及び２．５μＭの基質を含んだ。緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．３であった。これらのデータは、図２２Ａにおける３つの独立した実験の２回目の繰り返しからのものである。

【図23A】ＲＦＵ／秒の速度アプローチを使用した示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイからの結果を示すグラフである。これらのグラフは、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（図２３Ａ）、陽性対照である抗ＨｔｒＡ１抗体（ＹＷ５０５．９４Ａ ＩｇＧ、例えば、ＷＯ２０１３／０５５９９８を参照のこと）（図２３Ｂ）、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ（図２３Ｃ）、及び１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ（図２３Ｄ）の抗体濃度（ｎＭ）の関数としての対照（ＲＦＵ／秒）の百分率を示す。各グラフの隣の表は、各分析からのＩＣ５０、Ｙ範囲、勾配係数、及びバックグラウンドを示す。

【図23B】ＲＦＵ／秒の速度アプローチを使用した示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイからの結果を示すグラフである。これらのグラフは、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（図２３Ａ）、陽性対照である抗ＨｔｒＡ１抗体（ＹＷ５０５．９４Ａ ＩｇＧ、例えば、ＷＯ２０１３／０５５９９８を参照のこと）（図２３Ｂ）、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ（図２３Ｃ）、及び１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ（図２３Ｄ）の抗体濃度（ｎＭ）の関数としての対照（ＲＦＵ／秒）の百分率を示す。各グラフの隣の表は、各分析からのＩＣ５０、Ｙ範囲、勾配係数、及びバックグラウンドを示す。

【図23C】ＲＦＵ／秒の速度アプローチを使用した示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイからの結果を示すグラフである。これらのグラフは、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（図２３Ａ）、陽性対照である抗ＨｔｒＡ１抗体（ＹＷ５０５．９４Ａ ＩｇＧ、例えば、ＷＯ２０１３／０５５９９８を参照のこと）（図２３Ｂ）、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ（図２３Ｃ）、及び１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ（図２３Ｄ）の抗体濃度（ｎＭ）の関数としての対照（ＲＦＵ／秒）の百分率を示す。各グラフの隣の表は、各分析からのＩＣ５０、Ｙ範囲、勾配係数、及びバックグラウンドを示す。

【図23D】ＲＦＵ／秒の速度アプローチを使用した示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイからの結果を示すグラフである。これらのグラフは、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（図２３Ａ）、陽性対照である抗ＨｔｒＡ１抗体（ＹＷ５０５．９４Ａ ＩｇＧ、例えば、ＷＯ２０１３／０５５９９８を参照のこと）（図２３Ｂ）、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ（図２３Ｃ）、及び１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ（図２３Ｄ）の抗体濃度（ｎＭ）の関数としての対照（ＲＦＵ／秒）の百分率を示す。各グラフの隣の表は、各分析からのＩＣ５０、Ｙ範囲、勾配係数、及びバックグラウンドを示す。

【図23E】終点（ＲＦＵ）アプローチを使用して分析された示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイからの結果を示すグラフである。これらのグラフは、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＩｇＧ Ｍａｂ（図２３Ｅ）、陽性対照である抗ＨｔｒＡ１抗体（ＹＷ５０５．９４Ａ ＩｇＧ）（図２３Ｆ）、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ（図２３Ｇ）、及び１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ（図２３Ｈ）の抗体濃度（ｎＭ）の関数としての対照（ＲＦＵ／秒）の百分率を示す。各グラフの隣の表は、各分析からのＩＣ５０、Ｙ範囲、勾配係数、及びバックグラウンドを示す。

【図23F】終点（ＲＦＵ）アプローチを使用して分析された示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイからの結果を示すグラフである。これらのグラフは、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＩｇＧ Ｍａｂ（図２３Ｅ）、陽性対照である抗ＨｔｒＡ１抗体（ＹＷ５０５．９４Ａ ＩｇＧ）（図２３Ｆ）、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ（図２３Ｇ）、及び１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ（図２３Ｈ）の抗体濃度（ｎＭ）の関数としての対照（ＲＦＵ／秒）の百分率を示す。各グラフの隣の表は、各分析からのＩＣ５０、Ｙ範囲、勾配係数、及びバックグラウンドを示す。

【図23G】終点（ＲＦＵ）アプローチを使用して分析された示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイからの結果を示すグラフである。これらのグラフは、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＩｇＧ Ｍａｂ（図２３Ｅ）、陽性対照である抗ＨｔｒＡ１抗体（ＹＷ５０５．９４Ａ ＩｇＧ）（図２３Ｆ）、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ（図２３Ｇ）、及び１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ（図２３Ｈ）の抗体濃度（ｎＭ）の関数としての対照（ＲＦＵ／秒）の百分率を示す。各グラフの隣の表は、各分析からのＩＣ５０、Ｙ範囲、勾配係数、及びバックグラウンドを示す。

【図23H】終点（ＲＦＵ）アプローチを使用して分析された示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイからの結果を示すグラフである。これらのグラフは、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＩｇＧ Ｍａｂ（図２３Ｅ）、陽性対照である抗ＨｔｒＡ１抗体（ＹＷ５０５．９４Ａ ＩｇＧ）（図２３Ｆ）、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ（図２３Ｇ）、及び１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ（図２３Ｈ）の抗体濃度（ｎＭ）の関数としての対照（ＲＦＵ／秒）の百分率を示す。各グラフの隣の表は、各分析からのＩＣ５０、Ｙ範囲、勾配係数、及びバックグラウンドを示す。

【図24A】３つの独立した実験の第１の組からの示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＩＣ５０結果（図２４Ａ）及びＩＣ９０結果（図２４Ｂ）を示す表である。ＩＣ５０値を、４パラメータフィットを使用して決定した。ＩＣ９０値を、これらのフィットのＩＣ５０値及び勾配から決定した。実験Ｉは、図２３Ａ〜２３Ｆに示されるデータに対応する。ＣＶ％、変動係数。このデータを、速度（ＲＦＵ／秒）アプローチを使用して分析した。

【図24B】３つの独立した実験の第１の組からの示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＩＣ５０結果（図２４Ａ）及びＩＣ９０結果（図２４Ｂ）を示す表である。ＩＣ５０値を、４パラメータフィットを使用して決定した。ＩＣ９０値を、これらのフィットのＩＣ５０値及び勾配から決定した。実験Ｉは、図２３Ａ〜２３Ｆに示されるデータに対応する。ＣＶ％、変動係数。このデータを、速度（ＲＦＵ／秒）アプローチを使用して分析した。

【図25A】３つの独立した実験の第２の組からの示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＩＣ５０結果（図２５Ａ）及びＩＣ９０結果（図２５Ｂ）を示す表である。ＩＣ５０値を、４パラメータフィットを使用して決定した。ＩＣ９０値を、これらのフィットのＩＣ５０値及び勾配から決定した。このデータを、速度（ＲＦＵ／秒）アプローチまたは終点（ＲＦＵ）アプローチのいずれかを使用して分析した。

【図25B】３つの独立した実験の第２の組からの示されるｈ１５Ｈ６抗体変異形形式のＩＣ５０結果（図２５Ａ）及びＩＣ９０結果（図２５Ｂ）を示す表である。ＩＣ５０値を、４パラメータフィットを使用して決定した。ＩＣ９０値を、これらのフィットのＩＣ５０値及び勾配から決定した。このデータを、速度（ＲＦＵ／秒）アプローチまたは終点（ＲＦＵ）アプローチのいずれかを使用して分析した。

【図26A】インタクトなα−カゼイン滴定曲線を示すグラフである。実験的濃度を、理論的スパイクイン濃度（μｇ／ｍＬ）の関数としてプロットする。相関係数（Ｒ^２）は、０．９９９であった。

【図26B】質量分析に基づくＨｔｒＡ１活性アッセイの結果を示すグラフである。Ｈｔｒａ１−ＰＤ活性を阻害するＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３（ｈ１５Ｈ６．ｖ４）の能力を、実施例３のＧ節に記載されるように評定した。小分子阻害剤ｕｃｆ−１０１は、陽性対照の役割を果たした。

【図27A】２つの独立した内因性ＨｔｒＡ１活性アッセイ、実験Ｉ（図２７Ａ）及び実験ＩＩ（図２７Ｂ）の結果を示すグラフである。各抗体Ｆａｂについて、番号１及び番号２は、初期希釈を別々に行った同じ抗体の別個の希釈系列を示す。これらの２つの希釈系列を、同じ調製物由来の他の試薬を有する同じプレート上で泳動させた。

【図27B】２つの独立した内因性ＨｔｒＡ１活性アッセイ、実験Ｉ（図２７Ａ）及び実験ＩＩ（図２７Ｂ）の結果を示すグラフである。各抗体Ｆａｂについて、番号１及び番号２は、初期希釈を別々に行った同じ抗体の別個の希釈系列を示す。これらの２つの希釈系列を、同じ調製物由来の他の試薬を有する同じプレート上で泳動させた。

【図27C】図２７Ａ及び２７Ｂに示される内因性ＨｔｒＡ１活性アッセイの結果を要約する表である。

【図28】示されるｈ１５Ｈ６．ｖ２ Ｆａｂ変異形及び誘導体の動態結合特性及び阻害活性を要約する表である。ＹＷ５０５．９４ａ．２８（例えば、ＷＯ２０１３／０５５９９８を参照のこと）は、陽性対照の役割を果たした。ｈ１５Ｈ６ Ｆａｂ変異形及び誘導体は全て、ＹＷ５０５．９４ａ．２８ Ｆａｂと比較して親和性の改善及び効力の改善を示し、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂは、この抗体と比較しておよそ３０倍の親和性改善を示した。

【図29A】ヒトＨｔｒＡ１のアミノ酸配列を示す。成熟配列を大文字で示しており、プロテアーゼドメインには下線が引いてあり、残基Ｎ２２４及びＫ２４８は影付きになっている。

【図29B】マウスＨｔｒＡ１のアミノ酸配列を示す。成熟配列を大文字で示しており、プロテアーゼドメインには下線が引いてある。

【図30】参照抗Ｄ因子抗体（「野生型」）及びその選択変異形の軽鎖及び重鎖可変ドメインのアライメントを示す。可変ドメイン内のＨＶＲには下線が引いてある。これらの変異形における残基置換を太字で示している。

【図31A】ＨｔｒＡ１へのＹＷ５０５．９４ Ｆａｂ（ＷＯ２０１３／０５５９９８に記載のもの）の結合を示す。図３１Ａに指定されるアミノ酸がアラニンで置き換えられると、変異タンパク質に対するＹＷ５０５．９４ Ｆａｂの結合親和性が低減される。図３１Ｂに示される構造を、Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４７２（２）：１６９−８１に記載の電子顕微鏡法を使用して生成した。円は、ＨｔｒＡ１タンパク質上のＹＷ５０５．９４ Ｆａｂのエピトープを示す。ＹＷ５０５．９４ Ｆａｂは、ＨｔｒＡ１タンパク質のループ「Ｂ」及び「Ｃ」に結合する。

【図31B】ＨｔｒＡ１へのＹＷ５０５．９４ Ｆａｂ（ＷＯ２０１３／０５５９９８に記載のもの）の結合を示す。図３１Ａに指定されるアミノ酸がアラニンで置き換えられると、変異タンパク質に対するＹＷ５０５．９４ Ｆａｂの結合親和性が低減される。図３１Ｂに示される構造を、Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４７２（２）：１６９−８１に記載の電子顕微鏡法を使用して生成した。円は、ＨｔｒＡ１タンパク質上のＹＷ５０５．９４ Ｆａｂのエピトープを示す。ＹＷ５０５．９４ Ｆａｂは、ＨｔｒＡ１タンパク質のループ「Ｂ」及び「Ｃ」に結合する。

【図32A】ＨｔｒＡ１への１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂの結合を示し、１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂにより結合されるＨｔｒＡ１エピトープがＹＷ５０５．９４ Ｆａｂにより結合されるエピトープとははっきりと異なることを示す。図３２Ａは、Ｘ線結晶学により決定される、ＨｔｒＡ１タンパク質上の１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂとそのエピトープとの間の相互作用を示す。１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂは、ＨｔｒＡ１タンパク質のＬＡループに結合する（例えば、Ｇｌａｚａ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（６）：ｅ０１３１１４２を参照のこと）。図３２Ｂに示される構造を、電子顕微鏡法を使用して生成した。円は、ＨｔｒＡ１タンパク質上の１５Ｈ６Ｖ．４ Ｆａｂエピトープを示す。

【図32B】ＨｔｒＡ１への１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂの結合を示し、１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂにより結合されるＨｔｒＡ１エピトープがＹＷ５０５．９４ Ｆａｂにより結合されるエピトープとははっきりと異なることを示す。図３２Ａは、Ｘ線結晶学により決定される、ＨｔｒＡ１タンパク質上の１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂとそのエピトープとの間の相互作用を示す。１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂは、ＨｔｒＡ１タンパク質のＬＡループに結合する（例えば、Ｇｌａｚａ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（６）：ｅ０１３１１４２を参照のこと）。図３２Ｂに示される構造を、電子顕微鏡法を使用して生成した。円は、ＨｔｒＡ１タンパク質上の１５Ｈ６Ｖ．４ Ｆａｂエピトープを示す。

【発明を実施するための形態】

【0060】

Ｉ．定義
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。

【0061】

本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはアミノ酸配列変化を含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。

【0062】

本発明の抗体との関連での「活性の」または「活性」または「生物学的活性」は、例えば、インビトロ及び／またはインビボで、その標的の生物学的活性に拮抗する（それを部分的または完全に阻害する）能力である。ある抗体の生物学的活性の一例は、その標的に関連する障害の状態、例えば、病状の測定可能な改善を達成する能力である。例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体の場合、障害は、ＨｔｒＡ１関連障害、例えば、ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮）等であり得る。抗ＨｔｒＡ１抗体の活性は、関連動物モデルを使用した、結合アッセイ、活性アッセイ（例えば、ＦＲＥＴに基づく活性アッセイ（例えば、Ｈ２−Ｏｐｔ基質を使用して）、または質量分析に基づく活性アッセイ）を含むインビトロ試験もしくはインビボ試験、またはヒト臨床試験において決定され得る。別の例では、抗Ｄ因子抗体（例えば、抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子抗体）の場合、障害は、補体関連障害、例えば、補体関連眼障害等であり得る。抗Ｄ因子抗体の活性は、関連動物モデルを使用した、結合アッセイ、代替経路溶血アッセイ（例えば、代替経路補体活性または活性化の阻害を測定するアッセイ）を含むインビトロ試験もしくはインビボ試験、またはヒト臨床試験において決定され得る。

【0063】

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」とは、結合対のメンバー間（例えば、抗体と抗原との間）の１：１の相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）で表され得る。親和性は、本明細書に記載の方法を含む当該技術分野で既知の一般的な方法により測定され得る。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示の実施形態が、以下に記載されている。

【0064】

「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）及び／またはフレームワーク領域（ＦＲ）に１つ以上の改変を有し、かかる改変により抗体の抗原に対する親和性の改善がもたらされる抗体を指す。

【0065】

「抗ＨｔｒＡ１抗体」及び「ＨｔｒＡ１に特異的に結合する抗体」という用語は、抗体がＨｔｒＡ１の標的時に診断薬及び／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＨｔｒＡ１に結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＨｔｒＡ１タンパク質への抗ＨｔｒＡ１抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定される、ＨｔｒＡ１への本抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＨｔｒＡ１に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、異なる種由来のＨｔｒＡ１間で保存されるＨｔｒＡ１のエピトープに結合する。抗ＨｔｒＡ１抗体は、例えば、本明細書または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０５５９９８号に記載の任意の抗ＨｔｒＡ１抗体であり得る。

【0066】

「抗Ｄ因子抗体」及び「Ｄ因子に特異的に結合する抗体」という用語は、抗体が、例えば、補体活性化を阻害するか、または実質的に低減するような様式で、Ｄ因子の標的時に診断薬及び／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＤ因子に結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非Ｄ因子タンパク質への抗Ｄ因子抗体の結合の程度は、例えば、ＲＩＡにより測定される、Ｄ因子への本抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、Ｄ因子に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、異なる種由来のＤ因子間で保存されるＤ因子のエピトープに結合する。抗Ｄ因子抗体は、本明細書に記載されており、及び／または米国特許第８，０６７，００２号、同第８，２７３，３５２号、及び同第８，２６８，３１０号、ならびに米国特許出願第１４／７００，８５３号（これらは各々、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている任意の抗Ｄ因子抗体であり得る。

【0067】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。

【0068】

「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0069】

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して表記される１つの残留「Ｆｃ」断片とが産生される。Ｆａｂ断片は、重（Ｈ）鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）とともに全軽（Ｌ）鎖、及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のペプシン処理により、単一の大きいＦ（ａｂ’）_２断片が産出され、これは、概して、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片に対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなる数個の残基を有する点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。

【0070】

本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、存在しない場合もある。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載される、ＥＵ指標とも称されるＥＵ番号付けシステムに従う。

【0071】

「Ｆｖ」は、密接な非共有結合にある１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、かつ抗原結合特異性を抗体に与える６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各３つループ）が生じる。しかしながら、多くの場合、全結合部位よりも低い親和性であるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＨＶＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。

【0072】

「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも短縮される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に結合されるＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。

【0073】

「ダイアボディ」という用語は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間の対合が達成され、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にｓＦｖ断片（前段落を参照のこと）を短いリンカー（約５〜１０個の残基）で構築することによって調製された小さい抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８，１９９３により完全に記載されている。

【0074】

「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体とは、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減する抗体である。ある特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。

【0075】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、参照抗体と比較して抗原の重複する組のアミノ酸残基と接触するか、または競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体を指す。抗原と接触する抗体アミノ酸残基は、例えば、抗原と複合した抗体の結晶構造を決定することによって、または水素／重水素交換を行うことによって決定され得る。いくつかの実施形態では、５Å以内の抗原の抗体の残基が抗原と接触するとみなされる。いくつかの実施形態では、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する。例示の競合アッセイが本明細書に提供される。

【0076】

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。

【0077】

抗体の「クラス」とは、その重鎖が持つ定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。５つの主なクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0078】

「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、及びＢ細胞活性化が挙げられる。

【0079】

「フレームワーク」または「フレームワーク領域」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。

【0080】

「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指すために本明細書で同義に使用される。

【0081】

「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１の２１６〜２３８（ＥＵ番号付け）または２２６〜２５１（Ｋａｂａｔ番号付け）からの伸長と定義される。ヒンジは、３つのはっきりと異なる領域、上部、中央（例えば、コア）、及び下部ヒンジにさらに分類され得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域は、一般に、以下のように定義される。

【0082】

上部ヒンジは、配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１５７）を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、上部ヒンジは、２１６〜２２５位（ＥＵ番号付け）または２２６〜２３８位（Ｋａｂａｔ番号付け）にそのアミノ酸を含む。

【0083】

中央（例えば、コア）ヒンジは、配列ＣＰＰＣ（配列番号１２２）を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、コアヒンジは、２２６〜２２９位（ＥＵ番号付け）または２３９〜２４２位（Ｋａｂａｔ番号付け）にそのアミノ酸を含む。

【0084】

下部ヒンジは、配列ＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号１５８）を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、下部ヒンジは、２３０〜２３８位（ＥＵ番号付け）または２４３〜２５１位（Ｋａｂａｔ番号付け）にそのアミノ酸を含む。

【0085】

「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持つ抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

【0086】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択時に最も一般に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からである。一般に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３にあるような下位群である。一実施形態では、ＶＬの場合、下位群は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）にあるような下位群カッパＩである。一実施形態では、ＶＨの場合、下位群は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）にあるような下位群ＩＩＩである。

【0087】

非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置き換えられている。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。

【0088】

「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントが配列の点で、抗体間で広範囲にわたって異なるという事実を指す。可変または「Ｖ」ドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの長さにわたって均等に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各９〜１２アミノ酸長の「超可変領域」と呼ばれる極度の可変性を有するより短い領域によって分離される１５〜３０個のアミノ酸を有するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸長からなる。「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、例えば、ＶＬでは残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７（Ｌ３）、ＶＨでは残基約２６〜３５（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）（一実施形態では、Ｈ１は、残基約３１〜３５）からのアミノ酸残基、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、及び／または及び／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬでは残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）、ＶＨでは２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、ベータシート構造の一部を結合し、ある場合には、その一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって結合された主にベータシート配置をとる４つのＦＲを含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲにより近接近して一緒に保持され、他の鎖由来の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）に以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に出現する。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への関与等の様々なエフェクター機能を呈する。

【0089】

「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番号付け」、「Ｋａｂａｔアミノ酸残基」、または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という用語、及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って、残基５２ａ）、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って、残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準の」Ｋａｂａｔにより番号付けられた配列との抗体の配列の相同性領域でのアライメントによって所与の抗体について決定され得る。

【0090】

Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖残基１〜１０７及び重鎖残基１〜１１３）に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵ指標」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）で報告されているＥＵ指標）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標」とは、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書に別途述べられない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号への言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。本明細書に別途述べられない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号への言及は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する（ＥＵ番号付けについては、例えば、米国仮出願第６０／６４０，３２３号の図を参照のこと）。

【0091】

別途示されない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）に従って本明細書で番号付けされる。

【0092】

「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性薬剤を含むが、これに限定されない１つ以上の異種分子（複数可）にコンジュゲートされる抗体である。

【0093】

「単離された抗体」という用語は、本明細書に開示される様々な抗体を説明するために使用されるとき、抗体が発現された細胞または細胞培養物から特定され、分離及び／または回収された抗体を意味する。その天然環境の混入成分は、典型的にはポリペプチドの診断的または治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）アプローチにより決定される、９５％または９９％を超える純度まで精製される。抗体の純度の評定方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。好ましい実施形態では、抗体は、（１）スピニングカップシークエネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用してＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して非還元条件または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで精製される。単離された抗体としては、組換え細胞内のインサイツの抗体が挙げられるが、これは、ポリペプチド天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。

【0094】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体が同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能な変異形抗体を除き、かかる変異形は、一般に、少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれの特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物の利用方法を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示の方法が本明細書に記載されている。

【0095】

「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、特に、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体を網羅し、ＶＨ−ＶＬ単位が多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープまたは異なる生物学的分子上の各エピトープに結合することができる）。かかる多重特異性抗体としては、全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、及びトリアボディ、共有結合的または非共有結合的に結合された抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。「多重エピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「二特異性」または「二重特異性」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つの異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。しかしながら、二重特異性抗体とは対照的に、二特異性抗体は、アミノ酸配列が同一の２つの抗原結合アームを有し、各Ｆａｂアームは、２つの抗原を認識することができる。二特異性により、抗体が単一のＦａｂまたはＩｇＧ分子として高親和性で２つの異なる抗原と相互作用することが可能になる。一実施形態によれば、ＩｇＧ１形態の多重特異性抗体は、５μＭ〜０．００１ｐＭ、３μＭ〜０．００１ｐＭ、１μＭ〜０．００１ｐＭ、０．５μＭ〜０．００１ｐＭ、または０．１μＭ〜０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合する。「単一特異性」とは、１つのエピトープにのみ結合する能力を指す。

【0096】

「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型のうちの一方に割り当てられ得る。

【0097】

抗体の標的分子への結合に関して、「特異的結合」または特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドもしくはエピトープ「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、非特異的相互作用とはある程度異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と同様の対照分子、例えば、過剰な非標識標的との競合によって決定され得る。この場合、特異的結合は、標識された標的のプローブへの結合が過剰な標識されていない標的によって競合的に阻害される場合に示される。本明細書で使用される「特異的結合」または特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープ「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、例えば、１０^−４Ｍ以下、あるいは１０^−５Ｍ以下、あるいは１０^−６Ｍ以下、あるいは１０^−７Ｍ以下、あるいは１０^−８Ｍ以下、あるいは１０^−９Ｍ以下、あるいは１０^−１０Ｍ以下、あるいは１０^−１１Ｍ以下、あるいは１０^−１２Ｍ以下の標的に対するＫＤ、または１０^−４Ｍ〜１０^−６Ｍまたは１０^−６Ｍ〜１０^−１０Ｍまたは１０^−７Ｍ〜１０^−９Ｍの範囲のＫＤで分子によって提示され得る。当業者によって理解されるように、親和性及びＫＤ値は、逆相関する。抗原に対する高親和性は、低ＫＤ値によって測定される。一実施形態では、「特異的結合」という用語は、ある分子がいずれの他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく特定のポリペプチド上の特定のポリペプチドまたはエピトープに結合する結合を指す。

【0098】

「抗体をコードする核酸」とは、抗体重鎖及び軽鎖（またはその断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター内の核酸分子（複数可）を含み、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。いくつかの実施形態では、核酸は、抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする。他の実施形態では、核酸は、抗Ｄ因子抗体（例えば、抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子抗体）をコードし得る。

【0099】

「ベクター」という用語は、本明細書で使用されるとき、それが結合している別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に結合している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。

【0100】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、同義に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代数にかかわらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。

【0101】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一の候補配列内のアミノ酸残基の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野の技術の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大アライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアライメントに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が生み出したものであり、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）にユーザ文書とともに申請されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変動しない。

【0102】

ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：分数Ｘ／Ｙの１００倍（式中、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によってそのプログラムのＡとＢのアライメントにおいて完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％がＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％に等しくないことが理解される。別途具体的に述べられない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。

【0103】

抗体を含むタンパク質は、それがインタクトな立体配座構造及び生物学的活性を本質的に保持する場合、「安定している」と考えられる。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技法が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０に概説されている。「改善された安定性」を有する抗体変異形とは、出発参照抗体と比較してより安定した抗体変異形を指す。好ましくは、改善された安定性を有する抗体変異形は、特定のアミノ酸残基が、物理的安定性、及び／または化学的安定性、及び／または生物学的活性を改善し、及び／または天然抗体の免疫原性を低減する目的のために改変される参照（野生型）抗体の変異形である。

【0104】

「異性化」という用語は、概して、化学化合物が、その異性形態、すなわち、同じ化学組成を有するが、異なる構造または配置を有し、それ故に、一般に異なる物理的及び化学的特性を有する形態のうちのいずれかに形質転換される化学的プロセスを指す。アスパラギン酸異性化、すなわち、ポリペプチドの１つ以上のアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基（複数可）がイソアスパラギン酸残基（複数可）に形質転換されたプロセスが特に本明細書で使用される。例えば、Ｇｅｉｇｅｒｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７８５−９４，１９８７を参照されたい。

【0105】

「脱アミド化」という用語は、概して、アミド官能基が有機化合物から除去される化学反応を指す。アスパラギン脱アミド化、すなわち、ポリペプチド（例えば、抗体）の１つ以上のアスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基（複数可）がアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）に変換されたプロセス、すなわち、中性アミド側鎖が全体的な酸性特性を有する残基に変換されたプロセスが特に本明細書で使用される。例えば、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８：８−１３，１９９９を参照されたい。

【0106】

ポリペプチド分子（例えば、抗体）の「酸化」変異形は、元のポリペプチドの１つ以上のメチオニン（ＭまたはＭｅｔ）またはトリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）残基（複数可）がメチオニンの硫黄を介してスルホンまたはスルホキシドに変換されたポリペプチドである。酸化は、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）をロイシン（ＬまたはＬｅｕ）またはイソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）に変換することによって防止され得る。例えば、Ａｍｐｈｌｅｔｔｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：１−１４０，１９９６を参照されたい。

【0107】

ある特定の特定された物理的または化学的プロセス（例えば、異性化、脱アミド化、または酸化）を経る傾向があるアミノ酸残基は、異性化、脱アミド化、または酸化等の特定されたプロセスを経る傾向を有すると特定された特定のタンパク質分子内の残基を指す。それらの傾向は、多くの場合、タンパク質の一次及び／または立体配座構造内のそれらの相対位置によって決定される。例えば、Ａｓｐ−ＸＸＸモチーフ（式中、ＸＸＸは、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり得る）中の第１のＡｓｐが、同じタンパク質中のいくつかの他のＡｓｐがかかる傾向を有しない場合があるその隣接する残基の関与により、Ａｓｐ異性化を経る傾向があることが示されている。特定のタンパク質分子内のある特定のプロセスを経る傾向がある残基を特定するためのアッセイは、当該技術分野で既知である。例えば、Ｃａｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：１８９７−１９０３，１９９６を参照されたい。

【0108】

本明細書で同義に使用される「ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨｔｒＡ１）」または「ＨｔｒＡ１」という用語は、別途示されない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＨｔｒＡ１を指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＨｔｒＡ１、ならびに細胞内でのプロセシングから得られるＨｔｒＡ１の任意の形態を包含する。この用語は、ＨｔｒＡ１の天然に存在する変異形、例えば、スプライス変異形または対立遺伝子変異形も包含する。例示のヒトＨｔｒＡ１のアミノ酸配列が配列番号１２１に示される（図２９Ａを参照のこと）。ヒトＨｔｒＡ１のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ９２７４３である。例示のマウスＨｔｒＡ１のアミノ酸配列が配列番号１５５に示される（図２９Ｂを参照のこと）。マウスＨｔｒＡ１のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ９Ｒ１１８である。本明細書に記載されるように、ｈｕＨｔｒＡ１及びｍｕＨｔｒＡ１のアミノ酸残基は、それぞれ、配列番号１２１及び配列番号１５５を参照して作製される。アミノ酸位置は、一文字アミノ酸コードに続く配列番号１２１または配列番号１５５内のその位置によって特定される（図２９Ｂを参照のこと）。図２９Ａに示されるように、ヒトＨｔｒＡ１の成熟配列は、配列番号１２１の２３位のグルタミンから始まり、配列番号１２１の４８０位のプロリンで終わる配列、例えば、Ｑ２３〜Ｐ４８０を含む。ヒトＨｔｒＡ１の例示の断片としては、アミノ酸Ｄ１６１〜Ｋ３７９を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる断片が挙げられる。ＨｔｒＡ１は、プロテアーゼ、セリン、１１（ＩＧＦ結合）（ＰＲＳＳ１１）、ＡＲＭＤ７、ＨｔｒＡ、及びＩＧＦＢＰ５−プロテアーゼとしても当該技術分野で既知である。

【0109】

「ＨｔｒＡ１」という用語は、「ＨｔｒＡ１変異形」も包含し、これは、配列番号１２１または配列番号１５５等の天然配列ＨｔｒＡ１ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＨｔｒＡ１ポリペプチドを意味する。通常、ＨｔｒＡ１変異形は、天然ＨｔｒＡ１配列、例えば、配列番号１２１または配列番号１５５と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0110】

「ＨｔｒＡ１結合アンタゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、ＨｔｒＡ１生物学的活性を中和、遮断、部分的もしくは完全に阻害、抑止、低減、または妨害することができる任意の分子を含む。ＨｔｒＡ１結合アンタゴニストとしては、ＨｔｒＡ１に結合し、かつＨｔｒＡ１活性、例えば、インビトロで（例えば、Ｈ２−Ｏｐｔ基質もしくはカゼイン）またはインビボで基質を切断するＨｔｒＡ１の能力（例えば、眼障害（例えば、ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮）の病状に寄与するＨｔｒＡ１の能力）を中和、遮断、部分的もしくは完全に阻害、抑止、低減、または妨害することができる、抗ＨｔｒＡ１抗体、及びその抗体変異形、その抗原結合断片、他の結合ポリペプチド、ペプチド、及び非ペプチド小分子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0111】

「Ｄ因子」という用語は、本明細書で使用されるとき、天然配列及び変異形Ｄ因子ポリペプチドを指す。Ｄ因子は、補体Ｄ因子（ＣＦＤ）、Ｃ３前駆賦活体転換酵素、プロパージンＤ因子エステラーゼ、及びアジプシンとしても当該技術分野で既知である。

【0112】

「天然配列Ｄ因子」は、その調製様式にかかわらず自然界に由来するＤ因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。したがって、天然配列Ｄ因子は、自然界から単離され得るか、または組換え及び／または合成手段により産生され得る。成熟ヒトＤ因子タンパク質（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１９２８、配列番号１２６を参照のこと）等の成熟Ｄ因子タンパク質に加えて、「天然配列Ｄ因子」という用語は、具体的には、Ｄ因子の天然に存在する前駆体形態（例えば、タンパク分解的に切断されて活性形態を産生する不活性前タンパク質）、天然に存在する変異形形態（例えば、選択的にスプライスされた形態）、及びＤ因子の天然に存在する対立遺伝子変異形、ならびに自然界に由来するＤ因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するＤ因子分子の構造的立体配座変異形を包含する。ヒトＤ因子のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ００７４６である。より高次の霊長類及び非ヒト哺乳動物を含む非ヒト動物のＤ因子ポリペプチドが、この定義に具体的に含まれる。

【0113】

「Ｄ因子変異形」とは、天然配列ヒトＤ因子ポリペプチド（例えば、ＮＭ＿００１９２８、配列番号１２６）等の天然配列Ｄ因子ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性Ｄ因子ポリペプチドを意味する。通常、Ｄ因子変異形は、成熟ヒトアミノ酸配列（例えば、ＮＭ＿００１９２８、配列番号１２６）と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0114】

「Ｄ因子結合アンタゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、Ｄ因子生物学的活性を中和、遮断、部分的もしくは完全に阻害、抑止、低減、または妨害することができる任意の分子を含む。Ｄ因子結合アンタゴニストとしては、Ｄ因子に結合し、かつＤ因子活性、例えば、補体関連眼状態の病状に関与するＤ因子の能力を中和、遮断、部分的もしくは完全に阻害、抑止、低減、または妨害することができる、抗Ｄ因子抗体、及びその抗体変異形、その抗原結合断片、他の結合ポリペプチド、ペプチド、及び非ペプチド小分子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0115】

「ＶＥＧＦアンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用されるとき、ＶＥＧＦに結合するか、ＶＥＧＦ発現レベルを低減するか、またはＶＥＧＦ生物学的活性（１つ以上のＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦ結合、ＶＥＧＦシグナル伝達、ならびにＶＥＧＦ媒介血管新生及び内皮細胞生存または増殖を含むが、これらに限定されない）を中和、遮断、阻害、抑止、低減、または妨害することができる分子を指す。例えば、ＶＥＧＦ生物学的活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減、または妨害することができる分子は、１つ以上のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、膜結合ＶＥＧＦ受容体（ｍｂＶＥＧＦＲ）、または可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ））に結合することによってその効果を発揮することができる。ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合断片、ＶＥＧＦに特異的に結合し、それにより１つ以上の受容体へのその結合を隔離する受容体分子及び誘導体、融合タンパク質（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ））、及びＶＥＧＦ_１２１−ゲロニン（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）が、本発明の方法で有用なＶＥＧＦアンタゴニストとして含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニスト変異形、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１つの断片に相補的なアンチセンス核酸塩基オリゴマー、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１つの断片に相補的な小分子ＲＮＡ、ＶＥＧＦを標的とするリボザイム、ＶＥＧＦに対するペプチボディ、及びＶＥＧＦアプタマーも含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦＲに結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦＲ抗体、及びその抗原結合断片、ならびにＶＥＧＦＲに結合し、それによりＶＥＧＦ生物学的活性（例えば、ＶＥＧＦシグナル伝達）を遮断、阻害、抑止、低減、または妨害する誘導体、または融合タンパク質も含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲに結合し、かつＶＥＧＦ生物学的活性を遮断、阻害、抑止、低減、または妨害することができる非ペプチド小分子も含まれる。したがって、「ＶＥＧＦ活性」という用語は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ媒介生物学的活性を具体的に含む。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベルまたは生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上低減または阻害する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによって阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ（８−１０９）、ＶＥＧＦ（１−１０９）、またはＶＥＧＦ_１６５である。

【0116】

本明細書で使用されるとき、ＶＥＧＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦＲ２抗体及び関連分子（例えば、ラムシルマブ、タニビルマブ、アフリベルセプト）、抗ＶＥＧＦＲ１抗体及び関連分子（例えば、イクルクマブ、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ、ＥＹＬＥＡ（登録商標））、及びジブ−アフリベルセプト（ｚｉｖ−ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標）））、二重特異性ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＭＰ−０２５０、バヌシズマブ（ＶＥＧＦ−ＡＮＧ２）、及びＵＳ２００１／０２３６３８８に開示される二重特異性抗体）、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ１、及び抗ＶＥＧＦＲ２アームのうちの２つの組み合わせを含む二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、セバシズマブ、及びラニビズマブ）、及び非ペプチド小分子ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、パゾパニブ、アキシチニブ、バンデタニブ、スチバーガ、カボザンチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、オランチニブ、テラチニブ、ドビチニグ、セジラニブ、モテサニブ、スルファチニブ、アパチニブ、フォレチニブ、ファミチニブ、及びチボザニブ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0117】

「抗ＶＥＧＦ抗体」、「ＶＥＧＦに結合する抗体」、及び「ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体」という用語は、抗体がＶＥＧＦの標的時に診断薬及び／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＶＥＧＦタンパク質への抗ＶＥＧＦ抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定される、ＶＥＧＦへの本抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、異なる種由来のＶＥＧＦ間で保存されるＶＥＧＦのエピトープに結合する。

【0118】

ある特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患または状態を標的とし、かつそれを妨害する際に治療薬として使用され得る。また、本抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイに供され得る。かかるアッセイは、当該技術分野で既知であり、抗体の標的抗原及び意図される用途に依存する。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ、腫瘍細胞成長阻害アッセイ（例えば、ＷＯ８９／０６６９２に記載のもの）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び補体媒介細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）、ならびにアゴニスト活性または造血アッセイ（ＷＯ９５／２７０６２を参照のこと）が挙げられる。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、ＶＥＧＦ−ＢまたはＶＥＧＦ−Ｃ等の他のＶＥＧＦ相同体にも、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ、またはｂＦＧＦ等の他の成長因子にも結合しない。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ １０７０９によって産生されたモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ（ＢＶ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））として既知の抗体を含むが、これらに限定されない、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９に従って生成された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。

【0119】

「ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）」または「ｒｈｕＦａｂ Ｖ２」としても既知の抗ＶＥＧＦ抗体「ラニビズマブ」は、ヒト化親和性成熟抗ヒトＶＥＧＦ Ｆａｂ断片である。ラニビズマブは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現ベクターでの標準の組換え技術方法及び細菌発酵によって産生される。ラニビズマブはグリコシル化されておらず、約４８，０００ダルトンの分子量を有する。ＷＯ９８／４５３３１及びＵＳ２００３／０１９０３１７を参照されたい。さらなる好ましい抗体としては、各々参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００５／０１２３５９号及び同第ＷＯ２００５／０４４８５３号に記載のＧ６またはＢ２０シリーズ抗体（例えば、Ｇ６−３１、Ｂ２０−４．１）が挙げられる。さらなる好ましい抗体については、米国特許第７，０６０，２６９号、同第６，５８２，９５９号、同第６，７０３，０２０号、同第６，０５４，２９７号、ＷＯ９８／４５３３２、ＷＯ９６／３００４６、ＷＯ９４／１０２０２、ＥＰ０６６６８６８Ｂ１、米国特許出願公開第２００６００９３６０号、同第２００５０１８６２０８号、同第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、及び同第２００５０１１２１２６号、ならびにＰｏｐｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８８：１４９−１６４（２００４）を参照されたい。他の好ましい抗体としては、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、１９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３、及びＣ１０４を含むか、またはあるいは残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、１８３、及びＱ８９を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的エピトープに結合するものが挙げられる。さらなる抗ＶＥＧＦ抗体としては、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００９／１５５７２４号に記載の抗ＶＥＧＦ抗体が挙げられる。

【0120】

「ＩＬ−６結合アンタゴニスト」という用語は、ＩＬ−６と、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）（ＣＤ１２６とも呼ばれる）及び／またはｇｐ１３０（ＣＤ１３０とも呼ばれる）等のその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用から生じるシグナル変換を低減、遮断、阻害、抑止、または妨害する分子を指す。例示のＩＬ−６結合アンタゴニストとしては、例えば、抗ＩＬ−６アンタゴニスト（抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を含む）及び抗ＩＬ−６Ｒアンタゴニスト（抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標）を含む）が挙げられる。「小分子」は、約６００未満、好ましくは約１０００ダルトン未満の分子量を有すると本明細書で定義される。

【0121】

「障害」とは、本抗体での治療から利益を得る任意の状態である。これには、哺乳動物を問題の障害にかかりやすくする病理学的状態を含む慢性及び急性障害または疾患が挙げられる。本明細書で治療される障害の非限定的な例としては、ＨｔｒＡ１関連障害、眼障害、及び／または補体関連障害が挙げられる。

【0122】

「ＨｔｒＡ１関連障害」という用語は、本明細書で使用されるとき、最も広義に、異常なＨｔｒＡ１発現または活性に関連する任意の障害または状態を指す。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害は、非定型症状がＨｔｒＡ１レベルまたは活性により身体において局所的（例えば、眼）及び／または全身的に現れ得る過剰なＨｔｒＡ１レベルまたは活性に関連する。例示のＨｔｒＡ１関連障害としては、ＨｔｒＡ１関連眼障害が挙げられ、これには、例えば、湿潤（滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）ならびに乾燥（非滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮（ＧＡ）を含む）を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）が挙げられるが、これに限定されない。

【0123】

本明細書で使用されるとき、「眼障害」という用語は、湿潤（滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）ならびに乾燥（非滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮（ＧＡ）を含む）等の加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む黄斑変性疾患を含む眼障害、糖尿病性網膜症（ＤＲ）及び他の虚血関連網膜症、眼内炎、ブドウ膜炎、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）である。

【0124】

「補体関連障害」という用語は、最も広義に使用され、過剰なまたは制御不能な補体活性化に関連する障害を含む。それらには、心肺バイパス手術中の補体活性化；急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、挫滅外傷、多臓器不全、血液量減少性ショック、腸虚血、または虚血を引き起こす他の事象後の虚血−再灌流による補体活性化が含まれる。補体活性化は、炎症状態、例えば、重度の熱傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、血液透析、アナフィラキシーショック、重度の喘息、血管性浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎、及び膵臓炎にも関連することが示されている。この障害は、薬物有害反応、薬物アレルギー、ＩＬ−２誘導血管漏出症候群、またはＸ線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。これには、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病、及び多発性硬化症も含まれる。補体活性化は、移植片拒絶反応にも関連する。補体活性化は、補体関連眼障害等の眼障害にも関連する。

【0125】

「補体関連眼障害」という用語は、最も広義に使用され、全ての眼状態を含み、それらの病状は、補体の古典経路及び代替経路、特に、代替経路を含む補体を伴う。補体関連眼障害としては、黄斑変性疾患、例えば、全ての病期の加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性及び他の虚血関連網膜症、眼内炎、ブドウ膜炎、ならびに他の眼内新生血管疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、ＡＭＤには、湿潤ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮（ＧＡ）を含む）が含まれる。さらなる一例では、乾燥（非滲出性）ＡＭＤは、硬性ドルーゼン、軟性ドルーゼン、地図状萎縮、及び／または色素凝集の存在を含み得る。早期ＡＭＤは、例えば、複数の小型〜１つ以上の非広範な中型のドルーゼンを含み得る。中等度ＡＭＤは、例えば、広範な中型ドルーゼン〜１つ以上の大型ドルーゼンを含み得る。例えば、Ｆｅｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＲＥＤＳ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．１８、Ｓａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｙｅ Ｒｅｓ，３４（３）：２３８−４０，２００９、Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５９（１）：１７３５，２００８を参照されたい。さらなる一例では、中等度乾燥ＡＭＤは、大型の融合性ドルーゼンを含み得る。さらなる一例では、地図状萎縮は、光受容体及び／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）欠損を含み得る。さらなる一例では、地図状萎縮の領域は、小さい場合も大きい場合もあり、及び／または黄斑領域または周辺網膜内にあり得る。一例では、補体関連眼障害は、中等度乾燥ＡＭＤである。一例では、補体関連眼障害は、地図状萎縮である。一例では、補体関連眼障害は、湿潤ＡＭＤ（例えば、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。

【0126】

上述のリストは包括的ではなく、疾患または障害が様々なカテゴリー内に入り得ることが理解される。例えば、ＡＭＤは、いくつかの例では、ＨｔｒＡ１関連障害、眼障害、及び補体関連障害としてカテゴリー化され得る。

【0127】

本明細書で使用されるとき、「投与する」とは、対象に、化合物（例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする核酸）または組成物（例えば、薬学的組成物、例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体を含む薬学的組成物）のある投薬量を与える方法を意味する。本明細書に記載の方法で利用される組成物は、例えば、硝子体内（例えば、硝子体内注射により）、眼内（例えば、眼注射により）、眼球内（例えば、眼内注射により）、強膜近傍（例えば、強膜近傍注射により）、テノン嚢下（例えば、テノン嚢下注射により）、超脈絡膜（ｓｕｐｅｒｃｈｏｒｏｉｄａｌｌｙ）（例えば、超脈絡膜（ｓｕｐｅｒｃｈｏｒｏｉｄａｌ）注射により）、局所（例えば、点眼薬により）、筋肉内、静脈内、皮内、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、腫瘍内経口、腹腔、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼窩内、経口、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注射により、埋め込みにより、注入により、持続注入により、標的細胞を直接浸す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリーム剤中で、または脂質組成物中で投与され得る。本明細書に記載の方法で利用される組成物はまた、全身または局所投与され得る。投与方法は、様々な要素（例えば、投与される化合物または組成物、及び治療される状態、疾患、または障害の重症度）に応じて異なり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体（例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体、抗Ｄ因子抗体、及び抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子抗体）は、硝子体内注射により投与される。

【0128】

１つ以上のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与は、同時（並行）投与及び任意の順序での連続投与を含む。

【0129】

「長時間作用型送達」、「徐放性」、及び「制御放出」という用語は、概して、治療薬（例えば、本発明の抗体）の長期放出もしくは延長放出または生物学的利用能を達成するための製剤、剤形、デバイス、または他の種類の技術を使用する送達機構を説明するために使用される。これは、細胞、組織、臓器、関節、領域等を含む（が、これらに限定されない）、全身循環もしくは対象、または対象における局所活性部位への薬物の長期放出もしくは延長放出または生物学的利用能を提供する技術を指し得る。さらに、これらの用語は、製剤もしくは剤形からの薬物の放出を長引かせるか、または延長させるために使用される技術を指し得るか、またはそれらは、対象への薬物の生物学的利用能もしくは薬物動態もしくは作用持続時間を長引かせるか、または延長させるために使用される技術を指し得るか、またはそれらは、製剤によって誘発される薬力学的効果を長引かせるか、または延長させるために使用される技術を指し得る。

【0130】

「長時間作用型製剤」、「徐放性製剤」、または「制御放出製剤」とは、長時間作用型送達を提供するために使用される薬学的製剤、剤形、または他の技術である。一態様では、制御放出は、治療薬の局所生物学的利用能、特に、眼球送達との関連での眼球滞留時間を改善するために使用される。「増加した眼球滞留時間」とは、送達された眼薬が質（例えば、活性）の観点及び量（例えば、有効量）の観点の両方で有効な状態のままである送達後期間を指す。高用量及び制御放出に加えて、またはその代わりに、眼薬は、ＰＥＧ化等により翻訳後に修飾されて、増加したインビボ半減期を達成することができる。

【0131】

薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、必要な投薬量及び必要な期間にわたって所望の治療結果または予防結果を達成するのに有効な量を指す。

【0132】

「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。「対象」は、「患者」であり得る。

【0133】

「添付文書」という用語は、かかる治療薬の適応、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、及び／またはその使用に関する警告についての情報を含む治療薬の商用パッケージ内に習慣的に含まれる指示を指すために使用される。

【0134】

「薬学的に許容される担体」とは、対象に非毒性の活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0135】

「薬学的製剤」という用語は、含有される活性成分の生物学的活性が有効であるような形態であり、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性の追加の成分を含有しない調製物を指す。

【0136】

本明細書で使用されるとき、「治療」（及びその文法的変形、例えば、「治療する」または「治療すること」）とは、治療される個体の自然経過を変更しようとする臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理過程中のいずれかに行われ得る。望ましい治療効果としては、疾患または障害の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患または障害の任意の直接または間接的病理学的帰結の軽減、疾患進行速度の低減、疾患または障害状態の改善または寛解、及び緩解または予後改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患もしくは障害の発症を遅延させるために、または疾患または障害の進行を遅らせるために使用される。いくつかの例では、障害は、ＨｔｒＡ１関連障害、眼障害、及び／または補体関連障害、例えば、ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）である。

【0137】

「単離された」核酸分子とは、それが通常関連する核酸の天然源中の少なくとも１つの混入核酸分子から特定及び分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、それが自然界で見られる形態または設定以外である。したがって、単離された核酸分子は、天然細胞内に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある抗体を通常発現させる細胞内に含まれる核酸分子を含む。

【0138】

「制御配列」という表現は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列としては、例えば、プロモーター、任意に、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することで知られている。

【0139】

核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれているときに「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されるか、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結されるか、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられる場合に、コード配列に作動可能に連結される。概して、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合、連続的であり、リーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的でなくてもよい。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。

【0140】

本明細書で使用されるとき、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は、同義に使用され、全てのかかる表記が子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という単語には、初代対象細胞及び導入数にかかわらずそれに由来する培養物が含まれる。全ての子孫は、故意または不慮の変異により、ＤＮＡ含有量が正確に同一でない場合があることも理解される。最初に形質転換された細胞内でスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。はっきりと異なる表記が意図される場合、それは、文脈から明らかであろう。

【0141】

本明細書で使用されるとき、「ライブラリ」とは、複数の抗体または抗体断片配列（例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体）、またはこれらの配列をコードする核酸を指し、これらの配列は、例えば、本明細書に記載されるように、これらの配列に導入される変異形アミノ酸の組み合わせの点で異なる。

【0142】

「変異」とは、野生型配列等の参照ヌクレオチド配列に対するヌクレオチド（複数可）の欠失、挿入、または置換である。

【0143】

本明細書で使用されるとき、「コドンセット」とは、所望の変異形アミノ酸をコードするために使用される一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列を指す。一組のオリゴヌクレオチドは、例えば、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの全ての可能な組み合わせを表し、かつ所望のアミノ酸群をコードするであろう配列を含む、固相合成によって合成され得る。コドン表記の標準形式は、ＩＵＢコードのものであり、当該技術分野で既知である。コドンセットは、典型的には、イタリック体の３つの大文字、例えば、

等で表される。ある特定の位置での選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，１９９９、Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １２８：１０３，１９９３）である。ある特定のコドンセットを有するかかる組のオリゴヌクレオチドは、商用核酸合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）を使用して合成され得るか、または商業的に入手され得る（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成された一組のオリゴヌクレオチドは、典型的には、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、差異は、全体配列内のコドンセットによって確立される。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、例えば、クローニング目的に有用な制限酵素部位も含み得るが、必ずしも含むわけではない。

【0144】

「ファージディスプレイ」とは、変異形ポリペプチドが、ファージ、例えば、線維状ファージ粒子の表面上のコートタンパク質の少なくとも一部に融合タンパク質としてディスプレイされる技法である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質変異形の大きいライブラリが標的抗原に高親和性で結合する配列のために迅速かつ効率的に選別され得るという事実にある。ペプチド及びタンパク質ライブラリのファージ上でのディスプレイは、特異的結合特性を有するものについて何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は、線維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合によりランダム小ペプチド及び小タンパク質をディスプレイするために使用されている。例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：３５５−３６２，１９９２、及びそれに引用される文献を参照されたい。一価ファージディスプレイにおいて、タンパク質またはペプチドライブラリは、遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合され、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で、低レベルで発現され、これにより、ファージ粒子が融合タンパク質のコピーを１つディスプレイするか、または１つもディスプレイしないようになる。結合力効果は、選別が内因性リガンド親和性に基づくように多価ファージに対して低減され、ファージミドベクターが使用され、これにより、ＤＮＡ操作が簡略化される。例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５−２１６，１９９１を参照されたい。

【0145】

出発または参照ポリペプチドの「変異形」または「変異体」（例えば、参照抗体またはその可変ドメイン（複数可）／ＨＶＲ（複数可））とは、（１）出発または参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、かつ（２）天然変異誘発または人工（人造）変異誘発のいずれかにより出発または参照ポリペプチドから得られたポリペプチドである。かかる変異形は、例えば、本明細書で「アミノ酸残基改変」と称される、目的とするポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換を含む。したがって、変異形ＨＶＲとは、出発または参照ポリペプチド配列（ソース抗体または抗原結合断片のもの等）に対して変異形配列を含むＨＶＲを指す。アミノ酸残基改変とは、この文脈では、出発または参照ポリペプチド配列（参照抗体またはその断片のもの等）内の対応する位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸を指す。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせにより、最終変異形または変異体構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の機能的特性を有することを条件とする。グリコシル化部位の数または位置の変化等のアミノ酸変化により、ポリペプチドの翻訳後プロセスも改変され得る。

【0146】

「野生型（ＷＴ）」もしくは「参照」配列または「野生型」もしくは「参照」タンパク質／ポリペプチド、例えば、参照抗体のＨＶＲまたは可変ドメインの配列は、変異形ポリペプチドが変異の導入により得られる参照配列であり得る。一般に、所与のタンパク質の「野生型」配列は、自然界で最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、自然界で最も一般的に見られるその遺伝子の配列である。変異は、天然プロセスまたは人為的手段のいずれかにより「野生型」遺伝子（ひいては、それがコードするタンパク質）に導入され得る。かかるプロセスの産物は、最初の「野生型」タンパク質または遺伝子の「変異形」または「変異体」形態である。

【0147】

「参照抗体」とは、本明細書で使用されるとき、抗体またはその断片を指し、その抗原結合配列が鋳型配列の役割を果たし、そこで本明細書に記載の基準に従う多様化が行われる。抗原結合配列は、一般に、抗体可変領域、好ましくは少なくとも１つのＨＶＲを含み、好ましくはフレームワーク領域を含む。

【0148】

「濃縮された」とは、本明細書で使用されるとき、実体（例えば、アミノ酸残基改変）が、対応する参照ライブラリ（例えば、選別されていないライブラリ、または異なる抗原もしくは非関連抗原について選別されたライブラリ）と比較して、選別されたライブラリ内により高い頻度で存在することを意味する。対照的に、「枯渇した」とは、実体（例えば、アミノ酸残基改変）が、対応する参照ライブラリ（例えば、選別されていないライブラリ、または異なる抗原もしくは非関連抗原について選別されたライブラリ）と比較して、選別されたライブラリ内でより低い頻度で存在することを意味する。「中立」という用語は、アミノ酸残基変異形を特定する方法に関して使用されるとき、実体が濃縮も枯渇もしていないことを意味し、言い換えれば、それが、対応する参照ライブラリ（例えば、選別されていないライブラリ、または異なる抗原もしくは非関連抗原について選別されたライブラリ）と比較して、選別されたライブラリ内でおよそ同じ頻度で存在することを意味する。

【0149】

「等電点（ｐＩ）」とは、分子（例えば、抗体等のタンパク質）が正味電荷を持たないｐＨを意味し、当該技術分野で「ｐＨ（Ｉ）」または「ＩＥＰ」とも称される。

【0150】

ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、ＨｔｒＡ１に結合する新規の抗体、ならびにそれを作製及び使用する方法（例えば、治療的使用及び診断的使用のため）を提供する。本発明の抗体は、例えば、様々な障害、例えば、ＨｔｒＡ１関連障害、眼障害、及び／または補体関連障害、例えば、加齢性黄斑変性症（例えば、地図状萎縮）の診断または治療に有用である。

【0151】

Ａ．例示の抗ＨｔｒＡ１抗体
一態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する抗体に部分的に基づく。本発明の抗体は、例えば、障害、例えば、ＨｔｒＡ１関連障害、眼障害、及び／または補体関連障害、例えば、加齢性黄斑変性症（例えば、地図状萎縮）の治療または診断に有用である。

【0152】

本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を提供する。いくつかの例では、ＨｔｒＡ１は、ヒトＨｔｒＡ１（ｈｕＨｔｒＡ１）である。他の例では、ＨｔｒＡ１は、マウスＨｔｒＡ１（ｍｕＨｔｒＡ１）である。ある特定の例では、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体は、１００ｎＭ以下（例えば、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、１ｐＭ以下、または０．１ｐＭ以下）のＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に特異的に結合する。例えば、いくつかの例では、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体は、１ｎＭ以下（例えば、１ｎＭ以下、９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５５０ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１５０ｐＭ以下、１２５ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、７５ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２５ｐＭ以下、または１ｐＭ以下）のＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に特異的に結合する。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、約４０ｐＭ〜約７００ｐＭ（例えば、約４０ｐＭ〜約７００ｐＭ、約４０ｐＭ〜約６００ｐＭ、約４０ｐＭ〜約５５０ｐＭ、約４０ｐＭ〜約５００ｐＭ、約４０ｐＭ〜約４００ｐＭ、約４０ｐＭ〜約３００ｐＭ、約４０ｐＭ〜約２５０ｐＭ、約５０ｐＭ〜約２００ｐＭ、約５０ｐＭ〜約１７５ｐＭ、約５０ｐＭ〜約１５０ｐＭ、約５０ｐＭ〜約１２５ｐＭ、約７０ｐＭ〜約１２５ｐＭ、または約５０ｐＭ〜約１２５ｐＭ）のＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、約１１０ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、約６０ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。前述のＫＤ値のうちのいずれかは、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴を使用して測定される、ｈｕＨｔｒＡ１のプロテアーゼドメイン（ＰＤ）（ｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ）に対する本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体の結合親和性（例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体のＦａｂ）を表し得る。

【0153】

いくつかの例では、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体は、ＨｔｒＡ１の活性を阻害することができる。いくつかの例では、本抗体は、１０ｎＭ以下（例えば、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、または１ｐＭ以下）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）でｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤのプロテアーゼドメインの活性を阻害する。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、約０．２５ｎＭ〜約１ｎＭ（例えば、約０．２５ｎＭ〜約１ｎＭ、約０．２５ｎＭ〜約０．９ｎＭ、約０．２５ｎＭ〜約０．８ｎＭ、約０．２５ｎＭ〜約０．７ｎＭ、約０．２５ｎＭ〜約０．６ｎＭ、約０．２５ｎＭ〜約０．５ｎＭ、または約０．２５ｎＭ〜約０．４ｎＭ）のＩＣ５０でｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤの活性を阻害する。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、約０．３ｎＭのＩＣ５０でｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤの活性を阻害する。前述の例のうちのいずれにおいても、阻害活性は、インビトロでのＦＲＥＴに基づく遮断アッセイ測定値であり得る。いくつかの例では、インビトロでのＦＲＥＴに基づく遮断アッセイは、Ｈ２−Ｏｐｔプローブの切断（例えば、（Ｍｃａ）ＩＲＲＶＳＹＳＦ（Ｄｎｐ）ＫＫ（配列番号１５２）を含む。前述の例のうちのいずれにおいても、ＩＣ５０値は、ｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ活性を阻害する二価形式（例えば、ＩｇＧ形式）での抗ＨｔｒＡ１の能力に基づき得る。

【0154】

本発明は、ＨｔｒＡ１エピトープに特異的に結合する単離された抗体も包含し、ＨｔｒＡ１エピトープは、Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、Ｐｈｅ１９４、及びＡｒｇ１９７からなる群から選択されるＨｔｒＡ１タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含み、アミノ酸番号付けは、ヒトＨｔｒＡ１前駆体タンパク質の番号付けを参照する。一実施形態では、ヒトＨｔｒＡ１前駆体タンパク質は、配列番号１２１の配列を有する。一実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７からなる群から選択されるＨｔｒＡ１タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含む。一実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７からなる群から選択されるＨｔｒＡ１タンパク質の少なくとも２つのアミノ酸を含む。特定の一実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、ＨｔｒＡ１アミノ酸Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７を含む。別の実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、ＨｔｒＡ１アミノ酸Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、及びＡｒｇ１９７を含む。さらなる実施形態では、ＨｔｒＡ１エピトープは、ＨｔｒＡ１アミノ酸Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、Ｐｈｅ１９４、及びＡｒｇ１９７を含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、ＨｔｒＡ１に結合する場合、アミノ酸Ａｒｇ１９０、Ｌｅｕ１９２、Ｐｒｏ１９３、Ｐｈｅ１９４、及びＡｒｇ１９７のうちの１つ以上から４オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗体と１つ以上のアミノ酸との間の距離は、例えば、実施例に記載の結晶学方法を使用して、結晶学により決定される。

【0156】

いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）ＤＳＥＸ_１Ｈ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１（式中、Ｘ_１がＭｅｔまたはＬｅｕである）、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＸ_２ＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_２がＧｌｕまたはＡｓｐである）、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＸ_３ＦＩＨ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_３がＧｌｕまたはＡｓｎである）、（ｅ）ＡＴＳＸ_４ＬＡＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ_４が、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである）、及び（ｆ）ＱＱＷＸ_５ＳＸ_６ＰＷＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_５がＳｅｒまたはＴｙｒであり、Ｘ_６がＡｌａまたはＡｓｎである）から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの超可変領域（ＨＶＲ）、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号１〜６のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含み得る。

【0157】

例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＨＶＲ、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号３または７〜１１のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含み得る。

【0158】

いくつかの例では、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、以下の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワーク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ_１ＦＸ_２（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１（式中、Ｘ_１がＬｙｓまたはＴｈｒであり、Ｘ_２がＴｈｒ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇである）、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＡＴＩＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0159】

いくつかの例では、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、以下の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0160】

例えば、いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＡＴＩＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、ＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３である。

【0161】

別の例では、いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＤＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＮＦＩＨ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１２５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＥＷＩＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＮＩＶＶＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、１５Ｈ６（ｍ１５Ｈ６とも称される）である。

【0162】

別の例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）ＳＹＩＭＳ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＹＩＳＮＧＧＧＴＴＹＹＳＤＴＩＫＧ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＱＮＦＲＳＤＧＳＳＭＤＹ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＫＳＦＭＨ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＬＡＳＫＬＥＳ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＨＶＲ、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号３９〜４４のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含み得る。

【0163】

いくつかの例では、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、以下の重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号４７）またはＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＫＬＡＣＶＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号４８）またはＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号４９）またはＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＴＬＫＳＥＤＴＡＩＹＦＣＡＲ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５０）またはＷＧＱＧＴＡＶＴＶＳＳ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0164】

いくつかの例では、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、以下の軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣ（配列番号５１）またはＮＩＶＶＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号５２）またはＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ（配列番号５３）またはＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５４）またはＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0165】

例えば、いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の６つのＨＶＲ：ＳＹＩＭＳ（配列番号３９）、（ｂ）ＹＩＳＮＧＧＧＴＴＹＹＳＤＴＩＫＧ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＱＮＦＲＳＤＧＳＳＭＤＹ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＫＳＦＭＨ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＬＡＳＫＬＥＳ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、ｈ１９Ｂ１２．ｖ１である。

【0166】

別の例では、いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の６つのＨＶＲ：ＳＹＩＭＳ（配列番号３９）、（ｂ）ＹＩＳＮＧＧＧＴＴＹＹＳＤＴＩＫＧ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＱＮＦＲＳＤＧＳＳＭＤＹ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＫＳＦＭＨ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＬＡＳＫＬＥＳ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＫＬＡＣＶＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＴＬＫＳＥＤＴＡＩＹＦＣＡＲ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＡＶＴＶＳＳ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４を含む。さらなる例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＮＩＶＶＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、１９Ｂ１２（ｍ１９Ｂ１２とも称される）である。

【0167】

別の例では、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体は、抗体２０Ｅ２軽鎖及び重鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号６６及び６５）のＨＶＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ（ここで、（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１配列が、配列番号６６のＫａｂａｔアミノ酸残基２４〜３４を含み、ＨＶＲ−Ｌ２配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基５０〜５６を含み、ＨＶＲ−Ｌ３配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基８９〜９７を含み、（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列が、配列番号６５のＫａｂａｔアミノ酸残基３１〜３５を含み、ＨＶＲ−Ｈ２配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基５０〜６５を含み、ＨＶＲ−Ｈ３配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基９５〜１０２を含む）、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに抗体２０Ｅ２の上述のＨＶＲのうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号６５または配列番号６５の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号６６または配列番号６６の配列と少なくとも約９０％配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。

【0168】

別の例では、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体は、抗体３Ａ５軽鎖及び重鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号６８及び６７）のＨＶＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ（ここで、（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１配列が、配列番号６８のＫａｂａｔアミノ酸残基２４〜３４を含み、ＨＶＲ−Ｌ２配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基５０〜５６を含み、ＨＶＲ−Ｌ３配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基８９〜９７を含み、（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列が、配列番号６７のＫａｂａｔアミノ酸残基３１〜３５を含み、ＨＶＲ−Ｈ２配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基５０〜６５を含み、及びＨＶＲ−Ｈ３配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基９５〜１０２を含む）、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに抗体３Ａ５の上述のＨＶＲのうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号６７または配列番号６７の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号６８または配列番号６８の配列と少なくとも約９０％配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。

【0169】

別の例では、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体は、抗体１２Ａ５軽鎖及び重鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号７０及び６９）のＨＶＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ（ここで、（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１配列が、配列番号７０のＫａｂａｔアミノ酸残基２４〜３４を含み、ＨＶＲ−Ｌ２配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基５０〜５６を含み、ＨＶＲ−Ｌ３配列は、Ｋａｂａｔアミノ酸残基８９〜９７を含み、（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列が、配列番号６９のＫａｂａｔアミノ酸残基３１〜３５を含み、ＨＶＲ−Ｈ２配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基５０〜６５を含み、ＨＶＲ−Ｈ３配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基９５〜１０２を含む）、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに抗体１２Ａ５の上述のＨＶＲのうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含む。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号６９または配列番号６９の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号７０または配列番号７０の配列と少なくとも約９０％配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。

【0170】

いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号２１、２３、７６、７７、７８、９３〜１０１、１０６、もしくは１０７のうちのいずれか１つまたはその配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号２２、２４、７２〜７４、８１〜９２、１０５、もしくは１０８のうちのいずれか１つまたはその配列と少なくとも約９０％配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの例では、本抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号１００のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。

【0171】

いくつかの例では、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、以下の重鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ_１ＦＸ_２（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１（式中、Ｘ_１がＬｙｓまたはＴｈｒであり、Ｘ_２がＴｈｒ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇである）、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＡＴＩＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。他の例では、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、以下の重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＥＷＩＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0172】

いくつかの例では、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、以下の軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。他の例では、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、以下の軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＮＩＶＶＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0173】

いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号４５、５５、６５、６７、もしくは６９のうちのいずれか１つまたはその配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号４６、５６、６６、６８、もしくは７０のうちのいずれか１つまたはその配列と少なくとも約９０％配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの例では、本抗体は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの例では、本抗体は、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。

【0174】

いくつかの例では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を提供し、本抗体は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、本明細書でＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３と称される抗体等である。

【0175】

いくつかの例では、本発明は、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する単離された抗体を提供し、本抗体は、（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、本明細書でｈ１９Ｂ６．ｖ１と称される抗体等である。

【0176】

ある特定の例では、本発明は、前述の抗体のうちのいずれか１つと同じエピトープに結合する抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。いくつかの例では、本発明は、ＨｔｒＡ１への結合について前述の抗体のうちのいずれか１つと競合する抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。

【0177】

ある特定の実施形態では、前述の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、以下の特性：（ｉ）１つの可変ドメイン：１つのＨｔｒＡ１三量体サブユニットの比率でＨｔｒＡ１に結合する（例えば、Ｆａｂが３つのＦａｂ：１つのＨｔｒＡ１三量体の比率でＨｔｒＡ１三量体に結合し、ＩｇＧが３つのＩｇＧ：２つのＨｔｒＡ１三量体の比率でＨｔｒＡ１三量体に結合する）、（ｉｉ）２つの可変ドメインを含む抗体の場合、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７４３号の図９に示されるものと同様の「ケージ」の形成をもたらす様式でＨｔｒＡ１に結合する、（ｉｉｉ）ＨｔｒＡ１の三量体形成を阻止しない、（ｉｖ）マウスＨｔｒＡ１と交差反応する、（ｖ）ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３、及び／またはＨｔｒＡ４と交差反応しない、（ｖｉ）抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４．２８ａと競合的にＨｔｒＡ１に結合する（例えば、ＷＯ２０１３／０５５９９８を参照のこと）、（ｖｉｉ）ＨｔｒＡ１とａｌ−アンチトリプシン（ＡｌＡＴ）との間の複合体形成を阻害するという特性のうちの１つ以上を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明は、前述の抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合する抗体を提供する。

【0178】

さらなる一態様では、上述の実施形態のうちのいずれかによる抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下のＣ節「抗体特性及び特徴」の１〜８節に記載の特徴のうちのいずれかを単独または組み合わせで組み込み得る。

【0179】

Ｂ．例示の抗Ｄ因子抗体
本発明は、例えば、ＨｔｒＡ１関連障害、眼障害、及び／または補体関連障害（例えば、ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮））を含む障害の治療方法で、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体と使用され得る抗Ｄ因子抗体を提供する。本発明は、ＨｔｒＡ１及びＤ因子に特異的に結合する多重特異性（例えば、二重特異性）抗体（例えば、抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子抗体）も提供する。任意の好適な抗Ｄ因子抗体が、本発明の組成物及び方法に使用され得る。非限定的な例として、本明細書に記載されており、及び／または米国特許第８，０６７，００２号、同第８，２６８，３１０号、同第８，２７３，３５２号、及び／または米国特許出願第１４／７００，８５３号に記載されているいずれの抗Ｄ因子抗体も、本発明の組成物及び方法に使用され得る。

【0180】

例えば、いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、かつＨＢ１２４７６と指定されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体１６６−３２またはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。例えば、いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、（ａ）配列番号１３６もしくは配列番号１３６の配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１３７もしくは配列番号１３７の配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、抗Ｄ因子モノクローナル抗体１６６−３２等である。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、モノクローナル抗体１６６−３２のヒト化誘導体である。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、モノクローナル抗体１６６−３２と同じエピトープに結合する。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、モノクローナル抗体１６６−３２に由来する抗体断片である。いくつかの例では、モノクローナル抗体１６６−３２に由来する抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）_２断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体１６６−３２に由来する本抗体断片は、Ｆａｂである。

【0181】

いくつかの例では、モノクローナル抗体１６６−３２のヒト化誘導体は、本発明の組成物及び方法で用いられ得る。例えば、例えば米国特許第８，０６７，００２号に記載のモノクローナル抗体１６６−３２のいずれのヒト化誘導体も、本発明の組成物及び方法に使用され得る。米国特許第８，０６７，００２号に記載のモノクローナル抗体１６６−３２の例示のヒト化誘導体は、例えば、ヒト化抗Ｄ因子抗体クローン番号１１１、番号５６、番号２５０、及び番号４１６を含む。ヒト化抗Ｄ因子抗体クローン番号１１１、番号５６、番号２５０、及び番号４１６のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列は、例えば、米国特許第８，０６７，００２号の図５に示されている。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、抗Ｄ因子抗体クローン番号１１１、番号５６、番号２５０、もしくは番号４１６またはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0182】

いくつかの例では、修飾または変異形ヒト化抗Ｄ因子抗体、及びその断片が、本発明の組成物及び方法に使用され得る。例えば、例えば米国特許第８，２７３，３５２号に記載のヒト化抗Ｄ因子抗体クローン番号１１１の任意の修飾または変異形バージョン、例えば、抗体クローン２３８または２３８−１が、本発明の組成物及び方法に使用され得る。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、抗Ｄ因子抗体クローン２３８もしくは２３８−１またはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0183】

いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＸ_１ＤＦＫＧ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）、（ｃ）ＥＧＧＶＸ_１Ｎ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（式中、Ｘ_１がＡｓｎまたはＳｅｒである）、（ｄ）ＩＴＳＴＸ_１ＩＸ_２Ｘ_３ＤＭＮ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ_２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ_３がＡｓｐまたはＳｅｒである）、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＸ_１ＳＬＰＹＴ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＨＶＲ、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号１０９〜１１４のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含み得る。例えば、いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＸ_１ＤＦＫＧ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）、（ｃ）ＥＧＧＶＸ_１Ｎ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（式中、Ｘ_１がＡｓｎまたはＳｅｒである）、（ｄ）ＩＴＳＴＸ_１ＩＸ_２Ｘ_３ＤＭＮ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ_２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ_３がＡｓｐまたはＳｅｒである）、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＸ_１ＳＬＰＹＴ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）を含む。

【0184】

例えば、いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＨＶＲ、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号１０９、１１３、または１１５〜１１８のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含み得る。例えば、いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。

【0185】

いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、（ａ）配列番号１１９、１３１、もしくは１３２のうちのいずれか１つまたはその配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２０、１３３、１３４、もしくは１３５のうちのいずれか１つまたはその配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨ及び（ｂ）にあるようなＶＬを含む。例えば、いくつかの例では、本抗体は、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。他の例では、本抗体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。他の例では、本抗体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。他の例では、本抗体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。他の例では、本抗体は、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。図３０に示される抗Ｄ因子抗体のうちのいずれか、またはその変異形、またはその断片が、本発明の組成物及び方法に使用され得る。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗原結合抗体断片は、ＣＡＳ登録番号１２７８４６６−２０−８を有するランパリズマブである。

【0186】

別の例では、いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、例えば、米国特許第８，２６８，３１０号に記載の２０Ｄ１２抗体であるか、またはそれに由来する。一例では、抗Ｄ因子抗体は、抗体２０Ｄ１２軽鎖及び重鎖可変ドメイン（それぞれ、配列番号１２８及び１２７）のＨＶＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ（ここで、（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１配列が、配列番号１２８のＫａｂａｔアミノ酸残基２４〜３４を含み、ＨＶＲ−Ｌ２配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基５０〜５６を含み、ＨＶＲ−Ｌ３配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基８９〜９７を含み、（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列が、配列番号１２７のＫａｂａｔアミノ酸残基３１〜３５を含み、ＨＶＲ−Ｈ２配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基５０〜６５を含み、ＨＶＲ−Ｈ３配列が、Ｋａｂａｔアミノ酸残基９５〜１０２を含む）、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに抗体２０Ｄ１２の上述のＨＶＲのうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含む。

【0187】

いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、（ａ）配列番号１２７もしくは配列番号１２７の配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２８もしくは配列番号１２８の配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、抗Ｄ因子抗体２０Ｄ１２等である。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、モノクローナル抗体２０Ｄ１２のヒト化誘導体である。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、モノクローナル抗体２０Ｄ１２またはそのヒト化誘導体と同じエピトープに結合する。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体は、モノクローナル抗体２０Ｄ１２またはそのヒト化誘導体に由来する抗体断片である。いくつかの例では、モノクローナル抗体２０Ｄ１２またはそのヒト化誘導体に由来する抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）_２断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体２０Ｄ１２またはそのヒト化誘導体に由来する抗体断片は、Ｆａｂである。

【0188】

いくつかの例では、前述の抗Ｄ因子抗体のうちのいずれかの断片（例えば、抗原結合断片）が、本発明の組成物及び方法に使用され得る。本発明の抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｄＡｂ、超可変領域（ＨＶＲ）断片、線状抗体、一本鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片から形成される多重特異性抗体であり得る。さらなる一実施形態では、網膜の実質的に全てに浸透することができる抗Ｄ因子抗体断片（例えば、抗原結合断片）が、本発明の組成物及び方法に使用され得る。なおさらなる一実施形態では、網膜の全厚みを通じて浸透することができる抗Ｄ因子抗体断片（例えば、抗原結合断片）が、本発明の組成物及び方法に使用され得る。

【0189】

いくつかの例では、本発明は、ヒト化抗Ｄ因子抗体の使用を含み得、かかる抗体のＦａｂ断片は、単回硝子体内注射による哺乳類（例えば、ヒト）の眼の中への投与後少なくとも３、５、７、１０、または１２日間の半減期を有する。別の実施形態では、本発明は、ヒト化抗Ｄ因子抗体の使用を含み得、かかる抗体のＦａｂ断片は、単回硝子体内注射による哺乳類（例えば、ヒト）の眼の中への投与後少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、または１１５日間にわたって代替経路（ＡＰ）補体活性化を阻害する。別の実施形態では、本発明は、ヒト化抗Ｄ因子抗体の使用を含み得、代替経路（ＡＰ）補体活性化を阻害するかかる抗体のＦａｂ断片の濃度は、単回硝子体内注射による哺乳類（例えば、ヒト）の眼の中への投与後少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、または８５日間にわたって網膜組織内で維持される。別の実施形態では、本発明は、ヒト化抗Ｄ因子抗体の使用を含み得、代替経路（ＡＰ）補体活性化を阻害するかかる抗体のＦａｂ断片の濃度は、単回硝子体内注射による哺乳類（例えば、ヒト）の眼の中への投与後少なくとも８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、または１１５日間にわたって硝子体液中で維持される。一例では、本発明は、本抗Ｄ因子抗体の断片（例えば、抗原結合断片）の使用を含む。

【0190】

いくつかの例では、前述の抗Ｄ因子抗体のうちのいずれかは、その一価形態で、約２０ｎＭ以下のＫＤでＤ因子に結合する（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体のＫＤ）。いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、その一価形態で、約１０ｎＭ以下のＫＤでＤ因子に結合する。いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、その一価形態で、約５ｎＭ以下のＫＤでＤ因子に結合する。いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、その一価形態で、約２ｎＭ以下のＫＤでＤ因子に結合する。例えば、いくつかの例では、本抗体は、その一価形態で、約０．５ｐＭ〜約２ｎＭ（例えば、約０．５ｐＭ、約１ｐＭ、約２ｐＭ、約３ｐＭ、約４ｐＭ、約５ｐＭ、約６ｐＭ、約７ｐＭ、約８ｐＭ、約９ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約２５ｐＭ、約５０ｐＭ、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ、約６２５ｐＭ、約６５０ｐＭ、約６７５ｐＭ、約７００ｐＭ、約７２５ｐＭ、約７５０ｐＭ、約７７５ｐＭ、約８００ｐＭ、約８２５ｐＭ、約８５０ｐＭ、約８７５ｐＭ、約９００ｐＭ、約９２５ｐＭ、約９５０ｐＭ、約９７５ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、または約２ｎＭ）のＫＤでＤ因子に結合する。いくつかの例では、本抗体は、その一価形態で、約０．５ｐＭ〜約１００ｐＭのＫＤでＤ因子に結合する。いくつかの例では、本抗体は、その一価形態で、約０．５ｐＭのＫＤでＤ因子に結合する。いくつかの例では、本抗体は、その一価形態で、約１０ｐＭ未満のＫＤでＤ因子に結合する。

【0191】

いくつかの例では、前述の抗Ｄ因子抗体のうちのいずれかは、その二価形態で、約１０ｎＭ以下のＫＤでＤ因子に結合する（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体のＫＤ）。いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、その二価形態で、約５ｎＭ以下のＫＤでＤ因子に結合する。いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、その二価形態で、約２ｎＭ以下のＫＤでＤ因子に結合する。例えば、いくつかの例では、本抗体は、その二価形態で、約０．５ｐＭ〜約２ｎＭ（例えば、約０．５ｐＭ、約１ｐＭ、約２ｐＭ、約３ｐＭ、約４ｐＭ、約５ｐＭ、約６ｐＭ、約７ｐＭ、約８ｐＭ、約９ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約２５ｐＭ、約５０ｐＭ、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ、約６２５ｐＭ、約６５０ｐＭ、約６７５ｐＭ、約７００ｐＭ、約７２５ｐＭ、約７５０ｐＭ、約７７５ｐＭ、約８００ｐＭ、約８２５ｐＭ、約８５０ｐＭ、約８７５ｐＭ、約９００ｐＭ、約９２５ｐＭ、約９５０ｐＭ、約９７５ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、または約２ｎＭ）のＫＤでＤ因子に結合する。いくつかの例では、本抗体は、その二価形態で、約０．５ｐＭ〜約１００ｐＭのＫＤでＤ因子に結合する。いくつかの例では、本抗体は、その二価形態で、約０．５ｐＭのＫＤでＤ因子に結合する。いくつかの例では、本抗体は、その二価形態で、約１０ｐＭ未満のＫＤでＤ因子に結合する。

【0192】

さらなる一態様では、上述の実施形態のうちのいずれかによる抗Ｄ因子抗体は、以下のＣ節「抗体特性及び特徴」の１〜８節に記載の特徴のうちのいずれかを単独または組み合わせで組み込み得る。

【0193】

Ｃ．抗体特性及び特徴
本明細書に記載の抗体（例えば、上述の抗ＨｔｒＡ１抗体及び抗Ｄ因子抗体、ならびに以下に記載の抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子抗体）、ならびに本明細書に記載の方法に使用するための抗体のうちのいずれかは、以下の１〜８節に記載の特徴のうちのいずれかを単独または組み合わせで有し得る。

【0194】

１．抗体親和性
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体、抗Ｄ因子抗体、または二重特異性抗ＨｔｒＡ１抗Ｄ因子抗体）は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。例えば、いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、約１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＨｔｒＡ１（ｈｕＨｔｒＡ１）に結合する。いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、約５ｎＭ以下のＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、約２ｎＭ以下のＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。例えば、いくつかの例では、本抗体は、約２５ｐＭ〜約２ｎＭ（例えば、約２５ｐＭ、約５０ｐＭ、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ、約６２５ｐＭ、約６５０ｐＭ、約６７５ｐＭ、約７００ｐＭ、約７２５ｐＭ、約７５０ｐＭ、約７７５ｐＭ、約８００ｐＭ、約８２５ｐＭ、約８５０ｐＭ、約８７５ｐＭ、約９００ｐＭ、約９２５ｐＭ、約９５０ｐＭ、約９７５ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、または約２ｎＭ）のＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約７５ｐＭ〜約６００ｐＭ（例えば、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ）のＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約７５ｐＭ〜約５００ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約７５ｐＭ〜約４００ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約７５ｐＭ〜約３００ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約７５ｐＭ〜約２００ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約７５ｐＭ〜約１５０ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約７５ｐＭ〜約１２５ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約７５ｐＭ〜約１００ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約８０ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約６０ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約４０ｐＭのＫＤでｈｕＨｔｒＡ１に結合する。

【0195】

一実施形態では、ＫＤは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。一実施形態では、ＲＩＡは、目的とする抗体及びその抗原のＦａｂバージョンを用いて行われる。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、滴定系列の非標識抗原の存在下で、Ｆａｂを最小濃度の（^１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、その後、抗Ｆａｂ抗体でコーティングされたプレートと結合している抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと）。このアッセイの条件を確立するために、マイクロタイター（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍＬの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中２ｗ／ｖ％のウシ血清アルブミンで２〜５時間にわたって室温（およそ２３℃）で遮断する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［^１２５Ｉ］−抗原を、目的とするＦａｂの連続希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評定と一致する）。その後、目的とするＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）続けて、平衡に達することを確実にすることができる。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために捕捉プレートに移す。その後、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥した時点で、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）上で１０分間にわたって計数する。２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイでの使用に選択する。

【0196】

別の実施形態によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用したアッセイは、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で行われる。一実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）は、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）になるまで希釈された後、５μＬ／分の流量で注入されて、およそ１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質が得られる。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンが注入されて、未反応基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）が、２５℃の０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）界面活性剤を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中におよそ２５μＬ／分の流量で注入される。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上述の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超える場合、オン速度は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される場合に、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技法を使用して決定することができる。ＫＤは、以下の実施例に記載されるようにＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲアッセイを使用して測定することもできる。

【0197】

２．抗体安定性
本発明は、例えば、参照抗ＨｔｒＡ１抗体と比較して、安定性が強化された抗体を提供する。抗体の安定性は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、分光法（例えば、質量分光法）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、円偏光二色性（ＣＤ）、内在性タンパク質蛍光、示差走査熱量測定、光散乱（例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）及び静的光散乱（ＳＬＳ）、自己相互作用クロマトグラフィー（ＳＩＣ）を使用して決定され得る。抗ＨｔｒＡ１抗体は、例えば、参照抗ＨｔｒＡ１抗体と比較して、溶融温度（Ｔ_ｍ）、凝集温度（Ｔ_ａｇｇ）、または安定性の他の測定基準の高まりを有し得る。

【0198】

本発明は、参照抗ＨｔｒＡ１抗体と比較して、低減された脱アミド化を有する抗体を提供する。脱アミド化は、本明細書に記載されるように、及び／または当該技術分野で既知の方法を使用して低減または阻止され得る。本発明は、参照抗ＨｔｒＡ１抗体と比較して、例えば、低減された酸化（例えば、トリプトファン酸化（例えば、ＬＣ−Ｗ９１位で））を有する抗体も提供する。酸化（例えば、トリプトファン酸化）は、本明細書に記載されるように、及び／または当該技術分野で既知の方法を使用して低減または阻止され得る。本発明は、参照抗ＨｔｒＡ１抗体と比較して、例えば、低減された異性化を有する抗体も提供する。異性化は、本明細書に記載されるように、及び／または当該技術分野で既知の方法を使用して低減または阻止され得る。

【0199】

３．抗体断片
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び以下に記載の他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつ増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。

【0200】

ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。

【0201】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照のこと）。

【0202】

抗体断片は、本明細書に記載される、インタクトな抗体のタンパク分解、ならびに組換え宿主細胞による産生（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製され得る。

【0203】

いくつかの例では、本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体）は、Ｆａｂである。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、重鎖定常領域のヒンジ領域（例えば、上部ヒンジ）にトランケーションを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ重鎖定常領域は、２２１位（ＥＵ番号付け）で終端する。いくつかの実施形態では、２２１位のアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基（Ｄ２２１）である。いくつかの実施形態では、Ｆａｂの重鎖定常領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列またはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１６０の重鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１５９の軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１６０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１５９の軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、ＩｇＧ１ Ｆａｂである。

【0204】

いくつかの例では、Ｆａｂは、ＨｔｒＡ１に結合し、（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＨＶＲ、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号３または７〜１１のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含み得る。いくつかの例では、かかるＦａｂは、重鎖定常領域のヒンジ領域（例えば、上部ヒンジ）にトランケーションを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ重鎖定常領域は、２２１位（ＥＵ番号付け）で終端する。いくつかの実施形態では、２２１位のアミノ酸残基は、Ａｓｐ（Ｄ２２１）である。いくつかの実施形態では、Ｆａｂの重鎖定常領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列またはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｆａｂは、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域をさらに含む。

【0205】

いくつかの例では、Ｆａｂは、ＨｔｒＡ１に結合し、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列またはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列またはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、及び（ｃ）重鎖定常領域のヒンジ領域（例えば、上部ヒンジ）でのトランケーションを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ重鎖定常領域は、２２１位（ＥＵ番号付け）で終端する。いくつかの実施形態では、２２１位のアミノ酸残基は、Ａｓｐ（Ｄ２２１）である。いくつかの実施形態では、Ｆａｂの重鎖定常領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列またはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１６０の重鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１５９の軽鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、配列番号１６０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１５９の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0206】

いくつかの例では、Ｆａｂは、ＨｔｒＡ１に結合し、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、及び（ｃ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。

【0207】

４．キメラ及びヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サルに由来する可変ドメイン）及びヒト定常ドメインを含む。さらなる一例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。

【0208】

ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、かつＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。

【0209】

ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングについて記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」について記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」について記載）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチについて記載）にさらに記載されている。

【0210】

ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照のこと）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照のこと）、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照のこと）、及びＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0211】

５．ヒト抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は、概して、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。

【0212】

ヒト抗体は、抗原攻撃に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、または動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載）、米国特許第５，７７０，４２９号（ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術について記載）、米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載）、ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載）も参照されたい。かかる動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに修飾され得る。

【0213】

ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株について説明されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体についても、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）に記載の方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）についても、Ｖｏｌｌｍｅｒｓａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。

【0214】

ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。その後、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技法は、以下に記載されている。

【0215】

６．ライブラリ由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が、当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）にさらに記載されている。

【0216】

ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ中でランダムに組換えられ、その後、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングされる。ファージは、典型的には、抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとしてディスプレイする。免疫化源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、高親和性抗体を免疫原に提供する。あるいは、ナイーブレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）によって説明されるように、（例えば、ヒトから）クローニングされて、いかなる免疫化も伴うことなく、単一抗体源を広範囲の非自己抗原及び自己抗原に提供することができる。最後に、ナイーブライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）によって説明されるように、幹細胞由来の再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、かつランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変のＣＤＲ３領域をコードし、再編成をインビトロで達成することによっても合成的に作製され得る。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。

【0217】

ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。

【0218】

７．多重特異性抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＨｔｒＡ１の２つの異なるエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方は、ＨｔｒＡ１に対するものであり、他方は、任意の他の抗原（例えば、第２の生物学的分子、例えば、Ｄ因子）に対するものである。したがって、二重特異性抗体は、ＨｔｒＡ１及びＤ因子に対する結合特異性を有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。本明細書に記載の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかを使用して、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、例えば、抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子二重特異性抗体を操作することができる。本明細書に記載されており、及び／または当該技術分野で既知の抗Ｄ因子抗体のうちのいずれかを使用して、かかる抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子二重特異性抗体を操作することができる。

【0219】

例えば、いくつかの例では、（ａ）ＤＳＥＸ_１Ｈ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１（式中、Ｘ_１がＭｅｔまたはＬｅｕである）、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＸ_１ＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_１がＧｌｕまたはＡｓｐである）、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＸ_３ＦＩＨ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_３がＧｌｕまたはＡｓｎである）、（ｅ）ＡＴＳＸ_４ＬＡＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、Ｘ_４が、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである）、及び（ｆ）ＱＱＷＸ_５ＳＸ_６ＰＷＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_５がＳｅｒまたはＴｙｒであり、Ｘ_６がＡｌａまたはＡｓｎである）から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの超可変領域（ＨＶＲ）、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号１〜６のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含む、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する第１の結合ドメインを含む二重特異性抗ＨｔｒＡ１抗体は、Ｄ因子に結合する第２の結合ドメインを有し得る。Ｄ因子に特異的に結合する第２の結合ドメインは、例えば、（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＸ_１ＤＦＫＧ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）、（ｃ）ＥＧＧＶＸ_１Ｎ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（式中、Ｘ_１がＡｓｎまたはＳｅｒである）、（ｄ）ＩＴＳＴＸ_１ＩＸ_２Ｘ_３ＤＭＮ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ_２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ_３がＡｓｐまたはＳｅｒである）、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＸ_１ＳＬＰＹＴ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲ、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号１０９〜１１４のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含み得る。

【0220】

例えば、いくつかの例では、（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの超可変領域（ＨＶＲ）、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号３または７〜１１のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含む、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する第１の結合ドメインを含む二重特異性抗ＨｔｒＡ１抗体は、Ｄ因子に結合する第２の結合ドメインを有し得る。Ｄ因子に特異的に結合する第２の結合ドメインは、例えば、（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲ、または上述のＨＶＲのうちの１つ以上の組み合わせ、ならびに配列番号１０９、１１３、または１１５〜１１８のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異形を含み得る。

【0221】

特定の実施形態では、本発明は、ＨｔｒＡ１及びＤ因子の両方に特異的に結合する二重特異性抗ＨｔｒＡ１抗体を提供し、本抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＳＥＭＨ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＶＤＰＥＴＥＧＡＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＧＹＤＹＤＹＡＬＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＳＳＶＥＦＩＨ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＷＳＳＡＰＷＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する第１の結合ドメイン、ならびに以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、Ｄ因子に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む。いくつかの例では、第２の結合ドメインは、抗Ｄ因子抗原結合抗体断片ランパリズマブの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む。

【0222】

いくつかの例では、二重特異性抗ＨｔｒＡ１抗体は、（ａ）配列番号２１または配列番号２１の配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号２２または配列番号２２の配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する第１の結合ドメインを含み（例えば、ＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３）、Ｄ因子に結合する第２の結合ドメインを有し得る。Ｄ因子に特異的に結合する第２の結合ドメインは、例えば、（ａ）配列番号１１９または配列番号１１９の配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２０または配列番号１２０の配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含み得る。いくつかの例では、Ｄ因子に特異的に結合する第２の結合ドメインは、（ａ）抗Ｄ因子抗原結合抗体断片ランパリズマブまたはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）抗Ｄ因子抗原結合抗体断片ランパリズマブまたはその配列と少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含み得る。

【0223】

多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照のこと）、ならびに「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、静電ステアリング効果を操作して抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと）、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと）、及び例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるように三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。

【0224】

「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照のこと）。

【0225】

本明細書における抗体または断片は、ＨｔｒＡ１、ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含む（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照のこと）。

【0226】

８．抗体変異形
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異形（例えば、１つ以上のアミノ酸残基改変を含む抗体変異形）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異形は、その抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせにより、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有することを条件とする。

【0227】

ａ）置換、挿入、及び欠失変異形
ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異形が提供される。置換型変異誘発のための目的とする部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換が、表１の「好ましい置換」という見出しの下に示される。より実質的な変化が、表１の「例示の置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換が目的とする抗体に導入され得、その産物が、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。

【0228】

アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って群分けされ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0229】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの別のクラスとの交換を伴う。

【0230】

一種の置換型変異形は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基及び／またはＦＲ残基の置換を伴う。一般に、さらなる研究のために選択される結果として得られた変異形（複数可）は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、安定性の増加、発現の増加、ｐＩの改変、及び／または免疫原性の低減）における修飾（例えば、改善）を有し、及び／または親抗体の実質的に保持されたある特定の生物学的特性を有する。例示の置換型変異形は、例えば、本明細書に記載の技法等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。手短に言えば、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、変異形抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0231】

改変（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲで行われ得る。かかる改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を経るコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照のこと）、及び／または抗原と接触する残基で行われ得、結果として得られた変異形ＶＨまたはＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリの構築及びそれから再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性が、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のうちのいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。その後、二次ライブラリが作製される。その後、ライブラリがスクリーニングされて、所望の親和性を有する任意の抗体変異形を特定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に特定され得る。ＨＶＲ−Ｈ３及びＨＶＲ−Ｌ３が特に標的とされることが多い。

【0232】

ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）がＨＶＲで行われ得る。かかる改変は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外側であり得る。上述の変異形ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、改変されないか、または１つ、２つ、もしくは３つより多くのアミノ酸置換を含まないかのいずれかである。

【0233】

ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、１つ以上のＦＲ内で生じ得る。かかる改変は、例えば、抗体親和性及び／または安定性（例えば、溶融温度の上昇によって評定される）を改善し得る。

【0234】

修飾するためのフレームワーク領域残基またはＨＶＲ領域残基の例としては、可能な脱アミド化部位（すなわち、アスパラギン（ＮもしくはＡｓｎ））、酸化部位（すなわち、メチオニン（ＭもしくはＭｅｔ）またはトリプトファン（ＷもしくはＴｒｐ））、またはピログルタミン酸変換部位（すなわち、グルタミン（ＱもしくはＧｌｎ））が挙げられ、かかる部位での修飾により、それぞれ、脱アミド化及び／または酸化及び／またはピログルタミン酸変換が阻止または低減される。

【0235】

脱アミド化変異形の形成を阻止または低減するために、アスパラギン（ＮもしくはＡｓｎ）が、アラニン（ＡもしくはＡｌａ）、グルタミン（ＱもしくはＧｌｎ）、またはセリン（ＳもしくはＳｅｒ）に変異され得る。酸化変異形の形成を阻止または低減するために、メチオニン（Ｍｅｔ）またはトリプトファン（ＷもしくはＴｒｐ）が、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）に変異され得る。ピログルタミン酸変異形の形成を阻止または低減するために、グルタミン（ＱもしくはＧｌｎ）が、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）に変異され得る。例えば、Ａｍｐｈｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：１−１４０，１９９６を参照されたい。あるいは、または加えて、フレームワーク領域残基の１つ以上の改変（例えば、置換）は、親抗体のＦｃ領域においてであり得る。

【0236】

変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって説明される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基の群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）により置き換えられて、抗体と抗原との相互作用が影響を及ぼされたかを決定する。さらなる置換が、最初の置換に機能感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは、または加えて、抗体と抗原との間の接触点を特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接する残基が、置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。変異形がスクリーニングされて、それらが所望の特性を有するかを決定することができる。

【0237】

アミノ酸配列挿入としては、長さが１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異形としては、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのため）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が挙げられる。

【0238】

ｂ）グリコシル化変異形
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるように、アミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され得る。

【0239】

本抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物が改変され得る。哺乳類細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合により一般に結合した分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」内のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、ある特定の改善された特性を有する抗体変異形を作製するために行われ得る。

【0240】

一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異形が提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体内のわずかな配列変異により、２９７位の約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位と３００位との間にも位置し得る。かかるフコシル化変異形は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号、同第２００４／００９３６２１号を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異形に関する公報の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，特に実施例１１））、ならびにノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照のこと）が挙げられる。

【0241】

例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分される二分されたオリゴ糖を有する抗体変異形がさらに提供される。かかる抗体変異形は、低減されたフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。かかる抗体変異形の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８、米国特許第６，６０２，６８４号、及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異形も提供される。かかる抗体変異形は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異形は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７、ＷＯ１９９８／５８９６４、及びＷＯ１９９９／２２７６４に記載されている。

【0242】

ｃ）Ｆｃ領域変異形
ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異形が生成され得る。Ｆｃ領域変異形は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。ある特定の実施形態では、本発明は、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣ等）が不要または有害である用途に望ましい候補となる全てではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体変異形を企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（それ故に、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞が、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４貢の表３に要約されている。

【0243】

目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、ならびにＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣＹＴＯＴＯＸ ９６（登録商標）非放射性活性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示される動物モデルにおいて評定され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイが行われ得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定も、当該技術分野で既知の方法を使用して行われ得る（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照のこと）。

【0244】

低下したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異体としては、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0245】

ＦｃＲへの結合が改善または低減されたある特定の抗体変異形について記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照のこと）。

【0246】

ある特定の実施形態では、抗体変異形は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。

【0247】

いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の改変（すなわち、改善または低減のいずれか）をもたらす改変がＦｃ領域内で行われる。

【0248】

増加した半減期、及び母体ＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を内部に有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異形としては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上の置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域変異形の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。

【0249】

ｄ）システイン操作された抗体変異形
ある特定の実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作された抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体の到達可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の到達可能な部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を他の部分、例えば、薬物部分またはリンカー−薬物部分にコンジュゲートして、本明細書にさらに記載されるように、イムノコンジュゲートを作製することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちのいずれか１つ以上が、システインで置換され得る。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。

【0250】

ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合したポリマーの数は異なり得、１つより多くのポリマーが結合している場合、それらは同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／またはタイプは、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下にてある療法で使用されるか等を含むが、これらに限定されない考慮すべき事項に基づいて決定され得る。

【0251】

抗体−ポリマーコンジュゲートは、抗体をポリマーで誘導体化するのに好適な任意の技法を使用して作製され得る。本発明が、抗体または抗体断片とポリマーとの間のいずれかの特定のタイプの結合を利用するコンジュゲートに限定されないことが理解される。

【0252】

一態様では、本発明のコンジュゲートは、ポリマーが親抗体の特異的部位（複数可）に共有結合している種、すなわち、ポリマー結合が親抗体または抗体断片における特定の領域または特定のアミノ酸残基（複数可）に標的とされる種を含む。ポリマーの部位特異的コンジュゲーションは、最も一般的には、親抗体または抗体断片におけるシステイン残基への結合によって達成される。かかる実施形態では、カップリング化学は、例えば、親抗体におけるジスルフィド架橋にはないシステイン残基の遊離スルフヒドリル基を利用し得る。ポリマーは、親抗体の遊離スルフヒドリル基またはチオール基（複数可）と特異的に反応することができる任意の官能基、例えば、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、テシラート（ｔｅｓｙｌａｔｅ）、アジリジン、エキシラン、及び５−ピリジル官能基で活性化され得る。ポリマーは、米国特許第４，１７９，３３７号及び同第７，１２２，６３６号、ならびにＪｅｖｓｅｖａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．５：１１３−１２８，２０１０に記載のプロトコル及びシステム等の選択されるカップリングシステムの化学に好適な任意のプロトコルを使用して親抗体にカップリングされ得る。

【0253】

一実施形態では、親抗体に天然に存在する１つ以上のシステイン残基（複数可）は、ポリマーコンジュゲーションのための結合部位（複数可）として使用される。別の実施形態では、１つ以上のシステイン残基（複数可）は、特異的結合部位（複数可）をポリマーに提供する目的のために、親抗体における選択された部位（複数可）に操作される。

【0254】

一態様では、本発明は、抗体断片−ポリマーコンジュゲートを包含し、抗体断片は、Ｆａｂであり、ポリマーは、軽鎖と重鎖を連結する鎖間ジスルフィド結合を通常形成するＦａｂ断片の軽鎖または重鎖内の１つ以上のシステイン残基に結合する。

【0255】

別の態様では、本発明は、抗体断片−ポリマーコンジュゲートを包含し、抗体断片は、Ｆａｂ’であり、ポリマー結合は、Ｆａｂ’断片のヒンジ領域に標的とされる。一実施形態では、抗体断片のヒンジ領域に天然に存在する１つ以上のシステイン残基（複数可）は、ポリマーに結合するために使用される。別の実施形態では、１つ以上のシステイン残基は、特異的結合部位（複数可）をポリマーに提供する目的のために、Ｆａｂ’断片のヒンジ領域に操作される。一実施形態では、本発明のＦａｂ断片（例えば、抗ＨｔｒＡ１ Ｆａｂ断片、抗Ｄ因子Ｆａｂ断片、または抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子Ｆａｂ断片）は、１つの結合部位をポリマーコンジュゲーションに提供する目的のために、Ｃ’末端に１つのシステインを付加することによって修飾される。別の実施形態では、本発明のＦａｂ断片は、２つの結合部位をポリマーコンジュゲーションに提供する目的のために、Ｃ’末端に４つの追加の残基、Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１２２）を付加することによって修飾される。

【0256】

１つの一般的に使用される抗体コンジュゲーションは、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーが抗体の定常領域に共有結合するＰＥＧ化である。米国特許第４，１７９，３３７号及び同第７，１２２，６３６号を参照されたい。異なるサイズ（例えば、約５００Ｄ〜約３００，０００Ｄ）及び形状（例えば、直鎖状または分岐状）のＰＥＧポリマーが知られており、当該分野で広く使用されている。本発明に有用なポリマーは、商業的に入手され得る（例えば、Ｎｉｐｐｏｎ Ｏｉｌ ａｎｄ Ｆａｔｓ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）か、または従来の化学手技を使用して市販の出発材料から調製され得る。ＰＥＧ化は、抗体薬物の物理的及び化学的特性を変化させ、安定性の改善、免疫原性の低減、循環寿命の延長、ならびに滞留時間の増加等の薬物動態挙動の改善をもたらし得る。別の実施形態では、本明細書に記載の任意の抗体（例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体）が、ヒアルロン酸（ＨＡ）コンジュゲートされ得る。

【0257】

別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであり得、通常の細胞には害を及ぼさないが、非タンパク質性部分を抗体−非タンパク質性部分の近位の細胞が死滅する温度に加熱する波長を含むが、これに限定されない。

【0258】

ｆ）等電点変異形
本発明は、改変された等電点を有する抗体変異形を提供する。例えば、本発明は、参照抗ＨｔｒＡ１抗体と比較して、例えば、低減された等電点（ｐＩ）を有する抗体変異形を提供する。いくつかの例では、表面電荷は、生理学的ｐＨで減少する。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、約８以下（例えば、約８、約７、約６、約５、または約４）のｐＩを有する。いくつかの例では、本抗体は、約４〜約８（例えば、約４、約５、約６、約７、または約８）のｐＩを有する。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、約５〜約７（例えば、約５、約６、または約７）のｐＩを有する。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、約５〜約６（例えば、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、または約６）のｐＩを有する。

【0259】

本発明の抗体は、例えば、所与の位置の野生型アミノ酸残基を、より低いｐＩを有するアミノ酸で置換することによって、減少したｐＩを有するように操作され得る。アミノ酸のｐＩは、当該技術分野で既知のアミン（−ＮＨ_２）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）、及びアミノ酸の側鎖のｐＫａ値に基づいて決定され得る。いくつかの実施形態では、表面曝露アミノ酸残基は、抗体のｐＩを減少させるために置換され得る。一実施形態では、表面曝露アミノ酸残基は、グルタミン酸（Ｅ）で置換され得る。一実施形態では、表面曝露アミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換され得る。

【0260】

Ｄ．組換え方法及び組成物
本明細書に記載の抗体のうちのいずれか（例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体）は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組換え方法及び組成物を使用して産生され得る。一実施形態では、本明細書に記載の抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。かかる核酸は、本抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、本抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。さらなる一実施形態では、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる一実施形態では、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。かかる一実施形態では、宿主細胞は、（１）本抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び本抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）本抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び本抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗ＨｔｒＡ１抗体を作製する方法が提供され、本方法は、本抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、上に提供されるように、本抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、本抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。

【0261】

抗ＨｔｒＡ１抗体の組換え産生について、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞でのさらなるクローニング及び／または発現のために１つ以上のベクターに挿入される。かかる核酸は、従来の手技を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定され得る。

【0262】

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４（Ｅ．ｃｏｌｉ中での抗体断片の発現について記載）も参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。

【0263】

原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす菌及び酵母菌株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。

【0264】

グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞とともに使用され得る多数のバキュロウイルス菌株が特定されている。

【0265】

植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載）を参照されたい。

【0266】

脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合された哺乳類細胞株が有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例には、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載の２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載のＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載のＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞がある。他の有用な哺乳類宿主細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））、及び骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。

【0267】

Ｅ．アッセイ
本明細書に提供される抗ＨｔｒＡ１抗体（例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体及び抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子抗体）は、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって特定され得るか、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性についてスクリーニングされ得るか、または特徴付けられ得る。

【0268】

１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））等の既知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。

【0269】

一態様では、抗原結合活性（例えば、ＫＤによって示される）は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用したアッセイは、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で行われる。一実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）は、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）になるまで希釈された後、５μＬ／分の流量で注入されて、およそ１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質が得られる。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンが注入されて、未反応基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）が、２５℃の０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）界面活性剤を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中におよそ２５μＬ／分の流量で注入される。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上述の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超える場合、オン速度は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される場合に、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技法を使用して決定することができる。ＫＤは、以下の実施例に記載されるようにＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲアッセイを使用して測定することもできる。

【0270】

別の態様では、競合アッセイを使用して、ＨｔｒＡ１への結合について本明細書に記載の抗体と競合する抗体を特定することができる。ある特定の実施形態では、かかる競合抗体は、本明細書に記載の抗体によって結合される、同じエピトープ（例えば、直線状または立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。

【0271】

例示の競合アッセイでは、固定化ＨｔｒＡ１が、ＨｔｒＡ１に結合する第１の標識抗体と、ＨｔｒＡ１への結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の未標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＨｔｒＡ１が、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体のＨｔｒＡ１への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な結合していない抗体が除去され、固定化ＨｔｒＡ１に関連する標識の量が測定される。固定化ＨｔｒＡ１に関連する標識の量が対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第２の抗体がＨｔｒＡ１への結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。

【0272】

２．活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有するその抗ＨｔｒＡ１抗体を特定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、ＨｔｒＡ１の１つ以上の生物学的活性を阻害、遮断、拮抗、抑制、妨害、調節、及び／または低減することを含み得る。かかる生物学的活性をインビボ及び／またはインビトロで有する抗体も提供される。

【0273】

ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、かかる生物学的活性について試験される。ある特定の実施形態では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、ＨｔｒＡ１に結合し、例えば、以下の実施例に記載のＨ２−Ｏｐｔ基質、α−カゼイン、β−カゼイン、もしくはＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬカゼイン基質、または任意の他の好適なＨｔｒＡ１基質を含む１つ以上のＨｔｒＡ１基質に対するそのセリンプロテアーゼ活性を低減または阻害する。ある特定の実施形態では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、８００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ未満、またはそれ未満のＩＣ_５０で、１つ以上のＨｔｒＡ１基質に対するＨｔｒＡ１セリンプロテアーゼ活性を阻害する。ある特定の実施形態では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、Ｕ．Ｓ．２０１３／０１２９７４３の実施例１０に記載の一定露光マウスモデル等の眼疾患モデルにおいて、光受容細胞を分解から保護するか、外顆粒層の厚さを保護するか、または網膜電図機能活性を保護する。

【0274】

抗Ｄ因子抗体、またはその変異形もしくは断片（例えば、抗原結合断片）が、Ｄ因子に結合し、かつ生物学的効果、例えば、代替経路溶血の阻害を発揮することができるかを決定するために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２７３，３５２号の実施例２に記載のものを含む、ウサギ赤血球（ＲＢＣ）を使用した溶血阻害アッセイが使用され得る。かかる溶血阻害は、標準的なアッセイ（Ｋｏｓｔａｖａｓｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８：１７６３−７２，１９９７、Ｗｉｅｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４４：１５９−６０，２００６）を使用して決定され得る。かかるアッセイにおける補体活性化は、血清または血漿で開始され得る。血清または血漿中のＤ因子の適切な濃度（Ｐａｓｃｕａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ３４：５２９−５３６，１９９８；Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｊ．Ｍｏｒｌｅｙ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｊ．Ｗａｌｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０００）、Ｂａｒｎｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６７：３０３−３０９，１９８４）は、Ｐａｓｃｕａｌ ｅｔ ａｌ．（上記参照）及びＢａｒｎｕｍ ｅｔ ａｌ．（上記参照）、ならびに米国特許第８，２７３，３５２号の実施例４等の参考文献に記載されているものを含む、当該技術分野で既知の方法に従って日常的に決定され得る。本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体は、一般に、Ｄ因子に関連する生物学的活性を阻害することができる。例えば、１８μｇ／ｍＬ（血液中のヒトＤ因子のモル濃度の約１．５倍と同等、抗Ｄ因子抗体対Ｄ因子のモル比約１．５：１）の濃度で、抗体による代替補体活性の顕著な阻害が観察され得る（例えば、米国特許第６，９５６，１０７号を参照のこと）。

【0275】

３．安定性アッセイ
一態様では、抗ＨｔｒＡ１抗体の安定性（例えば、熱安定性）を決定するためのアッセイが提供される。例えば、抗体の安定性は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、円二色性（ＣＤ）、内在性タンパク質蛍光、示差走査熱量測定、分光法、光散乱（例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）及び静的光散乱（ＳＬＳ）、自己相互作用クロマトグラフィー（ＳＩＣ）を使用して決定され得る。アッセイの安定性は、例えば、ＡＡＰＨ応力試験及び／または熱応力試験との関連で、例えば、実施例４に記載の質量分析を使用して、本明細書に記載されるように決定され得る。

【0276】

Ｆ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかは、生物学的試料中のＨｔｒＡ１の存在の検出に有用である。「検出すること」という用語は、本明細書で使用されるとき、定量的検出または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、光受容細胞、網膜色素上皮細胞、外顆粒層の細胞、内顆粒層、ミュラー細胞、毛様体上皮、または網膜組織を含む試料等の細胞または組織を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、体液、例えば、硝子体または血液を含む。

【0277】

一実施形態では、診断または検出方法に使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体が提供される。さらなる一態様では、生物学的試料中のＨｔｒＡ１の存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、ＨｔｒＡ１への抗ＨｔｒＡ１抗体の結合を許容する条件下で、生物学的試料を本明細書に記載の抗ＨｔｒＡ１抗体と接触させることと、抗ＨｔｒＡ１抗体とＨｔｒＡ１との間で複合体が形成されるかを検出することとを含む。かかる方法は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。一実施形態では、例えば、ＨｔｒＡ１が患者の選択のためのバイオマーカーである場合、抗ＨｔｒＡ１抗体が、抗ＨｔｒＡ１抗体での治療に適格な対象を選択するために使用される。

【0278】

ある特定の実施形態では、抗ＨｔｒＡ１抗体での治療に好適な患者は、ＨｔｒＡ１プロモーター多型ｒｓ１１２００６３８（Ｇ／Ａ）等のＨｔｒＡ１遺伝子またはＨｔｒＡ１対照配列中の１つ以上の多型を検出することによって特定され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＤｅＷａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：９８９−９９２，２００６を参照のこと）。

【0279】

本発明の抗体を使用して診断され得る例示の障害としては、ＨｔｒＡ関連障害、眼障害、補体関連障害、及び子癇前症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、眼障害としては、例えば、湿潤ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮（ＧＡ）を含む）を含むＡＭＤ、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、またはポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0280】

いくつかの実施形態では、子癇前症は、本発明の抗体を使用して診断され得る。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１の参照レベルと比較した、対象由来の試料中のＨｔｒＡ１のレベルの増加は、対象が子癇前症を有するか、またはそれに感受性であることを示し得る。例えば、Ｔｅｏｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｃｅｎｔａ ３６（９）：９９０−９９５，２０１５を参照されたい。いくつかの実施形態では、血清ＨｔｒＡ１レベルは、本発明の抗体を使用して検出され得る。他の実施形態では、胎盤ＨｔｒＡ１レベルは、本発明の抗体を使用して検出され得る。

【0281】

ある特定の実施形態では、標識抗ＨｔｒＡ１抗体が提供される。標識としては、直接検出される標識または部分（蛍光標識、発色団標識、電子密度の高い標識、化学発光標識、及び放射性標識等）、ならびに間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用により検出される酵素またはリガンド等の部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示の標識には、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセイン等のフルオロフォア及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化させる酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼとカップリングされたウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等の複素環式オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定したフリーラジカル等が含まれるが、これらに限定されない。

【0282】

本発明の別の実施形態では、抗体が標識されなくてもよく、その存在は、抗体に結合する標識抗体を使用して検出され得る。

【0283】

本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ等の任意の既知のアッセイ法に用いられ得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。

【0284】

競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合について試験試料分析と競合する標識標準物の能力に依存する。試験試料中の抗原の量は、抗体に結合する標準物の量に反比例する。結合する標準物の量の決定を容易にするために、抗体は、抗体に結合する標準物及び分析が結合していないまま留まる標準物及び分析から好都合に分離され得るように、一般に、競合前または競合後に不溶化される。

【0285】

サンドイッチアッセイは、各々が検出されるべきタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープに結合することができる２つの抗体の使用を伴う。サンドイッチアッセイにおいて、試験試料分析物は、固体支持体上に固定化された第１の抗体によって結合され、その後、第２の抗体が分析物に結合し、それにより不溶性の三成分複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第２の抗体は、それ自体が検出可能な部分で標識され得る（直接サンドイッチアッセイ）か、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの種類は、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は、酵素である。

【0286】

免疫組織化学について、試料は新鮮なものであっても凍結されたものであってもよく、または例えば、パラフィン包埋され、ホルマリン等の保存剤で固定されてもよい。

【0287】

Ｇ．診断キット
便宜上、本発明の抗体（例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体または抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子抗体）は、キットで、すなわち、所定量の試薬と診断アッセイを行うための説明書とのパッケージ化された組み合わせで提供され得る。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、酵素（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）によって必要とされる基質及び補因子を含む。さらに、安定剤、緩衝液（例えば、遮断緩衝液または溶解緩衝液）等の他の添加物が含まれ得る。様々な試薬の相対量を広く変化させて、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供することができる。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、乾燥粉末、通常、凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得る。

【0288】

Ｈ．薬学的製剤
抗体またはその抗体変異形（例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体または抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子抗体）の治療製剤は、所望の純度を有するポリペプチドを、当該技術分野で典型的に用いられる任意の「薬学的に許容される」担体、賦形剤、または安定剤（これらは全て「賦形剤」と呼ばれる）と混合することによって、凍結乾燥された製剤または水溶液として保存するために調製され得る。例えば、緩衝剤、安定剤、保存剤、等張剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤、及び他の種々の添加物。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓｏｌ，Ｅｄ．（１９８０）を参照されたい。かかる添加物は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性でなければならない。

【0289】

緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲のｐＨを維持する助けとなる。それらは、好ましくは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明での使用に好適な緩衝剤としては、有機酸及び無機酸、ならびにその塩、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物等）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物等）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物等）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物等）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物等）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物等）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物等）、及び酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物等）が挙げられる。加えて、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、及びトリス等のトリメチルアミン塩が挙げられる。

【0290】

保存剤は、微生物成長を遅らせるために添加されてもよく、０．２ｗ／ｖ％〜１ｗ／ｖ％の範囲の量で添加され得る。本発明での使用に好適な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールが挙げられる。

【0291】

しばしば「安定剤」として知られる等張剤は、本発明の液体組成物の等張性を確保するために添加されてもよく、これには、多価糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが含まれる。

【0292】

安定剤は、幅広い区分の賦形剤を指し、その機能は、増量剤から、治療薬を可溶化するかまたは変性もしくは容器壁への付着の防止に役立つ添加物にまで及ぶ範囲であり得る。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上述のもの）；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン等のアミノ酸；イノシトール等のシクリトールを含む、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール等の有機糖または糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグルコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム等の還元剤を含有する硫黄；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０残基）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース、及びグルコース等の単糖類；ラクトース、マルトース、及びスクロース等の二糖類；ならびにラフィノース等の三糖類；ならびにデキストラン等の多糖類であり得る。安定剤は、活性タンパク質１重量部当たり０．１〜１０，０００重量の範囲で存在し得る。

【0293】

非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療用タンパク質（例えば、抗体）の可溶化を助けるために、かつ振動誘発性凝集から治療用タンパク質を保護するために添加されてもよく、これは、タンパク質の変性を引き起こすことなく製剤が剪断表面応力に曝露されることも可能にする。好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０等）、ポリオキサマー（１８４、１８８等）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０等）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在し得る。

【0294】

さらなる種々の賦形剤としては、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、及びビタミンＥ）、及び共溶媒が挙げられる。本明細書における製剤は、治療されている特定の適応症に対する必要に応じて、１つよりも多くの活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物も含有し得る。例えば、製剤中にＨｔｒＡ１結合アンタゴニスト（例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体）及びＤ因子結合アンタゴニスト（例えば、抗Ｄ因子抗体）を含むことが望ましい場合がある。別の例では、湿潤ＡＭＤ等の望ましくない血管新生に関連する眼障害を治療するために、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法、例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）等の抗血管新生療法をさらに提供することが望ましい場合がある。かかる活性成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。

【0295】

活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロフェア（ｍｉｃｒｏｐｈｅｒｅ）、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、あるいはマクロエマルジョン中に封入されてもよい。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓａｌ，Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0296】

徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、抗体またはその抗体変異形もしくは断片（例えば、抗原結合断片）を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成型品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性調製物の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）等の分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレンビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸等のポリマーが１００日間にわたる分子の放出を可能にする一方で、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長期間にわたって体内に留まる場合、それらは、３７℃の水分への曝露の結果として変性または凝集し、生物学的活性の損失及び免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略が講じられ得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加物を使用すること、及び特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって、安定化が達成され得る。

【0297】

Ｉ．治療方法及び組成物
本明細書に提供される抗ＨｔｒＡ１抗体（例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体及び抗ＨｔｒＡ１／抗Ｄ因子抗体）のうちのいずれも、治療方法に使用され得る。

【0298】

一態様では、薬剤として使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体が提供される。さらなる態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１関連障害の治療に使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害は、湿潤ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮（ＧＡ）を含む）を含むＡＭＤである。いくつかの例では、ＡＭＤは、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）である。

【0299】

別の実施形態では、本発明は、眼障害の治療に使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。いくつかの例では、眼障害は、湿潤（滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥（非滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡを含む）を含むＡＭＤ；糖尿病性網膜症（ＤＲ）及び他の虚血関連網膜症；眼内炎；ブドウ膜炎；脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）；未熟児網膜症（ＲＯＰ）；ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）；糖尿病性黄斑浮腫；病理学的近視；フォン・ヒッペル・リンドウ病；眼ヒストプラスマ症；網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）；角膜血管新生；または網膜血管新生である。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤ（例えば、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ））である。

【0300】

別の態様では、治療方法に使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体が提供される。ある特定の例では、本発明は、ＨｔｒＡ１関連障害を有する対象の治療方法に使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供し、本方法は、抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害は、湿潤ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）を含む）を含むＡＭＤである。いくつかの例では、ＡＭＤは、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）である。

【0301】

別の例では、本発明は、眼障害を有する対象の治療方法に使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供し、本方法は、抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を個体に投与することを含む。いくつかの例では、眼障害は、湿潤（滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥（非滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡを含む）を含むＡＭＤ；ＤＲ及び他の虚血関連網膜症；眼内炎；ブドウ膜炎；ＣＮＶ；ＲＯＰ；ＰＣＶ；糖尿病性黄斑浮腫；病理学的近視；フォン・ヒッペル・リンドウ病；眼ヒストプラスマ症；ＣＲＶＯ；角膜血管新生；または網膜血管新生である。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤ（例えば、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ））である。

【0302】

いくつかの例では、本発明は、対象における網膜または光受容細胞変性の阻害に使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。他の例では、本発明は、対象の眼におけるＨｔｒＡ１セリンプロテアーゼ活性の阻害に使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。上述の使用のうちのいずれかによる「対象」は、ヒトであり得る。

【0303】

本発明は、薬剤の製造または調製における抗ＨｔｒＡ１抗体の使用を提供する。例えば、一例では、薬剤は、ＨｔｒＡ１関連障害の治療用である。さらなる例では、薬剤は、ＨｔｒＡ１関連障害の治療方法に使用するためのものであり、本方法は、ＨｔｒＡ１関連障害を有する対象に薬剤の有効量を投与することを含む。薬剤の前述の使用のうちのいずれにおいても、本方法は、例えば、以下に記載の少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害は、湿潤ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）を含む）を含むＡＭＤである。いくつかの例では、ＡＭＤは、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）である。

【0304】

別の例では、薬剤は、眼障害の治療方法に使用するためのものであり、本方法は、眼障害を有する対象に薬剤の有効量を投与することを含む。いくつかの例では、眼障害は、湿潤（滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥（非滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡを含む）を含むＡＭＤ；ＤＲ及び他の虚血関連網膜症；眼内炎；ブドウ膜炎；ＣＮＶ；ＲＯＰ；ＰＣＶ；糖尿病性黄斑浮腫；病理学的近視；フォン・ヒッペル・リンドウ病；眼ヒストプラスマ症；ＣＲＶＯ；角膜血管新生；または網膜血管新生である。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤ（例えば、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ））である。

【0305】

本発明は、ＨｔｒＡ１関連障害の治療方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ＨｔｒＡ１関連障害を有する対象に抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害は、湿潤ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）を含む）を含むＡＭＤである。いくつかの例では、ＡＭＤは、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）である。さらなる例では、本方法は、以下に記載の少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することをさらに含む。上述の方法のうちのいずれかによる「対象」は、ヒトであり得る。

【0306】

本発明は、眼障害の治療方法を提供する。一実施形態では、本方法は、眼障害を有する対象に抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を投与することを含む。いくつかの例では、眼障害は、湿潤（滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥（非滲出性）ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡを含む）を含むＡＭＤ；ＤＲ及び他の虚血関連網膜症；眼内炎；ブドウ膜炎；ＣＮＶ；ＲＯＰ；ＰＣＶ；糖尿病性黄斑浮腫；病理学的近視；フォン・ヒッペル・リンドウ病；眼ヒストプラスマ症；ＣＲＶＯ；角膜血管新生；または網膜血管新生である。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤ（例えば、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ））である。

【0307】

本発明は、ＨｔｒＡ１関連障害、眼障害、及び／または補体関連障害の治療を必要とする対象におけるＨｔｒＡ１関連障害、眼障害、及び／または補体関連障害の治療方法を提供し、本方法は、対象に、ＨｔｒＡ１結合アンタゴニスト及び／またはＤ因子結合アンタゴニストの治療有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害または補体関連障害は、眼障害である。いくつかの実施形態では、眼障害は、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症、角膜血管新生、及び網膜血管新生からなる群から選択される。いくつかの例では、眼障害は、湿潤ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）を含む）を含むＡＭＤである。いくつかの例では、ＡＭＤは、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）である。前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＨｔｒＡ１−結合アンタゴニストは、抗ＨｔｒＡ１抗体またはその抗原結合断片、例えば、本明細書に記載の任意の抗ＨｔｒＡ１抗体またはその抗原結合断片であり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、及び（Ｆａｂ’）_２断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗原結合抗体断片は、Ｆａｂである。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、重鎖定常領域のヒンジ領域（例えば、上部ヒンジ）にトランケーションを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ重鎖定常領域は、２２１位（ＥＵ番号付け）で終端する。いくつかの実施形態では、２２１位のアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｆａｂの重鎖定常領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、ＩｇＧ１ Ｆａｂである。いくつかの例では、Ｄ因子結合アンタゴニストは、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片、例えば、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体のうちのいずれかである。

【0308】

別の態様では、本発明は、ＨｔｒＡ１関連障害、眼障害、及び／または補体関連障害の治療のための薬剤の製造における、ＨｔｒＡ１及びＤ因子の両方に特異的に結合する二重特異性抗体またはその抗原結合抗体断片の使用を提供する。いくつかの実施形態では、ＨｔｒＡ１関連障害及び／または補体関連障害は、眼障害である。いくつかの例では、眼障害は、湿潤ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性湿潤ＡＭＤを含む）及び乾燥ＡＭＤ（早期、中等度、及び進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）を含む）を含むＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤは、進行性乾燥ＡＭＤ（例えば、ＧＡ）である。二重特異性抗体は、本明細書に記載の抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかに由来する、ＨｔｒＡ１に特異的に結合する結合ドメインを含み得る。二重特異性抗体は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体のうちのいずれかに由来する、Ｄ因子に特異的に結合する結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、抗原結合抗体断片は、Ｆａｂ断片または（Ｆａｂ’）_２断片である。

【0309】

本明細書に記載され、及び／または当該技術分野で既知である抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれも、前述の方法または使用のうちのいずれかに使用され得る。例えば、いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＸ_１ＤＦＫＧ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）、（ｃ）ＥＧＧＶＸ_１Ｎ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（式中、Ｘ_１がＡｓｎまたはＳｅｒである）、（ｄ）ＩＴＳＴＸ_１ＩＸ_２Ｘ_３ＤＭＮ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘ_２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ_３がＡｓｐまたはＳｅｒである）、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＸ_１ＳＬＰＹＴ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３（式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＧｌｕである）を含む。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの例では、ＶＨドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＶＬドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、抗Ｄ因子抗原結合抗体断片は、ＣＡＳ登録番号１２７８４６６−２０−８を有するランパリズマブである。

【0310】

本発明の抗体が哺乳動物の治療に使用され得ることが企図される。一実施形態では、本抗体は、例えば、前臨床データを得る目的のために、非ヒト哺乳動物に投与される。治療される例示の非ヒト哺乳動物としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）、ならびに前臨床試験が行われる他の哺乳動物が挙げられる。かかる哺乳動物は、治療される疾患のための確立された動物モデルであってもよく、または目的とする抗体の毒性を研究するために使用されてもよい。これらの実施形態の各々において、用量漸増試験が哺乳動物において行われ得る。

【0311】

さらなる一態様では、本発明は、例えば、上述の治療方法のうちのいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施形態では、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗ＨｔｒＡ１抗体のうちのいずれかと、例えば、以下に記載の少なくとも１つの追加の治療薬とを含む。

【0312】

本明細書に記載の治療的使用及び方法のうちのいずれにおいても、抗ＨｔｒＡ１抗体は、Ｆａｂであり得る。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、重鎖定常領域のヒンジ領域（例えば、上部ヒンジ領域）にトランケーションを含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ重鎖定常領域は、２２１位（ＥＵ番号付け）で終端する。いくつかの実施形態では、２２１位のアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｆａｂの重鎖定常領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、ＩｇＧ１ Ｆａｂである。

【0313】

眼疾患または状態の予防または治療のための本発明の抗体（及び任意の追加の治療薬）は、例えば、眼内、眼球内、及び／または硝子体内注射、及び／または強膜近傍注射、及び／またはテノン嚢下注射、及び／または超脈絡膜（ｓｕｐｅｒｃｈｏｒｏｉｄａｌ）注射、及び／または点眼薬及び／または軟膏の形態の局所投与を含むが、これらに限定されない任意の好適な手段によって投与され得る。本発明のかかる抗体は、Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ ２００６）等の参考文献に記載されているものを含む、様々な方法、例えば、硝子体への化合物の徐放を可能にするデバイス及び／またはデポーとして硝子体内に送達され得る。一例では、デバイスは、化合物を長時間にわたって放出するミニポンプ、及び／またはマトリックス、及び／または受動拡散システム、及び／またはカプセル化された細胞の形態であり得る（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ ２００６）。局所、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、及び病巣内投与を含むが、これらに限定されない他の投与方法も使用され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。

【0314】

眼内、眼球内、または硝子体内投与のための製剤は、当該技術分野で既知の方法によって、かつ賦形剤を使用して調製され得る。効率的な治療のための重要な特徴は、眼を通した適切な浸透である。薬物が局所送達され得る眼の前部の疾患とは異なり、網膜疾患は、典型的には、より部位特異的なアプローチから利益を得る。点眼薬及び軟膏は、眼の後部にほとんど浸透せず、血液眼関門が、全身投与された薬物の眼組織への浸透を妨げる。したがって、ＡＭＤ及びＣＮＶ等の網膜疾患を治療するための薬物送達方法の選択肢は、典型的には、直接硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常、患者の状態、ならびに送達される薬物の特性及び半減期に応じた間隔で繰り返される。眼球内（例えば、硝子体内）浸透のために、通常、より小さなサイズの分子が好ましい。

【0315】

眼は、眼内薬物送達を困難にし得る多くの生物物理学的及び解剖学的特徴を有する。例えば、血液眼関門は、感染症から眼を保護するための防衛機構であるが、同時に、特に眼の後部の疾患の場合、薬物の浸透を困難にする。結果的に、有効性を改善するために、薬物のオンサイト生物学的利用能（例えば、眼内滞留時間）を達成及び維持するための高用量投与がしばしば望ましい。一方で、眼の後部の限られたスペースは、送達される薬物量を制限し、次いで、薬物が高濃度製剤で送達されることが好ましい場合がある。

【0316】

眼障害（例えば、ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮））を有する患者は、治療薬の長時間作用型／徐放送達からも利益を得ることができる。より少ない頻度での投薬は、患者に利便性の向上を提供し得、感染率の低下及び臨床効果の増大の潜在的利益を有する。高用量薬物の制御放出は、薬物の副作用を最小限に抑えることもできる。長時間作用型送達のための２つの有望な系は、ＰＬＧＡベースの固体インプラント及び埋め込み型ポート送達系（ＰＤＳ）である。両方の系は、長時間にわたってほぼゼロ次放出動態を提供する可能性を有する。ＰＬＧＡインプラントの場合、タンパク質薬物が疎水性ポリマーマトリックス中にカプセル化され、薬物放出は、ポリマーの緩徐な加水分解によって達成される。放出速度は、薬物負荷、ポリマー疎水性、またはポリマー分子量を変化させることによって制御され得る。ＰＤＳは、硝子体への放出がチタンフリットを含む多孔質金属膜によって制御される再充填可能なデバイスである。リザーバが低容量であるため、高いタンパク質濃度がＰＤＳでの効果的な送達に必要とされる。

【0317】

高濃度及び長時間作用型送達に加えて、またはその代わりに、タンパク質薬物が天然または合成ポリマーと共有結合でコンジュゲートされる、ポリシアリル化、ＨＥＳ化（ヒドロキシエチルデンプンとのコンジュゲーション）、及びＰＥＧ化等の翻訳後修飾によって、薬物の生物学的利用能（例えば、眼内滞留時間）の増加が達成または促進され得る。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．８：１２２１−３６，２０１１、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２３：９３−１０９，２０１１を参照されたい。ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のタンパク質への共有結合であるＰＥＧ化は、抗体断片治療薬の半減期の延長に特に有用な確立された技術である。Ｊｅｖｓｅｖａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．５：１１３−１２８，２０１０。

【0318】

薬物が曝露される条件は、使用される送達系によって異なる。固体ＰＬＧＡインプラントへの組み込みの場合、凍結乾燥または噴霧乾燥された薬物が使用される。インプラントは、溶融押出プロセスを使用して製造され、それにより、薬物が９０℃に近い温度に短時間曝露される。薬物は、放出中、固体状態のままであるが、ＰＬＧＡの分解は、薬物を低ｐＨ環境に曝露し得る。対照的に、ＰＤＳを用いて送達される薬物は、液体状態で高濃度に維持され、生理学的イオン強度及びｐＨで還元環境として特徴付けられる硝子体に曝露される。

【0319】

特定の眼障害または状態の治療に有効となる抗体またはその抗体変異形の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定され得る。可能な場合、ヒトにおける試験前に、最初にインビトロで、その後、有用な動物モデル系において用量反応曲線及び本発明の薬学的組成物を決定することが望ましい。

【0320】

追加の好適な投与手段には、非経口、肺内、及び鼻腔内、ならびに局所的治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短期であるか長期であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路、例えば、静脈内または皮下注射等の注射によるものであってもよい。単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。いくつかの例では、抗ＨｔｒＡ１抗体は、静脈内、筋肉内、皮内、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、腹腔内、腹腔、脳室内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼窩内、経口、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注射により、埋め込みにより、注入により、持続注入により、標的細胞を直接浸す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリーム剤中で、または脂質組成物中で投与され得る。

【0321】

ＡＭＤまたはＣＮＶ等の眼障害（例えば、補体関連眼障害）の治療の有効性は、眼内疾患の評価に一般的に使用される様々な終点によって測定され得る。例えば、失明が評価され得る。失明は、例えば、ベースラインから所望の時点までの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の平均値の変化による測定（例えば、ＢＣＶＡが、早期治療糖尿病性網膜症研究（ＥＴＤＲＳ）視力表及び４メートルの試験距離での評定に基づく場合）、ベースラインと比較して所望の時点で１５文字未満の視力を喪失した対象の割合の測定、ベースラインと比較して所望の時点で１５文字以上の視力を獲得した対象の割合の測定、所望の時点で２０／２０００以下のスネレン視力を有する対象の割合の測定、ＮＥＩ視覚機能アンケートの測定、例えば蛍光眼底造影による所望の時点でのＣＮＶのサイズ及びＣＮＶの漏出量の測定等を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知であり、及び／または本明細書に記載される任意の方法によって評価され得る。例えば、眼の検査の実施、眼内圧の測定、視力の評定、細隙灯圧の測定、眼内炎症の評定等を含むが、これらに限定されない眼の評定が行われ得る。

【0322】

疾患の予防または治療について、本発明の抗体の適切な投薬量は（単独で、または１つ以上の他の追加の治療薬と組み合わせて使用される場合）、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的または治療目的のために投与されるか、以前の療法、患者の病歴、及び抗体への応答、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は、一度に、または一連の治療にわたって患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与であるか、または持続注入によるかにかかわらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。いくつかの実施形態では、使用される抗体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。１つの典型的な１日用量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。状態に応じて数日間以上にわたる反復投与の場合、治療は、一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。

【0323】

いくつかの例では、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体の固定用量が、例えば、眼に投与される。いくつかの例では、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇまたは約５〜１５ｍｇ、例えば、約０．１ｍｇ／眼〜約０．５ｍｇ／眼、約０．５ｍｇ／眼〜約１ｍｇ／眼、約１ｍｇ／眼〜約１．５ｍｇ／眼、約１．５ｍｇ／眼〜約２ｍｇ／眼、約２ｍｇ／眼〜約２．５ｍｇ／眼、約２．５ｍｇ／眼〜約３ｍｇ／眼、約３ｍｇ／眼〜約３．５ｍｇ／眼、約３．５ｍｇ／眼〜約４ｍｇ／眼、約４ｍｇ／眼〜約４．５ｍｇ／眼、約４．５ｍｇ／眼〜約５ｍｇ／眼、約５ｍｇ／眼〜約５．５ｍｇ／眼、約５．５ｍｇ／眼〜約６ｍｇ／眼、約６ｍｇ／眼〜約６．５ｍｇ／眼、約６．５ｍｇ／眼〜約７ｍｇ／眼、約７ｍｇ／眼〜約７．５ｍｇ／眼、約７．５ｍｇ／眼〜約８ｍｇ／眼、約８ｍｇ／眼〜約８．５ｍｇ／眼、約８．５ｍｇ／眼〜約９ｍｇ／眼、約９ｍｇ／眼〜約９．５ｍｇ／眼、または約９．５ｍｇ／眼〜約１０ｍｇ／眼の本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体が眼に投与される。いくつかの例では、抗体は、約０．１ｍｇ／眼〜約２ｍｇ／眼、約０．１ｍｇ／眼〜約３ｍｇ／眼、約０．１ｍｇ／眼〜約５ｍｇ／眼、約０．１ｍｇ／眼〜約６ｍｇ／眼、約０．１ｍｇ／眼〜約７ｍｇ／眼、約０．１ｍｇ／眼〜約８ｍｇ／眼、約０．１ｍｇ／眼〜約９ｍｇ／眼、約０．１ｍｇ／眼〜約１０ｍｇ／眼、約０．５ｍｇ／眼〜約２ｍｇ／眼、約０．５ｍｇ／眼〜約３ｍｇ／眼、約１ｍｇ／眼〜約３ｍｇ／眼、または約２ｍｇ／眼〜約５ｍｇ／眼で使用される。いくつかの例では、約０．５ｍｇ／眼、約１ｍｇ／眼、約１．５ｍｇ／眼、約２ｍｇ／眼、約２．５ｍｇ／眼、約３ｍｇ／眼、約３．５ｍｇ／眼、約４ｍｇ／眼、約４．５ｍｇ／眼、約５ｍｇ／眼、約５．５ｍｇ／眼、約６ｍｇ／眼、約６．５ｍｇ／眼、約７ｍｇ／眼、約７．５ｍｇ／眼、約８ｍｇ／眼、約８．５ｍｇ／眼、約９ｍｇ／眼、約９．５ｍｇ／眼、約１０ｍｇ／眼、またはそれ以上の抗ＨｔｒＡ１抗体の固定用量が使用される。特定の例では、例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体の固定用量が、約２ｍｇ／眼で投与される。

【0324】

いくつかの実施形態では、用量は、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１１週間に１回、または１２週間に１回投与され得る。

【0325】

ＨｔｒＡ１結合アンタゴニスト（例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体）は、単独で、または少なくとも第２の治療化合物と組み合わせて投与され得る。ＨｔｒＡ１結合アンタゴニスト（例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体）及び任意の第２の治療化合物の投与は、同時に、例えば単一の組成物として、または２つ以上のはっきりと異なる組成物として、同じまたは異なる投与経路を使用して行われ得る。あるいは、または加えて、投与は、任意の順序で連続して行われ得る。ある特定の実施形態では、分単位から日単位、週単位、月単位の範囲の間隔が、２つ以上の組成物の投与間に存在し得る。例えば、ＨｔｒＡ１結合アンタゴニスト（例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体）が最初に投与され、続いて、第２の治療化合物が投与され得る。しかしながら、同時投与、またはＨｔｒＡ１結合アンタゴニスト（例えば、本発明の抗ＨｔｒＡ１抗体）前の第２の治療化合物の投与も企図される。一例では、ＨｔｒＡ１結合アンタゴニストは、抗ＨｔｒＡ１抗体、例えば、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で既知の任意の抗ＨｔｒＡ１抗体である。一例では、第２の治療化合物は、Ｄ因子結合アンタゴニストである。さらなる一例では、Ｄ因子結合アンタゴニストは、抗Ｄ因子抗体、例えば、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で既知の任意の抗Ｄ因子抗体である。特定の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、ランパリズマブである。さらなる実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、１〜１５ｍｇの用量で、例えば、１０ｍｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ランパリズマブは、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投与される。ある特定の実施形態では、追加の治療薬は、眼における望ましくない血管新生に関連する眼障害、例えば、湿潤ＡＭＤ等の治療に好適な治療薬である。好適な治療薬としては、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）を含む抗ＶＥＧＦ抗体及び抗体断片、及び抗ＶＥＧＦＲ１抗体及び関連分子（例えば、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ；ＥＹＬＥＡ（登録商標）））等の抗血管新生薬；補体因子Ｃ２アンタゴニスト（例えば、抗ＣＦＣ２抗体を含む）等の補体系の阻害剤；ならびにＩＬ−６結合アンタゴニスト（例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））及びＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））等の抗炎症剤が挙げられる。他の実施形態では、望ましくない眼内血管新生に関連する疾患または障害の治療は、抗ＨｔｒＡ１抗体及び光線力学療法（例えば、ＭＡＣＵＧＥＮ（商標）またはＶＩＳＵＤＹＮＥ（商標）による）の組み合わせを伴う。

【0326】

上述のかかる併用療法は、併用投与（同じまたは別個の製剤中に２つ以上の治療薬が含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療薬（複数可）の投与前、投与と同時に、及び／または投与後に行われ得る。一実施形態では、ＨｔｒＡ１結合アンタゴニスト（例えば、抗ＨｔｒＡ１抗体）の投与及び追加の治療薬の投与は、互いに約１ヶ月以内、または約１、２、もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５、もしくは６日以内に行われる。

【0327】

上述の製剤または治療方法のうちのいずれも、抗ＨｔｒＡ１抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して行われ得ることが理解される。

【0328】

Ｊ．製品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防、及び／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。本製品は、容器と、容器上のもしくは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静脈注射用溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、または別の組成物と組み合わせて、状態の治療、予防、及び／または診断に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択した状態を治療するために使用されることを示す。さらに、本製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を内部に収容した第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞傷害性薬剤、またはさもなければ治療薬を含む組成物を内部に収容した第２の容器とを含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、組成物が特定の状態を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは、または加えて、本製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

【実施例】

【0329】

以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述の概要を考慮して、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。

【0330】

［ＨｔｒＡ１に結合する安定した高効力の高親和性抗体の開発］
以下の実験の目標は、ＨｔｒＡ１に対してより高い効力及びより高い親和性を有する新たな抗ＨｔｒＡ１抗体を発見することであった。

【0331】

最初に、ｍＨｔｒＡ１ノックアウトマウスを作製した。恐らくマウス及びヒトＨｔｒＡ１タンパク質が９８％の配列同一性を共有するため、ＨｔｒＡ１を発現するマウスからハイブリドーマを作製する最初の試みが成功しなかったため、ノックアウトマウスを使用する必要があった。

【0332】

次に、ＨｔｒＡ１ノックアウトマウスをｍＨｔｒＡ１のプロテアーゼドメインで免疫化した。結果として得られたハイブリドーマをＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、７５個のＥＬＩＳＡ陽性クローンを特定した。これらの７５個のクローンを、ＨｔｒＡ１プロテアーゼ基質の切断を阻害する能力について試験した。７５個中１０個のクローンが、ＨｔｒＡ１プロテアーゼ活性を阻害することを示した。

【0333】

これらのクローンのうちの７個を、それらのプロテアーゼ活性を阻害する能力、ヒト及びマウスＨｔｒＡ１に結合する能力、及びｍｕＨｔｒＡ３及びｍｕＨｔｒＡ４よりｍｕＨｔｒＡ１に選択的に結合する能力に基づいて、さらなる分析のために選択した。これらの７個のクローンをさらなるスクリーニングに供し、４個が、対照抗体ＹＷ５０５．９４と比較して、ＨｔｒＡ１に対する効力が改善されていることが見出された。これらの抗体のうちの２個、１５Ｈ６及び９Ｂ１２を、効力及び選択性を含むそれらの好ましい分子プロファイルに基づいて、さらなる開発のために選択した。

【0334】

以下に概説するように、選択された抗体の超可変領域をヒトフレームワークにグラフトした。これらの残基を個別に交換し、かつヒト及びマウスＨｔｒＡ１への結合を試験することによって、マウス軽鎖Ｖｅｒｎｉｅｒ参照の重要性を１５Ｈ６について試験した。１つの置換が結合を消失させ、２つの置換が結合を減少させ、２つの置換がマウスＨｔｒＡ１への結合にのみ影響し、３つの置換は結合に著しい影響を与えなかった。これらの３つの置換を抗体１５Ｈ６．ｖ１に導入して、抗体１５Ｈ６．ｖ２を作製した。

【0335】

その後、１５Ｈ６．ｖ２を操作して、安定性を改善した。酸化（ＨＶＲ−Ｌ３におけるＷ９１）、クリッピング（ＨＶＲ−ＬＣにおけるＮ９４ Ｐ９５）、及び脱アミド化（ＨＶＲ−Ｈ２におけるＤ５５ Ｇ５６）をもたらし得る潜在的に不安定な残基を特定した。Ｗ９１の置換は、結合に実質的に影響を与えた。Ｎ９４位での４つの置換を試験した。これらの置換のうちの２つは結合に影響を与えたが、２つをさらなる分析のために選択した。Ｄ５５位での４つの置換を試験した。これらの置換のうちの１つのみが、親分子に匹敵する結合を示した。

【0336】

次のステップは、ＨｔｒＡ１に対するｈ１５Ｈ６．ｖ２結合の親和性を改善することであった。第１のステップとして、ディープシーケンシングを使用して、ｈ１５Ｈ６．ｖ２の構造／機能関係を調べた。この実験で試験した多くの個々の変異のうち、およそ１９の個々の変異がＨｔｒＡ１に対する親和性を改善することが見出された。最も遅いオフ速度を有するＬＣ及びＨＣ変異の組み合わせを含む抗体を設計及び試験し、ＨｔｒＡ１に対する効力及び親和性が改善された変異形抗体を特定した。最善の親和性及び効力を有する変異形も操作して、上述の安定化置換を導入した。結果として得られた変異形のうち、ｈ１５Ｈ６．ｖ４がＨｔｒＡ１に対して最も高い効力を有することが見出された。

【0337】

ＨｔｒＡ１に結合したＦａｂ形式でのｈ１５Ｈ６．ｖ４の構造を、Ｘ線結晶学及び電子顕微鏡法により決定した。この構造分析は、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＦａｂがＨｔｒＡ１タンパク質の「ＬＡループ」に密接に結合することを明らかにした。ｈ１５Ｈ６．ｖ４により結合されるエピトープは、対照抗体ＹＷ５０５．９４により結合されるものとははっきりと異なる。本発明が任意の特定の機構に拘束されるようには意図されていないが、ｈ１５Ｈ６．ｖ４とＨｔｒＡ１のＬＡループとの間の密接な相互作用が、ＹＷ５０５．９４と比較して、この抗体の親和性及び効力の著しい改善を説明することが可能である。

【0338】

上述の実験は、以下により詳細に概説される。

【0339】

実施例１：ハイブリドーマアプローチを使用した抗ＨｔｒＡ１抗体の生成
Ａ．培地及び抗体
ＣＬＯＮＡＣＥＬＬ（商標）−ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂ（カタログ番号０３８０２）、Ｍｅｄｉｕｍ Ｃ（カタログ番号０３８０３）、Ｍｅｄｉｕｍ Ｄ（カタログ番号０３８０４）、及びＭｅｄｉｕｍ Ｅ（カタログ番号０３８０５）を、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。電気融合に使用されるＣＹＴＯＦＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ Ｃ（カタログ番号ＬＣＭ−Ｃ）を、Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ヤギＦ（ａｂ’）_２抗マウスＩｇを、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ（カタログ番号１０１２−１１）から入手し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体を、Ｓｉｇｍａから入手した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（カタログ番号ＴＭＢＷ−１０００−０１）及びＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号ＢＳＴＰ−１０００−０１）を、ＢｉｏＦｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。

【0340】

Ｂ．マウスのインビボでの免疫化
５匹のＨｔｒＡ１ノックアウトマウス（ＨｔｒＡ１．ｎｏｎｅｏ．ＢＡＬＢ．ｋｏ．Ｃ１−３）を、３〜４日間隔で合計１２回のブーストでの足蹠注射（マウス１匹当たり２μｇ／注射）、続いて、リン酸緩衝生理食塩水中での抗原での２回の融合前ブーストにより、モノホスホリル脂質Ａ／トレハロースジコリノミコレートアジュバント中に懸濁させた精製されたＨｉｓタグ付き組換えマウスＨｔｒＡ１プロテアーゼドメイン（本明細書においてｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓ（配列番号１５３）と称され、ＷＯ２０１３／０５５９９８の実施例２を参照されたい）で免疫化した。最後のブーストの３日後、免疫化されたマウスの脾臓及びリンパ節由来のリンパ球を収集し、単離した。ＷＯ２０１３／０５５９９８の実施例２に記載されるように、ｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓを精製により注射のために調製した。

【0341】

Ｃ．細胞融合、ハイブリドーマスクリーニング、及びサブクローニング
２匹のマウス（番号７４８及び７４９）から単離したマウス脾臓細胞を、Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ ＣＥＥＦ−５０装置（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＳＰ２／０骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と融合させた。手短に言えば、ＣＹＴＯＦＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ Ｃで２回洗浄した後、単離した脾臓細胞及びＳＰ２／０細胞を１：１比で混合し、その後、ＣＹＴＯＦＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ Ｃ中に１０００万細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させた。電気融合を製造業者の指針に従って行った。融合した細胞を、７％ＣＯ_２インキュベータ内で、ＣＬＯＮＡＣＥＬＬ（商標）−ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃ中、３７℃で一晩培養した。翌日、融合した細胞を遠心分離し、その後、１０ｍＬのＣＬＯＮＡＣＥＬＬ（商標）−ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃ中に再懸濁させ、その後、選択的試薬ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ）を含有する９０ｍＬのメチルセルロース系ＣＬＯＮＡＣＥＬＬ（商標）−ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄと穏やかに混合した。細胞を４０×１００ｍｍのペトリ皿（カタログ番号３５１０２９、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にプレーティングし、７％ＣＯ_２インキュベータ内で、３７℃で成長させた。１０日間インキュベートした後、１４２９個の単一ハイブリドーマクローンを、ＣＬＯＮＥＰＩＸ（商標）システム（Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して採取し、２００μＬ／ウェルＣＬＯＮＡＣＥＬＬ（商標）−ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅを有する１５×９６ウェル細胞培養プレート（番号３５３０７５、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移した。ハイブリドーマ培養培地を交換し、３日後、ハイブリドーマ上清を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってスクリーニングして、ｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓへの結合についてアッセイした。

【0342】

ＥＬＩＳＡを標準プロトコルに従って行った。手短に言えば、９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１００μＬ／ウェルのｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−ＨｉｓまたはｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓ（配列番号１５４）で、０．０５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍＬで、４℃で一晩コーティングした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、Ｓｉｇｍａ）で３回洗浄した後、プレートを、ＢＳＡを有する１００μＬのＥＬＩＳＡアッセイ希釈剤で遮断した。１００μＬの培養上清または希釈した精製モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃと１時間インキュベートした。３回洗浄した後、結合した酵素を、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を５分間添加することによって検出した。反応を、１００μＬ／ウェルの停止試薬（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加することによって停止させ、続いて、色を吸光度６５０ｎｍ（Ａ_{６５０ｎｍ}）で検出した。１０５個の初期ＥＬＩＳＡ陽性上清を特定した。３日間増殖及び培養した後、これらのクローンを後続のＥＬＩＳＡで再スクリーニングし、１０５個のクローンのうちの７５個が、ｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓへの結合について依然としてＥＬＩＳＡ陽性であることを確認した（図１Ａ及び１Ｂ）。これらの７５個のクローンの大半は、ヒトＨｔｒＡ１プロテアーゼドメインにも結合した（図１Ａ及び１Ｂ）。

【0343】

次に、７５個のＥＬＩＳＡ陽性クローンを、インビトロアッセイを使用して試験して、ヒトＨｔｒＡ１プロテアーゼドメイン（ｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓ、配列番号１５４）による基質の切断を阻害するハイブリドーマ上清の能力を評定した。ＥＮＺＣＨＥＫ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）アッセイを使用した。このアッセイは、基質としてｐＨ非感受性緑色蛍光ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ色素で高度に標識されたカゼイン誘導体を用いる。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ色素の蛍光を、全長標識基質において分子内消光する。ｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤによる基質の切断は、蛍光ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ標識ペプチドを放出し、蛍光シグナルの増加をもたらす（図２Ａ）。手短に言えば、ハイブリドーマ上清及びＨｔｒＡ１−ＰＤ（２０ｎＭ ｈＨｔｒＡ１−ＰＤ、４０μＬのｈＨｔｒＡ１−ＰＤ：６０μＬの上清）を、最終体積２００μＬ中緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．０）中で、３７℃で２０分間インキュベートした。５μｇ／ｍＬのＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ標識基質を添加し、蛍光（ミリ相対蛍光単位（ｍＲＦＵ）／分）を２０分間読み取った。この遮断アッセイを使用して、７５個のクローンのうちの１０個が、ヒトＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介基質切断を阻害することが見出された（図２Ｂ及び２Ｃ）。図３Ａ及び３Ｂは、ｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤと比較した、ｍｕＨｔｒＡ１−ＰＤの活性を阻害するクローンのサブセットの能力の比較を示す。

【0344】

限界希釈による少なくとも２ラウンドの単一細胞サブクローニング後、様々な特性を有する７個のクローン（２０Ｅ２、１９Ｂ１２、１２Ａ５、３Ａ５、１５Ｈ６、１５Ｅ３、及び１９Ｇ１０）をスケールアップし、上清を抗体精製及びさらなる評定のために収集した。これらのクローンを、インビトロでＨｔｒＡ１活性を阻害する能力及びｍｕＨｔｒＡ３（１９Ｂ１２）への結合に部分的に基づいて選択した。これらの７個のクローンを、免疫組織化学においてｍｕＨｔｒＡ１を検出する能力、ならびにマウスＨｔｒＡ３−ＰＤ及びマウスＨｔｒＡ４−ＰＤに結合する能力（ＥＬＩＳＡにより評定）についても試験した。表２は、これらの７個のクローンの定性的特性の要約を示す。
表２：抗体精製のために選択された７個の最終クローンの特性

【0345】

次のステップは、上で選択された７個の抗体が、ＦＲＥＴアッセイで測定した場合、ＨｔｒＡ１媒介切断を阻害するかを決定することであった。

【0346】

ハイブリドーマ上清を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより精製し、続いて、滅菌濾過し（０．２μｍ孔径、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＮＹ，ＵＳＡ）、ＰＢＳ中に４℃で保存した。機能アッセイでさらに試験する前に、精製したモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにより確認した。精製したｍＡｂのアイソタイプをＩＳＯＳＴＲＩＰ（商標）マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により決定した。

【0347】

精製した抗体を、ＦＲＥＴに基づく遮断アッセイ（例えば、Ｈ２−Ｏｐｔアッセイ）において、ＨｔｒＡ１の活性を阻害する能力について試験した。このアッセイでは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、フェルスター共鳴エネルギー移動とも称される）基質の切断を阻害する抗体の能力を決定した。１６００Ｄａの分子量を有するＦＲＥＴペプチド基質Ｈ２−Ｏｐｔは、ドナーＭｃａ（７−メトキシクマリン−４−イル−アセチル）及びアクセプター（クエンチャー）Ｄｎｐ（Ｎ−２，４−ジニトロフェニル）を含む。ＦＲＥＴペプチド基質の全長配列は、（Ｍｃａ）ＩＲＲＶＳＹＳＦ（Ｄｎｐ）ＫＫ（配列番号１５２）である。インタクトなペプチド基質では、消光部分Ｄｎｐは、Ｍｃａドナーの蛍光を消光する。ＦＲＥＴペプチド基質のタンパク分解的切断は、フルオロフォア及びクエンチャーを分離させ、それによりＭｃａ蛍光の消光を緩和し、蛍光シグナルの増加をもたらす（図４Ａ）。このアッセイを、以下の実施例３のＦ節に記載のＨ２−Ｏｐｔアッセイ条件を使用して行った。蛍光強度の経時的増加は、基質の加水分解の程度に関連する。抗体を、５ｎＭ、５０ｎＭ、及び５００ｎＭの濃度で試験した。精製した抗ＨｔｒＡ１抗体のうちの５つ（１５Ｈ６、１９Ｂ１２、３Ａ５、１２Ａ５、及び２０Ｅ２）は、ヒト及びマウスＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介基質切断を遮断する能力を保持した（図４Ｂ及び４Ｃ）。

【0348】

次に、全長ＨｔｒＡ１媒介基質切断を阻害する精製した抗体の能力を試験した。精製した全長（ＦＬ）ｍｕＨｔｒＡ１またはｈｕＨｔｒＡ１を使用して、前段落に記載のＦＲＥＴに基づく遮断アッセイを用いた。ｍｕＨｔｒＡ１−ＦＬ及びｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬを、ＷＯ２０１３／０５５９９８の実施例２に記載されるように精製した。１５Ｈ６及び１９Ｂ１２を含む精製された抗体は、ｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬ（図５Ａ〜５Ｂ）及びｍｕＨｔｒＡ１−ＦＬ（図５Ｃ〜５Ｄ）の活性を阻害した。このアッセイでは、クローン１５Ｈ６は、ｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬを０．７ｎＭのＩＣ５０で阻害し、これは、陽性対照抗体ＹＷ５０５．９４のＩＣ５０と比較して約２倍改善された。１５Ｈ６は、ｍｕＨｔｒＡ１−ＦＬを１．１ｎＭのＩＣ５０で阻害し、これは、陽性対照抗体ＹＷ５０５．９４と比較して約５倍改善された。クローン１９Ｂ１２は、ｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬを１．４ｎＭのＩＣ５０で阻害し、ｍｕＨｔｒＡ１−ＦＬを１．０ｎＭのＩＣ５０で阻害した。選択された抗体を、以下のＤ節に記載されるように配列決定した。これらの５つの抗体の配列を、図６Ａ及び図６Ｂに示す。２つの抗体１５Ｈ６及び１９Ｂ１２を、それらの効力及びそれらの選択性を含むそれらの好ましい分子プロファイルに基づいてさらなる開発のために選択した。これらの抗体の再編成については、以下のＥ節に記載される。

【0349】

Ｄ．ハイブリドーマクローンからの抗体配列決定
ｉ．９６ウェル形式でｃＤＮＡ末端の５’−高速増幅（５’−ＲＡＣＥ）を使用したハイブリドーマ細胞からの可変領域遺伝子配列のクローニング
各ハイブリドーマクローンについて、約２５μＬの対数期増殖細胞（０．５〜１．０×１０^６細胞／ｍＬ）を、組織培養プレートから９６ウェルＵ底プレートのウェルに移した。その後、１５０μＬの冷１倍ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。上清を除去し、細胞ペレットを２５μＬの冷１倍ＰＢＳ中に再懸濁させた。

【0350】

ｉｉ．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）反応
以下からなるマスターミックスをエッペンドルフチューブ内で調製した（５０ウェル用）：２．５μＬのＲＮＡＳＥＯＵＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１０７７７０１９）、１２．５μＬの１０倍合成緩衝液（５倍ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）緩衝液）、１２．５μＬのジチオスレイトール（ＤＴＴ）（０．１Ｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号Ｐ／ＮＹ００１４７）、６．２５μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１８４２７−０１３）、１２．５μＬの２．５％ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）、２ｍｇ／ｍＬで６．２５μＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＢｉｏＬａｂｓ番号９００１Ｓ）、２５μＬのＲＡＣＥ４ｍｕＨＣプライマー（ＰＣＲグレード水中、１：１００）（軽鎖（ＬＣ）の配列決定のためのＲａｃｅ ３カッパプライマーの代用）、３７．５μＬのＰＣＲグレード水、及び１０μＬのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）３酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１８０８０−０９３）。Ｒａｃｅ４ｍｕＨＣ縮重プライマーヌクレオチド配列は、ＴＴＴ ＹＴＴ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＫＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＣ（配列番号１３９）であり、ここで、Ｙは、ＣまたはＴをコードし、Ｋは、ＧまたはＴをコードする。Ｒａｃｅ ３カッパプライマーヌクレオチド配列は、ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＡＡ ＧＡＡ Ｇ（配列番号１４０）である。

【0351】

その後、２．５μＬ／ウェルのマスターミックスを９６ウェルＰＣＲ反応プレートに移した。１μＬの細胞／ウェルをプレートに添加し、プレートを３０秒間の短時間にわたって回転させ、その後、プレートを振盪した。プレートをＰＣＲ機内に設置し、プログラムを４５℃で３０分間、続いて、５０℃で３０分間に設定した。このプレートをプレートＡとラベル付けした。

【0352】

ｉｉｉ．テーリング反応
１０倍ストックテーリング緩衝液を、以下の成分で作製した（５０ウェル用）：５μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２、５μＬの０．１Ｍ ＤＴＴ、５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０μＬの１００ｍＭ ｄＧＴＰ、及び２５μＬのＰＣＲグレード水。

【0353】

作業溶液を、以下の成分で作製した（５０ウェル用）：５０μＬの１０倍ストックテーリング緩衝液、３１２．５μＬのＰＣＲグレード水、及び１２．５μＬの３００単位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｍ８２８Ａ／Ｃ）。

【0354】

その後、この作業溶液をＰＣＲ反応プレートＡに７．５μＬ／ウェルで添加した。その後、プレートＡをＰＣＲ機内に３７℃で１時間、続いて、６５℃で５分間置いた。このプレートをプレートＡ／Ｂとラベル付けして、このプレートのテーリングを区別した。

【0355】

ｉｖ．第１のＰＣＲ反応
以下からなるマスターミックスを１５ｍＬファルコンチューブ内で調製した（５０ウェル用）：１０５０μＬのＰＣＲグレード水、５００μＬの５倍ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲ反応緩衝液、５００μＬのＧＣ−ｍｅｌｔ試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ番号Ｓ１０９１）、５０μＬの順方向プライマーＤＣ５ｄｎ、５０μＬのＲａｃｅ７ｍｕＨＣ（ＬＣのためのＲａｃｅ ２カッパプライマー）、５０μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、及び５０μＬのＧＣ ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ番号Ｓ１０８８）。Ｒａｃｅ７ｍｕＨＣ縮重プライマーヌクレオチド配列は、ＣＡＲ ＧＴＣ ＡＭＤ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＲＣ ＴＣＡ Ｇ（配列番号１４１）であり、ここで、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかをコードし、Ｍは、ＡまたはＣのいずれかをコードし、Ｄは、ＧまたはＡまたはＴのいずれかをコードする。Ｒａｃｅ ２カッパプライマーヌクレオチド配列は、ＧＡＧ ＧＣＡ ＣＣＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＡＣ（配列番号１４２）である。

【0356】

その後、４５μＬのこのマスターミックスを新たなＰＣＲ反応プレートのウェルに移し、その後、プレートＡ／Ｂからの鋳型１μＬを添加した。その後、このプレートをＰＣＲ機内に置き、以下に列記されるように、アニーリング温度の低下を伴うタッチダウンＰＣＲ法の下で起動させた。このプレートをプレートＣとラベル付けした。

【0357】

タッチダウンＰＣＲ法：
９６℃で４分間
［９６℃で４５秒間、６４℃で３０秒間、６８℃で９０秒間］を３サイクル、［９６℃で４５秒間、６１℃で３０秒間、６８℃で９０秒間］を３サイクル、［９６℃で４５秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で９０秒間］を３サイクル、［９６℃で４５秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で９０秒間］を３サイクル、［９６℃で４５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間］を３サイクル
［９６℃で４５秒間、５２℃で３０秒間、６８℃で９０秒間］を２５サイクル
６８℃で５分間、続いて、４℃で保持。

【0358】

その後、３μＬのＰＣＲ産物を２％臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）Ｅ−ＧＥＬ（登録商標）上で泳動させ、バンドを確認した。ＥｘｏＩ／エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を１０μＬ／ウェルで添加し、ＰＣＲ機内に３７℃で４５分間、続いて、８５℃で１５分間置いた。ＥｘｏＩ／ＳＡＰマスターミックスを５０ウェル用に作製した：２．５μＬの２０単位／μＬエキソヌクレアーゼＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ番号ＥＮ０５８２）、２５μＬのＳＡＰ（ＵＳＢ番号７００９２Ｙ）、４７２．５μＬのＰＣＲグレード水。ＰＣＲ産物の１：４希釈物を水中で作製した。Ｒａｃｅ７ｍｕＨＣプライマーを重鎖（ＨＣ）の配列決定に使用し、Ｒａｃｅ７．１ｍｕＬＣプライマーをＬＣの配列決定に使用した。Ｒａｃｅ７．１ｍｕＬＣプライマーヌクレオチド配列は、ＡＣＴ ＧＣＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＡＧ（配列番号１４３）である。

【0359】

ｖ．ゲル濾過及び質量分析特徴付け
ゲル濾過分析のために、２００ｍＭ Ｋ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．０を移動相として使用して、１０ｍＬの精製試料をＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）Ｓｕｐｅｒ ＳＷ３０００（４．６ｍｍ内径×３０ｃｍ、ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に０．３５ｍＬ／分で注入した。およそ２ｍｇの精製ＩｇＧを、５０ｍＭジチイオレイトール（ｄｉｔｈｉｏｒｅｉｔｏｌ）で、３７℃で２０分間にわたって還元し、ＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びアセトニトリル勾配を使用してオンライン逆相分離した後に、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ／ＭＳ ６２２４）により分析した。インタクトな質量を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定性分析ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して収集されたｍ／ｚスペクトルの最大エントロピー逆重畳積分により決定した。

【0360】

ｖｉ．結果
１９Ｂ１２、２０Ｅ２、３Ａ５、１２Ａ５、及び１５Ｈ６の重鎖可変領域（ＶＨ）の配列を、図６Ａに示す。１９Ｂ１２、２０Ｅ２、３Ａ５、１２Ａ５、及び１５Ｈ６の軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列を、図６Ｂに示す。これらのクローンは、特有の重鎖及び軽鎖を有する。質量分析データは、配列データを裏付けた（表３及び４を参照のこと）（例えば、Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１２（９）：１８３２−１８４２，２０１５を参照のこと）。
表３：質量分析により決定されたＨＣ質量

表４：質量分析により決定されたＬＣ質量

【0361】

Ｅ．抗体１５Ｈ６及び１９Ｂ１２の再編成
ｉ．抗体１５Ｈ６及び１９Ｂ１２のＴＯＰＯ（登録商標）クローニング
ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングを行って、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物（上述のもの）の直接配列決定から得られた抗体クローン１５Ｈ６及び１９Ｂ１２の可変領域配列を確認した。ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング反応を、ｐＣＲ（商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｋ４５７５−０２）マニュアルに記載されるように行った。手短に言えば、２μＬのＰＣＲ産物、２μＬの水、１μＬのｐＣＲ（商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター、及び１μＬの含塩溶液をチューブ内で組み合わせ、混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、反応物を氷上に置き、２μＬのこのＴＯＰＯ（登録商標）クローニング反応物をＯＮＥ−ＳＨＯＴ（登録商標）化学的にコンピテントなＴＯＰ１０ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｋ４５７５−０２）の解凍バイアルに添加し、ピペッティングせずに混合した。反応物を氷上で５〜３０分間インキュベートした。その後、細胞を振盪せずに４２℃で３０秒間熱ショックした。チューブを直ちに氷に移した。２５０μＬの室温ＳＯＣ培地を添加した。チューブに蓋をし、３７℃で１時間、２００ｒｐｍで水平に振盪した。次に、各形質転換体から５０μＬを、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する予め加温したＬＢ寒天プレート上に広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを翌日採取し、プラスミド精製を行った。配列を確認し、各々ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター中の１５Ｈ６ ＶＨ及びＶＬ配列、ならびに１９Ｂ１２ ＶＨ及びＶＬ配列を含有する特定のウェルを、無制限クローニングにおけるソースベクターとして使用するために選択した。

【0362】

ｉｉ．ｍＩｇＧ２ａへの無制限クローニング
ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにおける重鎖及び軽鎖可変領域を、ＬＣについて以下の方法でＰＣＲミックスを設定することによって増幅した：０．５μＬの鋳型ＤＮＡ（ミニプレップソースベクター）、４μＬの１５Ｈ６ ＶＬ順方向プライマー、４μＬの１５Ｈ６ ＶＬ逆方向プライマー、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、２０μＬの５倍ＨＦ緩衝液、１μＬのＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｆ−５４９Ｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２Ｕ／μＬ）、及び６８．５μＬの水。ＨＣのクローニングのための反応ミックスを、１５Ｈ６ ＶＨ順方向及び逆方向プライマーを使用したこと以外は、同じ方法で設定した。１９Ｂ１２ ＰＣＲミックスを、１９Ｂ１２プライマーを使用したこと以外は、１５Ｈ６ミックスと同じ方法で設定した。プライマー配列は、以下の通りであった：

【0363】

１５Ｈ６ ＶＬ順方向プライマーヌクレオチド配列：ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＴＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＡＴＴ ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣ（配列番号１４４）。

【0364】

１５Ｈ６ ＶＬ逆方向プライマーヌクレオチド配列：ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＣＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＧ（配列番号１４５）。

【0365】

１５Ｈ６ ＶＨ順方向プライマーヌクレオチド配列：ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＣＧ ＴＡＣ ＧＣＣ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧ（配列番号１４６）。

【0366】

１５Ｈ６ ＶＨ逆方向プライマーヌクレオチド配列：ＧＧＧ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＣＴ ＴＧＡ ＣＣＣ（配列番号１４７）。

【0367】

１９Ｂ１２ ＶＬ順方向プライマーヌクレオチド配列：ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＴＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＡＡＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＣＡＡ ＴＣＴ ＣＣ（配列番号１４８）。

【0368】

１９Ｂ１２ ＶＬ逆方向プライマーヌクレオチド配列：ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＣＣＧ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＧ（配列番号１４９）。

【0369】

１９Ｂ１２ ＶＨ順方向プライマーヌクレオチド配列：ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＣＧ ＴＡＣ ＧＣＣ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧ（配列番号１５０）。

【0370】

１９Ｂ１２ ＶＨ逆方向プライマーヌクレオチド配列：ＧＧＧ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＣＧ ＧＴＴ ＣＣＴ ＴＧＡ ＣＣＣ（配列番号１５１）。

【0371】

ＰＣＲサイクル条件は、以下の通りであった：
９８℃で３０秒間
［９８℃で１５秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３５秒間］を３５サイクル
７２℃で１０分間

【0372】

増幅したＶＨ及びＶＬをプライマーとして使用して、１５Ｈ６ ＬＣについて以下の方法でＰＣＲミックスを設定することによって鋳型ＤＮＡを増幅した：１．２５μＬの鋳型ｍＩｇＧ２ａ ＰＲＫベクターＤＮＡ（１：１０希釈のミニプレップ）、０．５μＬの１５Ｈ６ ＶＬ ＰＣＲ産物（１００〜２００ｎｇ／μＬ）、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μＬのＨＦ緩衝液（５倍）、１μＬのＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）ポリメラーゼ、及び３５．７５μＬの水。１５Ｈ６ ＨＣ ＰＣＲミックスを、１５Ｈ６ ＶＨ ＰＣＲ産物を使用したこと以外は、同じ方法で設定した。１９Ｂ１２ ＰＣＲミックスを、１９Ｂ１２ ＰＣＲ産物を使用したこと以外は、同じ方法で設定した。

【0373】

ＰＣＲサイクル条件は、以下の通りであった：
９８℃で３０秒間
［９８℃で１５秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で４分間］を２５サイクル
７２℃で１０分間

【0374】

その後、１８μＬのＰＣＲ反応物を新たなチューブに移し、チューブを定期的に回転させながら、２μＬのＤｐｎＩ（番号ＲＯ１７６Ｌ、ＮＥＢ ２０，０００Ｕ／ｍＬ）で、３７℃で２時間消化した。３０μＬのコンピテントなＮＯＶＡＢＬＵＥ ＳＩＮＧＬＥＳ（商標）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、７０１８１）を、製造業者の指示に従って１μＬのＤｐｎＩ消化物で形質転換した。手短に言えば、細胞を解凍し、ＤＮＡを添加し、細胞を氷上で５分間インキュベートした後に、３０秒間熱ショックし、氷上に２分間戻し、続いて、ＳＯＣ培地を添加した。２５μＬまたは５０μＬを５０μｇ／ｍＬカルベニシリン含有プレート上にプレーティングし、３７℃で一晩置いた。コロニーを翌日採取し、プラスミド精製をミニプレップにより行い、プラスミドを配列決定した。

【0375】

ｉｉｉ．抗体精製
２９３細胞上清からの自動精製を、５００ｍＬのＭＣＡ９６ヘッドを有するＴｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（登録商標）２００液体処理システム上で行った。手短に言えば、ＩｇＧを、２０ｍＬのＭＡＢＳＥＬＥＣＴ ＳＵＲＥ（商標）樹脂（Ｇｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ＆ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）をカスタム充填した先端カラムを使用して捕捉した。１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、ＩｇＧを１６０ｍＬの５０ｍＭリン酸（ｐＨ３）中に溶出し、１２ｍＬの２０倍ＰＢＳ（ｐＨ１１）で中和した。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ ＳＵＲＥ（商標）先端カラムを０．１ＭのＮａＯＨ中で取り除き、１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で再生して、最大１５回連続使用した。同様に、Ｆａｂを、２０ｍＬのＧＡＭＭＡＢＩＮＤ（商標）Ｐｌｕｓ樹脂（Ｇｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐ＆ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をカスタム充填した先端カラムを使用して捕捉し、続いて、１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。Ｆａｂを１９０ｍＬの１０ｍＭクエン酸（ｐＨ２．９）中に溶出し、１９ｍＬの０．４Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．７）で中和した。ＧＡＭＭＡＢＩＮＤ（商標）Ｐｌｕｓ先端カラムを６Ｍグアニジンで取り除き、１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で再生して、最大１５回連続使用した。

【0376】

ｉｖ．組換え１５Ｈ６及び１９Ｂ１２抗体は、元の遮断活性を保持する
ｈｕＨｔｒＡ１−ＦＬ活性を阻害する組換え１５Ｈ６及び１９Ｂ１２抗体の能力を、上述のＣ節に記載のＦＲＥＴ遮断アッセイを使用して評価した。これらの両方の組換え抗体は、ハイブリドーマ由来の抗体から決定されるように、それらの元の遮断活性を保持した（図７Ａ及び７Ｂ）。組換え１５Ｈ６抗体がおよそ０．７ｎＭのＩＣ５０を有した一方で、組換え１９Ｂ１２抗体は、およそ１．２ｎＭのＩＣ５０を有し、これは、ハイブリドーマ由来の抗体の活性を反映した（図７Ａ及び７Ｂ）。

【0377】

実施例２：抗ＨｔｒＡ１ハイブリドーマ抗体１５Ｈ６及び１９Ｂ１２のヒト化
Ａ．抗ＨｔｒＡ１抗体１５Ｈ６のヒト化
マウス１５Ｈ６抗体（ｍ１５Ｈ６とも称される）の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）配列をヒト抗体コンセンサス配列とアラインし、ヒトコンセンサス軽鎖カッパＩ（ｈｕκ１）及びヒトコンセンサス重鎖下位群Ｉ（ｈｕＶＨ１）を最も近いヒトフレームワークと特定した（図８Ａ及び８Ｂ）。

【0378】

ｍ１５Ｈ６軽鎖及び重鎖の超可変領域（ＨＶＲ）を、各超可変領域に別個のオリゴヌクレオチドを使用したＫｕｎｋｅｌ変異誘発（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２，１９８７を参照のこと）によって、それぞれ、ｈｕκＩ及びｈｕＶＨ１コンセンサスアクセプターフレームワークにグラフトして、抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ１を生成した（図８Ａ及び８Ｂ）。このプロセスでは、ｍ１５Ｈ６ ＶＬのＨＶＲ−Ｌ１の２４〜３４位、ＨＶＲ−Ｌ２の５０〜５６位、及びＨＶＲ−Ｌ３の８９〜９７位をｈｕκＩコンセンサスアクセプターにグラフトし、ｍ１５Ｈ６ ＶＨのＨＶＲ−Ｈ１の２６〜３５位、ＨＶＲ−Ｈ２の４９〜６５位、及びＨＶＲ−Ｈ３の９５〜１０２位をｈｕＧＩコンセンサスアクセプターにグラフトした。軽鎖のフレームワーク領域２（ＦＲ−Ｌ２）内の４６位、４７位、及び４９位、ならびに重鎖のフレームワーク領域３（ＦＲ−Ｌ３）内の６７位、６９位、７１位、及び９３位も、ヒト化プロセスに含め、これは、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒが、抗体と抗原との複合体の結晶構造について分析し、これらの位置が、ＨＶＲ構造を調整し、かつ抗原に適合するように微調整することができる「Ｖｅｒｎｉｅｒ」ゾーンとしての役割を果たすフレームワーク残基の一部であると見出したためである（Ｆｏｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９，１９９２）（図８Ａ〜８Ｂ）。ヒト及びマウスＨｒｔＡ１のＦａｂ形式でのｍ１５Ｈ６及びｈ１５Ｈ６．ｖ１の結合親和性を、以下のＣ節の小節ｉｉに記載のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析により測定した（図９Ａ〜９Ｄ）。表５は、この分析の結果を要約する。
表５：ｍ１５Ｈ６及びｈ１５Ｈ６．ｖ１のＨｔｒＡ１への動態結合分析

【0379】

ｈ１５Ｈ６．ｖ１におけるマウスＶｅｒｎｉｅｒ残基の重要性をさらに評価するために、この抗体をファージ上にディスプレイし、個々のＶｅｒｎｉｅｒマウス残基（ＬＣ：Ｐ４６、Ｗ４７、Ｓ４９；ＨＣ：Ａ６７、Ｌ６９、Ａ７１、及びＴ９３）をヒト残基（ＬＣ：Ｌ４６、Ｌ４７、Ｙ４９；ＨＣ：Ｖ６７、Ｉ６９、Ｒ７１、及びＡ９３）で置き換えて、点変異変異形を生成した。全ての７変異形をヒトまたはマウスＨｔｒＡ１に対するファージ競合ＥＬＩＳＡに供して、結合親和性（ファージＩＣ５０に関して、以下のＣ節の小節ｉを参照のこと）を決定した。結果は、ＬＣ−Ｐ４６Ｌ変異形がヒトＨｔｒＡ１及びマウスＨｔｒＡ１の両方へのｈ１５Ｈ６．ｖ１結合を完全に消失させたことを示した。ＬＣ−Ｓ４９Ｙ変異形は、ヒト及びマウスＨｔｒＡ１への結合を約１０倍低減した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。ＨＣ変異形ＨＣ−Ａ６７ＶもＨＣ−Ｔ９３Ａもいずれも、マウスＨｔｒＡ１への結合にのみ影響を及ぼし、ヒトＨｔｒＡ１への結合には影響を及ぼさなかった（図１０Ａ及び１０Ｂ）。他の変異形、ＬＣ−Ｗ４７Ｌ、ＨＣ−Ｌ６９Ｉ、及びＨＣ−Ａ７１Ｒは、ヒト及びマウスＨｔｒＡ１への結合のいかなる有意な低下も示さなかった（図１０Ａ及び１０Ｂ）。したがって、抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ１を、以下の変異：ＬＣ−Ｗ４７Ｌ、ＨＣ−Ｌ６９Ｉ、及びＨＣ−Ａ７１Ｒを付加することによってさらに操作して、抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２を生成した（図８Ａ及び８Ｂを参照のこと）。

【0380】

抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２の化学的安定性分析により、ＨＶＲにおけるいくつかの潜在的に不安定な残基または残基対：ＨＶＲ−Ｌ３におけるＷ９１（酸化）、ＨＶＲ−Ｌ３におけるＮ９４ Ｐ９５（クリッピング）、及びＨＶＲ−Ｈ２におけるＤ５５ Ｇ５６（異性化）が特定された。例えば、以下の実施例４を参照されたい。ＨＶＲ−Ｌ３におけるＷ９１酸化に対処するために、２つの変異形（ＬＣ−Ｗ９１Ｙ及びＬＣ−Ｗ９１Ｌ）を生成し、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ結合分析のためにＦａｂとして産生した。以下の表６に要約される結果は、位置ＬＣ−Ｗ９１が結合親和性に重要であり、置換がヒト及びマウスＨｔｒＡ１への結合に約２０〜５０倍影響を与えたことを示した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
表６：ｈ１５Ｈ６．ｖ２ ＬＣ−Ｗ９１変異形のＨｔｒＡ１への動態結合分析

【0381】

ＨＶＲ−Ｌ３の位置ＬＣ−Ｎ９４ ＬＣ−Ｐ９５でのクリッピングについて、ｈ１５Ｈ６．ｖ２の４つの変異形（ＬＣ−Ｎ９４Ａ ＬＣ−Ｐ９５（ＡＰとも称される）、ＬＣ−Ｎ９４Ｅ ＬＣ−Ｐ９５（ＥＰとも称される）、ＬＣ−Ｎ９４Ｑ ＬＣ−Ｐ９５（ＱＰとも称される）、及びＬＣ−Ｎ９４Ｓ ＬＣ−Ｐ９５（ＳＰとも称される））を生成し、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合分析のためにＦａｂとして産生した。結果は、ＡＰ及びＥＰ変異形がヒトＨｔｒＡ１と同様の結合親和性を示し、ＱＰ及びＳＰ変異形がヒトＨｔｒＡ１に対する結合親和性をおよそ２倍低減させたことを示した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。この分析の結果を要約する表を図１２Ｂに示す。

【0382】

ＨＶＲ−Ｈ２の残基ＨＣ−Ｄ５５ ＨＣ−Ｇ５６での異性化について、４つの変異形（ＨＣ−Ｄ５５Ａ ＨＣ−Ｇ５６（ＡＧとも称される）、ＨＣ−Ｄ５５Ｅ ＨＣ−Ｇ５６（ＥＧとも称される）、ＨＣ−Ｄ５５Ｓ ＨＣ−Ｇ５６（ＳＧとも称される）、及びＨＣ−Ｄ５５ ＨＣ−Ｇ５６Ａ（ＤＡとも称される））を生成し、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合分析のためにＦａｂとして産生した。結果は、ＥＧ変異形のみがヒトＨｔｒＡ１に対して同等の結合親和性を示し、重鎖５５位及び／または５６位のこれらの変異形の残りがヒトＨｔｒＡ１に対する結合親和性を２〜３倍低減させたことを示した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。この分析の結果を要約する表を図１３Ｂに示す。

【0383】

これらの結果に基づいて、変異形ＡＰ（ＨＶＲ−Ｌ３）及びＥＧ（ＨＶＲ−Ｈ２）の両方を抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２の配列に導入して、抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２．ＡＰＥＧ（ｈ１５Ｈ６．ｖ３またはＡＰ＿ＥＧとも称される）を生成した（図８Ａ及び８Ｂを参照のこと）。このクローンを、ＬＣ−Ｎ９４Ｅ ＬＣ−Ｐ９５ ＨＣ−Ｄ５５Ｅ ＨＣ−Ｇ５６（ＥＰ＿ＥＧとも称される）、ＬＣ−Ｎ９４Ｑ ＬＣ−Ｐ９５ ＨＣ−Ｄ５５Ｅ ＨＣ−Ｇ５６（ＱＰ＿ＥＧとも称される）、及びＬＣ−Ｎ９４Ｓ ＬＣ−Ｐ９５ ＨＣ−Ｄ５５Ｅ ＨＣ−Ｇ５６（ＳＰ＿ＥＧとも称される）を含むｈ１５Ｈ６．ｖ２のいくつかの他の変異形と比較した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析は、ｈ１５Ｈ６．ｖ２．ＡＰＥＧがｈ１５Ｈ６．ｖ２に対して同等の結合親和性を保持したことを示した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。この分析の結果を要約する表を図１４Ｂに示す。ＨｔｒＡ１活性の活性を遮断するこれらの変異形の能力を、実施例１に記載のＦＲＥＴに基づく遮断アッセイを使用して決定した（図１４Ｃ及び１４Ｄ）。Ｆａｂ形式でのこれらの変異形のｐＩもソフトウェアプログラムＳＭＡＣＫ（例えば、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１：１８６０１，２０１４を参照のこと）を使用して決定し、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））と比較して表７に示す。
表７：Ｈ１５Ｈ６．ｖ２変異形のｐＩ

【0384】

Ｂ．抗ＨｒｔＡ１ハイブリドーマ抗体１９Ｂ１２のヒト化
マウス抗体１９Ｂ１２（ｍ１９Ｂ１２とも称される）のＶＬ及びＶＨのアミノ酸配列をヒトコンセンサス配列とアラインし、ヒトコンセンサス軽鎖カッパＩＶ（ｈｕκ４）及びヒトコンセンサス重鎖下位群ＩＩＩ（ｈｕＶＨ３）を最も近いヒトフレームワークと特定した（図１５Ａ〜１５Ｂ）。

【0385】

ｍ１９Ｂ１２軽鎖及び重鎖の超可変領域を、各超可変領域に別個のオリゴヌクレオチドを使用したＫｕｎｋｅｌ変異誘発によって、それぞれ、ｈｕκ４及びｈｕＶＨ３コンセンサスアクセプターフレームワークにグラフトして、本明細書で抗体クローンｈ１９Ｂ１２．ｖ１と称される直接ＨＶＲグラフト変異形を生成した。このプロセスでは、１９Ｂ１２ ＶＬのＨＶＲ−Ｌ１の２４〜３４位、ＨＶＲ−Ｌ２の５０〜５６位、及びＨＶＲ−Ｌ３の８９〜９７位をｈｕκ４コンセンサスアクセプターにグラフトし、１９Ｂ１２ ＶＨのＨＶＲ−Ｈ１の２６〜３５位、ＨＶＲ−Ｈ２の５０〜６５位、及びＨＶＲ−Ｈ３の９５〜１０２位をｈｕＧＩＩＩコンセンサスアクセプターにグラフトした（図１５Ａ〜１５Ｂ）。

【0386】

ｍ１９Ｂ１２及びｈ１９Ｂ１２．ｖ１（Ｆａｂ形式）の結合親和性を、以下のＣ節の小節ｉｉに記載のアプローチを使用したＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ（図１６Ａ−１６Ｄ）を使用して決定した。この分析の結果を以下の表８に要約する。ｈ１９Ｂ１２．ｖ１のヒトＨｔｒＡ１への平衡結合定数（ＫＤ）は、ｍ１９Ｂ１２と比較して、ヒト化後におよそ２倍改善された（表８）。
表８：ｍ１９Ｂ１２またはｈ１９Ｂ１２．ｖ１のＨｔｒＡ１への動態結合分析

【0387】

Ｃ．材料及び方法
ｉ．ファージＩＣ５０を決定するためのファージ競合ＥＬＩＳＡ
ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）マイクロタイタープレートをＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのヒトＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓで２時間コーティングし、その後、ＰＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ及び０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）で、室温で１時間遮断した。培養上清から精製されたファージを、組織培養マイクロタイタープレート内でＰＢＳＴ緩衝液中連続希釈されたヒトまたはマウスＨｔｒＡ１と１時間インキュベートし、その後、混合物の８０μＬをヒトＨｔｒＡ１でコーティングされたウェルに１５分間にわたって移して、結合していないファージを捕捉した。プレートをＰＢＴ緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）で洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を４０分間にわたって添加した（ＰＢＳＴ緩衝液中１：５０００）。プレートをＰＢＴ緩衝液で洗浄し、テトラメチルベンジジン基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加することによって現像した。４５０ｎｍでの吸光度を溶液中の標的濃度の関数としてプロットして、ファージＩＣ５０を決定した。これを、ファージの表面にディスプレイされたＦａｂクローンの親和性推定値として使用した。

【0388】

ｉｉ．ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）による抗体親和性決定
抗ＨｔｒＡ１ Ｆａｂの結合親和性を単一サイクル動態により決定するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ１００機器での（ＳＰＲ）測定を使用した。手短に言えば、シリーズＳセンサチップＣＭ５を、供給業者の指示に従って１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）試薬で活性化し、ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）をカップリングしておよそ２５００応答単位（ＲＵ）を達成し、その後、反応していない基を１Ｍエタノールアミンで遮断した。

【0389】

動態測定のために、ビオチン化ヒトまたはマウスＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓを最初に１０μＬ／分の流量で注入して、３つの異なるフローセル（ＦＣ）でおよそ１５０ＲＵを捕捉し（参照の役割を果たしたＦＣ１を除く）、その後、低（０．４８ｎＭ）〜高（３００ｎＭ）のＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中抗ＨｔｒＡ１ Ｆａｂの５倍連続希釈物を注入間で再生せずに同じサイクルで交互に注入した（流量３０μＬ／分）。センサグラムを記録し、参照及び緩衝液減算に供した後に、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ１００評価ソフトウェア（バージョン２．０）で評価した。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を、単純な一対一ラングミュア結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数（ＫＤ）をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算した。

【0390】

実施例３：抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２の親和性成熟
Ａ．ｈ１５Ｈ６．ｖ２親和性成熟ＮＮＫライブラリ構築及びパニング
抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２の親和性をさらに改善するために、ファージライブラリを、２０個全てのアミノ酸をコードするＮＮＫ縮重コドンを使用して３２個のコドンでランダム化された軽鎖ＨＶＲ残基（すなわち、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）または重鎖ＨＶＲ残基（すなわち、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３）残基のいずれかを有する一価ＦａｂファージディスプレイのためのＦａｂ−ａｍｂｅｒ形式の変異形ｈ１５Ｈ６．ｖ２から構築した（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１２）：５３８１−５３８３，１９９２を参照のこと）。ライブラリを、３つの軽鎖または重鎖ＨＶＲの各々における１つのＮＮＫ変異を許容するように設計した。結果として生じたライブラリＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１細胞に電気穿孔して、およそ１０^９個の形質転換体を得た。いくつかの例では、ソフトランダム化ライブラリ及びＮＮＫエピスタシスをＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５６７２に記載されるように用いた。ファージライブラリを、ＳＵＰＥＲ遮断（商標）ＰＢＳ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）及び０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中７５０ｍＭのＮａＣｌと３０分間インキュベートし、その後、ニュートラアビジンで捕捉されたビオチン化ＨｔｒＡ１−Ｈｉｓタグに第１のパニングラウンドにわたって適用して、ＨｔｒＡ１とファージとの間の非特異的荷電相互作用を低減した。その後の２ラウンドでは、減少した濃度のビオチン化ｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓ抗原を溶液中の競合相手として１０００倍非ビオチン化ＨｔｒＡ１とともに使用して、選択ストリンジェンシーを増加させた。パニング戦略の概略図については、図１７を参照されたい。

【0391】

Ｂ．ｈ１５Ｈ６．ｖ２親和性成熟ライブラリのディープ配列決定
ディープ配列決定のために、ファージミド二本鎖ＤＮＡを、初期ファージライブラリ及び第３の選択ラウンド由来のファージミドベクターを持つＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１細胞から単離した。精製ＤＮＡを、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用したＶＬ及びＶＨ領域の限定サイクルＰＣＲに基づく増幅の鋳型として使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル抽出及び浄化（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製した。溶出アンプリコンＤＮＡを、ＴＲＵＳＥＱ（商標）ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した標準のＩｌｌｕｍｉｎａライブラリ調製方法を用いて、ディープ配列決定ライブラリ調製物の基準として使用した。アダプターでライゲートしたライブラリを単一のＰＣＲサイクルに供し、必要に応じて２００ｂｐまたは３００ｂｐの挿入サイズで対合末端配列決定を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭＩＳＥＱ（登録商標）で配列決定して、アンプリコンの全長をカバーした。

【0392】

Ｃ．ｈ１５Ｈ６．ｖ２親和性成熟ライブラリのディープ配列決定分析
配列決定データを、統計プログラミング言語Ｒ（例えば、Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ，Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２０１３を参照のこと）及びＳｈｏｒｔＲｅａｄパッケージ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５（１９）：２６０７−２６０８，２００９を参照のこと）を使用して分析した。品質管理（ＱＣ）を、各ＨＶＲ配列が正しい長さについての検査を受け、かつＮＮＫ変異を最大１つのみ有し、非ＮＮＫ変異を有しないよう許可された特定されたＨＶＲ配列で行った。位置重み行列を、あらゆるランダム化された位置の全ての変異の頻度を計算することによって生成した。各変異の濃縮比を、先に記載されるように（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（９）：７４１−７４６，２０１０）、選別された試料における所与の位置での所与の変異の頻度を選別されていない試料における全く同じ変異の頻度と分けることによって計算した。軽鎖ＨＶＲ位置及び重鎖ＨＶＲ位置における各変異の濃縮比を示すヒートマップを、それぞれ、図１８Ａ及び１８Ｂに示す。

【0393】

高濃縮比を有する軽鎖または重鎖ライブラリ由来の単一変異を選択して、クローニングのために合成してＦｌａｇタグを含む哺乳類Ｆａｂ発現構築物にして、Ｆａｂ−Ｆｌａｇタグ融合タンパク質を生成した。重鎖または軽鎖をコードするプラスミドを３０ｍＬ発現のために２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｆａｂを抗Ｆｌａｇカラムで精製した。

【0394】

単一変異を含む精製したＦａｂを、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析（以下のＤ節を参照のこと）を使用して結合親和性を決定するために使用した。単一変異の親和性データを表９に要約する。オフ速度は、ｈ１５Ｈ６．ｖ２の値約０．００１６と比較して、約０．００１３〜約０．００４の範囲であった。変異形ＬＣ３（ＬＣ−Ｎ３１Ｅ）は、オフ速度を１５Ｈ６．ｖ２に対して２〜３倍改善した。
表９：ディープスキャニング変異誘発によって特定されたｈ１５Ｈ６．ｖ２変異の結合親和性

【0395】

Ｄ．さらなる親和性改善のための選択された変異形の組み合わせ
重鎖または軽鎖ＮＮＫライブラリ由来の単一変異の大半が、親クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２に対してＨｔｒＡ１に対する結合親和性を改善しなかった（表９）。最も遅いオフ速度を有する変異形を軽鎖（ＬＣ３、ＬＣ４、及びＬＣ７）変異形ならびに重鎖（ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３、及びＨＣ５）変異形の両方から選択して、組み合わせ変異体を生成した。これらの組み合わせ変異体は、変異形軽鎖及び変異形重鎖の両方を含んだ。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）動態分析を、組み合わせ変異体を使用して（以下のＣ節に記載されるように）行った。組み合わせ変異体ＬＣ３．ＨＣ３、ＬＣ３．ＨＣ１、及びＬＣ７．ＨＣ２は、親Ｆａｂ（ｈ１５Ｈ６．ｖ２）に対して２〜３倍の親和性改善を有した（表１０）。
表１０：ＨｔｒＡ１への組み合わせ変異体結合の動態分析

【0396】

次に、ＬＣ変異体（ＬＣ３７＝ＬＣ３＿ＬＣ７、ＬＣ３４７＝ＬＣ３＿ＬＣ４＿ＬＣ７）及びＨＣ変異体（ＨＣ１３＝ＨＣ１＿ＨＣ３、ＨＣ２３＝ＨＣ２＿ＨＣ３）をさらに組み合わせた。これらの変異体を、親和性動態分析のために自己切断及び脱アミド化を回避するように、ＨＶＲ−Ｌ３ Ｎ９４Ａ及びＨＶＲ−Ｈ２ Ｄ５５Ｅ変異形（すなわち、ＡＰ＿ＥＧ、実施例２を参照のこと）を組み込むことによってさらに修飾した。

【0397】

ＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ１、ＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３（ｈ１５Ｈ６．ｖ４）、ＡＰＥＧ．ＬＣ３７．ＨＣ１３、ＡＰＥＧ．ＬＣ３７．ＨＣ２３、ＡＰＥＧ．ＬＣ３４７．ＨＣ１３、及びＡＰＥＧ．ＬＣ３４７．ＨＣ２３が、上位のクローンであり、ｈ１５Ｈ６．ｖ２に対して平均して３倍〜５倍の改善を有した（図２０）。これらの変異形のＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を、それぞれ、図２１Ａ及び２１Ｂに示す。これらのクローンの配列を、コンピュータによる分析を使用してＨＶＲ−Ｌ３ Ｗ９１での酸化の潜在的リスクにより分析した（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１：１８６０１，２０１４）。ＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３（ｈ１５Ｈ６．ｖ４）、ＡＰＥＧ．ＬＣ３７．ＨＣ１３、及びＡＰＥＧ．ＬＣ３４７．ＨＣ１３を、ｈ１５Ｈ６．ｖ３と同等のリスクとランク付けした。他のものは、ｈ１５Ｈ６．ｖ２よりも危険性が高かった。

【0398】

Ｅ．ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲによるＦａｂ親和性決定
ＨｔｒＡ１の選択されたＦａｂ変異形の結合親和性を決定するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器でのＳＰＲ測定を行った。手短に言えば、シリーズＳセンサチップＣＭ５を、供給業者の指示に従って１−ＥＤＣ及びＮＨＳ試薬で活性化し、抗Ｈｉｓ抗体をカップリングして２００〜３００応答単位（ＲＵ）を達成し、その後、反応していない基を１Ｍエタノールアミンで遮断した。動態測定のために、およそ５ｎＭのｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ−Ｈｉｓを最初に１０μＬ／分の流量で注入して、２つの異なるフローセル（ＦＣ）でおよそ１００ＲＵを捕捉した（参照の役割を果たしたＦＣ１を除く）。次に、低（０．８ｎＭ）〜高（５０ｎＭ）のＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中Ｆａｂの５倍連続希釈を注入した（流量３０μＬ／分）。ＨｔｒＡ１に対する結合応答を、ＲＵを空のフローセルから除することによって補正した。センサグラムを記録し、参照及び緩衝液減算に供した後に、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン２．０）で評価した。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を、単純な一対一ラングミュア結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数（ＫＤ）をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算した。

【0399】

Ｆ．ＨｔｒＡ１ ＦＲＥＴに基づく遮断アッセイ（Ｈ２−Ｏｐｔ遮断アッセイ）におけるｈ１５Ｈ６．ｖ２変異形の阻害活性
選択された親和性成熟ｈ１５Ｈ６．ｖ２変異形を、ＨｔｒＡ１活性を阻害する能力について試験した。Ｈ２−Ｏｐｔ基質（（Ｍｃａ）ＩＲＲＶＳＹＳＦ（Ｄｎｐ）ＫＫ）を使用したインビトロでのＦＲＥＴに基づく遮断アッセイを行った。Ｈ２−Ｏｐｔ遮断アッセイを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１２９７４３Ａ１号の実施例３に記載されるように行った。手短に言えば、ＨｔｒＡ２の基質として当初説明されたペプチドＨ２−Ｏｐｔ（Ｍｃａ−ＩＲＲＶＳＹＳＦ（Ｄｎｐ）ＫＫ）（配列番号１５２）（例えば、Ｍａｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４９４１７−２７，２００３を参照のこと）を、標準のＨＢＴＵを用いたカップリング手技を使用してＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ｗａｎｇ樹脂上で合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＤＮＰ）−−ＯＨ（Ａｎａｓｐｅｃ）をＰ５’位に組み込んだ。ペプチドを最大Ｐ５（Ｍｃａ、７−メトキシ−クマリン、Ａｌｄｒｉｃｈ）まで合成し、その後、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、及び水を使用して固体支持体から室温で２時間にわたって切断した。ペプチドをエチルエーテルから沈殿させ、酢酸、アセトニトリル、水で抽出し、凍結乾燥させた。粗標識ペプチドを溶解し、アセトニトリル／水を使用して分取逆相Ｃ１８カラムで精製した。精製した画分をプールし、凍結乾燥させ、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ）により分析し、それらの計算された質量と一致していることを見出した。

【0400】

ＨｔｒＡ１を、９６ウェル黒色光学底プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｎ．Ｙ．）中で、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ＣＨＡＰＳ）中で連続希釈した抗ＨｔｒＡ１抗体と３７℃で２０分間インキュベートした。ＤＭＳＯ中ペプチド基質Ｍｃａ−ＩＲＲＶＳＹＳＦ（Ｄｎｐ）ＫＫ（配列番号１５２）（Ｈ２−Ｏｐｔ）の１０ｍＭ原液を水中で１２．５μＭに希釈し、３７℃で予温し、その後、反応混合物に添加した。蛍光シグナル（励起３２８ｎｍ、発光３９３ｎｍ）の増加をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）で測定し、Ｈ２−Ｏｐｔ切断の線形速度（ｍＲＦＵ／分）を決定した。

【0401】

図２２Ａは、本質的に上述のように行った３つの独立したＨ２−Ｏｐｔアッセイ実験の結果の要約を示す。クローンの大半が、ｈ１５Ｈ６．ｖ２の約０．３９ｎＭと比較して、約０．４ｎｍ〜約０．５ｎＭの範囲のＩＣ５０値を有した。抗ＨｔｒＡ１抗体ＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３（ｈ１５Ｈ６．ｖ４とも称される）は、このアッセイで、約０．３８６ｎＭで最良のＩＣ５０値を示した（図２２Ａ）。図２２Ｂは、この分析からの代表的なプロットを示す。概して、親和性成熟ｈ１５Ｈ６．ｖ２変異形は、ｈ１５Ｈ６．ｖ２と比較してＨｔｒＡ１の最大阻害の改善を示し（図２２Ａ）、最大阻害値は、約７８％〜約９６％の範囲であった。

【0402】

ＦＲＥＴに基づくＨ２−Ｏｐｔ遮断アッセイを使用して、ＨｔｒＡ１活性を阻害するｈ１５Ｈ６．ｖ４を含むｈ１５Ｈ６．ｖ２変異形の異なる抗体形式の能力を評価した。Ｈ２−Ｏｐｔアッセイを、アッセイ条件が、１ｎＭ ｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ酵素、１．２５μＭ Ｈ２−Ｏｐｔ基質、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ＣＨＡＰＳであったことを除いて、本質的に表術のように行った。結果を、相対蛍光単位（ＲＦＵ）／秒速度（５０〜１０００秒）または２０００秒での終点ＲＦＵ値に基づいて分析した。図２３Ａ〜２３Ｈは、ｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤの活性を阻害するＦａｂ形式でのｈ１５Ｈ６．ｖ２の能力とＩｇＧまたはＦａｂ形式でのｈ１５Ｈ６．ｖ４の能力を比較する例示の独立した実験の結果を示す。抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４ａ（ＷＯ２０１３／０５５９８８を参照のこと）は、陽性対照の役割を果たした。図２４Ａ及び２４Ｂは、それぞれ、ＲＦＵ／秒アプローチを使用して分析した第１の組の３つの独立した実験からのＩＣ５０結果及びＩＣ９０結果の要約を示す。図２５Ａ及び２５Ｂは、それぞれ、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ ＦａｂのＲＦＵ／秒または終点ＲＦＵアプローチを使用して分析した第２の組の３つの独立した実験からのＩＣ５０結果及びＩＣ９０結果の要約を示す。

【0403】

Ｇ．質量分析に基づく活性アッセイにおけるＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３（ｈ１５Ｈ６．ｖ４）の遮断能力
インタクトな全長基質（α−カゼイン）のｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介切断を阻害するＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３（ｈ１５Ｈ６．ｖ４）の能力を、質量分析（ＭＳ）に基づく活性アッセイを使用して評定した。この実施例では、抗ＨｔｒＡ１抗体ｈ１５Ｈ６．ｖ４を、ＨｔｒＡ２に対するアンタゴニストとして説明されているＨｔｒＡプロテアーゼの小分子阻害剤ｕｃｆ−１０１（別名Ｏｍｉ）と比較した（Ｃｉｌｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１３）：１１４８９−１１４９４，２００３）。タンデム質量タグ（ＴＭＴ）同重体質量タグ化標識を、ｈ１５Ｈ６．ｖ４またはｕｃｆ−１０１の存在下でＨｔｒＡ１によるα−カゼイン切断のＭＳに基づく定量に用いた。α−カゼインは、ＨｔｒＡ１：Ｓｅｒ７２、Ｔｈｒ９５、及びＳｅｒ１５７によって切断され得る３つのＰ１’残基を有した。

【0404】

ＴＭＴＤＵＰＬＥＸ（商標）同重体質量タグ化試薬を使用して、α−カゼイン標準物及びアッセイ試料を差次的に標識し、インタクトなα−カゼインを定量した。ＴＭＴＤＵＰＬＥＸ（商標）試薬は、第一級アミン（−ＮＨ２）基の不可逆的共有結合標識のためにＮＨＳ活性化される複数の組の同重体化合物（すなわち、同じ質量及び構造、別名アイソトポマー）である。各同重体試薬は、質量レポータータグ部分中に異なる数の重同位体を含有し、それにより、試料特定及び相対定量のためのタンデムＭＳ／ＭＳ中に特有のレポーター質量がもたらされる。

【0405】

１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム、１００ｎＭ ｈｕＨｔｒＡ１、１００μｇ／ｍＬ α−カゼイン、及び阻害剤（すなわち、ｕｃｆ−１０１またはｈ１５Ｈ６．ｖ４）を３７℃で１８時間インキュベートした（最終体積２０μＬ）（消化溶液）。別個に、同様の溶液を阻害剤なしで生成し、同様にインキュベートした（対照溶液）。ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂを３．１２ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度で試験し、陽性対照小分子阻害剤ｕｃｆ−１０１を２ｎｍ〜２５０ｎＭの範囲の濃度で試験した。

【0406】

タンデム質量タグ（ＴＭＴＤＵＰＬＥＸ（商標））原液を、販売業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に推奨されるように生成した。５μＬのＴＭＴ−１２６を消化溶液に添加し、５μＬのＴＭＴ−１２７を対照溶液に添加した。室温で１時間インキュベートした後、上述の溶液を等体積基準で合わせた。試料をＬＣ−ＭＳに供し、高エネルギーＣ−トラップ解離（ＨＣＤ）を使用して最も強力なイオンピークの断片化により定量し、断片化後の１２６／１２７のレポーターイオン強度比を使用して、消化溶液中の濃度を決定した。

【0407】

滴定曲線は、本アッセイがインタクトなα−カゼインを正確に定量したことを示した（図２６Ｂ）。このアッセイでは、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂは、約４５ｎＭのＩＣ５０（ＩＣ９０＝約７１ｎＭ）でインタクトなα−カゼインのｈｕＨｔｒＡ１−ＰＤ媒介切断を阻害した。この値は、７７μＭのＩＣ５０を有した小分子阻害剤ｕｃｆ−１０１と比較して、顕著に改善された。

【0408】

Ｈ．内因性ＨｔｒＡ１活性アッセイにおけるｈ１５Ｈ６．ｖ２親和性成熟変異形の遮断能力
ウサギ眼モデルにおける内因性ＨｔｒＡ１活性を阻害するｈ１５Ｈ６．ｖ２親和性成熟変異形の能力を評定した。内因性ＨｔｒＡ１活性アッセイについて、ＨｔｒＡ１分泌細胞（ヒトＣ３２メラノーマ細胞）由来の培地をＨｔｒＡ１源として使用した。例えば、Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １８，２０１５，ＤＯＩ：１０．１０４２／ＢＪ２０１５０６０１を参照されたい。この内因性アッセイでは、組換えＨｔｒＡ１ Ｈ２−Ｏｐｔアッセイと比較して、およそ１０倍高い濃度のＨｔｒＡ１が存在し（例えば、図２８を参照のこと）、これは、内因性ＨｔｒＡ１及び組換えＨｔｒＡ１を使用してＨ２−Ｏｐｔアッセイで観察される異なるＩＣ５０値を説明すると考えられることに留意されたい。図２７Ａ〜２７Ｃは、内因性ＨｔｒＡ１アッセイの結果を示す。具体的には、クローンＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３（ｈ１５Ｈ６．ｖ４）は、約１．１２５ｎＭのＩＣ５０を有し（図２７Ｃ）、最大阻害は約８０．１％であった。

【0409】

Ｉ．選択されたｈ１５Ｈ６．ｖ２変異形の特性の要約
抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２の選択された誘導体の動態結合及び阻害活性を、ＢＩＡＣＯＲＥ ＳＰＲ分析及びＦＲＥＴに基づくＨ２−Ｏｐｔ活性アッセイを使用して比較した。最大阻害を決定するために、陽性対照及び陰性対照を使用して、０％阻害（酵素のみ、阻害剤なし）及び１００％阻害（酵素なし）を決定した。この比較の結果を図２８に示す。

【0410】

実施例４：抗ＨｔｒＡ１抗体の分子評定分析
抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｈ１５Ｈ６．ｖ２、ｈ１５Ｈ６．ｖ２．ＡＰＥＧ（ｈ１５Ｈ６．ｖ３とも称される）、及びＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３（ｈ１５Ｈ６．ｖ４とも称される）を、安定性特性について分子評定（ＭＡ）分析で試験した。抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｈ１９Ｂ１２．ｖ１も試験した。手短に言えば、抗ＨｔｒＡ１抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を、フリーラジカルを生成することで既知の小分子であるＡＡＰＨ（２，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩）を有する化学条件下での応力（例えば、Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９８（１２）：４４８５−４５００，２００９を参照のこと）、ならびに様々なｐＨでの熱条件下での応力（４０℃、ｐＨ５．５での２週間の熱応力試験）（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ １２７２：５６−６４，２０１３を参照のこと）について試験した。

【0411】

表１１は、ｈ１５Ｈ６．ｖ２のＭＡ分析結果とｈ１５Ｈ６．ｖ３のＭＡ分析結果との間の比較を示す。顕著に、ＨＶＲ−Ｌ３におけるＬＣ−Ｗ９１は、ＡＡＰＨ応力後にｈ１５Ｈ６．ｖ２及びｈ１５Ｈ６．ｖ３の両方において酸化の増加を有した（それぞれ、約８４．５％及び約８６．４％）。表１２は、ｈ１５Ｈ６．ｖ４のＭＡ分析の結果を示す。驚くべきことに、ｈ１５Ｈ６．ｖ４の場合のＨＶＲ−Ｌ３におけるＬＣ−Ｗ９１での酸化は、ｈ１５Ｈ６．ｖ２及びｈ１５Ｈ６．ｖ３と比較して低減し、ｈ１５Ｈ６．ｖ２及びｈ１５Ｈ６．ｖ３の場合のおよそ８４．５〜８６．４％の酸化増加と比較して、ＡＡＰＨ応力後に２６．５％しか酸化が増加しなかった。この改善は、ＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３がｈ１５Ｈ６．ｖ３と比較して２つしか置換を有さず（すなわち、ＦＲ−Ｈ１領域におけるＨＣ−Ｔ２８Ｋ及びＨＶＲ−Ｌ１におけるＬＣ−Ｎ３１Ｅ）、これらはいずれも導入されて親和性を改善し、これらはいずれもＬＣ−Ｗ９１の酸化に影響を与えないと予想されたため、予想外であった。このＭＡ分析に使用したｈ１５Ｈ６．ｖ４抗体を、単一カラム精製手技を使用して調製した。２カラム精製手技を使用して調製した抗体を使用してｈ１５Ｈ６．ｖ４のＭＡ分析を繰り返すと、ＬＣ−Ｗ９１がＡＡＰＨ応力下で不安定であることを示した。２カラム精製を使用して精製した材料で行ったＡＡＰＨ応力評定の結果が、単一カラム精製材料がＡＡＰＨ応力評定を妨害した混入物質を含有していたため、単一カラム精製手技により精製した材料を使用して得た結果とは異なったと考えられる。
表１１：ｈ１５Ｈ６．ｖ２及びｈ１５Ｈ６．ｖ３のＭＡ特性

表１２：ｈ１５Ｈ６．ｖ４（ＡＰＥＧ．ＬＣ３．ＨＣ３）のＭＡ特性

【0412】

表１３は、抗ＨｔｒＡ１抗体クローンｈ１９Ｂ１２．ｖ１のＭＡ分析の結果を示す。ＨＶＲ−Ｈ２におけるＨＣ−Ｎ５２ａ ＨＣ−Ｇ５３を不安定であると決定し、脱アミド化増加は４９％であった。したがって、ｈ１９Ｂ１２．ｖ１のこれらのＨＶＲ−Ｈ２位置（例えば、ＨＣ−Ｎ５２ａＥ、ＨＣ−Ｎ５２ａＳ、ＨＣ−Ｎ５２ａＳ、及びＨＣ−Ｎ５２ａ ＨＣ−Ｇ５３Ａ）での置換は、安定性を改善すると予想される。
表１３：ｈ１９Ｂ１２．ｖ１のＭＡ特性

【0413】

実施例５：ＨｔｒＡ１に結合したｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂの構造
ＨｔｒＡ１に結合したｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂの構造をＸ線結晶学及び電子顕微鏡法により決定した。結果は、ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ ＨｔｒＡ１エピトープがＨｔｒＡ１のＬＡループのターンを含むアミノ酸によって主に形成されることを実証した。

【0414】

ペプチド合成：
ＨｔｒＡ１タンパク質の領域に対応するペプチドを、当該技術分野で周知の方法を使用して生成した。例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９７８）．Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３：５３７−５３９を参照されたい。

【0415】

結晶化：
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中１０ｍｇ／ｍＬ ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ（１ｍＬ）を、ＨｔｒＡ１のＬＡループ内にアミノ酸を含有する１ｍｇのペプチド（３倍モル過剰ペプチド／タンパク質）と４℃で一晩インキュベートした。Ｆａｂ−ペプチド複合体を、２Ｍ硫酸アンモニウム、０．２Ｍ酢酸カリウムを使用して結晶化した。

【0416】

Ｘ線精密化：
ｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ／ＨｔｒＡ１ペプチド結晶を収集し、３０％グリセロールを母液に添加し、その後、液体窒素中に急浸漬することによって作製された抗凍結剤溶液中に浸漬することによって回折分析のために保存した。データをＳＳＲＬビームライン１２−２で収集し、ＸＤＳを使用して処理した（Ｋａｂａｓｃｈ Ｗ（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２６６：１２５−３２）。Ｆａｂ−ペプチド複合体の分子置換を、ＣＣＰ４における探索プローブとしてＦａｂ構造を使用して達成した（Ｗｉｎｎ ＭＤ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６７：２３５−４２）。厳密なボディ精密化後、ペプチドのＦｏ−Ｆｃ密度を確認することができた。その後、ループＡ（ＲＫＬＰＦＳＫＲＥＶＰＶ）由来のＨｔｒＡ１プロテアーゼドメイン残基の一部（ＰＤＢ ３ＴＪＯ）を、Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６：１２５−３２に本質的に記載されるように、密度にフィットさせた。

【0417】

Ｐｈｅｎｉｘにおけるいくつかの精密化ラウンド（Ａｄａｍｓ ＰＤ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６：２１３−２１）を利用した。Ｂｕｓｔｅｒにおける最終精密化ラウンド（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）により、Ｒ値をＲ＝１６．８％にし、Ｒｆｒｅｅ＝１９．８％、２．１Å分解能であった。

【0418】

ＨｔｒＡ１に結合したＦａｂ１５Ｈ６．ｖ４の電子顕微鏡法（ＥＭ）構造
ＥＭ撮像のために、４μＬのＨｔｒＡ１−ｈＦａｂ１５Ｈ６．ｖ４複合体を、新たにグロー放電された連続炭素４００メッシュ銅格子（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で３０秒間インキュベートした。インキュベートした後、試料を、２ｗ／ｖ％ギ酸ウラニル（ＳＰＩ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）溶液を使用して陰性染色した。過剰な染色溶液をワットマン紙で拭き取り、格子を空気乾燥させた。ＨｔｒＡ１−Ｆａｂ１５Ｈ６．ｖ４試料を、ＬａＢ６フィラメントを装備し、かつ低用量条件下にて１２０ｋｅＶで動作するＴｅｃｎａｉ−１２ ＢｉｏＴｗｅｅｎ（ＦＥＩ）で分析した。画像を、見かけの倍率６２，０００倍（１ピクセル当たり２．２２Å）の４ｋ×４ｋ ＣＣＤカメラ（Ｇａｔａｎ Ｉｎｃ．）を使用して収集した。１２８ｐｘのボックスサイズを有する２７３４６個の粒子を、ＥＭＡＮ２分布に含まれたｅ２ｄｏｇｐｉｃｋｅｒ．ｐｙルーチン下で入手可能な遊走アルゴリズムを使用して半自動的に選定した（Ｔａｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．４７：１４３８−４５）。その後、これらの粒子を、ソフトウェアスイートＲｅｌｉｏｎを使用して参照なしの２次元分類に供した（Ｓｃｈｅｒｅｓ ＳＨ（２０１２）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１８０：５１９−３０）。ＨＴＲＡ１三量体と結合したＦａｂとの間の柔軟性を考慮して、Ｒｅｌｉｏｎの３次元分類アルゴリズムを使用して、６０Åの分解能にローパスフィルタリングしたＨｔｒＡ１三量体（ＰＤＢ ＩＤ ３ＴＪＯ）の結晶構造を出発モデルとして使用した５つの３次元体積を生成した。これらの体積の各々を、ＲｅｌｉｏｎのＲｅｆｉｎｅ３Ｄアルゴリズムを使用して最後に精密化した。ＨＴＲＡ１三量体及びＦａｂ１５Ｈ６．ｖ４の結晶構造の原子密度を、Ｃｈｉｍｅｒａのフィットインマップアルゴリズムを使用してＥＭ密度にフィットさせた（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ＥＦ ｅｔ ａｌ．，２００４）。Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２５：１６０５−１２（２００４）。

【0419】

アラニン置換を使用したＨｔｒＡ１に結合したＦａｂ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂの構造の検証
上述の構造研究は、Ｆａｂ１５Ｈ６．ｖ４ ＦａｂがＨｔｒＡ１タンパク質のループ「Ａ」と密接に相互作用することを実証した。これを確認するために、ヒトＨｔｒＡ１配列の残基１９０〜２０１（この番号付けは、前駆体タンパク質の番号付けに対応する）に対応するペプチドを合成し、上述のように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してｈ１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂへの結合について試験した。ペプチド（ＬＡ−ｐｅｐ１）は、０．４ｎＭのＫＤ値を有する１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂとの強力な結合相互作用を示した。表１４を参照されたい。

【0420】

このペプチド配列におけるアラニン置換は、１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂへの結合を減少させる（ＬＡ−ｐｅｐ２、ＬＡ−ｐｅｐ５）か、または完全に消失させる（ＬＡ−ｐｅｐ３、ＬＡ−ｐｅｐ４、ＬＡ−ｐｅｐ５）。これらの生物物理学的結果は、上述かつ図３２Ａ及び３２Ｂの構造研究と一致し、１５Ｈ６．ｖ４に対する結合エピトープがＨｔｒＡ１のＬＡループのターンを含むアミノ酸によって主に形成されることを実証する。

【0421】

対照的に、ＹＷ５０５．９４ Ｆａｂは、ＬＡ−ｐｅｐ１にも、変異体形態のうちのいずれにも結合しなかった（表１４）。これは、ＹＷ５０５．９４ Ｆａｂとｈ１５Ｈ６．ｖ４がＨｔｒＡ１に結合するために互いに競合するという事実にもかかわらず、これらの２つのＦａｂのエピトープがはっきりと異なることを示す。ＹＷ５０５．９４ ＦａｂのエピトープがループＢ及びＣに中心がある一方で、１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂのエピトープは、ＬＡループの先端を主に含む。本発明が任意の特定の機構に拘束されるようには意図されていないが、ｈ１５Ｈ６．ｖ４とＨｔｒＡ１のＬＡループとの間の密接な相互作用が、ＹＷ５０５．９４と比較して、この抗体の親和性及び効力の著しい改善を説明することが可能である。
表１４：１５Ｈ６．ｖ４ Ｆａｂ及びＹＷ５０５．９４ ＦａｂへのＨｔｒＡ１ループＡ（ＬＡ）ペプチド結合

＊ＮＢ：最大１μＭで結合検出されず、＊＊親和性損失＝Ｋ_Ｄ変異体／Ｋ_Ｄ野生型。

【0422】

前述の発明が理解の明確化のために例証及び実施例により多少詳しく記載されているが、これらの記述及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図23E】

【図23F】

【図23G】

【図23H】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]