特許 6751084 薬物送達のための生還元性（ＢＩＯ−ＲＥＤＵＣＩＢＬＥ）自己組織化液晶ブロックコポリマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6751084

(24)【登録日】2020年8月17日

(45)【発行日】2020年9月2日

(54)【発明の名称】薬物送達のための生還元性（ＢＩＯ−ＲＥＤＵＣＩＢＬＥ）自己組織化液晶ブロックコポリマー

(51)【国際特許分類】

   C08F 293/00 20060101AFI20200824BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20200824BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 31/475 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 33/24 20190101ALI20200824BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 31/513 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20200824BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20200824BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200824BHJP

【ＦＩ】

   C08F293/00

   A61K9/14

   A61K47/34

   A61K31/704

   A61K31/475

   A61K31/337

   A61K33/24

   A61K31/4745

   A61K31/513

   A61K31/519

   A61K31/573

   A61K47/02

   A61P35/00

【請求項の数】27

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2017-519810(P2017-519810)

(86)(22)【出願日】2015年10月15日

(65)【公表番号】特表2017-532417(P2017-532417A)

(43)【公表日】2017年11月2日

(86)【国際出願番号】US2015055660

(87)【国際公開番号】WO2016061310

(87)【国際公開日】20160421

【審査請求日】2018年10月1日

(31)【優先権主張番号】62/064,041

(32)【優先日】2014年10月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516104009

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ コネチカット

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ル，シウリン

(72)【発明者】

【氏名】カシ，ラジェスワリ

(72)【発明者】

【氏名】トラン，タン−フェン

(72)【発明者】

【氏名】グェン，キー，タン

【審査官】 小森 勇

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１１３６４５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｆ ２９３／００

Ａ６１Ｋ ９／１４

Ａ６１Ｋ ３１／３３７

Ａ６１Ｋ ３１／４７４５

Ａ６１Ｋ ３１／４７５

Ａ６１Ｋ ３１／５１３

Ａ６１Ｋ ３１／５１９

Ａ６１Ｋ ３１／５７３

Ａ６１Ｋ ３１／７０４

Ａ６１Ｋ ３３／２４

Ａ６１Ｋ ４７／０２

Ａ６１Ｋ ４７／３４

Ａ６１Ｐ ３５／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式：

【化1】

で示される第一のブロックと、
式：

【化2】

で示される第二のブロックと、を含む、
下記式（１）で示されるコポリマーであって、
式（１）：

【化3】

前記式中、ｍは３〜５００の整数であり、
前記第一のブロックが、
式：

【化4】

（式中、ｍは３〜５００の整数）であり、
前記第二のブロック中のＲ^２が、ポリアルキレンオキシド、ポリエステル、又はポリペプチド部分であり、
前記第二のブロック中のＲ^３が、

【化5】

である、
コポリマー。

【請求項2】

Ｒ^２が、ポリアルキレンオキシド部分である、請求項１に記載のコポリマー。

【請求項3】

前記ポリアルキレンオキシド部分が、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシドチオラート、ポリプロピレンオキシド、またはポリプロピレンオキシドチオラートを含む、請求項２に記載のコポリマー。

【請求項4】

Ｒ^２が、ポリエチレンオキシドである、請求項３に記載のコポリマー。

【請求項5】

Ｒ^３が、式：

【化6】

で示される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコポリマー。

【請求項6】

鎖の末端部分Ｘ：

【化7】

（式中、Ａ及びＲ^１で示される第一のブロック、Ｒ^２、及びＲ^３は、請求項１で規定する第一のブロック、Ｒ^２、及びＲ^３と同義である。式中、ｍは式（１）のｍと同義である。）をさらに含み、
Ｘが、トリチオカルボナート、ジチオカルバマート、またはジチオエステルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコポリマー。

【請求項7】

Ｘが、−ＳＣ（Ｓ）Ｓ−Ｃ_１２Ｈ_２５である、請求項６に記載のコポリマー。

【請求項8】

構造：

【化8】

（式中、
ｍは、５〜２００の整数であり、
ｎは、５〜１００の整数であり、
Ｘは、請求項６で規定するＸと同義である）を含む、請求項６〜７のいずれか１項に記載のコポリマー。

【請求項9】

ｍが、１０〜１００である、請求項８に記載のコポリマー。

【請求項10】

ｎが、１５〜８５である、請求項８〜９のいずれか１項に記載のコポリマー。

【請求項11】

前記コポリマーの分子量が、５，０００〜２００，０００Ｄａである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコポリマー。

【請求項12】

前記コポリマーの分子量が、１０，０００〜１５０，０００Ｄａである、請求項１１に記載のコポリマー。

【請求項13】

前記コポリマーの分子量が、２０，０００〜６０，０００Ｄａである、請求項１２に記載のコポリマー。

【請求項14】

コア／シェルナノ粒子形態である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコポリマー。

【請求項15】

請求項１４のコポリマーと、疎水性医薬活性分子と、を含むナノ粒子。

【請求項16】

前記疎水性分子が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カンプトテシン、イリノテカン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、またはデキサメタゾンである、請求項１５に記載のナノ粒子。

【請求項17】

１種または複数の金属ナノ粒子または量子ドット（例えば、近赤外（ＮＩＲ）量子ドット）をさらに含む、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項18】

前記金属ナノ粒子が、金ナノ粒子である、請求項１７に記載のナノ粒子。

【請求項19】

前記金属ナノ粒子が、磁気ナノ粒子である、請求項１７に記載のナノ粒子。

【請求項20】

５〜９００ｎｍの径である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項21】

５〜２００ｎｍの径である、請求項２０に記載のナノ粒子。

【請求項22】

１０〜１００ｎｍの径である、請求項２１に記載のナノ粒子。

【請求項23】

対象に投与され、医薬活性分子を送達するために使用される、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項24】

対象に投与され、疾患または障害を処置するために使用される、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項25】

（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコポリマーを有機溶媒に溶解して、前記コポリマー溶液を得ること；および（ｂ）水溶液中で前記コポリマー溶液を混合して、ナノ粒子を形成させること、を含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のナノ粒子を調製する工程。

【請求項26】

前記有機溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフラン、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２５に記載の工程。

【請求項27】

前記コポリマー溶液を混合することが、前記水溶液中での透析によって実施される、請求項２５または２６に記載の工程。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、開示が全体として参照により本明細書に組み入れられる２０１４年１０月１５日出願の米国特許仮出願第６２／０６４，０４１号の優先権を主張するものである。

【0002】

発明の背景
発明の分野
本開示は、水溶液中でナノ粒子に即座に自己組織化することができ、疎水性医薬活性分子の封入も可能である、生分解性両親媒性液晶コポリマーを提供する。

【背景技術】

【0003】

関連技術の説明
薬物（例えば、抗癌剤）の臨床使用は、薬物の疎水性および非特異的毒性を理由に限定されている。例えば、臨床使用される抗癌剤の大部分は、健常組織および疾患組織の両方において身体全体に急速に拡散して重篤な副作用を誘発する低分子化合物である。抗癌剤のための安全かつ効果的な送達システムの開発が、ますます必要とされている。自己組織化ナノ粒子構造は、コア内への抗癌剤の封入を可能にしながら、親水性のシェルが水溶性および安定性を上昇させる。適当なサイズおよび表面特性を有するナノ粒子は、透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果によって腫瘍部位に蓄積して、腫瘍の血管およびリンパ管構造の異常をもたらす可能性を有し得る。

【0004】

様々な自己組織化ナノ粒子が、抗癌剤の送達用に開発された。不幸にもこれらのほとんどは、臨床試験で有益な効果を示さなかった。薬物送達ポリマー系の主要な障壁は、乏しいインビボ安定性、低い薬物負荷レベル、低い腫瘍標的性、ならびに腫瘍組織内および／もしくは腫瘍細胞内部での緩徐な薬物放出である。さらにインビボでの崩壊の際、多くの合成生分解性コポリマーは、周辺組織と有害に相互作用するオリゴマーおよびモノマーを生成する。

【0005】

コレステロール末端基を有するコポリマーは、細胞付着および増殖のための膜として働くこと、ポリマースカフォールドの基盤を形成すること、ならびに改善された血液適合性を有する材料として働くことなど、様々な生物医療用途についても関心を持たれている。しかし、コレステロールを含有する報告された両親媒性ポリマー構造は、１つまたは２、３のコレステロール分子のみを有するコンジュゲートまた直鎖状コポリマーである。このため、低い安定性、２０％（ｗ／ｗ）までの限られた薬物負荷能力と低い封入効率、およびこれらのコレステロール含有コポリマーについて急速な薬物放出となる。

【0006】

ジスルフィド結合を含むレドックス感受性ナノキャリアは、腫瘍微細環境および癌細胞における高いグルタチオン（ＧＳＨ）濃度の存在によって、細胞内薬物送達で大きな注目を集めてきた。例えば複数のグループが、細胞内還元性環境において封入薬物を急速に放出する、レドックス感受性ポリマー／ＤＮＡ複合体、ｓｉＲＮＡ送達のためのポリイオン複合体ミセル、架橋ミセル、および生理学的条件下で良好な安定性を有する分解性ナノゲルを報告した。しかし、還元感受性ポリマーで構成されたナノ粒子のインビボ挙動、およびナノ粒子と腫瘍組織との相互作用に関して入手可能な情報は、限られている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

発明の概要
薬物負荷能力を増加させ、同時にポリマー担体およびその分解産物の毒性を最小限に抑えるための適当な構造および組成を有するブロックコポリマーを設計することは、依然として難題である。コレステロール分子を含む液晶ポリマー（ＬＣＰ）は、生物活性材料およびバイオテクノロジーなどの様々な材料において適用されてきたが、薬物送達システムのためにＬＣＰを利用した研究者は、ほとんどいなかった。本発明は、新規な生分解性両親媒性液晶コポリマー（「コポリマー」または「ブロックコポリマー」）を提供する。本開示のブロックコポリマーは、水溶液中で自己組織化ナノ粒子を即座に形成した。これらのナノ粒子は、音波処理またはホモジネーション手順を用いずに、単に自己組織化を介して疎水性薬物の負荷を可能にする。本開示のナノ粒子はまた、抗ステロイド含量の疎水性コアの優れた安定性を示し、疎水性薬物の高い封入能力を実証した。親水性表面はまた、細網内皮系（ＲＥＳ）取り込みを防御し、体内での長期循環を容易にした。本発明の自己組織化ブロックコポリマーナノ粒子は、良好な生体適合性、高い薬物負荷能力、優れた安定性を有し、容易に大規模製造され得るため、それらは薬物送達、特に腫瘍への抗癌剤送達に適したものになる。最後に、本発明のナノ粒子は、生理学的条件下で安定でありながら、細胞進入後の細胞基質還元環境下でジスルフィド結合の切断によって封入された薬物を急速に放出し、癌細胞への効果的細胞毒性をもたらす（図１）。

【0008】

重要なこととして、ナノ粒子は、細胞内還元性環境に暴露されると、ジスルフィド結合の切断により、細胞内部で薬物を急速に放出し、非還元ナノ粒子に比較して有意に高い薬物有効性をもたらすことができる。さらにナノ粒子は、血液循環内での薬物の持続期間を有意に増加させ、腫瘍蓄積および抗腫瘍効力を改善し、遊離型抗癌剤に比較して毒性を有意に低下させ、薬物の心臓蓄積を減少させた。これらの特性によって本開示のナノ粒子は、抗癌剤送達での使用に特に好適になる。

【0009】

最後に、本開示のコポリマーは、官能基化され得（例えば、チオール基、リン酸基、カルボン酸基など）、そのようなコポリマーはまた、水性媒体中で自己組織化されて、明確に定義されたナノ粒子を形成し得る。例えば、チオール官能基化ナノ粒子は、物理的捕捉を介した疎水性抗癌剤と、チオール基への共有結合を介した金ナノ粒子（Ａｕ ＮＰ）と、の二重の封入のための多官能基担体として働いた。均一な粒度分布および良好な安定性と共に高い薬物負荷および高い封入効率によって、官能基化ナノ粒子は、例えば光熱癌療法および生物学的感知において、抗癌剤および金属ナノ粒子の送達に使用することができる。

【課題を解決するための手段】

【0010】

したがって広範囲の態様において、本開示は、水溶液中でナノ粒子に即座に自己組織化し得る生分解性両親媒性液晶コポリマー（「コポリマー」または「ブロックコポリマー」）を提供する。したがって一態様において、本開示は、
式：

【化1】

で示される第一のブロックと、
式：

【化2】

（式中、
ｍは、約３〜約５００の整数であり；
Ａは、独立して、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリノルボネン、ポリシクロペンテン、ポリシクロオクテン、ポリシロキサン、ポリエステル、またはポリペプチドから選択され；
Ｒ^１は、リンカーＲ^１１を場合により含むステロイド部分であり；
Ｒ^２は、ポリアルキレンオキシド、ポリエステル、またはポリペプチド部分であり；
Ｒ^３は、ジスルフィドリンカー部分である）で示される第二のブロックと、
を含むコポリマーを提供する。

【0011】

別の態様において、本開示は、本開示のブロックコポリマーをコア／シェルナノ粒子形態で提供する。一実施形態において、該コア／シェルナノ粒子形態は、水溶液中で自己組織化された本開示のブロックコポリマーである。

【0012】

一態様において、本開示は、本開示のブロックコポリマーと、疎水性医薬活性分子と、を含むナノ粒子を提供する。別の態様は、このナノ粒子を含む治療的送達システムを提供する。さらに別の態様は、このナノ粒子を対象に投与することを含む、医薬活性分子を送達する方法を提供する。さらに別の態様は、このナノ粒子を対象に投与することを含む、疾患または障害を処置する方法を提供する。例えば、疎水性医薬活性分子が、抗癌剤である場合、該疾患または障害は、癌である。

【0013】

最後に、本開示はまた、（ａ）本開示のブロックコポリマーを有機溶媒に溶解して、コポリマー溶液を得ること；および（ｂ）水溶液中で該コポリマー溶液を混合して、ナノ粒子を形成させること、を含む、本開示のナノ粒子を調製する工程を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】細胞内薬物放出のためのＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの水性媒体中での還元感受性を示す。

【図2】（ａ）ブランク・チオエステル−ＮＰ、（ｂ）ブランク・ＳＳ−ＮＰ、（ｃ）ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰ、および（ｄ）ＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰ、のＴＥＭ像を示す。

【図3】１０ｍＭ ＤＤＴ溶液を含む、または含まないインキュベーションの後のＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの粒度分布を示す。

【図4】図４（ａ）は、４℃で貯蔵されたＰＢＳ／ＦＢＳ（１：１）中のＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰの安定性を示し、図４（ｂ）は、３７℃のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）中でＤＴＴを含む、および含まないＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰの放出プロファイルを示す。

【図5a】ＤＯＸ当量１０μｇ／ｍＬで遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰと共に３０分間インキュベートしたＡ５４９および線維芽（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞の共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示す。スケールバーは、１０μｍである。青色−ＤＡＰＩで染色された核；赤色−ＤＯＸ。

【図5b】ＤＯＸ当量１０μｇ／ｍＬで遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰと共に２時間インキュベートしたＡ５４９および線維芽（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞の共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示す。スケールバーは、１０μｍである。青色−ＤＡＰＩで染色された核；赤色−ＤＯＸ。

【図5c】ＤＯＸ当量１０μｇ／ｍＬで遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰと共に４時間インキュベートしたＡ５４９および線維芽（ＮＩＨ３Ｔ３）細胞の共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示す。スケールバーは、１０μｍである。青色−ＤＡＰＩで染色された核；赤色−ＤＯＸ。

【図6a】ブランク・チオエステル−ＮＰおよびブランク・ＳＳ−ＮＰと共に２４時間インキュベートしたＡ５４９細胞の生存性を示す。

【図6b】異なるＤＯＸ濃度で遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰと共に２４時間インキュベートしたＡ５４９細胞の生存性を示す。

【図6c】異なるＤＯＸ濃度で遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰと共にインキュベートしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞生存性を示す。

【図7】ＤＯＸ当量１０μｇ／ｍＬで遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステルナノ粒子およびＤＯＸ封入ＳＳナノ粒子と共に２時間および４時間インキュベートしたＨｅＬａ細胞のＣＬＳＭ画像を示す。

【図8】異なる濃度のＤＯＸで遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰと共に４時間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の生存性を示す。

【図9】（ａ）静脈内注射後１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間および７２時間目の担腫瘍ＳＣＩＤマウスにおけるＤｉＲ封入ＳＳ−ＮＰのインビボ蛍光画像、ならびに（ｂ）注射後７２時間目の腫瘍および臓器のエクスビボ画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

発明の詳細な説明
開示された方法および材料を記載する前に、本明細書に記載された態様が具体的実施形態、方法、装置、または形態に限定されず、もちろんそれ自体が変動し得ることが理解されなければならない。同じく、本明細書で用いられる用語法が特別な態様を記載することを目的とし、本明細書に具体的に定義されない限り、限定を意図するものでないことが理解されなければならない。

【0016】

本開示の観点において、本明細書に記載された方法は、当業者によって構成されて、所望の要件を適えることができる。例えば特定の態様において、開示のコポリマーは、ステロイド含有ブロックと、ポリアルキレンオキシド含有ブロック、ポリエステル含有ブロック、またはポリペプチド部分含有ブロックと、で構成される。そのようなコポリマーは、音波処理またはホモジネーションを利用せずに水溶液中でナノ粒子として即座に自己組織化し、良好な生体適合性、高い薬物負荷能力、循環内での長期滞留、マルチモダリティの可能性を有し、容易に大規模製造することができる。別の実施例において、本開示のナノ構造は、抗癌剤などの疎水性治療活性分子を封入するために用いられ得る。抗癌剤を封入するナノ粒子は、遊離型抗癌剤に比較して、有意に低い毒性と共に高い腫瘍蓄積および抗腫瘍効力を示す。別の実施例において、本開示のブロックコポリマーは、官能基化され得（例えば、チオールで）、そのようなコポリマーはまた、水性媒体中で自己組織化して、官能基を有する明確に定義されたナノ粒子を形成した。チオールで官能基化されたナノ粒子は、物理的捕捉を介した疎水性抗癌剤と、チオール基への共有結合を介した金ナノ粒子（Ａｕ ＮＰ）と、の二重の封入のための多官能基担体として働いた。これらの二重のナノ粒子は、高い薬物負荷、高い封入効率、均一な粒度分布、および良好な安定性を示した。非還元性対照として、ジスルフィド結合を含まないコポリマーも合成し、インビトロおよびインビボで比較した。どちらの両親媒性液晶ポリマーも、水性媒体中で自己組織化して、生還元性および非還元性のナノ粒子を形成した。得られた本開示のジスルフィド含有ナノ粒子は、細胞外環境下で高い安定性を有し、細胞内還元条件下で急速な薬物放出を示した。

【0017】

本開示のブロックコポリマーは、第一のブロックがリンカーを場合により含むステロイド部分を含むことを必要とする。適切なステロイドは、所望の要件に適うように選択され得る。例えば該ステロイド部分は、コレステロール、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、ラノステロール、エストラジオール、テストステロン、胆汁酸、デキサメタゾン、セコステロイド、フィトステロールなどを含む。別の実施例において、該ステロイド部分は、コレステロール、コール酸、デオキシコール酸およびタウロコール酸から選択される。別の実施形態において、該ステロイド部分は、コレステロールを含む。

【0018】

ステロイドを含有する第一のブロックは、ブロックコポリマーの総重量の約１％〜約８０％（即ち、約１％〜約８０％の重量分率）存在し得る。例えば第一のブロックの重量分率は、ブロックコポリマーの総重量に基づき５０％を超える、または５０％未満、または約５％〜約７０％、または約４０％〜約７０％、または約４０％〜約５０％、または約６０％〜約７０％、または約２％〜約３０％、または約３％〜約３０％、または約５％〜約３０％、または約２％〜約２０％、または約３％〜約２０％、または約５％〜約２０％、または約７％〜約２０％であり得る。

【0019】

該ステロイド部分は、適切なリンカーＲ^１１を介してポリマーバックボーンに連結され得る。リンカーＲ^１１の幾つかの例としては、

【化3】

ポリラクトン、またはシロキサンのオリゴマーが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、Ｒ^１１のリンカーは、

【化4】

である。別の実施形態において、Ｒ^１１のリンカーは、

【化5】

である。別の実施形態において、Ｒ^１１のリンカーは、

【化6】

である。一実施形態において、Ｒ^１１のリンカーは、

【化7】

である。

【0020】

本開示のブロックコポリマーは、バックボーン部分Ａを必要とする。本明細書に記載されたブロックコポリマーは、例えば当業者に入手可能なポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリノルボネン、ポリシクロペンテン、ポリシクロオクテン、ポリシロキサン、ポリエステル、またはポリペプチドバックボーンＡを含有し得、所望の生成物に応じて変動し得る。一実施形態において、本開示のブロックコポリマーは、各Ａが独立してポリアクリラート、ポリメタクリラート、またはポリエステルであるブロックコポリマーである。別の実施形態において、各Ａは、独立してポリアクリラートまたはポリメタクリラートである。別の実施形態において、各Ａは、独立して、ポリアクリラートである。別の実施形態において、各Ａは、独立して、ポリメタクリラートである。別の実施形態において、各Ａは、独立してポリエステルである。

【0021】

例示的実施形態において、該第一のブロックは、式：

【化8】

で示される。

【0022】

本開示のブロックコポリマーは、第二のブロックが

【化9】

であることを必要とする。したがって第二のブロックは、ポリアルキレンオキシド、ポリエステル、またはポリペプチド部分であり得るＲ^２部分を含む。

【0023】

一実施形態において、Ｒ^２は、ポリアルキレンオキシド部分である。適切なポリアルキレンオキシドは、所望の要件に適うように選択され得る。幾つかの実施形態において、該ポリアルキレンオキシド部分は、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシドチオラート、ポリプロピレンオキシド、またはポリプロピレンオキシドチオラートを含む。別の実施形態において、該ポリアルキレンオキシド部分は、ポリエチレンオキシドまたはポリエチレンオキシドチオラートを含む。別の実施形態において、該ポリアルキレンオキシド部分は、ポリエチレンオキシドを含む。

【0024】

一実施形態において、Ｒ^２は、ポリエステル部分である。適切なポリエステルとしては、主鎖にエステル官能基を含むポリマーが挙げられる。例としては、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

一実施形態において、Ｒ^２は、ポリペプチド部分である。適切なポリペプチドは、ペプチド（アミド）結合によって互いに連結されたアミノ酸モノマーの１つまたは複数の鎖を含み、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸（インビボでＬ−アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性がある）、またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組み合わせを含み得る。典型的には、本明細書に記載されたポリペプチドは、約１００アミノ酸長未満の鎖を指す。本明細書に記載されたポリペプチドは、化学合成または組換え発現され得る。

【0026】

第二のブロックは、ブロックコポリマーの総重量の約２０％〜約９９％（即ち、約２０％〜約９９％の重量分率）存在し得る。例えば第二のブロックの重量分率は、ブロックコポリマーの総重量に基づいて、５０％を超える、または５０％未満、または約３０％〜約９５％、または約３０％〜約６０％、または約５０％〜約６０％、または約３０％〜約４０％、または約７０％〜約９８％、または約７０％〜約９７％、または約７０％〜約９５％、または約８０％〜約９８％、または約８％〜約９７％、または約８０％〜約９５％、または約８０％〜約９３％であり得る。

【0027】

第二のブロックはまた、還元性ジスルフィド結合を含むＲ^３リンカーを含む。一実施形態において、Ｒ^３は、

【化10】

からなる群から選択される。一実施形態において、Ｒ^３は、

【化11】

である。別の実施形態において、Ｒ^３は、

【化12】

から得られる。

【0028】

特定の実施形態において、本開示のコポリマーは、鎖の末端部分Ｘ：

【化13】

をさらに含み得る。一実施形態において、Ｘは、トリチオカルボナート、ジチオカルバマート、またはジチオエステルである。別の実施形態において、Ｘは、ＳＣ（Ｓ）Ｓ−（Ｃ_１〜Ｃ_２４アルキル）である。別の実施形態において、Ｘは、−ＳＣ（Ｓ）Ｓ−Ｃ_１２Ｈ_２５である。

【0029】

一実施形態において、本開示のコポリマーは、ポリアクリラートまたはポリメタクリラートを有するコレステロールブロックと、還元性ジスルフィド結合を有するポリアルキレンオキシドブロックと、を含む。一実施形態において、本開示のコポリマーは、ポリアクリラートまたはポリメタクリラートを有するコレステロールブロックと、還元性ジスルフィド結合を有するポリエチレングリコールブロックと、を含む。

【0030】

一実施形態において、本開示のブロックコポリマーは、構造：

【化14】

（式中、ｍは、約５〜約２００の整数であり、ｎは、約５〜約１００の整数である）を含む。

【0031】

ｍおよびｎの値は、当業者によって選択され得、所望の生成物に応じて変化し得る。例えばｍは、約１０〜約１００であり得、そして／またはｎは、約１５〜約８５であり得る。本開示のブロックコポリマーの分子量は、約５，０００〜約２００，０００Ｄａであり得る。一実施形態において、本開示のブロックコポリマーは、約５，０００〜約１５０，０００Ｄａ、または約５，０００〜約１００，０００Ｄａ、約５，０００〜約６０，０００Ｄａ、または約１０，０００〜約１５０，０００Ｄａ、または約１０，０００〜約１００，０００Ｄａ、または約１０，０００〜約６０，０００Ｄａ、または約２０，０００〜約１５０，０００Ｄａ、または約２０，０００〜約１００，０００Ｄａ，または約２０，０００〜約６０，０００Ｄａである。

【0032】

本開示のブロックコポリマーは、１種または複数のさらなる官能基をさらに含み得る。官能基の例としては、チオール基、リン酸基、カルボン酸基などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、特定の用途に基づいて所望の官能基を選択することができよう。例えばチオール官能基化ブロックコポリマーは、疎水性抗癌剤（即ち、物理的捕捉を介した）と、チオール基への共有結合を介した金ナノ粒子（Ａｕ ＮＰ）と、の二重の封入のための多官能基担体として働き得る。同様にリン酸またはカルボン酸官能基化ブロックコポリマーは、量子ドット（例えば、ＣｄＳｅなど）または磁気ナノ粒子を封入するために用いられ得る。

【0033】

本明細書に開示されたブロックコポリマーは、例えば比較的低い多分散性をはじめとする複数の所望の性質を有する。場合により本発明の実施形態において、該ポリマー鎖は、Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎが約１．０〜約２．５になるような多分散指数を示す。幾つかの実施形態において、該多分散指数は、約１．０〜約２．０、または約１．０〜約１．９、または約１．１〜約１．９、または約１．０〜約１．８、または約１．１〜約１．８、または約１．０〜約１．５、または約１．５〜約１．５、または約１．０〜約１．３、または約１．０〜約１．２、または約１．０、または約１．１、または約１．２、または約１．３、または約１．４、または約１．５、または約１．６、または約１．７、または約１．８、または約１．９、または約２．０である。特定の実施形態において、該ポリマーは、Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎが約１．０〜約１．５の多分散性を示す。特定の他の実施形態において、該ポリマーは、Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎが約１．０〜約１．２の多分散性を示す。

【0034】

一態様において本開示のコポリマーは、ナノ粒子形態（例えば、コア／シェルナノ粒子形態）で存在し得る。一実施形態において、該コア／シェルナノ粒子形態は、水溶液中で自己組織化された本開示のブロックコポリマーである。そのようなナノ粒子は、自己組織化工程の間に多量の疎水性薬物分子をナノ粒子中に封入することが可能である。したがって一態様において、本開示は、本開示の両親媒性コポリマーを用いた薬物送達のためのナノ粒子系を提供する。一態様において、本開示は、本開示のブロックコポリマーと、疎水性医薬活性分子と、を含むナノ粒子を提供する。任意の適切な疎水性医薬活性分子は、所望の治療効果に応じて用いられ得る。幾つかの例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カンプトテシン、イリノテカン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、またはデキサメタゾンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0035】

本開示のナノ粒子は、金ナノ粒子などの金属ナノ粒子および／または磁気ナノ粒子および／または量子ドット（例えば、近赤外（ＮＩＲ）量子ドット、ＣｄＳｅなど）の１種または複数をさらに含み得る。

【0036】

本明細書に開示されたブロックコポリマーは、例えば均一な粒度分布によって明確に定義されたような複数の所望の性質を有する。本開示のナノ粒子は、約５〜約９００ｎｍのサイズのいずれかであり得る。例えばナノ粒子は、約５〜約２００ｎｍ、または約１０〜約１００ｎｍ、または約１０〜約２００ｎｍ、または約５０〜約１５０ｎｍ、または約１００〜約２５０ｎｍ、または約１００〜約２００ｎｍ、または約１２０〜約１５０ｎｍ、または約１１０〜約１５０ｎｍ、または約１２０〜約１８０ｎｍ、または約１５０〜約２５０ｎｍ、または約１５０〜約２００ｎｍであり得る。

【0037】

本開示はまた、（ａ）請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコポリマーを有機溶媒に溶解して、コポリマー溶液を得ること；および（ｂ）水溶液中で該コポリマー溶液を混合して、ナノ粒子を形成させること、を含む、本開示のナノ粒子を調製する方法を提供する。ナノ粒子の調製に適した有機溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフラン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。該コポリマー溶液を混合することは、水溶液中での透析によって実施され得る。

【0038】

定義
本明細書全体を通して、文脈で他に要求されない限り、言語「含む」および「包含する」およびその活用（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「包含している」）は、言及された成分、特色、要素、または成分のステップもしくは群、複数の特色、複数の要素、あるいは複数のステップの包含を意味するが、任意の他の整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群を除外しないことは理解されよう。

【0039】

本明細書および添付の特許明細書で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明確な断りがなければ、複数の対象を含む。

【0040】

範囲は、本明細書において、「約」特定の値、および／または「約」別の特定の値のように表現され得る。そのような範囲が、表されている場合、別の態様は、１つの特定の値から、そして／または別の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用によって値が近似値として表されている場合、特定の値が別の態様を形成していることが理解されよう。範囲それぞれのエンドポイントが他のエンドポイントに関係して、そして他のエンドポイントと独立して、の両方において有意であることがさらに理解されよう。幾つかの実施形態において、用語「約」は、列挙された値の±１０％を意味する。別の実施形態において、用語「約」は、列挙された値の±５％を意味する。

【0041】

本明細書で用いられる用語「組み合わせること」は、１つまたは複数の物質を反応混合物に添加することを包含する。

【0042】

本明細書で用いられる用語「分散性」、「多分散性」、「多分散性指数」、「ＰＤＩ」および「Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ」は、互換的に用いられ、分子量の分布に関するポリマー均一性の尺度を指す。分散性は、重量平均分子量（Ｍ_ｗ）を数平均分子量（Ｍ_ｎ）で除算することによって計算され得る（即ち、Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ）。特定の実施形態において、分散性は、重合度に従って計算され得、ここで分散性は、Ｘ_ｗ／Ｘ_ｎであり、Ｘ_ｗは、重量平均重合度であり、Ｘ_ｎは、数平均重合度である。

【0043】

本明細書における全ての％値、比率および割合は、他に断りがなければ重量による。成分の重量％（重量％、ｗｔ％とも）は、反することが明記されない限り、成分を含む組成物の総重量に（例えば、反応混合物の総量に）基づいている。

【0044】

実施例
本開示の材料および方法を、さらに以下の実施例によって例示するが、範囲または主旨における開示を、実施例に記載された具体的手順および材料に限定するものと解釈されるべきではない。

【0045】

材料および方法
ドキソルビシン塩酸塩（ＤＯＸ．ＨＣｌ）は、Ｂｉｏｔａｎｇ Ｉｎｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、米国マサチューセッツ州所在）から購入した。Ｄ，Ｌ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、チオグリコール酸（９８％）、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（ＰＴＳＡ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）、ピレンおよび他の従来の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（米国ミズーリ州セントルイス所在）から得た。トリエチルアミン（ＴＥＡ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国マサチューセッツ州ボストン所在）から購入した。ペニシリン−ストレプトマイシン、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−０．０３％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ溶液、ＲＰＭＩ １６４０、およびＤＭＥＭ培地は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国メリーランド州ロックビル所在）から購入した。マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）およびヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）は、米国立癌研究所（米国メリーランド州フレデリック所在）から購入した。ウシ胎児血清は、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（米国ジョージア州ノークロス所在）から購入した。１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（ＤｉＲ）およびインビトロ毒性検査キット（ＭＴＴに基づく）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールズバッド所在）から得た。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州ランチョドミンゲル所在）から購入した。化学薬品は全て、分析等級であり、精製せずに用いた。液晶モノマーである６−メタクリロイルオキシヘキサン酸コレステリル（Ｃ５ＭＡ）は、Ｈａｍｌｅｙら（Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ． ２００５；１：３５５−３６３．）に従って調製した。ＲＡＦＴ剤であるＳ−１−ドデシル−Ｓ’−（α，α’−ジメチル酢酸）トリチオカルボナート（ＣＴＡ）は、Ｌａｉら（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ２００２； ３５：６７５４−６７５６）に従って合成した。

【0046】

データは、平均±標準偏差として表した。実験群と対照群の差の統計学的有意性は、スチューデントｔ検定を用いて決定した。０．０５未満の確率（ｐ）は、統計学的に有意と見なした。

【0047】

実施例１：ジスルフィド結合を有するコレステロール系ブロックコポリマーＰＥＯ−ＳＳ−ＰＣ５ＭＡの合成および精製

【化15】

【0048】

ＲＡＦＴ剤：ヒドロキシメルカプトピリジン（２．５２ｇ、１３．４６ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン５０ｍＬに溶解し、Ｓ−ドデシル−Ｓ’−２−（２，２−ジメチル酢酸）トリチオカルボナート（３．６２ｇ、１１．２１ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加した。ＤＣＣ（２．７８ｇ、１３．４６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．４ｇ、３．３６ｍｍｏｌ） をこの混合物に引き続き添加して、溶液を室温で１２時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、粗反応混合物を、固定相としてのシリカゲルおよび溶離液としての酢酸エチル／ヘキサン（４：１ｖ／ｖ比）混合物を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製して、ＲＡＦＴ剤４．４ｇ（８３％）を黄色液として得た。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）δ：８．４１（ｄ，１Ｈ），７．７０−７．６２（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｔ，１Ｈ），４．３２（ｔ，２Ｈ），３．２２（ｔ，２Ｈ），３．００（ｔ，２Ｈ），１．６７−１．６０（ｍ，８Ｈ），１．３３−１．２１（ｍ，１８Ｈ），０．８４（ｔ，３Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：１７２．７，１５９．９，１４９．６，１３７．１，１２０．８，１１９．７，６３．３，５５．８，３７．２，３７．０，３１．９，２９．６，２９．５，２９．４，２９．３，２９．１，２８．９，２７．９，２５．３，２２．７，１４．２。

【0049】

ＰＥＯ−ＳＨ：メトキシポリエチレングリコール２００００（５．０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびＰＴＳＡ（１７ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ中の新たに蒸留されたトルエンに添加した。その後、この溶液に、チオグリコール酸（１５０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を緩やかに添加した。この溶液を、その後、Ａｒ雰囲気下で一晩還流した。反応混合物を冷まして、真空濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／水を用いて分別し、有機層をＭｇＳＯ_４で脱水した。有機層を回収して、濃縮した。その後、粗生成物をメタノール２０ｍＬに溶解した後、ＤＴＴ（３０８ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加して、ジスルフィドを形成する可能性を低減した。溶液を室温で３時間撹拌した。得られた溶液をジエチルエーテルに注ぎ、生成物ＰＥＯ−ＳＨを沈殿させ、エーテルで５回洗浄して、ＤＴＴを除去した。純粋な生成物４．０ｇを白色固体として収率８０％で得た。ＧＰＣ（ＴＨＦ） Ｍ_ｎ：２０２５０。ＰＤＩ：１．０６。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：４．２７（ｔ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２−，ＰＥＯ末端基中），３．７９−３．４４（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−，ＰＥＯの繰り返し単位），３．３５（ｓ，−ＯＣＨ_３）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：１７０．９（−ＣＯＯ），７０．３，６４．８，５９．７（ＰＥＯ中の−ＣＨ_２繰り返し単位）。

【0050】

ＰＥＯマクロ連鎖移動剤：ＲＡＦＴ剤（３．０ｇ、５．６２ｍｍｏｌ）、ＰＥＯ−ＳＨ（４．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、および氷酢酸０．５ｍＬを、メタノール（５０ｍＬ）に溶解して、反応混合物を窒素雰囲気下、室温で６時間撹拌した。反応を停止させて、溶媒を蒸発させた。粗ＰＥＯマクロ連鎖移動剤生成物を、固定相としてのシリカゲルおよび溶離液としての酢酸エチル／ヘキサン（４：１ｖ／ｖ比）および塩化メチレン／メタノール（４：１ｖ／ｖ比）の混合物を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。純粋物５．８ｇを、淡黄色固体として収率７６％で得た。ＧＰＣ（ＴＨＦ） Ｍ_ｎ：２０４００。ＰＤＩ：１．１２。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：４．２６−４．１９（ｍ，４Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２−，ＰＥＯ末端基中），３．８０−３．４２（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−，ＰＥＯの繰り返し単位），３．３５（ｓ，−ＯＣＨ_３），３．２２（ｔ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２−Ｓ−），１．６７−１．６０（ｍ，−Ｓ−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＯＯ−），１．３３−１．２１（ｍ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２Ｓ−），０．８４（ｔ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２Ｓ−）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：１７２．６，１６９．４，７０．８，７０．４，６８．８，６４．６，６３．４，６２．１，５８．９，５５．８，５３．４，４１．５，３６．９，３６．５，３１．８，２９．５，２９．３，２９．０，２７．８，２５．３，２２．６，２１．２，１４．１。

【0051】

ＰＥＯ−ＳＳ−ＰＣ５ＭＡ：代表的手順において、ＰＥＯマクロ連鎖移動剤（１．２ｇ、０．２ｍｍｏｌ）と、Ｃ５ＭＡ（３．８ｇ、２８．０ｍｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ（６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）との混合物を、１，４−ジオキサン（３ｍＬ）に溶解して、３回の凍結−排気−解凍サイクルを実施することによって脱気した。反応混合物を密閉し、その後、オイルバスに入れて、９０℃で２０時間保持した。得られた混合物を濃縮し、大過剰のメタノールに沈殿させた。粗生成物を回収し、ソックスレーでメタノールを用いて一晩抽出し、未反応のモノマーを除去し、その後、ＴＨＦで抽出して、メタノールに再沈殿させた。生成物ＰＥＯ−ＳＳ−ＰＣ５ＭＡを回収して、真空乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：５．３３（ｄ，１Ｈ，−Ｃ＝ＣＨ−，コレステリル部分のオレフィン基），４．５（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ_２−ＣＯＯ−ＣＨ），３．９（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２），３．６４（ｍ，ＰＥＯの−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−繰り返し単位），３．４５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ_２ＯＣＨ−），３．３６（ｓ，−ＯＣＨ_３），３．２（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２−Ｓ−），２．５０−０．５５（ｍ，−ＣＨ_３，−ＣＨ_２−，−ＣＨ−，コレステリル部分の−ＣＨ−（ＣＨ_３）−，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯ−，スペーサの−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：１７０．９（−ＣＯＯ），１４０．９（−Ｃ＝ＣＨ−，コレステロール中のオレフィン基），１２１．９（−Ｃ＝ＣＨ−，コレステロール中のオレフィン基），１３３，１２６．６（−ＣＨ_２，ビニル基中のＣＨ），７４．５（−ＣＯＯＣＨ），７０．３および６４．８（ＰＥＯ中の−ＣＨ_２繰り返し単位），５１．３−１１．２（−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯ−，−コレステロール）。

【0052】

合成されたままのＰＥＯ−ＳＳ−ＰＣ５ＭＡの詳細な化学構造を、^１Ｈ−ＮＭＲによって確認した。^１Ｈ−ＮＭＲでは、得られたブロックコポリマーのモル組成および分子量の決定が可能になった。５．３、３．９および２．５〜０．５５ｐｐｍのシグナルは、コレステロールのプロトンに起因した。加えて、モノマーオレフィンの６．４２、６．０９および５．５４ｐｐｍのピークは、ＰＥＯ−ＳＳ−ＰＣ５ＭＡには存在しなかった。ＰＥＯ繰り返し単位およびＰＥＯのメチレン末端基に対応するＰＥＯブロックのシグナルが、それぞれ３．６ｐｐｍおよび４．２５ｐｐｍに観察された。５．３３ｐｐｍ（コレステリル部分のオレフィン基）および３．６４ｐｐｍ（ＰＥＯ繰り返し単位）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるピークの積分値を比較することによって、各ブロックの重量分率を決定した。ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、ＰＥＯ−ＳＳ−ＰＣ５ＭＡの数平均分子量（Ｍ_ｎ）および多分散指数（ＰＤＩ）を測定した（表１）。

【表1】

【0053】

実施例２：ジスルフィド結合を有さないコレステロール系ブロックコポリマーＰＥＯ−ＰＣ５ＭＡの合成および精製

【化16】

【0054】

ＰＥＯマクロ連鎖移動剤：メトキシポリエチレングリコール２００００（５．０ｇ、０，２５ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤（３．０ｇ、５．６２ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（１．２０ｇ、６ｍｍｏｌ）を、室温の無水ＣＨ_２Ｃｌ_２ ４０ｍＬに溶解して、反応混合物を１０分間撹拌した。４−ジ（メチルアミノ）ピリジン（７３．２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の添加の後、反応混合物を室温でさらに２０時間撹拌した。反応を停止させて、溶媒を蒸発させた。得られた溶液をジエチルエーテルに注ぎ、生成物を沈殿させた。粗生成物を、固定相としてのシリカゲルおよび溶離液としての塩化メチレン／メタノール（４：１ｖ／ｖ比）を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。純粋なＰＥＯマクロ連鎖移動剤を、黄色固体として収率８２％で得た。ＧＰＣ（ＴＨＦ） Ｍ_ｎ：２０ ８００。ＰＤＩ：１．０９。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：４．２６−４．１９（ｍ，４Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２−，ＰＥＯ末端基中），３．８０−３．４２（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−，ＰＥＯの繰り返し単位），３．３５（ｓ，−ＯＣＨ_３），３．２２（ｔ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２−Ｓ−），１．６７−１．６０（ｍ，−Ｓ−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＯＯ−），１．３３−１．２１（ｍ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２Ｓ−），０．８４（ｔ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２Ｓ−）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：１７２．６，１６９．４，７０．８，７０．４，６８．８，６４．６，６３．４，６２．１，５８．９，５５．８，５３．４，４１．５，３６．９，３６．５，３１．８，２９．５，２９．３，２９．０，２７．８，２５．３，２２．６，２１．２，１４．１。

【0055】

ＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステル：ＰＥＯマクロ連鎖移動剤（１．２ｇ、０．２ｍｍｏｌ）と、Ｃ５ＭＡ（３．８ｇ、２８．０ｍｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ（６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）との混合物を、１，４−ジオキサン（３ｍＬ）に溶解して、３回の凍結−排気−解凍サイクルを実施することによって脱気した。反応混合物を密閉し、その後、オイルバスに入れて、９０℃で２０時間保持した。得られた混合物を濃縮し、大過剰のメタノールに沈殿させた。粗生成物を回収し、ソックスレーでメタノールを用いて一晩抽出し、未反応のモノマーを除去し、その後、ＴＨＦで抽出して、メタノールに再沈殿させた。生成物ＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルを回収して、真空乾燥させた。チオエステルのピークが、ＵＶ可視分光法による測定で３１０ｎｍに現れた。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：５．３３（ｄ，１Ｈ，−Ｃ＝ＣＨ−，コレステリル部分のオレフィン基），４．５（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ_２−ＣＯＯ−ＣＨ），３．９（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２），３．６４（ｍ，ＰＥＯの−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−繰り返し単位），３．４５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ_２ＯＣＨ−），３．３６（ｓ，−ＯＣＨ_３），３．２（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２−Ｓ−），２．５０−０．５５（ｍ，−ＣＨ_３，−ＣＨ_２−，−ＣＨ−，コレステリル部分の−ＣＨ−（ＣＨ_３）−，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯ−，スペーサの−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：１７０．９（−ＣＯＯ），１４０．９（−Ｃ＝ＣＨ−，コレステロール中のオレフィン基），１２１．９（−Ｃ＝ＣＨ−，コレステロール中のオレフィン基），１３３，１２６．６（−ＣＨ_２，ビニル基のＣＨ），７４．５（−ＣＯＯＣＨ），７０．３および６４．８（ＰＥＯの−ＣＨ_２繰り返し単位），５１．３−１１．２（−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯ−，−コレステロール）。ＧＰＣ（４０℃，ＴＨＦ移動相，ポリスチレン標準）：Ｍ_ｎ＝３９６００ｇ／ｍｏｌ，ＰＤＩ＝１．１７。

【0056】

実施例３：自己組織化ナノ粒子およびＤＯＸ−ＮＰの調製および特徴づけ
ブランク・自己組織化ＮＰを、透析法によって調製した。手短に述べると、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯまたはＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルを、音波処理の助けを借りてＤＭＦに溶解した。その後、溶液を透析袋（ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ）に移し、蒸留水で４８時間透析した。ＤＯＸ負荷ＳＳ−ＮＰおよびチオエステル−ＮＰを調製するために、ＤＯＸ．ＨＣｌを最初、トリエチルアミン（ＴＥＡ）２当量を含有するＤＭＦに溶解して、暗室で一晩撹拌し、疎水性ＤＯＸおよびＴＥＡ．ＨＣｌを形成させた。各コポリマーを添加し、その後、溶液をさらに暗室で１時間撹拌した。その後、溶液を蒸留水で４８時間透析して、溶媒を除去した。ＤＯＸは疎水性で、溶解度が低いため、その溶解度を超える非封入ＤＯＸが、水に沈殿することになる。沈殿したＤＯＸを、８０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去し、続いて０．４５μｍシリンジによりろ過し、ＤＯＸ封入ナノ粒子の透明の赤色溶液を回収した。最終生成物を、凍結乾燥後に回収した。

【0057】

ＤＯＸ負荷ＳＳまたはチオエステルＮＰ（１ｍｇ／ｍＬ）の平均粒子径、粒度分布およびゼータ電位を、動的光散乱法（ＤＬＳ）（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）を用いて測定した。ＤＯＸ負荷ＳＳまたはチオエステルＮＰの形態を、ＴＥＭ（ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｂｉｏｔｗｉｎ、オランダ アイントホーフェン所在）により撮像した。ナノ粒子の懸濁液をホルムバール／カーボンフィルムグリッドに滴加して風乾することにより、標本を調製した。

【0058】

ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯまたはＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルコポリマーの臨界凝集濃度（ＣＡＣ）を、ピレンを疎水性プローブとして用いて蛍光測定することによって決定した。アセトン中のピレン溶液（３×１０^−４Ｍ）をガラス管に添加し、続いて蒸発させて有機溶媒を除去した。様々な濃度のコポリマー溶液（１０ｍＬ）をガラス管に添加して、６０℃で３時間音波処理し、ピレンとナノ粒子を平衡にした。コポリマー濃度は、０．００５〜０．５ｍｇ／ｍＬの範囲内であり、ピレンの最終濃度は、６．０×１０^−７Ｍであった。ピレンの発光スペクトルを、３３６ｎｍの励起波長で蛍光分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５５ｂ、米国）を用いて３５０〜４５０ｎｍで記録した。ピレン発光スペクトルの一番目（３７４．５ｎｍ）と三番目に高いエネルギーバンド（３８６ｎｍ）の強度比の測定では、励起および発光スペクトルのスリット開口を５ｎｍに設定した。

【0059】

ナノ粒子へのＤＯＸ封入の量を、比色法によって決定した。凍結乾燥されたＤＯＸ負荷ＳＳまたはチオエステルＮＰ（０．５ｍｇ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解して、透明溶液を得た。４８０ｎｍでの吸光度を、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（島津製作所、日本所在）で検出した。ＤＯＸ溶液を様々な濃度で調製して、４８０ｎｍの吸光度を測定し、薬物負荷量を計算するための検量線を作成した。薬物負荷量（ＤＬＣ）および封入効率（ＥＥ）を、以下の方程式を利用して計算した。

【数1】

【数2】

【0060】

水溶液中のＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯコポリマーの自己組織化挙動を、ピレンを疎水性蛍光プローブとして用いて臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を測定することによって特徴づけた。ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯコポリマーのＣＭＣ値（１１．４±０．１ｍｇ／Ｌ）は、ＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルコポリマーの値（１３．１±０．３ｍｇ／Ｌ）よりもわずかに低かった（表２）。

【表2】

【表3】

【0061】

疎水性ＤＯＸを、ＤＯＸとコレステロール部分の間の疎水性相互作用を通して、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯおよびＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルで自己組織化されたＮＰに封入した。ＤＯＸ．ＨＣｌ供給比２０％（ｗ／ｗ）を用いると、ＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルＮＰの薬物負荷量（ＤＬＣ）は、約１７．１％であり、封入効率（ＥＥ）は、８８．１％であった。ＤＬＣおよびＥＥ値は、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯコポリマーがわずかに高かった （それぞれ１８．２％ｗ／ｗおよび９４．９％）（表２）。ブランク・ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰ、ブランク・ＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルＮＰ、ＤＯＸ封入ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰ、およびＤＯＸ封入ＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルＮＰのサイズおよび形態を、それぞれＴＥＭ（図２）および動的光散乱法（ＤＬＳ）（表２）によって検査した。ＴＥＭ画像から、自己組織化ナノ粒子の全てが、２０〜４０ｎｍサイズの球形であることが示された（図２ａ〜ｄ）。ＤＬＳによって測定されたブランク・ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰおよびブランク・ＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルＮＰの平均粒子径は、それぞれ約８５．１ｎｍおよび９２．３ｎｍであり、狭い粒度分布であった（ＰＤＩ ０．２未満）（表２）。これらは、ＴＥＭによって測定されたサイズよりも大きく、それは自己組織化ＮＰが水性媒体において膨潤状態で存在するためであり得る。ＤＯＸの封入によって、ナノ粒子の粒子径がＤＯＸ封入ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰでは８９．４ｎｍに、そしてＤＯＸ封入ＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯチオエステルＮＰでは１０１．３ｎｍにわずかに増加した。ＳＳ−ＮＰ、チオエステル−ＮＰ、およびＤＯＸ負荷ＮＰは、−２２ｍＶ〜−２６ｍＶの範囲内のゼータ電位値に反映される通り、表面は負に帯電していた。ＤＯＸの物理的負荷は、ナノ粒子の表面負電荷をわずかに低下させた。

【0062】

還元により惹起された不安定化を観察するために、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）中の１０ｍＭ ＤＴＴと共に振とうしながら３７℃でインキュベートし、ＮＰのサイズ変動を異なる時間間隔で検査した。ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰのサイズ増加、および２つのピークの出現が、ＤＴＴとの３０分間のインキュベートの際に観察された（図３）。ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの初期サイズは、単峰型分布で８５．１±３．１ｎｍの平均水力学的径を示した。しかしＮＰの粒子径は、ＤＴＴとの３０分インキュベート後に２３５ｎｍに、そして２時間インキュベート後に５４０ｎｍに劇的に増加した。４時間のＤＴＴとのインキュベーション後には、粒子径が測定することができず、ＳＳ−ＮＰの解離の完了が示された。

【0063】

実施例４：ＤＯＸ封入ＮＰの安定性
凍結乾燥されたＤＯＸ負荷ＳＳまたはチオエステルＮＰ（１ｍｇ／ｍＬ）を、血清含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（５０％ＦＢＳ）に懸濁させた後、１０分間音波処理し、０．４５μｍシリンジろ過膜でろ過した。４℃で貯蔵されたナノ粒子の粒子径を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いて貯蔵時間にわたってモニタリングした。還元で惹起されたＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰの不安定化を、水性媒体中の１０ｍＭ ＤＴＴに応答したＮＰのサイズ変動を検出することによって観察した。手短に述べると、ＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰを１ｍｇ／ｍＬ濃度で、１０ｍＭ ＤＴＴを含有するＰＢＳに溶解し、その後、３７℃の振とう浴に保持した。粒子径を、所定の時間にＤＬＳによって測定した。ＤＯＸ封入ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰおよびＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルＮＰの平均粒子径は、５０％ＦＢＳ中での４℃での１週間貯蔵後に有意に変化せず（図４ａ）、沈殿または凝集が観察されなかった。

【0064】

実施例５：還元により惹起されたＳＳまたはチオエステルＮＰからのＤＯＸ放出
ナノ粒子からのＤＯＸのインビトロ放出を、透析法を利用して試験した。手短に述べると、凍結乾燥されたＤＯＸ負荷ＮＰ（６ｍｇ）を、ＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）３ｍＬに懸濁させた後、１０分間音波処理して、光学的に透明な懸濁液を得た。懸濁液を５ｍＬ透析器（ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ）に導入して、１００ｒｐｍの振とう浴において３７℃で、ＰＢＳまたは１０ｍＭ ＤＴＴ含有のＰＢＳ ２０ｍＬに浸漬した。選択された時間間隔で、アリコット（１０ｍＬ）を溶解媒体から取り出し、同容量の新しい培地を補充した。ＤＯＸ濃度を、４８０ｎｍのＵＶにより直ちに測定した。放出されたＤＯＸの割合％を、既知ＤＯＸ濃度の標準曲線に基づいて計算した。

【0065】

ＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰは、細胞内区画と類似の還元環境である１０ｍＭ ＤＴＴの存在下で、ＤＯＸを急速に放出し、５時間以内に５０％ＤＯＸ放出および２４時間以内に約７０％薬物放出を示した。反対に、最小薬物放出（約１０％）が、同じ条件下の非還元性ＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯ−チオエステルＮＰおよびＤＴＴの非存在下でのＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰで２４時間後に観察された（図４ｂ）。

【0066】

実施例６：Ａ５４９およびＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＤＯＸ封入ＮＰの細胞内取り込みおよび放出挙動
Ａ５４９（癌細胞）およびＮＩＨ３Ｔ３（正常細胞）細胞を、Ｌａｂ−Ｔｅｋ ＩＩチャンバースライドの８ウェルチャンバーにおいて１．０×１０^５個／ウェルの密度で播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間プレインキュベートした。同一用量（１０μｇ／ｍＬ）の遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰを含有する無血清ＤＭＥＭを各ウェルに添加した後、３７℃で３０分間、２時間および４時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳですすぎ、４％ホルムアルデヒド溶液で１０分間固定した。その後、カバーガラスをガラススライドに配置した。ＤＯＸ封入ＳＳまたはチオエステルＮＰの細胞内取り込みおよび放出挙動を、ＤＯＸの励起波長４８８ｎｍで共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）（Ｌｅｉｃａ、英国所在）によって撮像した。ＤＯＸそのものが蛍光性であるため、それを用いて、ナノ粒子のさらなる蛍光標識を行わずに直接、細胞内取り込みを検討した。

【0067】

図５に示された通り、Ａ５４９細胞をＤＯＸ封入チオエステルＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰと共に３０分間インキュベートすると、赤色蛍光シグナルが、主に細胞質で観察されたが、遊離ＤＯＸは、細胞核に進入していた。２時間および４時間までインキュベーション時間を増加させることによって、遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰが細胞核内で強力な赤色シグナルを示したが（図５ａ）、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰは、依然として細胞質のままであった（図５ｂ〜ｃ）。反対に、非還元性ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰからの細胞内薬物放出は、同じ条件下で無視できる程度であった。陰性対照として、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰの細胞内取り込みを比較するために用いた。細胞を遊離ＤＯＸと共にインキュベートすると、赤色シグナルが３０分〜４時間の全ての時点で細胞核内において観察された。細胞がＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰに暴露されると、赤色蛍光シグナルが４時間まで主に細胞質内で視覚化された（図５ａ〜ｃ）。結果から、レドックス感受性ナノ粒子からのＤＯＸ放出が、４時間インキュベーションの間、ＮＩＨ３Ｔ３などの正常細胞では無視できる程度であることが示された。

【0068】

実施例７：Ａ５４９およびＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＤＯＸ封入ＮＰの細胞毒性
Ａ５４９およびＮＩＨ３Ｔ３細胞（７５００個／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、１％抗体、および１％Ｌ−グルタミンを補充されたＤＭＥＭ ２００μＬ中、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間培養した。インキュベーション後に、補充物質を含まないＤＭＥＭに溶解された様々な濃度のＤＯＸ封入ＳＳまたはチオエステルＮＰおよび遊離ＤＯＸ（１〜５０μｇ／ｍＬ ＤＯＸ当量）を添加した。２４時間のインキュベーション後に、細胞毒性を、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、スイス メンネドルフ所在）で５４０ｎｍでの３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−３，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド色素（ＭＴＴ色素、最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）の取り込みを利用して決定した。

【0069】

ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰのインビトロ細胞毒性を、ＭＭＴアッセイを利用してＡ５４９およびＮＩＨ３Ｔ３細胞における遊離ＤＯＸと比較した。図６は、異なるＤＯＸ当量濃度でのブランク・ナノ粒子、遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰで処置されたＡ５４９およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の生存性を示す。ブランク・チオエステル−ＮＰおよびＳＳ−ＮＰは、１ｍｇ／ｍＬ濃度であってもＡ５４９細胞に対して無視できる程度の毒性を示し、処置の２４時間後に９０％を超える細胞生存性を有しており、Ａ５４９細胞への該ナノ粒子の良好な適合性が示された（図６ａ）。遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ封入ナノ粒子は、用量依存的に（１〜５０μｇ／ｍＬ ＤＯＸ）２４時間インキュベーションの後に細胞生存性を５〜８２％低下させた（図６ｂ）。ＤＯＸ濃度を１μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬへ上昇させることによって、遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰは、細胞生存性を大幅に低下させたが、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰは、細胞生存性を徐々に低下させた。全てのＤＯＸ濃度で、遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰの細胞毒性は、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰよりも有意に高かった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰの毒性は、全てのテスト濃度のＤＯＸでＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰと同等であった（図６ｃ）。

【0070】

実施例６：ＨｅＬａ細胞におけるＤＯＸ封入ＮＰの細胞内取り込みおよび放出挙動
細胞内取り込みを観察するために、ＨｅＬａ（癌細胞）をＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩチャンバースライドの８ウェルチャンバーにおいて１．０×１０^５個／ウェルの密度で播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間プレインキュベートした。同一用量（２５μｇ／ｍＬ）の遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰを含有する無血清ＤＭＥＭを各ウェルに添加した後、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳですすぎ、１０μＭ Ｄｒａｑ５で染色して、４％ホルムアルデヒド溶液で１０分間固定した。その後、カバーガラスをガラススライドに配置した。遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰの細胞内取り込みを、ＤＯＸの励起波長４８８ｎｍでＣＬＳＭによって撮像した。細胞内取り込みを定量するために、０．５ｍＬ中のＨｅＬａ細胞（５×１０^５個／ウェル）を２４ウェルプレートにおいて、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、３７℃で２４時間生育した。同一用量（２５μｇ／ｍＬ）の遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰを含有する無血清ＤＭＥＭを細胞に添加し、引き続き２時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで３回すすぎ、トリプシン処理によって回収して、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）試験管に移した。試料は全て、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンホセ所在）によって分析して、細胞内在化を決定した。細胞内ＤＯＸの蛍光測定を、ＦＬ２チャンネルで実施した。

【0071】

図７に示された通り、２時間インキュベートの後、赤色蛍光シグナルが、遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰ処置細胞で観察されたが、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰ処置細胞では、弱い赤色蛍光シグナルが観察された。４時間までインキュベーション時間を増加させることによって、遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰ処置細胞は、赤色シグナルを有意に増加させたが、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰ処置細胞は、無視できる程度の赤色シグナルを呈した。加えて、遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰによるＨｅＬａ細胞の４時間の処置は、細胞の萎縮および突出を生じ、ナノ粒子におけるＤＯＸの細胞毒性作用が示された。理想的サイズのナノ粒子が、ＥＰＲ効果により腫瘍微細環境内に蓄積されることは、周知である。細胞内在化は、腫瘍細胞内で生物学的機能を発揮する抗癌剤を必要とするため、腫瘍組織内の蓄積は、いつも治療転帰と相関するとは限らない。ＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰの効率的な細胞内取り込みおよび薬物放出は、より大きな薬物効力を示し、癌に対するＤＯＸの治療効果を改善する。

【0072】

実施例９：ＨｅＬａ細胞におけるＤＯＸ封入ＮＰの細胞毒性
ＨｅＬａ細胞（７５００個／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、１％抗体、および１％Ｌ−グルタミンを補充されたＤＭＥＭ ２００μＬ中、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間培養した。インキュベーション後に、補充物質を含まないＤＭＥＭに溶解された様々な濃度のブランク・ナノ粒子（０．２〜１ｍｇ／Ｌ）、ＤＯＸ−ＮＰ、および遊離ＤＯＸ（１〜５０μｇ／ｍＬ ＤＯＸ当量）を添加した。遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰとの２４時間のインキュベーション、ならびにブランク・ナノ粒子との４８時間のインキュベーション後に、細胞毒性をマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、スイス メンネドルフ所在）で５４０ｎｍでの３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−３，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド色素（ＭＴＴ色素、最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）の取り込みを利用して決定した。

【0073】

図８は、異なるナノ粒子および同一ＤＯＸ濃度の遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰで処置されたＨｅＬａ細胞の生存性を示す。遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰおよびＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰは、４時間インキュベーションの後、細胞生存性を用量依存的に（１〜５０μｇ／ｍＬ ＤＯＸ）８０〜９０％低下させた。ＤＯＸ濃度を１μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬに、そして５０μｇ／ｍＬまで上昇させると、遊離ＤＯＸは、細胞生存性を有意に低下させたが、ＤＯＸ封入ＮＰは、細胞生存性を徐々に低下させた。全てのＤＯＸ濃度で、遊離ＤＯＸは、ＤＯＸ封入ＮＰよりも有意に高い細胞毒性を示しており、それはことによると遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ封入ＮＰの取り込み経路の差異、ならびにＤＯＸ封入ＮＰの持続的放出特性が原因の可能性がある。類似のＤＯＸレベルでは、ＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰの細胞毒性は、ＤＯＸ封入チオエステル−ＮＰよりも有意に低く、細胞によって取り込まれたＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰが遊離形態のＤＯＸを放出することが示された。

【0074】

実施例８：ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰのインビボ撮像
ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの生体分布を、インビボ近赤外線（ＮＩＲ）撮像によって評価した。ＮＩＲフルオロフォアであるＤｉＲを、透析法によってナノ粒子に負荷した。手短に述べると、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ（１０ｍｇ）およびＤｉＲ（０．６ｍｇを、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、蒸留水で４８時間透析し、その後、０．４５μｍ膜でろ過して凍結乾燥した。ＤｉＲの負荷量を、７５０ｎｍ波長で分光光度法により決定した。腫瘍モデルは、Ａ５４９細胞（ＰＢＳ １００μＬ中に２×１０^６個）を雄ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下注射することによって樹立した。腫瘍が、許容し得るサイズに達したら、マウスの尾静脈注射を介してＤｉＲ負荷ＮＰ（５μｇ／ｋｇ ＤｉＲ当量）で処置した。全身画像を、ＩＶＩＳ画像システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ホプキントン所在）を用いて注射後１時間目、３時間目、６時間目、２４時間目、４８時間目および７２時間目に得た。心臓、腎臓、肝臓、脾臓、肺、および腫瘍をはじめとする様々な臓器の画像も、注射後７２時間目のマウスの殺処分後に得た。

【0075】

疎水性ＮＩＲＦ色素であるＤｉＲを、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰ（５％ｗ／ｗ）への封入のためのモデル薬物として用いた。ＳＳ−ＮＰからのＤｉＲ放出を模倣した生理学的条件下で検討し、結果はいずれのバースト放出も含まずに２４時間で７％未満のＤｉＲ放出を示し、ナノ粒子中でのＤｉＲの安定性が示された。この色素は、水またはヘモグロビンによって最小限に吸収される、強力なＮＩＲ蛍光を発する。これにより、非観血的動物撮像の際に、バックグランド蛍光からの少ない干渉が可能になる。ＤｉＲ負荷ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰを、尾静脈注射を介してＡ５４９腫瘍負荷ＳＣＩＤマウスに投与した。注射後１時間および３時間目に、蛍光シグナルを動物全体から検出することができた。肝臓における蛍光シグナルは、腫瘍シグナルよりも比較的弱かった（図９ａ）。その上、動物の周辺組織に比較した腫瘍におけるＤｉＲシグナルの対比は、２匹のマウスにおいてＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの注射後６時間目に既に明らかであり、１匹では注射後１時間目でも明らかであった。注射後２４時間目に、強力な赤色シグナルが、腫瘍組織において観察され、低いシグナルのみが、肝臓において観察された。腫瘍におけるこの強力な蛍光シグナルは、注射後７２時間目まで持続した。この時間の後、マウスを殺処分して、主要臓器を単離し、ＤｉＲ負荷ナノ粒子の組織分布を分析した。図９ｂに示された通り、最高のＮＩＲＦ強度が、腫瘍組織において観察されたが、シグナル強度は、肝臓などの他の組織ではより低く、心臓ではいずれの検出可能な蛍光シグナルも存在しなかった。

【0076】

結果
合成されたままのブロックコポリマーは、水溶液中で即座に自己組織化して、コレステロール部分の間の疎水性相互作用によってナノ粒子を形成した。ＣＭＣ値は、ＰＥＧ系ブロックコポリマーの典型的な範囲内であり、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯコポリマーがインビボで自己組織化ナノ粒子として長期間循環され得ることが示唆された。これらのナノ粒子は、疎水性薬物を封入し得る疎水性コレステロール内部コアを有するコア／シェル構造を有する。ＤＯＸ封入されたＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯおよびＰＣ５ＭＡ−ＰＥＯチオエステルＮＰは、１００ｎｍ未満のサイズおよび負電荷の表面を有する。腎クリアランスおよび肝捕捉を回避するための自己組織化ナノ粒子の理想的サイズが、それぞれ１０ｎｍより大きいことおよび１００ｎｍ未満であることが報告されている。それゆえ還元性ＮＰは、ＥＰＲ効果を介した腫瘍ターゲティングに適したサイズおよび表面電荷を有する。

【0077】

ＤＴＴの還元環境において、ＤＯＸ封入されたＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの粒子径は有意に増加し、該ナノ粒子が不安定であることが示された。さらに、いずれの粒子径も、インキュベーションの４時間後に検出可能でなく、ナノ粒子の完全な解離が示された。これは、還元環境でＮＰを破壊可能にするジスルフィド結合の存在によるものであった。これらの結果から、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰが、全身血液循環の際に安定したままであるが、ＰＣ５ＭＡブロックとＰＥＯブロックの間のジスルフィドリンカーの切断によって、細胞内還元環境ではＤＯＸを急速に解離させて放出することが示唆される。この結果は、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰが１０ｍＭ ＤＴＴによって不安定化した過去の観察と一致した。さらに、ＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰがＤＴＴの非存在下でＰＢＳ中での初期バースト放出を行わずに持続的放出パターンでＤＯＸを放出したことが、留意されなければならない。高濃度の細胞内ＧＳＨの存在下でのナノ粒子の解離によって薬物放出が癌細胞内で惹起されると、ナノ粒子が腫瘍組織に到達するまでに血流に放出される薬物の量が制限されているという点で、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの放出挙動は抗癌剤の送達に有用である。

【0078】

インビトロ実験の結果から、ＤＯＸ分子の放出を惹起する細胞内還性条件におけるＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰの急速な解離が、癌細胞対正常細胞での細胞内取り込み試験から明白な通り、核内への急速な薬物流入をもたらすことが示された。ＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰからの惹起されたＤＯＸ放出は、非還元性ＮＰに比較して有意に高い細胞毒性作用をもたらした。理想的サイズのナノ粒子が、ＥＰＲ効果によって腫瘍微細環境内に蓄積されることは、周知である。しかし、細胞内在化は、腫瘍細胞内で生物学的機能を発揮する抗癌剤を必要とするため、腫瘍組織内の蓄積は、いつも治療転帰と相関するとは限らない。結果から、ＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰの効率的な細胞内取り込みおよび薬物放出が、癌に対するＤＯＸの治療効果を改善することが示唆される。加えて、細胞毒性の結果から、ＤＯＸ封入ＳＳ−ＮＰが癌細胞内で遊離形態のＤＯＸを放出し、治療効果を誘導することがさらに確認された。結果から、ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰが抗癌剤の癌細胞特異的送達に効果的であることが示唆される。

【0079】

ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの生体分布を評価するために、担腫瘍ＳＣＩＤマウスにおけるＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰのインビボ蛍光画像を、非浸潤性近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）撮像を利用して得た。注射後１時間目および３時間目の弱い肝臓内蛍光シグナルが、過去に報告されたコレステロール含有ナノ粒子と一致していた（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ． “Ｌｏｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｒｕｓｈ−ｌｉｋｅ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｕｍｏｒｓ．” Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ２０１４；１５：４３６３−７５）。強い全身蛍光が、注射後６時間目に連続して観察され、ＤｉＲ負荷ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの長期循環時間が示された。過去のインビボ撮像試験から、遊離疎水性ＤｉＲが１時間〜２４時間に肝臓内に蓄積され、腫瘍蓄積が無視できる程度であることが示された（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。結果から、腫瘍組織におけるＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰの効果的蓄積が実証された。ＰＣ５ＭＡ−ＳＳ−ＰＥＯ ＮＰのこの特筆すべき腫瘍ターゲティング化能力は、ナノ粒子の安定性によって実現された長期循環時間と、小サイズであり腫瘍蓄積に好適で肝臓による捕捉を低減することによる腫瘍組織でのＥＰＲ効果と、から得られた可能性がある。腫瘍組織に蓄積されると、ＤＯＸの治療効果は、ＮＰからＤＯＸを放出して腫瘍細胞核に急速に拡散する還元性ＮＯの惹起作用によって増大し得る。

【0080】

本明細書に記載された実施例および実施形態が、例示のみを目的としており、それを考慮した様々な改良または変更が当業者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の主旨および範囲内で組み込まれるべきであることは理解されよう。本明細書に引用された全ての発行物、特許、および特許出願は、全ての目的で参照により本明細書に組み入れられる。

【図1】

【図2(a)】

【図2(b)】

【図2(c)】

【図2(d)】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7】

【図8】

【図9】