【実施例】
【0051】
実施例1:ペプチドの合成
配列番号1のペプチド(以下、「PEP1」という)を、従来知られている固相ペプチド合成法(solid phase peptide synthesis, SPPS)に従って製造した。具体的に、ペプチドは、ASP48S(Peptron, Inc., 大韓民国・大田)を用いて、Fmoc固相合成法でC−末端からアミノ酸を一つずつカップリングすることにより合成した。次のように、ペプチドのC−末端の一番目のアミノ酸が、レジンに付着されたものを用いた。例えば、以下の通りである。
【0052】
NH
2−Lys(Boc)−2−クロロ−トリチルレジン
NH
2−Ala−2−クロロ−トリチルレジン
NH
2−Arg(Pbf)−2−クロロ−トリチルレジン
ペプチドの合成に用いた全てのアミノ酸原料は、N−末端がFmocで保護(protection)され、残基は全て酸で除去される、Trt、Boc、t−Bu(t-ブチルエステル)、Pbf(2、2、4、6、7−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−5−スルフォニル)などで保護されたものを用いた。例えば、次の通りである。
【0053】
Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Arg(Pbf)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Phe−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Trp(Boc)−OH、Fmoc−Met−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Ahx−OH、Trt−メルカプト酢酸。
【0054】
カップリング試薬(Coupling reagent)としては、HBTU[2−(1H−ベンゾトリアゾル−1−イル)−1、1、3、3−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスファート]/HOBt[N−ヒドロキシベンゾトリアゾル]/NMM[4−メチルモルホリン]を用いた。Fmocの除去は、20%のDMF中のピペリジン(piperidine in DMF)を用いた。合成されたペプチドを、レジンから分離及び残基の保護基の除去には、切断カクテル(Cleavage Cocktail)[TFA (トリフルオロ酢酸)/TIS(トリイソプロピルシラン)/EDT(エタンジチオール)/H
2O=92.5/2.5/2.5/2.5]を用いた。
【0055】
アミノ酸の保護基が結合された出発アミノ酸が、固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸を各々反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護の過程を繰り返すことにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを、レジンから切り取った後、HPLCで精製し、MSで合成の可否を確認した後、凍結乾燥した。
【0056】
本実施例に用いられたペプチドへの高速液体クロマトグラフィーの結果、全てのペプチドの純度は、95%以上であった。
【0057】
ペプチドPEP1の製造についての具体的な過程は、以下の通りである。
【0058】
1)カップリング
NH
2−Lys(Boc)−2−クロロ−トリチルレジンに、保護されたアミノ酸(8当量)と、カップリング試薬HBTU(8当量)/HOBt(8当量)/NMM(16当量)とをDMFに溶解して加えた後、常温で2時間反応させ、DMF、MeOH 、DMFの順に洗浄した。
【0059】
2)Fmoc脱保護
20%のDMF中のピペリジン(piperidine in DMF)を加えて、常温で5分間2回反応させ、DMF、MeOH 、DMFの順に洗浄した。
【0060】
3)前記1)と2)の反応を繰り返して行い、ペプチドの基本骨格NH
2−E(OtBu)−A−R(Pbf)−P−A−L−L−T(tBu)−S(tBu)−R(Pbf)L−R(Pbf)−F−I−P−K(Boc)−2−クロロ−トリチルレジンを作製した。
【0061】
4)切断(Cleavage):合成が完了されたペプチドレジンに、切断カクテル(Cleavage Cocktail)を加えて、レジンからペプチドを分離した。
【0062】
5)得られた混合物に、冷却ジエチルエーテルを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈殿した。
【0063】
6)Prep−HPLCで精製した後、LC/MSで分子量を確認し、凍結してパウダーとして製造した。
【0064】
実施例2:耳毒性薬物による聴力損傷に対するPEP1の効能の確認
実験動物及び注射剤の用意
実験のために、C57/BL6マウス(4週〜6週令、重さ15〜25g、雄)を用意した。耳毒性薬物として、カナマイシンサルフェート(sulfate)形態のカナマイシンを、40mg/mlの濃度で食塩水溶液に溶かして、800mg/kgの注射投与用製剤を用意した。実施例1の方法で合成したペプチドであるPEP1は、10mlのPBS当り100mgの濃度で溶かして、注射投与用製剤として用意した。
【0065】
耳毒性薬物の投与、及び耳毒性薬物とPEP1の投与の実験群の分類
耳毒性薬物であるカナマイシンと、本発明によるペプチドであるPEP1とを、以下のように実験群を分けて用意した実験動物に投与した。
【0066】
実験群1:カナマイシン800mg/kg皮下注射(S.C.)+食塩水(saline)0.1ml/10gマウス腹腔内注射(I.P.)
実験群2:カナマイシン800mg/kgS.C.+PEP1 10mg/kg I.P.
前記実験群別に、各々の投与量を1日2回、14日間注射した。
【0067】
組織検査
実験を開始してから3週目に、マウスを安楽死した後、血液を採取し、0.1Mリン酸塩緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline)で希釈した4%パラフォルムアルデヒド(paraformaldehyde, pH7.4)を用いて、かん流固定し、臓器(側頭骨)を採取した。
【0068】
蝸牛と前庭の全般的な構造を見るために、4℃で24時間、4%パラフォルムアルデヒド(pH7.4)に固定した後、0.135MのEDTAに3日間放置して、脱灰(decalcification)を行った。凍結組織切片作製用包埋剤(Optimal cutting temperature compound, OCT compound)を用いて、組織ブロックを製作し、−80℃で保管した後、スライドを作って、H&E染色を行った。
【0069】
左側の側頭骨は、定量分析のために、蝸牛の全量(whole mount)を用意した。微細器具及び顕微鏡を用いて、蝸牛の骨性迷路(bony labyrinth)を、膜性迷路(membraneous labyrinth)から注意して分離し、尖部と基底部とを分離する。各々血管低のある側壁と、蝸牛のある基底膜部とに分離した後、4%パラフォルムアルデヒドで固定する。0.3%トリトン−X(Triton-X)で1時間反応した後、アレクサ488ファロイジン(Alexa 488 phalloidin)及び1%牛血清アルブミン(Bovine serum albumin, BSA)を用意する。メタノールで溶解したアレクサ488ファロイジンと、1%牛血清アルブミンとを、1:100となるように混ぜる。これを組織に分注し、シェイカー(shaker)で1時間反応させ、洗浄した後、4%パラフォルムアルデヒドで固定する。スライドグラスにベクタ(vector)を1滴落とし、分離した組織を分注して載せた(mount)後に、カバーグラスで固定する。対照群と実験群の両方の蝸牛組織と、腎臓組織とは、同じ強度の条件の下で、共焦点顕微鏡により観察した。
【0070】
聴性脳幹反応検査の実施
注射前、注射後1週、注射後2週、注射後3週に、聴性脳幹反応検査を実施した。聴覚の評価のために、刺激で4kHz、8kHz、16kHz、32kHzの音刺激を与え、聴性脳幹反応(ABR)において、V波が出現する最も小さい刺激強度を、閾値と判定した。薬物投与の開始前、全ての群で基底聴力を測定した。測定は、イソフルラン(isoflurane)を腹腔内注射して麻酔した後、実施した。
【0071】
統計処理
聴性脳幹反応検査の閾値を、各周波数別に合算し、実験群1と実験群2における聴力の閾値につき、マンーホイットニーテスト(Mann-Whitney test)を用いて、統計的有意性を確認した。
【0072】
基底部、中間部、尖部の蝸牛部位別に損傷していない有毛細胞の個数を合算し、実験群1と実験群2における有毛細胞数につき、マンーホイットニーテストを利用して、統計的有意性を確認した。
【0073】
組織検査結果の分析
組織検査を通じて、蝸牛の基底部、中間部、尖部で有毛細胞を観察した結果、実験群1では、全ての部位で有毛細胞の全般的な損傷が観察された(
図1を参照)。これと対照的に、実験群2では、全ての部位で有毛細胞の損傷が観察されなかた(
図2を参照)。
【0074】
また、組織検査において、有毛細胞の計数をした結果、蝸牛の中間部と基底部で、実験群1より実験群2において、統計的に有意に(*は、p<0.001)多い有毛細胞が確認できた(
図3を参照)。
【0075】
また、組織検査において、凍結切片として得た蝸牛及び膨大部組織のH&E染色の結果、実験群1では、蝸牛の有毛細胞が損失されており、膨大部の定常感覚上皮はなくなり、空胞形成(vacuolization)が多く行われていることが観察された(
図4を参照)。これと対照的に、実験群2では、蝸牛の定常有毛細胞と、膨大部の定常感覚上皮とが、保存されていることが観察された(
図5を参照)。
【0076】
聴性脳幹反応検査結果の分析
聴性脳幹反応検査を通じて、薬物の投与後、聴力の経時変化を観察した結果、実験群1では、時間の経過につれ、閾値が増加し、その反面、実験群2では、時間が経っても、閾値の変化が微かに現れることを見せた(
図6を参照)。両群間の結果の差は、統計的に有意した(*は、p<0.001)。
【0077】
実施例3:PEP1の投与による耳毒性聴力損傷の可否の確認
実験動物、注射剤の実験群別の用意
実験のために、C57/BL6マウス(4週〜6週令、重さ15〜25g、雄)を用意した。PEP1を濃度別に投与するために、実施例1の方法で合成したPEP1と、対照群である食塩水を用意した。PEP1は、基本の10mg/mlの濃度を1溶液単位と設定して用意した。対照群及び濃度別のPEP1投与群は、以下のような実験群に分けて用意した。
【0078】
実験群3:対照群として、食塩水を投与(生理食塩水10ml)
実験群4:PEP1を濃度0.1mg/kgで投与(1溶液単位1ml+PBS9ml)
実験群5:PEP1を濃度1mg/kgで投与(10溶液単位1ml+PBS9ml)
実験群6:PEP1を濃度10mg/kgで投与(100溶液単位1ml+PBS9ml)
実験群7:PEP1を濃度100mg/kgで投与(PEP1 100mg+PBS10ml)
前記実験群の各々の濃度で、1回に0.1ml/10gマウス重量の投与量で腹腔内に注射(I.P.)した。1日2回(午前9時及び午後5時)、7日間注射した。
【0079】
組織検査
実験の開始日から2週後に、動物を安楽死させ、実施例2のような方法で組織検査のためのサンプルの採取を実施した。
【0080】
組織検査結果の分析
組織検査を通じて、蝸牛の基底部、中間部、尖部で有毛細胞を観察した結果、全ての実験群で、蝸牛の有毛細胞の損傷は、観察されなかった(
図7を参照)。
【0081】
また、組織検査で凍結切片として得た蝸牛及び膨大部組織を、H&E染色したものを観察した結果、対照群である実験群2は、蝸牛の有毛細胞と血管底、膨大部の有毛細胞が、全て定常の所見を見せた(
図8を参照)。濃度別のPEP1を処理した実験群4〜7においても、蝸牛組織を観察した結果、蝸牛構造の損傷は、観察されなかった(
図9を参照)。
【0082】
実施例4:二つの耳毒性薬物による聴力損傷に対するPEP1の効能の確認及び既存の薬物との比較
実験動物モデルの用意
実験のために、耳毒性(ototoxicity)動物モデルとして、C57/BL6マウス(5週令、重さ15〜25g、雌)に、腹腔内投与でカナマイシン(1000mg/kg)を投与し、30分内にフロセミド(100mg/kg)を注射して用意した。
【0083】
実験対象物質の投与実験群の分類及び用意、反復実験
耳毒性動物モデル24匹を、次のように実験群及び対照群に分類して、実験を進めた。実験名をD1と表記した(
図10を参照)。
【0084】
実験群1:カナマイシン及びフロセミドの投与後、1、2、及び3日目に、それぞれPEP1(10mg/kg)を皮下投与(subcutaneous injection)した耳毒性動物モデル8匹
実験群2:カナマイシン及びフロセミドの投与後、1、2、及び3日目に、それぞれデキサメタゾン(15mg/kg)を皮下投与した耳毒性動物モデル8匹
対照群1:カナマイシン及びフロセミドの投与後、1、2、及び3日目に、それぞれ食塩水を投与した耳毒性動物モデル8匹
追加に、耳毒性動物モデルに耳毒性薬物を投与し、耳毒性が進行する時間をもっと与えた後に、実験の結果(即ち、実験物質の投与時期別の効果の差)を調べるために、耳毒性動物モデル24匹を、次のように実験群及び対照群に分類し、実験を進行した。実験名をD3と表記した(
図10を参照)。
【0085】
実験群3:カナマイシン及びフロセミドの投与後、3、4、及び5日目に、それぞれPEP1(10mg/kg)を皮下投与(subcutaneous injection)した耳毒性動物モデル8匹
実験群4:カナマイシン及びフロセミドの投与後、3、4、及び5日目に、それぞれデキサメタゾン(15mg/kg)を皮下投与した耳毒性動物モデル8匹
対照群2:カナマイシン及びフロセミドの投与後、3、4、及び5日目に、それぞれ食塩水を投与した耳毒性動物モデル8匹
聴性脳幹反応検査の実施
カナマイシン及びフロセミドの投与前(0日目)、投与後7日目、投与後14日目に聴性脳幹反応検査を行った(実験D1とD3の両方を同一に検査する)。聴覚の評価のために、刺激で8kHz、16kHz,32kHzの音刺激を与え、聴性脳幹反応(ABR)でV波が出現する最も小さい刺激強度を、閾値と判定した。薬物投与の開始前、全ての群において基底聴力を測定した。測定は、イソフルラン(isoflurane)を腹腔内に注射して麻酔した後、実施した。
【0086】
組織検査
カナマイシン及びフロセミドの投与後、14日目に、聴性脳幹反応検査を済んだマウスを安楽死させた後、耳嚢(otic capsule)を収穫し、共焦点顕微鏡(confocal scanning microscopy)により有毛細胞(hair cells)の損傷の程度を観察した。
【0087】
統計処理
聴性脳幹反応検査で測定された聴力の閾値と、組織検査で測定された有毛細胞の各群別の値は、統計的に処理して有意性を確認した。ここでは、ANOVAテストを用いた。
【0088】
聴性脳幹反応検査結果の分析
実験D1において、投与薬物による周波数別の聴力変化を観察した結果、PEP1を投与した実験群1は、食塩水を投与した対照群1に比べ、カナマイシン及びフロセミドの投与後14日目に測定した聴力の閾値を低く示し、特に、32kHzで統計的に有意差を示した(p=0.008、
図11を参照)。
【0089】
実験D3において、投与薬物による周波数別の聴力変化を観察した結果、PEP1を投与した実験群3は、食塩水を投与した対照群2及びデキサメタゾンを投与した実験群4に比べ、カナマイシン及びフロセミドの投与後14日目に測定した聴力の閾値を低く示し、特に、8kHz及び16kHzで統計的に有意差を示した(p=0.014、
図12を参照)。
【0090】
実験D1とD3とを比較して、PEP1の投薬時期による周波数別の聴力変化を観察した結果、カナマイシン及びフロセミドの投与前、投与後7日目、投与後14日目に、それぞれ測定した聴力の閾値は、有意差を示していなかった(
図13を参照)。
【0091】
組織検査結果の分析
実験D1において、カナマイシン及びフロセミドの投与後14日目に実施した組織検査を通じて、蝸牛の基底部(basal)、中間部(Mid)、尖部(apex)で、有毛細胞の生存力(viability)を観察した結果、食塩水を投与した対照群1では、蝸牛の基底部、中間部、尖部において、有毛細胞の全般的な損傷が観察され、PEP1を投与した実験群1、及びデキサメタゾンを投与した実験群2では、定常的な有毛細胞が観察された(
図14を参照)。
【0092】
実験D3において、カナマイシン及びフロセミドの投与後14日目に実施した組織検査を通じて、蝸牛の基底部、中間部、尖部で、有毛細胞の生存力を観察した結果、食塩水を投与した対照群2では、蝸牛の基底部、中間部、尖部において、有毛細胞の全般的な損傷が観察され、PEP1を投与した実験群3、及びデキサメタゾンを投与した実験群4では、定常的な有毛細胞が観察された(
図15を参照)。
【0093】
実験D1において、有毛細胞の生存率を定量的に分析した結果、蝸牛の基底部、中間部、尖部で、PEP1を投与した実験群1の定常有毛細胞の比率が、食塩水を投与した対照群1に比べ、高い傾向を示し、このような差異は、中間部と基底部において、統計的に有意であった(p=0.006)。また、PEP1を投与した実験群1の定常有毛細胞の比率は、デキサメタゾンを投与した実験群2に比べても、高い傾向を示した(
図16を参照)。
【0094】
実験D3において、有毛細胞の生存率を定量的に分析した結果、蝸牛の基底部、中間部、尖部で、PEP1を投与した実験群3の定常有毛細胞の比率が、食塩水を投与した対照群2に比べ、高い傾向を示し、このような差異は、中間部と基底部において、統計的に有意であった(p=0.011)。また、PEP1を投与した実験群3の定常有毛細胞の比率は、デキサメタゾンを投与した実験群4に比べても、高い傾向を示した(
図17を参照)。
【0095】
実験D1とD3とを比較して、PEP1の投薬時期による定常有毛細胞の比率を分析した結果、カナマイシン及びフロセミドの投与後14日目に実施した組織検査による定常有毛細胞の比率は、有意差が観察されなかった(
図18を参照)。
【0096】
実施例の結果をまとめると、実施例2における実験を通じて、PEP1が、聴力損傷を引き起こす薬物から、聴覚と、聴覚のための関連器官及び組織との損傷を予防することが分かり、実施例3における実験を通じて、PEP1が、聴力損傷を予防しながら、投与による聴覚器官に耳毒性を見せないので、安全であることが分かる。また、実施例4における実験を通じて、PEP1の投与が、耳毒性を示す物質を二つ以上投与したときに現す耳毒性聴力損傷から、聴力を保護するように機能し、特に、既存の聴力損傷症状の緩和剤と知られたデキサメタゾンを投与する場合に比べて、PEP1を投与するときが、より優れた聴力損傷予防及び緩和の効果を奏することが分かる。
【0097】
結論的に、PEP1を含む組成物は、聴力損傷を予防及び緩和しながら、投与による毒性かなく、既存の薬物に比べても、より効果的であり、安全な聴力損傷の治療及び予防用組成物として、聴力損傷の治療及び予防に使用できることがわかる。