特許 6752201 連結された絹フィブロインマイクロファイバーとナノファイバーからなるハイブリッド構造物の生産方法、そのようにして得られるハイブリッド構造物、および移植可能な医療デバイスとしてのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6752201

(24)【登録日】2020年8月20日

(45)【発行日】2020年9月9日

(54)【発明の名称】連結された絹フィブロインマイクロファイバーとナノファイバーからなるハイブリッド構造物の生産方法、そのようにして得られるハイブリッド構造物、および移植可能な医療デバイスとしてのその使用

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/22 20060101AFI20200831BHJP

   A61L 27/40 20060101ALI20200831BHJP

   A61L 27/54 20060101ALI20200831BHJP

   A61L 27/60 20060101ALI20200831BHJP

   A61L 27/50 20060101ALI20200831BHJP

【ＦＩ】

   A61L27/22

   A61L27/40

   A61L27/54

   A61L27/60

   A61L27/50 300

【請求項の数】16

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2017-522558(P2017-522558)

(86)(22)【出願日】2015年10月27日

(65)【公表番号】特表2017-533750(P2017-533750A)

(43)【公表日】2017年11月16日

(86)【国際出願番号】IB2015058262

(87)【国際公開番号】WO2016067189

(87)【国際公開日】20160506

【審査請求日】2018年10月9日

(31)【優先権主張番号】MI2014A001841

(32)【優先日】2014年10月27日

(33)【優先権主張国】IT

(73)【特許権者】

【識別番号】517140734

【氏名又は名称】シルク バイオマテリアルズ エス．アール．エル．

(74)【代理人】

【識別番号】100166338

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 正夫

(74)【代理人】

【識別番号】100152054

【弁理士】

【氏名又は名称】仲野 孝雅

(72)【発明者】

【氏名】アレッサンドリノ アントニオ

【審査官】 参鍋 祐子

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０１８７９３３０（ＣＮ，Ａ）

【文献】 米国特許第０８２０２３７９（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０６５６５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００４−０６８１６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２７０４２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Acta Biomaterialia，２０１２年，Vol.8，pp.3914-3920

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ ２７／２２

Ａ６１Ｌ ２７／４０

Ａ６１Ｌ ２７／５０

Ａ６１Ｌ ２７／５４

Ａ６１Ｌ ２７／６０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

絹フィブロインのマイクロファイバーとナノファイバーを互いに連結して作製するハイブリッド構造物の生産方法であって、以下の工程：
ａ）一又は複数のマイクロファイバー性フィブロイン製部品の調製工程と；
ｂ）一又は複数のナノファイバー性フィブロイン製部品の調製工程と；
ｃ）前記一又は複数のナノファイバー性フィブロイン製部品および前記一又は複数のマイクロファイバー性フィブロイン製部品を、別々または連結後に、フィブロイン用溶媒を用い、および／または、溶媒中に溶解されたフィブロインを含有する溶液を用いて、処理する工程と；
ｃ’）工程ｃ）において、前記ナノファイバー性部品およびマイクロファイバー性部品が、フィブロイン用溶媒を用い、および／または、溶媒中に溶解されたフィブロインを含有する溶液を用いて、別々に処理されていた場合は、前記部品を連結する工程と；
ｄ）工程ｃ）または工程ｃ’）において得られたハイブリッドマイクロファイバー性／ナノファイバー性構造物を、１０℃〜１５０℃の間の温度で、１分〜２４時間の時間、熱処理することによって固化結合する工程と；
ｅ）１０℃〜１００℃の間の温度で水もしくは水−アルコール混合液を用いて洗浄することによってか、または、任意ではあるが真空下で、１０℃〜１００℃の間の温度で蒸発させることによって、前記溶媒を除去する工程とを含み、
工程ｃ）で使用する前記溶媒が、ギ酸、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、トリフルオロ酢酸、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ−メチルモルホリンＮ−オキシド、イオン性液体、塩化カルシウム−エタノール−水混合物、硝酸カルシウム−メタノール−水混合物、リチウム塩の水溶液、およびこれらの溶媒の混合物ならびに／または水を有するこれらの溶媒から選択される、方法。

【請求項2】

以下の工程：
ｆ）請求項１に従って生産される二以上のハイブリッド構造物を連結して、階層的に上位のハイブリッド構造物を得る工程と；
ｇ）前記階層的に上位のハイブリッド構造物を用いて請求項１の工程ｃ）〜ｅ）を繰り返す工程とをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程ａ）が、１０デン〜４００デンの間のカウントを有する絹編み糸形態のマイクロファイバー性フィブロインであって、前記一又は複数のマイクロファイバー性フィブロイン製部品の生産の前または後に精練されるものを、出発材料として使用して実施され、前記一又は複数のマイクロファイバー性フィブロイン製部品が、横糸−縦糸機織法、ニッティング、ブレイディング、フィラメント巻取り、および不織布生産手法から選択される手法を用いて生産される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

工程ｂ）が、ギ酸、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、トリフルオロ酢酸、イオン性液体、およびこれらの溶媒の混合物ならびに／または水を有するこれらの溶媒から選択される溶媒中のフィブロインの溶液の力紡糸または電気紡糸によって実施され、前記フィブロインの濃度が、前記溶媒がギ酸の場合、１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの間であり、ギ酸とは異なる一又は複数の前記溶媒が使用される場合、５％ｗ／ｖ〜４０％ｗ／ｖの間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記溶媒が、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート、および１−エチル−３−メチルイミダゾリウムグリシンから選択されるイオン性液体である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記一又は複数のナノファイバー性フィブロイン製部品が、直径が０．０１ｍｍ〜１０ｍｍの間のノズルを有する紡糸口金、前記ノズルとナノファイバー収集器との間の距離が５ｃｍ〜６０ｃｍの間、前記ノズルと前記収集器の間の電位差が５ｋＶ〜１００ｋＶの間のものを使用して電気紡糸することによって生産される、請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

前記一又は複数のナノファイバー性フィブロイン製部品の生産用の出発溶液に、増殖因子、薬物、細胞、抗生物質、抗ウイルス剤、酵素、およびビタミンから選択される一又は複数の生理活性剤を加える、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

工程ｃ）が、溶媒を単独で用いて、
前記溶媒中に、前記一又は複数の部品を、１秒〜２４０分の間の時間、浸漬する工程；あるいは
前記一又は複数の部品の表面１ｃｍ^２当たり０．００１〜０．５ｍＬの量で、注いだり、コーティングしたり、霧吹きしたり、電気噴霧したり、または、電気紡糸したりすることによって、前記溶媒を堆積させる工程；あるいは、
１秒〜１２０分間の時間、前記一又は複数の部品を、前記溶媒の蒸気に暴露する工程
によって、前記一又は複数の部品を処理することによって実施され、
マイクロファイバー製部品の場合は４０〜８０℃の間、ナノファイバー製部品の場合は室温〜７０℃の間の温度で操作する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

工程ｃ）が、溶媒中のフィブロインの溶液を用いて、
前記溶液中に、前記一又は複数の部品を、１秒〜２４０分の間の時間、浸漬する工程；あるいは
前記一又は複数の部品の表面１ｃｍ^２当たり０．００１〜１００ｍＬの量で、注いだり、コーティングしたり、霧吹きしたり、電気噴霧したり、または、電気紡糸したりすることによって、前記溶液を堆積させる工程
によって、前記一又は複数の部品を処理することによって実施され、
マイクロファイバー製部品の場合は４０〜８０℃の間、ナノファイバー製部品の場合は室温〜７０℃の間の温度で操作する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記溶液が、ギ酸中の１〜３０％ｗ／ｖのフィブロインを含むか、または、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートまたは１−エチル−３−メチルイミダゾリウムグリシンであって、純粋なものかまたは５％〜５０％ｗ／ｗの水を含む混合液から選択される一又は複数の溶媒中の５％〜４０％ｗ／ｖのフィブロインを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られる、連結された絹フィブロインのマイクロファイバーとナノファイバーからなるハイブリッド構造物を含む、移植可能な医療デバイス。

【請求項12】

前記ハイブリッド構造物は、繊維産業で既知の手法によって得られるマイクロファイバー性フィブロイン製であるとともに絹フィブロインのマイクロファイバー製である部品を少なくとも含み、前記絹フィブロインのマイクロファイバーは、１０μｍ〜１５μｍの間の直径及び１０デン〜４００デンの間の編み糸カウントを有し、直径が２０ｎｍ〜１．５μｍの間の絹フィブロインのナノファイバー製の不織布の形態の少なくともナノファイバー性フィブロイン製部品に連結されている、請求項１１に記載の移植可能な医療デバイス。

【請求項13】

前記マイクロファイバー製部品がちりめん織物である場合、前記マイクロファイバー製部品を前記ナノファイバー製部品から分離するのに必要な平均分離力は５３±１１ｃＮであり、マイクロファイバー製部品がオーガンジー織物の場合、２１±９ｃＮである請求項１２に記載の移植可能な医療デバイス。

【請求項14】

前記マイクロファイバー性フィブロイン製部品および／または前記ナノファイバー性フィブロイン製部品が、増殖因子、薬物、抗生物質、抗ウイルス剤、酵素、およびビタミンから選択される一又は複数の生理活性剤を用いて機能付与される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の移植可能な医療デバイス。

【請求項15】

-内臓を閉じ込め保護する組織に、ヘルニアおよび脱出症の抑制に、または皮膚およびその層の再生のための基材として、使用するための平面状デバイス、
-末梢神経系、血管系、心血管系、および中枢神経系の組織および器官の再生のための基材としての管状デバイス、または
-筋骨格系の組織を再生するための基材としての中身が詰まった円筒状デバイス、
の形態の請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の移植可能な医療デバイス。

【請求項16】

-内臓を閉じ込め保護する組織は、硬膜、心膜、胸膜、および腹膜から選択され、
-末梢神経系の組織および器官は、末梢神経であり、
-血管系の組織および器官は、静脈、動脈、および血管アクセス用の動静脈瘻から選択され、
-心血管系の組織および器官は、冠動脈および心筋から選択され、
-中枢神経系の組織および器官は、脊髄であり、かつ
-筋骨格系の組織は、腱、靭帯、および筋肉から選択される、
請求項１５に記載の移植可能な医療デバイス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、相互に連結されたフィブロインマイクロファイバーとナノファイバーからなるハイブリッド構造物、任意ではあるが、ナノおよびマイクロファイバー性フィブロインを連結させることから得られるいくつかの一次構造物を含む複合構造物へと階層的に組織化されるハイブリッド構造物の生産方法に関する。本発明はまた、前記方法によって得られるハイブリッド構造物、および、組織工学と再生医療の分野での広範囲の応用例における移植可能な医療デバイスとしてのその使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

現代の外科手術においてますます使用される機会が多い基材は、身体部分と組織の損なわれた機能性を一時的に補う機能を有する移植可能なデバイスであり、そして、その基材には、その後、損傷部分または組織での自然な細胞が再成長することにより定着して、それら部分または組織の再生を実現する。

【0003】

それらの基材を作製する材料は、意図する応用例に依存して非常に異なる場合がある。例えば、ハイドロキシアパタイトとβ−リン酸三カルシウムの混合物からなる無機基材が、骨組織の一次的置換と再成長のために典型的に使用される。しかしながら、ポリマー性基材がさらにずっと一般的であり、好ましくは、生分解性且つ生体適合性バイオポリマーまたは合成ポリマーに基づいていて、一時的に軟質組織を置換することが意図される。

【0004】

ポリマー性基材は、生体内で実行される機能に対して最適化された一連の表面特性とバルク特性を持っている必要がある。目的の特性の中で、我々が考慮するのは、ナノ、マイクロ、肉眼レベルでの形態的特徴；物理的−力学的特性と性能（理想的には、これらは、再生される組織の生体内特徴と性能に可能な限り近いことが期待される）；ならびに化学的かつ生物学的特性であって、特に対象とするのは、生体適合性（すなわち、接着と細胞増殖を支持する能力であって、炎症や免疫原性反応を引き起こさず、有害物質等を放出しないこと等）および生分解性または生体吸収性（これらは、生体内でのこのデバイスの滞在時間と釣り合っていて、同様に、修復される組織の再構成速度に依存する必要がある）である。対象とする他の特性は、多孔性、流体への透過性、必要ならば、移植部位への活性剤、増殖因子、または薬物等の取り込み、保持、その後、放出する能力である場合がある。

【0005】

基材の製造に使用するための特に有望な天然ポリマーは、フィブロイン（チョウ類（飼い慣らされた種：カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）；野生種：サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ）、フィロサミア・リシニ（Ｐｈｉｌｏｓａｍｉａ ｒｉｃｉｎｉ）等）、他の昆虫類、およびクモ類によって、自然に生産される絹タンパク質）である。フィブロインはまた、組換えＤＮＡ技術によっても生産可能である。フィブロインは、いわゆる「精練」処理（フィブロインを被覆するセリシン層の除去にある処理）を用いて、天然シルクから得られる。この処理は、約６０〜１２０℃の温度、必要ならばオートクレーブ中で操作することにより、任意ではあるが、アルカリ（石鹸）、酸、または酵素を加えた水浴を通過させて一般的には実施される。このようにして得られるフィブロインは、平均直径が１２〜１４μｍで、最終強度が約６００ＭＰａで、破断点伸び値が２５〜３０％（値はカイコのマイクロファイバーのことを指す）のマイクロファイバー形態のものである。平面または立体構造物（織り糸、編み糸、織布、編物、不織布、ネット、組みひも、コード等）が、これらのマイクロファイバーを用いて製造可能であり、織物分野でのシルク応用例のために開発された各種技術を利用し、そして、それらは、従って、当業者の通常の知識の範囲内に収まる。

【0006】

フィブロインに対する関心がある主たる理由は、その証明されたフィブロインの生体適合性（各種細胞型の成長と増殖を支持する能力、免疫原性と炎症反応の欠如、および顕著な血管新生特性（特に、生体組織の修復／再生の事例に有用なのもの）を通して表される）にある。また、上述した物理的−力学的特質は、目的（特に、伸長、屈曲、圧縮応力に対する高い耐性；良好な弾力性；弾性等）に適する力学物性を有する基材の製造を可能とする。最後に、フィブロイン製基材は、生体内で中〜長期間（移植部位の生物学的環境の性質に依存して、数か月から１〜２年）の生分解性特質であって、基材が長期間力学的支持を確保しなければならない応用例に最適なものを有する。

【0007】

これらの特質のおかげで、フィブロインは、基材製造の技術分野で既に提案されている。

【0008】

部分的な溶解と、引き続いて、ファイバー上にポリマーの再堆積を通して、複数ファイバーの形態でポリマーを連結することは、例えば、特許文献１で既知である。

【0009】

特許文献２は、イオン性液体と第二液状化合物（一般的には、水、アルコール、またはケトン）を含む混合物で、天然ポリマーまたは合成ポリマーの複数ファイバーを処理して、それらファイバーを連結することを記載している。

【0010】

これらの文献は、大きさと化学的、物理的、および力学的特性が均質な複数ファイバー（同じ製造および／または加工プロセスに由来するもの）の連結を記載するのみである。

【0011】

特許文献３、特許文献４、および特許文献５は、靱帯（特に、膝の前十字靱帯）の再構成を目的とするフィブロイン構造物であって、その応用例に要求される大きさと力学性能に到達するまで階層レベルを増加させて組立てられる階層的ファイバー性構造物からなるものを記載する。

【0012】

特許文献６、特許文献７、および特許文献８は、それとは違い、それぞれ、腹部や骨盤部内の損傷組織の修復外科手術用、乳房の形成外科手術用、および脈管用人工装具用に最適化される、編むことによって得られるネット構造物を有する、天然フィブロインマイクロファイバーに基づくデバイスを記載する。

【0013】

これら基材は、繊維技術を使用して、フィブロインマイクロファイバー（前述したように、約１２〜１４μｍの直径を有するもの）から製造される。その技術では、少なくとも２０本のフィブロインマイクロファイバーからなる基礎となる絹糸は、合糸と撚糸操作によって、階層的上位構造（「編み糸」）であって、その横断寸法が、１／１０ミリメーターから１ミリメーター以上の範囲にある場合があるものへと一般的に組み立てられる。そのように作られた繊維構造物は通常柔らかさと滑らかさという優れた性質を有し、そして、肉眼レベルでは、それら繊維構造物が接着する表面へと容易に適合するが、顕微鏡レベルでは、局所的なかぶれ／炎症反応を引き起こすような堅さの領域を呈する場合がある。さらにまた、それら繊維構造物の結晶性と強靱性が高いことに起因して、フィブロインマイクロファイバーは、接触する組織表面をすり減らすような大きさの摩擦力を発揮する能力がある。これらの問題は、最悪の場合、移植物の部分的または完全な不全を導く場合がある。フィブロインマイクロファイバー基材の別の欠点は、それら基材が好ましくない表面／容量比を呈することである。従って、自己組織定着に適する部位全体は、移植部位に配置される材料が比較的高負荷となる。その結果として、生物によって廃棄される分解産物が局所的に蓄積されることに起因する生理活性および代謝活性が過負荷となる可能性がある。最後に、いくつかの事例では、フィブロインマイクロファイバーの自然な分解時間は、新たな組織が形成する速度と比べて長すぎである場合があり、従って、その組織増殖と干渉する場合もある。

【0014】

これら欠点を除去するために提案されているのは、ナノファイバー（つまり、１ミクロンより小さい直径、典型的には、数十から数百ナノメーターの直径を有するもの）形態のフィブロインの使用である。

【0015】

これらのナノファイバーは、既知のプロセス（天然のフィブロインを、まず、適切な溶媒に可溶化し、その後、いろいろなプロセス（例、力紡糸または電気紡糸）を用いて再生するもの）によって製造可能である。これらのプロセスでは、フィブロインの溶液を、紡糸口金と呼ばれる毛細管を通過させ、ナノスケールの寸法の液状フィラメントを生じさせ、収集器に向かって加速させる。力紡糸の事例では、加速は遠心力（数千ｒｐｍの速度で紡糸口金を回転させることによるもの）によって引き起こされる。一方で、電気紡糸の事例では、加速は、紡糸口金のノズルとマニホールド（液体を充填し、従って、溶液ジェットを作り出すもの）との間の電位差によって引き起こされる。そのポリマーの粘弾性特性のおかげで、そのジェットは引き延ばしプロセスを経て、そして、同時に起こる溶媒の蒸発を伴って、収集器上に蓄積されるナノファイバーの製造を導く。

【0016】

最近の研究は、フィブロインナノファイバーで作製した基材の優れた特性を実証した。

【0017】

非特許文献１の論文は、ラットの腹部大動脈に移植された電気紡糸フィブロイン製管状基材が、形態学的および機能的視点から、自然な血管組織と全体的に類似した血管組織の形成を可能とすることを示す。非特許文献２の論文は、脂肪組織の間葉系細胞と接触させることによって前もって活性化された電気紡糸フィブロインパッチが、その材料によって血管新生プロセスを直接的に刺激することに関与する生物学的機構を介して、糖尿病マウスの創傷治癒を誘導することに効果的であることを示す。

【0018】

フィブロインのマイクロファイバーとナノファイバーとを連結して製造された基材もまた、記載されている。

【0019】

特許文献９は、脈管用人工装具および／または神経再生用のガイドとして提案される、３層の管状構造物を有するデバイスを記載する。その構造物中では、内層は再生フィブロイン製の多孔性沈積物であり、中間層はネット状の、織られたフィブロインマイクロファイバーの管状構造物であり、そして、外層は電気紡糸によって製造されたナノファイバー性フィブロイン構造物からなる。この文献に記載されるデバイスの製造工程は複雑である。内層は、まず、標準的製織方法を用いて管状形態に作製される。そのようにして得た層を、フィブロイン溶液に浸漬し、得られた中間産物を４０〜６０℃で乾燥させる。この第一中間産物を、電気紡糸用の収集器ピンへとはめ込む。そして、ナノ−マイクロファイバー性のフィブロインの層を、この手法によって、上記した該第一中間産物の外表面上に堆積させる。このようにして得られた複合体を、その後、１〜４時間、メタノールまたはエタノールに浸漬する。最後に、この第一複合体を型へと導入する。そして、フィブロイン溶液から堆積させることによって、管状の内面上に、多孔性層を作製する。最も内層の多孔性を、−８０℃〜−１０℃の間の温度で処理して得る。溶媒中またはフィブロイン溶液中に浸漬する間にそれら層の表面上に形成されるフィブロインフィルムによって、この複合体の３つの層を一緒に接合する。この文献のプロセスにしたがって作製されるフィブロインフィルムは、しかしながら、一旦乾燥されおよび結晶化されるのであるが、非常に脆く、伸長、屈曲、圧縮等の力学的応力によって強く刺激されると直ぐに割れてしまう。このことにより、互いに異なる層間での形態学的および力学的不連続性ができてしまい、幾何学的特徴と性能の特徴の喪失（例、力学的視点からは、脆弱な層（特にナノファイバー性のもの）ができてしまったり及び／又は壊れてしまったりすること）を容易に導く可能性がある。

【0020】

特許文献１０は、小さな血管の修復用のステント又は人工補装具としての応用が見出される場合があるデバイスを記載し、また、この事例では、３層のハイブリッド構造物（内層と中間層はフィブロイン／ポリカプロラクトン混合物を電気紡糸することによって得られるナノファイバー性の構造物から作製される一方で、外層は、編み機により作製される、フィブロインマイクロファイバーの管状構造物からなるもの）からなる。この３層は、個別に作製されて、そして、スリーブとして互いに他のものの上に取り付けられるのであるが、それらを、一連の環状の縫い目によって一緒に固定する。このデバイスは、部分的にではあるが、前者のデバイスと同じ欠点を有する。さらにまた、連結が互いに離れた縫い目で実現されるという事実は、各種構成要素に対する動きの部分的自由度を残すことになる。力学的および生物学的視点から負荷がかかる使用条件（例、生体内移植の進行中に起こり得るもの）では、このことは、特に、その材料が生体液の流れに露出される場合、進行中の再生プロセスと干渉するような大きさの局所的ストレスを生み出す場合がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0021】

【特許文献1】ドイツ国特許出願公開第ＤＥ１４３６３１１Ａ１号明細書

【特許文献2】米国特許第ＵＳ８，２０２，３７９Ｂ１号明細書

【特許文献3】国際特許出願ＷＯ０３／０４３４８６Ａ２号明細書

【特許文献4】欧州特許出願公開第ＥＰ２２１０９７１Ａ１号明細書

【特許文献5】国際特許出願ＷＯ２０１１／０３１８５４Ａ１号明細書

【特許文献6】国際特許出願ＷＯ２０１３／０１２６３５Ａ２号明細書

【特許文献7】国際特許出願ＷＯ２０１３／０８２０９３Ａ１号明細書

【特許文献8】国際特許出願ＷＯ２０１２／１１１３０９Ａ１号明細書

【特許文献9】中国特許出願公開第ＣＮ１０１８７９３３０Ａ号明細書

【特許文献10】中国特許出願公開第ＣＮ１０２４９９８００Ａ号明細書

【非特許文献】

【0022】

【非特許文献1】「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌａｓｔｉｃ ｌａｍｉｎａ ｏｎ ｆｉｂｒｏｉｎ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｃａｆｆｏｌｄ」、Ｉ．Ｃａｔｔａｎｅｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ，３６（２０１３年）１６６

【非特許文献2】「Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｐｒｉｍｅｄ ｗｉｔｈ ａｄｉｐｏｓｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ」、Ｓ．Ｅ．Ｎａｖｏｎｅら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ，５（２０１４年）７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0023】

本発明の課題は、先行技術の欠点の無い、医療応用例のための基材の作製を可能とする、フィブロインのマイクロおよびナノファイバー製ハイブリッド複合材料を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0024】

この課題は本発明を用いて達成され、その第一の観点で、本発明が関するのは、絹フィブロインのマイクロファイバーとナノファイバーを互いに連結して作製するハイブリッド構造物の生産方法であって、以下の工程：
ａ）一又は複数のマイクロファイバー性フィブロイン製部品の調製工程と；
ｂ）一又は複数のナノファイバー性フィブロイン製部品の調製工程と；
ｃ）前記一又は複数のナノファイバー性フィブロイン製部品および前記一又は複数のマイクロファイバー性フィブロイン製部品を、別々または連結後に、フィブロイン用溶媒を用い、および／または、溶媒中に溶解されたフィブロインを含有する溶液を用いて、処理する工程と；
ｃ’）工程ｃ）において、前記ナノファイバー性部品およびマイクロファイバー性部品が、フィブロイン用溶媒を用い、および／または、溶媒中に溶解されたフィブロインを含有する溶液を用いて、別々に処理されていた場合は、前記部品を連結する工程と；
ｄ）工程ｃ）または工程ｃ’）において得られたハイブリッドマイクロファイバー性／ナノファイバー性構造物を、１０℃〜１５０℃の間の温度で、１分〜２４時間の時間、熱処理することによって固化結合（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）する工程と；
ｅ）水もしくは水−アルコール混合液を用いて洗浄することによってか、または、任意ではあるが真空下で、１０℃〜１００℃の間の温度で蒸発させることによって、前記溶媒を除去する工程とを含み、
工程ｃ）で使用する前記溶媒が、ギ酸、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、トリフルオロ酢酸、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ−メチルモルホリン Ｎ−オキシド、イオン性液体、塩化カルシウム−エタノール−水混合物、硝酸カルシウム−メタノール−水混合物、リチウム塩の水溶液、およびこれらの溶媒の混合物ならびに／または水を有するこれらの溶媒から選択される、方法である。

【0025】

本発明の方法は、以下の追加工程：
ｆ）工程ａ）〜ｅ）に従って得られた二以上のマイクロ／ナノファイバー性ハイブリッド構造物を連結して、上位階層構造物を形成する工程と；
ｇ）そのようにして得られた前記上位階層構造物を、上記工程ｃ）〜ｅ）を同様に繰り返して、固化結合する工程と、をさらに含む場合がある。
本発明の第二の観点では、本発明は、前記方法を用いて得られる前記ハイブリッド構造物を使用する移植可能な医療デバイスに関する。

【0026】

以下、添付した図面を参照して、本発明を、今から、詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】図１は、本発明に係るナノファイバー性部品とマイクロファイバー性部品を連結する操作を実行する装置を模式的に示す。

【図2】図２は、本発明に従って製造されたハイブリッド構造物のサンプルの、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用いて取得した顕微鏡写真を示す。

【図3】図３は、本発明に従って製造されたハイブリッド構造物のサンプルの、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用いて取得した顕微鏡写真を示す。

【図4】図４は、先行技術に従って製造されたハイブリッド構造物のサンプルに関して得られた顕微鏡写真であって、図２と３中のものと類似しているものを示す。

【図5】図５は、フィブロインマイクロファイバー単独のサンプル、または、フィブロインナノファイバー単独のサンプルと比較する、本発明に従って製造されたハイブリッド構造物のＩＲスペクトルを示す。

【図6】図６は、フィブロインマイクロファイバー単独のサンプル、または、フィブロインナノファイバー単独と本発明に従って製造されたハイブリッド構造物に関する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）のグラフを示す。

【図7】図７は、フィブロインマイクロファイバー単独のサンプル、または、フィブロインナノファイバー単独のサンプルと本発明に従って製造されたハイブリッド構造物のサンプルの負荷／伸長率の図を示す。

【図8】図８は、先行技術に従って製造されたハイブリッド構造物のサンプルの負荷／伸長率の図を示す。

【図9】図９は、ハイブリッド構造物の層を剥離するテストを実施する装置を模式的に示す。

【図10】図１０は、本発明のハイブリッド構造物の層と先行技術のハイブリッド構造物の層を引き離すテストで得られた、加えた力／剥離行程のグラフを示す。

【図11】図１１は、本発明のハイブリッド構造物を用いて作製した医療デバイス上での細胞増殖を表すグラフを示す。

【図12】図１２は、マイクロファイバー単独、ナノファイバー単独、および本発明のフィブロイン製ハイブリッド構造物を用いて作製されたパッチサンプル上での遺伝毒性測定に関するヒストグラムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本明細書中および添付した請求項中では、用語「部品」は、フィブロインの均質なファイバー（すなわち、マイクロファイバーのみ、または、ナノファイバーのみ）から形成される物体を意味する一方、用語「ハイブリッド構造物」は、ナノファイバーから形成される少なくとも一つの部品とマイクロファイバーから形成される少なくとも一つの部品を連結することによって形成される物体を意味する。

【0029】

本発明者らは、この後記載する方法に従ってフィブロインナノファイバーとマイクロファイバーを組み合わせることによって、移植可能な医療デバイスの製造に適合する力学特性を備えるハイブリッド構造物を形成することができることを発見した。

【0030】

本発明の目的に有用なナノファイバーの直径は、２０ｎｍ〜１．５μｍであり、好ましくは、０．４〜１μｍである。それとは違い、マイクロファイバーの直径は、典型的には、約１０〜１５μｍである。マイクロファイバーはまた、５００本までさえの個々の絹フィラメントを含む、マルチファイバーの編み糸へと連結可能である。本文の残り部分では、繊維技術で一般的である、測定単位デン（ｄｅｎ）も使用し、これは、９０００メーターのファイバーまたは編み糸の重量（ｇ単位）として定義される。

【0031】

本発明の第一観点において、本発明は、一又は複数のフィブロインマイクロファイバー部品と一又は複数のフィブロインナノファイバー部品を連結することによる、マイクロ／ナノファイバー性ハイブリッド構造物の生産方法に関する。

【0032】

本方法の工程ａ）は、一又は複数のマイクロファイバー性フィブロイン部品の調製にある。フィブロインマイクロファイバー性部品は、最終製品の医療デバイスに形と力学的強度を付与する。本方法の最初の工程として必要なのは、従って、所望のデバイスの形と寸法に基本的に対応する形と寸法を有するフィブロインマイクロファイバー性部品を調製することである。マイクロファイバー性フィブロインは、この部品の生産のための出発材料として使用され、１０デン〜４００デン、好ましくは、１５デン〜１００デンの間のカウントを有する絹編み糸の形態である。絹編み糸は、精練の後に使用可能であるか、または、そのままの状態で使用し、部品の製造後に精練してもよい。マイクロファイバー性フィブロインには、例えば、化学および／または酵素反応によって、生理活性剤（例、増殖因子、薬物、細胞、抗生物質、抗ウイルス剤、酵素、ビタミン等）を添加してもよい。この添加は、工程ａ）の前、工程ｃ）〜ｇ）の任意の工程中、または、その後に実施する場合がある。この部品は、繊維産業で既知の任意の手法（例、（直交する織物を得る）横糸−縦糸機織法、不織布製造手法、ニッティング、ブレイディング、または「フィラメント巻取り」として知られる手法（各種織り合わせパターンに従って、回転心棒のまわりに、編み糸を巻き取ることにあって、中空の円筒構造物を得ることに繋がるもの））によって得られる一又は複数の要素によって形成可能である。

【0033】

本方法の工程ｂ）は、一又は複数のナノファイバー性フィブロイン部品の調製にある。本発明の目的に有用なナノファイバー性フィブロイン部品は、フィブロイン溶液の力紡糸を介して、または、好ましくは、電気紡糸を介して取得可能である。

【0034】

出発溶液は、溶媒（ギ酸、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、トリフルオロ酢酸、またはイオン性液体（例、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムグリシン、１−アリル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−２，３−ジメチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムブロマイド、およびこれらの溶媒の混合物ならびに／または水を有するこれらの溶媒）から選択されるもの）中にフィブロインを溶解させることによって調製される。本発明の目的にとって好ましいイオン性液体は、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート、および１−エチル−３−メチルイミダゾリウムグリシンである。

【0035】

出発溶液のギ酸中フィブロイン濃度は、１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの間、好ましくは、６％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの間である。または、他の溶媒中のフィブロイン濃度は、５％ｗ／ｖ〜４０％ｗ／ｖの間、好ましくは、１０％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの間である。重量／容量（％ｗ／ｖ）パーセント濃度は、１００ｍＬの溶液中に溶解されるフィブロインのグラムを示す。

【0036】

ナノファイバー性フィブロイン部品の好ましい製造方法は電気紡糸であり、その一般的実行方法は当業者に既知である。本発明の目的に適するナノファイバー性フィブロインを得るための、溶液の電気紡糸での紡糸口金のノズルと収集器との間の電位差は、５ｋＶ〜１００ｋＶの間、好ましくは、１５ｋＶ〜３５ｋＶの間であり、前記ノズルと収集器との間の距離は、５ｃｍ〜６０ｃｍの間、好ましくは、１０ｃｍ〜２０ｃｍの間である。紡糸口金のノズルの直径は、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍの間、好ましくは、０．１ｍｍ〜１ｍｍの間である場合がある。

【0037】

力紡糸と電気紡糸の両ケースでは、出発溶液には、生理活性剤（例、増殖因子、薬物、細胞、抗生物質、抗ウイルス剤、酵素、ビタミン等）を添加してもよい。前記デバイスが目的とする身体領域の再生プロセスを促進するために、それら生理活性剤は、医療デバイス中に組み込まれて、その後、移植部位でのデバイスから放出される場合がある。ナノファイバー性フィブロインには、例えば、化学および／または酵素反応によって、生理活性剤（例、増殖因子、薬物、細胞、抗生物質、抗ウイルス剤、酵素、ビタミン等）を添加してもよい。この添加は、工程ｃ）〜ｇ）の任意の工程中、または、その後に実施する場合がある。

【0038】

説明を明確にする目的のためだけに、この前半の工程を、ａ）およびｂ）と名付けが、このことは、実施の時間的順序を意味していない。ナノおよびマイクロファイバー性部品を別々に製造し、そして、この二つの工程を任意の順序で実行してもよい。

【0039】

それら部品の調製の後、本方法の工程ｃ）では、マイクロファイバー性とナノファイバー性フィブロインの部品を、溶媒またはフィブロインをさらに含む溶液で処理する。この工程では、前記ファイバーの表面部分がゲル相へと移行し、本ファイバーの周囲にフィルムを形成する。前記溶媒または溶液を用いる処理を、前記個別の部品上、または、それら部品を互いに接触させた後で実施する。

【0040】

溶媒単独で処理するケースでは、溶媒はイオン性液体（例、純粋なものか、または、水との混合物状態の、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムグリシン、１−アリル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−２，３−ジメチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムブロマイド、またはその混合物であってもよい）；ギ酸；トリフルオロ酢酸；１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール；ヘキサフルオロアセトン；塩化カルシウム−エタノール−水混合物；硝酸カルシウム−メタノール−水混合物；Ｎ−メチルモルホリン Ｎ−オキシド；または、リチウム塩（臭化リチウム、チオシアン酸リチウム）の水溶液から選択される。この処理に好ましい溶媒は、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート、または、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムグリシンであって、純粋なものか、または、水とそれらの混合物であって、水分が５％ｗ／ｗ〜５０％ｗ／ｗの間、好ましくは、１０％ｗ／ｗ〜２５％ｗ／ｗの間のものである。本発明の目的に好ましい別の溶媒は、ギ酸である。

【0041】

ナノファイバー性およびマイクロファイバー性フィブロイン部品（別々であるか、または、既に互いに接触しているかのいずれかのもの）の前記溶媒への暴露は、各種方法に従って実施される。例えば、
１秒〜２４０分間、好ましくは、３０秒〜３０分間の時間、前記溶媒に浸漬すること；
注いだり、コーティングしたり、霧吹きしたり、電気噴霧したり、または、電気紡糸したりすることによって、前記溶媒を堆積させ、その堆積量は、０．００１ｍＬ／ｃｍ^２〜０．５ｍＬ／ｃｍ^２の間、好ましくは、０．０１ｍＬ／ｃｍ^２〜０．１ｍＬ／ｃｍ^２の間にあるようにすること（これらの量は、部品の見かけ上の表面のことを指して言う（すなわち、部品自身の長さと幅を単純に掛け算して推定される量（部品の表面に対する高さの寄与分は一般的に無視できる））が、個別のファイバーの総表面積を指して言わない）；
１秒〜１２０分間、好ましくは、３０秒〜３０分間の時間、前記溶媒の蒸気に暴露することである。

【0042】

マイクロファイバーと溶媒を接触する温度は可変であり、４０〜８０℃の間、好ましくは、５０〜７０℃の間である。また、４０℃未満の温度で操作可能である。しかし、この場合は、本方法の実施時間は非常に長くなり、工業的生産には適していない。ナノファイバーに関しては、溶媒との接触温度は可変であり、室温〜７０℃の間、好ましくは４０〜６０℃の間である。

【0043】

連結前にこの二つの部品を別々に処理する場合は、二つの内一つを溶媒単独で処理し、そして、他のものを溶媒中のフィブロインの溶液で処理することもできる（溶媒単独処理のものと必ずしも同じでなくてもよい）。

【0044】

また、溶媒単独で部品の一つまたは両方を連続して処理し、ファイバーの初期ゲル化を引き起こし、その後、フィブロイン溶液を用いて処理して、溶解済みポリマーのアリコートをさらに加えて、引き続くそれら部品の連結を促進することもできる。

【0045】

本発明の方法の最適な実施に関しては、ファイバーと溶媒の接触時間を、温度を上げたり、処理される部品の寸法または編み糸の寸法を減少させたりして、上述した範囲内で減少させることが期待される。例えば、同じ厚さのマイクロファイバーに関しては、溶媒との適切な接触時間は、７０〜８０℃の温度で約３０秒〜３分間、および４０〜５０℃の温度で約１５分〜１時間の間である場合がある。ナノファイバーに関しては、これらの接触時間は、７０℃で３０秒〜１分間、４０〜５０℃の温度で約５〜３０分間の範囲にある。

【0046】

同じ温度の場合、接触時間はまた、特に、マイクロファイバー製部品のケースでは、その部品の見かけ上の密度（すなわち、同部品の容量単位当たりのファイバー量）に依存して変化する。それでも上述した一般的範囲内ではあるが、織物に対する適する接触時間は、例えば、ちりめん（ｃｒｅｐｅ）からあや織り（ｔｗｉｌｌ）、あや織りからオーガンジー（ｏｒｇａｎｄｉｅ）、そしてオーガンジーから不織布と変化すると減少する。

【0047】

これらの一般的ガイドラインを考慮に入れると、当業者は利用可能なマイクロファイバー部品とナノファイバー部品の効果的連結を得るのに適する最適操作条件を選択することができる。

【0048】

フィブロイン溶液での処理の場合は、その溶液を溶媒単独処理に関して上記したと同一の溶媒を用いて作製する。好ましくは、溶液のベースとなるのは、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート、または、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムグリシンであって、純粋なものか、または、水とそれらの混合物であって（水分が５％ｗ／ｗ〜５０％ｗ／ｗの間、好ましくは、１０％ｗ／ｗ〜２５％ｗ／ｗの間のものである）、フィブロインの濃度が５％ｗ／ｖ〜４０％ｗ／ｖの間、好ましくは、１０％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの間のものである。または、ベースとなるのは、フィブロイン濃度が１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの間、好ましくは、６％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの間であるギ酸である。

【0049】

フィブロイン溶液とナノファイバー性およびマイクロファイバー性フィブロイン部品との接触は、溶媒単独処理のケースで上記報告されたと同一の方法、タイミングおよび分量を用いて、前記部品（既に互いに接触しているか、または、まだ別々の状態のもの）を溶媒中に浸漬するか、または部品上に同溶媒を堆積させることを介して起こる場合がある。

【0050】

溶媒または溶液を用いる前記処理前に前記部品がまだ互いに接触していなかった場合、それら部品を工程ｃ’）で互いに接触させて、マイクロ／ナノファイバー性ハイブリッド構造物を取得する。

【0051】

幾何学的に平面なデバイスの場合は、ナノファイバー性部品とマイクロファイバー性部品を、所望の数と順序で互いの上に積層（配置）する。管状医療デバイスの場合は、ナノファイバー性部品とマイクロファイバー性部品を、所望の数と順序で互いの上に「嵌め込む」。管状以外の立体的ハイブリッド構造物の場合は、ナノファイバー性部品とマイクロファイバー性部品を、所望の数と順序で互いに接着させる。

【0052】

工程ｃ）およびｃ’）では、使用する溶媒および／または溶媒中に生理活性剤（例、増殖因子、薬物、細胞、抗生物質、抗ウイルス剤、酵素、ビタミン等）を分散させて、そのような生理活性剤をハイブリッド構造物に加えて形成可能である。このように、生理活性剤は、ハイブリッド構造物の構成部品と接触され、そして、その中に取り込まれ、従って、生理活性剤が使用される移植可能な医療デバイス中に取り込んでもよい。

【0053】

本発明の工程ｄ）では、そのようにして得られたハイブリッド構造物を、その後、熱処理に掛けて、少なくとも一つのナノファイバー性フィブロインと少なくとも一つのマイクロファイバー性フィブロイン製の二以上のフィブロイン部品の連結を強化する。この処理を、１０℃〜１５０℃の間の温度で溶媒にまだ含浸されているハイブリッド構造物に実施する。好ましくは、イオン性液体が前工程で使用されている場合には、処理温度は８０℃〜１２０℃の間であり、ギ酸または他の溶媒が前工程で使用されている場合には、２０℃〜５０℃の間である。処理時間は、１分〜２４時間の間である。

【0054】

好ましくは、工程ｄ）中は、連結される部品セットを、典型的には、０．５〜５ｋｇ／ｃｍ^２、好ましくは、０．１〜１ｋｇ／ｃｍ^２の間の値で圧縮処理して、工程ｃ）で形成されたゲル化フィブロインを有する両方の型のファイバー上に分配するプロセスの効率を上昇させる。

【0055】

この操作を、例えば、図１に示されるような装置によって実施することができる。この装置は、底部に加熱素子１０（その上には、プレート１１が載っている）を含む。上部の部品には、その装置は、第２プレート１２を含む。これら２つのプレートは、硬く、熱伝導性で且つ非接着性材料から作製されている必要がある。加熱素子は、ゲル化プロセスを必要な精度で管理することを可能にするために、上記処理温度範囲内で、±０．５℃、より良くは±０．１℃の精度で、精密な温度制御を可能とする必要がある。上記した好ましい操作方法によると、軽度の圧力（下向き矢印と表示「Ｐ」によって、図中に示されるもの）を、加熱工程中、重石および／または二つのプレートを互いに近接させる閉鎖システムを用いて上部プレートに適用し、フィブロイン部品間や前記部品とプレート間の空間を残さないようにする。最後に、ゲル化プロセスの実効性を損ねる可能性のある熱損失を防止するために、デバイスを、好ましくは、外部からアクセス可能な断熱チャンバー内に固定する。連結される二つのフィブロイン部品の最適な配置を、図に示す。マイクロファイバー部品１４（イオン性液体と熱との組合せ効果に感受性がより低いもの）が加熱素子に隣接するプレート１１と接触している一方、ナノファイバー性部品１３は上部プレート１２と接触している。この構成（マイクロファイバー性部品を加熱素子に近接させ、そして、ナノファイバー性部品を加熱素子から遠ざける構成）は、部品の積層順序によって可能となる場合ではあるが、本方法の工程ｆ）とｇ）に従って得られる上位階層ハイブリッド構造物の事例においても好ましい。

【0056】

管状部品の事例では、例えば、中が詰まった又は中空であって、硬くて、熱伝導性且つ非接着性材料製である場合がある円筒からなる装置であって、装置直径が連結される部品の直径よりもやや大きい（直径の差が、好ましくは０．０５ｍｍ〜３ｍｍの間であるもの）装置を用いて、連結を実行する。心棒を、その温度を１０℃〜１５０℃の間の温度に調製するのに適するシステムと接続する必要がある。そして、システムは、断熱チャンバー内に収めてもよい。このチャンバーは熱的に制御可能であり、そして、同じ範囲で温度制御を可能とする。この操作モードでは、部品の一つを心棒に嵌め込み、その後、他の部品を最初の部品に嵌め込む。この両方の場合では、フィブロイン部品の弾力性を利用する。心棒と部品間の寸法の差によって、最も内側の部品への最も外側の部品による半径方向への圧力が生成されて、同部品の接着と連結を促進する。この操作モードの好ましい構成は、製造されるデバイスの最終目的によって決定される。従って、例としては、血管の修復／再生用医療デバイスの製造に関して、ナノファイバー部品を心棒と接触して設置する一方で、マイクロファイバー部品をそのナノファイバー性部品上に嵌め込んでもよい。

【0057】

本方法の工程ｅ）では、溶媒を、水または水−アルコール混合液で洗浄するか、あるいは、蒸発させることによって除去する。洗浄は、１０℃〜１００℃の間、好ましくは、２０℃〜５０℃の間の温度で、２分〜１８０分間、好ましくは、１０分〜６０分間の時間で実施する。水−アルコール混合液を使用する場合の好ましいアルコールは、メタノールとエタノールであって、その水分濃度が、５％ｖ／ｖ〜５０％ｖ／ｖの間、好ましくは、１０％ｖ／ｖ〜３０％ｖ／ｖの間である。溶媒を蒸発させることによって除去する場合は、任意ではあるが、真空下で、１０℃〜１００℃の間、好ましくは、１５℃〜５５℃の間の温度で、１０分〜１６８時間の間、好ましくは、３０分〜７２時間の時間で除去する。

【0058】

本方法の工程ｃ）とｄ）は、隣接する部品を構成するファイバー性材料の表面の部分的可溶化／ゲル化を導く。次工程ｅ）の溶媒除去では、ゲル化したフィブロイン部分の凝固を引き起こす。構造物間の接触領域で起こる、フィブロインのゲル状態から固体状態への移行（凝固）は、マイクロファイバーとナノファイバーとの間の「結合点」、統合、および、融合点の形成を導く。これにより、マイクロファイバーとナノファイバーが一緒に溶接されたものからなり、そして、単一部品を構成するハイブリッド構造物が形成される。

【0059】

一旦、マイクロ／ナノファイバー性ハイブリッド構造物が上記したように生産されると、上述した任意工程ｆ）とｇ）を実施することによって、この構造物を別の構造物または数個の類似構造物に連結させて、階層的に組織された複合構造物を形成させることもできる。

【0060】

本発明の第二の観点は、ここまで記載した本方法を用いて得られる前記ハイブリッド構造物を使用する移植可能な医療デバイスに関する。

【0061】

本発明の移植可能な医療デバイスは、再生医療のアプローチを用いて、ヒトと動物の組織および器官を修復するための基材として、主として使用される。それら標的組織および器官のなかで、我々が言及するのは、末梢神経系の組織（末梢神経）、血管系の組織（静脈、動脈、血管アクセス用の動静脈瘻）、心血管系の組織（冠状動脈と心筋）、中枢神経系の組織（脊髄）、皮膚とその層の組織、内臓を閉じ込めて保護する組織（硬膜、心膜、胸膜、腹膜）、筋骨格系の組織（腱、靱帯、筋肉）、およびヘルニアと脱出症を抑えるデバイス等がある。

【0062】

デバイスの形とサイズは、標的組織または器官に依存する。以下に挙げて記載するのは、上記した目的のいくつかを意図していて、そして、本発明のハイブリッド構造物を使用して実現可能なデバイスのおおまかな形とサイズである。しかし、他の可能な使用（および相当するデバイスの形とサイズ）は、当業者に明白である。
末梢血管の事例では、内径が２ｍｍ〜８ｍｍの間で、壁厚が０．２ｍｍ〜４ｍｍの間の管状デバイス；
末梢神経の事例では、内径が１ｍｍ〜６ｍｍの間で、壁厚が０．２ｍｍ〜１ｍｍの間の管状デバイス；
腱と靱帯の事例では、外径が２ｍｍ〜１５ｍｍの間の中身が詰まった円筒状デバイス；
皮膚とその層の事例では、厚さが０．１ｍｍ〜５ｍｍの間の平面状デバイス；
内臓を閉じ込めて保護する組織（例、硬膜、心膜、胸膜、腹膜）の事例では、厚さが０．０５ｍｍ〜２ｍｍの間の平面状デバイス；
ヘルニアと脱出症を抑えるデバイスの事例では、厚さが０．０５ｍｍ〜２ｍｍの間の平面状デバイス、である。

【実施例】

【0063】

本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。

【0064】

実施例１
この実施例は、マイクロファイバー性フィブロインフィラメントの生産と、これらフィラメントから得られる部品（ファイバー、織物）の製造を記載する。

【0065】

カイコの繭を紡糸に掛けて、生の絹編み糸を得た。合糸と撚糸の後、編み糸を３０分間、１２０℃、圧力下で水を用いて精練して、セリシンを除去した。織物の生産のために、その生編み糸をまず、所望の編み方で編み、そして、そのようにして得た織物を、その後、界面活性剤の存在下で１時間、９５〜９８℃で精練して、セリシンを除去した。不織布を製造するためには、繭を切り刻んで、そして、ふやけさせて、セリシンを除去した。そのようにして得た短いファイバーシルク（「シャッペ」と呼ばれるもの）を、梳綿（カーディング）処理した。カード機のベールを、ニードリングして不織布へとまとめた。

【0066】

そのようにして得たフィラメントを用いて以下のものを製造した：
精練絹編み糸（３本の編み糸の横糸；カウント：１７．１×３デン）；
以下の特徴を有する精練絹織物：編み方：ちりめん（ｃｒｅｐｅ）；縦糸の編み糸数／ｃｍ：５８（カウント：１５．３×３デン）；横糸の編み糸数／ｃｍ：３９（カウント：１５．３×３デン）；単位面積当たりの質量：５５ｇ／ｍ^２；厚さ０．１２ｍｍ；
以下の特徴を有する精練絹織物：編み方：オーガンジー（ｏｒｇａｎｄｉｅ）；縦糸の編み糸数／ｃｍ：５３（カウント：２０．７デン）；横糸の編み糸数／ｃｍ：３９（カウント：２３．４デン）；単位面積当たりの質量：３０ｇ／ｍ^２；厚さ０．０９ｍｍ；
以下の特徴を有する精練絹織物：編み方：あや織り（ｔｗｉｌｌ）；縦糸の編み糸数／ｃｍ：５５（カウント：１５．３×３デン）；横糸の編み糸数／ｃｍ：４３（カウント：１５．３×４デン）；単位面積当たりの質量：６０ｇ／ｍ^２；厚さ０．０９ｍｍ；
以下の特徴を有する、精練絹の不織布（ＴＮＴ）：ファイバー長：２０〜２７ｍｍ；単位面積当たりの質量：３３ｇ／ｍ^２。

【0067】

これらのサンプルを以下の実施例のテストのために使用する。

【0068】

実施例２
この実施例は、ナノファイバー性フィブロイン部品の生産を説明する。

【0069】

カイコの繭を、３０分間、１２０℃のオートクレーブ中、蒸留水を用いて精練して、セリシンを除去した。

【0070】

徹底的に濯いで、そして、室温で乾燥させた後、１ｇのフィブロインマイクロファイバーを、６０℃で３時間、１０ｍＬのＬｉＢｒ飽和溶液（約９．３Ｍ）中に溶解した。等量の蒸留水で希釈した後、そのフィブロイン溶液を蒸留水に対して３日間透析して、塩を除去した。得られたフィブロイン溶液を、水で６７ｍＬへと希釈して、１．５％ｗ／ｖのフィブロイン水溶液を得た。１５ｍＬずつのアリコートに分割されたその溶液を、直径５ｃｍの型へと注ぎ、室温で蒸発させて、平均厚さが５０μｍのフィブロインフィルムを得る。

【0071】

電気紡糸プロセスの直前に、２ｇのフィルムを、室温の２５ｍＬのギ酸に溶解し、ポリマー濃度が８％ｗ／ｖに等しい溶液を得る。

【0072】

ナノファイバー性フィブロイン部品の生産のために、ギ酸中のフィブロイン溶液を、ＰＴＦＥキャピラリー管を有する、注射ポンプ付属ポリプロピレン注射器（Ｇｒａｓｅｂｙ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＭＳ２０００）中に充填した。電気紡糸システムは、２５ｋＶまで発電できる二個の高電圧電源（Ｆ．ｕ．Ｇ．Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ ＧｍｂＨ、ＨＣＮ３５−１２５００）からなる。正極は紡糸口金（内径０．５ｍｍのスチール製キャピラリー管からなり、収集器を横断する方向に動くことができるもの）へ接続される。負極は収集器（２０ｃｍ×８ｃｍ（ｌ×ｄ）の回転式シリンダーからなる）へと接続される。ナノファイバー性部品はこのようなやり方で、中空の円筒体の形態で得られ、その後、縦方向に切断され、そして、展開されて、全体として平面な部品を形成する。電気紡糸フィブロイン部品のいくつかのサンプルを、以下の実験パラメータを使用して製造する：フィブロインの濃度＝８重量％；電圧＝２４ｋＶ；流速＝３ｍＬ／ｈ；紡糸口金／収集器距離＝１０ｃｍ；回収時間＝６時間。電気紡糸の終わりに、フィブロイン部品を、収集器から外し、室温で３０分間、水−アルコール溶液で処理し、そして、空気乾燥する。これらの部品の平均厚さは５０μｍである。

【0073】

実施例３
この実施例で記載されるテストの目的は、互いに異なるナノファイバー性またはマイクロファイバー性フィブロイン部品に保持可能なイオン性液体の量を決定することである。

【0074】

実施例１で述べた４種類のマイクロファイバー性フィブロイン織物（オーガンジー、ちりめん、あや織り、および不織布）の特性と実施例２のナノファイバー性フィブロイン部品の特性を評価する。

【0075】

このテストに使用されるイオン性液体は、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートである。

【0076】

このテストを、二種類の含浸方法（該液体中にサンプルを浸漬し、その後、重力によって水切りすることによるもの、および、ブラシを使用して表面に堆積させるやり方によるもの）に従って実施する。両方のケースにおいて、含浸処理直後の絞り処理後に保持される液体の量を、サンプル重量に対する重量パーセンテージとして評価測定する。絞り処理は、浸漬処理して得られたサンプルを、６０分間、０．５ｋｇ／ｃｍ^２の力で圧縮することによって実施し、そして、表面堆積処理により得られたサンプルを、２分間、０．１ｋｇ／ｃｍ^２の力で圧縮することによって実施する。得られる結果を、表１に示す。

【0077】

【表1】

【0078】

実施例４
本発明に係るナノファイバー性部品とマイクロファイバー性部品の連結

【0079】

３×５ｃｍのサイズの、実施例１のオーガンジー織物のサンプルとちりめん織物のサンプル一つ、および、実施例２のナノファイバー性部品のサンプルを、イオン性液体を用いて、実施例３の表面コーティングと絞り処理で処理する。

【0080】

それら材料を、上記のように含浸し、連結した材料を図１に図式化した装置中に導入して、オーガンジー／ナノファイバー性部品ハイブリッド構造物とちりめん／ナノファイバー性部品ハイブリッド構造物をその後製造する。

【0081】

ペアの材料をそれぞれ、マイクロファイバー層（オーガンジーまたはちりめん）を底部にして、加熱プレートと直接接触させて、前記装置中に導入する。軽く圧力（０．１ｋｇ／ｃｍ^２）を、上部プレートに加える。熱損失を防止するために、装置を恒温チャンバー中に置き、底部プレートの温度を、５分間、５５℃へと上げる。この期間の終わりに、装置を恒温チャンバーから取り出して、室温に（約１０分間で）冷まし、その後、水中のエチルアルコールが８０％ｗ／ｗの濃度の混合液を、注射器を使って二個のプレート間に注入する。

【0082】

それらのプレートをその後、開いて、そして、ハイブリッド構造物を、同じ水−アルコール混合液の浴槽に移して、残ったイオン性液体を全て除去する。このハイブリッド構造物を、２４時間この浴槽に放置する。

【0083】

この期間の後、ハイブリッド構造物を、蒸留水中で濯いで、アルコール分を除去し、そして、数枚の層のペーパータオル（構造物が完全に乾燥するまで定期的に交換するもの）間に置く（約１２時間かかる）。

【0084】

実施例５
本発明のナノおよびマイクロファイバー性ハイブリッド構造物の化学的特徴

【0085】

個別のフィブロインマイクロファイバー性部品とナノファイバー性部品および実施例４で得られたハイブリッド構造物のアミノ酸組成を評価した。

【0086】

この３種類のサンプルのそれぞれに関して、約２５ｍｇの材料を、真空下、２４時間、１０５℃で、６ＮのＨＣｌを用いて加水分解した。そのようにして得た加水分解物溶液を、自動イオン交換アミノ酸分析装置を用いて解析した。解析の結果を、表２に示す。

【0087】

【表2】

【0088】

実施例６（比較例）
先行技術に係るナノファイバー性部品とマイクロファイバー性部品の連結

【0089】

比較目的で、連結されたフィブロインナノファイバーとマイクロファイバーからなる４種類のサンプルを、文献ＣＮ１０１８７９３３０Ａの手順に従って作製する。

【0090】

実施例４と同じ出発材料を使用して、２つのハイブリッド構造物を、以下の手順に従って製造する：
ナノファイバー部品とマイクロファイバー織物（オーガンジーまたはちりめん）を接触させて、そして、４重量％のフィブロイン水溶液に含浸する；
得られた連結システムを、３０分間６０℃で処理し、その後、１５分間、８０％ｗ／ｗのメタノールの水−アルコール溶液中に浸漬する；
二種類の連結済みシステムをその後、温度と湿度条件の制御下（２０℃、６５％相対湿度）で、室温で乾燥させる。

【0091】

このようにして得られたハイブリッド構造物の二種類のサンプルを、以下、「ＳＦフィルム」と呼ぶ。

【0092】

実施例７（比較例）
先行技術に係るナノファイバー性部品とマイクロファイバー性部品の連結

【0093】

実施例６の手順を繰り返す。違いは、フィブロイン部品を接触させて、そして、４重量％のフィブロイン水溶液にそれら部品を含浸後、システムを、−２０℃で凍結し、その後凍結乾燥することによって固化結合することだけである。

【0094】

このようにして得られたハイブリッド構造物の二種類のサンプルを、以下、「ＳＦゲル」と呼ぶ。

【0095】

実施例８
本発明と先行技術のナノおよびマイクロファイバー性ハイブリッド構造物の化学的特徴

【0096】

実施例４で製造されたオーガンジー／ナノファイバー性部品のハイブリッド構造物を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、モデルＭＩＲＡ３、Ｔｅｓｃａｎ社）で観察した。比較のため、オーガンジー織物のサンプルとナノファイバー性部品のサンプルも、連結前に観察した。オーガンジー織物を選んだ理由は、縦糸と横糸の編み糸が開いた配置になっていて、いくつかの空間が残っているからであり、その空間を通して、マイクロファイバー性部品に隣接する側（連結側）上のナノファイバー性部品の表面の特徴解析ができる。

【0097】

この目的のため、０．５×０．５ｍｍのサンプルを、ハイブリッド構造物から取り出して、ＳＥＭ用のアルミニウム製サンプルホルダーに、両面粘着テープを用いて配置し、そして、スパッタリングによって金−パラジウムでコーティングした。空気に暴露される両サイドを検査した。つまり、マイクロファイバーのものとナノファイバーのものである。

【0098】

サンプルの顕微鏡写真を、図２に示す。

【0099】

図２Ａと図２Ｂは、それぞれ、連結前のマイクロファイバー性オーガンジー織物とナノファイバー性部品を示す。後者は、電気紡糸によって得られる基体の典型的特徴を有し、フィブロインのナノファイバーの平均直径は５００〜６００ｎｍであり、（不織布として）不規則に展開されて、非常に細やかな多孔性を有する。連結後、マイクロファイバー性部品（図２Ｃ）は、構成要素の編み糸がやや平坦化するように見えるが、これはおそらく、連結プロセスの各種工程で奏される圧力によるものだろう。しかしながら、編み糸の縦糸と横糸は、それでも、その元の構造を保持していて、それらが造られる個々のマイクロファイバーはそれでも十分に視認できる。

【0100】

織物の孔（図２Ｄと２Ｅ）の中では、連結されたナノファイバー性部品の表面を見ることができ、その表面は低倍率で視認できる典型的な凸凹を保持している。いくつかの領域（図２Ｅ）では、マイクロファイバーとナノファイバーを連結しそれらを近接して保持する形跡を有する部分的にゲル化した領域が観察される場合がある。

【0101】

図２Ｆは、連結後に空気に暴露されたナノファイバー性部品の表面を示す。ナノファイバーの融合領域があるけれども、未処理の元の部品に関して観察される典型的形態が保持されている。

【0102】

図３Ａと３Ｆ（特に、図３Ｆ）は、マイクロファイバーとナノファイバーの両方をコーティングするゲル薄層（ファイバー間結合を介して両ファイバーを結合するもの）の存在を示す。ゲル層は、非常に薄く且つ表面的であり、単独のマイクロファイバーの表面と、また、ナノファイバー表面を介して見えるもので、それらファイバーの形態は、それらの表面でやや変形するのみである一方、材料の残りの部分では実質的に保持されている。

【0103】

最後に、図３Ｂは、ＳＥＭ観察されたサンプルが撮影された切り口に沿って、ハイブリッド構造物の周辺領域を示す。この画像は、本発明の連結プロセスが効果的であり、そして、二個の連結部品が、変形と圧縮（ハサミまたはメスで切断する対象の領域で通常発生するもの）に供されても分離しないことを示す。

【0104】

比較のために、比較実施例６の手順に従って製造した先行技術のサンプル（オーガンジー「ＳＦフィルム」サンプル）を、ＳＥＭ下で検証する。このサンプルの画像を、図４Ａと４Ｂに示し、そして、それら図はマイクロファイバーの表面上のフィルムの存在を示すが、そのフィルムは潰れていて、マイクロファイバーに接着しているだけで、ナノファイバー部品との効果的接着剤として機能することはできない。

【0105】

実施例９
本発明のハイブリッド構造物の化学的−物理的特徴

【0106】

連結プロセスがマイクロおよびナノファイバー性構成部品の物理的−化学的特性、構造特性および立体構造特性に変化を生じさせるかどうかを検証するために、実施例４で製造したオーガンジー／ナノファイバーハイブリッド構造物を、フーリエ変換型赤外線（ＦＴＩＲ）分光分析によって、さらに特徴解析する。

【0107】

ＳｅＺｎ水晶セル付属Ｓｍａｒｔ Ｐｅｒｆｏｒｍｅｒアクセサリ付きのＮＥＸＵＳ Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｉｃｏｌｅｔ分光光度計を、ＡＴＲ（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｔｏｔａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ（減衰全反射））モードで使用した。ＦＴＩＲスペクトルを、波長数範囲４０００〜７００ｃｍ^−１で記録し、４ｃｍ^−１の解像度で６４回のスキャンを蓄積した。各スペクトルは、三回の測定の平均である（図５）。

【0108】

スペクトル領域１９００〜７００ｃｍ^−１は、ポリマーの組成と構造の視点からすると、フィブロインのフィンガープリントを表す。最も有意な立体構造的に感度のあるバンドは、アミドＩ（１６１５〜１６９０ｃｍ^−１）、アミドＩＩ（１５０９ｃｍ^−１）、およびアミドＩＩＩ（１２３０−１２６０ｃｍ^−１）（ペプチド結合の振動モードの倍数に由来するもの）として知られている。アミドＩは、ＣＮ結合の寄与がある、ＣＯ結合の伸縮振動に主として帰属する。アミドＩＩは、ＣＮ結合の伸縮の寄与がある、（主として）ＮＨ結合の屈曲に帰属する。アミドＩＩＩは、ＮＨ屈曲振動とＣＮ伸縮振動に帰属する。

【0109】

図５Ａは、重ねているが、処理前のマイクロファイバーのスペクトル（曲線（ａ））と本発明のハイブリッド構造物のスペクトル（曲線（ｂ））を示す。同様に、図５Ｂは、重ねているが、処理前のナノファイバーのスペクトル（曲線（ａ））と本発明のハイブリッド構造物のスペクトル（曲線（ｂ））を示す。

【0110】

スペクトルにおけるアミドＩ、ＩＩ、およびＩＩＩのバンドの位置と強度に基づくと、連結処理前のマイクロファイバーとナノファイバーの両方とも、典型的なβ−シート分子立体構造（天然（マイクロファイバー）または再生（フィルム、ナノファイバー等）結晶性フィブロイン材料に特徴的なもの）を有すると推論可能である。

【0111】

連結後のスペクトルプロフィールは、各未処理サンプルのものと正確に重複し、材料の構造的特徴が保持されていることを示している。

【0112】

アミドＩＩＩのバンドの二つの成分を使用して、連結プロセス前後の材料の結晶化度を計算した。結晶化度（Ｃ_Ｉ＝Ｉ_１２６０／Ｉ_１２３０）を、１２６０ｃｍ^−１でのバンド強度と１２３０ｃｍ^−１でのバンド強度間の比率から得る。マイクロファイバーに関しては、この結晶化度は連結後も基本的に変化がない（０．５２から０．５１へと変化する）。一方、ナノファイバーに関しては、結晶化度は、０．６０から０．５５へと約８％減少する。この挙動は、ゲル化プロセス中のナノファイバー性部品の一部の形質転換と矛盾しない。そして、次に起こる凝固では、先在する構造より規則性の低い構造を採ることとなる。つまり、実施例８の顕微鏡写真で示されるように、接着剤としての特性を有する移行相へと変化する。

【0113】

実施例１０
本発明のハイブリッド構造物の構造的特徴

【0114】

実施例４で作製したオーガンジー／ナノファイバー性部品のハイブリッド構造物を、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって、さらに特徴解析する。

【0115】

熱量測定器２００ Ｑ ＴＡを使用して、窒素流下、加熱速度が１０℃／分で室温から５００℃までの曲線を記録する。重量約５ｍｇの各サンプルを、アルミニウム性るつぼに導入し、二回繰り返して解析する。テスト結果を図６に示し、図は、マイクロファイバー単独のサーモグラム（曲線（ａ））、ナノファイバー単独のサーモグラム（曲線（ｂ））、および本発明のハイブリッド構造物のサーモグラム（曲線（ｃ））を示す。

【0116】

見て分かるように、全ての曲線は、材料内に閉じ込められた水分の蒸発に帰属可能な、１００℃以下の温度での第一の吸熱を示す。

【0117】

マイクロファイバーの場合には、β−シート立体構造を有する結晶性および規則性ファイバー形態のフィブロインの熱分解に帰属する、３１３℃でのピークを有する、第二の非常に強い吸熱が続く。

【0118】

処理前のナノファイバーのサーモグラム（曲線（ｂ））は、類似したプロフィールを有するが、第二の吸熱はより低い温度（２８２℃）であり、このことは、マイクロファイバーの場合よりも、結晶相の配向度がずっと低く、よりずっと不規則な結晶サイズを示している。

【0119】

ハイブリッド構造物サンプルの熱図（曲線（ｃ））は、二つの構成部品の特徴が移行したものを示す：ナノファイバーの分解ピークは、２８２℃のまま変わらない一方、マイクロファイバーの分解ピークは３０８℃に移行する。この移行は、おそらく、本発明の連結材料に存在する非常に密接な相互接触領域における分子間相互作用が原因である。

【0120】

実施例１１
本発明および先行技術のハイブリッド構造物の力学的特徴

【0121】

実施例４のサンプルで、引っ張り試験を実施する。サンプルは、ナノファイバー性部品（厚さ５０μｍ）とマイクロファイバー性構成部品としてのオーガンジー編み織物（厚さ９０μｍ）の連結物からなっている。比較のために、また、個別のナノファイバー性部品の細片およびマイクロファイバー性織物の細片の特性も評価した。

【0122】

連結前後のサンプルの厚さを、基準であるＵＮＩ ＥＮ ＩＳＯ５０８４：１９９８法に従って、測定した。得られた値を使用して、応力と弾性率の力学的パラメータを計算した。２０×１０ｍｍ（長さ×幅）のサイズのそのような部品の細片とハイブリッド構造物の細片に関して、１０ｍｍのゲージ長と１０ｍｍ／分のクロスバー速度で、Ｉｎｓｔｒｏｎ動力計モデル４５０１を使用して、力学物性を測定した。測定は、２０℃、６５％相対湿度の標準的雰囲気中で実施した。応力、変形値、および弾性値を、負荷−伸長率曲線から計算した。そして、それら値は、各サンプルを１０回測定した平均値で表す。

【0123】

得られた結果を、図７のグラフに示し、そして、表３にまとめる。

【0124】

マイクロファイバー性部品の負荷−伸長率曲線（図７Ａ）は、繊維構造を構成する編み糸が伸長する初期段階を特徴とする。一旦伸長されると、編み糸の弾力性という固有の特徴に起因するさらなる伸長が起こる。その特徴は、負荷値を徐々に増加させることによって示されるように、伸長それ自体に対する抵抗が増加することに抗する。最後に、破断が、約５０％伸長後に起こる。この部品の顕著な特徴は、高い強靱性、同等に高い伸長率、および比較的低い初期弾性率である。

【0125】

一方、ナノファイバー性部品（図７Ｂ）は、正反対の力学的伸長応答（低い強靱性と伸長値、非常に高い初期弾性率）を有する。

【0126】

本発明のハイブリッド構造物（図７Ｃ）は、このシステムの個々の構成部品の単純合計の結果ではない力学的挙動を呈する。つまり、むしろ、二個の構成部品間の非常に厳格で特異的な相互作用を説明する、加算したものからの逸脱を呈する。事実、ハイブリッド構造物は、加えた負荷に対する非常に高い初期抵抗性を特徴とする。この抵抗性は、二つの部品間のその界面での密接な相互作用に帰属する。負荷が増えるほど、負荷−伸長率曲線はギザギザになる。このことは、マイクロファイバー性部品とナノファイバー性部品間の接触点が経時的に破断するせいである。この相は、伸長値が２０〜２５％になるまで続き、６〜７％より多く伸長することのないそのようなナノファイバー性部品の伸長値よりも有意に高い。負荷をさらに増加させると、マイクロファイバー性部品の伸長値と非常に似た値である４５％〜５０％の間で、伸長のためにその後破断するそのようなマイクロファイバー性部品の寄与が生じる。

【0127】

テスト中に測定される力学的値（応力と弾性率も含む）を、図７Ｄに示し、そして、表３にまとめる。

【0128】

【表3】

【0129】

実施例１２（比較例）
比較のために、実施例１１のテストを、先行技術のサンプル（実施例７に記載されるように製造される、オーガンジー織物を用いる「ＳＦゲル」サンプル）に関してリピートする。

【0130】

同一の手順に引き続いて、水性溶液を型に注ぎ、その後、凍結と凍結乾燥してできる多孔性フィブロイン単独のシートもまた、作製した。

【0131】

２０×１０ｍｍの細片のこれらサンプルを、同一条件で、前実施例と同じテストに掛けた。

【0132】

多孔性シート（Ａ）とマイクロ／ナノハイブリッド構造物（Ｂ）のそれぞれに関して、結果を図８に示す。

【0133】

多孔性シート（図８Ａ）の力学的特性は非常に不良である。負荷強度の平均値は１．１±０．２Ｎであり、ナノファイバー性部品のもの（１１．２±１．８Ｎ；図７Ｂ参照）より約１０倍低い。曲線の形に変化があるのは、上記方法を用いて得られる絹フィブロインの多孔性材料の織地が不均質であることが原因である。

【0134】

多孔性フィブロインを使用して連結されたマイクロ／ナノハイブリッド構造物（Ｂ）の負荷−伸長率曲線（図８Ｂ）は、二つのピーク（一つは低い変形値でのもので、他のものは高い変形値でのもの）の存在を特徴とする。低変形でのピークは、ナノファイバー構成部品の破断に対応していて、このことは、破断値での負荷と伸長率（それぞれ、１５±２Ｎと５．５±０．２％）によって示される。

【0135】

高変形でのピークは、マイクロファイバー性基体の破断（負荷：４０±３Ｎ；破断点伸び：２９±３％）に対応する。

【0136】

実施例１３
本発明および先行技術のハイブリッド構造物の接着強度の測定

【0137】

オーガンジー織物とちりめん織物から調製した実施例４の本発明の二つのサンプルと、それぞれ、実施例６および７に記載したように作製された先行技術の「ＳＦフィルム」および「ＳＦゲル」材料の各々に関する二つのサンプル（オーガンジーおよびちりめん）を、ハイブリッド構造物の二つのマイクロおよびナノファイバー性構成部品間の接着強度を測定するように設計された力学テストに掛けた。テストを、基準であるＵＮＩ ＥＮ ＩＳＯ１３９３７−２：２０００法に従って、Ｉｎｓｔｒｏｎ動力計モデル４５０１を使用して、実施した。

【0138】

特に、１０×４０ｍｍの直方体細片を、各サンプルから採取する。サンプルの一方の端では、二つのフラップ（一つはナノファイバー性部品に対応し、もう一つはマイクロファイバー性部品に対応する）が、約１０ｍｍ離れて、精巧に引き離されていた。これらのフラップを、図９に示されるように、動力計のグリップ内に固定した。上部の（可動）グリップをその後作動させ、それを、２ｍｍ／分のクロスバー速度で、下部の（固定）グリップから引き離すように動かした。そして、ナノファイバー性（上部）部品からマイクロファイバー性（下部）部品の分離を生じさせるのに必要な力（ｃＮ単位で測定されるもの）は、少なくとも２０〜３０ｍｍ離れるまでの間連続的に記録した。各サンプルに関して少なくとも５回、テストを実施し、そして、個別の結果の平均を取った。典型的な「剥離負荷／行程」曲線を、図１０Ａに示す。実験データを処理して得た結果を、表４と図１０Ｂの棒グラフに示す。

【0139】

【表4】

【0140】

実施例１４
インビトロ細胞傷害性と遺伝毒性試験

【0141】

ヒトと動物の身体への移植用の基材の生産のための応用の視点から、本発明の複合材料のインビトロでの生物学的特性を評価した。

【0142】

テストを、二種類のヒト細胞モデル（ヒト線維芽細胞（ＭＧＭ１８００４Ｅ）とヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））を用いて実施した。

【0143】

２０％熱非働化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社）、２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ社）、ペニシリンスとトレプトマイシン（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ社）含有高グルコース含量ＤＭＥＭ培養培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で、ヒト線維芽細胞を培養した。

【0144】

ヒト内皮細胞を、ペニシリンとストレプトマイシン（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ社）含有ＥＢＭ−２培養培地（内皮細胞用基本培地２、Ｌｏｎｚａ社）中で培養した。

【0145】

バイオ材料の潜在的細胞傷害性と遺伝毒性のマーカーとして、細胞増殖とＤＮＡ損傷の度合いを評価するように、解析テストを設計した。

【0146】

Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）テストは、細胞の代謝活性（細胞増殖と直接リンクするもの）を測定する。細胞を、初期密度６０００細胞／ｃｍ^２で、９６穴プレートに播種した。培養培地単独と細胞単独を、ブランクとして使用した。テストを、二つの同じ生物材料で、技術的には三回繰り返して実施した。細胞を、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃のインキュベーター中で、２４、７２、および１２０時間培養した。培養培地を、３日目に変えた。インキュベーション期間の最後に、固定量のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）（総容量の１０％）を、各ウエルに加えた。さらに１８時間のインキュベーション期間の後、培地を別のプレートに移し、そして、５７０ｎｍと６００ｎｍでの吸光度を、マルチディスクリーダー（Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で記録した。本発明のバイオ材料と接触させるサンプルと細胞単独のサンプルとの間のパーセンテージの差として、結果を表した。

【0147】

ＤＮＡ損傷テストは、Ｈ２ＡＸヒストン中のリン酸化Ｓｅｒ_１３９の存在を検出することによって、バイオ材料が遺伝毒性を持つ可能性を評価する。リン酸化は、ＤＮＡ二本鎖の破断の存在によって誘導され、免疫蛍光染色により検証する。細胞播種の初期密度は、２４時間のものに関しては６０００細胞／ｃｍ^２、１２０時間のものに関しては３０００細胞／ｃｍ^２、および１２０時間のものに関しては１５００細胞／ｃｍ^２であった。培養培地を、３日目に変えた。２００ｍｍのＨ_２Ｏ_２で１６時間処理した細胞を、ポジティブコントロールとして使用した。実験の終わりに、細胞を、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で固定し、次に、０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて透過処理した。非特異的反応部位を、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ）でインキュベーションすることによってブロックした。次に、抗γＨ２ＡＸ抗体を１時間インキュベートし、そして、ヤギ二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５抗マウスＩｇＧを介して可視化した。細胞核を、ヘキスト３３３４２を用いてマークした。プレートを、Ｌｅｉｃａ製ＤＭＩ４０００Ｂ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を、２０倍で用いて調べた。ＤＮＡ損傷陽性細胞の平均数を、複数の同じバイオ材料の各々に関してと、各実験条件に関して、３〜５回独立した視野を観察することによって決定した。

【0148】

図１１は、コントロールの増殖に対するパーセンテージとして表した細胞増殖曲線を示す。２４時間では、ヒト繊維芽細胞は、コントロールウエル（ポリスチレン基体）中に播種された細胞の増殖度と類似した増殖度を示す。７２時間では、３種類のＳＦパッチ（マイクロファイバー、ナノファイバー、および、マイクロ／ナノハイブリッド）に接触している細胞の増殖曲線に、軽度の減少が観察された。しかし、この減少は、１２０時間で速やかに回復された。ヒト線維芽細胞増殖速度は、３種類の異なるＳＦパッチの存在によって乱されることは無いと結論可能である。

【0149】

３種類のＳＦバイオ材料に接触するヒト内皮細胞は、コントロールと比較して、増殖度の減少を示した。ヒト線維芽細胞でのテストに対しても、この３種類のＳＦバイオ材料は、７２時間までの細胞増殖に関しては、ほぼ同じ傾向を示すことは言及に値する。しかしながら、ナノファイバー性パッチを用いる１２０時間でのヒト内皮細胞の場合、それらは、さらに増殖曲線での減少を示す一方で、ハイブリッドマイクロ／ナノファイバー性パッチは、細胞の代謝活性の測定値（細胞増殖と直接リンクするもの）が増加した。

【0150】

ヒト線維芽細胞に関する遺伝毒性テスト結果（図１２）は、７２時間のインキュベーション後にＨ２ＡＸのリン酸化度の増加を示した。この結果は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）増殖テストの傾向と一致している。つまり、同じインキュベーション時間で細胞の代謝活性に軽度の減少を示した。これはおそらく、ＳＦバイオ材料上で培養された細胞の順応フェーズが原因である。２４と１２０時間では、３種類のＳＦバイオ材料上で培養されたヒト線維芽細胞は、ポリスチレン上で培養されたコントロール細胞と比較すると、リン酸化レベルが有意に低下した。このことは、これら３種類のＳＦパッチが、コントロール基体よりも、これらの細胞に対する遺伝毒性が低いことを示唆する。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）テストで既に観察されたように、ヒト内皮細胞はヒト線維芽細胞と挙動が異なる。マイクロファイバー性基体だけが、２４と１２０時間でＨ２ＡＸのリン酸化型の増加を誘導する。このことは、コントロール基体と比べて、このＳＦパッチの遺伝毒性効果がやや高いことを示す。他方、ナノファイバー性パッチおよび、最も重要なことに、マイクロ／ナノファイバー性ハイブリッドパッチのＤＮＡ損傷の程度はより低い。このことは、この型のヒト細胞に対する遺伝毒性に関しては生体適合性がより良好なことを示す。

【0151】

結果に対するコメント
上記テストで確認されるように、本発明の複合材料は、個別のナノファイバーとマイクロファイバーの特性を部分的に模写する特性だけでなく、この二つの型のファイバーの連結によって生じる新しい特徴も有する（引っ張り特性テスト、ＦＴＩＲ、およびＤＳＣ）。

【0152】

化学的分析結果は、ハイブリッド構造物が、出発マイクロファイバー性部品およびナノファイバー性部品と基本的に同じアミノ酸組成を有することを示す。その特徴は、ほぼ４種類のアミノ酸が大量に存在する（グリシン＋アラニン＋セリン＋チロシン＝８９モル％）一方で、全ての他のアミノ酸は少量で存在する（全体で約１１モル％）。連結プロセスはフィブロインの化学構造を改変せず、そして、ポリマーの生物学的化学向性は、従って、連結後でさえ変化が無いままであることが結論可能である。

【0153】

さらにまた、先行技術の材料と比較すると、本発明の材料は、接着性が良く、そして、力学テストにおける挙動がより一貫している。

【0154】

特に、本発明のハイブリッド構造物のＳＥＭ画像（図２と３）によると、部品間の接着が良好で、二つの同部品のファイバー間に連続するポリマーフィルムが存在する。一方で、最も近い先行技術（中国特許出願公開番号ＣＮ１０１８７９３３０Ａ明細書、図４）の構造物の同様の画像によると、部品間の接着を保証するべきはずのポリマーフィルムは、断片化されて、これら部品の一つにのみ接着しているだけである。

【0155】

引っ張り試験は、本発明の複合材料のユニークな特徴は、伸長率の範囲が約１０〜２５％の間であることであることを示した。これは、具体的には、二つの型のファイバー間の相互作用に起因する。逆に、先行技術の連結材料は、ナノおよびマイクロファイバー性構成部品の挙動の純粋な合計となる挙動を示す（図８Ｂ）。このことは、多孔性材料によって一緒に連結されたマイクロおよびナノ構成部品は、別々の相として挙動し、各相はその固有の特性を保持していて、連結手法によって引き起こされる変化／改善を全く示さないことを確認する。むしろ、最も近い先行技術に従ってハイブリッド構造物を作製することによって、マイクロファイバー性構成部品の引っ張り特性の悪化が得られる。つまり、負荷と破断点伸びの値が約６３Ｎと４８％であるのが、それぞれ、４０Ｎと３０％の値へと変化する。

【0156】

同様に、ハイブッド構造物の二つの層の引っ張り剥離テストは、先行技術の場合よりも、本発明の場合に、ナノおよびマイクロファイバー性部品間の接着強度がずっと高いことを確認した（図１０）。

【0157】

先行技術の方法は、従って、本発明の方法で得られる最終ハイブリッド構造の二つの部品間での同じ連続性特徴を保証しない。先行技術に従って製造されたデバイスの場合、このことは、互いに異なる層間の形態学的且つ力学的不連続性ができてしまうことに繋がる場合がある。その結果、性能と幾何学的特徴の喪失が起こり、力学的視点からは、より脆弱な（例、ナノファイバー性）層ができたり及び／又は壊れたりするまでになる。力学的および生物学的視点からの負荷がかかる使用条件（例、生体内移植の進行において発生する場合があるもの）では、先行技術のハイブリッド構造物を構成する二以上のポリマー相の挙動が異なるので、特に、材料が生理液の流れに曝される場合に、進行中の再生プロセスと干渉するような大きさの局所負荷を創出する可能性がある。

【0158】

本発明のハイブリッド構造物は、マイクロファイバー性フィブロインとナノファイバー性フィブロインの個々の部品よりもインビトロでの生物学的挙動が良好であった。このことは、生物学的挙動の視点からは、マイクロおよびナノファイバー性部品を個別に考慮した場合の既に良好な性能レベルを、さらに向上させた。マイクロフィブロイン単独の基材性能は、例えば、論文「Ｄｅ ｎｏｖｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｔｉｃｕｌａｒ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ ｎｏｎｗｏｖｅｎ ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、Ｄａｌ Ｐｒａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００５）２６、１９８７に記載されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】