特許 6754361 若年型バッテン病のための遺伝子療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6754361

(24)【登録日】2020年8月25日

(45)【発行日】2020年9月9日

(54)【発明の名称】若年型バッテン病のための遺伝子療法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20200831BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20200831BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200831BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200831BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200831BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200831BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20200831BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200831BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20200831BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20200831BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/864 100Z

   C12N7/01ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K35/76

   A61K48/00

   A61K31/7088

   A61P25/00

【請求項の数】14

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2017-531531(P2017-531531)

(86)(22)【出願日】2015年12月16日

(65)【公表番号】特表2018-500311(P2018-500311A)

(43)【公表日】2018年1月11日

(86)【国際出願番号】US2015066206

(87)【国際公開番号】WO2016100575

(87)【国際公開日】20160623

【審査請求日】2018年12月12日

(31)【優先権主張番号】62/092,501

(32)【優先日】2014年12月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/146,793

(32)【優先日】2015年4月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507282004

【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ネブラスカ

(73)【特許権者】

【識別番号】514137997

【氏名又は名称】オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】キーリアン， タミー

(72)【発明者】

【氏名】ファウスト， ケビン

【審査官】 澤田 浩平

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０２２５６６６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９７／００８３０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 HUMAN GENE THERAPY，２０１４年 ３月，25(3)，p.223-239

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３１／００−３１／８０，３５／００−３５／７６８，４８／００，

Ａ６１Ｐ１／００−４３／００，

Ｃ１２Ｎ１／００−７／０８，１５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡＰｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

メチル−ＣＰＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターに作動可能に連結されたヒトＣＬＮ３をコードするポリヌクレオチドを含む組換え自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクター。

【請求項2】

前記ＡＡＶゲノムが、天然由来の血清型または分離株もしくはクレードのＡＡＶに由来する、請求項１に記載のベクター。

【請求項3】

前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の群から選択される、請求項２に記載のベクター。

【請求項4】

ＳＶ４０もしくはＣＢＡ−ＭＶＭから選択される５’ＵＴＲ／イントロン、または
最小ＳＶ４０イントロン、または
ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０後期ポリアデニル化配列、ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、ＡＡＴＡＡＡ（配列番号３）ポリアデニル化シグナル、ＣＡＡＴＡＡＡ（配列番号４）ポリアデニル化シグナル、ＡＴＴＡＡＡ（配列番号５）ポリアデニル化シグナルまたはＴＡＮＡ（配列番号６）ポリアデニル化シグナルから選択されるポリアデニル化シグナル、または
転写後調節エレメント
をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項5】

前記転写後調節エレメントが、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、最小ガンマエレメントおよび部分的アルファ−ベータエレメントを含有するＷＰＲＥ２、または最小ガンマおよびアルファエレメントを含有するＷＰＲＥ３、またはＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）の群から選択される、請求項４に記載のベクター。

【請求項6】

ＡＡＶ９ベクターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項7】

配列番号２のヌクレオチド６６２〜７６７の配列を有する５’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）、配列番号２のヌクレオチド７７５〜１５１１の配列を有するＭｅＣＰ２プロモーター、配列番号２のヌクレオチド１５２０〜１６１６の配列を有するｍｏｄＳＶ４０後期１６ｓインサート、配列番号２のヌクレオチド１６８３〜２９９９の配列を有するＣＬＮ３導入遺伝子、配列番号２のヌクレオチド３０５２〜３１９８の配列を有するウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）、及び配列番号２のヌクレオチド３２７８〜３４１８の配列を有する３’ＩＴＲを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクターにより形質導入された宿主細胞。

【請求項9】

細胞に形質導入するための組成物であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクターを含み、該組成物は、宿主細胞に導入されることを特徴とする、組成物。

【請求項10】

請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス。

【請求項11】

請求項１０に記載の組換えアデノ随伴ウイルスと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬製剤。

【請求項12】

若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）の処置および／または予防のための組成物であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクター、請求項１０に記載のウイルス、または請求項１１に記載の製剤を含む、組成物。

【請求項13】

静脈内投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

体重１ｋｇあたり約１０^１０から最大約１０^１６ゲノムコピー、または対象あたり約１０^１０から最大約１０^１６ゲノムコピーで投与されることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の引用）
本出願は、２０１４年１２月１６日に出願された米国仮特許出願番号第６２／０９２，５０１号、および２０１５年４月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１４６，７９３号の出願日の利益を主張している。これらの先行する仮特許出願は、それらの全体が参考として援用される。

【背景技術】

【0002】

（背景）
リソソーム蓄積症は、リソソーム機能にとって重要なタンパク質における変異によって引き起こされる代謝障害の１クラスである。多くの種類のリソソーム蓄積症が存在し、各々は相対的に珍しいが、それらを組み合わせた有病率は、出生数８，０００につき１例であると推定される（Schultzら（２０１１年）Trends Neurosci.、３４巻：４０１〜４１０頁）。若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬまたは若年型バッテン病）は、出生数１００，０００につき約１例出現する致死的な神経変性リソソーム蓄積症であり、これは典型的には、年齢５〜１０歳の間の小児に見られる。ＪＮＣＬは、失明として開始し、発作、運動性喪失およびその後の認知機能低下へと進行する（GettyおよびPearce（２０１１年）Cell. Mol. Life Sci.６８巻：４５３〜４７４頁）。

【0003】

若年型バッテン病は、最も一般的には、エクソン７および８における１．０２ｋｂ欠失による、ＣＬＮ３遺伝子における常染色体劣性変異によって引き起こされ（Int. Batten Dis. Consortium（１９９５年）Cell、８２巻：９４９〜９５７頁）、ＣＬＮ３タンパク質は、リソソーム膜および他の膜区画に存することが示されてきたが、その機能は依然として未解明である。ＣＬＮ３は、エンドサイトーシスおよび細胞内タンパク質輸送、リソソーム恒常性、オートファジー、ミトコンドリア機能、アミノ酸トランスポート、酸化ストレス、神経細胞興奮毒性および細胞周期調節をとりわけ含む、いくつかの細胞過程に関係付けられてきた。
若年型バッテン病は、不溶性封入体の発生をもたらす、リソソームにおける脂質およびタンパク質（セロイドリポフスチン）の異常な細胞内蓄積によって特徴付けられる。リソソーム封入体は、身体のあらゆる細胞型において形成されるが、ニューロンが最も感受性が高く、進行性の細胞死を起こす（GettyおよびPearce（２０１１年）Cell. Mol. Life Sci.６８巻：４５３〜４７４頁）。この神経細胞死は、中枢神経系（ＣＮＳ）が再生できないという事実によってより深刻なものとなる。現在、一様に致死的であり、１０代後半または２０代前半への平均余命減少を伴う若年型バッテン病に対する処置はない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Schultzら（２０１１年）Trends Neurosci.、３４巻：４０１〜４１０頁

【非特許文献2】GettyおよびPearce（２０１１年）Cell. Mol. Life Sci.６８巻：４５３〜４７４頁

【非特許文献3】Int. Batten Dis. Consortium（１９９５年）Cell、８２巻：９４９〜９５７頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

（要旨）
若年型バッテン病としても公知の若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）ならびに関連する障害および症状の処置のための組成物および方法が、本明細書に提供されている。ある特定の実施形態では、本組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなり、この構築物は次いで、ヒトＣＬＮ３をコードする核酸（ヒト遺伝子ＣＬＮ３（またはＣＬＮ３ ｃＤＮＡ））を発現するアデノ随伴ウイルス構築物、例えば、自己相補的または非自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃ−ＡＡＶ）構築物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなる。例示的であるが非限定的な一実施形態では、ＡＡＶ−９構築物またはｓｃＡＡＶ−９構築物が使用される。ＡＡＶ構築物は、様々な実施形態では、ＡＡＶ構築物内で使用できて、ヒトＣＬＮ３遺伝子もしくはＣＬＮ３ ｃＤＮＡまたはこれらそれぞれの均等物の発現を駆動することができる種々のプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーの組合せを含む。ＡＡＶ構築物内で使用することができるプロモーターの例として、β−アクチンプロモーター（例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター）、ＭｅＣＰ２プロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。ＡＡＶ−ｈＣＬＮ３構築物を使用して、脳および他の重大な組織または臓器における野生型ＣＬＮ３の発現を回復させることができ、これはひいては、ＪＮＣＬの処置および／またはＪＮＣＬに関連する症状の改善に役立ち得る。この遺伝子療法は、特に静脈内注射、頭蓋内注射、くも膜下腔内注射等を含む種々の経路により投与することができる。

【0006】

本明細書に企図されている様々な実施形態として、次のうち１種または複数を挙げることができるが、これらに限定される必要はない：

【0007】

一態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムまたはその派生体と、ＣＬＮ３、例えば、ヒトＣＬＮ３またはこれらそれぞれの均等物をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターとを含むベクターを提供する。

【0008】

別の態様では、本開示は、自己相補的ＡＡＶ９ゲノムまたはその派生体と、ＣＬＮ３をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターとを含むベクターであって、プロモーターが、低いＣＬＮ３発現を駆動するベクターを提供する。

【0009】

別の態様では、本開示は、哺乳動物における若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）の処置および／または予防のための方法であって、前記方法が、ＣＬＮ３を発現する構築物により哺乳動物の細胞を形質転換するステップを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなり、ＣＬＮ３が、ＪＮＣＬを処置および／または防止するための有効量で発現される方法を提供する。

【0010】

一部の実施形態では、ＣＬＮ３は、ヒトＣＬＮ３である。他の実施形態では、ＣＬＮ３は、非ヒトＣＬＮ３である。

【0011】

一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムは、天然由来の血清型または分離株もしくはクレードのＡＡＶに由来する。一部の実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の群から選択される。好ましい実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９である。他の実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ２である。

【0012】

一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ、例えば、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓ−ＡＡＶ）ベクターの派生体である。他の実施形態では、派生体ベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃ−ＡＡＶ）ベクターである。

【0013】

一部の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、Ｂ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、シナプシン、ＭｅＣＰ２（メチル−ＣＰＧ結合タンパク質２）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、β−アクチン９（例えば、ニワトリベータアクチン）またはＣＢｈ（ハイブリッドＣＢＡ、またはＣＢＡプロモーターを伴うＭＶＭイントロン）から選択される。

【0014】

一部の実施形態では、プロモーターは、ニューロン、アストロサイトもしくはオリゴデンドロサイト特異的またはニューロン、アストロサイトもしくはオリゴデンドロサイト優先的プロモーター、例えば、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、オリゴデンドロサイト転写因子１（Ｏｌｉｇ１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Ｃｓｐｇ４）、ＣＮＰ（２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ）またはＧＦＡＰプロモーターである。

【0015】

一部の実施形態では、ベクターは、ＳＶ４０またはＣＢＡ−ＭＶＭから選択される５’ＵＴＲ／イントロンをさらに含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなる。一部の実施形態では、ベクターは、最小ＳＶ４０イントロンをさらに含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなる。他の実施形態では、ベクターは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０後期ポリアデニル化配列、ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、ＡＡＴＡＡＡ（配列番号３）ポリアデニル化シグナル、ＣＡＡＴＡＡＡ（配列番号４）ポリアデニル化シグナル、ＡＴＴＡＡＡ（配列番号５）ポリアデニル化シグナルまたはＴＡＮＡ（配列番号６）ポリアデニル化シグナルから選択されるポリアデニル化シグナルをさらに含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなる。なお他の実施形態では、ベクターは、翻訳後調節エレメントをさらに含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなり、そのようなものの非限定例として、例えば、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、最小ガンマエレメントおよび部分的アルファ−ベータエレメントを含有するＷＰＲＥ２、最小ガンマおよびアルファエレメントを含有するＷＰＲＥ３、またはＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。

【0016】

一部の実施形態では、ベクターは、上述のエレメントのうち１種または複数を含み、ベクターは、自己相補的ゲノムを含むＡＡＶ９である。

【0017】

一部の実施形態では、ＣＬＮ３、例えば、ヒトＣＬＮ３またはその均等物をコードするポリヌクレオチドは、ＭｅＣＰ２プロモーターに作動可能に連結されている。

【0018】

一部の実施形態では、ベクターは、低いＣＬＮ３発現またはその均等物を駆動する。

【0019】

さらなる態様では、本明細書に記載されているベクターは、検出可能な標識である遺伝子またはポリペプチドをさらに含む。そのようなものの例は、図１に例証されている。

【0020】

一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているベクターの方法および使用であって、本明細書に記載されているベクターにより、哺乳動物の中枢神経系の細胞を形質転換するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されているベクターにより、非ＣＮＳ組織（複数可）内に含有される細胞を形質転換するステップを含む。

【0021】

一部の実施形態では、本方法は、一態様では、ヒトである哺乳動物において行われ、ＣＬＮ３は、ヒトＣＬＮ３またはその均等物である。

【0022】

一部の実施形態では、処置するべきヒトは、ＣＬＮ３変異に関してホモ接合型である。さらなる態様では、ＣＬＮ３変異は、ホモ接合型変異を有するヒトにおけるバッテン病の発症に関係する。

【0023】

一部の実施形態では、処置するべき哺乳動物は、ヒト新生児、ヒト乳児またはヒト青年である。他の実施形態では、処置するべき哺乳動物は、ヒト成人である。

【0024】

一部の実施形態では、処置するべきヒト患者等の哺乳動物は、ＪＮＣＬに関して無症候性である。他の実施形態では、処置するべき哺乳動物は、ＪＮＣＬに関して症候性である、例えば、この哺乳動物は、失明、発作、運動性喪失、認知機能低下またはこれらのいずれかの組合せを呈する。

【0025】

本明細書に開示されている方法は、斯かる処置および／または予防を必要とする哺乳動物に、本明細書に記載されている実施形態のいずれか一つの実施形態に記載のベクターおよび／またはｒＡＡＶおよび／またはベクターを含有する医薬製剤を有効量で投与するステップを含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなる。

【0026】

一部の実施形態では、投与は、脳内投与、くも膜下腔内投与、静脈内、経口、エアロゾル投与、吸入による投与（鼻腔内および気管内送達を含む）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および直腸投与のうち１種または複数から選択される経路による。

【0027】

一部の実施形態では、処置レジメンは、単回投与、例えば、単回全身性投与を含む。他の実施形態では、処置レジメンは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０回の投与を含む。投与毎のベクターの投薬は、処置している医師または専門家によって決定される通り、同じであっても異なっていてもよい。

【0028】

一部の実施形態では、各投与は、処置するべき哺乳動物の体重１ｋｇ当たり約１０^１０から最大約１０^１６ゲノムコピーのＣＬＮ３またはその均等物を含む。他の実施形態では、各投与は、対象当たり約１０^１０から最大約１０^１６ゲノムコピーのＣＬＮ３またはその均等物を含む。

【0029】

一態様では、本開示は、本明細書に記載されている実施形態のいずれか一実施形態に記載のベクターにより形質導入された宿主細胞を提供する。

【0030】

一態様では、本開示は、細胞に形質導入する方法であって、本明細書に記載されている実施形態のいずれか一実施形態に記載のＡＡＶベクターを含む組成物を宿主細胞に導入するステップを含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなる方法を提供する。

【0031】

別の態様では、本開示は、ヒトＣＬＮ３またはその均等物をコードする核酸構築物を含む組換えアデノ随伴ウイルスを提供する。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスは、本明細書に記載されている実施形態のいずれか一実施形態に記載のベクターを含む。

【0032】

別の態様では、本開示は、上述の実施形態のいずれか一実施形態に記載の組換えアデノ随伴ウイルスと、薬学的に許容される担体または希釈剤等の担体とを提供する。一部の実施形態では、製剤は、脳内投与、くも膜下腔内投与、静脈内、経口、エアロゾル投与、吸入による投与（鼻腔内および気管内送達を含む）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および直腸投与からなる群から選択される経路による投与のために製剤化される。他の実施形態では、製剤は、滅菌注射液である。

【0033】

別の態様では、本開示は、若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）の処置および／または予防のための、本明細書に記載されている実施形態のいずれか一実施形態に記載のベクターの使用を提供する。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される：
（項目１）
哺乳動物における若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）の処置および／または予防のための方法であって、前記方法が、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムまたはその派生体と、ＣＬＮ３またはその均等物をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターとを含む組換えベクターにより前記哺乳動物の細胞を形質転換するステップを含み、前記ＣＬＮ３が、有効量で発現される方法。
（項目２）
前記哺乳動物の中枢神経系の組織を構成する細胞を形質転換するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
非ＣＮＳ組織を構成する細胞を形質転換するステップを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記哺乳動物が、ヒトであり、前記ＣＬＮ３が、ヒトＣＬＮ３である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記ヒトが、ＣＬＮ３変異に関してホモ接合型である、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記哺乳動物が、ヒト新生児、ヒト乳児またはヒト青年期である、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記哺乳動物が、ヒト成人である、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記哺乳動物が、ＪＮＣＬに関して無症候性である、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記哺乳動物が、ＪＮＣＬに関して症候性である、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記哺乳動物が、失明を呈する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記哺乳動物が、発作を呈する、項目９〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記哺乳動物が、運動性喪失を呈する、項目９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記哺乳動物が、認知機能低下を呈する、項目９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記ＣＬＮ３が、ヒトＣＬＮ３である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ＣＬＮ３が、非ヒトＣＬＮ３である、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＡＡＶゲノムが、天然由来の血清型または分離株もしくはクレードのＡＡＶに由来する、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の群から選択される、項目１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ９である、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ２である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ベクターが、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓ−ＡＡＶ）ベクターである、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ベクターが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃ−ＡＡＶ）ベクターである、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、Ｂ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、シナプシン、ＭｅＣＰ２（メチル−ＣＰＧ結合タンパク質２）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、β−アクチン９（例えば、ニワトリベータアクチン）またはＣＢｈ（ハイブリッドＣＢＡ、またはＣＢＡプロモーターを伴うＭＶＭイントロン）から選択される、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記プロモーターが、ニューロン、アストロサイトもしくはオリゴデンドロサイト特異的またはニューロン、アストロサイトもしくはオリゴデンドロサイト優先的プロモーターである、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記プロモーターが、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、オリゴデンドロサイト転写因子１（Ｏｌｉｇ１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Ｃｓｐｇ４）、ＣＮＰ（２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ）またはＧＦＡＰプロモーターから選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ベクターが、ＳＶ４０またはＣＢＡ−ＭＶＭから選択される５’ＵＴＲ／イントロンをさらに含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ベクターが、最小ＳＶ４０イントロンをさらに含む、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ベクターが、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０後期ポリアデニル化配列、ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、ＡＡＴＡＡＡ（配列番号３）ポリアデニル化シグナル、ＣＡＡＴＡＡＡ（配列番号４）ポリアデニル化シグナル、ＡＴＴＡＡＡ（配列番号５）ポリアデニル化シグナルまたはＴＡＮＡ（配列番号６）ポリアデニル化シグナルから選択されるポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ベクターが、翻訳後調節エレメントをさらに含む、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記転写後調節エレメントが、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、最小ガンマエレメントおよび部分的アルファ−ベータエレメントを含有するＷＰＲＥ２、または最小ガンマおよびアルファエレメントを含有するＷＰＲＥ３の群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記転写後調節エレメントが、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記ベクターが、自己相補的ゲノムを含むＡＡＶ９である、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記ポリヌクレオチドＣＬＮ３が、ＭｅＣＰ２プロモーターに作動可能に連結されている、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ベクターが、低いＣＬＮ３発現またはその均等物を駆動する、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記投与が、脳内投与、くも膜下腔内投与、静脈内、経口、エアロゾル投与、吸入による投与（鼻腔内および気管内送達を含む）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および直腸投与からなる群から選択される経路による、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
処置レジメンが、単回投与を含む、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
処置レジメンが、単回全身性投与を含む、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
処置レジメンが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０回の投与を含む、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
各投与が、１ｋｇ当たり約１０^１０から最大約１０^１６ゲノムコピーを含む、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
各投与が、対象当たり約１０^１０から最大約１０^１６ゲノムコピーを含む、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムまたはその派生体と、ＣＬＮ３またはその均等物をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターとを含む組換えベクター。
（項目４１）
前記ＣＬＮ３が、ヒトＣＬＮ３である、項目４０に記載のベクター。
（項目４２）
前記ＣＬＮ３が、非ヒトＣＬＮ３である、項目４０に記載のベクター。
（項目４３）
前記ＡＡＶゲノムが、天然由来の血清型または分離株もしくはクレードのＡＡＶに由来する、項目４０〜４２のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４４）
前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の群から選択される、項目４３に記載のベクター。
（項目４５）
前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ９である、項目４０〜４４のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４６）
前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ２である、項目４０〜４４のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４７）
一本鎖ＡＡＶ（ｓｓ−ＡＡＶ）ベクターである、項目４０〜４４のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４８）
自己相補的ＡＡＶ（ｓｃ−ＡＡＶ）ベクターである、項目４０〜４４のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４９）
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、Ｂ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、シナプシン、ＭｅＣＰ２（メチル−ＣＰＧ結合タンパク質２）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、β−アクチン（例えば、ニワトリベータアクチン）またはＣＢｈ（ハイブリッドＣＢＡ、またはＣＢＡプロモーターを伴うＭＶＭイントロン）から選択される、項目４０〜４８のいずれか一項に記載のベクター。
（項目５０）
前記プロモーターが、ニューロン、アストロサイトもしくはオリゴデンドロサイト特異的またはニューロン、アストロサイトもしくはオリゴデンドロサイト優先的プロモーターである、項目４０〜４９のいずれか一項に記載のベクター。
（項目５１）
前記プロモーターが、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、オリゴデンドロサイト転写因子１（Ｏｌｉｇ１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Ｃｓｐｇ４）、ＣＮＰ（２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ）またはＧＦＡＰプロモーターから選択される、項目５０に記載のベクター。
（項目５２）
ＳＶ４０またはＣＢＡ−ＭＶＭから選択される５’ＵＴＲ／イントロンをさらに含む、項目４０〜５１のいずれか一項に記載のベクター。
（項目５３）
最小ＳＶ４０イントロンをさらに含む、項目５２に記載のベクター。
（項目５４）
ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０後期ポリアデニル化配列、ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、ＡＡＴＡＡＡ（配列番号３）ポリアデニル化シグナル、ＣＡＡＴＡＡＡ（配列番号４）ポリアデニル化シグナル、ＡＴＴＡＡＡ（配列番号５）ポリアデニル化シグナルまたはＴＡＮＡ（配列番号６）ポリアデニル化シグナルから選択されるポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目４０〜５３のいずれか一項に記載のベクター。
（項目５５）
翻訳後調節エレメントをさらに含む、項目４０〜５４のいずれか一項に記載のベクター。
（項目５６）
前記転写後調節エレメントが、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、最小ガンマエレメントおよび部分的アルファ−ベータエレメントを含有するＷＰＲＥ２、または最小ガンマおよびアルファエレメントを含有するＷＰＲＥ３の群から選択される、項目５５に記載のベクター。
（項目５７）
前記転写後調節エレメントが、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）である、項目５５に記載のベクター。
（項目５８）
自己相補的ゲノムを含むＡＡＶ９である、項目４０〜５７のいずれか一項に記載のベクター。
（項目５９）
前記ポリヌクレオチドＣＬＮ３が、ＭｅＣＰ２プロモーターに作動可能に連結されている、項目５８に記載のベクター。
（項目６０）
低いＣＬＮ３発現またはその均等物を駆動する、項目４０〜５９のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６１）
自己相補的ＡＡＶ９ゲノムまたはその派生体と、ＣＬＮ３をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターとを含むベクターであって、前記プロモーターが、低いＣＬＮ３発現を駆動するベクター。
（項目６２）
項目４０〜６１のいずれか一項に記載のベクターにより形質導入された宿主細胞。
（項目６３）
細胞に形質導入する方法であって、項目４０〜６１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物を宿主細胞に導入するステップを含む方法。
（項目６４）
ヒトＣＬＮ３をコードする核酸構築物を含む組換えアデノ随伴ウイルス。
（項目６５）
項目４０〜６１のいずれか一項に記載のベクターを含む、項目６４に記載のアデノ随伴ウイルス。
（項目６６）
項目６４〜６５のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬製剤。
（項目６７）
脳内投与、くも膜下腔内投与、静脈内、経口、エアロゾル投与、吸入による投与（鼻腔内および気管内送達を含む）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および直腸投与からなる群から選択される経路による投与のために製剤化されている、項目６６に記載の医薬製剤。
（項目６８）
滅菌注射液である、項目６７に記載の医薬製剤。
（項目６９）
項目４０〜６１のいずれか一項に記載のベクターおよび／または項目６４〜６５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶおよび／または項目６６〜６８のいずれか一項に記載の医薬製剤を前記哺乳動物に投与するステップを含む、項目１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）の処置および／または予防のための、項目４０〜６１のいずれか一項に記載のベクターの使用。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１は、例証的なＡＡＶ９ ｈＣＬＮ３構築物を描写する。各構築物は、同一の最小ＳＶ４０イントロン（「イントロン」と標識）、ヒトＣＬＮ３ ｃＤＮＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（「ＰＡ」）および自己相補的（ｓｃ）ウイルスをパッケージするためのウイルス末端逆位反復配列を含有する。第１の構築物は、高発現ニワトリβ−アクチンプロモーターを含有する一方、第２の構築物は、マウスＭｅＣＰ２遺伝子由来の最小必須プロモーターを含有する。対照構築物は、ヒトＣＬＮ３ ｃＤＮＡを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドに置き換える。

【0035】

【図2A】図２Ａ〜図２Ｆは、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を使用したＣＬＮ３補充（replacement）が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為を改善することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（８匹／群）に、２×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）のｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３または対照としてのＧＦＰ発現ウイルスの１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、１ヶ月（図２Ａ）、２ヶ月（図２Ｂ）、３ヶ月（図２Ｃ）、４ヶ月（図２Ｄ）および５ヶ月（図２Ｅ）目に、加速ロータロッドおよびポール降下（pole descent）検査を行った。＊、ｐ＜０．０５。図２Ｆは、図２Ａ〜図２Ｅに描写されているデータを要約し、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為改善を示す。

【図2B】図２Ａ〜図２Ｆは、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を使用したＣＬＮ３補充（replacement）が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為を改善することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（８匹／群）に、２×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）のｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３または対照としてのＧＦＰ発現ウイルスの１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、１ヶ月（図２Ａ）、２ヶ月（図２Ｂ）、３ヶ月（図２Ｃ）、４ヶ月（図２Ｄ）および５ヶ月（図２Ｅ）目に、加速ロータロッドおよびポール降下（pole descent）検査を行った。＊、ｐ＜０．０５。図２Ｆは、図２Ａ〜図２Ｅに描写されているデータを要約し、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為改善を示す。

【図2C】図２Ａ〜図２Ｆは、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を使用したＣＬＮ３補充（replacement）が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為を改善することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（８匹／群）に、２×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）のｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３または対照としてのＧＦＰ発現ウイルスの１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、１ヶ月（図２Ａ）、２ヶ月（図２Ｂ）、３ヶ月（図２Ｃ）、４ヶ月（図２Ｄ）および５ヶ月（図２Ｅ）目に、加速ロータロッドおよびポール降下（pole descent）検査を行った。＊、ｐ＜０．０５。図２Ｆは、図２Ａ〜図２Ｅに描写されているデータを要約し、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為改善を示す。

【図2D】図２Ａ〜図２Ｆは、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を使用したＣＬＮ３補充（replacement）が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為を改善することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（８匹／群）に、２×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）のｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３または対照としてのＧＦＰ発現ウイルスの１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、１ヶ月（図２Ａ）、２ヶ月（図２Ｂ）、３ヶ月（図２Ｃ）、４ヶ月（図２Ｄ）および５ヶ月（図２Ｅ）目に、加速ロータロッドおよびポール降下（pole descent）検査を行った。＊、ｐ＜０．０５。図２Ｆは、図２Ａ〜図２Ｅに描写されているデータを要約し、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為改善を示す。

【図2E】図２Ａ〜図２Ｆは、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を使用したＣＬＮ３補充（replacement）が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為を改善することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（８匹／群）に、２×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）のｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３または対照としてのＧＦＰ発現ウイルスの１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、１ヶ月（図２Ａ）、２ヶ月（図２Ｂ）、３ヶ月（図２Ｃ）、４ヶ月（図２Ｄ）および５ヶ月（図２Ｅ）目に、加速ロータロッドおよびポール降下（pole descent）検査を行った。＊、ｐ＜０．０５。図２Ｆは、図２Ａ〜図２Ｅに描写されているデータを要約し、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為改善を示す。

【図2F】図２Ａ〜図２Ｆは、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を使用したＣＬＮ３補充（replacement）が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為を改善することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（８匹／群）に、２×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）のｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３または対照としてのＧＦＰ発現ウイルスの１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、１ヶ月（図２Ａ）、２ヶ月（図２Ｂ）、３ヶ月（図２Ｃ）、４ヶ月（図２Ｄ）および５ヶ月（図２Ｅ）目に、加速ロータロッドおよびポール降下（pole descent）検査を行った。＊、ｐ＜０．０５。図２Ｆは、図２Ａ〜図２Ｅに描写されているデータを要約し、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為改善を示す。

【0036】

【図3】図３は、ｓｃＡＡＶ９形質導入後の脳における用量依存性ｈＣＬＮ３発現を例示する。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３またはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、５ヶ月後に、ｑＲＴ−ＰＣＲにより表示の脳領域（ＣＢ、小脳；ＴＨ、視床；ＨＰＣ、海馬；ＳＴＲ、線条体；およびＶＣ、視覚皮質）におけるｈＣＬＮ３ ｍＲＮＡ発現を定量化した。結果は、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３と比較した、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３を与えたマウスにおけるｈＣＬＮ３発現の倍数増加として表現する。

【0037】

【図4】図４は、ｓｃＡＡＶ９形質導入後の脳における用量依存性ＧＦＰ発現を例示する。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（３匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰの１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、５ヶ月後に、ローディング対照としてβ−アクチンを用いたウエスタンブロットにより、表示の脳領域（ＣＢ、小脳；ＴＨ、視床；ＨＰＣ、海馬；ＳＴＲ、線条体；ＶＣ、視覚皮質；Ｓ１ＢＦ、体性感覚野バレル皮質（somatosensory barrel field cortex））におけるＧＦＰ発現を定量化した。

【0038】

【図5】図５Ａ〜図５Ｂは、それぞれ形質導入５ヶ月および１３ヶ月後の、共焦点顕微鏡により可視化された、脳領域および網膜におけるｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰの体内分布を示す。

【0039】

【図6】図６Ａ〜図６Ｂは、ＧＦＰ^＋細胞の数によって描写される、投与５ヶ月後のＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの脳におけるｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰの比較体内分布を示す。

【0040】

【図7A】図７Ａ〜図７Ｇは、ＣＬＮ３補充が、リソソーム封入体を低下させることを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３またはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、５ヶ月後に、定量的共焦点顕微鏡により、体性感覚野バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）（図７Ａ）、線条体（ＳＴＲ）（図７Ｂ）、視覚皮質（ＶＣ）（図７Ｃ）、視床（ＴＨ）（図７Ｄ）、海馬（ＨＰ）（図７Ｅ）、小脳（ＣＢ）（図７Ｆ）におけるリソソーム封入体を定量化した。＊、ｐ＜０．０５。Ｓ１ＢＦ、ＶＣおよびＴＨにおける媒体およびＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の比較の概要を図７Ｇに示す。

【図7B】図７Ａ〜図７Ｇは、ＣＬＮ３補充が、リソソーム封入体を低下させることを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３またはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、５ヶ月後に、定量的共焦点顕微鏡により、体性感覚野バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）（図７Ａ）、線条体（ＳＴＲ）（図７Ｂ）、視覚皮質（ＶＣ）（図７Ｃ）、視床（ＴＨ）（図７Ｄ）、海馬（ＨＰ）（図７Ｅ）、小脳（ＣＢ）（図７Ｆ）におけるリソソーム封入体を定量化した。＊、ｐ＜０．０５。Ｓ１ＢＦ、ＶＣおよびＴＨにおける媒体およびＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の比較の概要を図７Ｇに示す。

【図7CD】図７Ａ〜図７Ｇは、ＣＬＮ３補充が、リソソーム封入体を低下させることを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３またはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、５ヶ月後に、定量的共焦点顕微鏡により、体性感覚野バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）（図７Ａ）、線条体（ＳＴＲ）（図７Ｂ）、視覚皮質（ＶＣ）（図７Ｃ）、視床（ＴＨ）（図７Ｄ）、海馬（ＨＰ）（図７Ｅ）、小脳（ＣＢ）（図７Ｆ）におけるリソソーム封入体を定量化した。＊、ｐ＜０．０５。Ｓ１ＢＦ、ＶＣおよびＴＨにおける媒体およびＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の比較の概要を図７Ｇに示す。

【図7EF】図７Ａ〜図７Ｇは、ＣＬＮ３補充が、リソソーム封入体を低下させることを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３またはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、５ヶ月後に、定量的共焦点顕微鏡により、体性感覚野バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）（図７Ａ）、線条体（ＳＴＲ）（図７Ｂ）、視覚皮質（ＶＣ）（図７Ｃ）、視床（ＴＨ）（図７Ｄ）、海馬（ＨＰ）（図７Ｅ）、小脳（ＣＢ）（図７Ｆ）におけるリソソーム封入体を定量化した。＊、ｐ＜０．０５。Ｓ１ＢＦ、ＶＣおよびＴＨにおける媒体およびＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の比較の概要を図７Ｇに示す。

【図7G】図７Ａ〜図７Ｇは、ＣＬＮ３補充が、リソソーム封入体を低下させることを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３またはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、５ヶ月後に、定量的共焦点顕微鏡により、体性感覚野バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）（図７Ａ）、線条体（ＳＴＲ）（図７Ｂ）、視覚皮質（ＶＣ）（図７Ｃ）、視床（ＴＨ）（図７Ｄ）、海馬（ＨＰ）（図７Ｅ）、小脳（ＣＢ）（図７Ｆ）におけるリソソーム封入体を定量化した。＊、ｐ＜０．０５。Ｓ１ＢＦ、ＶＣおよびＴＨにおける媒体およびＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の比較の概要を図７Ｇに示す。

【0041】

【図8A】図８Ａ〜図８Ｃは、脳組織の形質導入におけるｓｃＡＡＶ９の全身性投与の効果を示す。図８Ａは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるニューロンに形質導入することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰ、ｉ．ｖ．の１回の注射を与え、その上で、５ヶ月後に脳組織を収集し、共焦点顕微鏡で表示の脳領域におけるＮｅｕＮ、ＧＦＰおよび核（ＤＡＰＩ）を染色した。挿入図は、より大きい拡大率で表示される領域を描写する。図８Ｂは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるアストロサイトに形質導入することを示す。図８Ｃは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるマイクログリアに形質導入しないことを示す。

【図8B】図８Ａ〜図８Ｃは、脳組織の形質導入におけるｓｃＡＡＶ９の全身性投与の効果を示す。図８Ａは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるニューロンに形質導入することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰ、ｉ．ｖ．の１回の注射を与え、その上で、５ヶ月後に脳組織を収集し、共焦点顕微鏡で表示の脳領域におけるＮｅｕＮ、ＧＦＰおよび核（ＤＡＰＩ）を染色した。挿入図は、より大きい拡大率で表示される領域を描写する。図８Ｂは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるアストロサイトに形質導入することを示す。図８Ｃは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるマイクログリアに形質導入しないことを示す。

【図8C】図８Ａ〜図８Ｃは、脳組織の形質導入におけるｓｃＡＡＶ９の全身性投与の効果を示す。図８Ａは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるニューロンに形質導入することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰ、ｉ．ｖ．の１回の注射を与え、その上で、５ヶ月後に脳組織を収集し、共焦点顕微鏡で表示の脳領域におけるＮｅｕＮ、ＧＦＰおよび核（ＤＡＰＩ）を染色した。挿入図は、より大きい拡大率で表示される領域を描写する。図８Ｂは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるアストロサイトに形質導入することを示す。図８Ｃは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるマイクログリアに形質導入しないことを示す。

【0042】

【図9】図９は、ヒト若年型バッテン病の特徴であり、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳にも観察されるＧＦＡＰ^＋反応性アストロサイトが、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の全身性投与後のマウスにおいて有意に低下されることを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（４匹／群）に、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、５ヶ月後に、定量的共焦点顕微鏡により、体性感覚野バレル皮質における反応性アストロサイト（ＧＦＡＰ^＋）を定量化した。＊＊＊、ｐ＜０．００１。

【0043】

【図10】図１０は、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を使用したＣＬＮ３補充が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動行為を改善することを示す。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（８匹／群）に、２×１０^１２ｖｇのｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３または対照としてのＧＦＰ発現ウイルスの１回のｉ．ｖ．注射を与え、その上で、形質導入１１ヶ月後に粘着テープ除去検査を行ったところ、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおいて、タッチするまでの時間の低下（左パネル）および除去するまでの時間の低下（右パネル）を示した。

【0044】

【図11】図１１は、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰ、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰの、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスへの全身性（system）ＡＡＶ９導入遺伝子送達の効果を例示する。結果は、毎週決定される体重のグラム数として表現する。

【0045】

【図12-1】図１２は、感染１ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【図12-2】図１２は、感染１ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【図12-3】図１２は、感染１ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【図12-4】図１２は、感染１ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【図12-5】図１２は、感染１ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【0046】

【図13-1】図１３は、感染１０ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【図13-2】図１３は、感染１０ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【図13-3】図１３は、感染１０ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【図13-4】図１３は、感染１０ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【図13-5】図１３は、感染１０ヶ月後の、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの正常血清化学プロファイルを実証する。

【0047】

【図14A-C】図１４Ａ〜図１４Ｆは、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスが、全身性炎症性変化の証拠を示さないことを実証する。

【図14D-F】図１４Ａ〜図１４Ｆは、ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３、ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰを投与したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスが、全身性炎症性変化の証拠を示さないことを実証する。

【発明を実施するための形態】

【0048】

（詳細な説明）
記載されている特定の実施形態は当然ながら変動し得るため、本発明が、記載されている特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に使用されている用語法が、単に特定の実施形態を記載することを目的としており、限定することを目的としないことも理解されたい。

【0049】

本発明の詳細な説明は、単に読者に便宜を図るために様々なセクションに分割されており、いずれかのセクションに見出される開示は、別のセクションにおける開示と組み合わせることができる。他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様または均等ないかなる方法および材料を使用してもよいが、好まれる方法および材料をここに記載する。本明細書に言及されているあらゆる刊行物は、刊行物が引用されているものに関連して方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれている。

【0050】

あらゆる数値指定、例えば、範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、必要に応じて増分０．１または１．０で（＋）または（−）に変動する近似である。必ずしも明確に記述されているとは限らないが、あらゆる数値指定には、用語「約」が先行していることを理解されたい。必ずしも明確に記述されているとは限らないが、本明細書に記載されている試薬が、単に例証的なものであり、そのようなものの均等物が本技術分野で公知であることも理解されたい。

【0051】

本明細書において使用される場合、また、添付の特許請求の範囲において、文脈が明らかにそれ以外を指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」が、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「１個の細胞（a cell）」の参照は、複数の細胞を含む。

【0052】

Ｉ．定義
本明細書において使用される場合、次の用語は、次の意義を有する。
用語「約」は、数値指定、例えば、範囲を含む温度、時間、量、濃度およびその他の前に使用される場合、（＋）または（−）１０％、５％または１％変動し得る近似を示す。

【0053】

「を含んでいる（comprising）」または「を含む（comprises）」は、組成物、例えば、培地および方法が、列挙されている要素を含む（include）が、それ以外を除外しないことを意味することを目的とする。「から本質的になる」は、組成物および方法の定義に使用される場合、記述されている目的のために、組合せにとって少しでも本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものである。よって、本明細書に定義されている要素から本質的になる組成物は、請求されている発明の基本および新規の特徴（複数可）に大幅な影響を与えない他の材料またはステップを除外しないであろう。「からなる」は、他の成分および実質的な方法ステップの微量な要素を超えるものを除外することを意味するものである。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。

【0054】

本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞への遺伝子材料の伝達に使用されるポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたはウイルスを指す。ベクターは、例えば、ウイルス、プラスミド、コスミドまたはファージであることができる。本明細書において使用されるベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかで構成され得る。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡで構成される。「発現ベクター」は、適切な環境中に存在する場合、ベクターによって運搬される１種または複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである。ベクターは、好ましくは、自律的に複製することができる。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、遺伝子は、プロモーター「に作動可能に連結された」と言われる。

【0055】

本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、調節エレメントおよび遺伝子またはそのコード領域の間の接続を記載するために使用されている。典型的には、遺伝子発現は、１種または複数の調節エレメント、例えば、限定することなく、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーの制御下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、調節エレメント「に作動可能に連結された」または「に操作可能に連結された」または「と作動可能に会合された」と言われ、これは、遺伝子またはコード領域が、調節エレメントによって制御または影響されていることを意味する。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現をもたらす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。

【0056】

用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、互換的に使用されている。一部の実施形態では、核酸は、共有結合により一体に連結された少なくとも２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本発明の核酸は、一本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、三本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を含む。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖もしくは二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）または一本鎖もしくは二本鎖のリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、核酸は、核酸アナログを含む。一部の実施形態では、核酸アナログは、非限定例により、ホスホラミド、ホスホロチオエート、ジチオリン酸またはＯ−メチルホスホラミダイト（methylphophoroamidite）結合等、ホスホジエステル結合以外のおよび／またはそれに加えた結合を含む骨格を有する。一部の実施形態では、核酸アナログは、正の（positive）骨格；非イオン性骨格および非リボース骨格から選択される骨格を備える核酸アナログから選択される。一部の実施形態では、核酸は、１個または複数の炭素環式糖を含有する。一部の実施形態では、核酸は、そのリボース−リン酸骨格の修飾を含む。一部の実施形態では、そのような修飾は、標識等、追加的な部分の付加を容易にするために行われる。一部の実施形態では、そのような修飾は、生理学的環境における斯かる分子の安定性および半減期を増加させるために行われる。

【0057】

用語「調節エレメント」および「発現制御エレメント」は、互換的に使用されており、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に影響を与えることができる核酸分子を指す。これらの用語は、広く使用されており、転写を促進または調節するあらゆるエレメントを網羅し、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメント、上流エレメント、エンハンサーおよび応答エレメントを含む（例えば、Lewin「Genes V」（Oxford University Press、Oxford）８４７〜８７３頁を参照）。原核生物における例示的であるが非限定的な調節エレメントは、宿主細胞におけるコード配列の発現および／またはコードされたポリペプチドの産生をもたらし、そして／または調節するプロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位、プロモーター等の転写および翻訳制御配列、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、配列内リボソーム進入エレメント（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列等を含む。

【0058】

本明細書において使用される場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、遺伝子の５’非コード領域中に、遺伝子の転写開始部位に対して近位に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは多くの場合、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。プロモーターの例として、細菌、酵母、植物、ウイルスおよび哺乳動物（ヒトを含む）由来のプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。プロモーターは、誘導性、抑圧可能および／または構成的であってよい。誘導性プロモーターは、その制御下において、温度変化等、培養条件におけるある変化に応答して、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を惹起する。

【0059】

本明細書において使用される場合、用語「エンハンサー」は、転写の効率を増加させることができる調節エレメントの種類を指す。ある特定の実施形態では、エンハンサーは、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または配向性に関係なく、転写を増加させるように作用する。

【0060】

本明細書において使用される場合、用語「トランスフェクション」は、「形質導入」と同義であり、宿主細胞への外来性核酸等の核酸の導入を指す。ある特定の実施形態では、この導入は、導入しようとする核酸（例えば、発現カセット）を含む組換えＡＡＶウイルスまたはベクターと細胞との接触によって為される。ＡＡＶゲノムは、ヒトおよび他の霊長類に感染するアデノ随伴ウイルスに全体的にまたは部分的に由来するゲノムである。ＡＡＶゲノムは、ポジティブまたはネガティブ・センスのいずれかの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で構成される。ゲノムは、ＤＮＡの両端における末端逆位反復配列（ＩＴＲ）および２個のオープンリーディングフレームを含む。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）は、野生型ＡＡＶから作製されたウイルスベクターである。自己相補的ＡＡＶは、ＡＡＶ派生体の例であり、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計された、ＡＡＶに由来する遺伝子操作されたウイルスベクターである。

【0061】

本明細書において使用される場合、用語「導入遺伝子」は、標的細胞にトランスフェクトされる、任意のヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を指す。導入遺伝子を含む構築物は、安定的エピソームとして存在することができるか、または標的細胞の１本もしくは複数の染色体に組み込むことができる。一部の実施形態では、導入遺伝子は、目的のタンパク質（例えば、ＣＬＮ３）をコードするポリヌクレオチドを含む。所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは一般に、プロモーター、エンハンサー、転写調節配列等、目的の遺伝子の所望の発現を得るために有用な他の配列に操作可能に連結されている。

【0062】

本明細書において使用される場合、セロイド−リポフスチン沈着症、ニューロナル３遺伝子（または「ＣＬＮ３遺伝子」）は、リソソーム機能に関与するタンパク質をコードする核酸を意図する。この遺伝子における変異は、神経変性疾患を引き起こす。ヒトタンパク質をコードする核酸およびヒトタンパク質は、本技術分野で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０４２４３２（最終アクセス２０１５年１２月１５日）に提供されており、非ヒトＣＬＮ３遺伝子の例は、ウェブサイトgenenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report?hgnc_id=HGNC:2074、最終アクセス２０１５年１２月１５日で入手できるラットおよびマウスホモログである。

【0063】

本明細書において使用される用語「処置、処置する、処置している等」としては、疾患もしくは状態（例えば、若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬまたは若年型バッテン病））の症状の軽減、ならびに／または疾患もしくは状態の進行、重症度および／もしくは範囲の低下、抑制、阻害、和らげる、緩和もしくは影響が挙げられるがこれらに限定されない。「処置」は、治療的処置および予防的または防止的方策の一方または両方を指す。処置を必要とする対象は、疾患または障害または望まれない生理学的状態に既に罹患した対象と共に、疾患または障害または望まれない生理学的状態が防止されるべき対象を含む。

【0064】

用語「有効量」は、本明細書において使用される場合、疾患もしくは状態を処置もしくは緩和することができるか、または他の仕方で意図される治療効果を生じることができる量を指す。ある特定の実施形態では、有効量は、ＪＮＣＬの１種または複数の症状の発病の低下、防止または遅延に十分な量である。斯かる症状として、視覚障害または失明、発作、パーソナリティおよび／または行動変化、学習の遅さ（slow learning）、不器用、口ごもり（stumbling）、精神的機能障害ならびに運動技能の喪失を挙げることができるがこれらに限定されない。

【0065】

用語「患者」、「対象」または「哺乳動物対象」は、本明細書において、互換的に使用されており、本明細書に記載されている処置または予防的方法（例えば、ＪＮＣＬの処置または予防のための方法）を必要とするいずれかの哺乳動物を含む。斯かる哺乳動物は、特にヒト（例えば、胎児期ヒト、ヒト乳児、ヒト十代、ヒト成人等）を含む。斯かる処置または予防を必要とする他の哺乳動物は、イヌ、ネコまたは他の飼い慣らされた動物、ウマ、家畜、実験動物（例えば、ウサギ類、非ヒト霊長類等）等、非ヒト哺乳動物を含むことができる。対象は、雄であっても雌であってもよい。ある特定の実施形態では、対象は、ＪＮＣＬのリスクがあるが、無症候性である（例えば、臨床徴候が明らかになる前にＪＮＣＬの遺伝子診断がある小児（これは滅多に起きない）、または臨床症状が発症する前の年齢（すなわち、出生から４〜５歳前後）のＪＮＣＬの遺伝子診断がある小児、例えば、ＪＮＣＬの確認された診断がある兄または姉によって遺伝子検査が為される場合）。ある特定の実施形態では、対象は、ＪＮＣＬの症状を発現する。

【0066】

用語、対象にベクターを「投与すること」または対象へのベクターの「投与」は、その意図される機能を行わせるために、ベクターを対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与は、経口、鼻腔内、非経口的（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）、頭蓋内または局所的を含む任意の適した経路によって行うことができる。投与は、自己投与および他者による投与を含む。

【0067】

用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用されており、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログのいずれかの、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を行うことができる。次に、ポリヌクレオチドの非限定例を挙げる：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等、修飾されたヌクレオチドを含むことができる。存在するのであれば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分で中断することができる。ポリヌクレオチドは、標識構成成分とのコンジュゲーションによるもののように、重合後にさらに修飾することができる。この用語は、二本および一本鎖分子の両方も指す。他に指定または要求がなければ、ポリヌクレオチドである、本発明のいずれかの実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知のまたは予測される２本の相補的一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。

【0068】

ポリヌクレオチドは、４種のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡの場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特異的な配列で構成される。よって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理ユニットを有するコンピュータ内のデータベースに入力し、機能ゲノミクスおよび相同性検索等、バイオインフォマティクス適用に使用することができる。

【0069】

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２個のペプチドの間または２個の核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、比較目的のために整列され得る各配列におけるポジションを比較することにより決定することができる。比較されている配列中のポジションが、同じ塩基またはアミノ酸によって占められている場合、これらの分子は、該ポジションにおいて相同である。配列間の相同性の程度は、これらの配列によって共有されるマッチするか、または相同なポジションの数の関数である。「無関係」または「非相同」な配列は、本発明の配列のうち１種と４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共有する。

【0070】

ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対しある特定のパーセンテージ（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有するとは、整列された場合、該パーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が、２配列の比較において同じであることを意味する。この整列およびパーセント相同性または配列同一性は、本技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubelら編（２００７年）Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。好ましくは、整列のためにデフォルトパラメータが使用される。整列プログラムの一例は、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、次のデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；選別＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥによる；データベース＝非重複性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムに関する詳細は、次のインターネットアドレスに見出すことができる：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。

【0071】

均等または生物学的に均等な核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはペプチドは、参照核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはペプチドに対して、少なくとも７０％配列同一性、あるいは少なくとも８０％配列同一性、あるいは少なくとも８５％配列同一性、あるいは少なくとも９０％配列同一性、あるいは少なくとも９２％配列同一性、あるいは少なくとも９５％配列同一性、あるいは少なくとも９７％配列同一性、あるいは少なくとも９８％配列同一性を有するものである。代替的な均等なポリペプチドは、高ストリンジェンシーの条件下で、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドである。代替的な均等なポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシーの条件下で、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。

【0072】

「ハイブリダイゼーション」は、１本または複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン（Hoogstein）結合により、または他の何らかの配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、複数本（multi）の鎖の複合体を形成する３本またはそれ超の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断等、より広範なプロセスにおけるステップを構成することができる。

【0073】

ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。一般に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、約４０℃、１０×ＳＳＣまたは均等なイオン強度／温度の溶液中で行われる。中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、典型的には、約５０℃、６×ＳＳＣで行われ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、一般に、約６０℃、１×ＳＳＣで行われる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の追加的な例として、次のものが挙げられる：低ストリンジェンシーのインキュベーション温度、約２５℃〜約３７℃；ハイブリダイゼーションバッファー濃度、約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約０％〜約２５％；および洗浄溶液、約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣ。中等度ハイブリダイゼーション条件の例として、次のものが挙げられる：インキュベーション温度、約４０℃〜約５０℃；バッファー濃度、約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約３０％〜約５０％；および洗浄溶液、約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣ。高ストリンジェンシー条件の例として、次のものが挙げられる：インキュベーション温度、約５５℃〜約６８℃；バッファー濃度、約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約５５％〜約７５％；および洗浄溶液、約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分間〜２４時間であり、１、２回またはそれ超の洗浄ステップであり、洗浄インキュベーション時間は、約１、２または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸塩のバッファーである。他の緩衝系を使用したＳＳＣの均等物を用いてよいことが理解される。ハイブリダイゼーション反応は、当業者に周知の「生理学的条件」下で行うこともできる。生理学的条件の非限定例は、細胞内で通常に見出される温度、イオン強度、ｐＨおよびＭｇ^２＋濃度である。

【0074】

本明細書において使用される場合、用語「低発現」は、ネイティブプロモーターよりも高く遺伝子発現を駆動することが本技術分野で公知であるβ−アクチンまたはＣＭＶプロモーター等、「高発現」プロモーターを使用して発現されるもの未満を意図する。低発現プロモーターの非限定的例は、ＭｅＣＰ２プロモーターである。

【0075】

本開示を実施するためのモード
若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）または若年型バッテン病は、ＣＬＮ３における常染色体劣性変異によって引き起こされるリソソーム蓄積障害である。ＪＮＣＬは、５〜１０歳の間に、進行性視力喪失、発作、認知および運動機能減退を呈し、１０代後半〜２０代前半までに死亡する。ＪＮＣＬに治癒はなく、このことは、この致命的な疾患を患う小児の寿命およびクオリティ・オブ・ライフを改善するための新規治療法を識別することの意義を強調する。

【0076】

ＪＮＣＬの現在の治療アプローチは、病的続発症を標的とする。しかし、持続性の保護を提供するために、代替的な戦略が必要とされている。斯かるアプローチの１種は、遺伝子療法である。遺伝子療法は、一部には、隣接する形質導入されていない細胞の相互是正（cross-correction）により、可溶性酵素における変異が関与する一部の形態のバッテン病の是正においては見込みを示した。しかし、ＣＬＮ３は、膜貫通タンパク質であるため、遺伝子療法アプローチは、ＪＮＣＬに対して実用性が低いと考えられてきた。このような事実にもかかわらず、近年の証拠は、ＪＮＣＬのための遺伝子療法が実行可能となり得ることを示唆し、それによると、ヒトＣＬＮ３を持つアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの頭蓋内送達は、リソソーム封入体を低下させることができたが、行動的欠損に変化は報告されなかった。

【0077】

本明細書の実施例に例示されている通り、ＡＡＶ９／ｈＣＬＮ３構築物は、それぞれｈＣＬＮ３の高い発現対低い発現を駆動するために、β−アクチンまたはＭｅＣＰ２プロモーターを使用して遺伝子操作された。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスに、２×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３またはＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を静脈内注射し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を駆動するウイルス（ＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰおよびＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰ）を対照とした。

【0078】

重要なことに、海馬（ＨＰＣ）、線条体（ＳＴＲ）、視床（ＴＨ）、視覚皮質（ＶＣ）および小脳（ＣＢ）を含む、ＪＮＣＬにおいてニューロンが死ぬように運命付けられたいくつかの脳領域においてｈＣＬＮ３のプロモーター遺伝子投与量（dosage）効果が確認され、ＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３と比べ、高発現ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおいて、ｈＣＬＮ３発現が３〜８倍上昇していた。ＡＡＶ９／ＧＦＰ構築物を与えた動物では、ウイルスが、ＮｅｕＮ^＋ニューロンに主に形質導入し、少量のＧＦＡＰ^＋アストロサイトも観察された一方、マイクログリアにおいてＧＦＰ発現が検出されなかったことが明らかになった。体性感覚野バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）、ＶＣ、ＳＴＲ、ＴＨ、ＨＰＣ、ＳＣＮおよびＣＢにおけるＧＦＰ発現によって明らかな通り、脳におけるウイルス形質導入の程度は広汎であった。

【0079】

重要なことに、低いｈＣＬＮ３発現を駆動するＡＡＶ９構築物（ＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３）のみが、ＷＴ動物に典型的な成績レベルまで、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの運動欠損を回復させることができ（加速ロータロッドおよびポールよじ登り）、脳における高いＣＬＮ３発現が、運動協調性の改善に有利ではなかったことを実証する。ＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えた動物のＳ１ＢＦ、ＶＣおよびＴＨにおいて有意に低下したリソソーム蓄積物質についても、同様の利益が観察された。ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの運動行為におけるＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の有益な効果は、ＧＦＰ対照構築物により観察されず、これから、ｈＣＬＮ３の作用の特異性が確認される。これらの観察に基づき、理論に制約されることなく、ＡＡＶ／ｈＣＬＮ３（例えば、ＡＡＶ９／ｈＣＬＮ３）媒介性遺伝子療法は、十分な数のＣＮＳ細胞を標的として、ＪＮＣＬ転帰を有意に改善するであろうと考えられる。これに関して、ＣＬＮ３変異のヘテロ接合性キャリア（すなわち、１／２遺伝子投与量）は、疾患または病理のいかなる証拠もないことが認められ、このような「低下したレベルのＣＬＮ３発現」が、健康な細胞の産生に十分であることを示す。本明細書に記載されているｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰウイルスを使用して、ＣＮＳにおける形質導入細胞の頻度を識別した。中程度の頻度にもかかわらず、ウイルス構築物により形質導入された細胞の識別に使用された方法（すなわち、ＧＦＰ抗体による免疫蛍光染色）は、感度が限られており、形質導入された脳内細胞数が過小評価された可能性があることを示唆する。それにもかかわらず、本明細書に記載されている疾患リードアウトにおける劇的な改善は、本明細書に記載されているＡＡＶ遺伝子療法アプローチ（複数可）が有効であることを示す。

【0080】

したがって、様々な実施形態では、ｈＣＬＮ３を発現するｒＡＡＶであるＡＡＶ／ｈＣＬＮ３構築物、ならびにＡＡＶ／ｈＣＬＮ３構築物を利用した処置および／または予防方法が提供される。

【0081】

ＡＡＶベクターおよび組成物
ある特定の実施形態では、ＣＬＮ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その多くが本技術分野で公知かつ利用できるウイルスベクターによって、中枢神経系（ＣＮＳ）の１種または複数の組織内のまたはこれを構成する細胞へと送達される。その上、様々な実施形態では、ＣＬＮ３は、全身の組織にも送達され、若年型バッテン病の小児は全身性疾患症状（すなわち、心臓の欠損）も有することから、このような送達が重要である。これに関して、ＣＬＮ３が、身体のあらゆる細胞型において遍在性に発現されることが認められる。ウイルスベクター（複数可）は、望ましくは無毒、非免疫原性であり、産生が容易であり、ＤＮＡの保護および標的細胞への送達において効率的である。例示的であるるが非限定的な一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターまたはその派生体であり、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルスベクターまたはその派生体を含む治療組成物は、適したプロモーターの制御下にある。

【0082】

ＡＡＶの３０種を超える天然に存在する血清型を利用することができ、本明細書に記載されている構築物および方法において有用である。ＡＡＶカプシドにおける多くの天然バリアントが存在し、神経細胞および他の細胞型に特に適する特性を備えるＡＡＶの識別および使用を可能にする。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学技法によって遺伝子操作することができ、所望の核酸配列の細胞特異的送達、免疫原性の最小化、安定性および粒子寿命の調整、効率的分解、核への正確な送達等に関するこのような粒子の最適化を可能にする。

【0083】

ＡＡＶの使用は、相対的に無毒であり、効率的な遺伝子移入をもたらし、特異的な目的に容易に最適化することができるため、ＤＮＡの外来性送達の共通モードである。ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、十分に特徴付けられたＡＡＶの血清型のうち、ヒト血清型２が、遺伝子移入ベクターとして開発された最初のＡＡＶである。この血清型は、異なる標的組織および動物モデルにおける効率的な遺伝子移入実験に広く使用されてきた。本開示のベクターおよび方法において有用な他のＡＡＶ血清型として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３、ＣＳＰ３等（例えば、様々なＡＡＶ血清型の考察に関して、ＷＯ２００５／０３３３２１および米国特許第７，１９８，９５１号を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、血清型は、所望の送達機序を最適化するために選択される。例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９は、優れたベクター伝播および高効率の形質導入をもたらす。ＡＡＶ１およびＡＡＶ９は、ほぼ排他的にニューロン指向性をもたらす一方、ＡＡＶ５は、ニューロンおよびグリアの混合型をもたらし、ＡＡＶ４は、大部分はアストロサイトを標的とする（例えば、Davidsonら（２０００年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９７巻：３４２８〜３４３２頁；Burgerら（２００４年）Mol. Ther.１０巻：３０２〜３１７頁；CearleyおよびWolfe（２００６年）Mol. Ther.１３巻：５２８〜５３７頁を参照）。ＡＡＶ１およびＡＡＶ６は、末梢注射後に優れた逆行性軸索輸送能力を有する（Hollisら（２００８年）Mol. Ther.１６巻：２９６〜３０１頁）一方、ＡＡＶ９は、脳内で効率的な軸索輸送を起こす（CearleyおよびWolfe（２００６年）上記参照）。ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は、くも膜下腔内投与後に脊髄および後根神経節への効率的な送達を実証し、特異的な血清型に依存して異なるサブセットの細胞を標的とする（Storekら（２００８年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１０５巻：１０５５〜１０６０頁；Towneら（２００９年）Mol. Pain、５巻：５２頁；Snyderら（２０１１年）Hum. Gene Ther.、２２巻：１１２９〜１１３５頁）。ＡＡＶ４の脳内脳室（ventricular）注射は、上衣細胞に効率的に形質導入する（Liuら（２００５年）Gene Ther.１２巻：１５０３〜１５０８頁）。本明細書に実証される通り、ＡＡＶ９は、静脈内投与後に血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して、脳内のニューロンおよびグリアに形質導入することができる。ある特定の実施形態では、ｒｈ．１０血清型は明確に除外される。よって、異なるＡＡＶ血清型の投薬量を同時発生的におよび／または逐次的に患者に投与して標的化送達をもたらし、疾患の症状および進行に基づき治療法を個別化することができることは、本開示の範囲内である。

【0084】

ベクターへのアセンブリのために望ましいＡＡＶ断片は、ｖｐｌ（例えば、配列番号１２および１３）、ｖｐ２（例えば、配列番号１４および１５）、ｖｐ３（例えば、配列番号１６および１７）および高度可変領域を含む、本技術分野で公知のｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８（例えば、配列番号１８）、ｒｅｐ６８（例えば、配列番号１９）、ｒｅｐ５２（例えば、配列番号２０）およびｒｅｐ４０（例えば、配列番号２１）を含むｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質およびその均等物をコードする配列を含む。これらの断片は、種々のベクター系および宿主細胞において容易に利用することができる。斯かる断片は、単独で、他のＡＡＶ血清型配列もしくは断片と組み合わせて、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用することができる。本明細書において使用される場合、人工ＡＡＶ血清型は、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するＡＡＶを限定することなく含む。斯かる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐｌカプシドタンパク質の断片）を、異なる選択されたＡＡＶ血清型、同じＡＡＶ血清型の非連続部分、非ＡＡＶウイルス供給源由来または非ウイルス供給源由来から得ることができる異種配列と組み合わせて使用し、いずれかの適した技法によって生成することができる。人工ＡＡＶ血清型は、限定することなく、シュードタイプ化ＡＡＶ、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシドまたは「ヒト化」ＡＡＶカプシドであることができる。あるＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられたシュードタイプ化ベクターも有用である（例えば、Asokan A.（２０１０年）Discov. Med.９巻（４８号）：３９９〜４０３頁を参照）。

【0085】

例示的であるが非限定的な一実施形態では、本明細書に記載されている組成物および方法において有用なベクターは、最低でも、選択されたＡＡＶ血清型カプシド、例えば、ＡＡＶ９カプシド（例えば、配列番号１３）またはその断片もしくは均等物をコードする配列を含有する。別の実施形態では、有用なベクターは、最低でも、選択されたＡＡＶ血清型ｒｅｐタンパク質、例えば、ＡＡＶ９ ｒｅｐタンパク質またはその断片をコードする配列を含有する。任意選択で、斯かるベクターは、ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐタンパク質の両方を含有することができる。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐの両方を加えたベクターにおいて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ配列は両者共に、１種の血清型起源、例えば、全てＡＡＶ９起源とすることができる（例えば、Balakrishnanら（２０１４年）Curr. Gene. Therap.１４巻：１〜１５頁；米国特許第８，９６２，３３０号；米国特許第７，１９８，９５１号を参照）。

【0086】

あるいは、ｃａｐ配列を提供しているＡＡＶ血清型とは異なるＡＡＶ血清型にｒｅｐ配列が由来するベクターを使用することができる。一実施形態では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、別々の供給源（例えば、別々のベクター、または宿主細胞およびベクター）から発現される。別の実施形態では、これらのｒｅｐ配列は、異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合されて、米国特許第７，２８２，１９９号に記載されているＡＡＶ２／８等、キメラＡＡＶベクターを形成する。一部の実施形態では、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶ３ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶ４ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶ５ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶ６ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶ６．２ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶ９ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．１０ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．３９ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．４３およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．４３ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９およびＣＳＰ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。一部の実施形態では、ＡＡＶＣＳＰ３ ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９およびｒｈ．４３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列にインフレームで融合される。

【0087】

典型的には、ベクターは、最低でも、導入遺伝子およびその必要な調節配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）で構成される。ＩＴＲの非限定例として、配列番号２のヌクレオチド６６２〜７６７およびヌクレオチド３２７８〜３４１８、ならびにこれらそれぞれの均等物が挙げられる。組換えＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質にパッケージされ、選択された標的細胞へと送達される。よって、一態様では、カプシドおよび／または標的細胞内に含有されるベクターは、本開示の態様である。本明細書に企図される通り、導入遺伝子は、ＣＬＮ３遺伝子産物（例えば、ＣＬＮ３ポリペプチド（例えば、International Batten Disease Consortium（１９９５年）Cell、８２巻：９４９〜９５７頁、ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０５３３７（配列番号１）、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２のヌクレオチド１６８３〜２９９９およびこれらそれぞれの均等物を参照））をコードする導入遺伝子である。ＣＬＮ３遺伝子産物の核酸コード配列（例えば、配列番号１１）およびその均等物は、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳および発現を可能にする様式で、調節構成成分に操作可能に連結される。

【0088】

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’および３’末端逆位反復配列を含む（例えば、Carter（１９９０年）In Handbook of Parvoviruses、P. Tijsser編、CRC Press、１５５〜１６８頁を参照）。ＩＴＲ配列は、典型的には、約１４５ｂｐの長さである。ある特定の実施形態では、ベクターにおいて、ＩＴＲをコードする実質的に配列全体が使用されるが、これらの配列のある程度の修飾が許容できる。このようなＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者の技能範囲内である（例えば、Sambrookら（１９８９年）Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、New York；およびFisherら（１９９６年）J. Virol.、７０巻：５２０〜５３２頁等を参照）。斯かる分子の一例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドであり、このプラスミドでは、選択された導入遺伝子配列および関連する調節エレメントが、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に挟まれている。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在識別されている哺乳動物ＡＡＶ型を含むいずれかの公知のＡＡＶから得ることができる。＊＊＊

【0089】

組換えＡＡＶベクターのための上で識別された主要なエレメントに加えて、ある特定の実施形態では、ベクターは、典型的には、プラスミドベクターをトランスフェクトされたまたはＡＡＶウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳および発現を可能にする様式で、導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御エレメントを含むこともできる。発現制御配列は、例えば、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル等、効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望であれば、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。ネイティブ、構成的、誘導性および／または組織特異的なプロモーターを含む多数の発現制御配列は、本技術分野で公知であり、利用することができる。

【0090】

タンパク質をコードする核酸のため、導入遺伝子配列の後かつ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に、ポリアデニル化配列が一般に挿入される。適したポリアデニル化配列として、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（例えば、配列番号２のヌクレオチド（nucelotide）３０５２〜３１９８）、ＳＶ４０後期ポリアデニル化配列、ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、ＡＡＴＡＡＡ（配列番号３）ポリアデニル化シグナル、ＣＡＡＴＡＡＡ（配列番号４）ポリアデニル化シグナル、ＡＴＴＡＡＡ（配列番号５）ポリアデニル化シグナル、ＴＡＮＡ（配列番号６）ポリアデニル化シグナルが挙げられるがこれらに限定されない。

【0091】

ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、望ましくは、プロモーター／エンハンサー配列および導入遺伝子の間に位置するイントロンも含有する。例示的だが非限定的な可能なイントロン配列の１種は、ＳＶ−４０に由来し、ＳＶ−４０ Ｔイントロン配列と称される。他のイントロン配列は、当業者に公知であり、とりわけ、ＣＢＡおよびＣＢＡ−ＭＶＭを含む（例えば、Grayら（２０１１年）Hum. Gene Ther.２２巻（９号）：１１４３〜１１５３頁およびその中に引用されている参考文献を参照）。

【0092】

任意選択で存在し得る別のエレメントは、翻訳後調節エレメントである。例示的な翻訳後調節エレメントとして、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、最小ガンマエレメントおよび部分的アルファ−ベータエレメントを含有するＷＰＲＥ２、最小ガンマおよびアルファエレメントを含有するＷＰＲＥ３（例えば、Choiら（２０１４年）Molecular Brain ７巻：１７〜２６頁を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。非限定的な例を添付の配列表に提示し、参照により本明細書に組み込まれる。

【0093】

宿主細胞における遺伝子発現に必要とされる調節配列の正確な性質は、種、組織または細胞型の間で変動し得るが、一般に、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサーエレメント等、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含む。特に、斯かる５’非転写調節配列は、作動可能に連接された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含み得る。調節配列は、所望に応じてエンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含むこともできる。ベクターは、５’リーダーまたはシグナル配列を任意選択で含むことができる。斯かるシグナルペプチドの例として、アルブミン、β−グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼまたはフィブロネクチン分泌シグナルペプチドが挙げられる。一態様では、エンハンサーは、ウッドチャック転写後（post）調節エレメント（「ＷＰＲＥ」）である（例えば、Zufferey, R.ら（１９９９年）J. Virol.７３巻（４号）：２８８６〜２９９２頁を参照）。ＷＰＲＥの非限定的な例として、配列番号３７または配列番号３８が挙げられる。エンハンサーエレメントは、プロモーターおよびＣＬＮ３遺伝子の下流に存在し得る。しかし、エンハンサーは、いかなる位置にあってもよい。非限定例を添付の配列表に提示し、参照により本明細書に組み込まれる。

【0094】

適したプロモーターの例として、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）（例えば、配列番号２８およびその均等物）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）（例えば、Boshartら（１９８５年）Cell、４１巻：５２１〜５３０頁を参照、例えば、配列番号２７およびその均等物）、ＳＶ４０プロモーター（例えば、配列番号２９）、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター（例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター）（例えば、配列番号２２、配列番号２３およびそれらの均等物）、ホスホグリセロール（phosphoglycerol）キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（例えば、配列番号３０およびその均等物）、ＥＦ１αプロモーター（例えば、配列番号３１およびその均等物）、ＣＢＡプロモーター（例えば、配列番号２４およびその均等物）、ＵＢＣプロモーター（例えば、配列番号３４およびその均等物）、ＧＵＳＢプロモーター、ＮＳＥプロモーター（例えば、配列番号３３およびその均等物）、シナプシンプロモーター（例えば、配列番号３２およびその均等物）、ＭｅＣＰ２（メチル−ＣＰＧ結合タンパク質２）プロモーター（例えば、配列番号２２、配列番号２３およびそれらの均等物）、ＧＦＡＰ、ＣＢｈプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。異なるプロモーターを使用して、導入遺伝子（例えば、ＣＬＮ３）の発現レベルを増大させることができることが企図される。例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢＡ）は、導入遺伝子の強い遍在性の発現をもたらすことができる一方、ＭｅＣＰ２プロモーターは、別のプロモーターと比較して、導入遺伝子のより低い発現をもたらすことができる。一部の実施形態では、プロモーターは、組織依存性様式で導入遺伝子発現を制御することができる。例えば、プロモーター活性は、グリアと比較してニューロンにおいてより高くなることができる。一部の実施形態では、プロモーターは、発生段階依存性様式で導入遺伝子発現を制御することができる。例えば、プロモーターに駆動される発現は、出生後に上昇し、成人期を通して必須であってもよい。

【0095】

ある特定の実施形態では、導入遺伝子のためのネイティブプロモーターまたはその断片を使用することができる。導入遺伝子の発現が、ネイティブな発現を模倣することが望まれる場合、ネイティブプロモーターが好まれる場合がある。ある特定の実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列等、他のネイティブ発現制御エレメントを使用して、ネイティブな発現を模倣することもできる。

【0096】

一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。場合によっては、組織特異的調節配列は、組織特異的様式で転写を誘導する組織特異的転写因子と結合する。斯かる組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等）は、本技術分野で周知である。例証的な組織特異的調節配列として、次の組織特異的プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Andersonら（１９９３年）Cell. Mol. Neurobiol.、１３巻：５０３〜５１５頁）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioliら（１９９１年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８８巻：５６１１〜５６１５頁および例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０４１４７．１（配列番号２５））およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Piccioliら（１９９５年）Neuron、１５巻：３７３〜３８４頁およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ０９９３８．１（配列番号２６））等の、ニューロンのプロモーター。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、神経核（ＮｅｕＮ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（Brennerら（１９９４年）J. Neurosci.１４巻（３号）：１０３０〜１０３７頁）、大腸腺腫症（ＡＰＣ）およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）から選択される遺伝子のプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチンプロモーター（例えば、配列番号２４またはその均等物）またはＭｅＣＰ２プロモーター（例えば、配列番号２のヌクレオチド７７５〜１５１１、配列番号２２、配列番号２３またはそれらの均等物）である。

【0097】

一部の実施形態では、１種または複数のｍｉＲＮＡのための１種または複数の結合部位が、ＡＡＶベクターの導入遺伝子中に取り込まれて、導入遺伝子を持つ対象の１種または複数の組織、例えば、非ＣＮＳ組織における導入遺伝子の発現を阻害する。当業者であれば、結合部位を選択して、組織特異的様式で導入遺伝子の発現を制御することができることを認識し得る。例えば、導入遺伝子から発現されるｍＲＮＡが、肝臓におけるｍｉＲ−１２２に結合し、これにより阻害されるように、肝臓における導入遺伝子の発現は、ｍｉＲ−１２２の結合部位を取り込むことにより阻害することができる。導入遺伝子から発現されるｍＲＮＡが、心臓においてｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１に結合し、これにより阻害されるように、心臓における導入遺伝子の発現は、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１の結合部位を取り込むことにより阻害することができる。ｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはコード領域に存在することができる。典型的には、標的部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに存在する。さらに、複数のｍｉＲＮＡが、同じか、または複数の部位を認識することによりｍＲＮＡを調節するように、導入遺伝子を設計することができる。複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在は、複数のＲＩＳＣの協調作用をもたらし、高度に効率的な発現阻害を生じることができる。ある特定の実施形態では、標的部位配列は、合計５〜１００、１０〜６０またはそれ超のヌクレオチドを含むことができる。ある特定の実施形態では、標的部位配列は、少なくとも５ヌクレオチドの標的遺伝子結合部位配列を含むことができる。

【0098】

ＣＬＮ３導入遺伝子
セロイド−リポフスチン沈着症ニューロナル３（ＣＬＮ３）は、リソソーム膜を含む複数の細胞構造の細胞膜に見出される疎水性の膜貫通タンパク質であるが、ＣＬＮ３の分子機能は未知である。ＣＬＮ３は、エンドサイトーシスおよび細胞内タンパク質輸送、リソソーム恒常性、オートファジー、ミトコンドリア機能、アミノ酸トランスポート、酸化ストレス、神経細胞興奮毒性および細胞周期調節を含むいくつかの細胞過程に関係付けられてきた。ＣＬＮ３は、有毒物質を正常に分解し、再利用可能な構成成分があればそれを再利用する細胞内の区画であるリソソームの正常機能に重要であることが公知である。

【0099】

ＣＬＮ３遺伝子における６０種を超える変異がバッテン病を有する人々において識別された。若年型バッテン病の最も一般的な変異は、ＣＬＮ３遺伝子におけるおよそ１ｋｂヌクレオチド欠失である。若年型バッテン病個体の９０％超が、斯かる変異を有することが推定される。この疾患を研究するために、ＣＬＮ３ノックアウト（ＫＯ）マウスおよびＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウス（小児に観察される主要変異を再現）を含むいくつかの動物モデルが派生された。

【0100】

上に記す通り、本明細書に企図されている構築物は、ヒトＣＬＮ３（例えば、International Batten Disease Consortium（１９９５年）Cell、８２巻：９４９〜９５７頁およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０５３３７（配列番号１）を参照）およびその均等物をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＣＬＮ３ ｃＤＮＡである。しかし、ＣＬＮ３をコードする核酸配列を改変して、例えば、発現カセットの構築を容易にし、発現を増強すること等ができる（例えば、コード最適化により）が認識され得る。ある特定の実施形態では、コードされたＣＬＮ３ペプチドを改変して、例えば、膜挿入を改善、活性および／または安定性を改善、免疫原性を低下させること等ができる。ある特定の実施形態では、特に、処置または研究目的での非ヒト対象へのＡＡＶの適用のために、非ヒトＣＬＮ３を利用することができる。ＣＬＮ３配列が、Ｃａｎｕｓ ｌｕｐｕｓ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ０５５４６．１（配列番号７））、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ６９９８３（配列番号８））、Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿０１１９５９７２５（配列番号９））、Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＭ４２８９０（配列番号１０））等が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかの哺乳動物で公知であることが注記される。

【0101】

一部の実施形態では、適したＣＬＮ３核酸配列は、ＣＬＮ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなり、このＣＬＮ３ポリペプチドは、配列番号１または均等物ポリペプチドを含み、均等物は、配列番号１に対し、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。追加的な非限定例を、参照により本明細書に組み込まれている添付の配列表に提示する。

【0102】

ＣＬＮ３またはその均等物をコードする核酸は、配列番号１１またはその生物学的均等物のポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなることができる。ＣＬＮ３核酸の生物学的均等物の一例は、高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号１１の相補体にハイブリダイズし、ＣＬＮ３生物学的活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。別の例として、配列番号１１またはその相補体に対し少なくとも８０％配列同一性を有し、ＣＬＮ３生物学的活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。ヒトＣＬＮ３バリアントが、本技術分野で公知であることが注記される。非限定例として、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０４２４３２．１（ＣＬＮ３、転写物バリアント１）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８６１０４．１（ＣＬＮ３、転写物バリアント３）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８６１０５．１（ＣＬＮ３、転写物バリアント４）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８６１０９．１（ＣＬＮ３、転写物バリアント５）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８６１１０．１（ＣＬＮ３、転写物バリアント６）、または上に挙げた例のうちいずれか一例もしくはその相補体に対し少なくとも８０％配列同一性を有し、ＣＬＮ３の生物学的活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。

【0103】

一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）によって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）によって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＳＶ４０プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、β−アクチンプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＰＧＫプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＥＦ１αプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＵＢＣプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＧＵＳＢプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＮＳＥプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、シナプシンプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＭｅＣＰ２プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＧＦＡＰプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＣＢｈプロモーターによって駆動される。好ましい実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＣＢＡプロモーター（例えば、配列番号２４）またはその均等物によって駆動される。より好ましい実施形態では、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現は、ＭｅＣＰ２プロモーター（例えば、配列番号２のヌクレオチド７７５〜１５１１、配列番号２２または配列番号２３）またはこれらそれぞれの均等物によって駆動される。一部の実施形態では、上述のプロモーターのうちいずれか１種は、ＣＬＮ３導入遺伝子の発現の駆動から明確に除外され得る。

【0104】

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生
一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムは、天然由来の血清型または分離株もしくはクレードのＡＡＶに由来する。一部の実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９である。他の実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ２である。

【0105】

非限定例として、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ１、全ゲノム）のポリヌクレオチド；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ２、全ゲノム）のポリヌクレオチド；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ４、全ゲノム）のポリヌクレオチド；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ２５６３２１．１（ＡＡＶ５、合成構築物）のポリヌクレオチド；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６、全ゲノム）のポリヌクレオチド；配列番号３５のポリペプチド、配列番号３６のポリヌクレオチド、またはこれらの生物学的均等物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、またはなお、さらにはこれからなることができる組換えＡＡＶが挙げられる。別の例として、上に参照されるポリヌクレオチドに対し少なくとも８０％配列同一性を有する核酸が挙げられる。

【0106】

適した組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型カプシドタンパク質またはその断片、機能的ｒｅｐ遺伝子；最低でもＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）およびＣＬＮ３ポリペプチド（または本明細書に記載されているそのバリアントもしくは均等物）をコードする核酸配列で構成されたミニ遺伝子、ならびにＡＡＶカプシドタンパク質へのミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養することにより生成することができる。

【0107】

ＡＡＶカプシドにＡＡＶベクターをパッケージするために宿主細胞において培養するべき構成成分は、宿主細胞にトランスで提供することができる。あるいは、要求される構成成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／またはヘルパー機能）のうちいずれか１種または複数は、当業者に公知の方法を使用して、要求される構成成分のうち１種または複数を含有するように遺伝子操作された安定的宿主細胞によって提供することができる。最も適切には、斯かる安定的宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下において要求される構成成分（複数可）を含有し得る。しかし、ある特定の実施形態では、要求される構成成分（複数可）は、構成的プロモーターの制御下に置くことができる。

【0108】

さらに別の代替法では、選択された安定的宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下における選択された構成成分（複数可）、および１種または複数の誘導性プロモーターの制御下における他の選択された構成成分（複数可）を含有することができる。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下においてＥ１ヘルパー機能を含有）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下においてｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する安定的宿主細胞を生成することができる。当業者によって、さらに他の安定的宿主細胞を生成することができる。

【0109】

ｒＡＡＶの産生に必要とされる組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、いずれか適切な遺伝的エレメント（ベクター）を使用して、パッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝的エレメントは、本明細書に記載されている方法を含むいずれか適した方法によって送達することができる。斯かる方法は、当業者に公知である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N.Y.を参照）。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法も周知である（例えば、Fisherら（１９９３年）J. Virol.、７０巻：５２０〜５３２頁；米国特許第５，４７８，７４５号；等を参照）。

【0110】

例示的であるが非限定的な一実施形態では、ｒＡＡＶは、トリプルトランスフェクション方法を使用して産生することができる（例えば、米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載）。典型的には、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子にパッケージしようとする組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクターおよびアクセサリー機能ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることにより産生される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、増殖性ＡＡＶ複製およびカプシド形成のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。典型的には、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）も生成することがない効率的なＡＡＶベクター産生を支持する。ベクターの例示的だが非限定的な例として、ｐＨＬＰ１９（米国特許第６，００１，６５０号を参照）、ｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクター（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号を参照）等が挙げられる。アクセサリー機能ベクターは、非ＡＡＶ由来ウイルスおよび／または細胞機能のためのヌクレオチド配列をコードすることができ、これにより、ＡＡＶは複製に依存性となる（すなわち、「アクセサリー機能」）。アクセサリー機能は、ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶカプシドアセンブリの活性化に関与する部分を限定することなく含む、ＡＡＶ複製に必要とされる機能を含むことができる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外の）およびワクシニアウイルス等、公知ヘルパーウイルスのいずれかに由来することができる。

【0111】

組換えＡＡＶ投与
ｒＡＡＶは、典型的には、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害効果を伴うことなく十分なレベルの遺伝子移入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路として、選択された組織への直接的送達（例えば、脳内投与、くも膜下腔内投与）、静脈内、経口、エアロゾル投与、吸入による投与（鼻腔内および気管内送達を含む）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、直腸および他の非経口的投与経路が挙げられるがこれらに限定されない。投与経路は、所望であれば組み合わせることができる。

【0112】

ある特定の実施形態では、対象へのある特定のｒＡＡＶの送達は、例えば、対象の血流への投与により行うことができる。血流への投与は、静脈、動脈または他のいずれかの導血管（vascular conduit）への注射により行うことができる。さらに、ある特定の事例において、脳組織、髄膜、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質内間隙等へとｒＡＡＶを送達することが望ましいことがある。一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、脳室領域への注射により脊髄または脳へと、また、定位的注射による等の本技術分野で公知の神経外科的技法を使用して、針、カテーテルまたは関連するデバイスにより、線条体（例えば、線条体の尾状核または被殻）および神経筋接合部または小脳小葉へと直接的に送達することができる（例えば、Steinら（１９９９年）J Virol.７３巻：３４２４〜３４２９頁；Davidsonら（２０００年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA；Davidsonら（１９９３年）Nat. Genet.３巻：２１９〜２２３頁；AliskyおよびDavidson（２０００年）Hum. Gene Ther.１１巻：２３１５〜２３２９頁等を参照）。

【0113】

対象における中枢神経系（ＣＮＳ）組織へと導入遺伝子を送達するための方法は、本明細書に提供されている。本方法は、典型的には、対象において導入遺伝子（例えば、ＣＬＮ３）を発現させるための核酸ベクターを含む有効量のｒＡＡＶを対象に投与するステップが関与する。有効量は、若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬまたは若年型バッテン病）を処置もしくは緩和する、ならびに／またはこの疾患もしくは状態の進行、重症度および／もしくは範囲を低下、抑制、阻害、和らげる、緩和もしくは影響することができる量を指す。

【0114】

有効量は、例えば、対象の種、年齢、体重、健康および標的とされるＣＮＳ組織等、種々の因子に依存するため、対象および組織の間で変動し得る。有効量は、投与機序に依存する場合もある。例えば、血管内注射によるＣＮＳ組織の標的化は、場合によっては、くも膜下腔内または脳内注射によるＣＮＳ組織の標的化とは異なる（例えば、それよりも高い）用量を必要とすることがある。場合によっては、複数用量のｒＡＡＶが投与される一方、他の場合では、本明細書の実施例に例示される通り、単一用量で十分となることがある。有効量は、使用されるｒＡＡＶに依存する場合もある。例えば、ＣＮＳ組織を標的化するための投薬量は、ｒＡＡＶの血清型（例えば、カプシドタンパク質）に依存し得る。例えば、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳｐ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を有することができる。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶの有効量は、１ｋｇ当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３または１０^１４または１０^１５または１０^１６ゲノムコピーである。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶの有効量は、対象当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３または１０^１４または１０^１５または１０^１６ゲノムコピーである。複数用量が投与される場合、治療法のために同じまたは異なる血清型を組み合わせることができる。

【0115】

対象におけるＣＮＳ組織に導入遺伝子を送達するための方法は、単一の経路または複数の経路によりｒＡＡＶを投与するステップを含むことができる。例えば、対象におけるＣＮＳ組織への導入遺伝子の送達は、静脈内投与により、血液脳関門を通過する有効量のｒＡＡＶを対象に投与するステップを含むことができる。対象におけるＣＮＳ組織への導入遺伝子の送達は、くも膜下腔内投与または脳内投与、例えば、脳室内注射により、有効量のｒＡＡＶを対象に投与するステップを含むことができる。対象におけるＣＮＳ組織に導入遺伝子を送達するための方法は、２種の異なる投与経路、例えば、くも膜下腔内投与および脳内投与により、有効量のｒＡＡＶを同時投与するステップを含むことができる。同時投与は、およそ同じ時点でまたは異なる時点で行うことができる。

【0116】

ある特定の実施形態では、標的とされるＣＮＳ組織は、例えば、皮質、海馬、視床、視床下部、小脳、脳幹、頸髄、胸髄および腰髄から選択することができる。ＣＮＳ組織を標的化するための投与経路は、典型的には、上述の通りＡＡＶ血清型に依存する。

【0117】

ある特定の実施形態では、対象において導入遺伝子（例えば、ＣＬＮ３）を発現させるための核酸ベクターを含む有効量のＡＡＶを対象に投与する前に、推定される対象の診断による確認（またはキャリアもしくは出生前検査）を先ず行って、ＣＬＮ３遺伝子における変異を識別することが望ましいことがある。斯かる検査は、例えば、共通１ｋｂ欠失のＰＣＲ増幅およびサイズ分類解析により、またはＣＬＮ３遺伝子の１５エクソンと隣接するイントロン領域を網羅する完全配列決定解析により行うことができる。配列決定は、ＣＬＮ３遺伝子において全て報告されたいずれかのナンセンス、ミスセンス、スプライシング変異、小型の挿入および欠失変異を明らかにすることができる。

【0118】

ある特定の状況下で、皮下、膵内、鼻腔内、非経口的、静脈内、筋肉内、脳内、くも膜下腔内、脳内、経口、腹腔内または吸入のいずれかにより、本明細書に開示されている適切に製剤化された医薬組成物として、ｒＡＡＶに基づく治療構築物を送達することが望ましいであろう。一部の実施形態では、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号に記載されている投与モダリティを使用して、ｒＡＡＶを送達することができる。

【0119】

一部の実施形態では、本明細書に記載されているベクター、組換えアデノ随伴ウイルス、医薬製剤等は、追加的な治療薬と共に投与することができる。追加的な治療薬の非限定例として、ミコフェノール酸モフェチル、カルベノキソロン（carbenoxolene）、グリチルレチン酸、グリチルリジン酸、シャペロン療法、酵素補充療法、幹細胞療法、抗痙攣薬物療法、抗酸化剤補給（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、メチオニン、Ｂ６）、オメガ−３脂肪酸が挙げられる（例えば、Hobertら（２００６年）Biochimica et Biophysica Acta １７６２巻（１０号）：９４５〜９５３頁を参照）。追加的な治療薬の投薬量、処置プロトコールおよび投与経路は、本技術分野で公知であるおよび／または処置の種類等に基づき決定する熟練した臨床医の技能範囲内である。

【0120】

一実施形態では、本明細書に記載されているベクター、組換えアデノ随伴ウイルス、医薬製剤等と、追加的な治療薬は、逐次に投与される。別の実施形態では、本明細書に記載されているベクター、組換えアデノ随伴ウイルス、医薬製剤等と、追加的な治療薬は、同時に投与される。一実施形態では、本明細書に記載されているベクター、組換えアデノ随伴ウイルス、医薬製剤等は、追加的な治療薬の投与期間の後に投与される。さらなる態様では、ｒＡＡＶ治療法は、他の相補的（complimentary）治療法と同時投与されて、疾患の症状を軽減または処置する。

【0121】

組換えＡＡＶ組成物
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、本技術分野で公知のいずれか適切な方法に従って、組成物中において対象へと送達することができる。例えば、生理学的に適合性の担体（例えば、組成物における）に懸濁されたｒＡＡＶは、対象、例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウまたは非ヒト霊長類（例えば、マカク）に投与することができる。組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１種もしくは複数の他のウイルス（例えば、１種または複数の異なる導入遺伝子をコードするか、またはこれを有する第２のｒＡＡＶ）と組み合わせて含むことができる。一部の実施形態では、組成物は、１種または複数の異なる導入遺伝子をそれぞれ有する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ超の異なるｒＡＡＶを含む。

【0122】

適した担体は、当業者であれば、ｒＡＡＶが対象とする適応症を考慮して容易に選択することができる。例えば、適した担体の１つとしては、種々の緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と共に製剤化することができる生理食塩水が挙げられる。他の例示的な担体として、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油および水が挙げられるがこれらに限定されない。

【0123】

任意選択で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（複数可）に加えて、保存剤または化学的安定剤等の他の従来の医薬品成分を含有することができる。適した例示的な保存剤として、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが挙げられるがこれらに限定されない。適した化学的安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。

【0124】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、特に、高ｒＡＡＶ濃度が存在する場合（例えば、約１０^１３ｖｇ／ｍｌまたはそれ超）、組成物におけるＡＡＶ粒子の凝集を低下させるように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を低下させるための方法は、本技術分野で周知であり、例えば、界面活性物質の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整等を含む（例えば、Wrightら（２００５年）Mol. Ther.１２巻：１７１〜１７８頁等を参照）。

【0125】

種々の処置レジメンにおいて本明細書に記載されている特定の組成物を使用するために適した投薬および処置レジメンの開発と同様に、薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は、当業者に周知である。典型的には、このような製剤は、少なくとも約０．１％の活性成分またはそれ超を含有することができるが、活性成分（複数可）のパーセンテージは、当然ながら変更することができ、便宜上、例えば、総製剤の重量または容量の約１または２％〜約７０％または８０％またはそれ超の間とすることができる。当然だが、治療上有用な組成物のそれぞれにおける活性成分の量は、化合物のいずれか所定の単位用量において適した投薬量が得られるような仕方で調製することができる。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間および他の薬理学的考察等の因子が、斯かる医薬製剤を調製する当業者によって考慮され、したがって、種々の投薬量および処置レジメンが望ましいことがある。

【0126】

注射使用に適した医薬品形態は、典型的には、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物ならびに油において調製することもできる。貯蔵および使用の通常条件下で、このような調製物は、微生物が殖えるのを防止するための保存剤を含有する。多くの場合、形態は、滅菌されており、容易な注射器使用能（syringability）が存在する程度まで流動的である。製剤は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で安定的であり、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保存される。ある特定の実施形態では、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、これらの適した混合物および／または植物油を含有する溶媒または分散媒とすることができる。ある特定の実施形態では、適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合は要求される粒子径の維持により、また、界面活性物質の使用により維持することができる。様々な実施形態では、微生物の作用の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが望ましいであろう。注射用組成物の延長された吸収は、組成物における、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。

【0127】

ある特定の実施形態では、注射用水溶液の投与のために、例えば、溶液は、必要であれば、適切に緩衝することができ、十分な生理食塩水またはグルコースにより液体希釈剤を先ず等張性にすることができる。このような特定の水溶液が、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、用いることができる滅菌水性培地は、当業者には公知であろう。例えば、１投薬量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下点滴療法液に添加する、または提案される注入部位に注射することができる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第１５版、１０３５〜１０３８および１５７０〜１５８０頁を参照）。宿主の状態に応じて、投薬量にある程度の変動が生じ得る。一部の実施形態では、投与責任者は、いずれにせよ、個々の宿主に適切な用量を決定するであろう。

【0128】

ある特定の実施形態では、滅菌注射用溶液は、必要に応じて本明細書に列挙されている様々な他の成分を有する適切な溶媒において要求される量の活性ｒＡＡＶを取り込み、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒および上に列挙されたもののうち要求される他の成分を含有する滅菌媒体に様々な滅菌された活性成分を取り込むことにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、例示的な調製方法として、以前に滅菌濾過されたその溶液から活性成分プラスいずれか追加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥およびフリーズドライ技法が挙げられるがこれらに限定されない。

【0129】

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されているｒＡＡＶ組成物は、中性または塩形態で製剤化することもできる。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸により形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成）を含む。遊離カルボキシル基により形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来してもよい。製剤化により、溶液は、投薬製剤と適合性の様式で、治療上有効となるような量で投与されるであろう。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル等、種々の剤形で容易に投与される。

【0130】

本明細書において使用される場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、媒体、コーティング、希釈剤、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。医薬品活性物質のための斯かる培地および薬剤の使用は、本技術分野で周知である。補足的活性成分を組成物に取り込むこともできる。語句「薬学的に許容される」は、宿主に投与される際にアレルギー性または同様の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。

【0131】

リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞等、送達媒体を、適した宿主細胞への本発明の組成物の導入のために使用することができる。特に、ｒＡＡＶベクターにより送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェアまたはナノ粒子等のいずれかの中に被包して、送達のために製剤化することができる。

【0132】

ある特定の実施形態では、斯かる製剤は、本明細書に開示されている核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容される製剤とすることができる。リポソームの形成および使用は一般に、当業者に公知である（例えば、米国特許第５，７４１，５１６号；同第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号；同第５，７９５，５８７号等を参照）。

【0133】

リポソームの使用は、他の手順によるトランスフェクションに対して通常であれば抵抗性であるいくつかの細胞型を用いて成功してきた。加えて、リポソームは、ウイルスに基づく送達系には典型的なＤＮＡの長さの制約がない。リポソームは、種々の培養細胞株および動物への遺伝子、薬物、放射線療法剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターの導入に有効に使用されてきた。加えて、リポソーム媒介性薬物送達の有効性を試験するいくつかの成功した臨床治験が完了した。

【0134】

リポソームは、水性培地中に分散したリン脂質から形成され、多層状同心円状二重層小胞（多層状小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００オングストロームの範囲内の直径を有し、コアに水溶液を含有する小型の単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。

【0135】

あるいは、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤を使用することができる。ナノカプセルは一般に、安定的かつ再現性のある仕方で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を回避するために、斯かる超微細粒子（０．１μｍ前後のサイズ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで分解され得るポリマーを使用して設計することができる。ある特定の実施形態では、このような要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が使用に企図される。

【0136】

上述の送達方法に加えて、宿主にｒＡＡＶ組成物を送達する代替法として次の技法も企図される。ソノフォレーシス（すなわち、超音波）が、循環器系へのおよびそれを介した薬物浸透の速度および有効性を増強するためのデバイスとして使用され、米国特許第５，６５６，０１６号に記載された。企図される他の薬物送達代替法は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、点眼用製剤、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号および同第５，７８３，２０８号）およびフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。

【0137】

キットおよび関連する組成物
本明細書に記載されている薬剤は、一部の実施形態では、医薬品または診断もしくは研究用キットへと集合させて、治療、診断または研究適用におけるその使用を容易にすることができる。キットは、本発明の構成成分を収容する１個または複数の容器と、使用説明書とを含むことができる。特に、斯かるキットは、本明細書に記載されている１種または複数の薬剤を、このような薬剤の意図される適用および適切な使用について記載する説明書と共に含むことができる。ある特定の実施形態では、キットにおける薬剤は、薬剤の特定の適用および投与方法に適した医薬製剤および投薬量中に存在することができる。研究目的のキットは、様々な実験を行うのに適切な濃度または含量の構成成分を含有することができる。

【0138】

キットは、本明細書に記載されている方法の使用を容易にするように設計することができ、多くの形態をとることができる。キットの組成物のそれぞれは、適用可能であれば、液体形態（例えば、溶液）または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供することができる。ある特定の事例において、組成物のいくつかは、例えば、キットに備わっていても備わっていなくてもよい適した溶媒または他の化学種（例えば、水または細胞培養培地）の添加により、構成可能（constitutable）または他の仕方で加工可能（例えば、活性形態に）であってもよい。

【0139】

本明細書において使用される場合、「説明書」は、説明および／または促進の構成成分を定義することができ、典型的には、本発明のパッケージング上のまたはそれに添えた書面の説明書が関与する。説明書は、キットに説明書が添えられていることを使用者が明らかに認識できるような、いずれかの様式で提供されたいずれかの口頭または電子の説明書、例えば、視聴覚（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤ等）、インターネットおよび／またはウェブに基づくコミュニケーション等を含むこともできる。書面の説明書は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定された形態とすることができ、この説明書は、動物投与のための製造、使用または販売の機関による承認が反映されたものであってもよい。

【0140】

キットは、１個または複数の容器中に、本明細書に記載されている構成成分のうちいずれか１種または複数を含有することができる。一例として、一実施形態では、キットは、キットの１種もしくは複数の構成成分を混合するため、および／または試料を単離し混合し、対象に適用するための説明書を含むことができる。キットは、本明細書に記載されている薬剤を収容する容器を含むことができる。薬剤は、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態とすることができる。薬剤は、滅菌的に調製し、注射器内にパッケージし、冷蔵して輸送することができる。あるいは、薬剤は、貯蔵のためのバイアルまたは他の容器内に収容することができる。第２の容器は、滅菌的に調製された他の薬剤を有することができる。あるいは、キットは、予め混合された活性薬剤を含み、注射器、バイアル、チューブまたは他の容器内において輸送することができる。キットは、注射器、局所的適用デバイスまたはＩＶ針チューブおよびバッグ等、対象への薬剤の投与に要求される構成成分のうち１種もしくは複数または全種を有することができる。

【0141】

本明細書に記載されている治療法は、適切な診断技法と組み合わせて、この治療法のための患者を識別および選択することができる。例えば、患者から試料を単離し、若年型バッテン病の発症に相関した変異（ホモ接合型またはヘテロ接合型）に関してこの試料を検査する。よって、症状出現に先立ちまたは疾患の前進前に、変異を持つ患者を識別することができる。

【実施例】

【0142】

以下の実施例は、請求されている発明を限定するのではなく例示するために提供されている。

【0143】

（実施例１）
若年型バッテン病の処置のための遺伝子療法
本実施例は、若年型バッテン病の処置のための遺伝子療法の初期試験について記載する。遺伝子療法は、一部には、隣接する形質導入されていない細胞の相互是正に起因して、可溶性酵素における変異が関与するバッテン病の形態の是正においては見込みを示したが（Passiniら（２００６年）J. Neurosci.２６巻（５号）：１３３４〜１３４２頁；Sondhiら（２０１２年）Hum. Gene Ther. Meth.２３巻（５号）：３２４〜３３５頁；Macauleyら（２０１４年）J. Neurosci.３４巻（３９号）：１３０７７〜１３０８２頁）、ＣＬＮ３は、膜貫通タンパク質であり（Cotmanら（２０１２年）Clin. Lipidol.７巻（１号）：７９〜９１頁）、表現型効果を生じるにはより多くの細胞に形質導入する必要があることを意味するため、斯かるアプローチは、ＪＮＣＬの処置には難しいと考えられた。しかし、本明細書に提供されているデータは、ＪＮＣＬのマウスモデルにおける運動行為を改善するのに十分な細胞にＣＬＮ３を送達することが可能であることを実証する。

【0144】

自閉症スペクトラム症であるレット症候群（Gargら（２０１３年）J. Neurosci.３３巻（３４号）：１３６１２〜１３６２０頁）の遺伝子投与量依存性モデルにおいて以前に有効であったメチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）のプロモーターにより、低いＣＬＮ３発現レベルが駆動され、別個の構築物が、β−アクチンプロモーターにより高レベルのＣＬＮ３を駆動した。このアプローチの理論的根拠は、出生後ＣＬＮ３発現は限定されているため（Eliasonら（２００７年）J. Neurosci.２７巻（３７号）：９８２６〜９８３４頁）、低ＣＬＮ３レベルが、正常な細胞機能に要求されるという予測に基づいた。本試験は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＬＮ３遺伝子投与量効果の最初の実証となり、驚くべきことに、高レベルのＣＬＮ３過剰発現が、治療利益を遮蔽することが観察された。

【0145】

後述する通り、原理証明試験のため、１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスに、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３（高発現）またはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３（低発現）の１用量の２×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）を静脈内に与え、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を駆動するウイルス（ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰおよびｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰ）を対照とした（図１を参照）。重要なことに、海馬（ＨＰＣ）、線条体（ＳＴＲ）、視床（ＴＨ）、視覚皮質（ＶＣ）および小脳（ＣＢ）を含む、ＪＮＣＬにおいてニューロンが死ぬように運命付けられたいくつかの脳領域において、ｈＣＬＮ３発現のプロモーター遺伝子投与量効果が確認され、ｈＣＬＮ３レベルは、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３と比べ、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおいて３〜８倍上昇していた。

【0146】

しかし、低いｈＣＬＮ３発現を駆動するｓｃＡＡＶ９構築物（ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３）のみが、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動欠損を是正することができたため（加速ロータロッドおよびポール降下）、ｈＣＬＮ３レベルと神経保護の間には断絶があり、脳における高いＣＬＮ３発現が、運動協調性の改善には有利ではないという驚くべき結果を実証する（図２Ａ〜図２Ｅを参照）。リソソーム蓄積物質についても同様の利益が観察され、この物質は、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えた動物の体性感覚野バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）（図７Ａを参照）、ＶＣ（図７Ｃを参照）およびＴＨ（図７Ｄを参照）において有意に低下した。

【0147】

ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの運動行為におけるｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の有益な効果は、ｓｃＡＡＶ９／ＧＦＰ対照構築物では観察されず、これから、ｈＣＬＮ３の作用の特異性が確認される（図２Ａ〜図２Ｅを参照）。Ｓ１ＢＦ、ＶＣ、ＳＴＲ、ＴＨ、ＨＰＣおよびＣＢにおけるＧＦＰ発現により明らかな通り（図４を参照）、脳におけるウイルス形質導入の程度は広汎であった。ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３は、１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおけるＮｅｕＮ^＋ニューロンおよびＧＦＡＰ^＋アストロサイトに形質導入した一方、マイクログリアにおいては限定的な発現が検出された（図６Ａ〜図６Ｃを参照）。野生型ＣＬＮ３発現は、ニューロンおよびグリアのサブセットにおいてのみ回復されたが、これは、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}動物における疾患関連の病理の是正に十分であった（運動機能改善およびリソソーム蓄積物質減少として測定される）。理論に制約されることは望まないが、これは、行動回路における細胞の重複性もしくは不十分なニューロン／グリアＣＬＮ３によって衰弱した回路に取って代わる他の機構による代償を反映し得る、および／または形質導入された細胞の数の過小評価を反映し得ることが想定される。

【0148】

これらの観察に基づき、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３遺伝子療法が、ＪＮＣＬ転帰を有意に改善するのに十分な数のＣＮＳ細胞を標的とするであろうと考えられる。

【0149】

方法および結果
自己相補的ＡＡＶ９（ｓｃＡＡＶ９）は、非分裂細胞において安定的エピソームとして存続し、多くの研究は、数年間の安定的導入遺伝子発現を報告している。ｓｃＡＡＶ９ベクターは、伝統的な一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶベクターよりも１０〜１００倍効率的である（McCartyら（２００３年）Gene Ther.１０巻（２６号）：２１１２〜２１１８頁；McCartyら（２００１年）Gene Ther.８巻（１６号）：１２４８〜１２５４頁）が、外来性ＤＮＡ＜２．２ｋｂしかパッケージできない。ｈＣＬＮ３ ｃＤＮＡは僅か１．３ｋｂであるため、このことは、本明細書に記載されているアプローチにとっての制約とならない。ｓｃＡＡＶ９構築物は、ｈＣＬＮ３を持つように遺伝子操作して、その翻訳潜在力を促進した（例えば、図１を参照）。ある特定の構築物において、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターが、ｈＣＬＮ３発現の駆動用に選択された。

【0150】

ＪＮＣＬの遺伝子療法アプローチの実現可能性は、１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスへのｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３（単一用量）の全身性ｉ．ｖ．送達が、運動行為を有意に改善したが、これは、ＧＦＰを持つ対照ウイルスでは観察されなかったことを示すデータによって支持される（図２Ａ）。運動行為改善は、形質導入２ヶ月後（図２Ｂ）、形質導入３ヶ月後（図２Ｃ）、形質導入４ヶ月後（図２Ｄ）および形質導入５ヶ月後（図２Ｅ）に観察され続けた。１ヶ月および３ヶ月目の血液化学プロファイルの解析は、いずれの処置群における異常も明らかにしなかった（データ図示せず）。

【0151】

ｓｃＡＡＶ９構築物は、それぞれβ−アクチンおよびＭｅＣＰ２プロモーターを使用して、形質導入細胞における高対低のｈＣＬＮ３発現を達成するように遺伝子操作した。１ヶ月齢ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスを後眼窩洞経由でウイルスにより形質導入した。形質導入５ヶ月および１３ヶ月後にマウスを屠殺し、その際マウスはそれぞれ６ヶ月および１４ヶ月齢であった。ビブラトーム切片（３００μｍ厚）から脳領域を解剖した。両方のｈＣＬＮ３に対してプロモーター遺伝子投与量効果が確認され、発現は、低発現ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３（図３）およびＧＦＰタンパク質（図４）と比較して、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３で処置したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの小脳（ＣＢ）、視床（ＴＨ）、海馬（ＨＰＣ）、線条体（ＳＴＲ）、視覚皮質（ＶＣ）、体性感覚野バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）および眼においておよそ３〜８倍上昇していた。

【0152】

加えて、形質導入５ヶ月後のマウスから収集された脳横断面から共焦点画像を取得して、分布および発現レベルをさらに可視化および確認した。同じ共焦点設定を使用して画像を取得して、発現の差を強調した。結果は、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３およびｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３で処置したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの両方における広い体内分布を示し、ＧＦＰ強度は、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３処置したマウスにおいてより大きかった。図５Ａ。結果は、形質導入１３ヶ月後のマウスの網膜領域におけるｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３およびｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の両方の分布も示した。図５Ｂ。

【0153】

ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３およびｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の投与５ヶ月後のＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの脳におけるｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ＧＦＰの比較体内分布は、ＧＦＰ^＋細胞および総細胞数（ＤＡＰＩ^＋）を計数することにより決定した。図６Ａ。図６Ｂにおいて要約される通り、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３処置したマウスは、脳のＳ１ＢＦ、ＶＰＭ／ＶＰＬおよびＶＣ領域におけるＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージの有意な増加を呈した。

【0154】

プロモーター遺伝子投与量効果に関する驚くべき知見は、両方のプロモーター構築物によって形質導入されたＮｅｕＮ^＋およびＧＦＡＰ^＋細胞のパーセンテージにおける類似性によってさらに実証された（データ図示せず）。重要なことに、データは、低発現構築物（ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３）の単一の注射を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスが、形質導入５ヶ月間後まで（現在までに試験した最新間隔）運動協調性における一貫した改善を呈した一方、高発現構築物（ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３）が、有効ではなかったことを示す（図２Ａ〜図２Ｅ）。

【0155】

加えて、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３を与えたＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの脳において、リソソーム蓄積物質の有意な低下が観察された（図７Ａ〜図７Ｇ）。レット症候群および脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）のモデルにおけるｓｃＡＡＶ９を使用した他の報告と合致して（Gargら（２０１３年）J. Neurosci.３３巻（３４号）：１３６１２〜１３６２０頁；Foustら（２０１０年）Nat. Biotechnol.２８巻（３号）：２７１〜２７４頁）、ｓｃＡＡＶ９の体内分布は広汎であり、ＮｅｕＮ^＋ニューロンおよびＧＦＡＰ^＋アストロサイトが、Ｓ１ＢＦ、ＶＣ、ＨＰＣ、ＳＴＲ、ＴＨ、ＣＢおよび視交叉上核（ＳＣＮ；図８Ａおよびデータ図示せず）において形質導入された。図８Ｂに示す通り、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与は、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるアストロサイトに形質導入する。図８Ｃは、ｓｃＡＡＶ９の全身性投与が、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}脳におけるマイクログリアに形質導入しないことを示す。

【0156】

ごく一部のＣＮＳ細胞が、ウイルスによって形質導入されたと思われるが、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}動物における行動改善は、ニューロンにおけるｈＣＬＮ３の有益な内因性効果およびおそらくｈＣＬＮ３形質導入グリアからの非細胞自律的寄与を示唆する。後者は、グルタミン酸塩レベルおよび三者間シナプスでのニューロン活性の調節におけるアストロサイトの十分に認められた役割に基づきニューロン生存を促進することが予想されるであろう（Pereaら（２００９年）Trends Neurosci.３２巻（８号）：４２１〜４３１頁）。

【0157】

ＪＮＣＬに対する別の共通症状は、体重減少である。ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスの体重増加におけるｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３の有益な効果は、ｓｃＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３またはｓｃＡＡＶ９／ＧＦＰ対照構築物では観察されず、これから、ｈＣＬＮ３の作用の特異性が確認される（図１１）。

【0158】

本明細書に記載されているアプローチは、全身性送達経路を用いてウイルス体内分布を増強し、予備的データは高ＣＬＮ３レベルが無効であることを示すことから、特有のプロモーター（ＭｅＣＰ２）を用いて低いＣＬＮ３発現を駆動することができるという点において、従来の治療法よりも有利であることが注記される。要約すると、ｓｃＡＡＶ９／ＭｅＣＰ２−ｈＣＬＮ３のいくつかの性状が、ＪＮＣＬ転帰改善の成功の見込みを支える、すなわち；１）このアプローチは、疾患の根本的原因において遺伝的欠損を是正し得る；２）ウイルスは、若年および成体動物におけるＣＮＳ細胞に効率的に形質導入することができ、ＪＮＣＬは５〜１０歳まで診断されないため、これが重大な意味を持つ；３）ＭｅＣＰ２プロモーターは、低レベルｈＣＬＮ３発現を駆動し、これは、本明細書に提示するデータが示す通り、ＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける運動機能の改善に必須である；ならびに４）ｈＣＬＮ３を持つウイルスの構築は、その臨床治験への移行を加速し得る。

【0159】

（実施例２）
安全性、毒性および炎症評価
異なる実験マウスコホートにおいて血清化学パネル（Ａｂａｘｉｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を実施して、ＡＡＶ処置の安全性および毒性を評価した。測定したメディエータは、アルブミン（ＡＬＢ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アミラーゼ（ＡＭＹ）、ビリルビン（ＴＢＩＬ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、カルシウム（ＣＡ）、リン（ＰＨＯＳ）、グルコース（ＧＬＵ）、ナトリウム（Ｎａ^＋）、カリウム（Ｋ^＋）、総タンパク質（ＴＰ）、グロブリン（ＧＬＯＢ）およびクレアチニン（ＣＲＥ）を含んだ。１ヶ月齢マウスにウイルスを投与し、感染後１ヶ月目（図１２）、３ヶ月目（データ図示せず）、５ヶ月目（データ図示せず）、７ヶ月目（データ図示せず）および１０ヶ月目（図１３）に検査を行った。データは、ある特定の分析物レベルの差、例えば、他の実験コホートと比較したＡＡＶ９／β−アクチン−ｈＣＬＮ３を与えたマウスにおけるアラニンアミノトランスフェラーゼレベルの増加を明らかにしたが、これらは、分析物毎の正常範囲に関して統計的に有意ではなかった。

【0160】

ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）パネル（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、血清炎症メディエータ解析も行った。測定したメディエータは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、ケモカイン（Ｃ−Ｃ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃ）リガンド３（ＣＣＬ３）、ケモカイン（Ｃ−Ｃ）リガンド５（ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃ）リガンド２（ＣＸＣＬ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃ）リガンド９（ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃ）リガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含んだ。１ヶ月齢マウスにウイルスを投与した。形質導入２および４ヶ月後に試料を収集して、ＡＡＶ９が、全身性炎症の証拠を誘発したか評価した。検出されたメディエータのみを図１４Ａ〜図１４Ｆに示す。先の試験と一貫して、媒体処置したＣＬＮ３^{Δｅｘ７／８}マウスにおける全身性炎症の証拠は殆どなかったが、その理由として、このようなマウスは典型的には、およそ１歳まで顕性の全身性またはＣＮＳ炎症を呈さないことが挙げられる。加えて、ＡＡＶ９ウイルスは、全身性炎症性変化の証拠を示さなかった。まとめると、これらのデータは、ＪＮＣＬの処置のためのＡＡＶ９の安全性を示唆する。

【0161】

（実施例３）
ＡＡＶ製造
２９３細胞において、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共にＲｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミドを備える二本鎖ＡＡＶ２−ＩＴＲに基づくＣＢ−ＧＦＰベクターを使用した一過性トランスフェクション手順により、ＡＡＶ９を産生した。血清型９配列を配列決定により検証したところ、以前に記載されたものと同一であった（Gaoら（２００２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９９巻：１１８５４〜１１８５９頁）。ウイルスを２回の塩化セシウム密度勾配精製ステップにより精製し、ＰＢＳに対して透析し、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８と共に製剤化してウイルス凝集を防止し、４℃で貯蔵した。Ｔａｑ−Ｍａｎ技術を使用した定量的ＰＣＲにより、全ベクター調製物を力価決定した。

【0162】

ＡＡＶ構築物は、遺伝子発現カセットを挟んで２個の末端逆位反復配列を含有する。左末端逆位反復配列に対する修飾は、Ｒｅｐニッキングの部位を除去し、これにより、自己相補的ＡＡＶゲノムを作製した。発現カセットは、導入遺伝子発現を駆動するために、以前に記載された（Gargら（２０１３年）J. Neurosci.３３巻：１３６１２〜１３６２０頁；Adachiら（２００５年）Hum Mol Genet.１４巻：３７０９〜３７２２頁）マウスＭｅＣＰ２プロモーターの断片を含有する。発現カセットは、ＳＶ４０イントロンおよびヒトＣＬＮ３バリアント２ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００８６．２；配列番号１１）と、続くウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を含有する。

【0163】

本明細書に記載されている実施例および実施形態が、単に例示を目的としており、それに照らした様々な修正または変更が当業者に示唆され、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、その中の配列表を含めて、あらゆる目的のため、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0164】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【表1-12】

【表1-13】

【表1-14】

【表1-15】

【表1-16】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7CD】

【図7EF】

【図7G】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図12-5】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図13-4】

【図13-5】

【図14A-C】

【図14D-F】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]