特許 6755318 突然変異フォン・ヴィレブランド因子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6755318

(24)【登録日】2020年8月27日

(45)【発行日】2020年9月16日

(54)【発明の名称】突然変異フォン・ヴィレブランド因子

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/745 20060101AFI20200907BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20200907BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20200907BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20200907BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200907BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200907BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200907BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200907BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20200907BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20200907BHJP

   A61K 38/36 20060101ALI20200907BHJP

   A61K 38/37 20060101ALI20200907BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/745ZNA

   C07K19/00

   C12N15/12

   C12N15/63 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/02 C

   A61P7/04

   A61K38/36

   A61K38/37

【請求項の数】23

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2018-535384(P2018-535384)

(86)(22)【出願日】2017年1月6日

(65)【公表番号】特表2019-504621(P2019-504621A)

(43)【公表日】2019年2月21日

(86)【国際出願番号】AU2017050009

(87)【国際公開番号】WO2017117630

(87)【国際公開日】20170713

【審査請求日】2018年9月6日

(31)【優先権主張番号】2016900033

(32)【優先日】2016年1月7日

(33)【優先権主張国】AU

(73)【特許権者】

【識別番号】518315254

【氏名又は名称】ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アンドリューズ、アーナ

(72)【発明者】

【氏名】パノーシス、コン

(72)【発明者】

【氏名】エムリッヒ、ケアスティン

(72)【発明者】

【氏名】ウィルソン、マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ダワー、スティーブ

(72)【発明者】

【氏名】ハーディー、マシュー

(72)【発明者】

【氏名】ハートマン、ダラス

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１２０９３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２５３６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０３１０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Biol. Chem., 2013, Vol.288, No.1, p.393-400

【文献】 Blood, 2014, Vol.124, p.445-452

【文献】 J. Biol. Chem., 2004, Vol.279, No.13, p.12102-12109

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ／Ｖ１０８３Ａ）のアミノ酸配列、
配列番号６（Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）のアミノ酸配列、
配列番号７（Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）のアミノ酸配列、
配列番号８（Ｎ１０１１Ｓ／Ｖ１０８３Ａ／Ｋ１１８１Ｅ）のアミノ酸配列、
配列番号１７（Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）のアミノ酸配列、
配列番号９（Ｖ１０８３Ａ）のアミノ酸配列、
配列番号１０（Ｓ１０４２Ｔ）のアミノ酸配列、
配列番号１１（Ｖ８０５Ａ／Ｑ１１５８Ｌ）のアミノ酸配列、
配列番号１２（Ｋ９１２Ｅ／Ｔ１０８８Ｓ）のアミノ酸配列、又は
配列番号１３（Ｌ７８１Ｐ）のアミノ酸配列を含む、改変成熟フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）を含む、ポリペプチド。

【請求項2】

配列番号３において少なくとも１、３および３２０位の改変を含む配列番号３の配列を含む改変成熟ＶＷＦを含む、ポリペプチドであって、
３２０位の残基がＡであり、３位の残基がＹ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、ＲおよびＷからなる群から選択され、１位の残基がＧ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、ＡおよびＬからなる群から選択され、
これにより、改変されていない配列番号３を含む参照ポリペプチドよりも低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、第ＶＩＩＩ因子に結合する、ポリペプチド。

【請求項3】

改変成熟ＶＷＦである、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

半減期延長部分をさらに含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記半減期延長部分が、前記改変成熟ＶＷＦと融合した異種アミノ酸配列である、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域およびその部分、トランスフェリンおよびその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮとして知られている大きな流体力学体積を有する溶媒和ランダム鎖、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、プロリンーアラニン−セリンリピート（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、α−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理条件下でアルブミンまたは免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド、ならびにこれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含むまたはポリペプチドからなる、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記半減期延長部分が、前記改変成熟ＶＷＦにコンジュゲートしている、請求項４から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記半減期延長部分が、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸およびアルブミン結合リガンド、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記異種アミノ酸配列がアルブミンを含む、請求項５又は６に記載のポリペプチド。

【請求項10】

前記アルブミンのＮ末端が直接またはスペーサーを介して前記改変成熟ＶＷＦのＣ末端に融合している、請求項９に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記改変成熟ＶＷＦの天然Ｃ末端の１〜５個のアミノ酸が欠失している、請求項１０に記載のポリペプチド。

【請求項12】

第ＶＩＩＩ因子分子と、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドとを含む複合体。

【請求項13】

請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１２に記載の複合体を含む医薬組成物。

【請求項14】

出血障害の治療または予防に使用するための、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記出血障害が、フォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）または血友病Ａである、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

出血障害を治療するための医薬品の調製における、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１２に記載の複合体の使用。

【請求項17】

前記出血障害がフォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）または血友病Ａである、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項19】

請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクター。

【請求項20】

発現ベクターである、請求項１９に記載のベクター。

【請求項21】

請求項１８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１９もしくは２０に記載のプラスミドを含む宿主細胞。

【請求項22】

改変成熟ＶＷＦを含むポリペプチドを生成する方法であって、
（ｉ）請求項２１に記載の宿主細胞を、改変成熟ＶＷＦを含むポリペプチドが発現されるような条件下で培養するステップと；
（ｉｉ）場合により、改変成熟ＶＷＦを含む前記ポリペプチドを前記宿主細胞または前記培養培地から回収するステップと
を含む方法。

【請求項23】

第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加させる方法であって、前記第ＶＩＩＩ因子を、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドと混合するステップを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

出願データ
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１月７日出願のオーストラリア特許出願番号第２０１６９０００３３号に関連し、その優先権を主張するものである。

【0002】

本発明は、第ＶＩＩＩ因子に対する改善された結合親和性を示すポリペプチド、特に改変フォン・ヴィレブランド因子に関する。本発明はさらに、当該ポリペプチドおよびＦＶＩＩＩを含む複合体、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに当該ポリペプチドを生成する方法に関する。さらに、本発明は、出血障害を処置するための本発明のポリペプチドまたは複合体の治療的または予防的使用に関する。

【背景技術】

【0003】

血液凝固因子の欠乏によって引き起こされる種々の出血障害がある。最も一般的な障害は、それぞれ血液凝固第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の欠乏に起因する血友病ＡおよびＢである。別の既知の出血障害は、フォン・ヴィレブランド病である。

【0004】

血漿中で、ＦＶＩＩＩは、主にＶＷＦとの非共有結合複合体で存在し、膜結合活性化第Ｘ因子産生複合体において活性化第ＩＸ因子の補因子(cofactor)として作用する。

【0005】

細胞受容体との相互作用を減少させることにより（国際公開第０３／０９３３１３号パンフレット、国際公開第０２／０６０９５１号パンフレット）、ポリマーとＦＶＩＩＩを共有結合させることによって（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット、国際公開第９７／１１９５７号パンフレットおよび米国特許第４９７０３００号明細書）、ＦＶＩＩＩのカプセル化によって（国際公開第９９／５５３０６号パンフレット）、新規な金属結合部位の導入によって（国際公開第９７／０３１９３号パンフレット）、ペプチド結合（国際公開第９７／４０１４５号パンフレットおよび国際公開第０３／０８７３５５号パンフレット）もしくはジスルフィド結合（国際公開第０２／１０３０２４号パンフレット）によりＡ２ドメインとＡ３ドメインを共有結合させることによって、またはＡ１ドメインとＡ２ドメインを共有結合させることによって（国際公開第２００６／１０８５９０号パンフレット）、非活性化ＦＶＩＩＩの半減期を延長させるためのいくつかの試みがなされてきた。

【0006】

ＦＶＩＩＩまたはＶＷＦの機能的半減期を増大するための別のアプローチは、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化によるものである（国際公開第２００７／１２６８０８号パンフレット、国際公開第２００６／０５３２９９号パンフレット、国際公開第２００４／０７５９２３号パンフレット）。ＶＷＦのＰＥＧ化（国際公開第２００６／０７１８０１号パンフレット）もまた、血漿中に存在するＦＶＩＩＩの半減期を間接的に増強するために試みられてきた。また、ＦＶＩＩＩの融合タンパク質も記載されている（国際公開第２００４／１０１７４０号パンフレット、国際公開第２００８／０７７６１６号パンフレットおよび国際公開第２００９／１５６１３７号パンフレット）。

【0007】

様々な形態のフォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）において、欠損している、機能的に欠陥がある、または低減した量でのみ利用可能なＶＷＦは、複数の生理学的機能を有する血漿中に存在する多量体の粘着性糖タンパク質である。一次止血の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特定の受容体とコラーゲンなどの細胞外マトリックスの成分との間のメディエーターとして作用する。さらに、ＶＷＦは、凝血原ＦＶＩＩＩのための担体および安定化タンパク質として働く。ＶＷＦは２８１３アミノ酸の前駆体分子として内皮細胞および巨核球で合成される。野生型ＶＷＦのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は、Ｃｏｌｌｉｎｓら１９８７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４３９３〜４３９７に開示されている。前駆体ポリペプチド、すなわちプレ−プロ−ＶＷＦは、血漿中に見られる、２２残基シグナルペプチド、７４１残基プロ−ペプチドおよび２０５０残基ポリペプチドからなる（Ｆｉｓｃｈｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５１：３４５〜３４８、１９９４）。小胞体におけるシグナルペプチドの切断後、ＶＷＦの２つの単量体の間にＣ末端ジスルフィド架橋が形成される。分泌経路を通るさらなる輸送の間に、１２個のＮ結合型および１０個のＯ結合型炭水化物側鎖が付加される。重要なことに、ＶＷＦ二量体はＮ末端ジスルフィド架橋を介して多量体化され、７４１アミノ酸のプロペプチドは後期ゴルジ装置(late Golgi aparatus)の酵素ＰＡＣＥ／フューリンによって切断される。プロペプチドならびにＶＷＦの高分子量多量体（ＶＷＦ−ＨＭＷＭ）は、内皮細胞のバイベル・パラーデ小体または血小板のα−顆粒中に貯蔵される。

【0008】

いったん血漿中に分泌されると、プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦのＡ１ドメイン内でＶＷＦを切断する。血漿ＶＷＦは、５００ｋＤａの単一二量体〜１００００ｋＤａを超える分子量の２０個超の二量体からなる多量体に及ぶ範囲の多量体からなる。典型的には、ＶＷＦ高分子量多量体（ＶＷＦ−ＨＭＷＭ）が最も強い止血活性を有し、これはリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）で測定することができる。ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ抗原の比が高いほど、高分子量多量体の相対量が高くなる。

【0009】

ＶＷＦの欠陥は、程度の差はあるが明白な出血表現型を特徴とするフォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）の原因である。３型ＶＷＤは、ＶＷＦが完全に欠損している最も重症の形態であり、ＶＷＤ１型は、ＶＷＦの量的損失に関連し、その表現型は非常に軽症となり得る。２型ＶＷＤは、ＶＷＦの質的欠陥に関連し、３型ＶＷＤと同じくらい重症となり得る。２型ＶＷＤは多くのサブフォームを有し、そのいくつかは高分子量多量体の損失または減少を伴う。２ａ型Ｖｏｎ ＶＷＤは、中程度の多量体と大型多量体の両方の損失を特徴とする。２Ｂ型ＶＷＤは、最も高分子量の多量体の損失を特徴とする。

【0010】

ＶＷＤは、ヒトにおいて最も頻繁な遺伝性の出血障害であり、血漿または組換え起源のＶＷＦを含む濃縮物による補充療法によって処置することができる。ＶＷＦは、例えば欧州特許第０５５０３９９１号明細書に記載されているようにヒト血漿から調製することができる。欧州特許第０７８４６３２号明細書は、組換えＶＷＦを産生および単離する方法を記載している。

【0011】

血漿中では、ＦＶＩＩＩは高い親和性でＶＷＦに結合し、これがＦＶＩＩＩを早期異化から保護するため、一次止血における役割に加えて、ＦＶＩＩＩの血漿レベルの調節において重要な役割を果たし、結果として、二次止血の制御における中心因子にもなる。ＶＷＦに結合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は、血漿中で約１２〜１４時間である。ＶＷＦが全くまたはほとんど存在しない３型フォン・ヴィレブランド病では、ＦＶＩＩＩの半減期はわずか約６時間であり、ＦＶＩＩＩの濃度低下のためにこのような患者において軽症から中等症の血友病Ａの症状がもたらされる。ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦの安定化効果は、ＣＨＯ細胞においてＦＶＩＩＩの組換え発現を助けるためにも使用されている（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８９、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ）。

【発明の概要】

【0012】

本出願人の同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２０１５／０５０３６９には、ＶＷＦのドメインＤ’におけるいくつかの改変が第ＶＩＩＩ因子との結合を増加させることができることが開示されている。この出願の開示は、相互参照により本明細書に含まれる。本発明者らは今回、ＶＷＦと第ＶＩＩＩ因子の結合が、Ｄ’における他の改変、特にＤ３ドメインにおける改変によって増加し得ることを見出した。

【0013】

したがって、第１の態様では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子に結合する改変ポリペプチドであって、配列番号３に示される配列またはその断片においてＬ１８、Ｖ４２、Ｋ１４９、Ｎ２４８、Ｓ２７９、Ｖ３２０、Ｔ３２５、Ｑ３９５およびＫ４１８からなる群から選択される少なくとも１つの位置における少なくとも１つの改変を含む、配列またはその断片を含み；改変されていない配列番号３を含む参照ポリペプチドよりも低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する改変ポリペプチドを提供する。

【0014】

本発明はまた、第ＶＩＩＩ因子分子と、本発明の改変ポリペプチドと、改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む複合体を提供する。

【0015】

本発明はまた、本発明の改変ポリペプチドまたは複合体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、出血障害を治療する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】中性ｐＨでのスクリーニングからの試料センサーグラムを示す図である。最も強い親和性があり、最も遅い解離速度を有する２つの候補物質を丸で囲んでいる。

【図2】ｐＨ７での２つの突然変異型Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ候補物質についてのＣＳＬ６２７の詳細な動態を示す試料センサーグラムを示す図である。ａ）突然変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙを有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡに結合する第ＶＩＩＩ因子；ｂ）突然変異：Ｓ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙを有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡに結合する第ＶＩＩＩ因子；ｃ）突然変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗを有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡに結合する第ＶＩＩＩ因子；ｄ）Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗに結合する第ＶＩＩＩ因子。

【図3】ｐＨ５．５での２つの突然変異型Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ候補物質についての第ＶＩＩＩ因子の詳細な動態を示す試料センサーグラムを示す図である。ａ）突然変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙを有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡに結合する第ＶＩＩＩ因子；ｂ）突然変異：Ｓ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙを有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡに結合する第ＶＩＩＩ因子；ｃ）突然変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗを有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡに結合する第ＶＩＩＩ因子；ｄ）Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗに結合する第ＶＩＩＩ因子。

【図4】ａ）中性ｐＨでの突然変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｅ、Ｓ７６６Ｙを有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡ二量体に結合するＣＳＬ６２７；ｂ）中性ｐＨでの野生型Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ二量体に結合するＣＳＬ６２７を示す図である。

【図5】ｐＨ５．５でのａ）突然変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｅ、Ｓ７６６Ｙを有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡ二量体に結合するＣＳＬ６２７；ｂ）野生型Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ二量体に結合するＣＳＬ６２７を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本明細書を通して、文脈上別段の意味を要しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明記される要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を含むことを意味するが、他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を除外することを意味しないことが理解される。

【0018】

本明細書において、以前の刊行物（もしくはそれから派生した情報）、または公知の事項に関する言及は、以前の刊行物（もしくはそれから派生した情報）、または公知の事項が、本明細書が関連する努力の分野における共通の一般知識の一部を形成することの認諾でも自認でもいずれの形態の示唆でもなく、またそのように解釈されるべきでない。

【0019】

本明細書で言及される全ての刊行物は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0020】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の態様を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及は、単一薬剤、ならびに２つ以上の薬剤も含み；「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、単一分子、ならびに２個以上の分子も含み；以下同様である。

【0021】

ＶＷＦ
本明細書で使用される「フォン・ヴィレブランド因子」または「ＶＷＦ」という用語は、野生型ＶＷＦの生物学的活性、特に第ＶＩＩＩ因子に結合する能力を有する任意のポリペプチドを指す。野生型ＶＷＦをコードする遺伝子は、推定分子量３１００００Ｄａを有する２８１３アミノ酸のプレ−プロポリペプチドに翻訳される９ｋｂのｍＲＮＡに転写される。プレ−プロポリペプチドは、２２アミノ酸のシグナルペプチド、７４１アミノ酸のプロ−ポリペプチドおよび成熟サブユニットを含む。Ｎ末端からの７４１アミノ酸のプロポリペプチドの切断は、２０５０アミノ酸からなる成熟ＶＷＦを生じる。ＶＷＦプレ−プロポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。特に指示しない限り、本明細書におけるＶＷＦ残基のアミノ酸の番号付けは、ＶＷＦ分子が配列番号２のすべての残基を含む必要がない場合であっても、配列番号２を参照する。成熟ＶＷＦのアミノ酸配列を配列番号４に示す。本明細書で使用される「ＶＷＦ」という用語は、特に指示しない限り、ＶＷＦの成熟形態を指す。

【0022】

野生型ＶＷＦのプロポリペプチドは、以下の順序で配置された複数のドメインを含む：
Ｄ１−Ｄ２−Ｄ’−Ｄ３−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＫ

【0023】

Ｄ１およびＤ２ドメインは、切断されて成熟ＶＷＦを生じるプロペプチドを表す。Ｄ’−Ｄ３ドメインは、第ＶＩＩＩ因子との結合を担うアミノ酸を包含する。野生型ＶＷＦのＤ’−Ｄ３ドメインの少なくとも一部のアミノ酸配列を配列番号３に示す。カルボキシ末端９０残基は、タンパク質の「システインノット」スーパーファミリーと相同である「ＣＫ」ドメインを含む。これらのファミリーメンバーは、ジスルフィド結合を通して二量体化する傾向がある。

【0024】

好ましくは、野生型ＶＷＦは、配列番号４に示される成熟ＶＷＦのアミノ酸配列を含む。また、ＶＷＦの生物学的活性、特にＦＶＩＩＩに結合する能力が保持されている限り、ＶＷＦの付加、挿入、Ｎ末端、Ｃ末端または内部欠失も包含される。欠失を有するＶＷＦが野生型ＶＷＦの生物学的活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％を保持する場合、生物学的活性は本発明の意味において保持される。野生型ＶＷＦの生物学的活性は、リストセチン補因子活性のための方法（Ｆｅｄｅｒｉｃｉ ＡＢら２００４．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８９：７７〜８５）、ＶＷＦと血小板糖タンパク質複合体Ｉｂ−Ｖ−ＩＸのＧＰ Ｉｂαの結合（Ｓｕｃｋｅｒら２００６ Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．１２：３０５〜３１０）またはコラーゲン結合アッセイ（Ｋａｌｌａｓ＆Ｔａｌｐｓｅｐ．２００１．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ８０：４６６〜４７１）を用いることによって、当業者により決定され得る。ＶＷＦの生物学的活性がＦＶＩＩＩに結合する能力である場合、これをいくつかの方法で測定することができるが、好ましくは本明細書の例１に記載されるように測定する。

【0025】

第ＶＩＩＩ因子
「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」、「第ＶＩＩＩ因子」および「ＦＶＩＩＩ」という用語は、本明細書において互換的に使用される。「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」は、野生型血液凝固ＦＶＩＩＩならびに野生型血液凝固ＦＶＩＩＩの凝血促進活性を有する野生型血液凝固ＦＶＩＩＩの誘導体を含む。誘導体は、野生型ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列と比較して、欠失、挿入および／または付加を有し得る。ＦＶＩＩＩという用語は、ＦＶＩＩＩのタンパク質分解的にプロセシングされた形態、例えば重鎖および軽鎖を含む活性化前の形態を含む。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩを含む、血漿由来および組換えＦＶＩＩＩが含まれる。市販製品の例としては、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）、Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）、Ｌｏｃｔａｔｅ（登録商標）およびＮｏｖｏｅｉｇｈｔ（登録商標）が挙げられる。

【0026】

「ＦＶＩＩＩ」という用語は、野生型第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性の少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％を有する任意のＦＶＩＩＩ変異体または突然変異体を含む。

【0027】

非限定的な例として、ＦＶＩＩＩ分子は、ＡＰＣ切断を防止するまたは減少させるＦＶＩＩＩ突然変異体（Ａｍａｎｏ １９９８．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：５５７〜５６３）、Ａ２ドメインをさらに安定化するＦＶＩＩＩ突然変異体（国際公開第９７／４０１４５号パンフレット）、発現が増加したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｓｗａｒｏｏｐら１９９７．ＪＢＣ ２７２：２４１２１〜２４１２４）、免疫原性が低下したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｌｏｌｌａｒ １９９９．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５０５〜５０８）、異なって発現した重鎖および軽鎖から再構成されたＦＶＩＩＩ（Ｏｈら、１９９９．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３１：９５〜１００）、ＦＶＩＩＩ様ＨＳＰＧ（ヘパラン硫酸プロテオグリカン）および／またはＬＲＰ（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）の異化をもたらす受容体との結合が減少したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ａｎａｎｙｅｖａら２００１．ＴＣＭ、１１：２５１〜２５７）、ジスルフィド結合安定化ＦＶＩＩＩ変異体（Ｇａｌｅら、２００６．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．４：１３１５〜１３２２）、分泌特性が改善したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｍｉａｏら、２００４：Ｂｌｏｏｄ １０３：３４１２〜３４１９）、補因子比活性が増加したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：１０２９８〜３０４）、生合成および分泌が改善し、ＥＲシャペロン相互作用が減少し、ＥＲ−ゴルジ輸送が改善し、活性化または不活性化に対する耐性が増加し、半減期が改善したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｐｉｐｅ ２００４．Ｓｅｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．３０：２２７〜２３７）が挙げられる。別の特に好ましい例は、Ｚｏｌｌｎｅｒら、２０１３、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３２：２８０〜２８７に記載される組換え型のＦＶＩＩＩである。これらのＦＶＩＩＩ突然変異体および変異体の全ては、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0028】

好ましくは、ＦＶＩＩＩが配列番号１４に示されるＦＶＩＩＩの全長配列を含む。また、ＦＶＩＩＩの生物学的活性が保持されている限り、ＦＶＩＩＩの付加、挿入、置換、Ｎ末端、Ｃ末端または内部欠失も包含される。改変を有するＦＶＩＩＩが野生型ＦＶＩＩＩの生物学的活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％を保持する場合、生物学的活性は本発明の意味において保持される。ＦＶＩＩＩの生物学的活性は、以下に記載されるように当業者によって決定され得る。

【0029】

ＦＶＩＩＩの生物学的活性を決定するための適切な試験は、例えば、一段階もしくは二段階凝固アッセイ（Ｒｉｚｚａら１９８２．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｏｆ ＦＶＩＩＩ：Ｃ ａｎｄ ＦＩＸａ ｉｎ Ｂｌｏｏｍ ｅｄ．Ｔｈｅ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｓ．ＮＹ Ｃｈｕｒｃｈｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ １９９２）または発色基質ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ（Ｓ．Ｒｏｓｅｎ、１９８４．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ３３：１３９〜１４５、補遺）である。これらの参考文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0030】

ヒト血液凝固ＦＶＩＩＩの成熟野生型形態のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。特定の配列のアミノ酸位置への言及は、ＦＶＩＩＩ野生型タンパク質における前記アミノ酸の位置を意味し、言及される配列中の他の位置の突然変異、例えば欠失、挿入および／または置換の存在を排除しない。例えば、配列番号１４を参照する「Ｇｌｕ２００４」における突然変異は、改変ホモログにおいて配列番号１４の１位〜２３３２位の１個または複数のアミノ酸が欠けていることを除外しない。

【0031】

上記の定義内の「ＦＶＩＩＩ」および／または「ＶＷＦ」にはまた、ある個体から別の個体に存在し、発生し得る天然対立遺伝子変異も含まれる。上記の定義内の「ＦＶＩＩＩ」および／または「ＶＷＦ」にはさらに、ＦＶＩＩＩおよび／またはＶＷＦの変異体が含まれる。このような変異体は、野生型配列とは１つまたは複数のアミノ酸残基が異なる。このような違いの例としては、保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特徴を有するアミノ酸の群、例えば（１）小型アミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、および（６）芳香族アミノ酸の中の置換が挙げられ得る。このような保存的置換の例を表１に示す。

【表1】

【0032】

改変ＶＷＦ
本発明の改変ＶＷＦは、野生型ＶＷＦのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。本発明によると、改変ＶＷＦは、配列番号３に示される野生型ＶＷＦのＤ’−Ｄ３ドメインのアミノ酸配列と比較して、Ｄ’−Ｄ３ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。

【0033】

改変ＶＷＦのＤ’−Ｄ３ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３に対して１つまたは複数のアミノ酸置換を有することができる。改変ＶＷＦのＤ’−Ｄ３ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは配列番号３に対して１つまたは２つまたは３つのアミノ酸置換を有する。

【0034】

改変ＶＷＦが、配列番号３の３２０位の改変を含むことが好ましい。この位置のＶがＡで置換されていることも好ましい。さらに好ましい形態では、改変ＶＷＦが、３２０位の改変に加えて、配列番号３の１位および／または３位、好ましくは１位と３位の両方でも改変されている。

【0035】

配列番号３の１位のＳが、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、ＡおよびＬからなる群から選択されるアミノ酸で置換されていることが好ましい。

【0036】

配列番号３の３位のＳが、Ｙ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、ＲおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸で置換されていることも好ましい。

【0037】

好ましい置換の組合せには、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ／Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｎ１０１１Ｓ／Ｖ１０８３Ａ／Ｋ１１８１Ｅ、Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｖ８０５／Ｑ１１５８ＬおよびＫ９１２Ｅ／Ｔ１０８８Ｓが含まれる。

【0038】

本発明の一態様によると、ＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドの結合親和性は、配列番号３の改変を除いて同じアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドの結合親和性よりも高い。

【0039】

第ＶＩＩＩ因子分子に対するＶＷＦ分子の結合親和性は、当技術分野で用いられる結合アッセイによって決定することができる。例えば、ＶＷＦ分子を固体支持体上に固定化し、増加する濃度の第ＶＩＩＩ因子を適用し、一定時間インキュベートし、洗浄後、結合した第ＶＩＩＩ因子を発色アッセイで決定する。次いで、親和定数または解離定数を、スキャチャード解析または別の適切な方法によって決定することができる。フォン・ヴィレブランド因子に対するヒト第ＶＩＩＩ因子の結合親和性を決定する方法は、Ｖｌｏｔら（１９９５）、Ｂｌｏｏｄ、第８５巻、第１１号、３１５０〜３１５７に記載されている。しかしながら、好ましくは、第ＶＩＩＩ因子に対するＶＷＦの親和性を本出願の例１に記載されるように決定する。

【0040】

解離定数を含む親和性の本明細書中のいかなる指標も、好ましくは、本発明の改変ＶＷＦまたは本発明のポリペプチドとＦＶＩＩＩの結合を指す。ＦＶＩＩＩの一本鎖のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。

【0041】

ＶＷＦとＦＶＩＩＩの相互作用は、典型的には高い結合速度を有するので、解離定数の変化は解離速度の変化に大きく依存する。したがって、ＶＷＦとＦＶＩＩＩの会合を増加させることにおける主な焦点は、ＦＶＩＩＩとＶＷＦの間の解離速度を低下させる努力を伴う。好ましくは、野生型ＶＷＦとＦＶＩＩＩと比較した改変ＶＷＦとＦＶＩＩＩの解離速度が、少なくとも２倍低い、より好ましくは少なくとも５倍低い、好ましくは少なくとも１０倍低い、より好ましくは少なくとも２０倍低い。

【0042】

ＶＷＦとＦＶＩＩＩからなる複合体の解離定数は、好ましくは０．２ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．１７５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．１５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．１２５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．０５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、最も好ましくは０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。

【0043】

本発明のポリペプチドと配列番号１４の第ＶＩＩＩ因子の複合体の解離定数ＫＤは、典型的には、参照ポリペプチド（例えば、配列番号４のポリペプチド）と配列番号１４の第ＶＩＩＩ因子の複合体の解離定数ＫＤの９０％未満である。本発明のポリペプチドと配列番号１４の第ＶＩＩＩ因子の複合体の解離定数ＫＤは、参照ポリペプチド（例えば、配列番号４のポリペプチド）と配列番号１４の第ＶＩＩＩ因子の複合体の解離定数ＫＤの、好ましくは７５％未満、より好ましくは５０％未満、より好ましくは２５％未満、より好ましくは１０％未満である、より好ましくは５％未満である。

【0044】

参照ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、ＶＷＦのＤ’−Ｄ３ドメイン内の突然変異を除いて、本発明のポリペプチドの配列と同一であるポリペプチドである。すなわち、参照ポリペプチドは、好ましくは、本発明のポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するが、但し、参照ポリペプチド中のＤ’−Ｄ３ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる。換言すれば、本発明のポリペプチドと参照ポリペプチドの間の配列の唯一の違いは、Ｄ’−Ｄ３ドメインのアミノ酸配列にある。参照ポリペプチドは、好ましくは、本発明のポリペプチドと同じ条件下で調製されている。

【0045】

半減期延長部分
本発明のポリペプチドは、改変ＶＷＦからなっていてもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドが、半減期延長部分をさらに含み得る。半減期延長部分は、切断されたＶＷＦと融合した異種アミノ酸配列であり得る。あるいは、半減期延長部分は、ペプチド結合とは異なる共有結合によって、切断されたＶＷＦを含むポリペプチドと化学的に結合していてもよい。

【0046】

本発明の一定の実施形態では、本発明のポリペプチドの半減期が、化学修飾、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマーまたはヒアルロン酸などの半減期延長部分の結合によって延長される。別の実施形態では、本発明のポリペプチドが、化学リンカーを介してアルブミンなどのＨＬＥＰとコンジュゲートしている。このコンジュゲーション技術の原理は、Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ ＬＬＣ（例えば、米国特許第７２５６２５３号明細書参照）によって例示的様式で記載されている。

【0047】

半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
好ましくは、半減期延長部分が半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）であり、より好ましくは、ＨＬＥＰがアルブミンまたはその断片、免疫グロブリン定常領域およびその部分、例えばＦｃ断片、大きな流体力学体積を有する溶媒和ランダム鎖（例えば、ＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら２００９；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６〜１１９０）、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）またはプロリンアラニンセリンリピート（ＰＡＳ）、アファミン（ａｆａｍｉｎ）、α−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリンまたはその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、生理条件下でアルブミンまたは免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチドまたは脂質から選択される。

【0048】

本明細書で使用される「半減期増強ポリペプチド」は、好ましくは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、免疫グロブリンＧの定常領域およびその断片、生理条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバーおよび免疫グロブリン定常領域の一部に結合することができる領域およびポリペプチドからなる群から選択される。これは、本明細書に記載される全長半減期増強タンパク質（例えば、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバーまたは免疫グロブリンＧの定常領域）あるいは凝固因子の治療活性または生物学的活性を安定化または延長することができるその１つまたは複数の断片であり得る。ＨＬＥＰ断片がＨＬＥＰなしのそれぞれのポリペプチドと比較して少なくとも２５％の機能的半減期延長を提供する限り、このような断片は１０以上のアミノ酸長であってもよく、または少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、もしくはそれ以上の連続のＨＬＥＰ配列からのアミノ酸を含んでもよく、またはそれぞれのＨＬＥＰの特定のドメインの一部または全部を含んでもよい。

【0049】

本発明のポリペプチドのＨＬＥＰ部分は、野生型ＨＬＥＰの変異体であってもよい。「変異体」という用語は、保存的または非保存的のいずれかの挿入、欠失および置換を含み、このような変化は切断されたＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合活性を実質的に変化させない。

【0050】

特に、本発明の提案されるＶＷＦ ＨＬＥＰ融合構築物は、ＨＬＥＰの天然多型変異体およびＨＬＥＰの断片を含み得る。ＨＬＥＰは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジまたはブタに由来し得る。非哺乳動物ＨＬＥＰには、それだけに限らないが、メンドリおよびサケが含まれる。

【0051】

一実施形態では、ポリペプチドが以下の構造を有する：
ｍＶＷＦ−Ｌ１−Ｈ、［式１］
（式中、ｍＶＷＦは改変ＶＷＦであり、Ｌ１は化学結合またはリンカー配列であり、ＨはＨＬＥＰである）。

【0052】

Ｌ１は、互いに等しくても異なっていてもよい１個または複数のアミノ酸、例えば１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５または１〜３（例えば、１、２もしくは３）個のアミノ酸からなる化学結合またはリンカー配列であり得る。通常、リンカー配列は野生型ＶＷＦの対応する位置には存在しない。Ｌ１に存在する適切なアミノ酸の例としては、ＧｌｙおよびＳｅｒが挙げられる。リンカーは非免疫原性であるべきであり、切断不能なリンカーであっても、切断可能なリンカーであってもよい。切断不能なリンカーは、国際公開第２００７／０９０５８４号パンフレットに例示されるように、交互のグリシンおよびセリン残基で構成され得る。本発明の別の実施形態では、切断されたＶＷＦ部分とアルブミン部分との間のペプチドリンカーが、ヒトタンパク質の天然のドメイン間リンカーとして働くペプチド配列からなる。好ましくは、その自然の環境におけるこのようなペプチド配列は、この配列に対する自然な耐性を想定することができるように、タンパク質表面に近接して位置し、免疫系に接近可能である。例は国際公開第２００７／０９０５８４号パンフレットに示されている。切断可能なリンカー配列は、例えば国際公開第２０１３／１２０９３９号パンフレットに記載されている。

【0053】

好ましいＨＬＥＰ配列は以下に記載される。同様に、それぞれのＨＬＥＰの正確な「Ｎ末端アミノ酸」もしくは正確な「Ｃ末端アミノ酸」との融合体、またはＨＬＥＰの１個もしくは複数のアミノ酸のＮ末端欠失を含むそれぞれのＨＬＥＰの「Ｎ末端部分」もしくは「Ｃ末端部分」との融合体も本発明に包含される。ポリペプチドは２つ以上のＨＬＥＰ配列、例えば２つまたは３つのＨＬＥＰ配列を含み得る。これらの複数のＨＬＥＰ配列を、直列に、例えば逐次反復としてＶＷＦのＣ末端部分に融合することができる。

【0054】

ＨＬＥＰとしてのアルブミン
「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）および「ヒトアルブミン」（ＨＡ）および「アルブミン」（ＡＬＢ）という用語は、本出願において互換的に使用される。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語はより広く、ヒト血清アルブミン（およびその断片および変異体）ならびに他の種のアルブミン（およびその断片および変異体）を包含する。

【0055】

本明細書で使用される場合、「アルブミン」は、アルブミンの１つまたは複数の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有する、アルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変異体を総称する。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンもしくはその断片、特に本明細書中で配列番号１６として示されるヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子もしくはその断片の類似体もしくは変異体を指す。

【0056】

特に、本発明の提案されるポリペプチドは、ヒトアルブミンの天然および非天然の多型変異体ならびにヒトアルブミンの断片を含み得る。一般的に言うと、アルブミン断片または変異体は、少なくとも１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも４０アミノ酸長、最も好ましくは７０アミノ酸長超である。

【0057】

本発明の好ましい実施形態には、ＦｃＲｎ受容体への結合が増強された本発明のポリペプチドのＨＬＥＰとして使用されるアルブミン変異体が含まれる。このようなアルブミン変異体は、野生型アルブミンとの切断されたＶＷＦ融合体と比較して長い切断されたＶＷＦアルブミン変異体融合タンパク質の血漿半減期をもたらし得る。変異体には、その開示が相互参照により組み込まれる国際公開第２０１４０７２４８１号パンフレット、国際公開第２０１２１５０３１９号パンフレット、国際公開第２０１３１３５８９６号パンフレット、国際公開第２０１１１２４７１８号パンフレット、国際公開第２０１１０５１４８９号パンフレットおよび国際公開第２０１２０５９４８６号パンフレットに記載されるものが含まれる。

【0058】

本発明のポリペプチドのアルブミン部分は、ＨＡまたはその保存的改変の少なくとも１つのサブドメインまたはドメインを含み得る。

【0059】

ＨＬＥＰとしての免疫グロブリン
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）は、治療用タンパク質の半減期を増加させることが当技術分野において知られている（Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ Ａら２００６、ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０：１５１〜１６０）。重鎖のＩｇＧ定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３）およびヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、任意の哺乳動物由来、またはそれぞれサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４由来であり得る。抗原結合ドメインを含まないＩｇＧおよびＩｇＧ断片もＨＬＥＰとして使用され得る。治療用ポリペプチド部分は、好ましくは切断可能でさえあり得る抗体のヒンジ領域またはペプチドリンカーを介してＩｇＧまたはＩｇＧ断片に連結される。いくつかの特許および特許出願は、治療用タンパク質のインビボ半減期を増強するための治療用タンパク質と免疫グロブリン定常領域の融合を記載している。米国特許出願公開第２００４／００８７７７８号明細書および国際公開第２００５／００１０２５号パンフレットは、インビボで迅速に排除される、Ｆｃドメインまたは免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部と、ペプチドの半減期を増加させる生物学的に活性なペプチドの融合タンパク質を記載している。生物学的活性増強、循環半減期の延長およびより高い溶解度を達成したＦｃ−ＩＦＮ−β融合タンパク質が記載された（国際公開第２００６／０００４４８号パンフレット）。血清半減期が延長し、インビボ効力が増加したＦｃ−ＥＰＯタンパク質（国際公開第２００５／０６３８０８号パンフレット）、ならびに全て半減期増強特性を有するＧ−ＣＳＦ（国際公開第２００３／０７６５６７号パンフレット）、グルカゴン様ペプチド−１（国際公開第２００５／０００８９２号パンフレット）、凝固因子（国際公開第２００４／１０１７４０号パンフレット）およびインターロイキン−１０（米国特許第６４０３０７７号明細書）とのＦｃ融合体が開示された。

【0060】

本発明により使用することができる種々のＨＬＥＰは、その開示が相互参照により本明細書に含まれる国際公開第２０１３／１２０９３９号パンフレットに詳細に記載されている。

【0061】

リンカー配列
本発明によると、治療用ポリペプチド部分を、ペプチドリンカーによってＨＬＥＰ部分に結合させることができる。リンカーは非免疫原性であるべきであり、切断不能なリンカーであっても、切断可能なリンカーであってもよい。

【0062】

切断不能なリンカーは、国際公開第２００７／０９０５８４号パンフレットに例示されるように、交互のグリシンおよびセリン残基で構成され得る。

【0063】

本発明の別の実施形態では、ＶＷＦ部分とアルブミン部分との間のペプチドリンカーが、ヒトタンパク質の天然のドメイン間リンカーとして働くペプチド配列からなる。好ましくは、その自然の環境におけるこのようなペプチド配列は、この配列に対する自然な耐性を想定することができるように、タンパク質表面に近接して位置し、免疫系に接近可能である。例は国際公開第２００７／０９０５８４号パンフレットに示されている。

【0064】

切断可能なリンカーは、プロテアーゼによる切断を可能にするのに十分に柔軟でなければならない。好ましい実施形態では、融合タンパク質が改変ＦＶＩＩＩである場合、リンカーの切断が融合タンパク質内のＦＶＩＩＩの活性化と同程度に速く進行する。

【0065】

切断可能なリンカーは、好ましくは、
（ａ）治療用ポリペプチドの活性化の間にタンパク質分解的に切断されるタンパク質分解性切断部位を含む場合、投与される治療用ポリペプチド自体、
（ｂ）治療用ポリペプチドの関与により活性化もしくは形成されるプロテアーゼによって切断される基質ポリペプチド、または
（ｃ）凝固もしくは線維素溶解に関与するポリペプチド
に由来する配列を含む。

【0066】

より好ましい実施形態では、リンカー領域が、発現された融合タンパク質の新生抗原特性のリスクを低下させるはずであるＶＷＦの配列を含む。

【0067】

リンカーペプチドは、好ましくは凝固系のプロテアーゼ、例えばＦＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａおよびＦＶＩＩａによって切断可能である。

【0068】

治療用ポリペプチド、切断可能なリンカーおよびＨＬＥＰの代表的な組合せには、国際公開第２００７／０９０５８４号パンフレット（例えば表２および図４）および国際公開第２００７／１４４１７３号パンフレット（例えば表３ａおよび３ｂ）に列挙される構築物が含まれるが、これらに限定されない。

【0069】

別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドと複合体化したＦＶＩＩＩの機能的半減期が、野生型ＶＷＦの機能的半減期もしくは野生型ＶＷＦと複合体化したＦＶＩＩＩの機能的半減期、または上で定義される参照ポリペプチドと比較して延長されている。増加は１５％以上、例えば少なくとも２０％または少なくとも５０％であり得る。また、このような機能的半減期値は、改変ＶＷＦまたはＦＶＩＩＩと改変ＶＷＦの複合体を投与した後に、前記哺乳動物から異なる時間間隔で採取された血液試料においてインビトロで測定することができる。

【0070】

本発明の別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドと複合体化したＦＶＩＩＩが、野生型ＶＷＦもしくは野生型ＶＷＦと複合体化したＦＶＩＩＩ、または上で定義される参照ポリペプチドと比較して改善されたインビボ回収率を示す。インビボ回収率は、例えば正常動物または血友病Ａの動物モデル、例えばＦＶＩＩＩノックアウトマウスにおいてインビボで決定することができ、対応する野生型ＶＷＦまたは上で定義される参照ポリペプチドと比較して、静脈内投与直後（５〜１０分）に循環中の抗原または活性アッセイによってＦＶＩＩＩの割合増加が見られると予想される。

【0071】

インビボ回収率は、好ましくは、野生型ＶＷＦと複合体化したＦＶＩＩＩまたは上で定義される参照ポリペプチドと比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％増加する。

【0072】

ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本出願に記載されているように、改変ＶＷＦまたは前記改変ＶＷＦを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。「１個または複数のポリヌクレオチド」という用語は、一般に、未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡであり得る。本明細書で使用される場合、「１個または複数のポリヌクレオチド」という用語はまた、１個または複数の改変塩基および／または異常塩基（イノシンなど）を含むＤＮＡまたはＲＮＡも含む。当業者に公知の多くの有用な目的を果たす種々の改変をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができることが認識されるであろう。「１個または複数のポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に改変された形態、ならびに例えば単純および複雑な細胞を含むウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。

【0073】

当業者であれば、遺伝暗号の縮重のために、所与のポリペプチドが異なるポリヌクレオチドによってコードされ得ることを理解するであろう。これらの「変異体」は、本発明に包含される。

【0074】

好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。「単離された」ポリヌクレオチドという用語は、それだけに限らないが、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡなどの他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを指す。単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製され得る。当業者に公知の慣用的な核酸精製方法を使用して、単離されたポリヌクレオチドを得ることができる。この用語は、組換えポリヌクレオチドおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドも含む。

【0075】

本発明はさらに、本発明の改変ＶＷＦまたは改変ＶＷＦを含む本発明のポリペプチドを共にコードするポリヌクレオチドの群に関する。群中の第１のポリヌクレオチドは、改変ＶＷＦのＮ末端部分をコードし得、第２のポリヌクレオチドは、改変ＶＷＦのＣ末端部分をコードし得る。

【0076】

本発明のさらに別の態様は、本発明によるポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターである。好ましくは、プラスミドまたはベクターが発現ベクターである。特定の実施形態では、ベクターが、ヒト遺伝子治療に使用するための導入ベクターである。

【0077】

本発明はまた、上記のポリヌクレオチド群を含むプラスミドまたはベクターの群に関する。第１のプラスミドまたはベクターは前記第１のポリヌクレオチドを含み得、第２のプラスミドまたはベクターは前記第２のポリヌクレオチドを含み得る。あるいは、２つの別個のプロモーター配列または１つのプロモーターおよび成熟ＶＷＦの産生を増強するために例えばフリンの発現を指示するために使用され得る配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して、両方のコード配列を１つの発現ベクターにクローニングする。

【0078】

本発明のさらに別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、プラスミドまたはベクター、あるいは本明細書に記載されるポリヌクレオチドの群またはプラスミドもしくはベクターの群を含む宿主細胞である。

【0079】

本発明の宿主細胞は、本発明の一部である、改変ＶＷＦまたは前記改変ＶＷＦを含むポリペプチドを生成する方法に使用することができる。この方法は、
（ａ）本発明の宿主細胞を、所望の改変タンパク質が発現されるような条件下で培養するステップと；
（ｂ）場合により、所望の改変タンパク質を宿主細胞または培養培地から回収するステップと
を含む。

【0080】

本発明の改変ＶＷＦまたは改変ＶＷＦを含むポリペプチドを８０％以上の純度、より好ましくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、混入している巨大分子、特に他のタンパク質および核酸に関して９９．９％超の純度であり、感染性および発熱性物質を含まない薬学的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、本発明の単離もしくは精製された改変ＶＷＦまたは本発明のポリペプチドは、他の非関連ポリペプチドを実質的に含まない。

【0081】

本発明の種々の生成物は医薬品として有用である。したがって、本発明は、本明細書に記載される改変ＶＷＦもしくは前記改変ＶＷＦを含むポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のプラスミドもしくはベクターを含む医薬組成物に関する。

【0082】

本発明はまた、血友病ＡもしくはＢまたはＶＷＤなどの血液凝固障害を患っている個体を治療する方法に関する。本方法は、有効量の本明細書に記載される（ｉ）ＦＶＩＩＩおよび改変ＶＷＦもしくは改変ＶＷＦを含むポリペプチドまたは（ｉｉ）ＦＶＩＩＩと改変ＶＷＦの複合体、または（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩと改変ＶＷＦを含むポリペプチドの複合体を前記個体に投与するステップを含む。別の実施形態では、本方法は、有効量の本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のプラスミドもしくはベクターを個体に投与するステップを含む。あるいは、本方法は、有効量の本明細書に記載される本発明の宿主細胞を個体に投与するステップを含み得る。

【0083】

改変ポリペプチドの発現
適切な宿主細胞中での高レベルでの組換え突然変異タンパク質の生成には、上記改変ポリヌクレオチド、典型的にはｃＤＮＡの、当業者に公知の方法により種々の発現系で増殖させることができる組換え発現ベクター中での適切な調節エレメントと合わせた効率的な転写単位への組み立てが必要である。効率的な転写調節エレメントは、それらの天然宿主としての動物細胞を有するウイルスから、または動物細胞の染色体ＤＮＡから誘導され得る。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルスもしくはラウス肉腫ウイルスの長い末端反復に由来するプロモーター−エンハンサーの組合せ、またはβ−アクチンもしくはＧＲＰ７８などの動物細胞における強力に構成的に転写される遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組合せを使用することができる。ｃＤＮＡから転写される安定な高レベルのｍＲＮＡを達成するために、転写単位は、その３’近位部分に、転写終止ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含むべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス４０初期転写領域、ウサギβグロビン遺伝子、またはヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子に由来する。

【0084】

次いで、ｃＤＮＡを改変ＦＶＩＩＩおよび／またはＶＷＦタンパク質の発現のための適切な宿主細胞株のゲノムに組み込む。好ましくは、正しい折り畳み、ジスルフィド結合形成、アスパラギン結合グリコシル化および他の翻訳後修飾ならびに培養培地への分泌を確実にするために、この細胞株は脊椎動物起源の動物細胞株であるべきである。他の翻訳後修飾の例は、新生ポリペプチド鎖のチロシンＯ−硫酸化およびタンパク質分解プロセシングである。使用することができる細胞株の例は、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胚腎臓２９３細胞およびハムスターＣＨＯ細胞である。

【0085】

対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターを、いくつかの異なる方法で動物細胞株に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターを、異なる動物ウイルスに基づくベクターから作製することができる。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、好ましくはウシパピローマウイルスに基づくベクターである。

【0086】

対応するＤＮＡをコードする転写単位を、組換えＤＮＡをそのゲノムに組み込んだ特定の細胞クローンの単離を容易にするために、これらの細胞において優性選択マーカーとして機能し得る別の組換え遺伝子と共に動物細胞に導入することもできる。このタイプの優性選択マーカー遺伝子の例は、ゲンタマイシン耐性（Ｇ４１８）を付与するＴｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびピューロマイシン耐性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、所望のタンパク質のｃＤＮＡをコードするベクターと同じベクター上に存在することができる、または宿主細胞のゲノムに同時に導入され、組み込まれる別個のベクター上にコードされ、しばしば異なる転写単位間の緊密な物理的結合をもたらし得る。

【0087】

所望のタンパク質のｃＤＮＡと共に使用することができる他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする種々の転写単位に基づく。内因性ｄｈｆｒ活性を欠く細胞、好ましくはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）にこのタイプの遺伝子を導入した後、これらをヌクレオシド欠損培地で増殖させることが可能である。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含まないＨａｍ’ｓ Ｆ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子を、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ転写単位と共に、同じベクター上または異なるベクター上に連結された上記のタイプのＣＨＯ細胞に導入し、組換えタンパク質を産生するｄｈｆｒ陽性細胞株を作製することができる。

【0088】

上記細胞株を細胞傷害性ｄｈｆｒ阻害剤メトトレキサートの存在下で増殖させると、メトトレキサートに耐性のある新しい細胞株が出現するだろう。これらの細胞株は、増幅した数の連結ｄｈｆｒおよび所望のタンパク質の転写単位のために、増加した速度で組換えタンパク質を産生し得る。これらの細胞株を増加する濃度のメトトレキサート（１〜１００００ｎＭ）で増殖させると、非常に高い速度で所望のタンパク質を産生する新しい細胞株を得ることができる。

【0089】

所望のタンパク質を産生する上記の細胞株を、懸濁培養または種々の固体支持体のいずれかで大規模に増殖させることができる。これらの支持体の例は、デキストランもしくはコラーゲンマトリックスに基づくマイクロキャリア、または中空繊維もしくは種々のセラミック材料の形態の固体支持体である。細胞懸濁培養またはマイクロキャリア上で増殖させる場合、上記細胞株の培養を、槽培養として、または長期間にわたる馴化培地の連続生産による灌流培養として行うことができる。したがって、本発明によると、上記細胞株は、所望の組換え突然変異タンパク質を生成するための工業プロセスの開発に非常に適している。

【0090】

精製および製剤
上記のタイプの分泌細胞の培地中に蓄積する組換え改変ＶＷＦタンパク質を、細胞培養培地中の所望のタンパク質と他の物質との間のサイズ、電荷、疎水性、溶解性、特異的親和性等の差異を利用する方法を含む種々の生化学的およびクロマトグラフィー方法によって濃縮および精製することができる。

【0091】

このような精製の一例は、組換え突然変異タンパク質のモノクローナル抗体への、例えば、ＨＬＥＰ、好ましくはヒトアルブミンに向けられた、または固体支持体上に固定化されたそれぞれの凝固因子に向けられた吸着である。改変ＶＷＦの支持体への吸着、洗浄および脱着の後、タンパク質を、上記の特性に基づいて種々のクロマトグラフィー技術によってさらに精製することができる。

【0092】

精製ステップの順序は、例えば、ステップの能力および選択性、支持体の安定性または他の側面によって選択される。好ましい精製ステップには、それだけに限らないが、イオン交換クロマトグラフィーステップ、免疫アフィニティークロマトグラフィーステップ、アフィニティークロマトグラフィーステップ、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ、色素クロマトグラフィーステップ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップ、マルチモードクロマトグラフィー（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ステップおよびサイズ排除クロマトグラフィーステップが含まれる。

【0093】

ウイルス汚染の理論上のリスクを最小化するために、ウイルスの有効な不活性化または排除を提供する追加のステップをプロセスに含めることができる。このようなステップは、例えば、液体または固体状態での熱処理、溶媒および／または界面活性剤による処理、可視またはＵＶスペクトルの放射線、γ線照射、あるいはナノ濾過である。

【0094】

本発明の改変ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を、ヒト遺伝子治療における使用のための導入ベクターに組み込んでもよい。

【0095】

本明細書に記載される種々の実施形態を互いに組み合わせることができる。本発明をその以下の例においてさらに詳細に記載する。本発明の特定の実施形態のこの説明は、添付の図面と関連して行う。

【0096】

本発明に記載される改変ＶＷＦを、治療的使用のために医薬製剤に製剤化することができる。精製タンパク質を、慣用的な生理学的に適合性の水性緩衝液に溶解してもよく、場合により、これに医薬賦形剤を添加して医薬製剤を得てもよい。

【0097】

このような医薬担体および賦形剤、ならびに適切な医薬製剤は、当技術分野で周知である（例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｆｒｏｋｊａｅｒら、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）または「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ｋｉｂｂｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００）参照）。標準的な医薬製剤技術は、当業者に周知である（例えば、２００５ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ、２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｌｉｐｓｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ編：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２０００参照）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含む医薬組成物は、凍結乾燥形態または安定な液体形態に製剤化され得る。ポリペプチド変異体は、当技術分野で公知の種々の手順によって凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は、注射のための滅菌水または滅菌生理食塩水などの１種または複数の薬学的に許容される希釈剤の添加によって、使用前に再構成される。

【0098】

組成物の製剤は、任意の薬学的に適切な投与手段によって個体に送達される。種々の送達系が知られており、任意の簡便な経路によって組成物を投与するために使用することができる。好ましくは、本発明の組成物を全身投与する。全身的使用のために、本発明のタンパク質を、慣用的な方法によって非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内もしくは経皮）または経腸（例えば、経口、膣もしくは直腸）送達用に製剤化する。最も優先的な投与経路は、静脈内投与および皮下投与である。製剤は、注入またはボーラス注射によって連続的に投与することができる。いくつかの製剤は徐放系を包含する。

【0099】

本発明のタンパク質は、治療上有効用量（耐え難い有害な副作用を生じる用量に達することなく治療される状態または適応症の重症度または広がりを予防または軽減しながら、所望の効果を生じるのに十分な用量を意味する）で患者に投与される。正確な用量は、例えば製剤および投与様式などの多くの因子に依存し、それぞれの適応症についての前臨床試験および臨床試験で決定されなければならない。

【0100】

本発明の医薬組成物は、単独で、または他の治療剤と併せて投与することができる。これらの薬剤を同じ医薬品の一部として組み込むことができる。このような薬剤の一例は、改変ＶＷＦとＦＶＩＩＩの組合せである。

【0101】

本明細書で言及される配列の要約を表２に示す。

【表2】

【0102】

例
例１
改善されたＦＶＩＩＩ結合を有するｖＷＦ突然変異体
背景
上および同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２０１５／０５０３６９に論じられるように、循環ＦＶＩＩＩの大部分はＶＷＦとの複合体である。ヒトでは、ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦの非存在下および存在下でそれぞれ約２時間および１６時間のｔ１／２で血液から除去される。ＶＷＦはＦＶＩＩＩ半減期の増加をもたらすが、これはまた自身の半減期によって指示されるｔ１／２に上限を設定する。米国特許第８５７５１０４号明細書は、ＶＷＦ−アルブミン融合タンパク質を開示している。この融合タンパク質は、げっ歯類モデルにおいて野生型ＶＷＦよりも５倍長い半減期を有する。この融合タンパク質とＦＶＩＩＩの間の安定した複合体は、ＦＶＩＩＩに追加の半減期利益を与えることができる。ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ相互作用の平衡結合定数は高いが、結合速度論が迅速であり、ＶＷＦ−アルブミン融合タンパク質との複合体中のＦＶＩＩＩは、注入時に内因性ｖＷＦと迅速に交換する。したがって、ＦＶＩＩＩとＶＷＦ−アルブミン融合体の解離速度が、ＦＶＩＩＩと天然ＶＷＦの解離速度と実質的に同等である場合、ＶＷＦ−アルブミン融合体の使用は、ＦＶＩＩＩの半減期の実質的な増加をもたらさない。

【0103】

したがって、ＶＷＦ−アルブミン融合体のより長い半減期を利用してＦＶＩＩＩの半減期を延長させるためには、ＦＶＩＩＩとＶＷＦ−アルブミン融合体の解離速度を低下させることが必要である。ＶＷＦレベルが正常であるがＶＷＦがＦＶＩＩＩと会合する能力がひどく低下している２Ｎフォン・ヴィレブランド病の患者で行われた測定を利用したモデリング研究から、ＦＶＩＩＩ半減期の臨床的に関連する改善を提供するためには少なくとも５倍の解離速度の低下が要求されると推定されている。ＦＶＩＩＩ ＶＷＦ−アルブミン融合体解離速度の低下とＦＶＩＩＩ半減期の増加との間の仮定される関係を表３に示す。

【表3】

【0104】

ＦＶＩＩＩ ＶＷＦ−アルブミン融合体解離速度を低下させる努力において、突然変異ＶＷＦ−アルブミン融合タンパク質が有意に遅いＦＶＩＩＩ解離速度を提供し、それによってＶＷＦ−アルブミン融合タンパク質との安定な会合を通してＦＶＩＩＩの半減期を延長させる実行可能な選択肢を提供することができるかどうかを評価するための実験を行った。

【0105】

ＰＣＴ／ＡＵ２０１５／０５０３６９に記載されている研究の延長において、Ｄ３ドメインの改変に重点を置いて、さらなる突然変異および突然変異の組合せを調査した。これらの実験では、組換え型のＦＶＩＩＩを使用した。このＦＶＩＩＩは、Ｚｏｌｌｎｅｒら、２０１３、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３２：２８０〜２８７に記載されている。

【0106】

方法
ヒトフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；アミノ酸（ａａ）７６４〜１２４２（配列番号２）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５４３に基づく）のＤ’およびＤ３ドメインをコードする合成コドン最適化ｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＡＲＴ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｅｒｇ、ドイツ）から得た。これを、グリシンセリンリンカーを介して自身のシグナルペプチド（ａａ１〜２２）をコードするために５’末端でおよびヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）をコードするために３’末端で改変した。開始メチオニンの上流にＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＧＣＣＡＣＣ）およびオープンリーディングフレームの３’末端にダブル終止コドン（ＴＧＡ）を有するｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に構築物（Ｈｕ−ｖＷＦ［７６４−１２７０］−ＨＳＡ）を指向的にクローニングし、プラスミド配列を自動配列決定により確認した。次いで、この発現プラスミドを鋳型として使用して、標準的なＰＣＲ技術を用いて一重、二重または三重残基変化を生じさせ、構築物をｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、上記のように配列決定した。Ｃ末端ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を有するＨｕ−ｖＷＦのＤ１およびＤ２ドメイン（ａａ１〜７６２）をコードする第２のコドン最適化ｃＤＮＡも合成し、ＧｅｎｅＡｒｔから得た；これを上記のようにｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、配列決定した。

【0107】

一過的哺乳動物発現のために、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ＴＭ ２９３懸濁細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５ｍｌ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１．１×１０^６細胞／ｍｌまで増殖させた。２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬７μＬを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１６７μＬと５分間プレインキュベートし、次いで、野生型／突然変異体Ｈｕ−ｖＷＦ［７６４−１２４２］−ＨＳＡをコードするプラスミドＤＮＡ２．５μｇとＨｕ−ｖＷＦ［１−７６２］−ＦＬＡＧをコードするプラスミドＤＮＡ２．５μｇに添加し、混合物をさらに２０分間インキュベートした。ＤＮＡ−２９３Ｆｅｃｔｉｎ複合体を、２５０ｒｐｍの振盪インキュベーター内で３７℃、８％ＣＯ_２で６日間培養した細胞に添加した。培養上清を２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって回収し、分析のために４℃で保存した。

【0108】

マウス抗ＨＳＡ抗体を、標準ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング化学を用いてＣＭ５チップ上に固定化した。典型的には、固定化レベルは約１４０００ＲＵであった。ｖＷＦ−ＨＳＡの各突然変異体を、０．１〜１μｇ／ｍｌに及ぶ種々の濃度で２分間、各フローセル内の単一スポット上に捕捉した。捕捉レベルは１００〜２００ＲＵに及んだ。抗ＨＳＡが固定化されているが、ｖＷＦ−ＨＳＡが捕捉されていない隣接スポットを参照として使用した。捕捉は、ＦＶＩＩＩ結合分析の前にサイクル毎に行った。

【0109】

最初の実験を、中性ｐＨで設定して、上位親和性および解離速度が改善したｖＷＦ−ＨＳＡ突然変異体についての一連の突然変異をスクリーニングした。第ＶＩＩＩ因子を、５、１および１．２５ｎＭで使用中の全てのスポットおよび全てのフローセル上で無作為に、二連で注入した。このスクリーニングの結果を表４に示す。

【表4】

【0110】

例２
詳細な動態解析
ｐＨ７での詳細な動態解析を対照を含む上位２つの候補物質について設定したその後の実験を精製物質を用いて行った。ｖＷＦ−ＨＡＳタンパク質を、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ヒトアルブミン親和性樹脂を用いて精製し、ｖＷＦ−ＨＡＳ二量体を調製物サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。次いで、精製物質を分析前に４℃で保存した。前と同様にｖＷＦ−ＨＡＳ二量体の捕捉を行い、次いで、第ＶＩＩＩ因子を１、０．５、０．２５、０．１２５および０．０６ｎＭで注射した。同様の様式で、対照を含む上位２つの候補物質についての詳細な動態解析をｐＨ５．５で設定し、第ＶＩＩＩ因子を相互作用に最も適した種々の濃度で注入した。

【0111】

全ての実験を通して、緩衝液ブランクも全ての捕捉タンパク質に注入した。第ＶＩＩＩ因子の会合および解離を、「スクリーニング」実験中にそれぞれ３分間監視した。ＣＳＬ６２７の会合を５分間監視し、解離を中性ｐＨでの「詳細な動態解析」実験の間に２０分間および６０分間監視した。ｐＨ５．５で、第ＶＩＩＩ因子の会合および解離を、相互作用に最も適した種々の時間枠で監視した。

【0112】

解離期間後、表面を２５ｍＭのグリシンｐＨ２．６の４５秒間の注入で再生した。泳動用緩衝液は、全体を通して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ７．３およびｐＨ５．５であり、流量は３０μｌ／分であった。各相互作用を３７℃で少なくとも２回（ｎ＝２）測定した。

【0113】

参照スポットへの結合に対する応答を、ｖＷＦ−ＨＳＡ捕捉スポットの応答から差し引いた。ブランク注入からの応答を、他の全ての試料の応答から差し引いて、二重参照センサーグラムを作成した。二重参照センサーグラムを、質量輸送制限の項を含む１：１動態モデルに適合させた。会合速度および解離速度を、包括的に適合させ、Ｒｍａｘを局所的に適合させた。結果を表５および表６に示し、図１〜図３に示す。

【表5】

【表6】

【0114】

例３
さらなる動態解析
簡単な方法：
ＨＡＳに融合した天然ｖＷＦ（Ｈｕ−ｖＷＦ［１−１２４２］−ＨＡＳ）のＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３領域をコードする単一ＤＮＳ構築物を用いて生成した上位候補タンパク質について、ｐＨ７およびｐＨ５．５でのさらに詳細な動態解析を設定するその後の実験を行った。これまでのように、この構築物を、一重、二重または三重残基変更を行うための鋳型として使用した。これまでのように、ｖＷＦ−ＨＡＳ二量体のトランスフェクションおよび精製を行った。

【0115】

マウス抗ＨＳＡ抗体を、標準ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング化学を用いてＣＭ５チップ上に固定化した。典型的には、固定化レベルは約１４０００ＲＵであった。Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡの各二量体突然変異体を、０．２〜０．７μｇ／ｍｌに及ぶ種々の濃度で２分間、各フローセル内の単一スポット上に捕捉した。捕捉レベルは５０〜２５０ＲＵに及んだ。抗ＨＳＡが固定化されているが、Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡが捕捉されていない隣接スポットを参照として使用した。捕捉は、ＦＶＩＩＩ（ＣＳＬ６２７）結合分析の前にサイクル毎に行った。

【0116】

ＣＳＬ６２７を、全てのフローセルの全てのスポット上で無作為に、二連で注入した。中性ｐＨで、ＣＳＬ６２７を１、０．５、０．２５、０．１２５および０．０６ｎＭで注入した。会合を５分間監視し、解離を２０分間、ならびに１ｎＭ濃度で１時間監視した。緩衝液ブランクも注入した。ｐＨ５．５で、ＣＳＬ６２７を、起こる相互作用に最も適した種々の濃度および時間枠で注入した。

【0117】

解離期間後、表面を２５ｍＭのグリシンｐＨ２．６の４５秒間の注入で再生した。泳動用緩衝液は、全体を通して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ７．３およびｐＨ５．５であり、流量は３０μｌ／分であった。各相互作用を３７℃で４回（ｎ＝４）測定した。

【0118】

参照スポットへの結合に対する応答を、ｖＷＦ−ＨＳＡ捕捉スポットの応答から差し引いた。ブランク注入からの応答を、他の全ての試料の応答から差し引いて、二重参照センサーグラムを作成した。二重参照センサーグラムを、質量輸送制限の項を含む１：１動態モデルに適合させた。会合速度および解離速度を、包括的に適合させ、Ｒｍａｘを局所的に適合させた。

【0119】

結果を表７および８ならびに図４および５に示す。

【表7】

【表8】

【0120】

例４
ＰＫ分析およびＦＶＩＩＩ半減期への影響
方法
Ｈｕ ｖＷＦ Ｄ’Ｄ３−ＦＰ Ｓ７６４Ｅ；Ｓ７６６Ｙ変異体を発現する安定なＣＨＯ由来細胞株を、標準的な実験方法を用いて作製した。材料を、１０Ｌバイオリアクターで安定な細胞株から作製し、ｖＷＦ Ｄ’Ｄ３−ＦＰ Ｓ７６４Ｅ；Ｓ７６６Ｙ二量体を前記のように精製した。

【0121】

野生型およびｖＷＦ Ｄ’Ｄ３−ＦＰ Ｓ７６４Ｅ；Ｓ７６６Ｙ変異体のＦＶＩＩＩレベルに対する相対的な影響を評価するために、ＣＤラット（３匹の動物／群）に、表９に示される用量で組換えＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇのＣＳＬ６２７）とｖＷＦ−ＦＰタンパク質の組合せを与えた。静脈内投与の０、３、８、２４、４８、５６および７２時間後に血漿試料を採取し、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＦＶＩＩＩ：Ａｇ ＥＬＩＳＡを用いてＦＶＩＩＩレベルを測定した。次いで、このデータを用いて、表９に示されるＦＶＩＩＩ半減期および平均滞留時間を決定した。

【表9】

【0122】

結論：
最初のスクリーニングから、突然変異：Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗ、Ｖ１０８３Ａ（ＰＷＡ突然変異体と呼ばれる）およびＳ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙ、Ｖ１０８３Ａ（ＧＹＡ突然変異体と呼ばれる）を有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡは、第ＶＩＩＩ因子に対して最も強い親和性および最も遅い解離速度を有するようであった。

【0123】

中性ｐＨでは、ＣＳＬ６２７（因子ＶＩＩＩ）に対する親和性および解離速度が最も改善されたｖＷＦ Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ突然変異二量体は、５ｐＭのＫＤおよび１０^−５ １／秒の解離速度を有するＳ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＧＹＡ）、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＥＹＡ）およびＳ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＹＡ）である。これは、野生型二量体と比較して、親和性が約２０倍改善され、解離速度が４０倍改善されている。

【0124】

酸性ｐＨでは、ＣＳＬ６２７に対する親和性および解離速度が最も改善されたｖＷＦ Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ突然変異体二量体は、５００ｐＭのＫＤおよび１０^−３１／秒の解離速度を有するＥＹＡであった。これに基づいて、ＥＹＡについての親和性および解離速度の改善は、野生型二量体と比較して、それぞれ約１００倍および少なくとも１０倍である。

【0125】

ＥＹＡ二量体は、中性ｐＨと酸性ｐＨの両方で、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉと同様の動態速度およびＣＳＬ６２７に対する親和性を有するようであった。

【配列表フリーテキスト】

【0126】

配列表５〜７、９〜１３、１７ ＜２２３＞ＶＷＦＰＲＴの改変Ｄ’−Ｄ３ドメイン
配列表１５ ＜２２３＞成熟一本鎖第ＶＩＩＩ因子

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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