特許 6755890 非特異的増幅産物を減少させる為の方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6755890

(24)【登録日】2020年8月28日

(45)【発行日】2020年9月16日

(54)【発明の名称】非特異的増幅産物を減少させる為の方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6844 20180101AFI20200907BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20200907BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6844 Z

   C12N15/09 Z

【請求項の数】14

【全頁数】66

(21)【出願番号】特願2017-560886(P2017-560886)

(86)(22)【出願日】2016年2月11日

(65)【公表番号】特表2018-506307(P2018-506307A)

(43)【公表日】2018年3月8日

(86)【国際出願番号】US2016017454

(87)【国際公開番号】WO2016130746

(87)【国際公開日】20160818

【審査請求日】2018年11月14日

(31)【優先権主張番号】62/114,788

(32)【優先日】2015年2月11日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/150,600

(32)【優先日】2015年4月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517281727

【氏名又は名称】パラゴン ゲノミクス，インク．

【氏名又は名称原語表記】ＰＡＲＡＧＯＮ ＧＥＮＯＭＩＣＳ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107364

【弁理士】

【氏名又は名称】斉藤 達也

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジートング

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００５／０９５６０５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／００１４６３４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Biotechniques, 2000, Vol. 28, No. 4, pp. 676-677, 680-681

【文献】 Appl. Environ. Microbiol., 2001, Vol. 67, No. 2, pp. 880-887

【文献】 Nucleic Acids Res., 2005, Vol. 33, No. 6, e58

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８４４

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
少なくとも１０対の標的特異的プライマーを含む複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅する工程であって、前記増幅工程は、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を生じさせる、工程；
異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを導入する工程；並びに
前記非特異的増幅産物をリゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程
を含み、
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちの一方である、方法。

【請求項2】

前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｃＤＮＡを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、異常なＤＮＡ構造を認識する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行った後に、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩのうちの少なくとも一方を含むエキソヌクレアーゼで前記非特異的増幅産物を切断する工程を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記リゾルバーゼを導入する前記工程の前に、前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記リゾルバーゼを導入する前記工程の後に、前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合に対してアダプターを連結させる工程を更に含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記リゾルバーゼで前記非特異的増幅産物を切断する前記工程は、前記非特異的増幅産物及び前記複数の標的特異的増幅産物を、約０．２Ｕ〜１０００Ｕのリゾルバーゼに対して、０．５分〜６０分、１６℃〜３７℃で曝露する工程を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合は、前記複数の標的特異的増幅産物の５０％超を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットであって、
前記キットは：
ポリメラーゼ；
少なくとも１０対の標的特異的プライマーを含む複数の標的特異的プライマー対；
増幅緩衝液；リゾルバーゼ緩衝液；
異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも１種のリゾルバーゼ；及び
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記リゾルバーゼを使用した増幅後に、増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の前記キットを使用するための説明書
を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本特許出願は：２０１５年２月１１日出願の米国仮特許出願第６２／１１４，７８８号「マルチプレックスＰＣＲにおいて非特異的増幅産物を排除する為の方法（Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）」、及び２０１５年４月２１日出願の米国仮特許出願第６２／１５０，６００号「非特異的増幅産物を減少させる為の方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｎｏｎ-Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」のそれぞれに対して優先権を主張する。各上記仮出願は、その全体において引用により本明細書に援用される。

【0002】

引用による援用
本明細書に記載の全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願それぞれが引用により援用されることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、それらの全体が引用により本明細書に援用される。

【0003】

本明細書に記載の方法、組成物、システム、及びキットは、ヌクレオチド配列の増幅に関する。特に、本明細書に記載の方法、組成物、システム、及びキットは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を含むマルチプレックスＰＣＲ中のように多数の異なるヌクレオチド領域を増幅する場合の、非特異的増幅産物（例えば、プライマーダイマー）の減少に関する。

【背景技術】

【0004】

ユニプレックスＰＣＲ（ｕｎｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）反応（以後、ユニプレックスＰＣＲと呼ぶ）では、反応は典型的には、鋳型ＤＮＡ、１つの増幅部位に隣接している２つのプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び緩衝液を含む。得られる増幅産物アンプリコンは、通常、１つ又は複数の標的ＤＮＡフラグメントである。時折生じる非特異的増幅産物は、通常は、アニーリング温度、マグネシウム濃度のようなＰＣＲ条件を細かく調整することにより、又はプライマーのよりストリンジェントな設計により除去される。

【0005】

マルチプレックスＰＣＲは、同じチューブ又はウェルの中で複数の標的ＤＮＡフラグメントを同時に増幅することをいう。これは、プライマーの２以上の対を一緒に入れることを伴う。実際の適用において、通常、数十〜数万の異なる種の標的ＤＮＡフラグメントが１つのチューブの中で同時に増幅されるとみられる。マルチプレックスＰＣＲは、異なるＤＮＡフラグメントが１つのチューブの中で一緒に増幅される必要がある場合に、ユニプレックスＰＣＲを上回る驚くほどの簡潔さ、処理量、及び経済的利点を提供する。これは、貴重な試料（例えば、臨床試料）を取り扱う際にもまた頻繁に使用される。

【0006】

マルチプレックスＰＣＲについては、ヒト、動物、穀類、及び植物における遺伝子及び微生物の検出及び臨床診断において、種の確認において、並びにより最近では、次世代シーケンシング（デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）シーケンシング及びターゲットリシーケンシングを含むがこれらに限定されるわけではない）用の試料及びライブラリーの調製において、すでに幅広い用途が見いだされている。遺伝子の試験及び診断においては、マルチプレックスＰＣＲは、一塩基多型（ＳＮＰ）、遺伝子型判定、コピー数のバリエーション、エピジェネティクス、遺伝子発現、及び突然変異のアッセイ、並びにハイブリダイゼーションアレイにおいて使用される。

【0007】

マルチプレックスＰＣＲには、典型的には、多数のプライマーを同一体積で特定の濃度で一緒に入れることが求められる。数千のプライマーが使用される場合は、これらのプライマーは、非常に多量に、例えば最大数マイクログラムまで蓄積される。マルチプレックスＰＣＲの難しさは、これらのプライマーが互いにアニーリングして、膨大な量の非特異的増幅産物の発生をもたらし得ることにある。これらの非特異的増幅産物は、通常は、標的フラグメントを検出不可能にするか、又は標的フラグメントの生産を単純に相殺する。

【0008】

これらの多量のプライマー及び生じるバックグラウンド「ノイズ」の問題にもかかわらず、マルチプレックスＰＣＲを実行可能にする為の現在の技術としては、以下を挙げることができる：非常に狭いパラメーターの範囲内でプライマーを特異的に設計すること、及び／又はエキゾチックマーカーを組み込むこと（例えば、特許文献１及び２は、チミジンをウリジンで置き換えることによるプライマーの修飾を記載しており、その結果、非特異的産物が、それらの長さに沿って散りばめられた多数のウリジンを含むプライマーの非特異的アニーリングにより主に形成され、これに基づいて非特異的産物を特異的に標的化できる）；プライマー−ダイマーの形成を妨げる又は減少させる為のオリゴヌクレオチドの使用（例えば、特許文献３を参照のこと）；並びにユニバーサルプライマーとの組み合わせにおいてブロックされるタグ化された標的特異的プライマー、及びブロック化プライマーを特異的に活性化する為のストラテジーの使用（例えば、特許文献４を参照のこと）。これらの技術の全てに相当な欠点があり、制限がある。

【0009】

例えば、プライマー設計に集中する、核酸増幅の際のプライマー−ダイマーのような人工物の形成を回避する又は減少させる為の方法は、増幅の際のプールの中の他のプライマーとの間で最小限の相互作用を示すと予想されるプライマー対を設計するように進行し、多くの場合はその為に専用のソフトウェアパッケージ（例えば、ディー・エヌ・エー・ソフトウェア社（ＤＮＡｓｏｆｔｗａｒｅ）のビジュアル・オー・エム・ピー（Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ）、マルチ・ピー・エル・エックス（ＭｕｌｔｉＰＬＸ）、エー・ビー・アイ社（ＡＢＩ）のプライマー・エクスプレス（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ）等）を利用する。そのようなソフトウェアの使用により、プライマーを、可能な限り標的特異的又はアンプリコン特異的となるように設計でき、多くの場合は、プライマーは、プライマー−プライマー相互作用、プライマー−ダイマーの形成及びスーパーアンプリコンを最小限にするようにサブセットにグループ化される。しかし、ストリンジェントな設計パラメーターは、同時に一緒に増幅できるアンプリコンの数を制限し、場合によっては、いくつかのアンプリコンの増幅を完全に妨げ得る。他の現在の方法には、増幅工程の際のプライマー人工物を最小限にする又は防ぐ為に、重複のないプールにプライマーを分離する為の多数のＰＣＲプライマープールの使用が必要である。他の方法としては、反応あたりの増幅産物の全体の収量を増大させる為の、多数のプライマープール、又はシングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅ ｐｌｅｘ）反応の使用が挙げられる。

【0010】

マルチプレックスＰＣＲ反応においては、各プライマー対は増幅反応において、限られた量のｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、及び他の試薬について、更なるプライマー対と競合する。プライマーは、ユニプレックスＰＣＲにおける長さより長く（２４〜３５塩基）、より高い融点（６５℃以上）及び５０〜６０％のＧＣ含量を持ち、全てのプライマーにまたがって類似する融点を維持し、３’末端の相補的配列及び３個以上のＧ又はＣの並びを回避するように設計され得る。プライマーの各対の特異性は、１つの標的フラグメントが増幅されることを確実にする為に、最初にユニプレックスＰＣＲにおいて確認される。プライマー対の濃度は、収量の均一性を確実にする為に、通常は、５０ｎＭから４００ｎＭまでに滴定される。プライマーは重複していないプールに分けられる。ｄＮＴＰＳ、マグネシウム、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの最適濃度が決定され、これらは通常は、ユニプレックスＰＣＲにおける濃度より高い。そして塩濃度もまた、増幅の特異性が最適となるように滴定される。最適化されたこれらのパラメーターを用いて、通常は２〜５の標的断片が同時にうまく増幅される。プライマーのコンピューターを利用した更なる設計により、同じチューブの中で約２０の標的フラグメントを同時に増幅する方法が市場で見られる。非特異的産物を減少させる又は排除することの難しさが原因で、日常的に行われる診断の実施においてはわずか数十の標的しか、現在は増幅されない。これらの方法は、プライマー及びＰＣＲ条件の慎重な設計を必要とし、一般的な診断用途についての標準法として使用できていない。

【0011】

マルチプレックスＰＣＲにおいて増幅される標的の数を拡大する為のおびただしい数のネストプライマー又は類似するストラテジーが報告されている。これらの方法は、非特異的産物の生成を緩和する場合があり、また、非特異的産物の生成を必ずしも常に緩和するのではない。加えて、更なるプライマー層、操作及び循環ストラテジーがこれらの方法において必要とされる。従って、これらの方法については限られた用途しか見いだされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】米国特許第８，５８６，３１０号

【特許文献2】米国特許第８，６７３，５６０号

【特許文献3】国際公開特許第２０１５０６３１５４号

【特許文献4】米国公開特許第２０１４０３２９２４５号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

従って、プライマーダイマーを含む人工物（非特異的増幅産物とも呼ばれる）の形成を回避するか又は最小限にしつつ、核酸分子の集団の中で多数の標的核酸分子の選択的増幅を可能にする、改良された方法、組成物、システム、装置、及びキットが必要である。人工物の形成を回避するか又は最小限にしつつ、ゲノムＤＮＡ及び／又はホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＤＮＡのような単一の核酸試料からの多数の標的核酸分子の選択的増幅を可能にする、改良された方法、組成物、システム、装置、及びキットもまた必要である。１つの反応において数千の標的特異的核酸分子の同時増幅を可能にする、任意の適用可能な下流のアッセイ又は分析において使用できる改良された方法、組成物、システム、及びキットもまた当該分野で必要である。本明細書に記載の方法、組成物、システム、及びキットは、上記で議論された課題及び制限に対処できる。

【課題を解決するための手段】

【0014】

一般に、本明細書に記載されるのは、鋳型依存性のプライマー伸張反応から非特異的増幅産物を減少させる為の方法、組成物、システム、及びキットである。これらの方法、組成物、システム、及びキットは、複数のプライマーが使用され得、非特異的ハイブリダイゼーション及び／又は増幅産物（いわゆる「プライマーダイマー」を含む）が生じ得る任意の反応において有用であり得る。例えば、本明細書に記載の方法、組成物、システム、及びキットは、マルチプレックスＰＣＲ及び次世代シーケンシングを伴う使用に特に十分に好適となり得る。

【0015】

本明細書に記載の方法、組成物、システム、及びキットは、リゾルバーゼ、並びに特に、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ及び／又はＴ７エンドヌクレアーゼＩを用いて、非特異的増幅産物を効率的に切断し、過剰量の複数のプライマー対（例えば、＞１０、＞１００、＞１０００、＞１０，０００等）が使用される増幅（例えば、マルチプレックス増幅）の間又は後に同じ反応混合物中の標的特異的増幅産物の実質的な割合を残すことができるという、新規かつ予想外の発見により生じる。いずれの特定の操作原理にも囚われず、本明細書に記載の方法、組成物、システム、及びキットは、これらが異常な部位（例えば、ホリデー構造（Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）若しくはジャンクション（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造（Ｙ-ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡ）を標的とするため、予想外に有効である。このような異常な部位は、マルチプレックス増幅における非特異的増幅産物の大部分の特徴であり、驚くべきことに、これらの異常な部位を標的とすることにより、標的特異的増幅産物のかなりの割合を完全なまま残しつつ、マルチプレックス増幅を有意に純粋なものとすることができる。

【0016】

例えば、鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法は、以下を含み得る：複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅する工程（ここでは、上記増幅工程は、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を生じさせる）；異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを導入し、上記非特異的増幅産物をリゾルバーゼで切断して、上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程。任意の適切なリゾルバーゼが使用され得る。特に、上記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちの一方であり得る。いくつかの例では、リゾルバーゼはＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである。

【0017】

例えば、鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法は、以下を含み得る：複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを上記混合物に導入し、上記複数の非特異的増幅産物をリゾルバーゼで切断して、上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程（ここでは、リゾルバーゼはＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちのである）；並びに上記切断された非特異的増幅産物を除去し、上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程。

【0018】

鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法は、以下を含み得る：複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを上記混合物に導入する工程（ここでは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩは上記非特異的増幅産物上の異常なＤＮＡ構造を認識する）；上記複数の非特異的増幅産物をＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩで切断して、上記複数の標的特異的増幅産物の５０％超を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程；並びに上記切断された非特異的増幅産物を除去し、上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程。

【0019】

これらの方法のうちのいずれにおいては、ポリヌクレオチドの増幅及びリゾルバーゼを使用した切断の後、ＤＮＡリガーゼが、特異的標的（及びそれに伴うものではない非特異的産物）上に負った任意のニックを埋める為に使用され得、１回以上のＰＣＲが標的を増幅させる為に行われる得る。そのような場合は、第１の複数の標的特異的プライマーの対が、第２のＰＣＲプライマーの配列の少なくとも一部を含有し得る。

【0020】

例えば、鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法は、以下を含み得る：複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを上記混合物に導入し、上記複数の非特異的増幅産物をリゾルバーゼで切断して、上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程（ここでは、リゾルバーゼはＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちの一方である）；上記切断された非特異的増幅産物を除去し、上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程；上記標的特異的増幅産物上のニックをＤＮＡリガーゼで修復する工程；並びに上記標的特異的増幅産物を再増幅する工程。

【0021】

これらの方法のうちのいずれでは、上記方法は、上記切断された非特異的増幅産物を除去し、上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程もまた含み得る。

【0022】

本明細書に記載の方法のうちのいずれは、上記標的特異的増幅産物を分析する工程を含み得る。上記分析工程は、次世代シーケンシング反応のようなシーケンシングを含むがこれに限定されない任意の適切な方法又は技術を含み得る。

【0023】

上記増幅は、任意の適切なポリヌクレオチド増幅技術（特に、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む）を含み得る。

【0024】

一般的には、上記標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）を含み得る。

【0025】

上記標的特異的プライマーは、１０対以上（例えば、少なくとも１０対）の標的特異的プライマー、１０対〜１００，０００対、１０対〜１０００対、１，０００対〜１００，０００対、１００，０００対超の標的特異的プライマーのような、任意の適切な複数の対を含み得る。

【0026】

本明細書に記載の方法のうちのいずれでは、リゾルバーゼが異常なポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構造を認識する。特に、リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む異常なポリヌクレオチド構造を認識する。

【0027】

これらの方法のうちのいずれは、上記リゾルバーゼの導入及び／又は上記リゾルバーゼでの処理の前又は後のいずれかに、上記複数の標的特異的増幅産物及び上記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を含み得る。例えば、本明細書に記載の方法のうちのいずれは、上記リゾルバーゼの導入前に、上記複数の標的特異的増幅産物及び上記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を含み得る。

【0028】

これらの方法のうちのいずれは、上記リゾルバーゼの導入後に、上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合に対してアダプターを連結させる工程を含み得る。上記アダプターは、少なくとも３個の連続するホスホロチオエートを含み得る。

【0029】

上述のように、これらの方法のうちのいずれは、上記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を含み得る。例えば、これらの方法のうちのいずれは、上記複数の標的特異的増幅産物及び上記複数の非特異的増幅産物上で末端修復及びアダプターの連結を行った後に、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩのうちの少なくとも一方を含むエキソヌクレアーゼで上記非特異的増幅産物を切断する工程を含み得る。

【0030】

リゾルバーゼでの処理は、任意の適切な条件（例えば、リゾルバーゼ濃度、処理時間、温度等）で行われ得る。一般的には、リゾルバーゼで上記非特異的増幅産物を切断する工程は、上記非特異的増幅産物及び上記複数の標的特異的増幅産物を、約０．２単位（Ｕ）〜１０００Ｕの１種以上のリゾルバーゼに対して、約０．５分〜６０分（例えば、０．５分間〜３０分間、２０分間、１５分間等）、１０℃〜４０℃（例えば、より詳細には１６℃〜３７℃）で曝露する工程を含み得る。

【0031】

本明細書に記載の方法のうちのいずれでは、リゾルバーゼ処理は、上記複数の標的特異的増幅産物の予め決定されたかなりの割合が上記混合物中で維持されるように滴定され得る。上記複数の標的特異的増幅産物の上記かなりの割合は、上記複数の標的特異的増幅産物の３０％以上（及び／又は３０％超）、４０％以上（及び／又は４０％超）、５０％以上（及び／又は５０％超）、６０％以上（及び／又は６０％超）、７０％以上（及び／又は７０％超）、８０％以上（及び／又は８０％超）、９０％以上（及び／又は９０％超）、９５％以上（及び／又は９５％超）を含み得る。このように、リゾルバーゼ反応が行われ得るが、上記標的特異的増幅産物の実質的な切断を防ぐ為に停止される。これは、上記で議論されたようなリゾルバーゼ処理条件を（例えば、約０．２単位（Ｕ）〜１０００Ｕの１種以上のリゾルバーゼに対して約０．５分〜６０分（例えば、０．５分間〜３０分間、２０分間、１５分間等）、１０℃〜４０℃（例えば、より詳細には１６℃〜３７℃）で）調節することにより調節され得る。適切なリゾルバーゼ緩衝液条件が、本明細書に記載のように使用され得る。

【0032】

本明細書に記載の方法のうちのいずれを実施する為のキットもまた本明細書に記載される。例えば、非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットは、以下を含み得る：ポリメラーゼ；複数の標的特異的プライマー対；増幅緩衝液；リゾルバーゼ緩衝液；異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも１種のリゾルバーゼ；及びリゾルバーゼを使用した増幅後に増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の上記キットの使用についての説明書。これらのキットのうちのいずれは、少なくとも１つの核酸アダプター（少なくとも３個のホスホロチオエートを含む少なくとも１つの核酸アダプターを含む）を含み得る。

【0033】

上記のように、キットの中の標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の標的特異的プライマー（１０以上、１００以上、１０００以上、１０，０００以上、１０〜１００，０００、１０〜１０，０００、１０〜１０００、１００〜１００，０００、１００〜１０，０００、１００〜１０００、１０００〜１００，０００、１０００〜１０，０００等）を含み得る。例えば、キットは、約１，０００〜約１００，０００の標的特異的プライマーを含み得る。いくつかのバリエーションでは、キットは１００，０００超の標的特異的プライマーを含む。

【0034】

キットは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む異常なポリヌクレオチド構造のような、異常なポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構造を認識する任意の適切なリゾルバーゼを含み得る。例えば、リゾルバーゼはＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩであり得る。

【0035】

本明細書に記載のキットのうちのいずれは、非特異的増幅産物の切断の為の１種以上のエキソヌクレアーゼもまた含み得る。例えば、キットは非特異的増幅産物を切断する為のエキソヌクレアーゼを含み得、ここでは、エキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩを含む。

【0036】

以下を含む、鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法もまた、本明細書に記載される：複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、上記非特異的増幅産物を除去する為に異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質に対して上記混合物を導入する工程（ここでは、上記異常なＤＮＡ構造は、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む）。

【0037】

特に、上記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合する上記タンパク質は、ＭｕｔＳであり得る。一般的には、上記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合する上記タンパク質は、基体に連結され得る。本明細書中で詳細に記載されるように、非特異的増幅産物を吸着するがそれを切断しないように使用される酵素は、異なる種由来の任意のＭｕｔＳ又はヒトエンドヌクレアーゼＶであり得る。好ましい酵素は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来のＭｕｔＳ、又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）及びサーマス・アクアチカス（Ｔ． ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＭｕｔＳとヒトエンドヌクレアーゼＶとの混合物である。

【0038】

上記のように、本明細書に記載の方法のうちのいずれは、例えば、シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング反応）により標的特異的増幅産物を分析する工程を含み得る。

【0039】

一般的には、増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する工程を含み得る。標的核酸はＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含み得る。標的核酸はゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである。任意の適切な数（例えば、１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００超等）の標的特異的プライマーが使用され得る。

【0040】

上記のように、本明細書に記載の方法のうちのいずれは、上記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質に対して、上記混合物を導入する上記工程の前に、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程もまた含み得る。これらの方法のうちのいずれは、上記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質の導入の後、上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合に対してアダプターを連結させる工程を含み得る。上記アダプターは少なくとも３個の連続するホスホロチオエートを含み得る。

【0041】

上記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質に対して、上記混合物を導入する上記工程は、上記非特異的増幅産物及び上記複数の標的特異的増幅産物を、約０．５分〜６０分（例えば、０．５分〜４０分、０．５分〜３０分、０．５分〜２０分等）、約１０℃〜４０℃（例えば、１５℃〜３７℃、２０℃〜４０℃等）のような、任意の適切な時間及びインキュベーション条件で、インキュベートする工程を含み得る。

【0042】

本明細書に記載のマルチプレックスＰＣＲのような増幅反応において非特異的増幅産物を減少させる方法は、増幅反応の任意の適切な構成を含み得、上記増幅反応は、複数のＤＮＡプライマーを利用する任意の反応であり得る。マルチプレックスＰＣＲ反応は当該分野で公知の任意のマルチプレックスＰＣＲであり得る。より具体的には、鋳型は任意の供給源に由来するＤＮＡであり得、任意の好熱性ＤＮＡポリメラーゼが使用され得、そして制限なく、任意の機能的なｐＨ、塩濃度、添加物、ｄＮＴＰの濃度、プライマー、並びに１０〜１００，０００（又はそれ以上）超の任意の数のプライマー対を利用できる。２〜３０超の任意の機能的であるサイクル数の増幅反応が、使用されるプライマー対の数に応じて、また利用され得る。いくつかの場合では、マルチプレックスＰＣＲのような増幅反応により生じた非特異的増幅産物は、本明細書に記載され、以下に更に詳細に記載される方法に従って及び／又はキットを使用して、増幅産物の全量を約０％〜約５０％減少させることができる。本明細書に詳細に記載されるように、非特異的増幅産物を切断する為に使用される酵素（「リゾルバーゼ」）は、定義された異常ＤＮＡ構造特異的酵素からの任意の１つであり得る。限定ではないが好ましい酵素はＴ７エンドヌクレアーゼＩ又はＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである。

【0043】

一般的には、リゾルバーゼは、異常なＤＮＡ構造を特異的に認識し、異常なＤＮＡ構造で又は異常なＤＮＡ構造の近くで切断する、酵素又は酵素全体である。従って、リゾルバーゼは、異常ＤＮＡ構造特異的酵素と呼ばれ得（本明細書中ではリゾルバーゼと総称的に呼ばれる）、ポリヌクレオチド上の異常なＤＮＡ構造で又はその近くで非特異的増幅産物を切断し得る。異常なＤＮＡ構造は、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は他の完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含み得る。これらは更に、一本鎖ＤＮＡフラグメントの３以上のストランドを含む構造を含み得る。これらは、有意な塩基対合を含まないプライマー又はプライマー−鋳型ＤＮＡの凝集体であり得る。好ましい異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ又はＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである。リゾルバーゼであり得る（又は、リゾルバーゼとして作用する酵素の混合物の一部として使用され得る）他の酵素としては、ホリデージャンクションリゾルバーゼ（Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｖａｓｅ）、Ｓｅｒリコンビナーゼ、Ｔｙｒリコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼＡ（ＲｅｃＡ）等を挙げることができる。これらのうちの以上（例えば、組み合わせ）が使用され得る。

【0044】

本明細書に詳細に記載されるように、酵素的切断後、切断された非特異的増幅産物は精製により（ＡＭＰｕｒｅビーズ又はカラム濾過のような大きさの選択を伴う任意の一般的な精製方法により）除去され得るか、又は除去されない場合もある。更に、そして本明細書に記載されるように、特異的増幅産物中のニックが、例えば、以下の酵素の任意の１つを使用して更に埋められ得る：９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ ＤＮＡリガーゼ、アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（登録商標）等。特にネストプライマーが増幅反応において使用される場合は、その後、特異的増幅産物が、ＰＣＲにより更に増幅され得る。

【0045】

更に、増幅後の酵素的切断前に、増幅産物は当業者に公知の方法により末端修復され得る。アダプターは、上記末端修復された特異的増幅産物の両方の末端に連結により付加され得る。使用されるリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと、以下のうちの１つとの組み合わせである：９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ ＤＮＡリガーゼ、アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（登録商標）等。アダプターは、３’又は５’末端のいずれかに、ホスホロチオエート若しくはビオチン、又はアダプターがエキソヌクレアーゼで消化されないようにする他の化学基若しくはタンパク質を含有し得る。アダプターの連結後、切断された非特異的増幅産物は、当業者に公知のエキソヌクレアーゼにより更に消化され得る。切断された非特異的増幅産物のエキソヌクレアーゼでの消化後、アダプターが連結された特異的増幅産物はＰＣＲにより更に増幅され得る。

【0046】

このように、非特異的増幅産物が減少した増幅反応を生じさせる方法が開示され、この方法は以下を含み得る：少なくとも１つの標的核酸を含む核酸試料を提供する工程；標的特異的プライマーを使用して、少なくとも１つの標的核酸を増幅する工程（ここでは、増幅により複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物が生じる）；並びに、複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じるように非特異的増幅産物を切断する為の異常ＤＮＡ構造特異的酵素を導入する工程。

【0047】

上述のように、これらの方法のうちのいずれは、上記切断された非特異的増幅産物を除去する工程を更に含み得る。異常ＤＮＡ構造特異的酵素（リゾルバーゼ）は、上記非特異的増幅産物を異常なＤＮＡ構造で切断し得る。上記異常なＤＮＡ構造は、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は他の完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含み得る。これらは、一本鎖ＤＮＡフラグメントの３以上のストランドを含む構造を更に含み得る。これらは、有意な塩基対合を持たないプライマー又はプライマー−鋳型ＤＮＡの凝集体であり得る。好ましい異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ又はＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである。

【0048】

本明細書に記載の方法は、上記切断された非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼと混合する工程を更に含み得る。エキソヌクレアーゼは、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩのうちの少なくとも一方であり得る。更に、この方法は、上記切断された非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼと混合する前に、上記標的特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼによる消化から保護する工程を含み得る。保護は、上記標的特異的増幅産物の両方の末端にアダプターを連結させることを含み得る。上記アダプターは少なくとも３個の連続するホスホロチオエートを含み得る。随意に、少なくとも３個の連続するホスホロチオエートは、３個、４個、５個、又は６個の連続するホスホロチオエートを含むことになる。更に、この方法は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより行われる連結工程を含み得る。更に、連結工程は、９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ ＤＮＡリガーゼ、又はアンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（登録商標）のうちの少なくとも１つを更に含み得る。

【0049】

上述のように、増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為のキットが記載される。上記キットは：少なくとも１つの異常ＤＮＡ構造特異的酵素（リゾルバーゼ）；緩衝液；及び上記増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の上記キットの使用についての説明書を含み得る。上記キットは、少なくとも１つの核酸アダプターを含み得る。上記少なくとも１つの核酸アダプターは、少なくとも３個のホスホロチオエートを含み得る。更に、上記少なくとも３個のホスホロチオエートは、３個、４個、５個、又は６個のホスホロチオエートを含み得る。上記少なくとも３個のホスホロチオエートは連続している場合がある。上記キットは更に、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する為の試薬を含み得、ここでは、上記試薬は、少なくとも緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、及び随意に、少なくとも１対の標的特異的プライマーを含む。上記少なくとも１対の標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の標的特異的プライマーを含み得る。更に、上記キットは、少なくとも１つのエキソヌクレアーゼを含み得る。上記少なくとも１つのエキソヌクレアーゼは、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩを含み得る。

【0050】

増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為のキットは：少なくとも１つのＤＮＡミスマッチ結合タンパク質（ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ-ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）；緩衝液；及び上記増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為のキットの使用についての説明書を含み得る。ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質は、例えば、ＭｕｔＳであり得る。

【0051】

増幅反応において非特異的増幅産物を減少させる際に使用される異常ＤＮＡ構造特異的酵素が、本明細書中で開示される。上記異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、異常なＤＮＡ構造の開始点の近傍で、又は異常なＤＮＡ構造の中で、非特異的増幅産物を切断し得る。上記異常なＤＮＡ構造は、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は他の完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含み得る。これらは、一本鎖ＤＮＡフラグメントの３以上のストランドを含む構造を更に含み得る。これらは、有意な塩基対合を持たないプライマー又はプライマー−鋳型ＤＮＡの凝集体であり得る。上記異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ又はＴ４エンドヌクレアーゼＶＩであり得る。

【0052】

本発明の新規の特徴は、以下の特許請求の範囲の中で詳細に示される。本発明の特徴及び利点の更なる理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の「発明を実施するための形態」、及び本発明の添付の図面を参照することにより得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】異常なポリヌクレオチド構造を有する非特異的増幅産物を切断することにより、マルチプレックスＰＣＲにおいて生じた非特異的産物を除去する為の本開示の方法の概略図である。

【図2】異常なポリヌクレオチド構造を有する非特異的増幅産物の吸着による、マルチプレックス増幅において生じた非特異的産物を除去する為の本開示の方法の別の例を示す図である。

【図3】マルチプレックス増幅反応により標的ポリヌクレオチド増幅産物を得る為の本開示の方法の別の例を説明する図である。

【図4】本明細書に記載のマルチプレックス増幅反応により標的ＤＮＡフラグメントを得る為の、別の可能性のある方法を示す図である。

【図5】マルチプレックス増幅反応により標的増幅産物を得る為の、本開示の代替的な方法を説明する図である。

【図6A】様々な処理パラメーター（例えば、３７℃で１０分間についてのリゾルバーゼの単位）でのリゾルバーゼ（この例ではＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ）の滴定の一例の結果を示すグラフである。

【図6B】図６Ａに示される滴定曲線と類似する滴定曲線において非特異的増幅産物の残留量を示すグラフである（ここでは、非特異的増幅産物は「プライマーダイマー」と呼ばれる）。

【図7A】様々な処理条件（３７℃で１Ｕ、５Ｕ、１０Ｕ）のリゾルバーゼ（この例では、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ）の時間経過を説明するグラフである。これは、マルチプレックス増幅反応混合物から非特異的増幅産物を除去する為の最適条件を見出す為に使用され得る。

【図7B】様々な処理条件（３７℃で１Ｕ、５Ｕ、１０Ｕ）のリゾルバーゼ（この例では、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ）の時間経過を説明するグラフである。これは、マルチプレックス増幅反応混合物から非特異的増幅産物を除去する為の最適条件を見出す為に使用され得る。

【図8A】非特異的増幅産物により生じる典型的なバックグラウンドを示しているマルチプレックス増幅反応の一例を説明する図である。この例では、非特異的増幅産物は所望される特異的増幅産物（「標的」）を圧倒する。

【図8B】非特異的増幅産物中の異常な部位を切断することにより非特異的増幅産物を選択的に除去する為に、リゾルバーゼ（例えば、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ）で処理することにより鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法の概略図である。

【図8C】非特異的増幅産物を選択的に除去する為に、リゾルバーゼで処理することにより非特異的増幅産物を減少させる方法の有効性を説明している例を示す図である。図８Ｃは、リゾルバーゼでの処理前の結果を示している。

【図8D】非特異的増幅産物を選択的に除去する為に、リゾルバーゼで処理することにより非特異的増幅産物を減少させる方法の有効性を説明している例を示す図である。図８Ｄは、処理後の結果を示しており、２０７対のプライマーを用いたマルチプレックス増幅反応において生じた非特異的増幅産物の除去を説明している。

【図9A】２０７対の長いプライマーを用いたマルチプレックス増幅反応において生じた非特異的増幅産物の除去の別の例を示す図である。図９Ａは、リゾルバーゼでの処理前の結果を説明している。

【図9B】２０７対の長いプライマーを用いたマルチプレックス増幅反応において生じた非特異的増幅産物の除去の別の例を示す図である。図９Ｂは、非特異的増幅産物の処理及び分解後の結果を示している。

【図10A】マルチプレックス増幅反応（この例では、２０７対のプライマーを使用している）から非特異的増幅産物を除去する為に、様々なＤＮＡポリメラーゼを本明細書に記載の方法と共に使用することを説明する図である。

【図10B】マルチプレックス増幅反応（この例では、２０７対のプライマーを使用している）から非特異的増幅産物を除去する為に、様々なＤＮＡポリメラーゼを本明細書に記載の方法と共に使用することを説明する図である。

【図10C】マルチプレックス増幅反応（この例では、２０７対のプライマーを使用している）から非特異的増幅産物を除去する為に、様々なＤＮＡポリメラーゼを本明細書に記載の方法と共に使用することを説明する図である。

【図10D】マルチプレックス増幅反応（この例では、２０７対のプライマーを使用している）から非特異的増幅産物を除去する為に、様々なＤＮＡポリメラーゼを本明細書に記載の方法と共に使用することを説明する図である。

【図10E】マルチプレックス増幅反応（この例では、２０７対のプライマーを使用している）から非特異的増幅産物を除去する為に、様々なＤＮＡポリメラーゼを本明細書に記載の方法と共に使用することを説明する図である。

【図10F】マルチプレックス増幅反応（この例では、２０７対のプライマーを使用している）から非特異的増幅産物を除去する為に、様々なＤＮＡポリメラーゼを本明細書に記載の方法と共に使用することを説明する図である。

【図11】標的アンプリコンの全収量に対するプライマー対の全濃度を増大させることの効果を説明しているグラフであり、全濃度が高ければ高いほど、高い収量が生じ、一方では、本明細書に記載の非特異的増幅産物を除去する為の方法により、なおも効率よく処理されることを示している。この例では、２０７対のプライマーが使用された。

【図12】本明細書に記載の非特異的増幅産物を除去する為の方法を伴うマルチプレックス増幅（ここでもまた２０７対のプライマーを使用している）についての、アニーリング及び伸張時間の効果を説明するグラフである。

【図13】２９１５対のプライマーを含むマルチプレックス増幅反応（ＰＣＲ）における、本明細書に記載の非特異的増幅産物を除去する為の方法の一例を説明する図である。

【図14】１６０００対のプライマーを含むマルチプレックス増幅反応（例えば、ＰＣＲ）における、本明細書に記載の非特異的増幅産物を除去する為の方法の別の例を示す図である。

【図15】ヒト乳癌由来のホルマリン固定化パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＤＮＡを使用した、２０７対のプライマーを用いたマルチプレックス増幅反応の一例を説明する図である。

【図16】以下に記載されるような２０７対のリン酸化されたプライマーを使用するマルチプレックス増幅の失敗した実験例の結果を説明する図である。

【図17】本明細書に記載されるようなマルチプレックス増幅及び非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼでの処理を使用した、ライブラリー（例えば、シーケンシング用）の作製の結果の一例を示す図である（この例では、２０７対のプライマーを使用している）。

【図18】本明細書に記載されるようなマルチプレックス増幅及び非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼでの処理を使用した、ライブラリー（例えば、シーケンシング用）の作製方法の別の例を説明する図である（この例では、２９１５対のプライマーを使用している）。

【図19】本明細書に記載されるようなマルチプレックス増幅及び非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼでの処理を使用した、ライブラリー（例えば、シーケンシング用）の作製方法の別の例を説明する図である（この例では、２０７対のプライマーを使用している）。

【図20】本明細書に記載されるようなマルチプレックス増幅及び非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼでの処理を使用したライブラリー（例えば、シーケンシング用）の作製方法の別の例を説明する図である（この例では、２０７対の長いプライマーを使用している）。

【図21A】ライブラリー（例えば、シーケンシング用）を作製する方法の概略図である。

【図21B】１６０００対の長いプライマーを使用している、本明細書に記載されるようなマルチプレックス増幅及び非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼでの処理を使用したライブラリーの作製の為の図２１Ａに示される方法のような方法の結果を説明する図である。

【図22】マルチプレックス増幅及び非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼでの処理を使用した本明細書に記載の方法（この例では、２０７対のプライマーを使用している）を使用して作製したライブラリーからのシーケンシングに基づく質の確認を説明する表（本明細書中では表１とも呼ばれる）を示す図である。

【図23】本明細書に記載のマルチプレックス増幅及び非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼでの処理を使用した方法の、（２０７対の長いプライマーを用いて作製した）ライブラリーからのシーケンシングの結果に基づく質の確認を説明する表（本明細書中では表２と呼ばれる）である。

【図24】本明細書に記載のマルチプレックス増幅及び非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼでの処理を使用した方法の、（１６０００対のプライマーを用いて作製した）ライブラリーからのシーケンシングの結果に基づく質の確認を説明する表（本明細書中では表３と呼ばれる）である。

【発明を実施するための形態】

【0054】

概して、多数の異なるヌクレオチド領域を増幅する場合に非特異的増幅産物（例えば、プライマーダイマー）を減少させることにより標的特異的増幅産物を増幅する又はその増幅を改善する為に使用され得る方法、組成物、システム、及びキットが本明細書中で記載される。これらの方法、組成物、システム、及びキットは、典型的には、異常なＤＮＡ構造を認識しそれに結合する、及び／若しくは異常なＤＮＡ構造を切断する１種以上のリゾルバーゼを含む、又は１種類以上のリゾルバーゼの使用を含む。

【0055】

例えば、本明細書中で提供される方法は、マルチプレックス増幅（例えば、ＰＣＲ）プロトコール又は複数のＤＮＡプライマー若しくはオリゴヌクレオチドを含む任意の他の方法の改良に使用され得る。より詳細には、本明細書中で提供される方法は、マルチプレックスＰＣＲプロトコール又は複数のＤＮＡプライマー若しくはオリゴヌクレオチドを含む任意の他の方法において非特異的増幅産物を減少させる為に使用され得る。本明細書中で開示される方法は、非特異的増幅産物が除去され、標的ＤＮＡアンプリコンが保存されるようにマルチプレックスＰＣＲ反応を実行する為の最適化されたプロトコールを提供する。全体として、上記方法は、改良された核酸ライブラリーの調製方法に関し得る。

【0056】

１つの態様では、増幅反応による非特異的増幅産物を減少させる為の方法が提供される。上記方法は、少なくとも１つの標的核酸を含む核酸試料を提供する工程を含み得る。核酸はＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ又はそれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。ＤＮＡは、真核生物細胞、古細菌細胞、細菌細胞、マイコバクテリア細胞、バクテリオファージ、ＤＮＡウイルス、若しくはＲＮＡウイルスに由来し得るか、又はＲＮＡから変換され得る。いくつかの場合では、ＤＮＡは哺乳動物に由来し得る。いくつかの場合では、ＤＮＡはヒトに由来し得る。ＤＮＡは未修飾（例えば、メチル化、グリコシル化等）の状態であり得、又は修飾された状態でもあり得る。核酸は増幅反応において使用され得る。増幅反応で使用される核酸は、少なくとも１つの標的核酸配列を含み得る。標的核酸配列とは、核酸の混合物の中で、（例えば標的特異的プライマーを用いて）標的化され、富化される核酸配列を総称的に指す。増幅反応は、複数のＤＮＡプライマー又はオリゴヌクレオチドをそれらの対応している標的に対してハイブリダイズさせる工程を伴う、任意の方法であり得る。増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり得る。ある例では、増幅反応はマルチプレックスＰＣＲである。他の例では、増幅反応は、２以上の対のオリゴヌクレオチドを用いるライゲーションエクステンション（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ネストマルチプレックスＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）、全ゲノム増幅、全エキソン増幅又は等温増幅反応等による増幅であり得る。一例として、マルチプレックスＰＣＲは、複数のアンプリコンを生じるように、１つの容器（即ち、チューブ、ウェル、バイアル等）の中での複数の標的核酸の同時増幅を提供する。マルチプレックスＰＣＲは一般に、複数の標的核酸を選択的に富化できる複数の標的特異的プライマー対の使用を伴う。複数の標的特異的プライマー対は、１０未満〜１００，０００超のプライマー対であり得る。ある場合では、複数の標的特異的プライマー対は、少なくとも１０対の標的特異的プライマー対を含む。別の場合では、複数の標的特異的プライマー対は、約１０〜約１００のプライマー対を含む。別の場合では、複数の標的特異的プライマー対は、約１００〜約１，０００のプライマー対を含む。更に別の場合では、複数の標的特異的プライマー対は、約１，０００〜約１００，０００のプライマー対を含む。更なる場合では、複数の標的特異的プライマー対は１００，０００超のプライマー対を含む。

【0057】

プライマーは、未修飾の塩基及び／若しくはホスホジエステル結合、又は修飾された塩基及び／若しくはホスホジエステル結合、保護されていない５’末端若しくは保護された５’末端、５’リン酸化末端又は５’非リン酸化末端を含み得る。プライマー対は、アンプリコンの長さが１００塩基対未満から１０００塩基対を上回るまでになり得るように設計され得る。本開示において想定されるマルチプレックスＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応において一般的に使用される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより行われ得る。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは野生型であり得、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、若しくは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性及び５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有し得るか、又はより高い忠実度の為の熱安定性ポリメラーゼの混合物であり得るか、又は長いアンプリコンを合成できるか、又はより速い合成速度を有する。適切な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの一例は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり得る。ＰＣＲについての熱プロフィール（温度及び時間）が最適化され得、プライマー濃度もまた、最高の性能に達するように最適化され得る。最後に、アンプリコンの最適な増幅を促し得る任意の添加物が使用され得る。これらの添加物として、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミド、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、４−メチルモルホリンＮ−オキサイド、塩化テトラメチルアンモニウム、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン、Ｌ−プロリン、ウシ血清アルブミン、トレハロース、及びＴ４遺伝子の３２タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0058】

本明細書に記載の方法は、標的特異的プライマーを使用して標的核酸を増幅する工程を含み得る。ここでは、増幅工程により複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物が生じる。マルチプレックスＰＣＲ反応は、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む複数の増幅産物を生じ得る。いくつかの場合では、複数の標的特異的増幅産物が、増幅反応における最も豊富な増幅産物であり得（即ち、増幅反応産物の５０％超）、他の場合では、複数の非特異的増幅産物が、増幅反応における最も豊富な増幅産物であり得る。いくつかの場合では、非特異的増幅産物が減少した増幅反応を生じるように（即ち、標的特異的増幅産物が増幅反応における最も豊富な増幅産物となるように）、非特異的増幅産物を除去する又は減少させることが望まれ得る。

【0059】

非特異的増幅産物は、多くの場合、増幅反応中の標的特異的増幅産物を分析する能力を妨げる可能性がある、マルチプレックスＰＣＲ反応の望ましくない副産物である。非特異的増幅産物の形成は、マルチプレックスＰＣＲ反応において利用されるプライマー対の数に依存し得る。増幅反応における非特異的増幅産物の形成は、以下を含む多数の要因に依存し得る複雑なプロセスであり得る：使用されるプライマー対の数、反応の温度、反応における塩濃度、プライマーの長さ、プライマーのＧＣ含有量、二次構造の形成、及びプライマー−プライマー結合とプライマー−鋳型結合との間での競合。マルチプレックスＰＣＲの早期サイクルでは、非特異的増幅産物は、プライマー間での部分的なアニーリング、若しくはプライマー−鋳型ＤＮＡ間での部分的なアニーリングにより、又はプライマー及び／若しくはプライマーと鋳型ＤＮＡとの有意な塩基対合を伴わない凝集により、最初に形成される。マルチプレックスＰＣＲのこれらの早期段階では、これらの非特異的増幅産物は、それらの構造の一部として、完全にはマッチしていないＤＮＡの領域を含有し得る（即ち、部分的にアニーリングした部分は、完全にはマッチしていないＤＮＡ構造を含有し、新しく合成された部分は、完全にマッチした二本鎖ＤＮＡである）。マルチプレックスＰＣＲのより後期のサイクルでは、これらの完全にはマッチしていない領域が、完全にマッチした二本鎖ＤＮＡとなる（即ち、非特異的増幅産物の全体構造は完全に塩基対合した二本鎖ＤＮＡとなる）。

【0060】

驚くべきことに、本発明者らは、限られた数のＰＣＲサイクル（即ち、８〜２８サイクル）内で、異常なＤＮＡ構造の切断を支援する条件下でマルチプレックスＰＣＲ産物をＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩで処理することにより、非特異的増幅産物を減少させることができることを決定した。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼＩ等は、広範囲に及ぶ基質を有する酵素の群に属する。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼＩが、完全にマッチした二本鎖ＤＮＡとは異なる様々な異常なＤＮＡ構造を認識し、異常なＤＮＡ構造の開始部位から１〜１０塩基以内でＤＮＡの一方又は両方のストランドを切断することが、一連の刊行物において報告されている。これらの異常なＤＮＡ構造としては、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ミスマッチ、ホリデー構造又はジャンクション、及び他の種の完全にはマッチしていないＤＮＡが挙げられる。これらは更に、一本鎖ＤＮＡフラグメントの３以上のストランドを含有する構造を含み得る。これらは、有意な塩基対合を持たないプライマー又はプライマー−鋳型ＤＮＡの凝集体であり得る。驚くべきことに、マルチプレックスＰＣＲの最初の８〜２８サイクルで形成される非特異的増幅産物は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと類似する活性を持つ酵素により切断され得る、様々な異常な二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ構造を含む。マルチプレックスＰＣＲの最初の８〜２８サイクルで生じる非特異的増幅産物をＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩでの切断により除去することができる方法、組成物、システム、及びキットが本明細書に記載される。これらの発見は本開示の方法についての特別な用途である。

【0061】

本明細書に記載の方法は、増幅反応を、非特異的増幅産物を切断する為の酵素と接触させることにより、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程を更に含み得る。本明細書中で使用される場合は、用語「接触工程、接触させること（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、本明細書に記載されるように、そのような酵素を既存の混合物に導入することと同等である。本開示の方法は、異常なＤＮＡ構造を認識して切断し得る様々な酵素を使用できる。いくつかの場合は、本明細書中で開示される方法を実行する為に有用な酵素は異常ＤＮＡ構造特異的酵素である。用語「異常ＤＮＡ構造特異的酵素」は、異常なＤＮＡ構造に結合し、切断する酵素を指すものとして本明細書中で使用される。複数形は、異常なＤＮＡ構造に結合し、切断する複数の酵素をいうように本明細書中で使用されるであろう。異常ＤＮＡ構造特異的酵素は一般的には、不完全にマッチした（即ち、非相補的な）塩基の少なくとも２つの対のストレッチにおいて、異常な二本鎖ＤＮＡ構造の近傍で又は異常な二本鎖ＤＮＡ構造の中でいずれかのストランド（即ち、センス又はアンチセンス）上に少なくとも１つの断裂又は切断事象を起こす少なくとも１つの活性を有するが、これに限定されない。これらの異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、異常なＤＮＡ構造の切断に限定されない複数の酵素活性を有し得る。異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、ＤＮＡ骨格のホスホジエステル結合を切断し、二本鎖ＤＮＡの一本鎖の中に断裂又はニックを生じさせることができる。本明細書中で開示される異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、ホリデー構造又はジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ミスマッチ、及び他の種の完全にはマッチしていないＤＮＡを含むがこれらに限定されない、様々な異常なＤＮＡ構造を認識できる。これらは更に、一本鎖ＤＮＡフラグメントの３以上のストランドを含む構造を含み得る。これらは、有意な塩基対合を持たないプライマー又はプライマー−鋳型ＤＮＡの凝集体であり得る。いくつかの場合では、異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、特定のタイプの異常なＤＮＡ構造を認識できる。他の場合は、異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、２以上のタイプの異常なＤＮＡ構造を認識できる。本明細書中で提供される方法は、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む増幅反応において生じた異常なＤＮＡ構造を認識して切断できる異常ＤＮＡ構造特異的酵素を組み合わせることができる。いくつかの場合では、異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、非特異的増幅産物を選択的に切断できる。いくつかの場合では、異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、非特異的増幅産物及び標的特異的増幅産物の両方を切断できる。いくつかの例では、異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、標的特異的増幅産物の量を減少させることなく、増幅反応中の非特異的増幅産物の量を減少させることができる。他の例では、非特異的増幅産物及び標的特異的増幅産物の両方を減少させることができる。いくつかの場合は、増幅反応は、非特異的増幅産物を実質的に含まないものであり得る。非特異的増幅産物を実質的に含まないことは、増殖反応中の非特異的増幅産物の量が、５０％を上回って、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％まで減少したことを意味し得る。

【0062】

本明細書中で提供される方法において異常なＤＮＡ構造を切断する為に利用できる、異常ＤＮＡ構造特異的酵素の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ファージＴ７由来のバクテリオファージホリデージャンクションリゾルバーゼＴ７エンドヌクレアーゼＩ、又はファージＴ３、ＹｅＯ３−１２由来のそのホモログ；ファージＴ４由来のＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、又はファージＹｅＯ３−１２、Ｌ５、Ｄ２９由来のそのホモログ；ラムダファージ由来のＲａｐ、ポックスウイルス由来のＡ２２、又はファージＰ２２、Ｈ−１９Ｂ、９３３Ｗ、２１、ＰＳ３４、ＶＴ２−Ｓａ、Ｄ３由来のそれらのホモログ；ファージｂＩＬ６６／６７／７０由来のＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼ、又はファージｓｋ１、ｃ２、ｖＭＬ３、７１２由来のそのホモログ；ｒ１ｔ由来のＲｕｓＡ、ファージＳＰＰ１由来のＧ４４Ｐ、又はファージＴｕｃ、ｕｌ３６、ｇ１ｅ、８２、ＨＫ１２２／９７、ＰＶＬ、ＴＭ４、Ａ１１８由来のそれらのホモログ；ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）、又は細菌、古細菌、及び真核生物細胞由来のそのホモログ；エンドヌクレアーゼＶ、又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エンドヌクレアーゼＶ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）エンドヌクレアーゼＶを含む、細菌、古細菌、及び真核生物細胞由来のそのホモログ；ＲｕｖＣ、ＲｅｃＵ、Ｈｊｃ、Ｈｊｅ、Ｈｊｒ、ＣＣＥ１、ＹＤＣ２、ＸＰＧクラス：ＧＥＮ１／Ｙｅｎ１、ＵｖｒＣクラス：Ｓｌｘ１−Ｓｌｘ４、ＥＲＣＣ４クラス：Ｘｐｆ（Ｘｐｆ−Ｅｒｃｃ１）、Ｍｕｓ８１（ＭＵＳ８１−ＥＭＥ１／Ｍｍｓ４）を含む、細菌、古細菌、及び真核生物由来の構造特異的エンドヌクレアーゼ；細菌由来のミスマッチ修復酵素ＭｕｔＨＬＳ；真菌及び植物由来の一本鎖特異的ヌクレアーゼ。これらは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＳ１ヌクレアーゼ、ペニシリウム−シトリヌ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）由来のＰ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、又はＣＥＬヌクレアーゼファミリー（ＣＥＬ Ｉ及びＳＰ１）を含む。本明細書中で提供される方法において異常なＤＮＡ構造に結合するが、これを切断しないように利用され得る酵素の例としては、細菌由来のＭｕｔＳ又はヒトエンドヌクレアーゼＶが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な例では、異常ＤＮＡ構造特異的酵素は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ又はＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩであり得る。本明細書に記載の開示の方法を実行できる、原則として任意の異常ＤＮＡ構造特異的酵素又はその突然変異体が想定されることが理解されるものとする。より詳細には、異常なＤＮＡ構造を切断する又はそれに結合できる任意の異常ＤＮＡ構造特異的酵素又はその突然変異体を使用できる。

【0063】

開示の他の方法では、非特異的増幅産物を、異常なＤＮＡ構造の切断を伴わずに増幅反応から除去することができる。この場合、複数の標的特異的増幅産物及び非特異的増幅産物を含む増幅反応を、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質と接触させることができる。このタイプのタンパク質は、ＤＮＡミスマッチ修復経路（ＤＮＡ合成又は組換えの際にＤＮＡミスマッチを認識し修復する為のシステム）に関与する酵素であり得る。これらの例では、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質は、核酸試料中の、対合していない塩基のストレッチを含むＤＮＡ塩基対ミスマッチ（即ち、非相補的な塩基の対合）に選択的に結合できる。これらの例では、非特異的増幅産物はＤＮＡミスマッチ結合タンパク質に選択的に結合でき、一方、標的特異的増幅産物はＤＮＡミスマッチ結合タンパク質には結合しないであろう。本明細書に記載の方法において有用なＤＮＡミスマッチ結合タンパク質は、核酸試料中の少なくとも１つのＤＮＡミスマッチを認識して結合し得る任意のＤＮＡミスマッチ結合タンパク質であり得る。１つの特別な例では、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質はＭｕｔＳであり得る。ＭｕｔＳは細菌（いくつかの場合では、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）又はサーマス・アクアチカス（Ｔ． ａｑｕａｔｉｃｕｓ））に由来し得る。いくつかの場合では、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質は固体支持体上に固定化され得る。この例では、非特異的増幅産物は固体支持体上に吸着され、増幅反応から除去され得る。特別な例が開示されているが、原則として、非特異的増幅産物を選択的に結合できるあらゆる物質を使用できる。

【0064】

いくつかの場合では、上記方法は、増幅反応から切断された非特異的増幅産物を除去する工程を含み得る。他の場合では、切断された非特異的増幅産物は除去されない。切断された非特異的産物は、エキソヌクレアーゼにより小さいオリゴヌクレオチド及びヌクレオチドに更に消化され得る。これらは、二本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ及び一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを含む。いくつかの場合では、エキソヌクレアーゼは、ラムダエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ、又は２つの組み合わせであり得る。この例では、エキソヌクレアーゼでの消化により標的特異的増幅産物の末端を保護することが所望される場合がある。この場合は、エキソヌクレアーゼは非特異的増幅産物を消化し、標的特異的増幅産物は消化しない。１つの例では、標的特異的増幅産物を消化から保護する工程は、標的特異的増幅産物の末端へのアダプターの連結を含み得る。これらのアダプターは、センスストランドの３’末端に複数の連続するホスホロチオエートを有し得る。ホスホロチオエートは、ヌクレアーゼによる切断に耐える正常なＤＮＡの変異体である。いくつかの場合では、アダプターは、センスストランドの３’末端に３個、４個、５個、６個、又は７個以上の連続するホスホロチオエートを含み得る。１つの例では、アダプターは、以下により詳細に記載されるように、次世代シーケンシング用のライブラリーを作製する為に使用されるアダプターであり得る。アダプターは更に、バーコード又はタグを含み得る。アダプターが連結された標的ＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲにより更に増幅され得る。いくつかの場合では、アダプターはセンスストランドの５’末端でリン酸化される。いくつかの場合では、アダプターのアンチセンスストランドの３’末端は、チミジン（Ｔ）突出を有し得る。この例では、アダプターのＴ突出は、末端修復されたＡ末端標的特異的増幅産物に連結され得る。

【0065】

いくつかの場合では、本明細書中で記載される増幅産物は、次世代シーケンシング用のライブラリーを調製する為に使用され得る。次世代シーケンシングの用途に有用なアダプターを、上記のように、標的特異的増幅産物の末端に連結させることができる。いくつかの場合では、アダプターは、センスストランドの３’末端に複数の連続するホスホロチオエートを有し得る。いくつかの場合では、アダプターは、センスストランドの３’末端に３個、４個、５個、６個、又は７個以上の連続するホスホロチオエートを含み得る。アダプターは、次世代シーケンシングプラットフォーム上で有用なシーケンシングアダプター（例えば、イルミナ・トゥルーシーク・アダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ａｄａｐｔｅｒ））であり得る。例えば、本発明の方法は、米国特許第５，７５０，３４１号（メルセビッツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）著）；同第６，３０６，５９７号（メルセビッツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）著）；及び同第５，９６９，１１９号（メルセビッツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）著）に記載されているような、イルミナ株式会社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により市販されている方法による次世代シーケンシングに有用である。

【0066】

キット
本開示は更に、本明細書中で開示される方法を実行する為に有用なキットを提供する。１つの態様では、本開示はマルチプレックスＰＣＲ反応を実行する為、及び非特異的増幅産物を減少させる為のキットを提供する。この例では、キットはマルチプレックスＰＣＲ反応における使用に適している試薬（例えば、限定ではないが、緩衝液、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ））を含み得る。マルチプレックスＰＣＲ反応において使用される複数のプライマー対は別々に販売されているものであってよい。いくつかの場合では、プライマー対は注文品である。いくつかの場合では、プライマー対は注文者により選択される。いくつかの場合では、プライマー対は標的特異的プライマー対である。他の場合では、プライマー対はランダムプライマー対であり得る。プライマー対は、１０〜１００，０００超のプライマー対を含み得る。この例のキットは更に、非特異的増幅産物を減少させる為に適している異常ＤＮＡ構造特異的酵素及び緩衝液（例えば、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ）を含み得る。この例のキットは更に、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）及び２回目のＰＣＲを実行する為の１対のＰＣＲプライマーを含み得る。

【0067】

別の場合では、本開示は、次世代シーケンシング用のアダプターが連結されたライブラリーを調製する為のキットを提供する。この例では、キットは、マルチプレックスＰＣＲ反応を実行する為、及び非特異的増幅産物を減少させる為の上記で開示された任意の試薬、並びに、ライブラリーの調製の為の更なる試薬を含み得る。ライブラリーの調製用の更なる試薬は、末端修復に適している酵素及び緩衝液（例えば、クレノウポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及び／又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ）、増幅末端の５’末端のリン酸化に適している酵素及び緩衝液（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）、Ａテーリング（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ）に適している酵素及び緩衝液（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）、連結反応を実行する為に適しているアダプター、ＤＮＡリガーゼ、及び緩衝液、エキソヌクレアーゼ（例えば、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩ）、並びに、アダプターが連結された核酸を増幅する為のＰＣＲプライマーを含み得るが、これらに限定されない。アダプターは、複数のホスホロチオエートを含むアダプター、及び／又は次世代シーケンシング．に適しているアダプターを含む、本明細書中で開示される任意のアダプター又はそれらの組み合わせであり得る。ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと、９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ ＤＮＡリガーゼ、及びアンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（登録商標）からなる群より選択される少なくとも１つの更なるリガーゼとを含み得る。アダプターが連結された核酸の増幅に使用されるＰＣＲプライマーは、アダプター配列の少なくとも一部にアニーリングする配列を含み得る。

【0068】

別の場合では、本開示は、マルチプレックスＰＣＲ反応、及び非特異的増幅産物を減少させる為の代替的な方法を実行する為のキットを提供する。この例では、キットは、マルチプレックスＰＣＲ反応での使用に適している試薬（例えば、限定ではないが、緩衝液、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を含み得る。マルチプレックスＰＣＲ反応で使用される複数のプライマー対は別々に販売されているものであってよい。いくつかの場合では、プライマー対は注文品である。いくつかの場合では、プライマー対は注文者により選択される。いくつかの場合では、プライマー対は標的特異的プライマー対である。他の場合では、プライマー対はランダムプライマー対であり得る。プライマー対は、１０〜１００，０００超のプライマー対を含み得る。キットは更に、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質（例えば、ＭｕｔＳ）を含み得る。いくつかの場合では、表面にＭｕｔＳが結合させられた固体支持体がキットの中に提供され得る。他の場合では、ＭｕｔＳ及び固体支持体は、固体支持体にＭｕｔＳを結合させる為に適している試薬とは別に提供され得る。キットは更に、本開示の方法を実行する為に適している任意の適切な洗浄緩衝液、溶離緩衝液等を含み得る。

【0069】

本開示の特定の態様及び図がここで詳細に参照されるであろう。そのような態様は例として提供されるにすぎない。おびただしい数のバリエーション、変更、及び置き換えが、本開示から逸脱することなくここで当業者には思い浮かぶであろう。

【0070】

図１では、マルチプレックスＰＣＲが、鋳型ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。プライマーの対の数は、１つのチューブ又はウェルの中の１つの反応において、１０未満〜１００，０００超の任意の数であり得る。ＰＣＲ産物は、標的ＤＮＡフラグメント（即ち、アンプリコン）及び異常なＤＮＡ構造を含有する様々な非特異的産物を含む。上記産物は、異常なＤＮＡ構造の近傍で二本鎖を切断し、一方、標的ＤＮＡフラグメントは完全なまま残すＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと接触させられる。標的ＤＮＡフラグメントは、切断された非特異的産物を除去する為の更なる精製を用いて又はそれを伴わずに得られ、様々な下流での用途に使用される。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩが、一本鎖ＤＮＡを小さいオリゴヌクレオチド及びヌクレオチドに分解する為に、マルチプレックスＰＣＲ後にＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと共に使用され得る。標的ＤＮＡフラグメントは、ニックトランスレーションにより蛍光又は放射性同位体で標識され、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、又は検出及び診断の為の他の技術で分析され得る。更に、標的ＤＮＡフラグメント中のニックは、以下の酵素の任意の１つで埋めることができる：９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ ＤＮＡリガーゼ、アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（登録商標）等。ネストプライマーがマルチプレックスＰＣＲにおいて使用される限りは、ニックの充填後、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって更に増幅できる。

【0071】

図１では、マルチプレックスＰＣＲで生じた非特異的増幅産物を除去する為の手順の模式図は、マルチプレックスＰＣＲ後に、非特異的増幅産物がリゾルバーゼ（この例では、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ）で切断され得、随意に精製によって除去され得ることを示している。標的アンプリコンは続く工程で直接使用され得るか、又は収量を増大させるか又はアダプターのような更なる配列を付加するかのいずれかの為にＰＣＲの更なる回が行われ、ライブラリーとして使用されるかのいずれかであり得る。

【0072】

或いは、又は更に、ポリヌクレオチド中の異常に結合するタンパク質（例えば、リゾルバーゼ）が、非特異的結合増幅産物を単に切断するのではなく、非特異的結合増幅産物に結合し、除去する為に使用され得る。例えば、リゾルバーゼ又はリゾルバーゼの異常に結合する部分は、固相基体に繋がれ得る。図２は、マルチプレックスＰＣＲで生じた非特異的増幅産物を除去する為の手順の模式図である。マルチプレックスＰＣＲ後に、非特異的増幅産物は、固定化されたＭｕｔＳ又は様々な生物由来の固定化されたＭｕｔＳの組み合わせの上に吸着され、一方、標的ＤＮＡフラグメントは溶液中に存在し、非特異的産物から分離される。固定化されたＭｕｔＳは、カラム又はカートリッジの中に含有され得、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）又はサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のものであり得る。ＭｕｔＳは、ポリヌクレオチド中の異常に結合する為の１つ以上の結合部位を含む。

【0073】

図２では、マルチプレックスＰＣＲが、鋳型ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び好熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。プライマーの対の数は、１つのチューブ又はウェルの中の１つの反応において、１０未満〜１００，０００超の任意の数であり得る。ＰＣＲ産物は、標的ＤＮＡフラグメント（即ち、アンプリコン）及び異常なＤＮＡ構造を含有する様々な非特異的産物を含む。これらのＰＣＲ産物は、固定化されたＭｕｔＳ又は様々な生物由来の固定化されたＭｕｔＳの組み合わせと接触させられる。非特異的産物は固定化されたタンパク質上に吸着され、一方、標的ＤＮＡフラグメントは溶液中に存在し、非特異的産物から分離される。上記のように、固定化されたＭｕｔＳは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）又はサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）に由来のものであり得る。

【0074】

本明細書に記載の任意の方法がライブラリーを作製する為に使用され得る。ライブラリーは、例えば、シーケンシングに使用され得る。これは図３及び図２１Ａで説明される。図３は、マルチプレックスＰＣＲで生じた非特異的増幅産物を除去する為の手順、及び標的アンプリコン由来のライブラリーの模式図である。手順は、ＤＮＡフラグメントの末端の末端修復、非特異的産物の切断、アダプターの連結、連結されていないアダプターの除去、及びライブラリーの更なる増幅を含む。

【0075】

図３では、マルチプレックスＰＣＲが、鋳型ＤＮＡ、リン酸化されていないプライマー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。プライマーの対の数は、１つのチューブ又はウェルの中の１つの反応において、１０未満〜１００，０００超の任意の数であり得る。産物は、標的ＤＮＡフラグメント（即ち、アンプリコン）、及び異常なＤＮＡ構造を含有する様々な非特異的産物を含む。ＰＣＲ後、上記産物は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより末端修復されて平滑末端が作製され、その後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’末端がリン酸化され、その後、Ｔａｑポリメラーゼにより、ｄＡＴＰを含有する緩衝液中で３’末端にＡが付加される。上記産物は、次いで、異常なＤＮＡ構造で又は異常なＤＮＡ構造の近くで二本鎖を切断し、一方、標的ＤＮＡフラグメントは完全なまま残すＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと接触させられる。次いで、ＤＮＡ混合物がアダプターと連結される。アダプターは、センスストランドの３’末端に３個から６個の連続するホスホロチオエートを含有する（図３では^＊Ｎ３’により示される）。ＤＮＡ混合物が大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ及びラムダエキソヌクレアーゼにより消化される場合では、標的ＤＮＡフラグメントは、アダプターにより両側が保護され、一方、全ての他のＤＮＡフラグメントは小さいオリゴヌクレオチド及びヌクレオチドに分解される。標的ＤＮＡフラグメントは、非特異的産物の破片を除去する為の更なる精製を伴って、又はそのような精製を伴わずに、様々な下流での用途に使用され得る。

【0076】

より詳細には、アダプターはセンスストランドの５’末端でリン酸化される。アンチセンスストランドの３’末端は、末端修復されたＰＣＲ産物とのＴ−Ａ連結を可能にする余分なＴを含有する。

【0077】

更に詳細には、連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと、以下のＤＮＡリガーゼのうちの１つとを含む：９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ ＤＮＡリガーゼ、アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（登録商標）等。

【0078】

更に詳細には、アダプターの連結及び非特異的産物の除去の後、標的ＤＮＡフラグメントがＰＣＲによって更に増幅され得る。

【0079】

図４は、マルチプレックスＰＣＲで生じた非特異的増幅産物を除去する為の予想される手順及び標的アンプリコン由来のライブラリーの模式図である。この手順では、リン酸化されたプライマーが使用される。上記手順は、ＤＮＡフラグメントの末端の末端修復、非特異的産物の切断、アダプターの連結、連結されていないアダプターの除去、及びライブラリーの更なる増幅を含む。図４では、マルチプレックスＰＣＲにおいてリン酸化されたプライマーが使用される。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ、リン酸化されたプライマー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。プライマーの対の数は、１つのチューブ又はウェルの中の１つの反応において、１０未満〜１００，０００超の任意の数であり得る。産物は、標的ＤＮＡフラグメント（即ち、アンプリコン）、及び異常な構造を含有する様々な非特異的産物を含む。上記産物は、異常なＤＮＡ構造の近傍で二本鎖を切断し、一方、標的ＤＮＡフラグメントは完全なまま残すＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと接触させられる。次いで、ＤＮＡ混合物がアダプターと連結される。アダプターは、センスストランドの３’末端に３個から６個の連続するホスホロチオエートを含有する（図４では^＊Ｎ３’により示される）。ＤＮＡ混合物が大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ及びラムダエキソヌクレアーゼにより消化される場合では、標的ＤＮＡフラグメントは、アダプターにより両側が保護され、一方、全ての他のＤＮＡフラグメントは小さいオリゴヌクレオチド及びヌクレオチドに分解される。標的ＤＮＡフラグメントは、非特異的産物の破片を除去する為の更なる精製を伴って、又はそのような精製を伴わずに、様々な下流での用途に使用され得る。より詳細には、アダプターは、センスストランドの５’末端でリン酸化され得る。アンチセンスストランドの３’末端は、ＰＣＲ産物とのＴ−Ａ連結を可能にする余分なＴを含有する。更に詳細には、連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと、以下のＤＮＡリガーゼのうちの１つとを含み得る：９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ ＤＮＡリガーゼ、アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（登録商標）等。アダプターの連結及び非特異的産物の除去の後、標的ＤＮＡフラグメントはＰＣＲにより更に増幅され得る。

【0080】

図５は、マルチプレックスＰＣＲで生じた非特異的増幅産物を除去する為の手順の別のバリエーション、及び標的アンプリコン由来のライブラリーの模式図を示す。この手順では、連結されていないアダプターは消化によって除去されない。この手順は、ＤＮＡフラグメントの末端の末端修復、非特異的産物の切断、アダプターの連結、及びライブラリーの更なる増幅を含む。図５では、マルチプレックスＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ、リン酸化されていないプライマー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。プライマーの対の数は、１つのチューブ又はウェルの中の１つの反応において、１０未満〜１００，０００超の任意の数であり得る。産物は、標的ＤＮＡフラグメント（即ち、アンプリコン）、及び異常な構造を含有する様々な非特異的産物を含む。上記産物は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより末端修復されて平滑末端が作製され、その後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５’末端がリン酸化され、その後、Ｔａｑポリメラーゼにより、ｄＡＴＰを含有する緩衝液中で３’末端にＡが付加される。上記産物は、次いで、異常なＤＮＡ構造の近傍で二本鎖を切断し、一方、標的ＤＮＡフラグメントは完全なまま残すＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと接触させられる。その後、ＤＮＡ混合物がアダプターと連結される。連結された標的ＤＮＡフラグメントはＰＣＲにより更に増幅される。

【0081】

アダプターはセンスストランドの５’末端でリン酸化され得る。アンチセンスストランドの３’末端は、末端修復されたＰＣＲ産物とのＴ−Ａ連結を可能にする余分なＴを含有する。アダプターはホスホロチオエートを含有しない。連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと、以下のＤＮＡリガーゼのうちの１つとを含み得る：９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｉ ＤＮＡリガーゼ、アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（登録商標）等。

【実施例】

【0082】

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明する目的の為に提供され、いずれにしても本発明を限定するようには意味されない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、好ましい実施形態を代表的に表しており、例示であり、そして本発明の範囲を限定するようには意図されない。特許請求の範囲により定義される本発明の意図に含まれる本発明の中での変更及び他の用途を、当業者は思い浮かべるであろう。

【0083】

実施例１
実施例１は、上で簡単に論じたように図１に示されており、鋳型ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いるマルチプレックスＰＣＲの模式図を示す。

【0084】

実施例２
実施例２は、上で論じたように図２に示されており、鋳型ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び好熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるマルチプレックスＰＣＲの１つの方法である。

【0085】

実施例３
上で簡単に論じた図３に示した実施例３は、鋳型ＤＮＡ、リン酸化されていないプライマー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いるマルチプレックスＰＣＲの１つの方法である。

【0086】

実施例４
上で簡単に論じた図４に示した実施例４は、マルチプレックスＰＣＲにおいて使用されるリン酸化されたプライマーを用いるマルチプレックスＰＣＲの１つの方法である。

【0087】

実施例５
図５に示し、上で簡単に論じた実施例５は、鋳型ＤＮＡ、リン酸化されていないプライマー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いるマルチプレックスＰＣＲの模式図である。

【0088】

実施例６：反応条件の最適化
本明細書に記載の任意の方法で、リゾルバーゼ条件（濃度、緩衝液、インキュベーション／処理時間、及び／又は温度）を決定できる。上記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる為の、リゾルバーゼの使用についての一般的なパラメーターが本明細書中で提供される。例えば、一般的には、標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、リゾルバーゼで非特異的増幅産物を切断することは、非特異的増幅産物及び複数の標的特異的増幅産物を、約０．２Ｕ〜１０００Ｕのリゾルバーゼに対して、０．５分〜６０分、１６℃〜３７℃で曝露することを含み得る。図６Ａ〜７Ｂはそのような範囲の決定を説明している。図６Ａ及び６Ｂは、２０７対のプライマーが関係するマルチプレックスＰＣＲにおいて非特異的増幅産物を除去する為に使用できる濃度の範囲を見出す為の、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩの滴定を説明している。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩの効果は、残留している標的ＤＮＡの量又は残留しているプライマーダイマーの量のいずれかによりアッセイした。以下に更に詳細に記載するように、約０．５〜２０の範囲（例えば、およそ１０単位）のＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩが十分であることが明らかになった。図７Ａ〜７Ｂは、２０７対のプライマーを含むマルチプレックスＰＣＲにおいて非特異的増幅産物を除去する為の最適な時間を見出す為の、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩの時間経過の例を示す。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩの効果は、残留している標的ＤＮＡの量のいずれかによりアッセイした。約０．５分〜２０分（例えば、５分）のインキュベーションが十分であることが明らかになった。

【0089】

様々な活性により異常なＤＮＡ構造の近傍でＤＮＡを切断できる酵素が多く存在するが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、並びに大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）及びサーモトガ・マリティマ（Ｔ． ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のエンドヌクレアーゼＶは市販されている。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ及びＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩはいずれも、様々な異常なＤＮＡ構造に対して強力な活性を有することが報告されている。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは６ヌクレオチドまでの長さの５’突出末端を生じ、一方、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩは同じ長さの３’突出末端を生じる。これらの２つのエンドヌクレアーゼはまた、一本鎖ＤＮＡに対して強い活性を有する。これらは機能的に互換性がある。エンドヌクレアーゼＶは、ＤＮＡ中のデオキシアデノシンの脱アミノ化産物であるデオキシイノシンを認識するＤＮＡ修復酵素と考えられており、多くの場合はデオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼと呼ばれる。エンドヌクレアーゼＶは様々な異常なＤＮＡ構造に対して弱い活性を有する。これらの酵素は全て、二本鎖ＤＮＡ上にランダムなニックを作製する。多量の酵素を用いて長時間インキュベートすると、二本鎖ＤＮＡはＤＮＡフラグメントのより小さい断片に徐々に切断されるであろう。これらの理由から、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを以下の実験で使用したが、他のリゾルバーゼを使用してもよく、本明細書に記載の方法、キット、及び組成物はＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩに限定されない。

【0090】

Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩの最適濃度を見出す為に、本発明者らはマルチプレックスＰＣＲを実行し、次いで、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを使用して増幅産物を処理した。小さいＤＮＡフラグメントを磁性ビーズでの１回の精製により除去した。得られたＤＮＡを、バイオアナライザー（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）の高感度チップでアッセイした。

【0091】

イオンアンプリシーク（商標）ホットスポットキャンサーパネルｖ２（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭ ｈｏｔｓｐｏｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ ｖ２）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４４７５３４６）のプライマーパネルをマルチプレックスＰＣＲに使用した。このプライマーパネルは、５０の発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子に由来するおよそ２，８００のＣＯＳＭＩＣ突然変異を網羅する。これは１つのプールの中に２０７のプライマー対を有する。マルチプレックスＰＣＲ反応を１０μｌ中で行った。以下の構成成分を０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ（トーマスサイエンティフィック社（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、スナップストリップＩＩナチュラル０．２ｍｌ ＰＣＲストリップチューブ（Ｓｎａｐｓｔｒｉｐ ＩＩ ｎａｔｕｒａｌ ０．２ｍｌ ＰＣＲ ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ）、カタログ番号１２２８Ｆ７３）のそれぞれに添加した：５μｌの２倍に濃縮したプライマープール、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１×ＰＣＲ緩衝液：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのｄＮＴＰ）、２μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）（エンザイマティック社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、Ｐ７５００−ＬＣ−Ｆ）、１μｌの１０ｎｇ／μｌのヒトＤＮＡ（コーリエル社（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＮＡ１２８７８）、及び１μｌの蒸留水。

【0092】

０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブに付属のキャップで蓋をし、３秒間軽くボルテックスし、そしてミニセントリフュージ（ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）（ピペットコム社（Ｐｉｐｅｔｔｅ．ｃｏｍ）、マイフュージ１２プレイスミニセントリフュージ（ＭｙＦｕｇｅ １２ ｐｌａｃｅ ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、カタログ番号Ｃ１０１２）の中で３秒間回転させた。ＰＣＲ反応混合物の表面を覆う為の鉱油は必要なかった。チューブをサーモスサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｓ ｃｙｃｌｅｒ）（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ）、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４３１４８７８）の中に置いた。

【0093】

ＰＣＲは、最初に２分間９８℃に保持し、続いて、９８℃で１５秒間の変性及びアニーリング及び６０℃で４分間の合成を１７サイクル行った。サイクル後、反応物を次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0094】

ＰＣＲ後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した：１０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、１μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。

【0095】

インキュベーション後、反応を１ｕｌの０．５ＭのＥＤＴＡで停止させた。ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。常磁性ビーズはアムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）（アムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）、ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐ、カタログ番号ＭＤ６１０２１）によるものであった。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、次に、増幅させて混合したアンプリコンの体積の１．６倍に相当する６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを、増幅させたアンプリコンを含有するチューブに添加した。チューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。次いで、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。マグネティックラックの内側の磁石は、ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）によるものであった（ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）、カタログ番号Ｄ４Ｘ０ＤＩＡ−Ｎ５２）。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを取り出さずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールをチューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージで３秒間回転させた。チューブの内側に残留しているエタノールの全ての液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、４０μｌの蒸留水をチューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を新しいチューブに移した。ＤＮＡフラグメントをこの方法によって計２回、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを用いて精製した。最後の精製の後、ＤＮＡフラグメントを５μｌの蒸留水中に溶離させ、以下の工程においてアッセイした。

【0096】

ＤＮＡフラグメントの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。前の工程で得た１μｌの精製したＤＮＡフラグメントを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。上記のように、図６Ａは、３７℃で１０分間、０〜２００単位のＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（Ｔ４Ｅ７とも呼ばれる）により処理した、残留している標的ＤＮＡを示している。残留している標的ＤＮＡは、期待される大きさのＰＣＲ産物をいう。本発明者らは、二本鎖ＤＮＡがより高濃度のＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩで分解されることを観察した。これは、類似する大きさの非特異的産物を酵素により除去されて、標的ＤＮＡが後に残ったこともまた示し得る。

【0097】

図６Ｂは、３７℃で１０分の０〜２００単位のＴ４Ｅ７ Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩにより、残存しているプライマーダイマーを示している。非特異的増幅産物の量は減少した。加えて、本発明者らは、バイオアナライザー（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）でアッセイすることにより、非特異的増幅産物の大きさがより小さくシフトしたことを観察した。これは、非特異的増幅産物がＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩによって少なくとも１回切断されたことを示している。これらは、選択的消化及び／又はポリメラーゼ連鎖反応の更なる回のような更なるアプローチによる、これらのフラグメントの除去を容易にするであろう。

【0098】

非特異的増幅産物は、一度切断された後に除去することができるので、上記結果は、限定されたＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩの活性が十分であることを示している。これにより、標的ＤＮＡを維持し、一方で非特異的増幅産物を除去することができる。

【0099】

マルチプレックスＰＣＲを上記のように行った。ＰＣＲ後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した：１０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、１μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で様々な時間インキュベートした。インキュベーション後、上記のように反応を停止させ、ＤＮＡを精製し、バイオアナライザー（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）でアッセイした。

【0100】

第１の実験では、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩの効果を５分のインターバルで２０分までアッセイした（図７Ａ）。本発明者らは、低濃度（５単位）のＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを用いた標的ＤＮＡの段階的な減少、及び１０単位のＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩでの標的ＤＮＡの急な減少を観察した。第２の実験では、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩの効果を１分のインターバルで９分までアッセイした（図７Ｂ）。この滴定により、３７℃で５分の１０単位のＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩが非特異的増幅産物を除去する為に十分であることが明らかになった。

【0101】

図８Ａは、非特異的増幅産物により生じる典型的なバックグランドを示している例示的なマルチプレックス増幅反応を説明している。この実施例における標的特異的増幅産物は、塩基対の大きさ（ｂｐ）についての相対的な蛍光強度（蛍光単位の量、ＦＵ）を示しているグラフに基づくと、サイズマーカーの間で、非特異的増幅産物（「マルチプレックスＰＣＲにより生じたバックグラウンド」）に実質的に圧倒されている。

【0102】

実施例７
図８Ｂは、図１及び図３〜５で例示した方法と同様に、マルチプレックス増幅手順において非特異的増幅産物を減少させ、標的特異的増幅産物を明らかにする為のリゾルバーゼ（例えば、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ）の使用を説明している。図８Ｂでは、リゾルバーゼは、示したような１つ以上の異常なポリヌクレオチド構造（例えば、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡ）を有すると仮定される、バックグラウンドである非特異的増幅産物を標的とする。

【0103】

図８Ｃ及び８Ｄは、この方法の実施例を説明する。イオンアンプリシーク（商標）ホットスポットキャンサーパネルｖ２（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭ ｈｏｔｓｐｏｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ ｖ２）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４４７５３４６）のプライマーパネルをマルチプレックスＰＣＲで使用した。このプライマーパネルは、５０の発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子に由来するおよそ２，８００のＣＯＳＭＩＣ突然変異を網羅する。これは１つのプールの中に２０７のプライマー対を有する。マルチプレックスＰＣＲ反応を１０μｌ中で行った。以下の構成成分を０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ（トーマスサイエンティフィック社（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、スナップストリップＩＩナチュラル０．２ｍｌ ＰＣＲストリップチューブ（Ｓｎａｐｓｔｒｉｐ ＩＩ ｎａｔｕｒａｌ ０．２ｍｌ ＰＣＲ ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ）、カタログ番号１２２８Ｆ７３）のそれぞれに添加した：５μｌの２倍に濃縮したプライマープール、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１×ＰＣＲ緩衝液：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのｄＮＴＰ）、２μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）（エンザイマティック社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、Ｐ７５００−ＬＣ−Ｆ）、１μｌの１０ｎｇ／μｌのヒトＤＮＡ（コーリエル社（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＮＡ１２８７８）、及び１μｌの蒸留水。

【0104】

０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブに付属のキャップで蓋をし、３秒間軽くボルテックスし、そしてミニセントリフュージ（ピペットコム社（Ｐｉｐｅｔｔｅ．ｃｏｍ）、マイフュージ１２プレイスミニセントリフュージ（ＭｙＦｕｇｅ １２ ｐｌａｃｅ ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、カタログ番号Ｃ１０１２）の中で３秒間回転させた。ＰＣＲ反応混合物の表面を覆う為の鉱油は必要なかった。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ）、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４３１４８７８）の中に置いた。

【0105】

ＰＣＲは、最初に２分間９８℃に保持し、続いて、９８℃で１５秒間の変性及びアニーリング及び６０℃で４分間の合成を１５サイクル行った。サイクル後、反応物を次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0106】

ＰＣＲ後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した：１０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、１μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。

【0107】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。常磁性ビーズはアムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）（アムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）、ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐ、カタログ番号ＭＤ６１０２１）によるものであった。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、次に、増幅させて混合したアンプリコンの体積の１．６倍に相当する６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを、増幅させたアンプリコンを含有するチューブに添加した。チューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。次いで、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。マグネティックラックの内側の磁石は、ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）によるものであった（ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）、カタログ番号Ｄ４Ｘ０ＤＩＡ−Ｎ５２）。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを取り出さずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールをチューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージで３秒間回転させた。チューブの内側に残留しているエタノールの全ての液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、４０μｌの蒸留水をチューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を新しいチューブに移した。ＤＮＡフラグメントをこの方法によって計２回、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを用いて精製した。最後の精製の後、ＤＮＡフラグメントを５μｌの蒸留水中に溶離させ、以下の工程においてアッセイした。

【0108】

ＤＮＡフラグメントの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。前の工程で得た１μｌの精製したＤＮＡフラグメントを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。結果を図８Ｃ及び８Ｄに示す。図８Ｃは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩによる消化前の標的アンプリコン及び非特異的増幅産物の存在を示している。非特異的増幅産物は２００ｂｐ〜２０００ｂｐ超である。１００ｂｐ〜２００ｂｐのピークが標的ＤＮＡフラグメントであった。図８Ｄは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩでの消化後の効果を示している。２００ｂｐ〜２０００ｂｐ超の非特異的増幅産物を、Ｔ４エンドヌクレアーゼでの消化及びそれに続く精製により除去した。

【0109】

実施例８
非特異的増幅産物の同様の減少を、図９Ａ〜９Ｂに示すように、２０７対の長いプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲにおいて見ることができる。この実施例では、５’ＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ３’を各正方向プライマーの５’末端に付加し、５’ＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ３’を各逆方向プライマーの５’末端に付加したことを除いて、プライマーパネルは、イオンアンプリシーク（商標）ホットスポットキャンサーパネルｖ２（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭ ｈｏｔｓｐｏｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ ｖ２）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４４７５３４６）のプライマーパネルと同じであった。これらの「長い」プライマーは、ＰＣＲの更なる回によるアンプリコン上へのアダプターの容易な付加を可能にする。

【0110】

マルチプレックスＰＣＲ、並びに、それに続く処理及びアッセイを実施する方法は、上記実施例７の方法と同じであった。結果を図９Ａ〜９Ｂに示す。図９Ａは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩでの消化の前の、長いプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲの結果を示している。図９Ｂは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩでの消化による非特異的増幅産物の除去を示している。

【0111】

実施例９：マルチプレックスＰＣＲにおけるポリメラーゼ
一般的には、任意の適切なポリメラーゼが、本明細書中で記載される増幅（マルチプレックス増幅）を実行する為に使用され得る。本明細書中で記載される方法、組成物、及びキットは、様々な酵素に対応している。図１０Ａ〜１０Ｆは、マルチプレックスＰＣＲにおける様々なポリメラーゼ酵素の使用を説明している。各実施例において、マルチプレックスＰＣＲを、５単位のプラチナタック（Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｔａｑ）（図１０Ａ）、チタンタック（Ｔｉｔａｎｉｕｍ ｔａｑ）（図１０Ｂ）、オムニ・クレンタック（Ｏｍｎｉ Ｋｌｅｎ ｔａｑ）（図１０Ｃ）、タッククレノウ（Ｔａｑ Ｋｌｅｎｏｗ）（図１０Ｄ）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（図１０Ｅ）、及びＴｆｉ ＤＮＡポリメラーゼ（図１０Ｆ）を各マルチプレックスＰＣＲ反応で使用したことを除いて、上記実施例６に記載したように行った。ＰＣＲ後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した：１０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、１μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、０．５ＭのＥＤＴＡで反応を停止させた。ＤＮＡを、実施例６で記載したように、精製し、バイオアナライザー（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）でアッセイした。結果は、プラチナタック（Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｔａｑ）、チタンタック（Ｔｉｔａｎｉｕｍ ｔａｑ）、及びオムニ・クレンタック（Ｏｍｎｉ Ｋｌｅｎ ｔａｑ）は比較可能な量の標的アンプリコンを生じ、一方、タッククレノウ（Ｔａｑ Ｋｌｅｎｏｗ）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴｆｉ ＤＮＡポリメラーゼは非常に多量の非特異的増幅産物を生じたことを示している。この実施例では、プラチナタック（Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｔａｑ）、チタンタック（Ｔｉｔａｎｉｕｍ ｔａｑ）、及びオムニ・クレンタック（Ｏｍｎｉ Ｋｌｅｎ ｔａｑ）がマルチプレックスＰＣＲに好ましいものであり得る。

【0112】

実施例１０
マルチプレックスＰＣＲ中のプライマー濃度を滴定できる。この実施例では、２０、３０、４０、５０ｎＭの２０７対のプライマーを各マルチプレックスＰＣＲ反応において使用したことを除いて、実施例６で記載したようにマルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した：１０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、１μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、０．５ＭのＥＤＴＡで反応を停止させた。ＤＮＡを、実施例６で記載したように、精製し、バイオアナライザー（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）でアッセイした。結果を図１１に示す。この実験は、高濃度のプライマーがより多量の標的アンプリコンをもたらしたことを示していた。

【0113】

実施例１１
マルチプレックスＰＣＲのアニーリング及び伸張時間もまた、図１２に示すように、本明細書中で記載される効果を最適化する為に調整できる。この実施例では、１分、２分、３分のアニーリング及び伸張時間を各マルチプレックスＰＣＲ反応において使用したことを除いて、実施例６で記載したようにマルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した：１０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、１μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、０．５ＭのＥＤＴＡで反応を停止させた。ＤＮＡを、実施例６で記載したように、精製し、バイオアナライザー（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）でアッセイした。結果を図１２に示す。この実験は、１分のアニーリング及び伸張が、より多量の標的アンプリコンをもたらしたことを示していた。

【0114】

実施例１２
上記のように、多数のプライマー対を本明細書に記載の方法において使用でき、それでもなお非特異的増幅産物の実質的な減少を生じさせることができる。例えば、図１３は、２９１５対のプライマーを含むマルチプレックスＰＣＲにおける非特異的増幅産物の除去を説明している。

【0115】

プライマーパネルはキアゲン・ジーンリード・ディー・エヌ・エー・シーク・ヒト乳癌パネル（Ｑｉａｇｅｎ ＧｅｎｅＲｅａｄ ＤＮＡｓｅｑ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号ＮＧＨＳ−００１Ｘ−１２）であった。このパネルは、２９１５対のプライマーで２６８６２１の標的塩基の４４の遺伝子を網羅し、各プールがおよそ７３０のプライマー対を含有する４つのプールに分けられている。このパネルについては、２０×シーケンシング深度中央値で９８．２％のカバー率、９６．８％の特異性、９１％の均一性が報告されている。このパネルの各プライマー中にはウラシルヌクレオチドは存在せず、また、いずれの他の塩基の修飾も存在しない。このプライマーパネルは２倍濃縮されている。従って、４回のＰＣＲ反応をプライマーの４つのプールのそれぞれを用いて行い、各反応の全ＰＣＲ体積の５０％が４つのプールのそれぞれであった。

【0116】

各マルチプレックスＰＣＲ反応を１０μｌで行った。以下の構成成分を０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ（トーマスサイエンティフィック社（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、スナップストリップＩＩナチュラル０．２ｍｌ ＰＣＲストリップチューブ（Ｓｎａｐｓｔｒｉｐ ＩＩ ｎａｔｕｒａｌ ０．２ｍｌ ＰＣＲ ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ）、カタログ番号１２２８Ｆ７３）のそれぞれに添加した：５μｌの２倍に濃縮したプライマープール、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１×ＰＣＲ緩衝液：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのｄＮＴＰ）、２μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）（エンザイマティック社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、Ｐ７５００−ＬＣ−Ｆ）、１μｌの１０ｎｇ／μｌのヒトＤＮＡ（コーリエル社（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＮＡ１２８７８）、及び１μｌの蒸留水。キアゲン・ジーンリード・ディー・エヌ・エー・シーク・ヒト乳癌パネル（Ｑｉａｇｅｎ ＧｅｎｅＲｅａｄ ＤＮＡｓｅｑ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）については４つのマルチプレックスＰＣＲ反応が存在した。

【0117】

０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブに付属のキャップで蓋をし、３秒間軽くボルテックスし、そしてミニセントリフュージ（ピペットコム社（Ｐｉｐｅｔｔｅ．ｃｏｍ）、マイフュージ１２プレイスミニセントリフュージ（ＭｙＦｕｇｅ １２ ｐｌａｃｅ ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、カタログ番号Ｃ１０１２）の中で３秒間回転させた。ＰＣＲ反応混合物の表面を覆う為の鉱油は必要なかった。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ）、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４３１４８７８）の中に置いた。以下の２種類の温度プロフィールをプライマーパネルのそれぞれについて実行した。

【0118】

キアゲン・ジーンリード・ディー・エヌ・エー・シーク・ヒト乳癌パネル（Ｑｉａｇｅｎ ＧｅｎｅＲｅａｄ ＤＮＡｓｅｑ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）については、ＰＣＲを、最初に２分間９８℃に保持し、続いて、９８℃で１５秒間の変性及びアニーリング及び６０℃で４分間の合成を１５サイクル行った。サイクル後、反応物を次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0119】

インキュベーション後、反応混合物を、緩衝液を交換せずにこの工程に直接進めた。以下の構成成分を、各上記反応物に直接添加した：４０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、４μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0120】

インキュベーション後、０．５ＭのＥＤＴＡで反応を停止させた。ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、１２８μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、５μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を新しいチューブに移し、以下の工程においてアッセイした。

【0121】

ＤＮＡフラグメントの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。前の工程で得た１μｌの精製したＤＮＡフラグメントを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。結果を図１３に示す。

【0122】

実施例１３
図１４は、１６０００対のプライマーを必要とするマルチプレックスＰＣＲにおける非特異的増幅産物の除去の一例を説明している。この実施例では、プライマーパネルは、イオンアンプリシーク（商標）コンプリヘンシブ・キャンサー・パネル（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４４７７６８５）であった。このプライマーパネルは、頻繁に突然変異する、学術論文に記載されている４０９の重要な腫瘍抑制遺伝子及び発癌遺伝子の全てのエキソンを網羅する。これは、４つのプールの中に１６０００のプライマー対を有し、各プールがおよそ４，０００のプライマー対を有する。アンプリコンの長さは１２５〜１７５塩基対までの範囲であり、標的領域はおよそ１７３万塩基を網羅する。ライブラリーをこのパネル及びライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のイオンアンプリシーク（商標）ライブラリーキット２．０（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ ２．０）を用いて作製し、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のイオン・ピー・ジー・エム（商標）システム（Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）ｓｙｓｔｅｍ）でシーケンシングした場合、このパネルは、９７％の標的塩基（１回の実行あたりで、マップされた全塩基のうち、標的領域にマップされた塩基）について＞２０％のシークエンシング深度中央値で９４％のカバー率が報告されている。マルチプレックスＰＣＲでは、４つのプライマープールのそれぞれに鋳型としての１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡが必要であり、パネル全体を網羅する為には合計４０ｎｇが必要である。このプライマーパネルの各プライマーの中には少なくとも１つのウラシルヌクレオチドが存在する。このプライマーパネルは２倍濃縮されている。従って、４つのＰＣＲ反応をプライマーの４つのプールのそれぞれを用いて行った。

【0123】

各マルチプレックスＰＣＲ反応を１０μｌで行った。以下の構成成分を０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ（トーマスサイエンティフィック社（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、スナップストリップＩＩナチュラル０．２ｍｌ ＰＣＲストリップチューブ（Ｓｎａｐｓｔｒｉｐ ＩＩ ｎａｔｕｒａｌ ０．２ｍｌ ＰＣＲ ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ）、カタログ番号１２２８Ｆ７３）のそれぞれに添加した：５μｌの２倍に濃縮したプライマープール、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１×ＰＣＲ緩衝液：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのｄＮＴＰ）、２μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）（エンザイマティック社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、Ｐ７５００−ＬＣ−Ｆ）、１μｌの１０ｎｇ／μｌのヒトＤＮＡ（コーリエル社（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＮＡ１２８７８）、及び１μｌの蒸留水。イオンアンプリシーク（商標）コンプリヘンシブ・キャンサー・パネル（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）については４つのマルチプレックスＰＣＲ反応が存在し、キアゲン・ジーンリード・ディー・エヌ・エー・シーク・ヒト乳癌パネル（Ｑｉａｇｅｎ ＧｅｎｅＲｅａｄ ＤＮＡｓｅｑ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）については４つのマルチプレックスＰＣＲ反応が存在した。

【0124】

０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブに付属のキャップで蓋をし、３秒間軽くボルテックスし、そしてミニセントリフュージ（ピペットコム社（Ｐｉｐｅｔｔｅ．ｃｏｍ）、マイフュージ１２プレイスミニセントリフュージ（ＭｙＦｕｇｅ １２ ｐｌａｃｅ ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、カタログ番号Ｃ１０１２）の中で３秒間回転させた。ＰＣＲ反応混合物の表面を覆う為の鉱油は必要なかった。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ）、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４３１４８７８）の中に置いた。以下の２種類の温度プロフィールをプライマーパネルのそれぞれについて実行した。

【0125】

ＰＣＲは、最初に２分間９８℃に保持し、続いて、９８℃で１５秒間の変性及びアニーリング及び６０℃で８分間の合成を１３サイクル行った。サイクル後、反応物を次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0126】

インキュベーション後、反応混合物を、緩衝液を交換せずにこの工程に直接進めた。以下の構成成分を、各上記反応物に直接添加した：２０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、２μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0127】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、１２８μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、１０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を新しいチューブに移し、以下の工程においてアッセイした。

【0128】

ＤＮＡフラグメントの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。前の工程で得た１μｌの精製したＤＮＡフラグメントを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。結果を図１４に示す。

【0129】

実施例１４
本明細書に記載の方法は、非常に小さい及び／又は損傷したＤＮＡ鋳型を用いる場合（特に、鋳型としてのＦＦＰＥ ＤＮＡを伴うマルチプレックスＰＣＲにおける非特異的増幅産物の除去の為を含む）にもなお使用できる。この実施例では、１０ｎｇのＦＦＰＥ ＤＮＡを各マルチプレックスＰＣＲ反応において使用したことを除いて、実施例６で記載したようにマルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、以下の構成成分を上記反応物に直接添加した：１０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、１μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、０．５ＭのＥＤＴＡで反応を停止させた。ＤＮＡを、実施例６で記載したように精製し、バイオアナライザー（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）でアッセイした。結果を図１５に示す。この実験は、２０７対のプライマー及び１０ｎｇのＦＦＰＡ ＤＮＡを含むマルチプレックスＰＣＲにより非特異的増幅産物が効率よく除去されたことを示していた。

【0130】

実施例１５
本明細書に記載の方法を使用して、リン酸化されたプライマーを含むマルチプレックスＰＣＲを試みた。イオンアンプリシーク（商標）ホットスポットキャンサーパネルｖ２（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭ ｈｏｔｓｐｏｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ ｖ２）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４４７５３４６）のプライマーパネルをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって５’末端でリン酸化した。次いで、プライマーをマルチプレックスＰＣＲ反応において１０μｌ中で５０ｎＭで使用した。その後、マルチプレックスＰＣＲ及びＤＮＡ精製を実施例８に記載したように行った。精製したＤＮＡを２０μｌの蒸留水の中でマグネティックビーズから溶離させた。

【0131】

ＤＮＡフラグメントを、先に精製したＤＮＡ溶液に対して以下を添加することにより合計４０μｌの中で平滑末端にした：４μｌの１０×ブラントエンドバッファー（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ）（１×ブラントバッファー（ｂｌｕｎｔ ｂｕｆｆｅｒ）：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＡＴＰ、０．４ｍＭのｄＮＴＰ）、１２単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＤＰ−１００）、４０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＰＫ−１００）。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを室温で１０分間インキュベートした。

【0132】

反応後、実施例８で記載したように、ＤＮＡを１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＤＮＡを２０μｌの蒸留水の中でマグネティックビーズから溶離させた。

【0133】

以下の構成成分を精製したＤＮＡ溶液に添加した：４μｌの１０×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）、０．５μｌの１００ｍＭのＡＴＰ、１μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で４０μＬまで。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを７２℃で１０分間インキュベートした。

【0134】

インキュベーション後、反応混合物を、緩衝液を交換せずにこの工程に直接進めた。以下の構成成分を、各上記反応物に直接添加した：２０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、２μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0135】

反応後、実施例８で記載したように、ＤＮＡを１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製し、１０μｌの蒸留水の中で溶離させた。

【0136】

アダプターの連結の為に、２つのオリゴヌクレオチドをインテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。一方のオリゴは、イルミナ・トゥルーシーク・ユニバーサルアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｄａｐｔｅｒ）（５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ^＊Ｔ３’）と同じヌクレオチド配列を有しており、他方は、トゥルーシーク・アダプター・インデックス１（ＴｒｕＳｅｑ ａｄａｐｔｅｒ ｉｎｄｅｘ １）（５’ＰＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ３’）と同じ配列を有する。ここでは、^＊は、配列に更に付加されたホスホロチオエート結合を表す。二本鎖アダプターを作製する為に、上記オリゴを、０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ中の１００μｌの全量の中で、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ）中に、それぞれ１０μＭで一緒に混合した。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））の中に置き、９５℃で２分間、７５℃で１分間、５５℃で１分間加熱し、次の工程に進めるまで２５℃に保持した。

【0137】

以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：４μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２μｌの１０μＭのアダプター、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）、１μｌの９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２３８Ｓ）、及び蒸留水で４０μＬまで。１６℃で１５分間、次いで４５℃で１５分間インキュベートした。

【0138】

以下の構成成分を上記反応に直接添加した：１ｕｌのラムダエキソヌクレアーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２６２Ｓ）、１ｕｌの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２９３Ｓ）。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0139】

反応後、ＤＮＡを、実施例８に記載したように、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製し、２０μｌの蒸留水の中で溶離させた。

【0140】

上記工程により得たＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって５サイクル更に増幅した。以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．５μｌの１０μＭのプライマーミックス、２μｌのオムニ・クレンタック・ポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で５０μｌまで。ＰＣＲを、サーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））で、９８℃で２分間の変性、その後、９８℃で１５秒、５８℃で１分の５サイクルにより実行し、その後、次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0141】

ＰＣＲに使用したプライマーは以下であった：５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ３’及び５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ３’。これらのオリゴは、インテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。

【0142】

最後に、ＤＮＡを、実施例８に記載したように、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製し、２０μｌのＴＥ緩衝液の中で磁気ビーズから溶離させた。

【0143】

ライブラリーの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。先の工程で得た各ライブラリー１μｌを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。結果を図１６に示す。この実施例では、連結及び２回目のＰＣＲの後、有意な量の標的アンプリコンは生じなかった。

【0144】

実施例１６
連結されていないアダプターを除去する工程を含まないライブラリーの作製を、本明細書に記載の方法を使用してうまく実行できた。その後、マルチプレックスＰＣＲ及びＤＮＡ精製を実施例８に記載したように行った。精製したＤＮＡを２０μｌの蒸留水の中でマグネティックビーズから溶離させた。

【0145】

ＤＮＡフラグメントを、先に精製したＤＮＡ溶液に対して以下を添加することにより合計４０μｌの中で平滑末端にした：４μｌの１０×ブラントエンドバッファー（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ）（１×ブラントバッファー（ｂｌｕｎｔ ｂｕｆｆｅｒ）：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＡＴＰ、０．４ｍＭのｄＮＴＰ）、１２単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＤＰ−１００）、４０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＰＫ−１００）。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを室温で１０分間インキュベートした。

【0146】

反応後、実施例８で記載したように、ＤＮＡを１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＤＮＡを２０μｌの蒸留水の中でマグネティックビーズから溶離させた。

【0147】

以下の構成成分を精製したＤＮＡ溶液に添加した：４μｌの１０×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）、０．５μｌの１００ｍＭのＡＴＰ、１μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で４０μＬまで。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを７２℃で１０分間インキュベートした。

【0148】

インキュベーション後、反応混合物を、緩衝液を交換せずにこの工程に直接進めた。以下の構成成分を、各上記反応物に直接添加した：２０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、２μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0149】

反応後、実施例８で記載したように、ＤＮＡを１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製し、１０μｌの蒸留水の中で溶離させた。

【0150】

アダプターの連結の為に、２つのオリゴヌクレオチドをインテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。一方のオリゴは、イルミナ・トゥルーシーク・ユニバーサルアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｄａｐｔｅｒ）（５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ^＊Ｔ３’）と同じヌクレオチド配列を有しており、他方は、トゥルーシーク・アダプター・インデックス１（ＴｒｕＳｅｑ ａｄａｐｔｅｒ ｉｎｄｅｘ １）（５’ＰＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ３’）と同じ配列を有する。ここでは、^＊は、配列に更に付加されたホスホロチオエート結合を表す。二本鎖アダプターを作製する為に、上記オリゴを、０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ中の１００μｌの全量の中で、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ）中に、それぞれ１０μＭで一緒に混合した。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））の中に置き、９５℃で２分間、７５℃で１分間、５５℃で１分間加熱し、次の工程に進めるまで２５℃に保持した。

【0151】

以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：４μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２μｌの１０μＭのアダプター、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）、１μｌの９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２３８Ｓ）、及び蒸留水で４０μＬまで。１６℃で１５分間、その後４５℃で１５分間インキュベートした。

【0152】

反応後、ＤＮＡを、実施例８に記載したように、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製し、２０μｌの蒸留水の中で溶離させた。

【0153】

上記工程により得たＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって５サイクル更に増幅した。以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．５μｌの１０μＭのプライマーミックス、２μｌのオムニ・クレンタック・ポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で５０μｌまで。ＰＣＲを、サーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））で、９８℃で２分間の変性、その後、９８℃で１５秒、５８℃で１分の５サイクルにより実行し、その後、次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0154】

ＰＣＲに使用したプライマーは以下であった：５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ３’及び５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ３’。これらのオリゴは、インテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。

【0155】

最後に、ＤＮＡを、実施例８に記載したように、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製し、２０μｌのＴＥ緩衝液の中で磁気ビーズから溶離させた。

【0156】

ライブラリーの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。先の工程で得た各ライブラリー１μｌを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。結果を図１７に示す。いくつかの非特異的産物が最終的なライブラリーの中に存在していた。

【0157】

実施例１７
本明細書に記載の方法を使用してライブラリーを作製できる。例えば、図１８は、２９１５対のプライマーを含むライブラリーの生産において非特異的増幅産物を除去する為のリゾルバーゼの使用の結果を説明している。

【0158】

この実施例では、実施例８で記載したようなプライマーパネルキアゲン・ジーンリード・ディー・エヌ・エー・シーク・ヒト乳癌パネル（Ｑｉａｇｅｎ ＧｅｎｅＲｅａｄ ＤＮＡｓｅｑ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号ＮＧＨＳ−００１Ｘ−１２）を使用して、ライブラリーを作製する為のワークフローを試験した。その後、マルチプレックスＰＣＲ及びＤＮＡ精製を実施例８に記載したように行った。精製したＤＮＡを２０μｌの蒸留水の中でマグネティックビーズから溶離させた。

【0159】

ＤＮＡフラグメントを、先に精製したＤＮＡ溶液に対して以下を添加することにより合計４０μｌの中で平滑末端にした：４μｌの１０×ブラントエンドバッファー（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ）（１×ブラントバッファー（ｂｌｕｎｔ ｂｕｆｆｅｒ）：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＡＴＰ、０．４ｍＭのｄＮＴＰ）、１２単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＤＰ−１００）、４０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＰＫ−１００）。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを室温で１０分間インキュベートした。

【0160】

反応後、実施例８で記載したように、ＤＮＡを１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＤＮＡを２０μｌの蒸留水の中でマグネティックビーズから溶離させた。

【0161】

以下の構成成分を精製したＤＮＡ溶液に添加した：４μｌの１０×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）、０．５μｌの１００ｍＭのＡＴＰ、１μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で４０μＬまで。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを７２℃で１０分間インキュベートした。

【0162】

インキュベーション後、反応混合物を、緩衝液を交換せずにこの工程に直接進めた。以下の構成成分を、各上記反応物に直接添加した：２０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、２μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0163】

反応後、実施例８で記載したように、ＤＮＡを１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製し、１０μｌの蒸留水の中で溶離させた。

【0164】

アダプターの連結の為に、２つのオリゴヌクレオチドをインテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。一方のオリゴは、イルミナ・トゥルーシーク・ユニバーサルアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｄａｐｔｅｒ）（５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ^＊Ｔ３’）と同じヌクレオチド配列を有しており、他方は、トゥルーシーク・アダプター・インデックス１（ＴｒｕＳｅｑ ａｄａｐｔｅｒ ｉｎｄｅｘ １）（５’ＰＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ３’）と同じ配列を有する。ここでは、^＊は、配列に更に付加されたホスホロチオエート結合を表す。二本鎖アダプターを作製する為に、上記オリゴを、０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ中の１００μｌの全量の中で、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ）中に、それぞれ１０μＭで一緒に混合した。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））の中に置き、９５℃で２分間、７５℃で１分間、５５℃で１分間加熱し、次の工程に進めるまで２５℃に保持した。

【0165】

以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：４μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２μｌの１０μＭのアダプター、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）、１μｌの９°Ｎ商標）ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２３８Ｓ）、及び蒸留水で４０μＬまで。１６℃で１５分間、次いで４５℃で１５分間インキュベートした。

【0166】

以下の構成成分を上記反応に直接添加した：１ｕｌのラムダエキソヌクレアーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２６２Ｓ）、１ｕｌの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２９３Ｓ）。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0167】

反応後、ＤＮＡを、実施例８に記載したように、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製し、２０μｌの蒸留水の中で溶離させた。

【0168】

上記工程により得たＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって５サイクル更に増幅した。以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．５μｌの１０μＭのプライマーミックス、２μｌのオムニ・クレンタック・ポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で５０μｌまで。ＰＣＲを、サーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））で、９８℃で２分間の変性、その後、９８℃で１５秒、５８℃で１分の５サイクルにより実行し、その後、次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0169】

ＰＣＲに使用したプライマーは以下であった：５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ３’及び５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ３’。これらのオリゴは、インテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。

【0170】

最後に、ＤＮＡを、実施例８に記載したように、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製し、２０μｌのＴＥ緩衝液の中で磁気ビーズから溶離させた。

【0171】

ライブラリーの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。先の工程で得た各ライブラリー１μｌを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。結果を図１８に示す。この実施例では、標的増幅産物が２００〜３００ｂｐの間のピークにより示される。ごくわずかなバックグラウンドが上記で議論したリゾルバーゼ処理後に残っている。

【0172】

実施例１８
図１９は、シーケンシング用の２０７対のプライマーを用いて作製したライブラリーの別の例を説明している。この実施例では、イオンアンプリシーク（商標）ホットスポットキャンサーパネルｖ２（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭ ｈｏｔｓｐｏｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ ｖ２）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４４７５３４６）のプライマーパネルをマルチプレックスＰＣＲにおいて使用した。このプライマーパネルは、５０の発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子に由来するおよそ２，８００のＣＯＳＭＩＣ突然変異を網羅する。これは１つのプールの中に２０７のプライマー対を有する。マルチプレックスＰＣＲ反応を１０μｌ中で行った。以下の構成成分を０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ（トーマスサイエンティフィック社（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、スナップストリップＩＩナチュラル０．２ｍｌ ＰＣＲストリップチューブ（Ｓｎａｐｓｔｒｉｐ ＩＩ ｎａｔｕｒａｌ ０．２ｍｌ ＰＣＲ ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ）、カタログ番号１２２８Ｆ７３）のそれぞれに添加した：５μｌの２倍に濃縮したプライマープール、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１×ＰＣＲ緩衝液：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのｄＮＴＰ）、２μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）（エンザイマティック社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、Ｐ７５００−ＬＣ−Ｆ）、１μｌの１０ｎｇ／μｌのヒトＤＮＡ（コーリエル社（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＮＡ１２８７８）、及び１μｌの蒸留水。

【0173】

０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブに付属のキャップで蓋をし、３秒間軽くボルテックスし、そしてミニセントリフュージ（ピペットコム社（Ｐｉｐｅｔｔｅ．ｃｏｍ）、マイフュージ１２プレイスミニセントリフュージ（ＭｙＦｕｇｅ １２ ｐｌａｃｅ ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、カタログ番号Ｃ１０１２）の中で３秒間回転させた。ＰＣＲ反応混合物の表面を覆う為の鉱油は必要なかった。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ）、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４３１４８７８）の中に置いた。

【0174】

ＰＣＲは、最初に９８℃で２分間保ち、続いて、９８℃で１５秒間の変性及びアニーリング及び６０℃で４分間の合成を１７サイクル行った。サイクル後、反応物を次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0175】

ＰＣＲ後、常磁性ビーズを用いてＤＮＡを吸着し、次いで上記常磁性ビーズを７０％のエタノールで洗浄して、タンパク質、ｄＮＴＰ、塩、及びＰＣＲプライマーの部分を取り除く除去した。常磁性ビーズはアムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）（アムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）、ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐ、カタログ番号ＭＤ６１０２１）によるものであった。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、次に、増幅させて混合したアンプリコンの体積の１．６倍に相当する６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。マグネティックラックの内側の磁石は、ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）によるものであった（ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）、カタログ番号Ｄ４Ｘ０ＤＩＡ−Ｎ５２）。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、２０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0176】

ＤＮＡフラグメントを、先に精製したＤＮＡ溶液に対して以下を添加することにより合計４０μｌの中で平滑末端にした：４μｌの１０×ブラントエンドバッファー（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ）（１×ブラントバッファー（ｂｌｕｎｔ ｂｕｆｆｅｒ）：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＡＴＰ、０．４ｍＭのｄＮＴＰ）、１２単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＤＰ−１００）、４０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＰＫ−１００）。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを室温で１０分間インキュベートした。

【0177】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、２０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0178】

以下の構成成分を精製したＤＮＡ溶液に添加した：４μｌの１０×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）、０．５μｌの１００ｍＭのＡＴＰ、１μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で４０μＬまで。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを７２℃で１０分間インキュベートした。

【0179】

インキュベーション後、反応混合物を、緩衝液を交換せずにこの工程に直接進めた。以下の構成成分を、各上記反応物に直接添加した：２０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、２μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0180】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、１２８μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、１０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0181】

アダプターとの連結の為に、２つのオリゴヌクレオチドをインテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。一方のオリゴは、イルミナ・トゥルーシーク・ユニバーサルアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｄａｐｔｅｒ）（５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ^＊Ｔ３’）と同じヌクレオチド配列を有しており、他方は、トゥルーシーク・アダプター・インデックス１（ＴｒｕＳｅｑ ａｄａｐｔｅｒ ｉｎｄｅｘ １）（５’ＰＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ３’）と同じ配列を有する。ここでは、^＊は、配列に更に付加されたホスホロチオエート結合を表す。二本鎖アダプターを作製する為に、上記オリゴを、０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ中の１００μｌの全量の中で、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ）中に、それぞれ１０μＭで一緒に混合した。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））の中に置き、９５℃で２分間、７５℃で１分間、５５℃で１分間加熱し、次の工程に進めるまで２５℃に保持した。

【0182】

以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：４μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２μｌの１０μＭのアダプター、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）、１μｌの９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２３８Ｓ）、及び蒸留水で４０μＬまで。１６℃で１５分間、次いで４５℃で１５分間インキュベートした。

【0183】

以下の構成成分を上記反応に直接添加した：１ｕｌのラムダエキソヌクレアーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２６２Ｓ）、１ｕｌの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２９３Ｓ）。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0184】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、２０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0185】

上記工程により得たＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって５サイクル更に増幅した。以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．５μｌの１０μＭのプライマーミックス、２μｌのオムニ・クレンタック・ポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で５０μｌまで。ＰＣＲを、サーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））で、９８℃で２分間の変性、次いで、９８℃で１５秒、５８℃で１分の５サイクルにより実行し、その後、次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0186】

ＰＣＲに使用したプライマーは以下であった：５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ３’及び５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ３’。これらのオリゴは、インテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。

【0187】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、２０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0188】

ライブラリーの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。先の工程で得た各ライブラリー１μｌを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。結果を図１９に示す。このライブラリーをシークマティック・エル・シー・シー社（ＳｅｑＭａｔｉｃ ＬＬＣ）（フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ），ＣＡ ９４５３９）によりシーケンシング及び分析し、結果を図２２（表１）に示す。このライブラリーは３００塩基対（例えば、２００〜４００ｂｐ）の主要なピークを有していた。表１は、２０７対のプライマーを用いたライブラリーのシーケンシング結果の質的確認を示している。詳細の最重要点は、ＰＣＴ＿ＰＦ＿ＵＱ＿ＲＥＡＤＳ＿ＡＬＩＧＮＥＤ ９９．４６％、ＰＣＴ＿ＡＭＰＬＩＦＩＥＤ＿ＢＡＳＥＳ ９５．６３％、平均値の≧２０％にあるアンプリコンの百分率９８．５５％である。被覆率（ＰＣＴ＿ＴＡＲＧＥＴ＿ＢＡＳＥＳ＿２Ｘ−ＰＣＴ＿ＴＡＲＧＥＴ＿ＢＡＳＥＳ＿１００Ｘ）は、この実施例では優れた（９９．９７〜１００％）被覆率を示し、一方、均一性（９８．５５％の平均値の≧２０％にあるアンプリコンの百分率）は極めて高かった。

【0189】

実施例１９
図２０は、シーケンシング用の２０７対の長いプライマーを用いて本明細書に記載したように作製したライブラリーの別の例を示している。このライブラリーの分析を図２３の表（表２）に示す。この実施例では、プライマーパネルは、５’ＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ３’を各正方向プライマーの５’末端に付加し、５’ＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ３’を各逆方向プライマーの５’末端に付加したことを除いて、イオンアンプリシーク（商標）ホットスポットキャンサーパネルｖ２（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ^ＴＭ ｈｏｔｓｐｏｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ ｖ２）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４４７５３４６）のプライマーパネルと同じであった。これらの「長い」プライマーは、ＰＣＲの更なる回によるアンプリコン上へのアダプターの容易な付加を可能にする。マルチプレックスＰＣＲ反応を１０μｌ中で行った。以下の構成成分を０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ（トーマスサイエンティフィック社（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、スナップストリップＩＩナチュラル０．２ｍｌ ＰＣＲストリップチューブ（Ｓｎａｐｓｔｒｉｐ ＩＩ ｎａｔｕｒａｌ ０．２ｍｌ ＰＣＲ ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ）、カタログ番号１２２８Ｆ７３）のそれぞれに添加した：５μｌの２倍に濃縮したプライマープール、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１×ＰＣＲ緩衝液：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのｄＮＴＰ）、２μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）（エンザイマティック社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、Ｐ７５００−ＬＣ−Ｆ）、１μｌの１０ｎｇ／μｌのヒトＤＮＡ（コーリエル社（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＮＡ１２８７８）、及び１μｌの蒸留水。

【0190】

０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブに付属のキャップで蓋をし、３秒間軽くボルテックスし、そしてミニセントリフュージ（ピペットコム社（Ｐｉｐｅｔｔｅ．ｃｏｍ）、マイフュージ１２プレイスミニセントリフュージ（ＭｙＦｕｇｅ １２ ｐｌａｃｅ ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、カタログ番号Ｃ１０１２）の中で３秒間回転させた。ＰＣＲ反応混合物の表面を覆う為の鉱油は必要なかった。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ）、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４３１４８７８）の中に置いた。

【0191】

ＰＣＲは、最初に２分間９８℃に保持し、続いて、９８℃で１５秒間の変性及びアニーリング及び６０℃で４分間の合成を１７サイクル行った。サイクル後、反応物を次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0192】

ＰＣＲ後、常磁性ビーズを用いてＤＮＡを吸着し、次いで上記常磁性ビーズを７０％のエタノールで洗浄して、タンパク質、ｄＮＴＰ、塩、及びＰＣＲプライマーの部分を取り除く除去した。常磁性ビーズはアムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）（アムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）、ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐ、カタログ番号ＭＤ６１０２１）によるものであった。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、次に、増幅させて混合したアンプリコンの体積の１．６倍に相当する６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。マグネティックラックの内側の磁石は、ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）によるものであった（ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）、カタログ番号Ｄ４Ｘ０ＤＩＡ−Ｎ５２）。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、２０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0193】

以下の構成成分を、各上記反応物に直接添加した：２０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、２μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0194】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、１２８μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、１０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0195】

上記工程により得たＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって５サイクル更に増幅した。以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．５μｌの１０μＭのプライマーミックス、２μｌのオムニ・クレンタック・ポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で５０μｌまで。ＰＣＲを、サーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））で、９８℃で２分間の変性、その後、９８℃で１５秒、５８℃で１分の５サイクルにより実行し、その後、次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0196】

ＰＣＲに使用したプライマーは以下であった：５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ３’及び５’ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ３’。これらのオリゴは、インテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。

【0197】

ライブラリーの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。先の工程で得た各ライブラリー１μｌを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。結果を図２０に示す。このライブラリーをシークマティック・エル・シー・シー社（シークマティック・エル・シー・シー社（ＳｅｑＭａｔｉｃ ＬＬＣ））（フリーモント（フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）），ＣＡ ９４５３９）によりシーケンシング及び分析し、結果を図２３の表２に表した。このライブラリーは３００塩基対（例えば、２００〜４００）の主要なピークを有していた。図２３に示した２０７対の長いプライマーを用いたライブラリーのシーケンシング結果の質的確認は、ＰＣＴ＿ＰＦ＿ＵＱ＿ＲＥＡＤＳ＿ＡＬＩＧＮＥＤ ９９．６２％、ＰＣＴ＿ＡＭＰＬＩＦＩＥＤ＿ＢＡＳＥＳ ９８．９４％、及び高い均一性（例えば、平均値の≧２０％にあるアンプリコンの百分率９７．５２％）を含む詳細の最重要点を示している。

【0198】

実施例２０
図２１Ａは、非特異的増幅産物を減少させる為のリゾルバーゼでの処理を含め本明細書に記載したように作製したライブラリーの別の例の結果を示している。ここでは、ライブラリーを、シーケンシング用の１６０００対のプライマーを用いて作製した。表３（図２４）はこのライブラリーの分析を記載している。

【0199】

プライマーパネルは、イオンアンプリシーク（商標）コンプリヘンシブ・キャンサー・パネル（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４４７７６８５）であった。このプライマーパネルは、頻繁に突然変異する、学術論文に記載されている４０９の重要な腫瘍抑制遺伝子及び発癌遺伝子の全てのエキソンを網羅する。これは、４つのプールの中に１６０００のプライマー対を有し、各プールがおよそ４，０００のプライマー対を有する。アンプリコンの長さは１２５〜１７５塩基対までの範囲であり、標的領域はおよそ１７３万塩基を網羅する。ライブラリーをこのパネル及びライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ ２．０を用いて作製し、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のイオン・ピー・ジー・エム（商標）システム（Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）ｓｙｓｔｅｍ）でシーケンシングした場合、このパネルは、９７％の標的塩基（１回の実行あたりマップされた全ての塩基のうち、標的領域にマップされた塩基）について＞２０％のシークエンシング深度中央値で９４％のカバー率が報告されている。マルチプレックスＰＣＲでは、４つのプライマープールのそれぞれに鋳型としての１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡが必要であり、パネル全体を網羅する為には合計４０ｎｇが必要である。このプライマーパネルの各プライマーの中には少なくとも１つのウラシルヌクレオチドが存在する。このプライマーパネルは２倍濃縮されている。従って、４つのＰＣＲ反応をプライマーの４つのプールのそれぞれを用いて行った。

【0200】

マルチプレックスＰＣＲ反応を１０μｌ中で行った。以下の構成成分を０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ（トーマスサイエンティフィック社（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、スナップストリップＩＩナチュラル０．２ｍｌ ＰＣＲストリップチューブ（Ｓｎａｐｓｔｒｉｐ ＩＩ ｎａｔｕｒａｌ ０．２ｍｌ ＰＣＲ ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ）、カタログ番号１２２８Ｆ７３）のそれぞれに添加した：５μｌの２倍に濃縮したプライマープール、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１×ＰＣＲ緩衝液：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのｄＮＴＰ）、２μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）（エンザイマティック社（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、Ｐ７５００−ＬＣ−Ｆ）、１μｌの１０ｎｇ／μｌのヒトＤＮＡ（コーリエル社（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＮＡ１２８７８）、及び１μｌの蒸留水。イオンアンプリシーク（商標）コンプリヘンシブ・キャンサー・パネル（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）について４つのマルチプレックスＰＣＲ反応が存在した。

【0201】

０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブに付属のキャップで蓋をし、３秒間軽くボルテックスし、そしてミニセントリフュージ（ピペットコム社（Ｐｉｐｅｔｔｅ．ｃｏｍ）、マイフュージ１２プレイスミニセントリフュージ（ＭｙＦｕｇｅ １２ ｐｌａｃｅ ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、カタログ番号Ｃ１０１２）の中で３秒間回転させた。ＰＣＲ反応混合物の表面を覆う為の鉱油は必要なかった。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ）、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号４３１４８７８）の中に置いた。以下の２種類の温度プロフィールをプライマーパネルのそれぞれについて実行した。

【0202】

ＰＣＲは、最初に２分間９８℃に保持し、続いて、９８℃で１５秒間の変性及びアニーリング及び６０℃で８分間の合成を１３サイクル行った。サイクル後、反応物を次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0203】

ＰＣＲ後、いずれかのイオンアンプリシーク（商標）コンプリヘンシブ・キャンサー・パネル（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）のフルプライマーパネルを表している４つの反応を合わせて１つにし、４０μｌの増幅させたアンプリコンライブラリーの１つのチューブを得た。常磁性ビーズを用いてＤＮＡを吸着し、次いで上記常磁性ビーズを７０％のエタノールで洗浄して、タンパク質、ｄＮＴＰ、塩、及びＰＣＲプライマーの部分を取り除く除去した。常磁性ビーズはアムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）（アムスバイオ・エル・シー・シー社（Ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ）、ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐ、カタログ番号ＭＤ６１０２１）によるものであった。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、次に、増幅させて混合したアンプリコンの体積の１．６倍に相当する６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。マグネティックラックの内側の磁石は、ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）によるものであった（ケイ・ジェイ・マグネティクス社（ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）、カタログ番号Ｄ４Ｘ０ＤＩＡ−Ｎ５２）。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、２０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0204】

ＤＮＡフラグメントを、先に精製したＤＮＡ溶液に対して以下を添加することにより合計４０μｌの中で平滑末端にした：４μｌの１０×ブラントエンドバッファー（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ）（１×ブラントバッファー（ｂｌｕｎｔ ｂｕｆｆｅｒ）：それぞれ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＡＴＰ、０．４ｍＭのｄＮＴＰ）、１２単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＤＰ−１００）、４０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（モレキュラー・クローニング・ラボラトリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号Ｔ４ＰＫ−１００）。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを室温で１０分間インキュベートした。

【0205】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、２０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0206】

以下の構成成分を精製したＤＮＡ溶液に添加した：４μｌの１０×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１×Ａテーリングバッファー（Ａ-ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）、０．５μｌの１００ｍＭのＡＴＰ、１μｌのオムニ・クレンタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で４０μＬまで。各チューブの中の反応混合物を、最初にミニセントリフュージの中で３秒間軽く回転させてチューブの底に全ての液滴を集め、３秒間ボルテックスし、その後、再び３秒間回転させて反応物の均一性を確保した。チューブを７２℃で１０分間インキュベートした。

【0207】

インキュベーション後、反応混合物を、緩衝液を交換せずにこの工程に直接進めた。以下の構成成分を、各上記反応物に直接添加した：２０μｌの２×消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）、２μｌのＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、部品番号７８３００ ５０ＫＵ）、１８ｕｌの蒸留水。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0208】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、１２８μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、１０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0209】

アダプターとの連結の為に、２つのオリゴヌクレオチドをインテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。一方のオリゴは、イルミナ・トゥルーシーク・ユニバーサルアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｄａｐｔｅｒ）（５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ^＊Ｔ３’）と同じヌクレオチド配列を有しており、他方は、トゥルーシーク・アダプター・インデックス１（ＴｒｕＳｅｑ ａｄａｐｔｅｒ ｉｎｄｅｘ １）（５’ＰＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ３’）と同じ配列を有する。ここでは、^＊は、配列に更に付加されたホスホロチオエート結合を表す。二本鎖アダプターを作製する為に、上記オリゴを、０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブ中の１００μｌの全量の中で、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ）中に、それぞれ１０μＭで一緒に混合した。チューブをサーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６-ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））の中に置き、９５℃で２分間、７５℃で１分間、５５℃で１分間加熱し、次の工程に進めるまで２５℃に保持した。

【0210】

以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：４μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２μｌの１０μＭのアダプター、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）、１μｌの９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２３８Ｓ）、及び蒸留水で４０μＬまで。１６℃で１５分間、次いで４５℃で１５分間インキュベートした。

【0211】

以下の構成成分を上記反応に直接添加した：１ｕｌのラムダエキソヌクレアーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２６２Ｓ）、１ｕｌの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）、カタログ番号Ｍ０２９３Ｓ）。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。

【0212】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、２０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0213】

上記工程により得たＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって５サイクル更に増幅した。以下の構成成分を上記ＤＮＡ溶液に添加した：５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２．５μｌの１０μＭのプライマーミックス、２μｌのオムニ・クレンタック・ポリメラーゼ（Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（４．２単位／μｌ）、及び蒸留水で５０μｌまで。ＰＣＲを、サーモスサイクラー（ジーンアンプ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００ ９６ウェルゴールドプレーティッド（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ９６−ｗｅｌｌ ｇｏｌｄ ｐｌａｔｅｄ））で、９８℃で２分間の変性、次いで、９８℃で１５秒間、５８℃で１分間の５サイクルにより実行し、その後、次の工程に進めるまで１０℃に保持した。

【0214】

ＰＣＲに使用したプライマーは以下であった：５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ３’及び５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ３’。これらのオリゴは、インテグレイティッドＤＮＡテクノロジーズ株式会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。

【0215】

反応後、ＤＮＡを、１．６倍量のＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズで１回精製した。ＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズをボルテックスにより容器内で均一になるように懸濁し、６４μｌのＭａｇＳｉ−ＮＧＳｐｒｅｐビーズを各チューブに添加した。これらのチューブを５秒間ボルテックスすることにより混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの上に２分間置いてビーズを捕捉した。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。マグネティックラックからチューブを動かさずに、１５０μｌの新しく作った７０％エタノールを各チューブに添加した。次いで、チューブをマグネットラック上で１８０度回転させて、各チューブの内壁の一方の側からビーズペレットを剥がし、反対側にペレットさせた。溶液が透明になった後、ビーズペレットをかき乱さないように上清を注意深くピペッティングにより取り出し、廃棄した。ビーズをこの方法で計２回、７０％エタノールで洗浄した。最後の洗浄において７０％エタノールをピペッティングにより取り出した後、チューブをミニセントリフュージの中で３秒間回転させた。チューブの内側に残留している全てのエタノールの液滴を、ビーズペレットをかき乱すことなく、ピペッティングにより取り出した。ビーズペレットを、チューブのキャップを開けてマグネットラック上で室温で３分間風乾させた。最後に、チューブをマグネティックラックから取り出し、２０μｌの蒸留水を各チューブに添加した。チューブを５秒間激しくボルテックスしてビーズを蒸留水に再懸濁させ、ミニセントリフュージの中で３秒間回転させ、マグネティックラックの中に２分間置いた。溶液が透明になった後、溶離したＤＮＡフラグメントを含有する上清を、それぞれ新しいチューブに移した。

【0216】

ライブラリーの大きさ、濃度、及び純度を２１００バイオアナライザー機器（２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号Ｇ２９３８Ｂ）でアッセイした。先の工程で得た各ライブラリー１μｌを高感度ＤＮＡ分析キット（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号５０６７−４６２６）で、供給業者により提供される方法に従ってアッセイした。結果を図２１Ｂに示す。このライブラリーをシークマティック・エル・シー・シー社（ＳｅｑＭａｔｉｃ ＬＬＣ）（フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ），ＣＡ ９４５３９）によりシーケンシング及び分析し、結果を表３（図２４）に表した。図２１Ａで概要を説明したように、ライブラリー（次世代シーケンシングに使用できる）を、１６０００対のプライマー及びヒトゲノムＤＮＡ（ＮＡ１２８７８）を用いて、実施例３に記載した方法により作製し、最終的なライブラリーを図２１Ｂに示した。このライブラリーは、３００塩基対（２００〜４００ｂｐ）の１つのピークがある。表３（図２４）に示すように、１６０００対のプライマーを用いて作製したこのライブラリーのシーケンシング結果の質的確認は、高い被覆率と均一性の両方を生じる（例えば、ＰＣＴ＿ＰＦ＿ＵＱ＿ＲＥＡＤＳ＿ＡＬＩＧＮＥＤ ９８．１８％、ＰＣＴ＿ＡＭＰＬＩＦＩＥＤ＿ＢＡＳＥＳ ９９．３９％、平均値の≧２０％にあるアンプリコンの百分率９５．２０％）。

【0217】

本明細書中で使用されている用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明を限定することを意図したものではない。例えば、本明細書中で使用される場合、単数形「ある（ａ、ａｎ）」、及び「上記（ｔｈｅ）」は、文脈が明白にそうでないことを示していない限りは、複数形も同様に含むことが意図される。更に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び／又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書中で使用される場合、記載される特徴、工程、操作、要素、及び／又は構成成分の存在を明示するが、１つ以上の他の特徴、工程、操作、要素、構成成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しないことが、理解されるであろう。本明細書中で使用される場合、用語「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、関連する列挙された要素のうちの１つ以上の任意の組み合わせ及び全ての組み合わせを含み、「／」により省略される場合がある。

【0218】

用語「第１の（ｆｉｒｓｔ）」及び「第２（ｓｅｃｏｎｄ）」は本明細書において様々な特徴／要素（工程を含む）を説明する為に使用され得るが、これらの特徴／要素は、文脈がそうでないことを示していない限りは、これらの用語によって限定されないものとする。これらの用語は、１つの特徴／要素を別の特徴／要素と区別する為に使用され得る。従って、本発明の教示から逸脱することなく、以下で議論される第１の特徴／要素を、第２の特徴／要素と呼ぶことができ、同様に、以下で議論される第２の特徴／要素を第１の特徴／要素と呼ぶことができる。

【0219】

本明細書及び以下の特許請求の範囲全体を通じて、文脈がそうでないことを求めていない限りは、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、様々な構成成分をその方法及び物品の中で一緒に利用できることを意味する（例えば、組成物、並びにデバイス及び方法を含む装置）。例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、任意の記載される要素又は工程の包含を暗に意味するものとして理解され、任意の他の要素又は工程の排除を意味するものとしては理解されないであろう。

【0220】

明細書及び特許請求の範囲においてで使用され（実施例で使用される場合を含む）、そうでないことが明白に記載されていない場合は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が明記されていなくても、全ての数値に用語「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が先行するものとして読むことができる。表現「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、大きさ及び／又は位置を説明する際に使用される場合があり、これは、記載された値及び／又は位置が、妥当な予想される値及び／又は位置の範囲内に収まることを指示する。例えば、ある数値は、記載された値（又は値の範囲）の＋／−０．１％である値、記載された値（又は値の範囲）の±１％、記載された値（又は値の範囲）の±２％、記載された値（又は値の範囲）の±５％、記載された値（又は値の範囲）の±１０％等の値を有し得る。文脈がそうでないことを示していない限りは、本明細書に提供される任意の数値はまた、約その値又はおよそその値も含むと理解されるものとする。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。本明細書に記載の値の範囲は、その中に包含される全ての副範囲を含むことを意図している。ある値が、その値「以下」であると開示される場合は、当業者には適切に理解されているように、「その値以上」及び、値の間の可能な範囲もまた開示されることもまた理解される。例えば、値「Ｘ」が開示される場合、「Ｘ以下」及び「Ｘ以上」（ここでは、Ｘは数値である）もまた開示される。明細書全体を通して、データが多数の異なる形式で提供されいること、並びにこのデータが、終点及び始点、並びに複数のデータ点の任意の組み合せの範囲を表すこともまた理解される。例えば、特定のデータ点「１０」と、特定のデータ点「１５」とが開示される場合、１０及び１５より大きい、１０及び１５以上、１０及び１５未満、１０及び１５以下、並びに１０及び１５と等しいことが開示され、更には、１０〜１５も同様に開示されるとみなされることが理解される。また、２つの特定の単位間にある各単位もまた開示されることも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合は、１１、１２、１３、及び１４もまた開示される。

【0221】

様々な説明の為の実施形態について上に記載してきたが、特許請求の範囲に記載されるような本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態に対して任意の多数の変更を行うことができる。例えば、記載された様々な方法の工程が行われる順序は、代替的な実施形態では変更される場合があり、他の代替的な実施形態では、１つ以上の方法の工程が完全にスキップされる場合がある。様々なデバイス及びシステムの実施形態の随意の特徴を、いくつかの実施形態では含めることができ、また他の実施形態では含めないこともできる。従って、上記の説明は、主に例示を目的として提供されたものであり、特許請求の範囲に示される本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。

【0222】

本明細書に含まれる実施例及び図は、限定ではなく例示として、本主題を実施できる特定の実施形態を示している。上記のように、他の実施形態を例示した実施形態から利用及び導き出すことができ、その結果、本開示の範囲から逸脱することなく、構造的及び論理的な置換及び変更を行うことができる。本主題のそのような実施形態は、本明細書において、単に便宜上、用語「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」によって個別的及び／又は集合的に呼称され得るが、これは、２以上の発明が実際に開示されている場合に、本出願の範囲をいずれか１つの発明又は創造的な発想に自発的に限定することを意図するものではない。従って、特定の実施形態について本明細書中で説明及び記載してきたが、同じ目的を達成する為に算出される任意の構成で、示されている特定の実施形態を置換してもよい。本開示は、様々な実施形態のありとあらゆる応用形態又は変形形態を網羅することを意図している。上記説明を検討すれば、上記実施形態及び本明細書で詳細には説明されていない他の実施形態の組み合せが、当業者には明らかであろう。
〔付記１〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅する工程であって、前記増幅工程は、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を生じさせる、工程；
異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを導入する工程；並びに
前記非特異的増幅産物をリゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程
を含み、
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちの一方である、方法。
〔付記２〕
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記３〕
前記標的特異的増幅産物を分析する工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記４〕
前記分析工程は、次世代シーケンシング反応を含む、付記３に記載の方法。
〔付記５〕
前記増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、付記１に記載の方法。
〔付記６〕
前記標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、付記１に記載の方法。
〔付記７〕
前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである、付記１に記載の方法。
〔付記８〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の前記標的特異的プライマーを含む、付記１に記載の方法。
〔付記９〕
前記標的特異的プライマーは、１０対〜１０００対の前記標的特異的プライマーを含む、付記１に記載の方法。
〔付記１０〕
前記標的特異的プライマーは、１，０００〜約１００，０００対の前記標的特異的プライマーを含む、付記１に記載の方法。
〔付記１１〕
前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、付記１に記載の方法。
〔付記１２〕
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、異常なＤＮＡ構造を認識する、付記１に記載の方法。
〔付記１３〕
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである、付記１に記載の方法。
〔付記１４〕
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記１５〕
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する工程を更に含み、
前記非特異的増幅産物をエキソヌクレアーゼで切断する前記工程は、前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行った後に、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩのうちの少なくとも一方を含むエキソヌクレアーゼで前記非特異的増幅産物を切断する工程を含む、付記１に記載の方法。
〔付記１６〕
前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記１７〕
前記リゾルバーゼを導入する前記工程の前に、前記複数の標的特異的増幅産物及び前記複数の非特異的増幅産物上で末端修復を行う工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記１８〕
前記リゾルバーゼを導入する前記工程の後に、前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合に対してアダプターを連結させる工程を更に含む、付記１に記載の方法。
〔付記１９〕
前記アダプターは、少なくとも３個の連続するホスホロチオエートを含む、付記１８に記載の方法。
〔付記２０〕
前記リゾルバーゼで前記非特異的増幅産物を切断する前記工程は、前記非特異的増幅産物及び前記複数の標的特異的増幅産物を、約０．２Ｕ〜１０００Ｕのリゾルバーゼに対して、０．５分〜６０分、１６℃〜３７℃で曝露する工程を含む、付記１に記載の方法。
〔付記２１〕
前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合は、前記複数の標的特異的増幅産物の５０％超を含む、付記１に記載の方法。
〔付記２２〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；
異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを前記混合物に導入し、前記複数の非特異的増幅産物を前記リゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程であって、前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちのである、工程；並びに
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程
を含む、方法。
〔付記２３〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；
Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを前記混合物に導入する工程であって、前記Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩは、前記非特異的増幅産物上の異常なＤＮＡ構造を認識する、工程；
前記複数の非特異的増幅産物を前記Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物の５０％超を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程；並びに
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程
を含む、方法。
〔付記２４〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；
異常なＤＮＡ構造を認識するリゾルバーゼを前記混合物に導入し、前記複数の非特異的増幅産物を前記リゾルバーゼで切断して、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、複数の切断された非特異的増幅産物を生じさせる工程であって、前記リゾルバーゼはＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩのうちの一方である、工程；
前記切断された非特異的増幅産物を除去し、前記複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を残す工程；並びに；
前記標的特異的増幅産物を再増幅する工程
を含む、方法。
〔付記２５〕
前記標的特異的増幅産物上のニックをＤＮＡリガーゼで修復する工程を更に含む、付記２４に記載の方法。
〔付記２６〕
非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットであって、
前記キットは：
ポリメラーゼ；
複数の標的特異的プライマー対；
増幅緩衝液；リゾルバーゼ緩衝液；
異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも１種のリゾルバーゼ；及び
前記リゾルバーゼを使用した増幅後に、増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の前記キットの使用についての説明書
を含む、キット。
〔付記２７〕
少なくとも１つの核酸アダプターを更に含む、付記２６に記載のキット。
〔付記２８〕
少なくとも１つの核酸アダプターを更に含み、
前記少なくとも１つの核酸アダプターは、少なくとも３個のホスホロチオエートを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記２９〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の標的特異的プライマーを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３０〕
前記標的特異的プライマーは、約１，０００〜約１００，０００の前記標的特異的プライマーを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３１〕
前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３２〕
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、異常なＤＮＡ構造を認識する、付記２６に記載のキット。
〔付記３３〕
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである、付記２６に記載のキット。
〔付記３４〕
前記非特異的増幅産物を切断するためのエキソヌクレアーゼを更に含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３５〕
前記非特異的増幅産物を切断するためのエキソヌクレアーゼを更に含み、
前記エキソヌクレアーゼは、ラムダエキソヌクレアーゼ又は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩを含む、付記２６に記載のキット。
〔付記３６〕
非特異的増幅産物を選択的に除去する鋳型依存性プライマー伸張反応用のキットであって、
前記キットは：
ポリメラーゼ；
複数の標的特異的プライマー対；
増幅緩衝液；
リゾルバーゼ緩衝液；
異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識して切断する少なくとも１種のリゾルバーゼ；
前記標的特異的アンプリコンを再増幅するための再増幅ＰＣＲプライマー対；及び
リゾルバーゼを使用した増幅後に増幅反応による非特異的増幅産物を除去する為の前記キットの使用についての説明書
を含む、キット。
〔付記３７〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の標的特異的プライマーを含む、付記３６に記載のキット。
〔付記３８〕
前記標的特異的プライマーは、約１，０００〜約１００，０００の前記標的特異的プライマーを含む、付記３６に記載のキット。
〔付記３９〕
前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、付記３６に記載のキット。
〔付記４０〕
前記リゾルバーゼは、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、異常なＤＮＡ構造を認識する、付記３６に記載のキット。
〔付記４１〕
前記リゾルバーゼは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩである、付記３６に記載のキット。
〔付記４２〕
鋳型依存性プライマー伸張反応による非特異的増幅産物を減少させる方法であって、
前記方法は：
複数の標的特異的プライマーの対を使用して、複数の標的核酸を増幅することにより、複数の標的特異的増幅産物及び複数の非特異的増幅産物を含む混合物を形成する工程；
複数の標的特異的増幅産物のかなりの割合を維持しつつ、前記非特異的増幅産物を除去する為に異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質に対して前記混合物を導入する工程であって、前記異常なＤＮＡ構造は、ホリデー構造若しくはジャンクション、分岐したＤＮＡ、Ｙ構造、十字部、ヘテロデュブレックスループ、かさ高い付加物、一本鎖突出、ＤＮＡミスマッチ、又は完全にはマッチしていないＤＮＡのうちの少なくとも１つを含む、工程
を含む、方法。
〔付記４３〕
前記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合する前記タンパク質は、ＭｕｔＳである、付記４２に記載の方法。
〔付記４４〕
前記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合する前記タンパク質は、基体に連結される、付記４２に記載の方法。
〔付記４５〕
前記標的特異的増幅産物を分析する工程を更に含む、付記４２に記載の方法。
〔付記４６〕
前記標的特異的増幅産物を分析する工程を更に含み、
前記分析工程は、次世代シーケンシング反応を含む、付記４２に記載の方法。
〔付記４７〕
前記増幅工程は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、付記４２に記載の方法。
〔付記４８〕
前記標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、付記４２に記載の方法。
〔付記４９〕
前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである、付記４２に記載の方法。
〔付記５０〕
前記標的特異的プライマーは、少なくとも１０対の前記標的特異的プライマーを含む、付記４２に記載の方法。
〔付記５１〕
前記標的特異的プライマーは、約１，０００〜約１００，０００の前記標的特異的プライマーを含む、付記４２に記載の方法。
〔付記５２〕
前記標的特異的プライマーは、１００，０００超の前記標的特異的プライマーを含む、付記４２に記載の方法。
〔付記５３〕
前記異常なＤＮＡ構造を有するポリヌクレオチドを認識し、それに結合するタンパク質に対して、前記混合物を導入する前記工程は、前記非特異的増幅産物及び前記複数の標的特異的増幅産物を、０．５分〜２０分、２０℃〜４０℃で、インキュベートする工程を含む、付記４２に記載の方法。
〔付記５４〕
前記複数の標的特異的増幅産物の前記かなりの割合は、前記複数の標的特異的増幅産物の５０％超を含む、付記４２に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24】