特許 6757858 低胃毒性のナプロキセン系非ステロイド性抗炎症薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6757858

(24)【登録日】2020年9月2日

(45)【発行日】2020年9月23日

(54)【発明の名称】低胃毒性のナプロキセン系非ステロイド性抗炎症薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4415 20060101AFI20200910BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200910BHJP

   C07D 213/67 20060101ALI20200910BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/4415

   A61P29/00

   C07D213/67

【請求項の数】1

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2019-545236(P2019-545236)

(86)(22)【出願日】2017年10月31日

(65)【公表番号】特表2019-537627(P2019-537627A)

(43)【公表日】2019年12月26日

(86)【国際出願番号】RU2017000808

(87)【国際公開番号】WO2018084748

(87)【国際公開日】20180511

【審査請求日】2019年9月30日

(31)【優先権主張番号】2016143071

(32)【優先日】2016年11月2日

(33)【優先権主張国】RU

(73)【特許権者】

【識別番号】519159709

【氏名又は名称】アクトシオナーノエ オブシェストヴォ“タツフィムファルムプレパラティ”

(73)【特許権者】

【識別番号】519159710

【氏名又は名称】フェデラルノエ ゴスダーツヴェノエ アヴトノムノエ オブラゾヴァテルノエ ウシュレヅデノエ ヴィッシェゴ オブラゾヴァニヤ“カザンスキー（プリヴォルジュスキー）フェデラルニーユニバーシテット”

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】シュチルリン，ユーリイ グリゴレヴィッチ

(72)【発明者】

【氏名】パべレフ，ローマン セルゲーエヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】イクサノヴァ，アルフィヤ ガブドゥラッハトヴナ

(72)【発明者】

【氏名】シュチルリン，ニキータ ヴァレリーヴィッチ

(72)【発明者】

【氏名】プガチェフ，ミハイール ヴラジーミロヴィッチ

(72)【発明者】

【氏名】バラキン，コンスタンティン ヴァレリーヴィッチ

(72)【発明者】

【氏名】アジャマレットディノヴ，アレクサンドラ マゾビッチ

(72)【発明者】

【氏名】ガニーヴ，イヌール マクームトヴィッチ

(72)【発明者】

【氏名】マランイーヴァ，アルヴィーナ ジェナードエヴィナ

【審査官】 星 功介

(56)【参考文献】

【文献】 ロシア国特許出願公開第２５１３０８９（ＲＵ，Ａ）

【文献】 特開昭５５−３６４８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１０１０６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５２６１５１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ｃ０７Ｄ ２１３／６７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）：

である、抗炎症、鎮痛および解熱作用、ならびに低減した急性毒性および胃毒性を有するナプロキセン系非ステロイド性抗炎症薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高い抗炎症性、鎮痛性および解熱作用、ならびに低い急性毒性および胃毒性であり、医薬品産業、医学および獣医学で使用できる式Ｉの新規ナプロキセン誘導体に関する。

【0002】

【化1】

【背景技術】

【0003】

非ステロイド性抗炎症薬（以降ではＮＳＡＩＤ）の処方のための主な適応症は、種々の性質および局在性、痛みおよび発熱の炎症プロセスである。ＮＳＡＩＤは、最も広く使用されている薬物群の１つである。例えば、ＮＳＡＩＤは、内部臓器の種々の疾患を有する入院患者の約２０％に対し処方される（非特許文献１）。

【0004】

ＮＳＡＩＤの作用機序の主要要素は、炎症メディエーター−プロスタグランジンの合成の抑制である。変化のプロセス（炎症の第１の段階）中に、細胞膜は、ホスホリパーゼＡ２の酵素の作用下でアラキドン酸に代謝されるリン脂質を放出する。次に、アラキドン酸は、２つの方式：シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）で代謝される。ＮＳＡＩＤはＣＯＸのみを抑制し、そのため、ＮＳＡＩＤは炎症の第２の段階の発達のみを阻止する（非特許文献１）。

【0005】

２種のＣＯＸイソ酵素が存在し、ＣＯＸ−１（構成的、通常存在）は、胃、血管および腎臓の生理学的機能を調節するプロスタノイドの産生を制御し、ＣＯＸ−２（誘導性）は、炎症におけるプロスタグランジンの合成に関与する。ＣＯＸ−２は通常、存在せず、炎症反応を誘導する組織因子（サイトカイン、など）の影響下で形成される。ＮＳＡＩＤの抗炎症作用は、ＣＯＸ−２の抑制が原因であり、副作用はＣＯＸ−１の抑制が原因であると考えられている（非特許文献１）。

【0006】

最もよく知られたＮＳＡＩＤは、ケトプロフェン（３−ベンゾイル−α−メチルベンゼン酢酸）、イブプロフェン（（ＲＳ）−２−（４−イソブチルフェニル）プロピオン酸）、ジクロフェナク（２−［（２，６−ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸）、インドメタシン（１−（４−クロロベンゾイル）−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸）およびナプロキセン（（Ｓ）−６−メトキシ−α−メチル−２−ナフタレン酢酸）である。現在では、ナプロキセンがＮＳＡＩＤ群の中で指導的地位の１つを占めており、その理由は、他のＮＳＡＩＤより長い作用を有し、耐容性が良好であるためである（非特許文献２）。

【0007】

今日まで知られているＮＳＡＩＤ、すなわち、非選択的シクロオキシゲナーゼ阻害剤の欠点は、それらの顕著な胃毒性である（非特許文献３）。ＣＯＸ−２の選択的阻害剤は、胃毒性が低いが、それらの心臓血管系に対する悪影響が知られている（非特許文献４）。したがって、この申請資料の提出の時点で、両タイプのＮＳＡＩＤ−選択的および非選択的シクロオキシゲナーゼ阻害剤の副作用を減らすという問題が未解決のまま残されている。

【0008】

このように、安全で効果的なＮＳＡＩＤの開発は、総体的に見て、薬物療法および健康管理の内で最も重要な仕事の１つである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】欧州特許出願公開第２４３１３６１号明細書

【特許文献2】国際公開第２００８１０１０６４号

【特許文献3】ロシア国特許出願公開第２５１３０８９号明細書

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｐａｒｔ ｏｎｅ／ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａ．Ｎ．Ｍｉｒｏｎｏｖ．−Ｍ．：Ｇｒｉｆ ａｎｄ Ｋ Ｐｕｂｌ．，２０１２．ｐ．９４４．

【非特許文献2】Ｍａｓｈｋｏｖｓｋｙ Ｍ．Ｄ．Ｌｅｋａｒｓｔｖｅｎｎｙｅ ｓｒｅｄｓｔｖａ．［Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｄｒｕｇｓ．］１６ｔｈ ｅｄ．，ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ−Ｍ．：Ｎｏｖａｙａ Ｖｏｌｎａ ［Ｎｅｗ Ｗａｖｅ］ Ｐｕｂｌ．，２０１２．ｐ．１２１６．

【非特許文献3】Ｈａｎｄａ，Ｏ．Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ／Ｏ．Ｈａｎｄａ，Ｙ．Ｎａｉｔｏ，Ａ．Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．Ｏｍａｔｓｕ，Ｔ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ／／Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．−２０１４．− Ｖ．５４，Ｎ．１．−Ｐ．２−６．

【非特許文献4】Ｓｉｎｇｈ，Ｂ．Ｋ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ／Ｂ．Ｋ．Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｅ．Ｈａｑｕｅ，Ｋ．Ｋ．Ｐｉｌｌａｉ／／Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．−２０１４．−Ｖ．１０，Ｎ．２．−Ｐ．１４３−１５６．

【非特許文献5】Ｌｉｕ，Ｗ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｒｃｕｍｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＮＳＡＩＤｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｔｅｘｔ］／Ｗ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｌｉ，Ｙ．Ｙｕｅ，ほか．／／Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．−２０１５．−Ｖ．２５，Ｎ．１５．−Ｐ．３０４４−３０５１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

技術レベルの分析に基づいた出願者の見解では、最も有望な抗炎症薬の開発方向は、非選択的ＮＳＡＩＤの探索である。同時に、上述のように、開発者は、副作用を減らすという仕事に直面する。この副作用の主要なものは胃毒性である。

【0012】

非選択的ＣＯＸ阻害剤のカルボキシル基の保護は、このＮＳＡＩＤ群の毒性を減らす主要な方法の１つである。エステル保護がこの目的のために最もよく使用される（非特許文献５）。ＮＳＡＩＤエステルは，典型的な前投薬であり、これは、消化管（以降ではＧＩＴと呼ぶ）中で酵素加水分解を受けて、ＮＳＡＩＤが徐々に放出され、薬物の長期作用をもたらす。さらに、エステル系前投薬は、より良好に細胞膜に進入し、そのため、ＧＩＴの粘膜に対し刺激作用が少ない。ＮＳＡＩＤのアスコルビン酸エステルは、アリール酢酸またはアリールプロピオン酸の誘導体，例えば、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン並びにそれらの塩であることが知られている［特許文献１、２０１２年３月２１日に公示］。関節炎、痛みおよび炎症プロセスの治療のために、ナプロキセンの２（メタンスルホニル）エチルエステルがＨ２受容体アンタゴニストと一緒に提案された［特許文献２、２００８年８月２１日公示］。このＮＳＡＩＤの改変は、胃毒性の低減に繋がるが、同時に、治療効果も大きく低減する。この理由のため、これらの化合物は診療に採用されてこなかった。

【0013】

同時に起こる特徴と請求される発明に対する達成される技術的結果の最も近い組み合わせは、特許文献３「Ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」の発明に記載の技術的解決策である。この特許の最も重要なポイントは、抗炎症活性を有する一般式（Ｉ）のピリドキシン誘導体である：

【0014】

【化2】

式中、
Ｒ_２＋Ｒ_３＝−Ｃ（ＣＨ_３）_２−またはＣＨ（ＣＨ_３）−の場合、Ｒ_１＝

【0015】

【化3】

であり、Ｒ_１＝Ｈの場合；Ｒ_３＝Ｈ；Ｒ_２＝

【0016】

【化4】

であり、あるいは、Ｒ_１＝Ｒ_２＝Ｒ_３＝

【0017】

【化5】

【0018】

３種のナプロキセンのフラグメントを含むプロトタイプ型は、効果的抗炎症化合物である。特に、これは、亜急性の（ホルマリン）浮腫のインビボモデルに対し、顕著な抗炎症作用を有する。

【0019】

しかし、急性（カラゲニン）浮腫のインビボモデルに対しては、このプロトタイプは十分に効果的ではなかった。プロトタイプは示した技術的解決策では、胃毒性を含む低毒性と組み合わせた、固有の一連の特性、すなわち、高抗炎症（急性（カラゲニン）浮腫のインビボモデルに対し）、鎮痛作用および解熱作用を同時に有していないことに留意することは重要である。この理由のために、出願者は、このプロトタイプを比較薬物とは見なさず、その代わりに、最近の非ステロイド性抗炎症薬ナプロキセンおよびその類似体をこの目的のために使用する（表３）。

【課題を解決するための手段】

【0020】

請求された組成物のための請求された技術的解決策は、追加のナプロキセンのフラグメントの存在がプロトタイプに記載のものとは異なり、これにより、出願者の実験的根拠のある見地によれば、薬理学的に重要な好ましい効果が現れる。したがって、請求された共有結合エステル結合の分子の組み合わせは、生理的条件下で分解し、ナプロキセンとピリドキシンのフラグメントを連結する非共有結合のイオン結合が相乗的効果を出現させるが、これは専門家にも明らかなことではない。これらの効果は、増大した抗炎症、鎮痛作用および解熱作用として現れ、さらに、顕著に低減した胃毒性および急性毒性として現れる。特に、請求された式Ｉの化合物は、低減した胃毒性および急性毒性を背景にして、急性および亜急性の両方の浮腫インビボモデルに対する顕著な抗炎症作用の急速な開始を確実にし、それにより、出願者は、プロトタイプおよびナプロキセンを含む多くの他のＮＳＡＩＤの両方に特有の、克服できないように見える問題を解決できる（後者はまた、請求された技術的解決策のプロトタイプでもある）。

【0021】

請求された技術的解決策の目的は、指定用途への既知の手段を大きく広げる、高い抗炎症、鎮痛作用および解熱作用を有し、胃毒性を含む毒性の低いナプロキセン系医薬品を生成することである。

【0022】

本発明の技術的結果は、ピリドキシンおよびナプロキセン系の新規非ステロイド性抗炎症薬であり、プロトタイプを含む既知のＮＳＡＩＤと比較して、顕著に低い胃毒性を含む毒性を背景にした高い抗炎症、鎮痛および解熱作用を示す。

【0023】

式Ｉの化合物を合成し、それを、低減された胃毒性を備えた抗炎症、鎮痛および解熱剤として使用することにより、問題は解決され、請求された技術的結果は達成される。

【0024】

【化6】

【0025】

請求された技術的解決策は、次の資料に示される：
スキーム−式Ｉの化合物の合成の化学的スキーム；
表１−分析用ＨＰＬＣの勾配溶出モードパラメーター；
表２−胃内投与における式Ｉの化合物の急性毒性；
表３−式Ｉの化合物およびいくつかの既知のＮＳＡＩＤの特性比較；
表４−２０００ｍｇ／ｋｇの用量での単剤投与による式Ｉの化合物の胃毒性；
表５−胃内投与における式Ｉの化合物の急性滲出性炎症に対する効果；
表６−ラットに対する式Ｉの化合物の鎮痛作用；
表７−ラットに対する式Ｉの化合物の解熱作用；

【発明を実施するための形態】

【0026】

請求された化合物の組成および構造を確証する情報は、具体的実施例中に示されている。得られた化合物の構造は、^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ分光法、ＵＶ分光法、クロマトグラフィー−質量分析法により確認した。

【0027】

ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ−４００装置で記録した。化学シフトは、重水素化溶媒（^１Ｈおよび^１３Ｃ）の残留プロトンのシグナルに対して決定した。生成物の融解温度は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＰＡ−１００ ＯｐｔｉＭｅｌｔを用いて、１℃／分の加熱速度で測定した。ＵＶ分光光度計Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ３００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、式Ｉの化合物の溶液のスペクトル特性を調査した。比旋光度は、自動偏光計ＡＤＰ４４０＋（Ｂ＆Ｓ）（英国）により、石英マトリックスチューブ１００°Ｚを用いて測定した。ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００，ＡＢ Ｓｃｉｅｘ（ドイツ）質量分析計を用いて、１０ｅＶに相当する窒素分子による衝突エネルギーで、イオン化−ターボイオンスプレー（ＴＩＳ）−によるメタノール溶液からの高解像度質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を記録した。

【0028】

式Ｉの化合物の純度の測定は、表１の勾配溶出方式の値を用いて、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ダイオードアレイ検出器（サイズ４．６ｘ５０ｍｍ、３．５μｍ）を備えた高速液体クロマトグラフＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（日本）を使って、逆相ＨＰＬＣにより実施した。カラムサーモスタットの温度は＋４０℃、流量は１ｍｌ／分、導入した試料の量は１ｍｇ／ｍｌである。２２０ｎｍの分析波長、ならびに不純物測定のための２５４および３３０ｎｍの波長を用いてＵＶ検出を実施した。移動相として：チャネルＡ−水中の０．１体積％のギ酸、チャネルＢ−アセトニトリルを使用した。ポンプの操作モードは勾配溶出であり、分析時間は２２分である。

【0029】

【表1】

【0030】

請求された技術的解決策の具体的実施形態の実施例
ピリドキシン（ビタミンＢ_６）およびナプロキセンのフラグメントを含む請求された式Ｉの化合物の調製は、市販の基質、試薬および溶媒を用いて、以下のスキームに従って、２段階で実施した。

【0031】

【化7】

【実施例1】

【0032】

（２Ｓ，２’Ｓ）−（５−（（Ｓ）−２−（６−メトキシナフタ−２−イル）プロパノイルオキシ）−６−メチルピリジン−３，４−ジイル）ビス（メチレン）ビス（２−（６−メトキシナフタ−２−イル）プロパノエート）（化合物ＩＶ）の調製
丸底フラスコに、５ｌのアセトン中の、２８．３５ｇのピリドキシン塩酸塩ＩＩ、９５．２３ｇのナプロキセンＩＩＩ、５０．５２ｇの４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンならびに１２３．７３ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを装填する。ジシクロヘキシル尿素の沈殿物の形成が停止するまで、反応混合物を攪拌した後、沈殿物を濾過し、２００ｍｌのアセトンで洗浄し、濾液を真空中で蒸発させた。生成物をシリカゲルによるカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−石油エーテル＝１：１の溶出液）で精製する。生成物ＩＶが白色結晶質物質として得られる（収量８２．０ｇ、７４％）。より詳細には、この化合物の調製物およびその性質は、特許文献３による発明に記載されている。

【実施例2】

【0033】

３−（（Ｓ）−２−（６−メトキシナフタ−２−イル）プロパノイルオキシ）−４，５−ビス（（（Ｓ）−２−（６−メトキシナフタ−２−イル）プロパノイルオキシ）メチル）−２−メチルピリジニウム（Ｓ）−２−（６−メトキシナフタ−２−イル）プロパノエート（化合物Ｉ）の調製
８２．０ｇの化合物ＩＶを丸底フラスコに入れ、１ｌのアセトンを加えて、１０分間撹拌する。得られた溶液に、１８．２２ｇの（Ｓ）−２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオン酸（ナプロキセン）ＩＩＩを加え、沈殿物が完全に無くなるまで撹拌する。ロータリーエバポレーター（９０ｒｐｍ、残圧１０ミリバール、温度４０℃）を用いて真空中でアセトンを除去する。沈殿物を収集し、ロータリーエバポレーター（９０ｒｐｍ、残圧１０ミリバール、温度８０℃）を用いて真空下で乾燥する。請求された化合物Ｉの収率は１００．１ｇ（９９．９％）である。

【0034】

融解温度は１４５℃である。［α］^２４_Ｄ＝＋２２．８°（ｃ＝３．０１、ＣＨ_２Ｃｌ_２）。式Ｉの化合物の溶液の吸収スペクトルは、アセトニトリルおよび塩化メチレン中、２００〜４５０ｎｍの範囲の波長で測定する。この場合、最大吸収は、２６２、２７２、３１７および３３２ｎｍにある。最大位置の偏差は±２ｎｍである。溶液の濃度は４０μｇ／ｍｌである。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルで下記のシグナルが観察される（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ、ｐｐｍ、Ｊ／Ｈｚ）：１．３３（ｂｒ ｄ，３Ｈ，ＣＨ_３，^３Ｊ＝３．７）；１．４０（ｄ，３Ｈ，ＣＨ_３，^３Ｊ＝７．１）；１．５０（ｄ，６Ｈ，２ＣＨ_３，^３Ｊ＝７．１）；１．９０（ｂｒ ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３）；３．４７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，）；３．６５（ｋ，１Ｈ，ＣＨ，^３Ｊ＝７．１）；３．７４−３．８７（ｍ，１３Ｈ）；４．５０（ｂｒ ｓ，１ Ｎ）；４．８０（ｂｒ ｓ，１ Ｎ）；４．９５および５．０４（ＡＢ，２Ｈ，ＣＨ_２，^２Ｊ＝−１２．８）；６．９５−７．６６（ｍ，２０ Ｎ），８．１９（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）．^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルで下記のシグナルが観察される（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ、ｐｐｍ）：１７．９６；１８．４２；１８．５２；１８．９２；４５．０２；４５．３４；４５．３８；５５．４０；５７．１３；６１．６５；１０５．６６；１０５．７３；１１９．０９；１１９．１３；１１９．１８；１１９．３８；１２５．９６；１２６．０９；１２６．１６；１２６．２０；１２６．３８；１２６．５７；１２７．３０；１２７．３６；１２７．４９；１２８．９６；１２９．０１；１２９．３９；１２９．６４；１３３．７８；１３３．８１；１３３．８６；１３４．０５；１３４．１３；１３５．１８；１３５．２１；１３５．４２；１３６．１６；１４４．７８；１４７．１６；１５２．７５；１５７．７４；１５７．７９；１５７．９６；１７１．９５；１７４．０２；１７９．３０．

【0035】

標的物質Ｉは、化合物ＩＶとナプロキセンとの塩である。これに関しては、逆相ＨＰＬＣの条件（表１）下、この塩はクロマトグラム上に化合物ＩＶとナプロキセンに相当する２つのピークとして現れ、その質量スペクトルは、計算データおよび文献データ（それぞれ、８０６．３３２４および２２９．０８７０）に対応する。

【0036】

式Ｉの化合物の急性毒性の調査
実験は、両方の性のＷｉｓｔａｒラット、６匹／群に対し、固定用量法に従って実施した。初期胃内投与量は、５０００ｍｇ／ｋｇとした。使用溶媒は０．５％ツイーン８０溶液（ツイーン８０−ポリオキシエチレンのソルビタンおよびオレイン酸誘導体；市販ポリマー）で、これは、０．５ｇのツイーン８０を１００ｍｌの蒸留水中に溶解することにより調製した。

【0037】

５０００ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、２５ｇの試験化合物を、秤のＶｉｂｒａ（新光電子、日本、カタログ番号ＡＦ２２５ＤＲＣＥ）上のポリスチレンボート中に秤取して、クラスＡの精度の１００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で１００ｍｌに調節し、調製物の懸濁液を分散剤ＳｉｌｅｎｔＣｒｕｓｈｅｒ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｐ／Ｎ５９５−０６０００−００−３）を用いて均一な粘稠度になるまで撹拌した。

【0038】

食料を与えていない（８時間以上の期間）が水は自由に与えた動物に対し、投与を実施した。投与の量は、投与の直前に記録した体重を基準にして、各動物に対し個別に計算した。フィードは投与の１時間後に新しくした。投与後３０分間動物を個別に観察した後、４時間の間は少なくとも１時間に１回、その後は１日１回で１４日間観察した。体重を調製物の投与の直前に記録して投与量を計算し、その後は、２日毎に１回記録した。試験中に動物が死亡した場合、死亡時間を特定し、可能な限り正確に記録した。可能な限り速やかに動物を秤量し、切開した。臨死動物は、秤量し、安楽死させて切開した。二酸化炭素の吸入により、動物を安楽死させた。ＩＢＭ ＳＰＳＳ 統計ソフトウェアを用いたプロビット分析により、毒性投与量ＬＤ_１０、ＬＤ_１６、ＬＤ_５０およびＬＤ_８４を計算した。

【0039】

５０００ｍｇ／ｋｇの投与量を胃内投与した場合には、動物の軽微な活動の抑制が観察された。２０〜３０分でこの症状は消失した。１．５〜２時間後、動物は食物と水の摂取を始めた。３日後、１匹のラット（雌）が倒れて死亡した。試験中を通して、さらなる死亡例はなかった。

【0040】

実験全体を通して、実験動物の生命活動の全ての主要な指標は、標準活動に相当し、対照の活動とは異ならなかった。動物は、良好な食欲、光沢のある外被を有し、可視粘膜は淡いピンク色であり、行動は、この種の動物に相当し、観察期間中に異常性は観察されなかった。ラットの体重は、実験の開始後２日および４日目に、それぞれ（１〜４）％および（２〜６）％増加し、これは、対照群のラットの体重増とほぼ一致した。調査の８日目に、動物の体重は、（２〜８）％増加した。実験終了時点で、体重は（５〜１３）％増加した。急性毒性パラメーターを表２に示す。

【0041】

【表2】

【0042】

実験の終わりに、対照および実験動物の安楽死および病理形態学的切開を実施した。ラットの剖検中、変化は観察されなかった。動物の死体は、適切な構造で、平均的であるか、または平均的肥満度であった。自然開口部：口は閉じられ、舌は口中にあり、唇および歯茎の粘膜は、淡いピンク色で、なめらかで、光沢がある。鼻開口部−粘膜は淡いピンク色で、乾燥し、流出物は無く、透過性は良好である。耳介は変化がなく、外耳道はきれいである。肛門は閉じ、粘膜は淡いピンク色である。毛髪はうまく保持され、毛被は光沢がある。皮膚は弾性があり、皮下線維は良好に発現し、黄色がかった色で弾性がある。筋肉は赤みがかっており、よく発達し、腱および靱帯は白色で弾性および耐久性がある。骨および関節の配置は、破壊されていない。胸部および腹部空洞の器官の位置は解剖学的に正しい。胸部および腹部空洞に体液はない。咽頭および食道の開通性は、破壊されていない。心臓の体積は変化していない。心臓の空洞は、少量の非凝集血を含み、心内膜はなめらかで光沢がある。肺は、淡いピンク色で、均一に着色し、膨潤の徴候はなく、分葉は良好に発現している。脾臓は拡大しておらず、シャープエッジを有し、楕円形状であり、弾性的堅さがあり、赤褐色である。肝臓は拡大しておらず、シャープエッジを有し、形状は変化しておらず、密度が高く、赤褐色である。胃は、均一な堅さの灰色のフィード塊を含む。胃の粘膜は淡い灰色である。腸の薄いまたは厚い部分の腸粘膜は、淡いピンク色または淡い灰色である。腎臓は、豆形状で、暗褐色であり、腎傍体では、わずかな量の脂肪があり、嚢は容易に分離し、皮質と脳ゾーンとの間の境界は発現している。膀胱は、空であるか、または淡黄色の尿で満たされ、粘膜は淡いピンク色である。生殖器は異常が無い。雄の精巣は、弾性的堅さがあって、陰嚢の空洞中にあり、楕円形状をしている。雌は、正常な卵巣および子宮を有する。脳は水腫性ではなく、脳の白質は弾性があり、出血はない。

【0043】

このように、実施した調査は、式Ｉの請求された化合物は、胃内投与後、第４危険物クラス、すなわち、低危険性物質（ＧＯＳＴ １２．１．００７−７６「有害物質。分類および一般安全性要件」）に属し、およびＬＤ_５０致死用量の観点でのその安全性は、現在まで知られているほとんどのＮＳＡＩＤを凌ぐ（表３）。例えば、請求された化合物は、ナプロキセンより８倍低い毒性である。

【0044】

【表3】

【0045】

式Ｉの化合物の胃毒性
胃毒性の調査では、６〜７週齡の、１８０〜２２０ｇの体重の雌および雄Ｗｉｓｔａｒラットを採用した。各群の動物の数は１０匹とした。
式Ｉの化合物を、調査前の１６時間にわたり断食させたラットの胃内に１回投与した。２０００ｍｇ／ｋｇの量の試験物質の懸濁液（ツイーン８０の０．５％水溶液中）の投与の３時間後に、動物を安楽死させた；それらの胃を取り出し、小弯に沿って切開し、生理的溶液で洗浄して内容物を取りだした。

【0046】

胃毒性の評価は、４点尺度法で実施された。
０−損傷なし；
０．５−充血；
１−単一微量損傷（１または２箇所の出血）；
２−複数の損傷（びらん、スポット出血）；
３−粘膜の顕著な複数の損傷（びらん、出血）；
４−粘膜の全表面にわたる全体損傷（広範囲の出血、びらん、穿孔）。

【0047】

評価の結果に従い、ＵＤ_５０−２点に相当する胃毒性（潰瘍発生）効果を引き起こす試験物質の投与量−を決定した。

【0048】

２０００ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、３２．０ｇの式Ｉの化合物を、秤のＶｉｂｒａ（新光電子、日本、カタログ番号ＡＦ２２５ＤＲＣＥ）上のポリスチレンボート中に秤取して、クラスＡの精度の４００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で４００ｍｌに調節し、調製物の懸濁液を分散剤ＳｉｌｅｎｔＣｒｕｓｈｅｒ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，ドイツ，Ｐ／Ｎ５９５−０６０００−００−３）を用いて均一な粘稠度になるまで撹拌した。ラットへの導入は、５ｍｌ／２００ｇ以下の量で実施される。

【0049】

二酸化炭素吸入法により、動物を安楽死させた。

【0050】

２０００ｍｇ／ｋｇの用量の式Ｉの化合物の単一導入では、胃毒性効果は、雄ラットの０．６点および雌ラットの０．４点の平均に一致した（表４）。

【0051】

【表4】

【0052】

このように、式Ｉの化合物に対しては、ＵＤ_５０の値は、＞２０００ｍｇ／ｋｇであり、これは、ほとんどのＮＳＡＩＤの類似のパラメーターを凌ぐ（表３）。例えば、請求された化合物は、ナプロキセンより４０倍低い毒性である。

【0053】

式Ｉの化合物のインビトロ抗炎症活性
立体構造的酵素シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ１）は、種々の細胞型で発現し、それらの正常な（生理学的）機能活性の確保に関与している。シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）は、重度炎症状態においてプロスタグランジンの合成に関与している。

【0054】

ＣＯＸ活性の分析は、シクロオキシゲナーゼのペルオキシダーゼ活性の測定にある。ＰＧＧ２（プロスタグランジンＧ２）と、ＣＯＸプローブとして使用されるキット「シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性アッセイキット（蛍光定量的）」（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，カタログ番号Ｋ５４９−１００）で提供されるＡＤＨＰ（１０−アセチル−３，７−ジヒドロフェノキサジン）との反応中に、蛍光成分レゾルフィンが形成され、この吸収波長は５３０〜５４０ｎｍ、発光波長は（５８５〜５９５）ｎｍである。蛍光強度は、試料中のＣＯＸの残留活性に正比例する。皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ）は、シクロオキシゲナーゼ酵素源として選択された。線維芽細胞のライセートは、２．１３１μＵ／ｍｇのＣＯＸ活性を有することが示された。

【0055】

細胞ライセートの調製：皮膚線維芽細胞（２〜６ｘ１０^６個）を１０ｍｌのリン酸緩衝液で１回洗浄する。細胞を５ｍｌの緩衝液に再懸濁し、１５ｍｌのチューブに移す。これを、１５００ｇで４分間遠心分離する。その後、上清を捨て、細胞ペレットを０．５〜１ｍｌのプロテアーゼ反応混液（１００μｌの細胞ペレットあたり約０．４ｍｌの緩衝液）を含む冷溶解緩衝液中に再懸濁し、４℃で１５分間、１０，０００ｇで遠心分離する。上清を分離し、ＣＯＸの原料として使用する。

【0056】

試薬の調製：ＣＯＸ補助因子を２μｌの補助因子を３９８μｌの緩衝液に使用直前に加えることにより、２００倍に溶解した。６５μｌのアラキドン酸および６５μｌのＮａＯＨを混合した後、１１７０μｌの蒸留水で１０倍に希釈する。この溶液は１時間、安定である。

【0057】

下記に示した次の試薬を混合することにより、反応混合物を調製する（２つの並列ウエルに対し）：
・ＣＯＸプローブ−２μｌ；
・溶解した補助因子−４μｌ（１時間安定）；
・細胞ライセート−２０μｌ；
・ＣＯＸ緩衝液を用いて、体積を１７２μｌにする。

【0058】

試験物質の調製：
ナプロキセンストック溶液およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０００μＭの濃度の式Ｉの物質を使用して、２倍希釈により予備的希釈液を調製する。それぞれ、６２．５〜１０００μＭの５つの希釈液を調製する。

【0059】

マルチチャンネルピペットを用いて、試薬を適切なプレートウエルに次のように加える：最初に、反応混合物、次に試験物質のＤＭＳＯ中の一連の濃度の溶液および対照物質（阻害剤ＣＯＸ１ ＳＣ５６０および阻害剤ＣＯＸ２ セレコキシブ）、純粋な溶媒ＤＭＳＯ（より高い活性のウエルに対し）。２回反復処理を行う。これらを５分間インキュベートする。

【0060】

反応の開始：反応の開始前に、プレートのウエル中で単回の蛍光測定を実施して、それ自身の試験物質および対照物質の信号を考慮する。その後、１０μｌのアラキドン酸溶液をマルチチャンネルピペットを用いてプレートの全ウエルに加えて、反応を開始する。アラキドン酸添加後、直ちに、蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８７ｎｍ）を反応速度モードで１５秒毎に３０分間にわたり測定する

【0061】

対照および試験物質による画像の蛍光パラメーターを式：
平均正味ＲＦＵ＝平均ＲＦＵ−平均ブランクＲＦＵ
ＣＯＸ阻害のパーセンテージは、次式に従って計算される：

【0062】

【数1】

【0063】

さらに、試験物質および基準物質（ナプロキセン）に対して利用できるデータポイントを用いて、我々は、最も好適するシグモイド阻害曲線を作製する。この曲線に基づいて、試験試料のＣＯＸに対するＩＣ_５０が計算される。

【0064】

使用したキットの製造業者の推奨に従って、ＣＯＸ１阻害剤ＳＣ５６０およびＣＯＸ２阻害剤セレコキシブを２μｌの体積で反応混合物に加える（この量は、適切なアイソフォームを完全に阻害するのに十分である）。ＳＣ５６０およびセレコキシブによる処理後に、細胞ライセート中に含まれるＣＯＸの残留活性は、それぞれ、７２．８％および３２．０％である。

【0065】

阻害活性の調査では、ナプロキセンおよび試験物質のウエル中の濃度は、１．２５〜２０μＭである。

【0066】

それぞれのアイソフォームの調製により阻害の割合を決定するために、選択的阻害剤ＣＯＸ１ ＳＣ５６０の存在下、ならびに選択的阻害剤ＣＯＸ２セレコキシブの存在下で、調査物質を一定の濃度パターンで試験する。阻害剤は、対応する酵素のアイソフォームを完全に阻害するのに十分な量であると同時に、他のアイソフォームが活性のまま残る量で添加される。

【0067】

試験調製物のみが１００％の存在下で活性を従来方式で仮定して、ＣＯＸ１およびＣＯＸ２の残留活性ならびに各アイソフォームの調製物による阻害パーセンテージが計算される。式Ｉの化合物は、ＣＯＸ２のアイソフォームに対し優先的阻害活性を示す。

【0068】

したがって、ナプロキセンＩＣ_５０（プロトタイプ）は９．５６μＭであり、これは、式Ｉの化合物のＩＣ_５０（７．７μＭ）の１．２５倍である。上記のことから、請求された式Ｉの化合物は、より低い濃度で作用するので、シクロオキシゲナーゼ阻害剤として、より効果的であることが結論できる。

【0069】

式Ｉの化合物のインビボ抗炎症活性
この実験は、６〜７週齡の、１８０〜２２０ｇの体重の雌および雄Ｗｉｓｔａｒラットを使って実施した。各群の動物の数は１０匹とした。

【0070】

１％のカラゲニン（アイルランドの紅藻類由来の硫酸化ポリサッカライド）溶液の０．１ｍｌの足底下（足底または足底腱膜の下）投与により、急性炎症反応（浮腫）を再現した。炎症反応の重症度を炎症誘導の３時間後に足の体積の変化により評価した（臓器容積測定法）。カラゲニンの１％溶液の導入の１時間前に、式Ｉの物質をプローブと共に胃中に投与した。０．５％のツイーン８０溶液を陰性対照として使用した。浮腫の減少で評価される、抗炎症効果を、対照のパーセンテージとして表した。分析物の４種の投与量の作用の結果に従い、ＥＤ_５０の計算を実施した。

【0071】

５０ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、１０００ｍｇの式Ｉの化合物を、秤のＶｉｂｒａ（新光電子、日本、カタログ番号ＡＦ２２５ＤＲＣＥ）上のポリスチレンボート中に秤取して、クラスＡの精度の２００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で２００ｍｌに調節し、調製物の懸濁液を分散剤ＳｉｌｅｎｔＣｒｕｓｈｅｒ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，ドイツ，Ｐ／Ｎ５９５−０６０００−００−３）を用いて均一な粘稠度になるまで撹拌した。ラットへの導入は、１ｍｌ／１００ｇ以下の量で実施された。得られた溶液の濃度は、５ｍｇ／ｍｌであった。

【0072】

２０ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、５ｍｇ／ｍｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）の濃度の４０ｍｌの溶液を採取し、クラスＡの精度の１００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で１００ｍｌに調節し、調製物の懸濁液を均一な粘稠度になるまで分散剤を用いて撹拌した。

【0073】

１０ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、５ｍｇ／ｍｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）の濃度の２０ｍｌの溶液を採取し、クラスＡの精度の１００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で１００ｍｌに調節し、調製物の懸濁液を均一な粘稠度になるまでマグネチックスターラーＭＲ Ｈｅｉ−Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，ドイツ）で撹拌した。

【0074】

５ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、５ｍｇ／ｍｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）の濃度の４ｍｌの溶液を採取し、クラスＡの精度の１００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で１００ｍｌに調節し、調製物の懸濁液を均一な粘稠度になるまでマグネチックスターラーで撹拌した。

【0075】

投与の３０分後に動物を個別に観察した後、４時間の間は少なくとも１時間に１回観察した。体重を調製物の投与の直前に記録して投与量を計算した。

【0076】

二酸化炭素の吸入により、動物を安楽死させた。

【0077】

５０、２０、１０および５ｍｇ／ｋｇの投与量の式Ｉの化合物が雄ラットに投与されると、炎症性浮腫は、対照群に対して、それぞれ、６２．３４、５１．２５、２３．５７および１２．３９％減少した。５０、２０、１０および５ｍｇ／ｋｇの投与量の式Ｉの化合物が雌ラットに投与されると、浮腫は、それぞれ、６５．４７、６７．８９、３８．６４および１３．３７％減少した。結果を表５に示す。

【0078】

【表5】

【0079】

得られたデータの統計処理の結果によると、雄に対する式Ｉの化合物のＥＤ_５０は、２３ｍｇ／ｋｇ、雌に対しては１４ｍｇ／ｋｇである。性の区別のないＥＤ_５０の平均値は、１８．５（約１９）ｍｇ／ｋｇである。

【0080】

文献によると、ＥＤ_５０は、ナプロキセンで１５ｍｇ／ｋｇ、イブプロフェンで４８ｍｇ／ｋｇ、ジクロフェナクナトリウムで８ｍｇ／ｋｇ、ピロキシカムで２０ｍｇ／ｋｇ、フェニルブタゾンで５６ｍｇ／ｋｇ、インドメタシンで１０ｍｇ／ｋｇ、アセチルサリチル酸で９８ｍｇ／ｋｇである（非特許文献１）。このように、出願者は、式Ｉの化合物の高抗炎症活性の存在を実験的に証明した。この化合物は、最近のＮＳＡＩＤの抗炎症活性よりその値が優れている（７つのケースの内の４つで）またはそれと同等である。

【0081】

式Ｉの化合物の鎮痛作用
式Ｉの化合物の鎮痛特性の調査では、６〜７週齡の、１８０〜２２０ｇの体重の雌および雄Ｗｉｓｔａｒラットを採用した。各群の動物の数は１０匹とした。

【0082】

カラゲニン（アイルランドの紅藻類由来の硫酸化ポリサッカライド）の１％溶液の０．１ｍｌの右後肢の足底下投与により、ラットにおける慢性免疫炎症のモデルとした。胃中プローブを使って、物質を胃内へ投与した。ナプロキセンを比較薬物として使用し、０．５％のツイーン８０溶液を陰性対照として使用した。浮腫の減少により評価した抗炎症効果を、対照に対するパーセンテージで表し、試験物質の４種の投与量の作用の結果に従い、ＥＤ_５０の計算を実施した。

【0083】

炎症性痛覚過敏（ラットの炎症性組織の増大した痛覚感受性）をカラゲニンにより生じさせ、カラゲニンの導入の前およびその３時間後に、動物の足組織の機械的刺激（圧迫）に対する痛覚感受性閾値−ＰＳＴの低減により（ＰＳＴの差異により）評価した。測定は、炎症性足に対し実施した。使用した無痛覚計Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ Ｓ．Ｒ．Ｌ．（イタリア）は、ラットの炎症性足に対し、疼痛反応が現れるまで（動物の鳴き声、または足を引っ込めることにより評価される）、後負荷を段階的に増加させる。分析物をカラゲニン投与の２時間後に投与した。ＥＤ_５０の評価による鎮痛作用を、分析物の胃内投与の１時間後の痛覚過敏の減少により評価した。調査物質の影響下で、疼痛反応閾値の増加は、足の圧迫力の増加で表され、調製物の鎮痛作用の強度を特徴付ける。実験後、二酸化炭素吸入法により、動物を安楽死させた。

【0084】

５０ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、１０００ｍｇの式Ｉの化合物を、秤のＶｉｂｒａ（新光電子、日本、カタログ番号ＡＦ２２５ＤＲＣＥ）上のポリスチレンボート中に秤取して、クラスＡの精度の２００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で２００ｍｌに調節し、懸濁液を分散剤ＳｉｌｅｎｔＣｒｕｓｈｅｒ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，ドイツ，Ｐ／Ｎ５９５−０６０００−００−３）を用いて均一な粘稠度に分散させた。ラットへの導入は、１ｍｌ／１００ｇ以下の量で実施された。得られた溶液の濃度は、５ｍｇ／ｍｌであった。

【0085】

２０ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、５ｍｇ／ｍｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）の濃度の４０ｍｌの溶液を採取し、クラスＡの精度の１００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で１００ｍｌに調節し、懸濁液を分散剤を用いて均一な粘稠度に分散させた。

【0086】

１０ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、５ｍｇ／ｍｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）の濃度の２０ｍｌの溶液を採取し、クラスＡの精度の１００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で１００ｍｌに調節し、懸濁液を均一な粘稠度になるまでマグネチックスターラーＭＲ Ｈｅｉ−Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，ドイツ）で撹拌した。

【0087】

５ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、５ｍｇ／ｍｌ（５０ｍｇ／ｋｇ）の濃度の４ｍｌの溶液を採取し、クラスＡの精度の１００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で１００ｍｌに調節し、懸濁液を均一な粘稠度になるまでマグネチックスターラーで撹拌した。
実験の結果を表６に示す。

【0088】

【表6】

【0089】

本結果から、請求された式Ｉの化合物は、５ｍｇ／ｋｇの投与量で既に、顕著な麻酔作用を示すが、一方、ナプロキセン（プロトタイプ）は、１５ｍｇ／ｋｇになってようやく類似の効果を有するということになり、これは、その高い効率の事実を実証するものである。したがって、鎮痛作用の観点での請求された化合物の治療指数（ＬＤ_５０／ＥＤ_５０）は、ナプロキセンの４２に対し、１０００を超え、また、安全指数（ＵＤ_５０／ＥＤ_５０）は、ナプロキセンの３．２に対して、４００を超える。

【0090】

ラットに対する式Ｉの化合物の解熱作用
式Ｉの化合物の解熱特性の調査では、６〜７週齡の、１８０〜２２０ｇの体重の雌および雄Ｗｉｓｔａｒラットを採用した。各群の動物の数は１０匹とした。

【0091】

発熱反応を、ベーキング酵母の２０％懸濁液の皮下投与により生じさせた。酵母の導入の前および導入の１８時間後に、電子体温計で直腸温を測定した（これらの間の差異は、推定体温上昇反応である）。調製物を体温上昇のピーク時（１８時間後）に動物に１回投与した。解熱作用は、試験物質の注入の２時間後の体温上昇の減少により評価し、動的作用（ｅｆｆｅｃｔ ｄｙｎａｍｉｃｓ）を７時間にわたり１時間間隔で記録した。

【0092】

７５ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、１５００ｍｇの式Ｉの化合物を、秤のＶｉｂｒａ（新光電子、日本、カタログ番号ＡＦ２２５ＤＲＣＥ）上のポリスチレンボート中に秤取して、クラスＡの精度の２００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で２００ｍｌに調節し、調製物の懸濁液を分散剤ＳｉｌｅｎｔＣｒｕｓｈｅｒ Ｍ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，ドイツ）を用いて均一な粘稠度になるまで撹拌した。ラットへの導入は、１ｍｌ／１００ｇ以下の量で実施された。得られた溶液の濃度は、７．５ｍｇ／ｍｌであった。

【0093】

５０ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、７．５ｍｇ／ｍｌ（７５ｍｇ／ｋｇ）の濃度の６６．７ｍｌの溶液を採取し、クラスＡの精度の１００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で１００ｍｌに調節し、調製物の懸濁液を均一な粘稠度になるまで分散剤を用いて撹拌した。

【0094】

２０ｍｇ／ｋｇの用量を調製するために、７．５ｍｇ／ｍｌ（７５ｍｇ／ｋｇ）の濃度の２６．７ｍｌの溶液を採取し、クラスＡの精度の１００ｍｌのメスフラスコに移し、ツイーン８０の０．５％の水溶液で１００ｍｌに調節し、調製物の懸濁液を均一な粘稠度になるまでマグネチックスターラーＭＲ Ｈｅｉ−Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ，ドイツ）で撹拌した。調製物投与後および酵母で誘導の１８時間後の温度の差異を体温上昇低減のパラメーターとして求めた。

【0095】

投与後、試験の全体を通して、個別に動物を観察した。体重を調製物の投与の直前に記録して投与量を計算した。全てのデータに対し、記述統計を用いた；平均値および平均値の標準誤差を計算し、最後の表７に結果を示した。ウィルコクソンノンパラメトリック基準を、実験群の統計比較に用いた。差異は、０．０５レベルの有意性で判定した。Ｒ−スタジオプログラムを用いて、統計分析を実施した。種々の投与量の式Ｉの化合物の解熱作用の調査結果を表７に示す。

【0096】

【表7】

【0097】

ベーキング酵母懸濁液の皮下投与の１８時間後、動物群で平均１．５℃の直腸温の増加が観察された。全体の観察期間を通して、対照群の動物では、温度の低下は、観察されなかった（調製物投与の７時間後まで）。２０ｍｇ／ｋｇの投与量の式Ｉの化合物の雄および雌の両方への投与により、解熱作用は観察されなかった。投与量を５０ｍｇ／ｋｇに増やした場合、雌の群で温度の明確な低下が観察された−すなわち、物質の投与の２および３時間後に、温度が投与前よりも０．９℃低く、投与の４、５、６および７時間後には、（０．５〜０．７）℃低下した。

【0098】

５０ｍｇ／ｋｇの投与量の式Ｉの化合物の投与により、投与の３〜４時間後に、有意な温度の低下が観察された。低下のレベルは、（０．３４〜０．９７）℃であった。

【0099】

最大の効果は、７５ｍｇ／ｋｇの投与量の式Ｉの化合物が投与された動物群で観察された。したがって、実験全体を通して、７５ｍｇ／ｋｇの投与量での物質の投与により、温度は有意に低下し、投与の前より（０．７６〜１．５）℃低かった。

【0100】

１５ｍｇ／ｋｇ（または６５μｍｏｌ／ｋｇ）の投与量のナプロキセンの投与の場合にも、温度は有意に低下した。温度低下のレベルは、（０．７４〜１．６）℃であった。

【0101】

得られた結果をまとめると、７５ｍｇ／ｋｇの投与量では、請求された化合物は、１５ｍｇ／ｋｇのナプロキセンの投与量のレベルの解熱特性を有すると結論づけられるべきである。ナプロキセンのモル質量は、式Ｉの化合物のモル質量よりかなり小さく、ナプロキセンの２３０ｇ／ｍｏｌと、請求された化合物の１０３６ｇ／ｍｏｌであることから、モルの観点からは、これらの投与量は、実用上は異ならないことに特に留意すべきである。解熱作用の観点での請求された化合物の治療指数（ＬＤ_５０／ＥＤ_５０）は、ナプロキセンの４２に対し、６７を超え、また、安全指数（ＵＤ_５０／ＥＤ_５０）は、ナプロキセンの３．２に対して、２７を超える。

【0102】

したがって、上記結果から、出願者はピリドキシンおよびナプロキセンに基づく新規化合物：３−（（Ｓ）−２−（６−メトキシナフタ−２−イル）プロパノイルオキシ）−４，５−ビス（（（Ｓ）−２−（６−メトキシナフタ−２−イル）プロパノイルオキシ）メチル）−２−メチルピリジニウム（Ｓ）−２−（６−メトキシナフタ−２−イル）プロパノエート、を得て、これは、ナプロキセン（プロトタイプ）の類似の特性に勝る、またはそれと同等の高い抗炎症、鎮痛および解熱特性と同時に、極端に低い毒性（胃毒性を含む）を維持する特性を同時に有するということになる。

【0103】

一般に、請求された化合物は、ナプロキセン（プロトタイプ）と比べて、８倍低い毒性で、４０倍低い胃毒性である。

【0104】

請求された技術的解決策は、発明に該当する「新規性」の基準を満たす。理由は、調査した技術のレベルからは、低胃毒性を含む低毒性を有する新規ピリドキシンおよびナプロキセン誘導体である、示した技術的結果の実現に繋がる本質的な特徴に関して請求されたものに一致する技術的解決策が見つからなかったためである。請求された化学的化合物は、リウマチ性疾患、ならびに炎症、疼痛および熱が伴う疾患の治療用製品の範囲を拡大し、使用の有効性および安全性の観点から、世界的に基本的に新規な、他に例を見ないものである。

【0105】

請求した技術的解決策は、この技術分野の専門家には明らかではない、すなわち、調査した技術レベルからは、請求された構造の抗炎症、鎮痛および解熱薬は特定されなかったので、本発明に該当する「進歩性」の基準に適合する。

【0106】

請求された技術的解決策は、標準的な装置、よく知られた国内の材料および技術を用いて任意の特殊化された事業で実施することができるので、「産業上の利用可能性」の基準に適合する。出願者は実験室で標的製品−請求された技術的結果を有するナプロキセン系非ステロイド性抗炎症薬を得、また、全ての請求された目的を達成した。