特許 6757981 微少流体を用いる白血球および微小粒子分画

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6757981

(24)【登録日】2020年9月3日

(45)【発行日】2020年9月23日

(54)【発明の名称】微少流体を用いる白血球および微小粒子分画

(51)【国際特許分類】

   G01N 35/08 20060101AFI20200910BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200910BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20200910BHJP

【ＦＩ】

   G01N35/08 A

   G01N33/53 K

   G01N37/00 101

【請求項の数】11

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2017-567746(P2017-567746)

(86)(22)【出願日】2016年6月30日

(65)【公表番号】特表2018-523118(P2018-523118A)

(43)【公表日】2018年8月16日

(86)【国際出願番号】SG2016050306

(87)【国際公開番号】WO2017003380

(87)【国際公開日】20170105

【審査請求日】2019年5月9日

(31)【優先権主張番号】10201505259T

(32)【優先日】2015年7月2日

(33)【優先権主張国】SG

(31)【優先権主張番号】10201510460P

(32)【優先日】2015年12月18日

(33)【優先権主張国】SG

(73)【特許権者】

【識別番号】506076891

【氏名又は名称】ナンヤン テクノロジカル ユニヴァーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】ホウ、ハン ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ベーム、ベルンハルト オット

(72)【発明者】

【氏名】テイ、フイ ミン

(72)【発明者】

【氏名】ロー、セイ チャイ ヨアヒム

【審査官】 長谷 潮

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１５２６４３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００７０５８１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０４６６２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／０５７１５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５２１００１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０８２０８１３８（ＵＳ，Ｂ２）

【文献】 国際公開第２０１３／０８５７９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０３９２３８２５（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−０５８３９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３８２４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５０００１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nivedita Nivedita，Continuous separation of blood cells in spiral microfluidic devices，BIOMICROFLUIDICS，２０１３年 ９月 ５日，Vol. 7, 054101，pp. 1-13

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３５／００−３７／００

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液細胞を分離するための方法であって、
血液試料の赤血球を溶解するように該血液試料を処理し、処理した前記試料を希釈して希釈試料を調製する工程と；
少なくとも第１の端部および第２の端部を有するスパイラル形状フローチャネルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記スパイラル形状フローチャネルは、前記第１の端部もしくはその付近の２つの入口ポートと前記第２の端部もしくはその付近の少なくとも２つの出口ポートとを有し、前記２つの入口ポートの一方は前記スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、かつ他方の入口ポートは前記スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、前記出口ポートの少なくとも１つは血液細胞の貯蔵を可能にする容器に接続され、前記スパイラル形状フローチャネルが１１０〜１３０μｍの高さを有する、マイクロ流体デバイスを提供する工程と；
溶解赤血球を含む前記希釈試料を前記スパイラル形状フローチャネルの前記外壁に位置する前記入口ポートに導入し、シース液を前記スパイラル形状フローチャネルの前記内壁に位置する前記入口ポートに導入する工程と；
前記希釈試料および前記シース液を、前記スパイラル形状フローチャネルを通すように駆動する工程と；
前記少なくとも１つの出口ポートに接続された前記容器内の前記血液細胞を回収する工程と、
を含み、
前記少なくとも２つの出口ポートが少なくとも４つの出口ポートを含み、前記スパイラル形状フローチャネルが前記出口ポートの分岐部で約１０００μｍの幅まで徐々に拡大し、第１の出口ポートが、前記内壁から前記外壁にかけて形成される前記スパイラル形状フローチャネルの０〜１００μｍの幅をカバーし、第２の出口ポートが１０１〜２５０μｍの幅をカバーし、第３の出口ポートが２５１〜６５０μｍの幅をカバーし、かつ第４の出口ポートが６５１〜１０００μｍの幅をカバーする、方法。

【請求項2】

遠心分離工程を含まず、かつ、少なくとも１つのタイプの血液細胞がマーカー分子で標識される標識工程を含まない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記血液試料が指穿刺から提供されるまたは静脈穿刺から生成される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記スパイラル形状フローチャネル内を流れる前記希釈試料のレイノルズ数（Ｒｅ）が５０〜１００である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記スパイラル形状フローチャネルが、
３００〜６００μｍの幅と；
１１０〜１３０μｍの高さと；
７〜１３ｃｍの全長と；
のうちの１つ以上を有するように形成されている、
請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記血液試料が、好中球、単球、リンパ球、血小板、赤血球、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記好中球および前記単球を第２の前記出口ポートから回収する工程か、前記リンパ球を第３の前記出口ポートから回収する工程か、またはその両方をさらに含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記シース液の流速が、前記希釈試料の流速よりも少なくとも５倍高い；
前記希釈試料の流速が１２０〜１３０μＬ／分である、またはその両方である、
請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記血液細胞が緩衝液で回収される；
前記血液試料が緩衝液で少なくとも１：５に希釈される、またはその両方である、
請求項１に記載の方法。

【請求項10】

少なくとも第１の端部および第２の端部を有するスパイラル形状フローチャネルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記スパイラル形状フローチャネルが、前記第１の端部もしくはその付近に２つの入口ポートおよび前記第２の端部もしくはその付近に少なくとも２つの出口ポートを有し、ここで前記２つの入口ポートの一方が前記スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、かつ他方の入口ポートが前記スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、かつ前記出口ポートの少なくとも１つが血液細胞の貯蔵を可能にする容器に接続され；ここで前記スパイラル形状フローチャネルが１１０〜１３０μｍの高さを有し、前記少なくとも２つの出口ポートが少なくとも４つの出口ポートを含み、前記スパイラル形状フローチャネルが前記出口ポートの分岐部で約１０００μｍの幅まで徐々に拡大し、第１の出口ポートが、前記内壁から前記外壁にかけて形成される前記スパイラル形状フローチャネルの０〜１００μｍの幅をカバーし、第２の出口ポートが１０１〜２５０μｍの幅をカバーし、第３の出口ポートが２５１〜６５０μｍの幅をカバーし、かつ第４の出口ポートが６５１〜１０００μｍの幅をカバーする、マイクロ流体デバイス。

【請求項11】

血液細胞から微小粒子を分離するための方法であって、
血液試料の赤血球を溶解するように該血液試料を処理し、処理した前記試料を希釈して希釈試料を調製する工程と；
少なくとも第１の端部および第２の端部を有するスパイラル形状フローチャネルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記スパイラル形状フローチャネルは、前記第１の端部もしくはその付近の２つの入口ポートと前記第２の端部もしくはその付近の少なくとも２つの出口ポートとを有し、前記２つの入口ポートの一方は前記スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、かつ他方の入口ポートは前記スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、前記出口ポートの少なくとも１つは血液細胞の貯蔵を可能にする容器に接続され、前記スパイラル形状フローチャネルが１１０〜１３０μｍの高さを有する、マイクロ流体デバイスを提供する工程と；
溶解赤血球を含む前記希釈試料を前記スパイラル形状フローチャネルの前記外壁に位置する前記入口ポートに導入し、シース液を前記スパイラル形状フローチャネルの前記内壁に位置する前記入口ポートに導入する工程と；
前記希釈試料および前記シース液を、前記スパイラル形状フローチャネルを通すように駆動する工程と；
前記少なくとも１つの出口ポートに接続された前記容器内の前記血液細胞から前記微小粒子を回収する工程であって、前記微小粒子が約０．１μｍから約１μｍまでの範囲である平均粒径を有する、工程と、
を含み、
前記少なくとも２つの出口ポートが少なくとも４つの出口ポートを含み、前記スパイラル形状フローチャネルが前記出口ポートの分岐部で約１０００μｍの幅まで徐々に拡大し、第１の出口ポートが、前記内壁から前記外壁にかけて形成される前記スパイラル形状フローチャネルの０〜１００μｍの幅をカバーし、第２の出口ポートが１０１〜２５０μｍの幅をカバーし、第３の出口ポートが２５１〜６５０μｍの幅をカバーし、かつ第４の出口ポートが６５１〜１０００μｍの幅をカバーする、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生化学の分野に位置し、血液細胞を分離するための方法であって、（ａ）血液試料の赤血球を溶解し、前記試料を希釈する工程と；（ｂ）少なくとも第１の端部および第２の端部を有するスパイラル形状フローチャネルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記フローチャネルは前記第１の端部もしくはその付近に２つの入口ポートおよび前記第２の端部もしくはその付近に少なくとも２つの出口ポートを有し、ここで２つの入口ポートの一方はスパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、かつ他方の入口ポートはスパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、かつ出口ポートの少なくとも１つは血液細胞の貯蔵を可能にする容器に接続される、マイクロ流体デバイスを提供する工程と；（ｃ）工程（ａ）の試料をスパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する入口ポートに導入し、かつシース液をスパイラル形状フローチャネルの内壁に位置する入口ポートに導入する工程と；（ｄ）前記試料およびシース液を、スパイラル形状フローチャネルを通すように駆動する工程と；（ｅ）少なくとも１つの出口ポートに接続された少なくとも１つの容器内の血液細胞を回収する工程と、を含む、方法に関する。本発明はまた、被験者における糖尿病または炎症性疾患を診断するための方法およびマイクロ流体デバイスに関する。

【背景技術】

【0002】

小粒子分離は、材料科学（ナノテクノロジー）、環境バイオサンプリングから臨床的状況における細菌診断にわたる範囲の多数の用途における重要な試料調製工程である。従来の分離方法は、バッチモード処理や小さいマイクロ／ナノ粒子（＜５μｍ）の分離に適用されるときに増加する困難によって制限される遠心分離、沈降または膜濾過を含む。小粒子のサイズに基づく分離は、粒子特性（密度、表面電荷、および磁気親和性）と独立し、連続フロー様式で機能し得ることから、興味深い選択肢である。しかし、密集サイズの小粒子分離を達成し得る新たな分離技術を開発する必要性を提唱するような効率的かつ受動的な粒子選別法が欠如している。

【0003】

臨床的状況における標準的な血液分析は、炎症状態を評価するための全血球計算（ＣＢＣ）に依存し、白血球における機能的異常を特徴づけるための限られた方法が存在する［（非特許文献１）］。主な背景理由が、単純かつ再現可能な様式で細胞機能を試験するための好適な単離およびアッセイ方法の欠如である。これは、多量の血液量（約１０ｍＬ）を必要とする通常の白血球単離方法（密度勾配遠心分離およびＲＢＣ溶解）を用いての血液試料調製の困難さによりさらに悪化し、望ましくない細胞活性化を引き起こすことがある［（非特許文献２）］。実験的状況では、フローサイトメトリーによる免疫表現型決定は可能であるが、コスト、機器へのアクセスおよび労力がかかる白血球精製手順によって制限を受ける。それ故、血清試験に加えて健康状態に関するさらなる情報を得るため、白血球試験用の新しいツールを開発することは重要である。

【0004】

糖尿病（ＤＭ）は、慢性高血糖症によって特徴づけられる原型的な代謝異常症候群であり、地球規模で深刻な健康負荷であり続け、２０３０年までに３億６０００万人に昇ると予測されている［（非特許文献３）］。２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）では、患者は心血管合併症のリスク増加とともに低グレード炎症および自然免疫系の活性化をもたらすグルコース代謝障害を患う［（非特許文献４）；（非特許文献５）；（非特許文献６）；（非特許文献７）］。示差白血球数およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルは、ルーチン的に測定され、糖尿病患者における心血管死亡率［（非特許文献８）；（非特許文献９）］、大血管／微小血管合併症［（非特許文献１０）；（非特許文献１１）］および代謝表現型［（非特許文献１２）］に関連するが、白血球の数え上げに加えて特定の免疫機能を定量し
得る新しい細胞に基づくバイオマーカーを開発することは急務である。自然免疫系の主要なエフェクター細胞である好中球は、Ｔ２ＤＭの病因ならびにそれに伴う血管合併症において中心的役割を果たすことが知られている［（非特許文献１３）］。細菌感染に対する感度の増加をもたらす、細胞硬化［（非特許文献１４）；（非特許文献１５）］、化学走性の障害［（非特許文献１６）；（非特許文献１７）］および食作用［（非特許文献１８）］を含む様々な好中球機能障害がＴ２ＤＭ患者において報告されている［（非特許文献１９）］。したがって、Ｔ２ＤＭ患者における好中球機能の包括的な表現型決定により、タイムリーな治療的介入における免疫健康の早期かつ直接的な特徴づけが可能になる。しかし、通常の好中球単離方法は労力がかかり、細胞活性化を生じやすく、好中球をその天然状態で末梢血から単離することは重要であり［（非特許文献２０）］、それは抗体フリーの好中球単離方法により著しく最小化され得る［（非特許文献２１）］。批判的であるが、現在、低グレード炎症状態に関する好中球機能の定量化を可能にするポイントオブケア（ＰＯＣ）技術は存在しない。これは、Ｔ２ＤＭ患者の炎症状態をより十分に特徴づけるための、高速な非標識の好中球選別および機能的な表現型決定を意図した新規な技術を開発するという強い臨床的需要を提唱する。

【0005】

微細加工における進歩に伴い、微少流体技術は、ポイントオブケア診断および生物医学的研究において試料および試薬のその低消費、デバイス小型化、およびハイスループットな単一細胞分析を伴う場合の刺激的なツールボックスを提供する［（非特許文献２２）］。幾つかの微少流体技術が、好中球選別のために開発されており［（非特許文献２３）；（非特許文献２４）；（非特許文献２５）］、重篤な外傷および火傷ならびに喘息を有する患者における炎症性応答を試験するのに用いられている。これらのデバイスは、抗体結合（ＣＤ６６ｂおよびＰ−セレクチン）に基づく好中球精製を実行し、それに続く特徴づけは、選別された好中球がマイクロチャネル内部に付着されるようにチップ上で実施される。これは、選別された好中球をデバイスから回収することが困難であることから、インビトロ細胞培養アッセイおよびフローサイトメトリー分析を含む下流での用途を本質的に制限する。注目すべきことに、今日まで、心血管リスク因子、異常な白血球表現型およびそれに伴う内皮機能障害を改変する中での関連性を試験する場合に貴重となる、Ｔ２ＤＭ患者における好中球の機能的な表現型決定に微少流体技術が適用されているような公表された報告は存在しない。

【0006】

ディーンフロー分画（ＤＦＦ）は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および微生物を含む異常細胞のサイズに基づく分離において当該技術分野で公知である［（非特許文献２６）；（非特許文献２７）］。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】ヘイカリ，Ｄ．（Ｈｅｉｋａｌｉ，Ｄ．）およびＤ．ディ・カルロ（Ｄ．Ｄｉ Ｃａｒｌｏ）著、２０１０年、第１５巻、第４号：ｐ．３１９−３２８

【非特許文献2】ヤング，Ｊ．（Ｙａｎｇ，Ｊ．）ら著、２００２年、第９巻、第５号：ｐ．１１４２−１１４３

【非特許文献3】ワイルド，Ｓ．（Ｗｉｌｄ，Ｓ．）ら著、ダイアベティス・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）、第２７巻、ｐ．１０４７−１０５３（２００４年）

【非特許文献4】ステハウワー，Ｃ．Ｄ．Ａ．（Ｓｔｅｈｏｕｗｅｒ，Ｃ．Ｄ．Ａ．）ら著、ダイアベティス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、第５１巻、ｐ．１１５７−１１６５（２００２年）

【非特許文献5】プラダン，Ａ．Ｄ．（Ｐｒａｄｈａｎ，Ａ．Ｄ．）ら著、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（ＪＡＭＡ）、第２８６巻、ｐ．３２７−３３４（２００１年）

【非特許文献6】ピックアップ，Ｊ．Ｃ．（Ｐｉｃｋｕｐ，Ｊ．Ｃ．）著、ダイアベティス・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）、第２７巻、ｐ．８１３−８２３（２００４年）

【非特許文献7】シルバーナゲル，Ｇ．（Ｓｉｌｂｅｒｎａｇｅｌ，Ｇ．）ら著、ダイアベティス・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）、第３４巻、ｐ．２４７１−２４７３（２０１１年）

【非特許文献8】ハータイ，Ｂ．（Ｈａｒｔａｉｇｈ，Ｂ．）ら著、アテロスクレローシス（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、第２２４巻、ｐ．１６１−１６９（２０１２年）

【非特許文献9】フリードマン，Ｇ．Ｄ．（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｇ．Ｄ．）ら著、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、第２９０巻、ｐ１２７５−１２７８（１９７４年）

【非特許文献10】カヴァロット，Ｆ．（Ｃａｖａｌｏｔ，Ｆ）ら著、ダイアベティス・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）、第２５巻、ｐ．２３５４−２３５５（２００２年）

【非特許文献11】トン，Ｐ．Ｃ．（Ｔｏｎｇ，Ｐ．Ｃ．）ら著、ダイアベティス・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）、第２７巻、ｐ．２１６−２２２（２００４年）

【非特許文献12】メナート・ハウターマンス，Ｂ．（Ｍｅｎａｒｔ−Ｈｏｕｔｅｒｍａｎｓ，Ｂ．）ら著、ダイアベティス・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）、第３７巻、ｐ．２３２６−２３３３（２０１４年）

【非特許文献13】アルバ・ロウレイロ，Ｔ．Ｃ．（Ａｌｂａ−Ｌｏｕｒｅｉｒｏ，Ｔ．Ｃ．）ら著、ブラジリアン・ジャーナル・オブ・メディカル・アンド・バイオロジカル・リサーチ（Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．）、第４０巻、ｐ．１０３７−１０４４（２００７年）

【非特許文献14】アーネスト，Ｅ．（Ｅｒｎｓｔ，Ｅ．）およびマトライ，Ａ．（Ｍａｔｒａｉ，Ａ．）著、ダイアベティス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、第３５巻、ｐ．１４１２−１４１５（１９８６年）

【非特許文献15】ペクスヴァラディ，Ｚ．（Ｐｅｃｓｖａｒａｄｙ，Ｚ．）ら著、ダイアベティス・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）、第１７巻、ｐ．５７−６３（１９９４年）

【非特許文献16】モワト，Ａ．Ｇ．（Ｍｏｗａｔ，Ａ．Ｇ．）およびバウム，Ｊ．（Ｂａｕｍ，Ｊ．）著、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、第２８４巻、ｐ．６２１−６２７（１９７１年）

【非特許文献17】ドゥラメール，Ｍ．（Ｄｅｌａｍａｉｒｅ，Ｍ．）ら著、ダイアベティック・メディスン（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｍｅｄ）、第１４巻、ｐ．２９−３４（１９９７年）

【非特許文献18】バグデード，Ｊ．Ｄ．（Ｂａｇｄａｄｅ，Ｊ．Ｄ．）ら著、ダイアベティス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、第２３巻、ｐ．９−１５（１９７４年）

【非特許文献19】シャー，Ｂ．Ｒ．（Ｓｈａｈ，Ｂ．Ｒ．）およびハックス，Ｊ．Ｅ．（Ｈｕｘ，Ｊ．Ｅ．）著、ダイアベティス・ケア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ）、第２６巻、ｐ．５１０−５１３（２００３年）

【非特許文献20】フクダ，Ｓ．（Ｆｕｋｕｄａ，Ｓ．）およびシュミド・ショーンバイン，Ｇ．Ｗ．（Ｓｃｈｍｉｄ−Ｓｃｈｏｅｎｂｅｉｎ，Ｇ．Ｗ．）著、ジャーナル・オブ・リューコサイト・バイオロジー（Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．）、第７２巻、ｐ．１３３−１３９（２００２年）

【非特許文献21】ドーワード，Ｄ．Ａ．（Ｄｏｒｗａｒｄ，Ｄ．Ａ．）ら著、ジャーナル・オブ・リューコサイト・バイオロジー（Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．）、第９４巻、ｐ．１９３−２０２（２０１３年）

【非特許文献22】ザックマン，Ｅ．Ｋ．（Ｓａｃｋｍａｎｎ，Ｅ．Ｋ．）、フルトン，Ａ．Ｌ．（Ｆｕｌｔｏｎ，Ａ．Ｌ．）およびビーベ，Ｄ．Ｊ．（Ｂｅｅｂｅ，Ｄ．Ｊ．）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第５０７巻、ｐ．１８１−１８９（２０１４年）

【非特許文献23】コッツ，Ｋ．Ｔ．（Ｋｏｔｚ，Ｋ．Ｔ．）ら著、ネイチャー・メディスン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、第１６巻、ｐ．１０４２−１０４７（２０１０年）

【非特許文献24】ザックマン，Ｅ．Ｋ．−Ｈ．（Ｓａｃｋｍａｎｎ，Ｅ．Ｋ．−Ｈ．）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第１１１巻、ｐ．５８１３−５８１８（２０１４年）

【非特許文献25】ボーズ，Ｓ．（Ｂｏｓｅ，Ｓ．）ら著、サイエンティフィック・レポート（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．）、第３巻、ｐ．２３２９（２０１３年）

【非特許文献26】ホウ，Ｈ．Ｗ．（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．）ら著、サイエンティフィック・レポート（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．）、第３巻（２０１３年）

【非特許文献27】ホウ，Ｈ．Ｗ．（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．）ら著、ラボラトリーチップ（Ｌａｂ Ｃｈｉｐ）、第１５巻、ｐ．２２９７−２３０７（２０１５年）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

したがって、当該技術分野で、血液成分、具体的には好中球を穏やかに精製するための、精製成分の、例えばそれらを糖尿病アッセイに適用するためのさらなる試験を可能にする方法およびデバイスに対して需要がある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

血液細胞を分離するための方法を提供することにより上記の需要を満たすことは、本発明の目的である。意外にも、本発明者は、ディーンフロー分画（ＤＦＦ）の使用が、血液試料の分画および血液中に生じる血液成分または微小粒子、例えば細菌の精製を可能にすることを見出している。本発明者は、ディーンフロー分画の異なるパラメータを組み合わせることにより、遠心分離工程および／またはマーカー分子を用いる標識工程を適用することなく好中球の精製が可能になることを見出している。かかる方法を用いて、好中球は、遠心分離および／または標識工程を用いる方法と比べて穏やかに（その天然状態で）かつ高速に精製される。

【0010】

好中球を天然状態で精製するための上記の方法は、そのローリング速度、好中球真円度（ＮＣ）指数および／またはマーカー、例えば細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）、ＣＤ１１ｂもしくはＰＳＧＬ−１の発現を測定することによる好中球の調査をさらに含む、糖尿病を診断するための方法と共役されることで高く評価されている。

【0011】

それ故、第１の態様では、本発明は、血液細胞を分離するための方法であって、（ａ）血液試料の赤血球を溶解し、前記試料を希釈する工程と；（ｂ）少なくとも第１の端部および第２の端部を有するスパイラル形状フローチャネルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記フローチャネルは、前記第１の端部もしくはその付近に２つの入口ポートおよび前記第２の端部もしくはその付近に少なくとも２つの出口ポートを有し、ここで２つの入口ポートの一方はスパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、かつ他方の入口ポートはスパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、かつ出口ポートの少なくとも１つは血液細胞の貯蔵を可能にする容器に接続される、マイクロ流体デバイスを提供する工程と；（ｃ）工程（ａ）の試料をスパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する入口ポートに導入し、かつシース液をスパイラル形状フローチャネルの内壁に位置する入口ポートに導入する工程と；（ｄ）前記試料およびシース液を、スパイラル形状フローチャネルを通すように駆動する工程と；（ｅ）少なくとも１つの出口ポートに接続された少なくとも１つの容器内の血液細胞を回収する工程と、を含む、方法を対象とする。

【0012】

本発明の様々な実施形態では、本発明の方法は、（ａ）遠心分離工程；および／または（ｂ）少なくとも１つのタイプの血液細胞がマーカー分子で標識される場合の標識工程を含まない。

【0013】

本発明の範囲はまた、試料が指穿刺試料または静脈穿刺から生成される試料である場合の様々な実施形態を包含する。
本発明のさらなる様々な実施形態では、少なくとも２つの出口ポートは少なくとも４つの出口ポートである。他の様々な実施形態では、スパイラル形状フローチャネル内を流れる試料のレイノルズ数（Ｒｅ）は５０〜１００である。

【0014】

本発明の範囲によりさらに包含されるのは、スパイラル形状フローチャネルが、（ａ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むかまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる；（ｂ）３００〜６００μｍ、好ましくは５００μｍの幅を有する；（ｃ）１１０〜１３０μｍ、好ましくは１１５μｍの高さを有する；かつ／または（ｄ）７〜１３ｃｍ、好ましくは１０ｃｍの全長を有することである。

【0015】

様々な実施形態では、スパイラル形状フローチャネルは、出口ポートの分岐部で８００〜１２００μｍの幅まで徐々に拡大する。好ましい実施態様では、拡大された幅は１０００μｍである。

【0016】

本発明のさらなる様々な実施形態では、第１の出口ポートは、内壁から外壁にかけて形成されるフローチャネルの０〜１００μｍの幅をカバーし、第２の出口ポートは１０１〜２５０μｍの幅をカバーし、第３の出口ポートは２５１〜６５０μｍの幅をカバーし、かつ第４の出口ポートは６５１〜１０００μｍの幅をカバーする。

【0017】

さらに包含されるのは、血液細胞が好中球、単球およびリンパ球、血小板ならびに赤血球を含む場合の実施形態である。さらなる好ましい実施形態では、好中球および単球は、第２の出口ポートによって回収され、かつ／またはリンパ球は第３の出口ポートによって回収される。

【0018】

様々な実施形態では、（ａ）シース液の流速は希釈試料の流速よりも少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍高く；かつ／または（ｂ）希釈試料の流速は１２０〜１３０μＬ／分である。

【0019】

さらなる実施形態では、（ａ）血液細胞は緩衝液で回収され；かつ／または（ｂ）血液試料は緩衝液で少なくとも１：５に希釈される。
さらなる態様では、本発明は、被験者における糖尿病または炎症性疾患を診断するための方法であって、（ａ）前記被験者の血液試料を提供し、好中球を単離する工程と；（ｂ）（Ｉ）前記被験者の試料の単離された好中球が、少なくとも１名の健常者との比較可能な対照試料の単離された好中球と比べて、糖尿病または炎症性疾患を示す、増加した平均ローリング速度を有するか否か；（ＩＩ）前記被験者の試料の単離された好中球が、少なくとも１名の健常者との比較可能な対照試料の単離された好中球と比べて、糖尿病または炎症性疾患を示す、減少した好中球真円度（ＮＣ）指数を有するか否か、または（ＩＩＩ）前記被験者の試料の単離された好中球が、少なくとも１名の健常者との比較可能な対照試料の単離された好中球と比べて、糖尿病または炎症性疾患を示す、細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）もしくはＣＤ１１ｂの増加した発現またはＰＳＧＬ−１の低下した発現を有するか否か、判定する工程と、を含む、方法に関する。

【0020】

本発明の様々な実施形態では、好中球は、本発明の血清または血漿から血液細胞を分離するための方法に従って単離される。
本発明の範囲はまた、糖尿病が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である場合の様々な実施形態を包含する。

【0021】

好中球のローリング速度の測定に関する本発明のさらなる様々な実施形態では、増加した平均ローリング速度は少なくとも５．３０μｍ／秒である。様々な他の実施形態では、ローリング速度はＥ−セレクチンでコーティングされたチャネル内で測定される。

【0022】

本発明の範囲によりさらに包含されるのは、好中球真円度（ＮＣ）指数の測定に関する実施形態では、減少した好中球真円度（ＮＣ）指数が少なくとも０．８５の好中球真円度（ＮＣ）を有する被験好中球の７６％未満と定義されることである。

【0023】

細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）、ＣＤ１１ｂおよびＰＳＧＬ−１の発現に関する様々な実施形態では、（ａ）前記被験者の試料の単離された好中球における細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）もしくはＣＤ１１ｂの発現は、比較可能な対照試料における発現と比べて少なくとも１０％増加し；かつ／または（ｂ）前記被験者の試料の単離された好中球におけるＰＳＧＬ−１の発現は、比較可能な対照試料における発現と比べて少なくとも１０％減少する。

【0024】

本発明のさらなる態様では、本範囲は、少なくとも第１の端部および第２の端部を有するスパイラル形状フローチャネルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記フローチャネルが、前記第１の端部もしくはその付近に２つの入口ポートおよび前記第２の端部もしくはその付近に少なくとも２つの出口ポートを有し、ここで２つの入口ポートの一方がスパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、かつ他方の入口ポートがスパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、かつ出口ポートの少なくとも１つが血液細胞の貯蔵を可能にする容器に接続され；ここでフローチャネルが１１０〜１３０μｍ、好ましくは１１５μｍの高さを有する、マイクロ流体デバイスを包含する。

【0025】

デバイスの様々な実施形態では、少なくとも２つの出口ポートは少なくとも４つの出口ポートである。
本発明の範囲はまた、スパイラル形状フローチャネルが出口ポートの分岐部で８００〜１２００μｍの幅まで徐々に拡大する場合の様々な実施形態を包含する。好ましい実施態様では、スパイラル形状フローチャネルは、出口ポートの分岐部で８００〜１２００μｍの幅まで徐々に拡大する。さらなる好ましい実施形態では、拡大された幅は１０００μｍである。さらなる好ましい実施形態では、第１の出口ポートはフローチャネルの幅の５〜３０％、好ましくは２０％をカバーし、かつ第２の出口ポートはフローチャネルの幅の７０〜９５％をカバーし、ここで第１の出口ポートは内壁に位置し、かつ第２の出口ポートは外壁に位置する。

【0026】

本発明の範囲によりさらに包含されるのは、様々な実施形態では、スパイラル形状フローチャネルが、（ａ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むかまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる；（ｂ）７〜１３ｃｍ、好ましくは１０ｃｍの全長を有する；かつ／または（ｃ）４００〜６００μｍ、好ましくは５００μｍの幅を有することである。

【0027】

デバイスの好ましい実施形態では、少なくとも２つの出口ポートは２つの出口ポートである。上で定義される２つの出口ポートデバイスのさらに好ましい実施形態では、第１の出口ポートは、内壁から外壁にかけて規定されるフローチャネルの０〜５０μｍの幅をカバーし、第２の出口ポートは５１〜３００μｍの幅をカバーする。上で定義される２つの出口ポートデバイスの様々な実施形態では、スパイラル形状フローチャネルは、（ａ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むかまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる；（ｂ）５〜１０ｃｍ、好ましくは６．５ｃｍの全長を有する；（ｃ）２００〜４００μｍ、好ましくは３００μｍの幅を有する；かつ／または（ｄ）３０〜９０μｍ、好ましくは６０μｍの高さを有する。

【0028】

本発明は、非限定例および添付の図面と関連させて考察されるとき、詳細な説明に準拠することでより十分に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】ディーンフロー分画（ＤＦＦ）マイクロ流体技術を用いた単一工程式非標識好中球選別を示す。（Ａ）Ｔ２ＤＭ患者における好中球の単離および表現型決定のための実験ワークフロー。血液試料は溶解され、効率的なサイズに基づく好中球選別のために開発された２入口、４出口のスパイラルマイクロデバイスを用いて処理される。出口２からの精製された好中球は、Ｅ−セレクチンで機能化されたマイクロチャネル内でのインビトロ細胞ローリングアッセイ、ならびに形状測定（好中球真円度）において用いられる。白血球数および好中球活性化レベルは、フローサイトメトリー分析によって決定される。（Ｂ）ＤＦＦ分離原理の模式図。溶解血液試料およびシース液（０．１％ＢＳＡを有する１×ＰＢＳ）が、異なる流速（１：１０）でデバイス入口内にポンピングされ、チャネル外壁で試料流が制限される。ディーン渦の影響下で、小細胞成分（血小板および溶解ＲＢＣ）および遊離ヘモグロビンが、ディーン牽引力（Ｆ_Ｄ（黄色矢印））により、内壁の方へ側方に、また外壁に戻るように遊走する。大きめの白血球は、さらに強力な慣性揚力（Ｆ_Ｌ（赤色矢印））を受け、出口領域の内壁付近に集中し、選別された白血球の連続的分離および緩衝液交換がなされる。Ｆ_ＬおよびＦ_Ｄが細胞サイズに強く依存することに起因し、大きめの好中球／単球（１０〜１２μｍ）は、内壁付近に集中し、出口２へ選別される一方、小さめのリンパ球（約７〜８μｍ）は出口３で収集される。出口４は、血小板、溶解ＲＢＣおよび遊離ヘモグロビンの除去に用いられる。

【図2】ＤＦＦマイクロデバイスを用いる好中球精製を示す。（Ａ）スパイラルデバイスの出口２における好中球選別に対する流速の特徴づけ。１３０μＬ分^−１で最適な分離が達成された（強調部）。ｎ＝２〜４からの平均±標準偏差。（Ｂ）異なる出口への大きめの好中球（赤色矢印）および小さめのリンパ球（緑色矢印）の分離を示す代表的な高速画像。拡大された挿入画像（点線ボックス）は細胞サイズ差を図示する。（Ｃ）出口２からの選別された好中球（赤色ボックス）および出口３からのリンパ球（緑色ボックス）のライト・ギムザ染色。（Ｄ）溶解血液の処理およびゴーストＲＢＣ（黄色矢印）および白血球（赤色矢印）の分離の代表的な高速画像。（Ｅ）入口試料の白血球組成物およびＤＦＦ選別後の出口２。ｎ＝３からの平均±標準偏差。

【図3】Ｅ−セレクチン上での好中球ローリングを示す。（Ａ）捕捉された細胞のローリング映像からの画像オーバーレイ（６０×倍率）は健常好中球とＴＮＦ−αで処理された好中球との間でのローリング軌道における明らかな差異を強調する。（Ｂ）健常好中球、グルコース処理された好中球（３０ｍＭ）、ＴＮＦ−α処理された好中球（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＰＭＡ処理された好中球（１μΜ）における好中球ローリング速度の累積度数曲線。すべての処理群（各群につき約５０〜２００個の細胞）におけるローリング速度は、健常好中球と比べて有意に異なった（Ｐ＜０．００５）。健常好中球および処理された好中球に対する（Ｃ）ＰＳＧＬ−１発現および（Ｄ）ＣＤ１１ｂ発現のフローサイトメトリー分析。細胞は、マウスＡＰＣ抗ヒトＰＳＧＬ−１ ＩｇＧ２ａ／マウスＡＰＣ ＩｇＧ２ａアイソタイプおよびＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ１１ｂ（活性化）ＩｇＧ１／ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１アイソタイプとともにインキュベートされた。

【図4】Ｔ２ＤＭ患者における好中球の免疫表現型を示す。（Ａ）白血球数および（Ｂ）好中球数に対するフローサイトメトリー分析、ならびに健常（ｎ＝１３）およびＴ２ＤＭ患者（ｎ＝１６）に由来する好中球上での（Ｃ）細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）、（Ｄ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｅ）ＰＳＧＬ−１の発現。データは平均±平均値の標準誤差として示される（^＊Ｐ＜０．０５，^＊＊Ｐ＜０．０１および^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。好中球ＰＳＧＬ−１レベルと（Ｆ）ＲＯＳ発現および（Ｇ）ＣＤ１１ｂ発現との相関。

【図5】Ｔ２ＤＭ患者における好中球ローリングを示す。（Ａ）Ｔ２ＤＭ患者に由来する高純度のＤＦＦで選別された好中球（約９０％）。ｎ＝６からの平均±標準偏差。Ｅ−セレクチンで機能化されたマイクロチャネル内での健常（ｎ＝１６）およびＴ２ＤＭ患者（ｎ＝１６）に由来する好中球の（Ｂ）度数分布および（Ｃ）平均ローリング速度。平均±平均値の標準誤差（^＊Ｐ＜０．０５）。健常およびＴ２ＤＭ患者における好中球ローリング軌道の代表的な画像オーバーレイ。平均ローリング速度と好中球の（Ｄ）細胞内ＲＯＳレベルおよび（Ｅ）ＰＳＧＬ−１発現との相関。健常およびＴ２ＤＭ患者の（Ｆ）好中球真円度。平均±標準偏差、ｎ＝３００個の細胞（健常対照５名由来）および５００個の細胞（Ｔ２ＤＭ患者７名由来）。^＊＊＊Ｐ＜０．００１。挿入プロットは、好中球真円度の度数分布を示す。代表的な明視野画像（６０×倍率）は、健常（灰色ボックス）およびＴ２ＤＭ（黒色ボックス）患者からの好中球形状の差異を例示する。

【図6】Ｔ２ＤＭ試験における機能的バイオマーカーとしての好中球ローリング表現型を示す。特定のローリング速度度数と（Ａ）ＨｂＡｌｃ（％）、（Ｂ）ＬＤＬコレステロールおよび（Ｃ）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）との相関。（Ｄ）平均ローリング速度および９μｍ／秒でのローリング速度度数を用いた患者データのＲＯＣ分析。（Ｅ）ＰＣＡスコアプロットは第１主成分に対する健常およびＴ２ＤＭ患者の十分な分離を示す。（Ｆ）負荷プロットは第１および第２主成分スコア値への各計量の寄与を示す。

【図7】本願の試験において検査された健常およびＴ２ＤＭ患者の特性を有する表を示す。

【図8】精製された細胞型の比（細胞サイズ依存性）およびフローチャネルのチャネル高さへの依存性を表す表を示す。

【図9】精製された細胞型の比（細胞サイズ依存性）および溶解全血試料を希釈するために用いられる希釈緩衝液の体積への依存性を示す。

【図10】スパイラルマイクロチャネル内での粒子のディーン遊走の直接的な可視化および特徴づけを示す。５０ｎｍの蛍光ビーズ試料が入口領域での（Ａ）内壁または（Ｂ）外壁で導入された。平均蛍光スタック画像は、チャネル沿いの５０ｎｍのビーズ位置を示す。黄色ラインはチャネル壁の位置を示す。チャネル横断面の対応する模式画像は、ビーズの初期位置に依存したビーズ遊走パターンにおける明らかな差異を図示する。（Ｃ）内壁から外壁にかけてチャネルの中央線沿いの粒子遊走（赤色）に対して、粒子がチャネルの最上部および底部で外壁から内壁にかけて再循環する（青色）とき、より高いディーン遊走速度が測定された。実験的に測定されたディーン速度は、オオカワラ（Ｏｏｋａｗａｒａ）ら［オオカワラ，Ｓ．（Ｏｏｋａｗａｒａ，Ｓ．）ら著、ケミカル・エンジニアリング・サイエンス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００６年、第６１巻、第１１号：ｐ．３７１４−３７２４］のディーン速度方程式に基づく分析値と十分に一致した。

【図11】内壁領域でディーン遊走中のビーズのサイズ依存性の過渡的位置を示す。平均蛍光（Ａ）スタック画像（疑似色）および（Ｂ）外壁から内壁にかけてのディーン遊走中の異なるサイズ（５０ｎｍ、１μｍ、２μｍおよび３μｍ）のビーズにおける内壁の過渡的位置を示す強度ラインスキャン。黄色ラインはチャネル壁の位置を示す。大きめのビーズは壁に誘導される慣性揚力の増加を受け、内壁からさらに離れた過渡的平衡化位置をもたらす（Ｂにおける挿入図は内壁領域０〜１００μｍでの強度ラインスキャンの拡大図を示す）。

【図12】間隔が密なサイズを有する小型微小粒子のハイスループット分離を示す。（Ａ）最適化されたフロー条件での（Ａ）５μｍのビーズ（緑色）および３μｍのビーズ（赤色）、（Ｂ）３μｍのビーズ（緑色）および２μｍのビーズ（赤色）ならびに（Ｃ）２μｍのビーズ（緑色）および１μｍのビーズ（赤色）の内壁での過渡的平衡化位置を示す平均蛍光スタック画像。黄色点線はチャネル出口分岐の位置を示す。分離効率および小型粒子の濃縮比が右側に示される（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝３）。

【図13】ナノ粒子および小型微小粒子の分離を示す。平均蛍光（Ａ）スタック画像および（Ｂ）強度ラインスキャンは、外壁から内壁にかけてのディーン遊走中の５０ｎｍおよび２μｍのビーズにおける内壁での過渡的位置における明らかな差異を示す。黄色点線はチャネル出口分岐の位置を示す。

【図14】黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）（赤色矢印）の出口１への分離および濃縮（他方、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）は出口２に選別される）を図示する光学画像（１００×倍率）を示す。

【図15】開発されたスパイラル技術を用いての大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のサイズ分画を示す。異なる出口で選別された大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の細胞サイズにおける明らかな差異を図示する代表的画像（１００×倍率）および度数分布（フィットされたガウス）。約５０〜８０の細菌が各出口で測定された。（Ｂ）ＰＬＧＡナノ粒子のサイズ分画。挿入ＳＥＭ画像は、試料（挿入図）と異なる出口の間での明らかなサイズ差を強調する。

【図16】フィコールパックプラス（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ）を用いる密度勾配遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）から得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の非標識分画におけるワークフローを示す。（Ｂ）ＤＦＦを用いての単球およびリンパ球各々の出口２および出口３への効率的分離を示す模式図およびフローサイトメトリー分析。

【図17】２出口ＤＦＦスパイラルデバイスを用いる単球分画のフローサイトメトリー分析を示す。古典的単球は、ＣＤ１４＋（ＤＡＰＩ）およびＣＤ１６−（ＦＩＴＣ）と定義される。中間単球は、ＣＤ１４＋／ＣＤ１６＋と定義される。非古典的単球は、ＣＤ１４−／ＣＤ１６＋と定義される。非古典的単球は、出口２で２〜３倍に濃縮される。

【図18】微小粒子（ＭＰ）を血液から回収するためのワークフローを示す。（Ａ）ディーンフロー分画（ＤＦＦ）を用いての直接的な全血からの単一工程での微小粒子単離。スパイラルマイクロチャネル内でのディーン渦の影響下で、微小粒子（ＭＰ、約０．１〜１μｍ）および血小板（約２〜３μｍ）は内壁の方へ側方遊走する。小さめのＭＰの最内側の過渡的位置は血小板よりも内壁に接近し、ひいては優れた分解能で効率的なＭＰ精製をもたらす。（Ｂ）デバイス入口（Ｘ）および出口（Ｙ）でのチャネル横断面の模式図。ＭＰは内部出口（ＭＰ出口）に継続的に選別される一方、血小板および血液細胞は廃棄物として収集される。（Ｃ）血液由来の選別されたＭＰのＳＥＭ画像。（Ｄ）ＤＦＦおよび通常の遠心分離を用いて血液から単離されたＭＰのサイズのＤＬＳ測定。

【図19】（Ａ）で２μｍのビーズ、血液細胞および血小板の平衡位置を図示する蛍光および高速画像を示す。流速は、２μｍのビーズの廃棄物出口への集中に基づいて最適化される。大き目のＲＢＣは、有意な牽引力を受けて、外壁に接近したままである。血小板は２μｍのビーズと同様に平衡化し、廃棄物出口に選別される。挿入図（青色ボックス）は、６０×倍率での血小板の代表的画像である。（Ｂ）フローサイトメトリー分析（フォワードおよびサイドスキャッター）は、ＭＰ出口での無視できる血小板汚染を示す。（Ｃ）内皮細胞培養物（ＨＵＶＥＣ）および全血を用いてのＭＰ分離効率の特徴づけ。（Ｄ）通常の多段階遠心分離およびＤＦＦを用いての全血からのＭＰ単離効率の比較。

【図20】（Ａ）でフローサイトメトリー分析における２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を有する患者からの血液由来のＭＰを単離するための開発されたＤＦＦ技術の臨床評価を示す。健常被験者と比べて百分率が高めのＴ２ＤＭ患者における内皮ＭＰ（ＶＥ−Ｃａｄ＋）、白血球由来ＭＰ（ＣＤ４５＋）および好中球由来ＭＰ（ＣＤ６６ｂ＋）（各群につきｎ＝５）が検出され、これは血管性および全身性炎症の亢進を示す。健常およびＴ２ＤＭ患者における内皮ＭＰおよび好中球由来ＭＰと（Ｂ）白血球数および（Ｃ）コレステロールレベルとの関連性。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本発明者は、意外にも、ディーンフロー分画（ＤＦＦ）が血液中に存在する血液成分および／または微小粒子（細菌など）を分離するものとして認定されていることを見出した。目的の成分または微小粒子によると、マイクロ流体デバイスのパラメータ設定は、効率的かつ明確な精製に適応されることが必要とされる。本発明者は、好中球の他の血液成分からの分離を可能にする方法を見出した。その後、これらの精製された好中球は、糖尿病を診断するためのさらなるアッセイにおいて用いることができる。

【0031】

したがって、第１の態様では、本発明は、このように、血液細胞を分離するための方法であって、（ａ）血液試料の赤血球を溶解し、前記試料を希釈する工程と；（ｂ）少なくとも第１の端部および第２の端部を有するスパイラル形状フローチャネルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記フローチャネルは、前記第１の端部もしくはその付近に２つの入口ポートおよび前記第２の端部もしくはその付近に少なくとも２つの出口ポートを有し、ここで２つの入口ポートの一方はスパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、かつ他方の入口ポートはスパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、かつ出口ポートの少なくとも１つは血液細胞の貯蔵を可能にする容器に接続される、マイクロ流体デバイスを提供する工程と；（ｃ）工程（ａ）の試料をスパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する入口ポートに導入し、かつシース液をスパイラル形状フローチャネルの内壁に位置する入口ポートに導入する工程と；（ｄ）前記試料およびシース液を、スパイラル形状フローチャネルを通すように駆動する工程と；（ｅ）少なくとも１つの出口ポートに接続された少なくとも１つの容器内の血液細胞を回収する工程と、を含む、方法を対象とする。

【0032】

ディーンフロー分画（ＤＦＦ）と称されるマイクロ流体細胞選別技術は、異常細胞のサイズに基づく分離として周知である［ホウ，Ｈ．Ｗ．（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．）ら著、サイエンティフィック・レポート（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．）、第３号（２０１３年）；ホウ，Ｈ．Ｗ．（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．）ら著、ラボラトリーチップ（Ｌａｂ Ｃｈｉｐ）、第１５巻、ｐ．２２９７−２３０７（２０１５年）］。ＤＦＦは、高い流速で支配的な慣性力（Ｆ_Ｌ）（レイノルズ数、Ｒｅ：約５０〜１００）により明確な位置に集束するための流線を通る粒子または細胞の側方遊走を含む、慣性微少流体技術に基づく選別方法である。ＤＦＦシステムでは、スパイラルマイクロチャネルをフロースルーする流体は、半径方向外向きの遠心加速を受けて、チャネルの上半分および下半分で、２つの対称的な反対方向に回転するディーン渦の形成をもたらす。スパイラルマイクロチャネルにおけるディーン渦の存在は、両方の力（Ｆ_ＬおよびＦ_Ｄ）の粒径とのスケール非線形性として優位な分解能をもたらす、さらなる側方のディーン牽引力（Ｆ_Ｄ）を課し、それらの重ね合わせ（ＦＬ／ＦＤ）がチャネル横断面内部の平衡位置を決定する（図１Ｂ）。

【0033】

用語「分離」、「分離する」、または「部分的に精製する」は、本明細書で交換可能に用いられ、分子の１種、特に血液試料の天然もしくは非天然成分（好ましくは好中球および／または単球）が、血液試料の他の成分（この試料中に天然もしくは非天然に存在している）を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、また最も好ましくは９０％含まないことを指す。これらの百分率値は、目的の成分の重量またはモル濃度に関連し得る。例えば、これは、分離後の単球および好中球が１つの容器内で一緒に回収されるが、血液試料の他の成分の少なくとも６０％が前記容器内に存在しない場合、単球および好中球は血清から分離されていることを意味する。様々な実施形態では、回収された好中球および／または単球はリンパ球から分離される。これは、好中球および／または単球がこれらの細胞に天然に付随するリンパ球の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％から分離されることを意味する。

【0034】

用語「血液細胞」は、本明細書で用いられるとき、血小板、赤血球および白血球を含むことを意味する。すべての白血球は有核であることから、それらは無核の赤血球および血小板から区別される。白血球のタイプは、標準的方法で分類され得る。２対の最も広いカテゴリーによると、それらは構造（顆粒球または無顆粒球）または細胞系統（骨髄系細胞またはリンパ球様細胞）のいずれかによって分類される。これらの最も広いカテゴリーはさらに、５つの主なタイプ：好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球に分割され得る。これらのタイプは、それらの物理および機能特性により区別される。単球および好中球は食作用性がある。さらなるサブタイプ分類は当該技術分野で周知である。

【0035】

「試料」または「患者試料」は、本明細書で用いられるとき、組織および体液などの生物学的試料を含む。「体液」は、限定はされないが、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、胸水、涙、乳糜管液（ｌａｃｔａｌ ｄｕｃｔ ｆｌｕｉｄ）、リンパ、痰、尿、羊水、および精液を含んでもよい。試料は、「無細胞」である体液を含んでもよい。「無細胞体液」は、約１％（ｗ／ｗ）未満の全細胞物質を含む。血漿または血清は、無細胞体液の例である。試料は、天然または合成起源の検体を含んでもよい。「血漿」は、本明細書で用いられるとき、血液中に見出される無細胞液を指す。「血漿」は、当該技術分野で公知の方法（例えば、遠心分離、濾過など）によって全細胞物質を血液から除去することにより、血液から得てもよい。本明細書で用いられるとき、「末梢血血漿」は、末梢血試料から得られる血漿を指す。「血清」は、本明細書で用いられるとき、血漿または血液の凝固が可能になり、凝固した画分が除去された後に得られる血漿の画分を含む。したがって、血清試料は無細胞でもある。それに対し、用語「全血」は、本明細書で用いられるとき、ヒトなどの被験者から本質的に収集され、未分離血液細胞を含有する血液を意味する。さらに、全血を適切な緩衝液などで希釈することにより、かつ／または添加剤、例えば抗凝固剤もしくはプロテアーゼ阻害剤を添加することにより得られる試料は、全血試料として用いられてもよい。全血試料は、血液細胞、例えば血小板、赤血球および白血球を含む。

【0036】

「溶解する」は、本明細書で用いられるとき、目的の所望される血液成分または微小粒子、例えば好中球および／または単球を放出するための赤血球またはそのタンパク質の破裂である。

【0037】

用語「希釈」は、本明細書で用いられるとき、一般に、同用語の通常の意味、すなわち、第２の流体または希釈液の、被験材料、例えば可溶性化学成分または部分的に不溶性の材料の懸濁液もしくは乳濁液を含有する第１の流体への添加と、それにより被験材料の得られる濃度が第１の流体の濃度よりも減少することを通じた、特定の被験材料のその材料を含有する流体の単位体積あたりの量における減少を包含する。本発明の観点では、希釈剤は、水性もしくは非水性液体を含む種々の形態を呈してもよく、かつ／または、追加的な材料成分、例えば可溶性化学成分または少なくとも部分的に不溶性の成分の懸濁液もしくは乳濁液を含んでもよい。上で言及されるように、被験材料は、化合物、可溶性のものかまたは懸濁液もしくは乳濁液として、生物学的材料のいずれか、可溶性のものかまたは懸濁液（例えば細胞）もしくは乳濁液としてなどのいずれかを含む、実質的に任意の組成物を含んでもよい。様々な実施形態では、被験材料は、上で定義されるような血液試料であり、かつ／または、希釈剤は、緩衝液、好ましくは血液細胞と適合できる緩衝液、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水（略してＰＢＳ）および他の周知の緩衝液である。希釈剤の体積に対する被験材料の体積の比は、少なくとも１：０、５；１：１；１：２；１：３；１：４；１：５；１：６；１：７；１：８；１：９；１：１０；１：１３；１：１５または例えば１：１〜１：３５；１：５〜１：３０もしくは１：１０〜１：２０の範囲であってもよい。

【0038】

本明細書で用いられるとき、表現「フローチャネル」は、液体用管状通路を意味する。好ましくは、フローチャネルはスパイラル形状である。スパイラル形状が非対称的形状を表すので、内壁および外壁を定義することが可能である（図１、１０、１６および１８）。本明細書で用いられるとき、表現「マイクロ流体デバイス」は、小さい、典型的にはミリメートル未満の規模まで幾何的に制約される、流体の制御および操作を可能にする物理的要素を意味する。「マイクロ流体デバイス」は、本明細書で用いられるとき、液体試料を、典型的には１ミリリットル未満の体積で、運搬し、貯蔵し、混合し、反応し、かつ／または分析するように設計された、１つ以上のマイクロ流体フローチャネルを含むデバイスを指す。マイクロ流体デバイスを作製するのに使用可能な材料の代表例として、限定はされないが、シリコンゴム、ガラス、プラスチック、シリコンおよび金属が挙げられ、好ましくは、マイクロ流体デバイスはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製である。

【0039】

用語「入口ポート」は、本明細書で用いられるとき、希釈試料およびシース液と最初に接触されるフローチャネルの端部と定義される。それに対し、用語「出口ポート」は、希釈試料の流体材料およびシース液をマイクロ流体デバイスから放出するフローチャネルの端部を指す。

【0040】

用語「容器に接続される」は、本明細書で用いられるとき、本発明のマイクロ流体デバイスにおいて回収される流体の第２の貯蔵ユニットへの移送に関する。「容器」は、本発明としての意味では、回収された流体を貯蔵するという機能のみを有するユニットだけでなく、さらなる精製、例えばカラムもしくはフィルターユニット、または回収された流体の分析を可能にするデバイスであり得る。回収された流体の分析に用いられるデバイスは、限定はされないが、ＦＡＣＳ装置、質量分析装置、顕微鏡、遠心分離機、ＰＣＲサーマルサイクラーおよびコーティング剤を含む第２のフローチャネル（機能的アッセイを実施するのに利用可能である）を含んでもよい。様々な実施形態では、かかるコーティングされたチャネルは、好中球のローリング速度を測定可能にするＥ−セレクチンコーティングを含む。

【0041】

用語「シース液」は、本明細書で用いられるとき、水性もしくは非水性液体および／または追加的な材料成分、例えば、可溶性化学成分または少なくとも部分的には不可溶性の成分の懸濁液もしくは乳濁液を含み得る液体を含む、種々の液体を指す。好ましくは、シース液は、緩衝液、好ましくは血液細胞と適合できる緩衝液、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水（略称ＰＢＳ）や他の周知の緩衝液である。用語「緩衝液」は、本明細書で用いられるとき、溶解または分散される環境のｐＨを制御する任意の化合物または化合物の組み合わせを意味する。ｐＨ値については、緩衝液は、緩衝液に添加される酸または塩基の効果を低下させる。緩衝液は一般に、その溶解度に基づいて２つのカテゴリーに分けることができる。両カテゴリーの緩衝液は、別々に、または組み合わせて用いることができる。「水溶性緩衝液」は、典型的には、１００ｍｌ中少なくとも１グラム、好ましくは７５ｍｌ中少なくとも１グラム、より好ましくは３０ｍｌ中少なくとも１グラムの水への溶解度を有する。水溶性緩衝液の例として、限定はされないが、ＰＢＳ、メグルミン、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グリセロリン酸カルシウム、トロメタミン、酸化マグネシウムまたは前述の任意の組み合わせが挙げられる。「水不溶性緩衝液」は、典型的には、１，０００ｍｌ中１グラム未満、好ましくは５，０００ｍｌ中１グラム未満、より好ましくは１０，０００ｍｌ中１グラム未満の水への溶解度を有する。水不溶性緩衝液の例として、限定はされないが、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、ジヒドロキシアルミニウム炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸アルミニウム、炭酸アルミニウム、アミノ酢酸ジヒドロキシアルミニウム、酸化マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、および前述の組み合わせが挙げられる。緩衝液はまた、支持剤、例えば塩、洗剤、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などが添加され得る。上記の緩衝液の各々において使用可能な濃度は当該技術分野で周知である。

【0042】

試料は、毛管引力の力によって駆動され得る。あるいは、試料は、電気力により、または試料を駆動するための他の手段により、ポンプに駆動され得る。ポンプは、限定はされないが、回転（遠心）ポンプ；蠕動ポンプ；および超音波ポンプを含む。電気力は、限定はされないが、電気流体力学的力；電場駆動力、例えば、電気泳動、電気浸透；および表面張力駆動、例えば、電気湿潤、誘電体表面上の電気湿潤を含む。試料を駆動するための手段は、ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）ら、グローバー（Ｇｒｏｖｅｒ）ら、ハント（Ｈｕｎｔ）らおよびベルサノ・ベゲイ（Ｂｅｒｓａｎｏ−Ｂｅｇｅｙ）らにより、より詳細に考察されている［ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら著
、「微少流体技術の基礎と応用（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、第２版、アーテックハウス社（ＡＲＴＥＣＨ ＨＯＵＳＥ，ＩＮＣ．）（ノーウッド、マサチューセッツ州：２００６年）、ｐ．２５５−３０９；エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）ら著、「微少流体システムにおける動電輸送への導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ
Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻、「製作および微少流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．２３１−２４８；グローバー（Ｇｒｏｖｅｒ）ら著、「モノリシック膜の弁およびポンプ（Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｖａｌｖｅｓ ａｎｄ Ｐｕｍｐｓ）」、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻、「製作および微少流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．２８５−３１７；ハント（Ｈｕｎｔ）ら著、「誘電体操作のための集積回路／マイクロ流体チップ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ／Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈｉｐｓ ｆｏｒ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）」、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２巻：「生体分子の分離および分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．１８７−２０６、ベルサノ・ベゲイ（Ｂｅｒｓａｎｏ−Ｂｅｇｅｙ）ら著、「ブライユ微少流体（Ｂｒａｉｌｌｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２巻：「生体分子の分離および分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．２６９−２８５］。Ｎｇｕｙｅｎらは、マイクロ弁、マイクロポンプ、マイクロフローセンサ、マイクロフィルターおよびマイクロセパレータについて詳細に考察している。ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）らにおける章では、弁、ポンプ、および分離について詳細に考察されている。

【0043】

試料は、シリンジを用いて、デバイスを試料に浸漬することにより、または他の手段により、マイクロ流体デバイスのフローチャネルに導入され得る。試料をマイクロ流体デバイスのフローチャネルに導入するための他の手段は、マイクロディスペンサー、例えば液滴ディスペンサー、例えば注射ノズルなど；インチャネルディスペンサー（ｉｎ−ｃｈａｎｎｅｌ ｄｉｓｐｅｎｓｅｒｓ）、例えば計量ディスペンサーを含む。試料をマイクロ流体デバイスのフローチャネルに導入するための手段は、ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）らおよびリー（Ｌｉ）らにより、より詳細に考察されている［ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら著、「微少流体技術の基礎と応用（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、第２版、アーテックハウス社（ＡＲＴＥＣＨ ＨＯＵＳＥ，ＩＮＣ．）（ノーウッド、マサチューセッツ州：２００６年）、ｐ．３９５−４１７；リー（Ｌｉ）ら著、「マイクロチップに基づく分析システム用の注射スキーム（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｍｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻：「製作および微少流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．３８５−４０３］。ヌグイェン（Ｎ
ｇｕｙｅｎ）らはマイクロディスペンサーについてより詳細に考察している。リー（Ｌｉ）らはマイクロディスペンサーについてより詳細に考察している。

【0044】

用語「回収する」は、本明細書で用いられるとき、ポリペプチドまたは細胞などの種を、例えば当該技術分野で周知の細胞および／またはタンパク質精製技術を用いる単離により、天然に付随する成分を実質的に含まないようにする過程を指す。

【0045】

本発明の様々な実施形態では、本発明の方法は、（ａ）遠心分離工程；および／または（ｂ）少なくとも１つのタイプの血液細胞がマーカー分子で標識される場合の標識工程を含まない。用語「遠心分離工程」は、本明細書で用いられるとき、遠心分離によって提供される細胞試料の他の成分（例えば非細胞成分）からの細胞の分離を指す。遠心工程は、以下の態様：限定はされないが、勾配分離、赤血球減少、血小板除去および細胞洗浄のうちの１つ、２つ以上もしくは全部を含んでもよい。用語「標識」は、本明細書で用いられるとき、１つ以上の検出可能なマーカー（または「標識」）の本発明で用いられる細胞、タンパク質および／またはペプチドへの付着または取り込みを意味する。用語「マーカー分子」または「検出可能なマーカー」は、本明細書で交換可能に用いられるとき、化学、物理または酵素反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的または間接的に生成する、１つ以上の適切な化学物質または酵素を含む任意の化合物を指す。本明細書で用いられるとき、同用語は、上記のような標識（すなわち、タンパク質および／またはペプチドに結合される化合物または部分）と標識試薬（すなわち、ペプチドまたはタンパク質との結合に先立つ化合物または部分）の双方を含むように理解されるべきである。本発明で用いられる標識は、タンパク質および／またはペプチドのアミノ酸残基に共有結合または非共有結合を介して付着されてもよい。典型的には、結合は共有結合である。標識は、特に、同位体標識、等圧標識、酵素標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、放射性標識、ハプテン、ビオチン、金属錯体、金属、およびコロイド金から選択され得るが、同位体標識および等圧標識が特に好ましい。これらの標識タイプはすべて、当該技術分野で十分に確立されている。

【0046】

本発明の範囲はまた、試料が指穿刺試料または静脈穿刺から生成される試料である場合の様々な実施形態を包含する。「指穿刺試料」は、本明細書で用いられるとき、指（先）から採取される１滴からなる血液の試料である。好ましくは、試料は、痛みなく皮膚に穴を開けて新たな血流を生み出すことができる小型の指先ランセットデバイスによって採取される。一旦停滞している１滴の血液が指上で利用可能であれば、コレクターがその液滴に適用可能であり、血液はコレクターにより吸収され得る。指穿刺試料の体積は、１０〜５００μＬ、好ましくは５０〜３００μＬ、より好ましくは８０〜１５０μＬの範囲であってもよい。

【0047】

本発明のさらなる様々な実施形態では、少なくとも２つの出口ポートは少なくとも４つの出口ポートである。他の様々な実施形態では、スパイラル形状フローチャネルをフロースルーする試料のレイノルズ数（Ｒｅ）は５０〜１００である。

【0048】

本明細書で用いられるとき、表現「レイノルズ数」は、ρυＬ／μ（式中、ρは液体の密度を表し；υは液体の速度を表し；Ｌはフローチャネルの特徴的長さを表し、μは液体の粘度を表す）を意味する。

【0049】

本発明の範囲によりさらに包含されるのは、スパイラル形状フローチャネルが、（ａ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むかまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなり；（ｂ）４００〜６００μｍ、好ましくは５００μｍの幅を有し；（ｃ）１１０〜１３０μｍ、好ましくは１１５μｍの高さを有し；かつ／または（ｄ）７〜１３ｃｍ、好ましくは１０ｃｍの全長を有することである。

【0050】

マイクロ流体デバイスおよびそのフローチャネルの寸法、ならびにマイクロ流体デバイスを構築するための材料およびマイクロ流体デバイスを構築するための方法は、ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、タベリング（Ｔａｂｅｌｉｎｇ）、アルマニ（Ａｒｍａｎｉ）ら、ツァオ（Ｔｓａｏ）ら、カーレン（Ｃａｒｌｅｎ）ら、チェン（Ｃｈｅｕｎｇ）ら、サン（Ｓｕｎ）らおよびワッデル（Ｗａｄｄｅｌｌ）により記載がなされている［ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら著、「微少流体技術の基礎と応用（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、第２版、アーテックハウス社（ＡＲＴＥＣＨ ＨＯＵＳＥ，ＩＮＣ．）（ノーウッド、マサチューセッツ州：２００６年）、ｐ．５５−１１５；タベリング（Ｔａｂｅｌｉｎｇ）著、「微少流体技術入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）（オックスフォード、グレート・ブリテン：２００５年）、ｐ．２４４−２９５；アルマニ（Ａｒｍａｎｉ）ら著、「ビニルサインプロッターを用いたＰＤＭＳマイクロ流体チャネルの製作（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ ＰＤＭＳ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｖｉｎｙｌ Ｓｉｇｎ Ｐｌｏｔｔｅｒ）」、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻：「製作および微少流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．９−１５；ツァオ（Ｔｓａｏ）ら著、「熱可塑性マイクロ流体におけるボンディング技術（Ｂｏｎｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻：「製作および微少流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．４５−６３；カーレン（Ｃａｒｌｅｎ）ら著、「シリコンおよびガラス微細加工（Ｓｉｌｉｏｎ ａｎｄ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ）、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻：「製作および微少流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．８３−１１４；チェン（Ｃｈｅｕｎｇ）ら著、「多成分生体適合性微細構造の製作における微少流体技術に基づくリソグラフィー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ−ｂａｓｅｄ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻：「製作および微少流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．１１５−１３８；サン（Ｓｕｎ）ら著、「酵素および化学分析のためのラミネートオブジェクト製造（ＬＯＭ）技術に基づく多チャネルラブオンアチップ（Ｌａｍｉｎａｔｅｄ Ｏｂｊｅｃｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（ＬＯＭ）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｎｅｌ Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、ラブオンアチップ技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻：「製作および微少流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．１６１−１７２；ワッデル（Ｗａｄｄｅｌｌ）著、「レーザー微細加工（Ｌａｓｅｒ Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ）」、ラブオンアチップ
技術（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１巻：「製作および微少流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（ノーフォーク、英国：２００９年）、ｐ．１７３−１８４］。

【0051】

様々な実施形態では、スパイラル形状フローチャネルは、出口ポートの分岐部で８００〜１２００μｍの幅まで徐々に拡大する。好ましい実施態様では、拡大された幅は１０００μｍである。

【0052】

本明細書で用いられるとき、用語「分岐される」は、枝に分割されることを意味する。本明細書で用いられるとき、用語「枝」は、より大きいかまたはより複雑な本体の限られた部分、すなわち、一次フローチャネルから出現するかまたは一次フローチャネルに入力もしくは再入力するより小さいフローチャネルを意味する。本明細書で用いられるとき、用語「一次フローチャネル」または「第１のフローチャネル」は、試料の少なくとも大部分がフロースルーするフローチャネルを意味する。

【0053】

本発明のさらなる様々な実施形態では、第１の出口ポートは内壁から外壁にかけて規定されるフローチャネルの０〜１００μｍの幅をカバーし、第２の出口ポートは１０１〜２５０μｍの幅をカバーし、第３の出口ポートは２５１〜６５０μｍの幅をカバーし、第４の出口ポートは６５１〜１０００μｍの幅をカバーする。

【0054】

本発明の他の実施形態では、第１の出口ポートはフローチャネルの幅の１〜２０％をカバーし、第２の出口ポートはフローチャネルの幅の１０〜２０％をカバーし、第３の出口ポートはフローチャネルの幅の３０〜５０％をカバーし、第４の出口ポートはフローチャネルの幅の２５〜４５％をカバーし、ここで出口ポート１〜４の順序は内壁から外壁にかけて規定される。

【0055】

さらに包含されるのは、血液細胞が好中球、単球およびリンパ球、血小板ならびに赤血球を含む場合の実施形態である。さらなる好ましい実施形態では、好中球および単球は第２の出口ポートによって回収され、かつ／またはリンパ球は第３の出口ポートによって回収される。

【0056】

用語「白血球」は、本明細書で用いられるとき、顆粒球およびリンパ球系統の哺乳動物細胞を意味する。白血球細胞の例として、多形核白血球、例えば好中球、および単核食細胞、例えば単球およびマクロファージ、およびリンパ球が挙げられる。

【0057】

用語「単球」は、本明細書で用いられるとき、（１）常在性マクロファージおよび樹状細胞を正常状態下で補充し、かつ（２）炎症性シグナルに応答し、単球が組織内の感染部位に高速に移動し（約８〜１２時間）、マクロファージおよび樹状細胞に分離／分化して免疫応答を誘発するという免疫系における２つの主な機能を有する白血球の１種を指す。それらの半数は脾臓に貯蔵される。単球は通常、染色塗抹でその大きい二葉核によって同定される。ＣＤ１４の発現に加えて、単球はまた、以下の表面マーカー：１２５Ｉ−ＷＶＨ−１、６３Ｄ３、アディポフィリン、ＣＢ１２、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ５４、Ｃｄ１６３、シチジンデアミナーゼ、Ｆｌｔ−１などのうちの１つ以上の発現を示す。

【0058】

単球という用語は、限定はされないが、古典的単球と非古典的炎症促進性単球の双方（双方ともヒト血液中に存在する）を含む。
用語「古典的単球」は、本明細書で用いられるとき、ＣＤ１４細胞表面受容体の高レベル発現によって特徴づけられる単球細胞（ＣＤ１４＋＋単球）の１種を指し、用語「非古
典的炎症促進性単球」は、本明細書で用いられるとき、ＣＤ１４の低レベル発現とともに、微生物産物による刺激に応答して腫瘍壊死因子およびインターロイキン−１２などの炎症促進性サイトカインを多量に産生することによって特徴づけられるＣＤ１６受容体のさらなる同時発現を伴う細胞（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球）を指す。これらの細胞は、ＣＤ１４＋＋単球から発生する。

【0059】

用語「マクロファージ」は、本明細書で用いられるとき、非特異的防御（先天性免疫）ならびに脊椎動物の特異的防御機構（獲得免疫）の開始を支援することの双方で作用する貪食細胞であるように特徴づけられる、単球の分化から誘導されるＣＤ１４＋陽性細胞を指す。その役割は、細胞残屑および病原体を定常細胞または可動細胞のいずれかとして貪食する（飲み込み、次に消化する）ことであり、また病原体に応答するため、リンパ球および他の免疫細胞を刺激することである。

【0060】

ＣＤ１４の発現に加えて、マクロファージはまた、以下の表面マーカー：ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０（マウス）／ＥＭＲｌ（ヒト）、リゾチームＭ、ＭＡＣ−ｌ／ＭＡＣ−３、２７Ｅ１０、カルボキシペプチダーゼＭ、カテプシンＫ、ＣＤ１６３およびＣＤ６８のうちの１つ以上の発現を示す。これらのマーカーは、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学染色によって測定され得る。

【0061】

用語「骨髄樹状細胞」は、本明細書で用いられるとき、単球から誘導され、限定はされないがｍＤＣ−１およびｍＤＣ−２を含む樹状細胞の集団を指す。ＣＤ１４の発現に加えて、骨髄樹状細胞はまた、以下の表面マーカー：ＡＤＡＭ１９、ＢＤＣＡ−２、ＣＤａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２１、ＣＤ８６、ＣＤ２０８、クラスタリン、エストロゲン受容体−αのうちの１つ以上の発現を示す。

【0062】

「好中球」は、本明細書で用いられるとき、骨髄細胞、後骨髄球および帯状体などの前駆細胞から生じ、かつ好酸球性または好塩基球性（好酸球または好塩基球など）でない細胞質を有する成熟白血球を意味する。「好中球」という用語は、ビタミンＢ１２の欠乏および／または葉酸欠乏が原因で生じる好中球および巨赤芽球性の好中球を含む。巨赤芽球性好中球はまた、過分葉核を有することがある。好中球はまた、ヒトを含む動物における好中球様細胞を包含する。好中球様細胞の具体例が、ジブチリル環状ＡＭＰでの処理後に分化したＨＬ６０細胞である。用語「好中球刺激活性」は、ヒトを含む動物における好中球または好中球様細胞の遊走（時として「化学遊走」と称される）および／または活性化を促進する活性を意味する。遊走は、好中球または好中球様細胞の組織への浸潤およびそれらの局所部位への移動を包含する。活性化は、活性酸素の産生、分解性酵素（例えばβ−ＨＡ）の分泌、様々なサイトカインおよび過酸化物の産生、ならびに食作用を包含する。これらの好中球刺激活性は、好中球の走化活性、活性酸素の放出を測定し、かつβ−ΗΑ分泌の量および／または細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇を測定することによりアッセイされ得る。特定のポリペプチドが「好中球刺激活性を有する」ことが本明細書中に記載されるとき、目的の好中球刺激活性は、好中球の遊走を促進する活性もしくは好中球の活性化を促進する活性のいずれかまたは両方の活性であってもよい。

【0063】

用語「リンパ球細胞」または「リンパ球」は、本明細書で交換可能に用いられるとき、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（通常、細胞媒介性の細胞傷害性自然免疫に関与する）、Ｔ細胞（通常、細胞媒介性の細胞傷害性獲得免疫に関与する）、Ｂ細胞（通常、体液性の抗体駆動性獲得免疫に関与する）、それらの大部分およびそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを指す。末梢血単核性（ＰＢＭＣ）細胞、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞（通常、腫瘍細胞の死滅に関与する）もまた、リンパ球細胞と考えられる。リンパ球の非限定例として、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ、ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ２^＋）、およびヘルパーＴ細胞
（ＣＤ４^＋）が挙げられる。

【0064】

様々な実施形態では、（ａ）シース液の流速は希釈試料の流速よりも少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍高く；かつ／または（ｂ）希釈試料の流速は１２０〜１３０μＬ／分である。

【0065】

さらなる実施形態では、（ａ）血液細胞は緩衝液で回収され；かつ／または（ｂ）血液試料は緩衝液で少なくとも１：５に希釈される。
「少なくとも１つ」は、本明細書で用いられるとき、１つ以上、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多いことに関する。

【0066】

さらなる態様では、本発明は、被験者における糖尿病または炎症性疾患を診断するための方法であって、（ａ）前記被験者の血液試料を提供し、好中球を単離する工程と；（ｂ）（Ｉ）前記被験者の試料の単離された好中球が、少なくとも１名の健常者との比較可能な対照試料の単離された好中球と比べて、糖尿病または炎症性疾患を示す、増加した平均ローリング速度を有するか否か；（ＩＩ）前記被験者の試料の単離された好中球が、少なくとも１名の健常者との比較可能な対照試料の単離された好中球と比べて、糖尿病または炎症性疾患を示す、減少した好中球真円度（ＮＣ）指数を有するか否か、または（ＩＩＩ）前記被験者の試料の単離された好中球が、少なくとも１名の健常者との比較可能な対照試料の単離された好中球と比べて、糖尿病または炎症性疾患を示す、細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）もしくはＣＤ１１ｂの増加した発現またはＰＳＧＬ−１の低下した発現を有するか否か、を判定する工程と、を含む、方法に関する。

【0067】

用語「診断する」および「診断」は、本明細書で用いられるとき、当業者が、被験者が所与の疾患、障害または状態を患うか否かを評価し、ひいては判定することができる方法を指す。当業者は、１つ以上の診断指標（上記の通り）に基づいて診断を行い、その（存在または不在を含む）量は、状態の存在、重症度、または不在についての指標である。

【0068】

用語「被験者」は、本明細書で用いられるとき、個人、植物、または動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）、家畜（例えば、鳥類、魚、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、家畜哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、または実験動物（例えば齧歯類、例えばマウス、ラットおよびモルモット）を指す。同用語は、特定の年齢または性別を意味しない。用語「被験者」は、胚および胎児を包含する。被験者という用語は、本発明との関連では、患者という用語と交換可能に用いられてもよい。

【0069】

「糖尿病」は、本明細書で用いられるとき、別段の指示がない限り、真性糖尿病を指し、１型、２型、および３型（１．５型とも称される）を含む。「糖尿病」は、７５ｇの経口グルコース負荷の摂取から２時間後の１２６ｍｇ／ｄｌ（６．９ミリモル／ｌ）以上の空腹時血漿グルコース濃度、または２００ｍｇ／ｄｌ（１１．１ミリモル／ｌ）以上の血漿グルコース濃度に対応する。好ましくは、糖尿病は２型糖尿病である。用語「２型糖尿病」は、本明細書で用いられるとき、血糖レベルにおける不適切な上昇によって特徴づけられる疾患を指す。糖尿病の慢性高血糖症は、長期損傷、機能障害、および異なる臓器の不全を伴い、網膜症、腎症、および末梢神経障害などの種々の合併症をもたらす。２型糖尿病は、低下したβ細胞の質量および機能の組み合わせに起因する、末梢組織（主に骨格筋、脂肪組織、および肝臓）におけるインスリン抵抗性および不適切な代償性インスリン分泌応答によって引き起こされる。グルコース濃度の上昇に加えて、欠陥のあるインスリン作用が、コレステロールまたはトリグリセリドレベルの上昇をもたらすことが多い。

【0070】

「炎症性疾患」は、本明細書で用いられるとき、炎症によって特徴づけられる疾患また
は状態を指す。炎症は、感染または刺激に対する免疫系の初期応答を包含し、時として自然カスケードと称される。炎症は、典型的には、以下の症状：関連する臓器の紅化、発熱、腫脹、疼痛、および機能障害のうちの１つ以上によって特徴づけられる。「治療」は、本明細書で用いられるとき、疾患またはその進行の予防、疾患または状態に伴う１つ以上の症状（例えば疼痛）の軽減、および／または元の病態または状態の寛解もしくは治癒を包含する。

【0071】

本明細書に記載のように治療可能な炎症性疾患の例として、限定はされないが、移植拒絶；関節の慢性炎症性障害、例えば関節炎、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、変形性関節症および骨再吸収の増加に関連した骨疾患；炎症性腸疾患、例えば回腸炎、潰瘍性大腸炎、バレット症候群、およびクローン病；炎症性肺障害、例えば喘息、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または慢性閉塞性気道疾患；眼の炎症性障害、例えば角膜異栄養症、トラコーマ、オンコセルカ症、ぶどう膜炎、交感神経性眼球炎および眼内炎；歯肉の慢性炎症性障害、例えば歯肉炎および歯周炎；結核；ハンセン病；腎臓の炎症性疾患、例えば尿毒性合併症、糸球体腎炎およびネフローゼ；肝臓の炎症性疾患、例えばウイルス性肝炎および自己免疫性肝炎；皮膚の炎症性障害、例えば硬化性皮膚炎、乾癬、紅斑、湿疹、または接触皮膚炎；中枢神経系の炎症性疾患、例えば脳卒中、神経系の慢性脱髄性疾患、多発性硬化症、ＡＩＤＳ関連神経変性およびアルツハイマー病、感染性髄膜炎、脳脊髄炎、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症およびウイルス性もしくは自己免疫性脳炎；自己免疫性疾患、例えば糖尿病、免疫複合体脈管炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；心臓の炎症性疾患、例えば心筋症、虚血性心疾患、高コレステロール血症、および粥状動脈硬化；ならびに子癇前症、慢性肝不全、脳および脊髄外傷、およびがんなどの様々な疾患に起因する炎症、が挙げられる。本明細書に記載のような治療可能な炎症性疾患は、身体の全身性炎症をさらに含む。全身性炎症の例として、限定はされないが、グラム陽性もしくはグラム陰性ショック、敗血症、敗血症性ショック、出血性もしくはアナフィラキシーショック、および全身性炎症性応答症候群が挙げられる。炎症性疾患のさらなる例として、循環性ショック、出血性ショックおよび心原性ショックが挙げられる。

【0072】

用語「測定する」は、本明細書で用いられるとき、一般に、例えば限られた体積（例えば液滴）の定量的もしくは定性的な分析もしくは測定、および／または限られた体積内の種、特性、もしくは状態の存在、不在、もしくは量の検出を指す。

【0073】

「単離された」として本明細書で参照される細胞は、その元となる供給源（例えばそれが細胞またはインビトロもしくは合成発現系において存在するとき）の他の細胞および他の細胞成分から分離された細胞であり、さらなる処理を受けていてもよい。「単離された」は、本明細書で用いられるとき、細胞が天然に会合する他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、最も好ましくは９０％含まない細胞を指す。この百分率値は、重量または数／モル濃度に関する場合がある。「単離された」細胞は、本質的に純粋な細胞を含む、本明細書に記載の方法、類似方法または他の好適な方法によって得られる細胞を含む。「単離する」は、本明細書で用いられるとき、単一成分、例えば規定された高分子種を、成分の混合物から、例えば組換え細胞の培養物から放出し、獲得する過程と定義される。これは典型的には、遠心分離、真空下での濾過もしくは真空下でない濾過、正圧下での濾過、蒸留、蒸発またはそれらの組み合わせなどの手段により実行される。単離は、精製（その間に単離物の化学純度、キラル純度または化学およびキラル純度が増加する）を伴う場合または伴わない場合がある。精製は、典型的には、結晶化、蒸留、抽出、酸性、塩基性もしくは中性アルミナを通す濾過、酸性、塩基性もしくは中性炭を通す濾過、キラル定常期が詰め込まれたカラムでのカラムクロマトグラフィー、多孔質紙、プラスチックもしくはガラスバリアを通す濾過、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、再結晶化、順相高性能液体クロマトグラフィー
、逆相高性能液体クロマトグラフィー、研和などの手段により実行される。

【0074】

用語「対照試料」は、本明細書で用いられるとき、例えば、がんまたは他の疾患を患っていない健常被験者由来の試料、評価対象の被験者よりも大して重篤でないかまたは進行が遅い所与の疾患を有する被験者由来の試料、一部の他の疾患タイプを有する被験者由来の試料、治療前の被験者由来の試料、非患部組織（例えば非腫瘍組織）の試料、患部に対して同じ起源および近い起源に由来する試料などを含む、任意の臨床的に関連した比較可能な試料を指す。対照試料は、１名以上の被験者由来の試料を含んでもよい。対照試料はまた、評価対象の被験者からより早い時点に作製された試料であってもよい。例えば、対照試料は、疾患の発症前に、疾患のより早いステージで、または治療もしくは治療の一部を施す前に、評価対象の被験者から採取された試料であり得る。対照試料は、精製された試料、細胞、化合物、タンパク質、および／または核酸であり得る。かかる対照試料は、追加的薬剤がさらに添加され得る。

【0075】

用語「健常」は、本明細書で用いられるとき、用語「健常」が任意の絶対的評価または状態に対応するように限定され得ないことから、具体的な疾患、または疾患因子、または疾患判定基準に対して相対的であることは理解されるであろう。したがって、任意の具体的な疾患または疾患判定基準を参照して健常と定義される個体は、実際には任意の他の１つ以上の疾患と診断され得るかまたは任意の他の１つ以上の疾患判定基準を呈し得る。

【0076】

白血球では、血液が身体の組織に到達するための輸送培地として用いられる。白血球溢出は、４つの工程：化学誘引、ローリング接着、密な接着および遊出に分かれる。ローリング接着の間、循環白血球上の炭水化物リガンドは、容器の内壁上のセレクチン分子にわずかな親和性で結合する。これにより、白血球は減速し、容器壁の内表面に沿ってローリングし始める。このローリング動作の間、セレクチンとそのリガンドとの間で、一過性の結合が形成され、破壊される。このローリング動作は、所与の時間枠内での白血球によりカバーされる距離を測定することにより測定され得る。用語「ローリング速度」は、本明細書で用いられるとき、カバーされる距離と時間とのこの関係を指す。糖尿病の期間、白血球のローリング速度は、健常者における白血球の速度と比べて増加する。好ましい実施態様では、少なくとも４．５、５．０、５．３、５．５、６．０、６．５もしくは７．０μｍ／秒のローリング速度は糖尿病を示す。

【0077】

用語「好中球真円度（ＮＣ）指数」は、本明細書で用いられるとき、白血球の形態の定量化を可能にする系を指す。好中球真円度指数を決定するため、好中球の画像が画像分析ソフトウェア、例えばＩｍａｇｅＪバージョン１．３３（アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、ベセスダ、メリーランド州）を用いて分析され、細胞真円度が判定される。細胞の真円度［（４Π×面積）／周囲長^２］は、真円に対応する１．０に接近し；より小さい値は次第に細長い楕円を表す。好中球の真円度を定量するための方法およびソフトウェアは当該技術分野で周知である。好ましい実施態様では、好中球真円度（ＮＣ）指数の減少は、少なくとも０．８５の好中球真円度（ＮＣ）を有する被験好中球の６０％、６５％、７０％、７３％、７６％、７８％もしくは８０％より小さいと定義される。

【0078】

用語「発現された」または「発現」は、本明細書で用いられるとき、遺伝子の２つの核酸鎖の一方の領域に対して部分的に少なくとも相補的なＲＮＡ核酸分子をもたらすための遺伝子からの転写を指す。用語「発現された」または「発現」はまた、本明細書で用いられるとき、タンパク質もしくはポリペプチドまたはその一部をもたらすための前記ＲＮＡ核酸分子からの翻訳を指す。

【0079】

用語「反応性酸素種（ＲＯＳ）は、本明細書で用いられるとき、酸素を含有する化学反
応性分子に関する。例として、ペルオキシド、スーパーオキシド、ヒドロキシル基、および一重項酸素が挙げられる。生物学的状況下では、ＲＯＳは、酸素の正常代謝の天然副産物として形成され、細胞シグナル伝達および恒常性において重要な役割を有する。しかし、環境ストレス（例えば紫外線または熱への曝露）または病態形成の期間では、ＲＯＳレベルは劇的に上昇し得る。

【0080】

インテグリン・アルファＭ（ＩＴＧＡＭ）は、マクロファージ−１抗原（Ｍａｃ−１）または補体受容体３（ＣＲ３）としても公知のヘテロ二量体インテグリン・アルファ−Ｍ・ベータ−２（α_Ｍβ_２）分子を形成する１つのタンパク質サブユニットである。ＩＴＧＡＭはまた、ＣＲ３Ａ、および表面抗原分類分子１１Ｂ（ＣＤ１１Ｂ）としても公知である。α_Ｍβ_２の第２鎖は、ＣＤ１８として公知の共通のインテグリンβ_２サブユニットであり、それ故、インテグリンα_Ｍβ_２はβ_２サブファミリー（または白血球）インテグリンに属する。

【0081】

ＰＳＧＬ−１、ＳＥＬＰＬＧまたはＣＤ１６２（表面抗原分類１６２）としても公知のセレクチンＰリガンドはヒト遺伝子である。ＳＥＬＰＬＧは、骨髄系細胞上および刺激されたＴリンパ球上のＰ−セレクチン上での高親和性の対抗受容体である。そのように、それはＰ−セレクチンを発現する活性化された血小板または内皮へのこれらの細胞の繋留において重要な役割を果たす。Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１は、Ｅ−セレクチン（内皮）およびＬ−セレクチン（白血球）を含むセレクチンのファミリーの１つであるＰ−セレクチン（Ｐは血小板を表す）に結合する白血球および内皮細胞の上に見出される糖タンパク質である。セレクチンは、細胞接着分子のより広範なファミリーの一部である。ＰＳＧＬ−１は、そのファミリーの３つすべてのメンバーに結合し得るが、Ｐ−セレクチンに最良に（最高の親和性で）結合する。

【0082】

好ましい実施態様では、糖尿病を有する患者由来の好中球内での細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）またはＣＤ１１ｂの発現レベルは、健常患者におけるレベルと比べて、少なくとも５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％もしくは１００％増加する。他の好ましい実施形態では、糖尿病を有する患者由来の好中球内でのＰＳＧＬ−１の発現レベルは、健常患者におけるレベルと比べて、少なくとも５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％もしくは８０％減少する。

【0083】

本発明の様々な実施形態では、好中球は、本発明の血清または血漿に由来する血液細胞を分離するための方法に従って単離される。
本発明の範囲はまた、糖尿病が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である場合の様々な実施形態を包含する。

【0084】

好中球のローリング速度の測定に関する本発明のさらなる様々な実施形態では、増加した平均ローリング速度は少なくとも５．３０μｍ／秒である。様々な他の実施形態では、ローリング速度は、Ｅ−セレクチンでコーティングされたチャネル内で測定される。

【0085】

ＣＤ６２抗原様ファミリーメンバーＥ（ＣＤ６２Ｅ）としても公知であるＥ−セレクチンは、内皮−白血球接着分子１（ＥＬＡＭ−１）、または白血球−内皮細胞接着分子２（ＬＥＣＡＭ２）は、サイトカインによって活性化される内皮細胞に限って発現される細胞接着分子である。他のセレクチンと同様、それは炎症における重要な部分を担う。ヒトでは、Ｅ−セレクチンはＳＥＬＥ遺伝子によってコードされる。

【0086】

本発明の範囲によりさらに包含されるのは、好中球真円度（ＮＣ）指数の決定に関する実施形態では、減少した好中球真円度（ＮＣ）指数は、少なくとも０．８５の好中球真円度（ＮＣ）を有する被験好中球の７６％未満と定義される。

【0087】

細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）、ＣＤ１１ｂおよびＰＳＧＬ−１の発現に関する様々な実施形態では、（ａ）前記被験者の試料の単離された好中球における細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）もしくはＣＤ１１ｂの発現は、比較可能な対照試料における発現と比べて少なくとも１０％増加し；かつ／または（ｂ）前記被験者の試料の単離された好中球におけるＰＳＧＬ−１の発現は、比較可能な対照試料における発現と比べて少なくとも１０％減少する。

【0088】

本発明のさらなる態様では、本範囲は、少なくとも第１の端部および第２の端部を有するスパイラル形状フローチャネルを含むマイクロ流体デバイスであって、前記フローチャネルが、前記第１の端部もしくはその付近に２つの入口ポートおよび前記第２の端部もしくはその付近に少なくとも２つの出口ポートを有し、ここで２つの入口ポートの一方がスパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、かつ他方の入口ポートがスパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、かつ出口ポートの少なくとも１つが血液細胞の貯蔵を可能にする容器に接続され；ここでフローチャネルが１１０〜１３０μｍ、好ましくは１１５μの高さを有する、マイクロ流体デバイスを包含する。

【0089】

デバイスの様々な実施形態では、少なくとも２つの出口ポートは少なくとも４つの出口ポートである。
本発明の範囲はまた、スパイラル形状フローチャネルが出口ポートの分岐部で８００〜１２００μｍの幅まで徐々に拡大する場合の様々な実施形態を包含する。好ましい実施態様では、スパイラル形状フローチャネルは、出口ポートの分岐部で８００〜１２００μｍの幅まで徐々に拡大する。さらなる好ましい実施形態では、拡大された幅は１０００μｍである。さらなる好ましい実施形態では、第１の出口ポートは、内壁から外壁にかけて規定されるフローチャネルの０〜１００μｍの幅をカバーし、第２の出口ポートは１０１〜２５０μｍの幅をカバーし、第３の出口ポートは２５１〜６５０μｍの幅をカバーし、かつ第４の出口ポートは６５１〜１０００μｍの幅をカバーする。

【0090】

本発明の範囲によりさらに包含されるのは、様々な実施形態では、スパイラル形状フローチャネルが、（ａ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むかまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる；（ｂ）７〜１３ｃｍ、好ましくは１０ｃｍの全長を有する；かつ／または（ｃ）４００〜６００μｍ、好ましくは５００μｍの幅を有することである。

【0091】

デバイスの好ましい実施形態では、少なくとも２つの出口ポートは２つの出口ポートである。上で規定される２つの出口ポートデバイスのより好ましい実施形態では、第１の出口ポートはフローチャネルの幅の５〜３０％、好ましくは２０％をカバーし、かつ第２の出口ポートはフローチャネルの幅の７０〜９５％をカバーし、ここで第１の出口ポートは内壁に位置し、かつ第２の出口ポートは外壁に位置する。上で規定される２つの出口ポートデバイスの様々な実施形態では、スパイラル形状フローチャネルは、（ａ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むかまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる；（ｂ）５〜１０ｃｍ、好ましくは６．５ｃｍの全長を有する；（ｃ）２００〜４００μｍ、好ましくは３００μｍの幅を有する；かつ／または（ｄ）３０〜９０μｍ、好ましくは６０μｍの高さを有する。

【0092】

分離方法について説明されるすべての好ましい実施形態はまた、本発明のマイクロ流体デバイスに適用される。
好ましい実施態様では、本発明の両方法（１．血液細胞を分離するための方法と２．糖尿病を診断するための方法）は共役される。この場合、糖尿病の診断に必要とされる好中球は、本明細書に記載の通りに血液細胞を分離するための方法に従って精製および生成さ
れる。したがって、かかる共役方法を実施するため、上記工程を実施することを可能にする２つのデバイスは相互接続され得る。したがって、本発明のマイクロ流体デバイスは、内壁にてＥ−セレクチンでコーティングされた第２のマイクロ流体フローチャネルに直接的に連結され得る。第２のフローチャネルを用いて、好中球のローリング速度は、本明細書に記載のように測定され得る。したがって、本発明のマイクロ流体デバイスの１つ以上の出口ポートまたはその容器は、被験患者に対する糖尿病診断を行うため、好中球を試料から精製し、そのローリング速度を直接的に分析するための、Ｅ−セレクチンでコーティングされたフローチャネルと接続され得る。

【0093】

別の態様では、本発明はまた、内壁がＥ−セレクチンでコーティングされたマイクロ流体フローチャネルに関する。かかるチャネルは、少なくとも０．１ｃｍの長さを有してもよい。好ましくは、チャネルは０．５〜２ｃｍの長さを有する。幅は、少なくとも２００μｍ、好ましくは３５０〜５００μｍの間であってもよい。チャネル高さは、少なくとも４０μｍ、好ましくは４５〜７５μｍの間であってもよく、より好ましくは、高さは６０μｍである。Ｅ−セレクチンでコーティングされたチャネルを用いてローリング速度を測定するための例が下記に示される。つまり、直線状のマイクロチャネル（１ｃｍの長さ×４００μｍの幅×６０μｍの高さ）は、４℃で１時間、Ｅ−セレクチンでコーティングされ（５０μｇ／ｍＬ、ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡで室温にて３０分間ブロッキングされ得る。ブロッキング後、チャネルは、チャネル内の余分なＥ−セレクチンを刺激し、洗い流すため、ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡが負荷されたシリンジに接続され得る。ローリングアッセイにおいては、Ｅ−セレクチン上での好中球の結合およびローリングのカルシウム依存性相互作用を促進するため、ＣａＣｌ_２（２０μΜ、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））がＤＦＦで精製された好中球に添加され得る。約１０〜２０μＬのＤＦＦで精製された好中球（約１０^６個の細胞／ｍＬ）が入口リザーバーで負荷され得、またシリンジが、好中球ローリングを開始させるため、２．６μＬ／分（約２ダインｃｍ^−２）で取り除くように設定され得る。位相差像が、メタモルフ（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）ソフトウェア（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））を用いて２０倍の倍率で０．５秒間隔ごとにマイクロチャネルの中央部で３０秒間捕捉され得る（全部で６１フレーム）。炎症および病態を誘発するため、ＤＦＦで精製された好中球はまた、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍＬ、ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））、ＰＭＡ（２ｎＭ、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））またはＤ−グルコース（３０ｍＭ、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で室温にて３０分間処理され得る。次に、好中球は、ローリングアッセイのため、１０００×ｇで４分間洗浄され、２０μΜ ＣａＣｌ_２とともに約１０^６個の細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁され得る。

【0094】

さらなる態様では、本発明は、上記のようなスパイラル形状フローチャネルを含むマイクロ流体デバイスに関し、ここでフローチャネルは、ＰＤＭＳ製でもよく、また２００〜４００μｍ、好ましくは３００μｍの幅を有してもよい。高さは５０〜１００μｍ、好ましくは６０μｍであってもよい。チャネルの全長は５〜１０ｃｍであってもよい。第１の出口ポートの幅は０〜５０μｍであってもよく、第２の出口ポートの幅は５１〜３００であってもよい（内壁〜外壁から決定）。

【0095】

さらなる態様では、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）および大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）を分離する方法に関する。この方法では、上記の２つの出口ポートデバイスが用いられる。

【0096】

さらなる態様では、本発明は、上記の２つの出口ポートデバイスを用いて微小粒子を血液から回収する方法に関する。
［実施例］
実施例１：糖尿病におけるマイクロ流体好中球の精製および表現型決定
全血由来の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）［ハウ，Ｈ．Ｗ．（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．）ら著、サイエンティフィック・レポート（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．）、第３号（２０１３年）］および微生物［ハウ，Ｈ．Ｗ．（Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．）ら著、ラボラトリーチップ（Ｌａｂ Ｃｈｉｐ）、第１５巻、ｐ．２２９７−２３０７（２０１５年）］を含む異常細胞のサイズに基づく分離のため、ディーンフロー分画（ＤＦＦ）と称されるマイクロ流体細胞選別技術が開発されている。ここで、白血球サブタイプ間のわずかな細胞サイズ差が、単一工程方式で溶解全血から好中球を精製するための４出口ＤＦＦスパイラルデバイスによる分離において十分であり得るか否かを試験した（図１）。

【0097】

ＤＦＦスパイラルデバイスは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中で製作されたもので、全長が約１０ｃｍの２入口、４出口のスパイラルマイクロチャネル（５００μｍ（幅）×１１５μｍ（高さ））から構成される。大きめの白血球（約８〜１２μｍ、ａ_ｐ／ｈ＞０．０７（ａｐは粒径））のみが慣性集束を受けて、内壁により接近して平衡化できるように、チャネル高は１１５μｍで固定した。出口領域付近で、チャネルは、異なる幅の４つの収集出口を有する分岐部でより大きい幅（１０００μｍ）まで徐々に拡大する（内壁：出口１（Ｏ１）：１００μｍ、出口２（Ｏ２）：１５０μｍ、出口３（Ｏ３）：４００μｍ、出口４（Ｏ４）：３５０μｍから開始）。好中球を全血から精製するため、ヒト全血をＲＢＣ溶解緩衝液で溶解し（１：１０体積）、その後、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した１×リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でクエンチした（１：２体積）。希釈した溶解血液試料を外側入口に１３０μＬ分^−１でポンピングし、シース液（０．１％ＢＳＡを添加したｌ×ＰＢＳ）を、内側入口を通してより高い流速（１０×、１３００μＬ分^−１）でポンピングし、試料流を外壁付近で拘束した。血液試料がチャネル沿いに流れるとき、細胞は支配的なＦ_Ｄにより内壁の方への側方遊走を経る。小さめの血小板および溶解ＲＢＣ（ａ_ｐ／ｈ＜０．０５）は外壁に戻るように再循環し、ディーンサイクル（ＤＣ１）を完成させる一方、大きめの白血球（ａ_ｐ／ｈ＞０．０７）は、追加的な慣性揚力（Ｆ_Ｌ）を受け、内壁付近に集中する。細胞サイズ差に起因し、大きめの好中球／単球（１０〜１２μｍ、ａ_ｐ／ｈが約０．９〜０．１）は、リンパ球（約７〜８μｍ、ａ_ｐ／ｈが約０．０７）よりも強力なＦ_Ｌを（内壁方向に向けて）受け、内壁により接近して平衡化し、好中球およびリンパ球各々の出口２および３への白血球分画を生じる（図１Ｂ）。これにより、選別された好中球が収集中にシース緩衝液に再懸濁される一方、元の溶解血液試料（血小板、溶解ＲＢＣおよび遊離ヘモグロビン）が出口４で溶出されることから、効率的な好中球精製が促進される。

【0098】

好中球精製のための最適なフロー条件を決定するため、血液試料を溶解し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＢＣ汚染物質を除去した。次に、主に白血球および血小板からなる洗浄試料をスパイラルＤＦＦデバイスに異なる流速でポンピングし、フローサイトメトリー分析のため、溶出剤を４つの出口から収集した。白血球示差分析においては、白血球をフォワードおよびサイドスキャッターシグナルに基づいてゲーティングし、抗体のカクテルで染色し、好中球、単球およびリンパ球を同定した。図２Ａに示すように、大きめの好中球および単球は出口２へ１２０〜１３０μＬ分^−１の試料流速で効率的に選別され（＞８０％）、小さめのリンパ球の大部分（約９５％）は出口３へ分離された。これは高速顕微鏡画像によって明白であり、大きめの細胞は内壁により接近した慣性集束を示した（図２Ｂ）。選別された白血球はまた、ライト・ギムザ染色で染色し、出口２で好中球同一性を確認し、細胞は分離後にその形態を十分に保存することが示された（図２Ｃ）。流速が１３０μＬ分^−１を超えて増加するにつれて、好中球の出口２での回収は減少したが、単球選別は無影響のままであった。それ故、最適な流速は、出口２でのリンパ球汚染が最少のハイスループットな好中球選別を達成するためのその後の実験において１３０μＬ分^−１に設定した。この単一工程手順では、好中球を指穿刺血液の１滴（約５０μＬの全血；全溶解血液量が約１〜１．５ｍＬ）から単離するのに約１０分必要である。好中球精製に加えて、単球
およびリンパ球の非標識分画を、密度勾配遠心分離から得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて行った（図Ｓ２）。

【0099】

ポイントオブケア試験においては、結果の一貫性を保証するため、マニュアル試料の調製を最低限にすることは重要である。次に（遠心分離を伴わない）直接的な溶解血液処理の効果を、ＤＦＦを用いて試験し、同様の好中球分離性能が、２倍の生理食塩水体積でクエンチされた溶解血液試料を用いて実証された。好中球は内壁付近に集中しており、ゴーストＲＢＣから明確に分離され（図２Ｄ）、出口２において高い好中球純度（約９０％）が得られた（図２Ｅ）。最後に、ＤＦＦ分離の前と後における好中球ＣＤ６６ｂの発現および細胞内ＲＯＳレベルを特徴づけ、（健常被験者から得られる）選別された未処理の好中球のＲＯＳレベルが活性化された（ＰＭＡ処理された）好中球よりも有意に低いままであることが示された。これにより、以前の試験［ウーＬ．（Ｗｕ，Ｌ．）ら著、アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、第８４巻、ｐ．９３２４−９３３１（２０１２年）］と一致するように、スパイラルデバイス内部での高フロー条件（約ｍ／秒）が白血球活性化に対して無視できる効果を有することが示され、Ｔ２ＤＭもしくは代謝異常の他の状態（例えば糖尿病を伴わない心血管疾患）を有する患者由来の血液試料を処理するためのＤＦＦ好中球精製技術の利用がさらに検証される。

【0100】

Ｅ−セレクチン上での好中球ローリング表現型について試験するため、直線状のマイクロチャネル（１ｃｍ（長さ）×４００μｍ（幅）×６０μｍ（高さ））を組換えヒトＥ−セレクチン（５０μｇ／ｍＬ）でコーティングし、毛細管後の細静脈におけるフロー条件（約１〜１０ダインｃｍ^−２）をシミュレートした。ＤＦＦで選別された好中球を生理学的剪断条件（２ダインｃｍ^−２）でチャネルにポンピングし、時間差イメージングを用いて好中球ローリングを捕獲した。ＭＡＴＬＡＢ追跡アルゴリズムを開発し、好中球ローリング軌道を追跡し、ハイスループット単一細胞分析のため、速度を測定した。図３Ａに示すように、健常好中球は、直線経路内で安定的なローリング挙動を呈した一方、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）が活性化された好中球におけるローリング軌道は「フリッピング」動作を伴って不連続であった。グルコース処理（３０ｍＭ）およびＴＮＦ−α活性化（１０ｎｇ／ｍＬ）が施された好中球のローリング速度は、健常好中球よりも高く（Ｐ＜０．００５）、ＰＭＡ処理（１μΜ）が施された好中球は、ローリングしない代わりに、フロー下でＥ−セレクチンに堅く付着した（図３Ｂ）。ローリング表現型におけるこれらの差については、Ｅ−セレクチン上での白血球ローリングを媒介することで知られる、好中球でのＰＳＧＬ−１の発現、ならびにＥ−セレクチンへの付着を支持する白血球上で発現されるＣＤ１１ｂ、Ｍａｃ−１インテグリンを測定することにより、さらに検討した。好中球上でのＰＳＧＬ−１の発現は、グルコースおよびＴＮＦ−α処理の双方とともに減少し、その下方制御はＰＭＡ処理された好中球においてより有意であったが、それは活性化された白血球においてＰＳＧＬ−１の脱落を示す以前の報告に一致する（図３Ｃ）。同様に、好中球でのＣＤ１１ｂレベルはすべての処理条件において上方制御され、ＰＭＡ処理された好中球における増加がより高かった（図３Ｄ）。これらの結果によると、ＰＳＧＬ−１およびＣＤ１１ｂの表面発現の改変がＥ−セレクチン上での好中球ローリングに影響し、細胞ローリング表現型の、糖尿病患者における好中球活性化を評価するための新規な機能的バイオマーカーとしての使用を示唆することが確認された。

【0101】

好中球機能障害がＴ２ＤＭ患者において以前に報告されていることから、１回目の免疫表現型決定を、フローサイトメトリーならびに低グレードの炎症状態および心血管リスクのための主要マーカーであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の測定を用いることにより、健常被験者（ｎ＝１３）およびＴ２ＤＭ（ｎ＝１６）患者において実施した（図７にまとめる）。Ｔ２ＤＭ患者における白血球数および好中球数の双方が健常被験者と比べてより高かったが（Ｐ＜０．００１）、これはインビボでの炎症応答の増強を示している（図４Ａ、Ｂ）。平均好中球ＲＯＳレベル（図４Ｃ）およびＣＤ１１ｂ発現（図４Ｄ）について
もＴ２ＤＭ群にて上昇したことから（Ｐ＜０．０１）、Ｔ２ＤＭ患者におけるより明白な好中球活性化が確認された。興味深いことに、Ｔ２ＤＭ患者における好中球でのＰＧＳＬ−１発現の有意な下方制御が認められた（Ｐ＜０．０５）（図４Ｅ）。ＰＳＧＬ−１の発現低下が好中球活性化の増強に関連したことから、これは健常およびＴ２ＤＭ患者双方において好中球ＲＯＳレベル（図４Ｆ）およびＣＤ１１ｂ発現（図４Ｇ）と十分に相関した。Ｔ２ＤＭ患者におけるＤＦＦで選別された好中球と遠心分離で洗浄された好中球との間で、ＰＳＧＬ−１およびＣＤ１１ｂの発現における無視できる差が認められたが、ＤＦＦが下流アッセイまたはポイントオブケア試験における効率的な好中球精製技術であることがさらに検証された。好中球以外では、Ｔ２ＤＭ患者の単球においてもＰＳＧＬ−１発現の下方制御が認められ（Ｐ＜０．０１）、Ｔ２ＤＭ患者における単球−内皮相互作用および心血管合併症において洞察を得るための試験であることがさらに確認された。まとめると、これらの結果は、慢性炎症状態に寄与し得る活性化された好中球の存在の増加を伴う、Ｔ２ＤＭ患者における炎症誘発状態を明示する。

【0102】

現在のマイクロ流体ローリングアッセイは、設計の複雑性およびアッセイに先立つ従来式白血球単離方法により制限を受ける。Ｔ２ＤＭ患者における好中球ローリング表現型を特徴づけるため、開発したＤＦＦマイクロ流体技術を用いて健常被験者（ｎ＝１３）およびＴ２ＤＭ（ｎ＝１６）患者から好中球を単離し、マイクロ流体アッセイにおいてＥ−セレクチン上でそのローリング速度を測定した。想定通り、Ｔ２ＤＭ患者由来の血液試料を処理するとき、スパイラルデバイスの出口２にて高い好中球純度（−９０％）が得られた（図５Ａ）。好中球ローリング速度は、Ｔ２ＤＭ患者におけるより高いローリング速度度数分布への変化によって明白であるように、健常およびＴ２ＤＭ患者間で変動した（図５Ｂ）。これはＴ２ＤＭ患者においてより高い平均ローリング速度を生じさせ（６．０１±０．２１μｍ／秒（Ｔ２ＤＭ）対５．０４±０．２３μｍ／秒（健常）、Ｐ＜０．０５）、Ｔ２ＤＭ好中球のローリング軌道は、健常好中球と比べてより不連続かつ不規則であった（図５Ｃ）。平均ローリング速度は、健常被験者とＴ２ＤＭ患者の双方において、好中球ＲＯＳレベル（図５Ｄ）およびＰＳＧＬ−１発現（Ｐ＜０．００１）（図５Ｅ）と強く相関したが、ＣＤ１１ｂとはそうではなく、これは炎症の間に白血球ローリングを媒介する上でのＰＳＧＬ−１の主要な役割を示唆する。同じ患者からの静脈穿刺または指穿刺を用いて得られた血液試料中で好中球ローリングパターンを比較した。好中球ローリング速度における無視できる差が異なる血液試料採取方法の間で認められた（Ｐが約０．３５〜０．６８）が、これは好中球選別および機能的な表現型決定に用いられる開発されたマイクロ流体的方法の頑強性を示す。最後に、好中球形態を好中球真円度（ＮＣ）指数に基づいて特徴づけた。図５Ｆに示すように、ＤＦＦで選別された健常好中球は大部分が環状であったが（ＮＣ＞０．８５を有する細胞の約７６％）、Ｔ２ＤＭ患者由来の好中球は形状がより異質性であり、より多数の細長い細胞が存在した（ＮＣ０．５〜０．８を有する細胞の約５５％）。かかる細胞質延長は、細胞形態に影響することが知られている好中球活性化に起因し得る［ラヴォア・ラムルーＡ．（Ｌａｖｏｉｅ−Ｌａｍｏｕｒｅｕｘ，Ａ．）ら著、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・ラング・セルラー・アンド・モレキュラー・フィジオロジー（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ）、第２９９巻、Ｌ４７２−Ｌ４８２（２００９年）］。要するに、ＤＦＦ好中球精製技術の健常被験者およびＴ２ＤＭ患者のコホートにおける検証が奏功し、健常好中球および糖尿病好中球が、Ｅ−セレクチン上でのそのローリング表現型に影響する明確な活性化特性および細胞形態を有するという明白な証拠が提供されている。

【0103】

Ｔ２ＤＭ患者由来の好中球が健常被験者と比べてより高速にＥ−セレクチン上をローリングしたことを確認してから、健常被験者の平均ローリング速度より高い（＞５μｍ／秒）、Ｔ２ＤＭ患者におけるローリング速度度数を分析することにより、これらの機能的差異が臨床状態と関連し得るか否かを判定した。より高い心血管リスク因子を有する患者は、低グレード炎症のレベル増加に起因してローリングがより高速な好中球を有する可能性
が高い。当然、より高いヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルは、Ｔ２ＤＭ患者におけるローリング速度が５μｍ／秒のより高い度数に対応し（図６Ａ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよびＣＲＰレベルも各々、ローリングが６および８μｍ／秒でより高速な好中球の度数の増加に関連した（図６Ｂ、Ｃ）。これらの関係は、好中球の機能性（細胞ローリング）に影響し、ひいては内皮の炎症に対する白血球の動員／応答を減弱させ得る、好中球活性化におけるグルコースおよびコレステロール代謝の重要性を明示する。糖尿病試験における機能的バイオマーカーとしての好中球ローリング速度の臨床的有効性をさらに評価するため、ローリング速度度数（５μｍ／秒）が、Ｔ２ＤＭ患者における空腹時血糖レベルよりも感度が高いＨｂＡ１ｃに対する指数（％）であることが示された。９μｍ／秒でのローリング速度度数の診断カットオフを用いた患者データの受信者動作特性（ＲＯＣ）の分析により、感度および特異度として各々、約８１％および約７０％が得られる（図６Ｄ）。次に、臨床的尺度（図７）およびローリング速度分布に関する主成分分析（ＰＣＡ）を実施し、それは第１主成分スコアによる健常およびＴ２ＤＭ患者の十分な分離を示した（図６Ｅ）。好中球ローリング速度を特徴づける分布を説明するため、平均、中央値（Ｍｅａｎ／Ｍｅｄｉａｎ＿ｒｏｌｌ）、標準偏差（ＳＤ＿ｒｏｌｌ）、歪度および尖度（Ｋｕｒｔｏｓｉｓ／ｓｋｅｗ＿ｒｏｌｌ）を含む複数のパラメータを用いた。９５パーセンタイルを超えるローリング速度は、平均し（９５ｐ＿ｒｏｌｌ）、右テール上の分布を捕らえるために用いた。さらに、ＰＣＡ分析によると、第１主成分負荷における大規模な判断として、ローリング速度およびその分布特性が糖尿病表現型を識別する上で多大な寄与を有することも示された（図６Ｆ）。最後に、メトホルミンおよびプラバスタチンを含む確立された血管リスク改良薬の健常好中球のローリング表現型に対する効果を試験した。これらの薬剤は、一般に糖尿病患者、ならびに代謝異常状態（すなわち、前糖尿病、ＣＨＤ）を有する患者において用いられ、糖尿病を発症するリスクを低減するさらなる抗炎症効果を有する［ディーンズ，Ｋ．Ａ．（Ｄｅａｎｓ，Ｋ．Ａ．）およびサッターＮ．（Ｓａｔｔａｒ，Ｎ．）、ダイアベティス・テクノロジー・アンド・セラピューティクス（Ｄｉａｅｔｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｔｈｅｒ）、第８巻、ｐ．１８−２７（２００６年）］。それらは好中球化学走性および食作用活性を改変することが記載されており［パーク，Ｄ．Ｗ．（Ｐａｒｋ，Ｄ．Ｗ．）ら著、モレキュラー・メディスン（Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、第１９巻、ｐ．３８７−３９８（２０１３年）；ドゥンゼンドルファーＳ．（Ｄｕｎｚｅｎｄｏｒｆｅｒ，Ｓ．）ら著、サーキュレーション・リサーチ（Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ）、第８１巻、ｐ．９６３−９６９（１９９７年）］、ひいては好中球−内皮相互作用における他の遊走性応答に影響する可能性が高い。これらの薬物への先行曝露を回避するため、実験は健常被験者を用いて実施し、マイクロ流体ローリングアッセイ前に、ＤＦＦで精製された好中球を、メトホルミン（１ｍＭ）およびプラバスタチン（２０μΜ）とともに１時間インキュベートした。両方の薬剤で処理した好中球の平均ローリング速度は、すべての対となる観察結果において対照（未処理）よりも高かったが（Ｐ＜０．０５）、これは好中球ローリング表現型の迅速かつ活発な変化と薬剤監視における炎症性機能的マーカーとしてのその潜在性を示唆する。

【0104】

実施例２：２出口デバイスを用いた微少流体を用いての小型マイクロ／ナノ粒子の分離
マイクロ流体デバイスは、標準のソフトリソグラフィー技術を用いてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中で製作する。開発されたマイクロデバイスは、０．５〜０．６ｃｍの半径および約６．５ｃｍの全長を有する２入口、２出口のスパイラルマイクロチャネル（３００μｍ（幅）×６０μｍ（高さ））からなる。試料（５０μｍの幅）およびシース（２５０μｍの幅）の入力は各々、チャネルの外壁および内壁に固定する。出口の２分岐においては、チャネル内壁の小さい方の出口チャネルは小さめの粒子を収集するように設計する（出口１）一方、大きめの粒子は大きい方の出口で収集される（出口２）。

【0105】

デバイスの操作中、ビーズ試料を外部入口にポンピングする一方、シース液（１×ＰＢＳ）は高流速（１：５）で内部入口を通してポンピングし、外壁付近の試料流を制限する
。我々のデバイスにおける慣性集束の不在を確認するため、より小さい半径（５０ｎｍ、１μｍ、２μｍおよび３μｍ）のビーズを、それらがデバイス内で慣性集束を受けないことになるように選択した（ａ_ｐ／ｈ≪０．０７）。ビーズがチャネルを通過すると、それらは側方牽引力（Ｆ_Ｄ）を受け、固有のディーン渦に起因し、内壁に向けて遊走する。内壁領域付近で、遊走するビーズは追加的な壁に誘導される慣性揚力（Ｆ_ＷＬ）を受け、外壁へ戻るように再循環する前にサイズ依存性の過渡的位置が得られる。興味深いことに、大きめのビーズは壁に誘導される慣性揚力の増加を受け、過渡的平衡化位置は内壁からさらに離される。チャネル流体抵抗性がないチップを制御することにより、異なるサイズのビーズのディーン過渡的位置におけるわずかな差異は、サイズが近い小型粒子の分離のため、利用され得る。

【0106】

チャネルに沿う小型粒子のディーン遊走特性を理解するため、マイクロデバイスを、試料入口が外壁ではなく内壁に固定される点以外では同じ幾何学およびチャネル寸法で設計した。５０ｎｍの蛍光ビーズ溶液を同じフロー条件で両方のデバイスにポンピングし、それらのディーン誘導性の側方遊走パターンをチャネルに沿った異なる位置でのイメージングによって特徴づけた（図１０Ａ、Ｂ）。実験データは、５０ｎｍのビーズのディーン遊走特性における差異を明示した。ビーズを内壁に最初に導入した時、それらは外壁へ向かうバンドとして密接にチャネル中央線沿いに遊走することになった。それに対して、ビーズは最初に外壁で、内壁に向かってチャネルの最上部および底部に沿って遊走することになった。側方位置における差異は粒子のディーン遊走速度を計算するために用い、それはオオカワラ（Ｏｏｋａｗａｒａ）らのディーン速度方程式に基づく分析値と十分に一致した（図１０Ｃ）。

【0107】

内壁でのビーズのディーン過渡的位置における差異を特徴づけるため、様々な直径（５０ｎｍ、１μｍ、２μｍおよび３μｍ）のビーズを、異なる流速でデバイスに別々に導入した。図１１に示すように、最小の５０ｎｍのビーズがすべて、無視できるＦ_ＷＬにより、内壁に向けて遊走した。大きめのビーズはＦ_ＷＬの増加を受け、内壁からさらに離れた過渡的平衡化位置が得られる。

【0108】

ビーズの内壁での過渡的位置におけるこのわずかな差異が、間隔が密なサイズを有する小型粒子の分離において使用可能であることを実証するため、様々な組み合わせのビーズ混合物（５μｍおよび３μｍのビーズ；３μｍおよび２μｍのビーズ；２μｍおよび１μｍのビーズ）を、経験的に決定される最適化されたフロー条件でのスパイラルデバイスによって処理した。図１２に示すように、デバイスは、フロー条件を変えて、出口チャネルの抵抗性を調節することにより、すべてのビーズの組み合わせに対する二成分選別を達成することができた。小型粒子は有意に濃縮され（約１０〜３０倍）、出口１にて継続的に収集された。唯一の例外は、５μｍのビーズが内壁で慣性集束されるようになった一方（ａ_ｐ／ｈが約０．０８）、より小さい３μｍのビーズが外壁に向けて再循環し、代わりに出口２で収集された）ことから、５μｍおよび３μｍのビーズの選別である。同様に、ナノ粒子合成またはエキソソームに関連した試験（エキソソームはサイズが約５０ｎｍ）において重要である、５０ｎｍおよび２μｍのビーズの選別は見事に達成された（図１３）。

【0109】

実施例３：細菌選別
２出口スパイラルデバイスにおける集束機構に基づき、細菌種の分離および濃縮をそれらの細胞サイズに基づいて実施した。概念の証拠として、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（桿状、約２〜４μｍの長さ、１μｍの幅）および黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）（環状、約１μｍの直径）の混合物を含有する試料溶液をデバイスにポンピングした。より小さい黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）を出口１で選別した一方、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）は大部分、出口２にて回収した（図１４）。興味深いことに、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）のサイズ分画が、より小さい大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（平均±標準偏差；２．０３±０．４６μｍ）およびより大きい大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（２．８５±０．７５μｍ）として認められ、出口１および２にて各々選別された（図１５）。これはさらに、細菌選別または診断に対する本技術の優れた分離分解能を例示する。

【0110】

実施例４：単球選別
単球は、図１６のワークフローに従って血液試料から分画している。単球の濃縮画分は４出口マイクロ流体デバイスにおいて選別しており、選別はフローサイトメトリー（ＦＡＣｓ）分析により検討している（図１７）。

【0111】

実施例５：糖尿病患者における迅速な血管健康プロファイリングに対する内皮微小粒子の全血からの単一工程単離
下流での処理および分析用に効率的に微小粒子（ＭＰ）を全血から直接的に単離するため、本発明の技術を用いての高速な（約５分）単一工程式マイクロ流体プラットフォームについて説明する。この技術の臨床的有用性は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）患者および健常被験者におけるＭＰレベルを数え上げ、検査することにより、さらに実証された（図１〜３）。

【0112】

本発明は、本明細書で広範かつ一般的に説明されている。一般的開示の範囲内に該当するより狭い種および下位分類の各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、任意の主題を属から除く但し書きや消極的限定を、除かれた内容が本明細書で詳述されるか否かにかかわらず有する本発明の一般的説明を含む。他の実施形態は以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループの観点で説明される場合、本発明についてもマーカッシュグループの任意の個別のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点で説明されることを当業者は理解するであろう。

【0113】

本発明が目的を遂行し、言及される目標および利点、ならびにその中に固有のものを得るのに十分に適応することを当業者であれば容易に理解するであろう。さらに、本発明の範囲および精神から逸脱することない限り、様々な置換および修飾を本明細書に開示される本発明に行ってもよいことは当業者に容易に理解されるであろう。本明細書に記載の組成物、方法、手順、処理、分子および特定化合物は現在、例示的であり、本発明の範囲に対する制限として意図されないような好ましい実施形態を代表するものである。当業者が思い付くであろう、本発明の精神の範囲内に包含されるような本明細書中の変化および他の使用は、特許請求の範囲によって限定される。本明細書中での以前に公開された文書についてのリストまたは考察は、その文書が先端技術の一部であるまたは周知の一般的知識であることの承認として必ずしも解釈されるべきではない。

【0114】

本明細書に例示的に記載される本発明は、好適には、本明細書で詳細には開示されていない任意の１つもしくは複数の要素、１つもしくは複数の制限の不在下で実行されてもよい。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、限定はされないが、拡大解釈されるべきである。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載の整数または整数の群の包含であり、任意の整数または整数の群の排除でないことを意味することが理解されるであろう。加えて、本明細書で用いられる用語および表現は、制限の用語としてでなく説明の用語として用いられており、かかる用語および表現を、示され、説明される特徴の任意の均等物またはその部分を除外するように用いる意図はないばかりか、様々な修飾が請求される本発明の範囲内に含まれる可能性があることは理解されている。したがって、本発明が本明細書で例示される本発明の例示的実施形態および任意選択的な特徴、修飾および変形により詳細に開示されているが、本明細書での開示内容が当業者
に依存してもよく、またかかる修飾および変形が本発明の範囲内に含まれると考えられることは理解されるべきである。

【0115】

本明細書中で引用されるすべての文書および特許文書は、それら全体が参照により援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】