特許 6758317 脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6758317

(24)【登録日】2020年9月3日

(45)【発行日】2020年9月23日

(54)【発明の名称】脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20200910BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20200910BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20200910BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20200910BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 N

   A61P37/06

   A61P29/00 101

   A61P19/02

   A61P19/08

   A61P17/06

   A61P37/02

   A61P3/10

   A61P25/00

   A61P7/06

   A61P7/00

   C07K16/18ZNA

   !C12P21/08

【請求項の数】20

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2017-550975(P2017-550975)

(86)(22)【出願日】2015年12月18日

(65)【公表番号】特表2018-502905(P2018-502905A)

(43)【公表日】2018年2月1日

(86)【国際出願番号】CN2015097820

(87)【国際公開番号】WO2016095839

(87)【国際公開日】20160623

【審査請求日】2018年10月31日

(31)【優先権主張番号】201410811678.8

(32)【優先日】2014年12月19日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】517215560

【氏名又は名称】上海易▲る▼生物技▲術▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】李昌▲き▼

(72)【発明者】

【氏名】王▲華▼茂

(72)【発明者】

【氏名】戴茹萍

(72)【発明者】

【氏名】蔡秀梅

(72)【発明者】

【氏名】周新富

【審査官】 岩下 直人

(56)【参考文献】

【文献】 Journal of Neurological Sciences，２００９年，Vol.287，pp.17-26

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３／１０

Ａ６１Ｐ ７／００

Ａ６１Ｐ ７／０６

Ａ６１Ｐ １７／０６

Ａ６１Ｐ １９／０２

Ａ６１Ｐ １９／０８

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３７／０２

Ａ６１Ｐ ３７／０６

Ｃ０７Ｋ １６／１８

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

自己免疫疾患を予防し、軽減し、または治療するための薬剤の製造における、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子の使用であって、
ここで、前記結合分子が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ１領域、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ２領域、および、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域；ならびに、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ１領域、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ２領域、および、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である、使用。

【請求項2】

前記モノクローナル抗体が、配列番号１からなるＣＤＲ１領域、配列番号２からなるＣＤＲ２領域、および、配列番号３からなるＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域；ならびに、配列番号４からなるＣＤＲ１領域、配列番号５からなるＣＤＲ２領域、および、配列番号６からなるＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記モノクローナル抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号７からなるアミノ酸配列を有し；前記モノクローナル抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号８からなるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記モノクローナル抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号１１からなるヌクレオチド配列によってコードされるか；または前記モノクローナル抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号１２からなるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３に記載の使用。

【請求項5】

前記モノクローナル抗体の前記重鎖が、配列番号９のアミノ酸配列からなるか；または前記モノクローナル抗体の前記軽鎖が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の使用。

【請求項6】

前記モノクローナル抗体の前記重鎖が、配列番号１３からなるヌクレオチド配列によってコードされるか；または前記モノクローナル抗体の前記軽鎖が、配列番号１４からなるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項５に記載の使用。

【請求項7】

前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、再生不良性貧血、クリオグロブリン血症、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。

【請求項8】

前記薬剤は、また神経学的障害を軽減し；中枢神経系における炎症性サイトカイン浸潤を阻害し；脊髄白質における髄鞘損失を緩和し；またはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、またはＴＮＦ−αの発現を減少させるために使用される、請求項１に記載の使用。

【請求項9】

前記自己免疫疾患が、関節リウマチである、請求項１に記載の使用。

【請求項10】

前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１に記載の使用。

【請求項11】

自己免疫疾患を予防し、軽減し、または治療するための、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子を含む組成物であって、
ここで、前記結合分子が、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ１領域、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ２領域、および、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域；ならびに、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ１領域、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ２領域、および、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である、組成物。

【請求項12】

前記モノクローナル抗体が、配列番号１からなるＣＤＲ１領域、配列番号２からなるＣＤＲ２領域、および、配列番号３からなるＣＤＲ３領域とを有する重鎖可変領域；ならびに、配列番号４からなるＣＤＲ１領域、配列番号５からなるＣＤＲ２領域、および、配列番号６からなるＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記モノクローナル抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号７からなるアミノ酸配列を有し；前記モノクローナル抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号８からなるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記モノクローナル抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号１１からなるヌクレオチド配列によってコードされるか；または前記モノクローナル抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号１２からなるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記モノクローナル抗体の前記重鎖が、配列番号９のアミノ酸配列からなるか；または前記モノクローナル抗体の前記軽鎖が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載の組成物。

【請求項16】

前記モノクローナル抗体の前記重鎖が、配列番号１３からなるヌクレオチド配列によってコードされるか；または前記モノクローナル抗体の前記軽鎖が、配列番号１４からなるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、再生不良性貧血、クリオグロブリン血症、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。

【請求項18】

前記組成物は、また神経学的障害を軽減し；中枢神経系における炎症性サイトカイン浸潤を阻害し；脊髄白質における髄鞘損失を緩和し；またはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、またはＴＮＦ−αの発現を減少させるために使用される、請求項１１に記載の組成物。

【請求項19】

前記自己免疫疾患が、関節リウマチである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項20】

前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物薬剤学の分野に関し、より詳細には、脳由来神経栄養因子の前駆体（ｐｒｏＢＤＮＦ）に特異的に結合する結合分子の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

自己免疫疾患（ＡＩＤ）は、自己免疫寛容が破壊され、免疫系が自己抗原を攻撃するように活性化され、組織または臓器の損傷をもたらす疾患クラスのことを言う。これらの病因論及び発症機序はいまだ解明されておらず、自己抗体、自己反応性Ｔリンパ球、またはそれら両方に起因する、自己抗原に対する過敏性疾患として現在は見なされている。ＡＩＤは、２つのカテゴリー、すなわち、臓器特異的ＡＩＤと全身性ＡＩＤに分けることができる。臓器特異的な自己免疫疾患とは、組織または臓器の病理学的損傷及び機能障害が、抗体または感作リンパ球が向けられる臓器にのみ限定される疾患のことを言い、主に、橋本甲状腺炎、中毒性広汎性甲状腺腫、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、自己免疫血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡などが挙げられる。全身性自己免疫疾患とは、例えば、血管壁中の抗原抗体複合体の広範な堆積による、全身の多数の臓器の損傷のことを言い、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強直性脊椎炎、クリオグロブリン血症、多発性硬化症などが挙げられる。

【0003】

その機構は依然として不明であるため、現在のところ根治療法のための薬剤はいまだ存在していない。従来のグルココルチコイド及び免疫抑制剤は、適時に投与すると疾患を制御し、患者の生存率を改善し得るが、それらの長期使用は、一連の副作用をもたらす。これは、患者の生活の質に影響を及ぼし、重篤な場合には命に関わることさえある。さらに、一部の患者は、グルココルチコイド及び免疫抑制剤による治療に感受性がない場合がある。近年、ＡＩＤの分子機構に対する深い洞察により、遺伝子療法、エピジェネティックな介入、小分子Ｔｏｌｌ様受容体阻害剤、抗炎症性因子抗体、Ｂ細胞の枯渇、幹細胞及び調節性Ｔ細胞の自己血輸血、樹状細胞ワクチンなどを含む、新しい治療戦略が継続的に提案されている。これらの治療薬または方法のいくつかは臨床的に使用されており（ベリムマブ、リツキシマブなど）、それらのいくつかはいまだ臨床研究下であるか（幹細胞自己血輸血療法など）または動物実験の段階でさえある（エピジェネティック調節など）。しかしながら、これらの薬剤は、第一選択薬としてグルココルチコイドと置き換えることができないため、臨床応用用に新規の安全で有効な治療薬及び方法が急務とされている。

【0004】

脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、神経成長因子に続いて発見された神経栄養因子であり、分子量が１２．４ｋＤａである。主に中枢神経系に分布するが、末梢神経系にもＢＤＮＦの合成がある。ＢＤＮＦは、ニューロンの生存、分化、シナプス可塑性、損傷修復などの調節の面で重要な機能を担う。現在、ＢＤＮＦは、神経系の発育及び情動障害を調節する重要な因子だけでなく、重要な痛覚の修飾物質でもあることを示す証拠が現れた。

【0005】

脳由来神経栄養因子の前駆体（ｐｒｏＢＤＮＦ）は、ＢＤＮＦ遺伝子から転写、翻訳を経て小胞体内で合成される。そのペプチド鎖の長さは、２４７個のアミノ酸である。そのアミノ酸配列の理論分子量は２７．８ｋＤであるが、タンパク質のグリコシル化修飾の程度が異なるため、実際の分子量は３２〜３６ｋＤの範囲で変化し得る。シグナルペプチド配列は、ＰｒｏＢＤＮＦ分子のアミノ酸配列の１〜１８位に位置し、分泌の過程で２つの断片が生成され、その１つの断片は、配列の１９〜１２９番目のアミノ酸、すなわち、前駆体ドメインを含むポリペプチド断片（ｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインとも知られる）で、もう１つの断片は、配列の１３０〜２４７番目、すなわち、成熟ドメインでコードされる断片で、この断片は、処理後に生物活性を有する成熟体ＢＤＮＦを形成する。

【0006】

現在、大量の証拠によって、ｐｒｏＢＤＮＦは、成熟体ＢＤＮＦ合成の中間産物として作用するだけでなく、配位子としてその高親和性の受容体ｐ７５神経栄養因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ）と結合して生物学的効果を発揮するためにも使用できることが示されている。神経栄養因子の前駆体（ｐｒｏＮＧＦ、ｐｒｏＢＤＮＦなどを含む）がアポトーシス及び炎症反応を促進し得ることが、研究により示されている。しかしながら、自己免疫疾患におけるｐｒｏＢＤＮＦの役割及びそのシグナル伝達はいまだ不明である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の目的は、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子（ｐｒｏＢＤＮＦ）の使用を提供することである。

【0008】

本発明の第１の態様では、自己免疫疾患を予防し、軽減し、または治療するための薬剤の製造における、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子（ｐｒｏＢＤＮＦ）の使用を提供する。

【0009】

好ましい実施形態では、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子は、配列番号１に示すようなＣＤＲ１領域と、配列番号２に示すようなＣＤＲ２領域と、配列番号３に示すようなＣＤＲ３領域とを有する重鎖可変領域；配列番号４に示すようなＣＤＲ１領域と、配列番号５に示すようなＣＤＲ２領域と、配列番号６に示すようなＣＤＲ３領域とを有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。

【0010】

別の好ましい実施形態では、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子は、ｐｒｏＢＤＮＦタンパク質前駆体ドメインにおけるアミノ酸１９〜１２８からのアミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体である。

【0011】

別の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体の重鎖可変領域は、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を有し；モノクローナル抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８に示すようなアミノ酸配列を有する。

【0012】

別の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体の重鎖可変領域は、配列番号１１に示すようなヌクレオチド配列を有する；またはモノクローナル抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１２に示すようなヌクレオチド配列を有する。

【0013】

別の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体の重鎖は、配列番号９に示すようなアミノ酸配列を有する；またはモノクローナル抗体の軽鎖は、配列番号１０に示すようなアミノ酸配列を有する。

【0014】

別の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体の重鎖は、配列番号１３に示すようなヌクレオチド配列を有する；またはモノクローナル抗体の軽鎖は、配列番号１４に示すようなヌクレオチド配列を有する。

【0015】

別の好ましい実施形態では、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子が、ポリクローナル抗体である。

【0016】

別の好ましい実施形態では、ポリクローナル抗体は、脳由来神経栄養因子の前駆体、またはそのタンパク質断片、好ましくは、配列番号３７に示すようなアミノ酸配列を含む断片で動物を免疫することによって産生される。

【0017】

別の好ましい実施形態では、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子は、限定されないが、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体、マウス由来抗体、またはそれらの組み合わせを含む抗体である。

【0018】

別の好ましい実施形態では、脳由来神経栄養因子の結合前駆体は、脳由来神経栄養因子のヒト結合前駆体である。

【0019】

別の好ましい実施形態では、自己免疫疾患は、全身性自己免疫疾患である。

【0020】

別の好ましい実施形態では、自己免疫疾患には、限定されないが、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病など）、多発性硬化症、再生不良性貧血、クリオグロブリン血症、またはそれらの組み合わせが含まれる。

【0021】

別の好ましい実施形態では、薬剤は、静脈内または腹腔注射によって投与される。

【0022】

別の好ましい実施形態では、薬剤は、神経学的障害を軽減し；中枢神経系における炎症性サイトカイン浸潤を阻害し；脊髄白質における髄鞘損失を緩和し；またはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、またはＴＮＦ−αの発現減少させるためにも使用される。

【0023】

本発明の別の態様では、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、自己免疫疾患を予防し、軽減し、または治療するための方法を提供し、結合分子は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく；例えば、結合分子は、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス由来抗体、親和性成熟抗体、またはそれらの組み合わせであってもよい。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
自己免疫疾患を予防し、軽減し、または治療するための薬剤の製造における、脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する結合分子の使用。
（項目２）
脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する前記結合分子が、配列番号１に示すようなＣＤＲ１領域と、配列番号２に示すようなＣＤＲ２領域と、配列番号３に示すようなＣＤＲ３領域とを有する重鎖可変領域；配列番号４に示すようなＣＤＲ１領域と、配列番号５に示すようなＣＤＲ２領域と、配列番号６に示すようなＣＤＲ３領域とを有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である、項目１に記載の使用。
（項目３）
前記モノクローナル抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を有し；前記モノクローナル抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示すようなアミノ酸配列を有する、項目２に記載の使用。
（項目４）
前記モノクローナル抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号１１に示すようなヌクレオチド配列を有する；または前記モノクローナル抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号１２に示すようなヌクレオチド配列を有する、項目３に記載の使用。
（項目５）
前記モノクローナル抗体の前記重鎖が、配列番号９に示すようなアミノ酸配列を有する；または前記モノクローナル抗体の前記軽鎖が、配列番号１０に示すようなアミノ酸配列を有する、項目２に記載の使用。
（項目６）
前記モノクローナル抗体の前記重鎖が、配列番号１３に示すようなヌクレオチド配列を有する；または前記モノクローナル抗体の前記軽鎖が、配列番号１４に示すようなヌクレオチド配列を有する、項目５に記載の使用。
（項目７）
脳由来神経栄養因子の前駆体に特異的に結合する前記結合分子が、ポリクローナル抗体である、項目１に記載の使用。
（項目８）
前記ポリクローナル抗体が、脳由来神経栄養因子の前駆体、またはそのタンパク質断片、好ましくは、配列番号３７に示すようなアミノ酸配列を含む断片で動物を免疫することによって産生される、項目７に記載の使用。
（項目９）
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、再生不良性貧血、クリオグロブリン血症、またはそれらの組み合わせを含む、項目１に記載の使用。
（項目１０）
前記薬剤は、また神経学的障害を軽減し；中枢神経系における炎症性サイトカイン浸潤を阻害し；脊髄白質における髄鞘損失を緩和し；またはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、またはＴＮＦ−αの発現減少させるために使用する、項目１に記載の使用。

【0024】

本発明の他の態様は、本明細書の開示から当業者に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】実施例１の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）によって発現された精製ヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す。１、精製ヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質；２、タンパク質分子量マーカー（低）、ＴＡＫＡＲＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３４５０から購入。

【図2】本発明の実施例２のＨＥＫ２９３Ｆ細胞によって発現された精製ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す。１、精製ヒト前駆体ドメインタンパク質；２、タンパク質分子量マーカー（低）、ＴＡＫＡＲＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３４５０から購入。

【図3】ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合タンパク質（ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン−Ｆｃ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す。レーン１の標的バンドの分子量は、約４４．３ｋＤ（矢印によって示す）。

【図4】本発明の実施例３の個々のハイブリドーマ細胞株によって産生された抗ｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体の特異的抗原結合領域の、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ及びヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインへの結合の実験結果を示す。

【図5】本発明の実施例３の個々のハイブリドーマ細胞株によって産生された抗ｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体の特異的抗原結合領域の、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ及びマウスｐｒｏＢＤＮＦへの結合の実験結果を示す。

【図6】本発明の実施例３の抗ｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体２Ｂ１１のサブタイプ分析の結果を示す。

【図7】異なる希釈条件下での本発明の実施例６のヒト−マウスキメラ抗体ＣＨ２Ｂ１１の、本発明の実施例１のヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質への結合の実験結果を示す。

【図8】正常群と比較した、コラゲナーゼ（ＣＡＩＡモデル）により誘発された自己免疫関節炎をもつＢａｌｂ／Ｃマウスの体重に対する、腹腔内に注射した２Ｂ１１の効果を示す。

【図9】正常群と比較した、コラゲナーゼ（ＣＡＩＡモデル）により誘発された自己免疫関節炎をもつＢａｌｂ／Ｃマウスの関節炎スコア指標に対する、腹腔内に注射した２Ｂ１１の効果を示す。

【図10】正常群と比較した、コラゲナーゼ（ＣＡＩＡモデル）により誘発された自己免疫関節炎をもつＢａｌｂ／Ｃマウスの関節腫脹の程度に対する、腹腔内に注射した２Ｂ１１の効果を示す。

【図11】ＥＡＥ群と比較した、ＣＦＡ／Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの注射により誘発された実験的アレルギー性脳脊髄炎をもつマウスの神経学的機能に対する、腹腔内に注射した２Ｂ１１の治療効果を示す。

【図12】実験的自己免疫性脳脊髄炎の初期ステージで、ＮＳＳ及び抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体でそれぞれ処置したＥＡＥモデルマウスの臨床スコアリングの比較を示す。

【図13】実験的自己免疫性脳脊髄炎の初期ステージで、ＮＳＳ及び抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体でそれぞれ処置したＥＡＥモデルマウスの脊髄のＨＥ染色を示す。

【図14】実験的自己免疫性脳脊髄炎の初期ステージで、ＮＳＳ及び抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体でそれぞれ処置したＥＡＥモデルマウスの脊髄のＬＦＢ染色を示す。

【図15】実験的自己免疫性脳脊髄炎の初期ステージで、ＮＳＳ及び抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体でそれぞれ処置したＥＡＥモデルマウスの脊髄内の個々の炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現を示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対正常群及びＥＡＥ＋ＮＳＳ群。

【図16】実験的自己免疫性脳脊髄炎のピークで、ＮＳＳ及び抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体でそれぞれ処置したＥＡＥモデルマウスの臨床スコアリングの比較を示す；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、対ＥＡＥ＋ＮＳＳ群。

【図17】実験的自己免疫性脳脊髄炎のピークで、ＮＳＳ及び抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体でそれぞれ処置したＥＡＥモデルマウスの脊髄のＨＥ染色を示す。

【図18】実験的自己免疫性脳脊髄炎のピークで、ＮＳＳ及び抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体でそれぞれ処置したＥＡＥモデルマウスの脊髄のＬＦＢ染色を示す。

【図19】実験的自己免疫性脳脊髄炎のピークで、ＮＳＳ及び抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体でそれぞれ処置したＥＡＥモデルマウスの脊髄内で個々の炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現を示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対正常群及びＥＡＥ＋ＮＳＳ群。

【発明を実施するための形態】

【0026】

綿密な研究の後、本発明者らは、脳由来神経栄養因子の前駆体（ｐｒｏＢＤＮＦ）が、自己免疫疾患の治療における重要な標的であり、かつ、ｐｒｏＢＤＮＦ（抗ｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む）に特異的に結合する結合分子が、自己免疫疾患の著しい軽減または治療効果を有することを初めて見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成した。

【0027】

本発明は、ｐｒｏＢＤＮＦに特異的に結合することができる結合分子を提供し、結合分子は、ｐｒｏＢＤＮＦに対して中和または阻害活性を示す。

【0028】

本発明の結合分子は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などのインタクトな免疫グロブリン分子であってもよい。あるいは、結合分子は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、二重特異性二重鎖抗体、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、及びｐｒｏＢＤＮＦまたはその断片に特異的に結合するのに十分である免疫グロブリン断片を少なくとも含む（ポリ）ペプチドを含む、抗原結合断片であってもよい。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、ヒトモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。

【0029】

Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）に記載されるように、ＣＤＲ領域は、免疫学的関心のあるタンパク質配列である。本発明の実施形態では、結合分子は、本明細書に開示されるＣＤＲ領域の２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含み得る。好ましくは、本発明の結合分子は、本明細書に開示される少なくとも２つのＣＤＲを含む。

【0030】

本発明の別の態様は、本明細書に記載の結合分子の機能的変異体を含む。変異体が、ｐｒｏＢＤＮＦまたはそのタンパク質断片に特異的に結合するための親結合分子と競合することができる場合、変異体分子は、本発明の結合分子の機能的変異体であると見なされる。言い換えると、機能的変異体は、ｐｒｏＢＤＮＦまたはその断片に結合することもできる。機能的変異体には、一次構造及び配列が実質的に同様である誘導体であるが、親結合分子中には見出されない、例えば、インビトロまたはインビボでの化学的及び／または生化学的修飾を含有しているものが含まれるが、これに限定されるものではない。そのような修飾としては、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはその誘導体の共有結合、脂質またはその誘導体の共有結合、架橋、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、ペグ化、タンパク分解性ｐｒｏセシング、リン酸化などが含まれる。言い換えると、親結合分子のアミノ酸及び／またはヌクレオチド配列の修飾は、ヌクレオチド配列によってコードされるかまたはアミノ酸配列を含む結合分子の結合性に著しい影響を及ぼさないかまたは変更させない、すなわち、結合分子は、なおその標的部位を認識し、それに結合することができる。

【0031】

機能的変異体は、ヌクレオチド及びアミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む保存的配列修飾を有し得る。これらの修飾は、当該技術分野において公知の標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発及びランダムＰＣＲ介在突然変異誘発によって導入することができ、天然及び非天然のヌクレオチド及びアミノ酸を含み得る。

【0032】

保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の構造的または化学的性質を有する別のアミノ酸残基と置き換えられるような置換が含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、及びトリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ｐｒｏリン、フェニルアラニン、及びメチオニン）、分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、及びイソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファン）が挙げられる。当業者には、上で記載されたものに加えて、アミノ酸残基ファミリーの他の分類法を使用することができることが理解されるであろう。さらに、変異体は、非保存的なアミノ酸置換を有し得、例えば、アミノ酸を、異なる構造的または化学的性質を有する別のアミノ酸残基で置換する。同様の軽微な変化はまた、アミノ酸の欠失及び／または挿入を含み得る。当該技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用して、免疫学的活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させることができるかの決定することができる。

【0033】

さらに、機能的変異体は、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかまたは両方にアミノ酸配列の切断を含むことができる。本発明の機能的変異体は、親結合分子と比較して、同じまたは異なる、高いまたは低い結合親和性を有することができるが、ｐｒｏＢＤＮＦまたはその断片になお結合することができる。例えば、本発明の機能的変異体は、親結合分子と比較して、ｐｒｏＢＤＮＦまたはその断片に対する結合親和性が増加していてもよく、または減少していてもよい。本発明の範囲内にある機能的変異体は、本明細書に記載の親結合分子と、少なくとも約５０％〜約９９％、好ましくは少なくとも約６０％〜約９９％、より好ましくは少なくとも約７０％〜約９９％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％〜約９９％、最も好ましくは少なくとも約９０％〜約９９％、特に少なくとも約９５％〜約９９％、特に少なくとも約９７％〜約９９％のアミノ酸配列相同性を有する。当業者に知られているＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔなどのコンピューターアルゴリズムは、比較し、同一または類似のアミノ酸残基を決定するために、アミノ酸配列を最適にアライメントするために使用することができる。機能的変異体は、エラープロ−ンＰＣＲ、オリゴヌクレオチド特異的な突然変異誘発、部位特異的な突然変異誘発、並びに重鎖及び／または軽鎖シャフリングを含むが、これらに限定されない、当該技術分野において知られている従来の分子生物学的方法を用いて、親結合分子またはその一部を改変することによって得ることができる。実施形態では、本発明の機能的変異体は、ｐｒｏＢＤＮＦに対する中和活性を有する。中和活性は、親結合分子のものと同じ、またはそれよりも高い、またはそれよりも低くてもよい。本明細書で使用する場合、「（ヒト）結合分子」という用語は、（ヒト）結合分子の機能的変異体も包含する。

【0034】

本発明の好ましい実施形態では、結合分子は、モノクローナル抗体である。本発明は、モノクローナル抗体の対応するアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、及びモノクローナル抗体の可変領域鎖を含むモノクローナル抗体を提供する。また、本発明は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖及び重鎖を含む任意の抗体、及びＣＤＲ領域が本発明のモノクローナル抗体のＣＤＲに９０％（好ましくは、９５％を超える）を超える相同性を有する任意の抗体を提供する。

【0035】

モノクローナル抗体の抗原結合性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる重鎖及び軽鎖可変領域に位置する３つの特異的領域に対して説明することができる。ＣＤＲは、可変領域を４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分離し、４つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的保存的であり、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは、ＦＲによって形成されたβシートが空間構造内で互いに近接している環状構造を形成し、重鎖上のＣＤＲ、及び対応する軽鎖上のＣＤＲが、抗体の抗原結合部位を構成する。同じ型の抗体のアミノ酸配列の比較を用いて、どのアミノ酸がＦＲまたはＣＤＲ領域を構成しているかを決定することができる。

【0036】

本発明で使用されるモノクローナル抗体または抗体断片は、完全ヒト、ヒト化、キメラまたはマウス由来のモノクローナル抗体または抗体断片であってもよい。本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体、及び／または、当該技術分野において公知の本出願で開示されたヒト化抗体を調製するための技術で調製された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト化抗体は、遺伝子クローニング及びＤＮＡ組み換え技術によってマウス（または他の非ヒト）由来のモノクローナル抗体から遺伝子操作される再発現抗体を主に指し、その抗体中で、ほとんどのアミノ酸配列がヒト配列に置換され、親ラットモノクローナル抗体の親和性及び特異性は実質的に保持されながら、非相同性が減少していることで、ヒト身体に応用しやすくなる。ヒト化抗体には、キメラ抗体、再構成抗体（ＣＤＲグラフト抗体とも知られる）、再表面化抗体、または完全ヒト化抗体が含まれる。ヒト化抗体は、当該技術分野において公知の種々の方法によっても産生することができ；例えば、ヒト化抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択することができる。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン部位をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活性化させたマウスに導入することによって調製することもできる。さらに、ヒト化抗体は、特定の抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製することもできる。

【0037】

本発明の好ましい実施形態では、ｐｒｏＢＤＮＦのプロドメインのアミノ酸１９〜１２８を特異的に認識することができ、かつ、以下のアミノ酸配列：（ａ）配列番号１に示すようなＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号２に示すようなＣＤＲ２領域、及び（ｃ）配列番号３に示すようなＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域；及び／または以下のアミノ酸配列：（ｄ）配列番号４に示すようなＣＤＲ１領域、（ｅ）配列番号５に示すようなＣＤＲ２領域、及び（ｆ）配列番号６に示すようなＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含む、抗ｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体を提供する。

【0038】

本発明は、本発明の少なくとも１つの結合分子及びその機能的変異体をコードする核酸分子をさらに提供する。このような核酸分子は、クローニング用の、例えば、上述のような親和性成熟法で使用される中間体として使用することができる。好ましい実施形態では、核酸分子は、単離されるかまたは精製される。ＤＮＡ分子の配列は、従来の技術またはハイブリドーマ技術によって得ることができる。これらの核酸分子の機能的変異体は、本発明の一部を構成する。機能的変異体は、標準遺伝コードを用いて直接翻訳され、親核酸分子から翻訳された配列と同じアミノ酸配列をもたらすことができる核酸配列である。関連配列が得られると、組み換え方法によってバッチで得ることができる。関連配列は、通常は、従来の方法によってベクターにクローニングされ、細胞に形質転換し、増殖した宿主細胞から単離された後に得ることができる。さらに、関連配列も人工合成方法によって合成することができる。

【0039】

本発明は、上述のような適切なＤＮＡ配列、及び適切なｐｒｏモーターまたは対照配列を含むベクターをさらに提供する。ベクターを使用して、適当な宿主細胞を変換させて、タンパク質を発現させることができるようになる。ベクターは、真核性ベクターまたは原核性ベクターであってもよい。

【0040】

本発明は、所望の多機能性抗体ポリペプチドを発現するベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。「宿主細胞」は、挿入されたポリヌクレオチドを含むベクターを受け入れることができ、かつ受け入れている単一細胞または細胞培養を含む。本発明の宿主細胞は、使用したベクターと互換性がある任意の原核性宿主細胞または真核性宿主細胞であってもよい。酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞などを含む真核性宿主細胞は、真核性細胞が標的タンパク質の複雑な後翻訳修飾（例えば、グリコシル化）を含むために好ましく、そのため、大規模培養でますます使用されている。一般に使用される宿主細胞株としては、サル腎細胞株（ＣＯＳ−７ ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚性腎細胞株２９３及びそのサブクローン細胞株、ベビーハムスター腎細胞株（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）などが挙げられる。好ましくは、本発明の真核性宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。

【0041】

本発明によるｐｒｏＢＤＮＦに特異的に結合する結合分子は、ｐｒｏＢＤＮＦに特異的に結合するポリクローナル抗体であってもよい。本発明で使用する場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、抗原チャレンジの際に体内で免疫反応が引き起こされた後に、身体の血漿細胞によって合成され、分泌される、抗原に特異的に結合することが可能なグロブリンの群を指す。抗原は通常、複数の抗原決定基からなる。抗原決定基の１つが身体を刺激すると、１つのＢリンパ球がこの抗原を受け入れ、モノクローナル抗体と呼ばれる抗体を産生する。複数の抗原決定基が身体を刺激すると、種々のモノクローナル抗体がそれに応じて産生され、これらの混合モノクローナル抗体が、ポリクローナル抗体を構成する。ポリクローナル抗体は、高い力価、高い特異性、強い親和性、良好な感度、便利なヒトの取り扱い、及び品質管理などの利点を提供する。さらに、ポリクローナル抗体は、比較的簡単かつより経済的に調製することができる。

【0042】

ポリクローナル抗体は、当該技術分野において周知の種々の方法によって調製することができる。ｐｒｏＢＤＮＦまたはその断片を動物（例えば、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラットなど）に投与して、ポリクローナル抗体の産生を誘発することができる。同様に、ｐｒｏＢＤＮＦまたはその断片を発現する細胞を使用して、動物を免疫して、抗体を産生してもよい。ポリクローナル抗体は、リンパ節注入法、多部位皮下注入法、複数経路を組み合わせ注入法などの免疫方法によって調製することができる。本発明の具体例では、高い力価をもつポリクローナル抗体は、ヒツジを背面で多部位皮下注射を介してフロイントアジュバントと混合した抗原としてｐｒｏＢＤＮＦ断片（配列番号３７）で免疫し；強化免疫を実施することによって、最終的に得られる。

【0043】

本発明によるｐｒｏＢＤＮＦに特異的に結合する結合分子は、自己免疫疾患の軽減または治療効果を有する。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、全身性エリテマトーデス、混合性結合組織病、自己免疫糖尿病（Ｉ型糖尿病）、多発性硬化症、再生不良性貧血などが挙げられる。結合分子の使用には、神経学的障害を軽減すること；中枢神経系における炎症性サイトカイン浸潤を阻害すること；脊髄白質における髄鞘損失を緩和すること；またはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、またはＴＮＦ−αの発現減少することが挙げられる。

【0044】

本発明は、有効量の結合分子を含む医薬組成物をさらに提供する。組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。医薬組成物は、限定されないが、静脈内、腹腔注射などを含む従来の経路によって投与することができる。本発明の医薬組成物は、自己免疫疾患用の他の治療剤と併用してもよい。

【0045】

本発明で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、結合分子自体及び組成物を動物またはヒトに適切に投与した場合に、悪影響、アレルギー効果、または他の副作用を生じないことを意味する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、本発明の結合分子と両立すべきである、すなわち、一般的な組成物の効果を大きく減少させることなく結合分子と混合することができることである。

【0046】

本開示で記載されるように、「有効量」という用語は、病気の進行の軽減または疾患の治癒の臨床結果を含む有益かつ所望の結果をもたらすのに十分な量を指す。「有効量」は、１つ以上の投与によって達成され得る。具体的な投与量は、投与経路、患者の状態、及び他の要因によって決定すべきであり、それは、熟練した医師の技術の範囲内である。

【0047】

薬学的に許容される担体またはその成分として使用することができる材料のいくつかの具体的な例は、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン、及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及びメチルセルロースなどのセルロース及びその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸及びステアリン酸マグネシウムなどの固体潤滑剤；硫酸カルシウム；落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びココアバターなどの植物油；ｐｒｏピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）などの乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；香味剤；錠剤化剤；安定化剤；抗酸化剤；防腐剤；パイロジェンフリー水；等張食塩液；リン酸緩衝溶液などである。

【0048】

本発明の組成物は、所望のように種々の剤形に製剤化することができ、患者の種類、年齢、体重及び一般的な疾患状態、投与モードなどの因子に基づいて医師によって決定される、患者に有益な投与量で投与することができる。投与モードは、例えば、注射または他の治療モードであってもよい。

【0049】

本発明の結合分子は、非分離形態または分離形態で使用してもよい。さらに、本発明の結合分子は、単体、または本発明の少なくとも１つの結合分子（または変異体またはその断片）を含む混合物で使用してもよい。言い換えると、結合分子は、組み合わせて、例えば、本発明の２つ以上の結合分子、変異体、またはそれらの断片を含む医薬組成物として使用してもよい。例えば、相補性活性をもつ結合分子を１つの治療レジメンで組み合わせて、所望の予防、軽減、または治療効果を達成することができる。あるいは、同じ活性をもつ結合分子を１つの治療レジメンで組み合わせて、所望の予防、軽減、または治療効果を達成することもできる。

【0050】

投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）をもたらすために調整してもよい。適当な投与量は、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。さらに、例えば、単回ボーラスを与えてもよく、または複数の分離用量を、時間をかけて与えてもよく、または投与量は、治療している症状の重症度に応じて、それに比例して減少または増加させてもよい。本発明の結合分子及び組成物は、滅菌しているのが好ましい。これらの分子及び組成物を滅菌する方法は、当該技術分野において周知である。

【0051】

本発明は、具体的な実施例を参照しながらさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を説明することのみを目的とすることを理解すべきである。具体的な条件について以下の実施例で説明しない実験方法は、一般的に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ，２００２に記載のものなどの従来の条件に従って、または製造者によって推奨される条件に従って行われる。

【実施例】

【0052】

実施例１．ヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原の原核発現
１．１ ｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦベクターの構築及び同定
ヒト腫瘍細胞Ｕ８７ＭＧのｃＤＮＡを鋳型（ＲＡＹＧＥＮＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）とし、以下のようなプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
ＰＲＯＢＤＮＦ−Ｆ：５’ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＣＣ３’（配列番号：１５）；及び
ＰＲＯＢＤＮＦ−Ｒ：５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＧ３’（配列番号：１６）。
両末端にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ制限部位があるＰＲＯ ＢＤＮＦ遺伝子断片（７０３ｂｐ）を得、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ（ＮＥＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）で二重消化し、標的遺伝子断片ｐｒｏＢＤＮＦを得た。ベクタープラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、ベクター断片を回収した。ベクター断片をＴ４リガーゼ（ＮＥＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）によって上述の標的遺伝子断片ｐｒｏＢＤＮＦで連結した後、大腸菌ＴＯＰ１０（ＬＩＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）に形質転換した。アンピシリン耐性によるスクリーニング、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化による挿入を含む陽性クローンの同定、及びシークエンシングによる検証を通じて、正確なヒトｐｒｏＢＤＮＦ遺伝子配列を含む原核発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦが得られた。

【0053】

１．２ ヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質の発現と精製
ｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦプラスミドを発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）に形質転換し、アンピシリンを補充した培地を含むプレートに広く塗り、３７℃にて逆さまで一晩培養した。誘導発現のために単クローンをピックアップした後、ＯＤ_６００が０．６〜０．８になるまで振とう培養した。最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを入れ、３０℃にて４時間誘導した後に細菌懸濁液を収集した。ペレットを遠心分離によって回収し、１／１０体積の緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を添加して、再懸濁させた。ＰＭＳＦ（最終濃度１ｍＭ）を添加した。氷の上に置いて超音波（超音波３秒、間隔１０秒、一組９９回、計４組）で処理し、１５分間遠心分離した（４℃、１２，０００ｇ）後、上清を遠心分離によって収集した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）親和性カラムクロマトグラフィーを行い、精製して標的発現タンパク質を得た後、ＰＢＳ溶液で透析した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで透析後の精製タンパク質の純度を分析し、Ａ２８０でタンパク質の含有量を検出した。少量のタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥ上でランさせて、その分子量を検出した。図１に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、レーン１における精製して得られた標的バンドが、ｐｒｏＢＤＮＦ分子の理論分子量（２７．８ｋＤ）と実質的に同じである約３０ｋＤの分子量を有することを示している。

【0054】

実施例２．ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインの真核発現
２．１ ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン発現ベクターＶ５Ｆ−前駆体ドメインの構築
上記で得られたプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦを鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
ＢＤＮＦｐｒｏＶＦ１（配列番号１７）：５’ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧ３’；及び
ＢＤＮＦｐｒｏＶＲ１（配列番号１８）：５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＴＧ３’。
両末端にＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位があるヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン遺伝子断片を得た（３５０ｂｐ）。ＰＣＲ断片をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ（ＮＥＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）で二重消化した。得られた前駆体ドメイン遺伝子断片を、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ（ＮＥＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）で二重消化したベクターＶ５Ｆ（ＲＡＹＧＥＮＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）と共に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって連結した後、宿主株ＴＯＰ１０（ＬＩＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）に形質転換した。陽性クローンを取ってＰＣＲ同定を行い、正確な挿入をシークエンシングによって検証した。その後、Ｖ５Ｆ−前駆体ドメインプラスミドの構築に成功した。

【0055】

２．２ ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質の発現と精製
良好に生長したＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ、ＬＩＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）を１×１０^６細胞／ｍＬの密度で培養三角フラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで一晩培養した。上記手順から得られたＶ５Ｆ−前駆体ドメインプラスミドとリポソーム（２９３Ｆｅｃｔｉｎ、ＬＩＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）をそれぞれＤＭＥＭで希釈して穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベートしたＤＮＡ−リポソーム複合体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで７２時間培養した。細胞培養液を収集し、４５００ｇで１５分間遠心分離した。細胞を除去し、上清を取った。１ｍｌのＦＬＡＧ抗体親和性充填剤（抗ＦＬＡＧアガロース親和性ゲル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）をカラムに充填し、ＦＬＡＧ親和性カラムを５〜１０カラム体積の溶解緩衝液（５０ｍＭ ＰＢ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で平衡化した。遠心分離した細胞培養液の上清を１ｍｌ／分でＦＬＡＧ親和性カラムを通過させ、通った液を収集して、４℃にて保存した。５〜１０カラム体積の洗浄緩衝液１（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール）でカラムを洗浄し、洗浄液１を収集し、４℃にて保存した。４〜５カラム体積の洗浄緩衝液２（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール）でカラムを洗浄し、洗浄液２を収集し、４℃にて保存した。４〜５カラム体積の溶出緩衝液（５０ｍＭグリシン、ＨＣｌ、ｐＨ３．０、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール）でカラムを溶出し、溶出液を収集した。中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐＨ８．０）の添加後、溶出液を透析溶液（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール）に対して４℃にて一晩透析し、保存した。少量の溶出液をＳＤＳ ＰＡＧＥ上でランさせた。図２に示すような電気泳動の結果は、レーン１の標的バンドが、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質の理論分子量（１３ｋＤ）よりもわずかに大きい約２０ｋＤの分子量を有することを示している。理論に束縛されるものではないが、これは発現されたタンパク質の真核システムにおけるグリコシル化の程度に関係するかもしれない。

【0056】

実施例３．ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合タンパク質（ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン−Ｆｃ）の真核発現
３．１ ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合発現ベクターＶ５ＦＣ−ラット前駆体ドメイン−Ｆｃの構築
ラットのｃＤＮＡ（ＲＡＹＧＥＮＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）を鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
ＲａｔｐｒｏＦ１：５’ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣ３’（配列番号１９）；及び
ＲａｔｐｒｏＲ１：５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＧＡＣＡＴＧ３’（配列番号２０）。
両末端にＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ制限部位があるラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン遺伝子断片を得た（３５６ｂｐ）。ＰＣＲ断片をＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ（ＮＥＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）で二重消化した。得られた前駆体ドメイン遺伝子断片を、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ（ＮＥＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）で二重消化したＦｃ融合発現ベクターＶ５ＦＣ（ＲＡＹＧＥＮＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）と共に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって連結し、宿主株ＴＯＰ１０（ＬＩＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）に形質転換した。陽性クローンを取ってＰＣＲ同定を行い、正確な挿入をシークエンシングによって検証した。その後、Ｖ５ＦＣ−ラット前駆体ドメインプラスミドの構築に成功した。

【0057】

３．２ ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合タンパク質の発現と精製
良好に生長したＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ、ＬＩＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）を１×１０^６細胞／ｍｌの密度で培養三角フラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで一晩培養した。上記手順から得られたＶ５ＦＣ−ラット前駆体ドメインプラスミドと、リポソーム（２９３Ｆｅｃｔｉｎ、ＬＩＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）をそれぞれＤＭＥＭで希釈し、穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベートしたＤＮＡ−リポソーム複合体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで７２時間培養した。細胞培養液を収集し、４５００ｇで１５分間遠心分離した。細胞を除去し、上清を取った。１ｍｌのタンパク質Ａ親和性充填剤（プロテインＡアガロース、ＲＡＹＧＥＮＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）をカラムに充填し、プロテインＡ親和性カラムを５〜１０カラム体積の溶解緩衝液（５０ｍＭ ＰＢ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で平衡化した。遠心分離した細胞培養液の上清を１ｍｌ／分でプロテインＡ親和性カラムを通過させ、通った液を収集して、４℃にて保存した。５〜１０カラム体積のＰＢＳ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）でカラムを洗浄し、洗浄液１を収集し、４℃にて保存した。４〜５カラム体積の溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン、ＨＣｌ、ｐＨ２．５）でカラムを溶出し、溶出液を回収した。１０％体積の中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐＨ８．０）の添加後、溶出液を透析溶液（５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール）に対して４℃にて一晩透析し、保存した。少量の溶出液をＳＤＳ ＰＡＧＥ上でランさせた。図３に示すような電気泳動の結果は、レーン１の標的バンドが、ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン融合タンパク質（ラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン−Ｆｃ）の理論分子量と同程度の約４４．３ｋＤ（矢印によって示す）の分子量を有することを示している。

【0058】

実施例４．抗ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインモノクローナル抗体の調製と同定
４．１ 組み換えタンパク質による免疫
上述の実施例１で得られた１ｍｌの精製ヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質（１．０ｍｇ／ｍＬ）を抗原として１ｍＬの完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）と十分に混合し、乳化した後、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに対する皮下免疫に使用した。各マウスに１００μｇのヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原で免疫を行った。４週間後、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原と不完全フロイントアジュバントを乳化混合し、各マウスに５０μｇずつの腹腔注射によってマウスに免疫を行った。その後２週間ごとに、腹腔注射によって、５０μｇの抗原による強化免疫を行った。４回目の強化免疫の１週間後、上記実施例２で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質をコーティングしたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡ法によってマウスの血清抗体価を測定した。マウスの血清抗体価が＞１０^５になるまで強化免疫を続けた。最後の強化免疫の３週間後、上記ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質２０μｇで脾内免疫を行い、使用に備えた。

【0059】

４．２ ヒトｐｒｏＢＤＮＦハイブリドーマ細胞株の構築
脾内強化免疫の４日間後、無菌の状況で脾臓をマウスから取り、１００メッシュスクリーンを介した濾過によってリンパ球を分離し、骨髄腫細胞系ＳＰ２／０と融合し、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ）の選択性培養を３日間行った後、ＨＴ培地を添加し、１週間さらに培養した。抗原として本発明の上記実施例のヒトｐｒｏＢＤＮＦでコーティングしたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡで陽性クローンをスクリーニングした。有限希釈法によってサブクローニングを３回行い、サブクローンを２カ月間継続して培養した。最後に、安定したハイブリドーマ細胞株が得られ、クローンを、２Ｂ１１、２Ｃ７、５Ｃ１０、４Ｃ３、６Ｆ３、２Ｆ３、８Ｅ１、及び１Ｇ７と名付けた。

【0060】

４．３ 抗体の精製
上記のハイブリドーマ細胞クローンを、５×１０^５細胞／マウスの量でそれぞれの群のマウスに腹腔に注射し、腹水を調製した。１００ｍｌの腹水を、２倍体積の０．０６Ｍ、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム緩衝液で希釈し、ゆっくり４％オクタン酸を撹拌しながら滴下た。３０分撹拌した後、混濁液を１０，０００ｇで３０分間遠心分離した。沈殿物を捨て、上清を０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で一晩透析した。等体積の飽和硫酸アンモニウムを透析液にゆっくりと添加した後、２時間静置した。混濁液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿物を０．０１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４で溶解した。溶液を０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析し、その間に液を２回交換し、２回の液交換の時間の間隔は５時間未満であった。透析液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。沈殿物を捨て、上清を収集した。

【0061】

プロテインＧ親和性カラム（ＧＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）を室温に戻し、５カラム体積のＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した。上記段落で回収した上清をカラムに充填した。５カラム体積のＰＢＳでカラムを洗浄し、０．１Ｍ、ｐＨ２．３のグリシン塩酸塩溶液で溶出した。１／１０体積のｐＨ９．０の１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を溶出液に添加し、中和した。溶液を０．０１Ｍ、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析し、その間に液を２回交換し、２回の液交換の時間の間隔は５時間超であった。透析液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を、０．２２μｍフィルターを介して濾過して、保管し、それぞれのクローンに対応する精製されたモノクローナル抗体を得た。

【0062】

４．４ ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体結合領域の同定
実験群１：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で、実施例１で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質を希釈した。各群は、８ウェルを含む、８つの対応する精製されたモノクローナル抗体をそれぞれに添加した。
実験群２：実施例２で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質をＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で希釈した。各群は、８ウェルを含む、８つの対応する精製されたモノクローナル抗体をそれぞれに添加した。

【0063】

実験群１及び２の希釈したタンパク質をそれぞれ５０μｌ（５０ｎｇ）の体積（質量）で、４℃にて一晩コーティングするのに使用した。その後、上清を捨て、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中の５％粉乳で３７℃にて２時間ブロックした。その後、実験群１及び２の８つのウェルにそれぞれ上記実施例３．３で得られた８つの精製されたモノクローナル抗体を５０μｌ（１μｇ／ｍｌ）添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、５０μｌのＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、ＡＢＴＳ基質を添加して、１５分間呈色させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した。実験を２回繰り返し、２回の吸光度の測定値の平均値を取った。吸光度値が陰性対照ウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。

【0064】

図４に示すように、精製されたモノクローナル抗体２Ｂ１１は、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ及びヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインの両方に結合し、抗体２Ｂ１１が２つのタンパク質の共通セグメント、すなわち、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン領域に結合することを示唆している。

【0065】

４．５ モノクローナル抗体２Ｂ１１の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識
１０ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を１ｍｌの水に溶解させ、１ｍｌの０．５Ｍ ＮａＩＯ_４を添加して、４℃にて３０分間反応させた。１ｍｌの０．１６Ｍエチレングリコールを添加し、４℃にて３０分間反応させた。１０ｍｇの２Ｂ１１抗体を０．０５Ｍ、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液で透析した。酸化したＨＲＰを２Ｂ１１抗体とよく混合し、４℃にて一晩透析した。０．４ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＮａＢＨ_４を添加し、４℃にて２時間撹拌した。低濃度のＮａＨ_２ＰＯ_４溶液でｐＨを弱酸性に調整し、等体積のグリセロールを添加して、使用するまで保管した。

【0066】

４．６ ＥＬＩＳＡ法による、抗体２Ｂ１１とｐｒｏＢＤＮＦの結合の種属特異性の決定
実験群１：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例１で得られた精製されたヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質を希釈した。
実験群２：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で原核発現のマウスｐｒｏＢＤＮＦ（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）を希釈した。
実験群３：ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で実施例３で得られた真核発現のラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインを希釈した。

【0067】

実験群１、２及び３の希釈したタンパク質をそれぞれ５０μｌ（５０ｎｇ）の体積（質量）で４℃にて一晩コーティングするのに使用した。その後、上清を捨て、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中の５％粉乳で３７℃にて２時間ブロックした。上清を捨て、希釈した実施例４．５におけるＨＲＰ標識２Ｂ１１抗体（１μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。上清を捨て、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで各ウェルを３回洗浄した。ＡＢＴＳ基質を添加して、１５分間呈色させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した。吸光度値が陰性対照ウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。

【0068】

図５に示すように、クローン２Ｂ１１から分泌された抗体は、ヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質、本発明の実施例１で調製したマウスｐｒｏＢＤＮＦタンパク質、及び実施例３で真核発現のラットｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインのいずれとも結合する。

【0069】

４．７ ＥＬＩＳＡ法によるクローン２Ｂ１１の抗体サブタイプの決定
分類する抗体の数に基づいて、６つの実験群を設けた。希釈した原核発現のヒトｐｒｏＢＤＮＦ（５０ｎｇ）タンパク質を５０μｌの体積で各群の各ウェルに添加し、４℃にて一晩コーティングするのに使用した。上清を捨て、各ウェルをＰＢＳ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、ＰＢＳ中の５％粉乳で３７℃にて２時間ブロックした。上清を捨て、クローン２Ｂ１１由来の、精製され、希釈した上記抗体（１μｇ／ｍｌ）５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。上清を捨て、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで各ウェルを３回洗浄した。６つの対応する型の抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）：ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ、ヤギ抗マウスＩｇＧ３、ヤギ抗マウスＩｇＡ、及びヤギ抗マウスＩｇＭをそれぞれ実験群１〜６に添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。上清を捨て、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで各ウェルを３回洗浄した。５０μｌのＨＲＰ標識ロバ抗ヤギ二次抗体を添加して、３７℃にて１時間インキュベートした。上清を捨て、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴで各ウェルを５回洗浄した。ＡＢＴＳ基質を添加して、１５分間呈色させ、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した。吸光度値が陰性対照ウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。図６に示すように、クローン２Ｂ１１は、ＩｇＧ１型と同定された。

【0070】

実施例５．モノクローナル抗体２Ｂ１１のシークエンシング
５’−ＲＡＣＥ法で２Ｂ１１の配列をクローニングし、シークエンシングによって決定した（具体的な手順はＴａｋａｒａ ５’−ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｋｉｔの説明書を参照されたい）。アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で全ＲＮＡにおける露出した５’リン酸基に対して脱リン酸反応をさせた。全ＲＮＡの使用量は２μｇで、反応後フェノール／クロロホルム抽出によって全ＲＮＡを回収した。タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）でｍＲＮＡの５’キャップ構造を脱離させ、一つのリン酸基を残した。Ｔ４ＲＮＡリガーゼで５’ＲＡＣＥ ＡｄａｐｔｏｒをｍＲＮＡに連結し、反応後フェノール／クロロホルム抽出によって、産物を回収した。逆転写酵素で逆転写反応を行い、使用されたプライマーはキットで提供されたＲａｎｄｏｍ ９ ｍｅｒｓであった。

【0071】

逆転写産物を鋳型とし、高正確性酵素を用いて標的遺伝子をＰＣＲ増幅した。使用されたプライマーは以下の通りである：
５’：５’ＲＡＣＥアウタープライマー：ＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＡ（配列番号２１）；
３’：重鎖：ｍＩｇＧ１−アウトプライマー：ＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴ（配列番号２２）；
軽鎖：ｍκ−アウトプライマー：ＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧ（配列番号２３）

【0072】

上記増幅で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、ネステッドＰＣＲを行った。使用されたプライマーは以下の通りである：
５’：５’ＲＡＣＥインナープライマー：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣ ＧＡＴＧ（配列番号２４）；
３’：重鎖：ｍＩｇＧ１−インナープライマー：ＣＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴ（配列番号２５）；
軽鎖：ｍκ−インナープライマー：ＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＧＧ（配列番号２６）。

【0073】

上記増幅によって得られたＰＣＲ産物を精製し、ＴＡクローン（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入。手順は当該キットの説明書を参照されたい）によって、それぞれＴｅａｓｙ−２Ｂ１１ＶＨ及びＴｅａｓｙ−２Ｂ１１ＶＫベクターを得た。モノクローナル抗体２Ｂ１１の重鎖及び軽鎖は、シークエンシングによって得られ、それぞれ配列番号９及び配列番号１０で示した。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列は、ＫａｂａｔＭａｎによって決定され、それぞれ配列番号７及び配列番号８で示した。重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って決定され、それぞれ配列番号１〜３で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列は、決定され、それぞれ配列番号４〜６で示された。

【0074】

実施例６．キメラ抗体ベクターｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１及びｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１の構築及び結合活性の予備同定
６．１ ベクターｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１の構築
本発明の実施例５で構築されたベクターＴｅａｓｙ−２Ｂ１１ＶＨを鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った：
２ＢＶＨＦ：５’−ｇｇｃｔｇｔｔｃａｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｔｇｇｔｔｔｃｃｔｇｔｃｔｇａｇｇｔｇａａｇｇｔｇｇｔｇｇａｇ−３’（配列番号２７）；
２ＢＶＨＲ：５’−ｃｇａｔｇｇｇｃｃｃｔｔｇｇｔｇｇａｇｇｃｔｇａｇｇａｇａｃｇｇｔｇａｃｔｇ−３’（配列番号２８）。
２Ｂ１１抗体の重鎖可変領域を得た。

【0075】

同時に、抗体ベクターｐＨ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ（すなわち、ｐＨ−ＣＨ１２、このベクターの構築方法はＰＣＴ／ＣＮ２００９／０７４０９０の実施例７．１を参照されたい）を鋳型とし、ＰＣＲ増幅を行った：
プライマーＦｃＦ：５’−ｇｃｃｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇ ｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇ−３’（配列番号２９）；及び
プライマーＰＩＨＲ：５’−ｃｇｃｔｔｔｔｇａｇａｇｇｇａｇｔａｃｔｃａｃ−３’（配列番号３０）。
ヒトＩｇＧ１の定常領域を得た。

【0076】

上記２つのＰＣＲ増幅の断片を回収した後、架橋し、さらに以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った：
Ｎｈｅ：５’−ｃｃｔａｇｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｇａｇａｇｔｇｃｔｇａｔｔｃｔｔｔｔｇｔ ｇｇｃｔｇｔｔｃａｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｔ−３’（配列番号３１）；及び上記プライマーＰＩＨＲ（配列番号３０）。
産物のアガロースゲルを回収した後、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）で二重消化し、同様に二重消化されたベクターｐＨに連結し、キメラの２Ｂ１１重鎖を含む発現プラスミドｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１を得、ＰＣＲ同定及びシークエンシングによって確認した。

【0077】

６．２ ベクターｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１の構築
本発明の実施例５で構築されたベクターＴｅａｓｙ−２Ｂ１１Ｖκを鋳型とし、以下のプライマーでＰＣＲ増幅を行った：
２ＢＶκＦ：５’−ｃｔｔｇｃａｔｔｃｔｔｇｔｔｇｃｔｔｔｇｇｔｔｔｃｃａｇｇｔｇｃａａｇａｔｇｔｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｔｃ−３’（配列番号３２）；及び
２ＢＶκＲ：５’−ａｇｃｃａｃｃｇｔａｃｇ ｔｔｔｔａｔｔｔｃｃａａｃｔｔｔｇ−３’（配列番号３３）。

【0078】

モノクローナル抗体２Ｂ１１の軽鎖可変領域を得、断片を回収した。以下のプライマーで上記ＰＣＲ増幅断片を増幅した：
Ｅｃｏ：５’−ｇａｔｃｇａｔａｔｃｃａｃｃａｔｇｇａｃａｔｇａｔｇｇｔｃｃｔｔｇｃｔｃａｇｔｔｔｃｔｔｇｃａｔｔｃｔｔｇｔｔｇ−３’（配列番号３４）、及び２ＢＶκＲ（配列番号３１）。
増幅産物をアガロースゲル上で回収し、ＥｃｏＲＶ及びＢｓｉＷＩ（ＮＥＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入）で二重消化し、同様に二重消化されたベクターｐＫに連結し、キメラの２Ｂ１１軽鎖を含む発現プラスミドｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１を得、ＰＣＲ及びシークエンシングによって確認した。

【0079】

実施例７．キメラ抗体ＣＨ２Ｂ１１の構築及び結合活性の同定
上記構築された発現ベクターｐＨ−ＣＨ２Ｂ１１及びｐＫ−ＣＨ２Ｂ１１を懸濁液中のＣＨＯ細胞に共形質転換して発現させ、培養上清を３日後に収集した。ＣＨＯ細胞の培養上清に、発現されたキメラ抗体ＣＨ２Ｂ１１が含まれた。

【0080】

培養上清を使用して、ＥＬＩＳＡ結合実験を行った。本発明の実施例１で調製したヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質の実験群１だけを含め、後でウェルに対応する８つのモノクローナル抗体のクローンではなく、本実施例における細胞上清の勾配希釈液を添加した以外は、実験方法は、本発明の実施例４．４の方法と実質的に同じであった。同様に、吸光度値が陰性対照ウェルの読み取り値の３倍以上よりも高い場合を陽性とした。

【0081】

実験結果を図７に示す。キメラ抗体ＣＨ２Ｂ１を分泌するＣＨＯ細胞の培養上清は、１：３２希釈で、ヒトｐｒｏＢＤＮＦと結合する活性を示した。すなわち、抗体の結合性は優れている。

【0082】

実施例８．モノクローナル抗体２Ｂ１１は、関節リウマチのマウスモデルの臨床症状を緩和する。
関節リウマチ（ＲＡ）は、病因不明の全身性自己免疫疾患であり、主として中高年の女性に起こり、主に関節に関与する。通常、関節症状は再発する。発病の回数が増すにつれて、関節損傷がますます深刻になり、最終的には、種々の度合いの機能障害及び変形をもたらす。９００万人を超える外来、及び２５０，０００人を超える入院が毎年ＲＡによって引き起こされる。ＲＡに起因する労働定員の損失は、巨大は経済的損失と、家族に重い負担をもたらす。最も一般に使用されるＲＡマウスモデルは、コラゲナーゼ注射に起因する関節炎モデル（ＣＡＩＡモデル）である。本実施例では、ＣＡＩＡモデルを使用して、２Ｂ１１のＲＡに対する治療効果を評価した。

【0083】

１．実験動物
１８〜２０ｇの重さの６〜８週齢の雌のＳＰＦグレードのＢａｌｂ／Ｃマウス（ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供）を本実験で使用した。給餌条件は、以下の通りであった：クリーングレード、５〜６匹のマウス／ケージ、水と飼料は自由摂取；マウスの食事は、給水に浸して柔らかくした後に与えた。実験動物は完全に無作為化した。

【0084】

実験は、４つの群に無作為化した：
（１）正常対照群：正常マウス、モデリング無し；
（２）ＣＡＩＡ群：自己免疫関節炎モデルを設けたが、ＰＢＳは対照治療として与えた；
（３）ＣＡＩＡ＋２Ｂ１１前処置群：モノクローナル抗体２Ｂ１１を５００μｇ／ｋｇで１日１回、合計で１週間、モデリングの日からモデリング後の７日目まで腹腔内に注射した；
（４）ＣＡＩＡ＋２Ｂ１１処置群：モノクローナル抗体２Ｂ１１は、モデリング後１７日目に与えた。

【0085】

２．ＣＡＩＡモデルの調製
ＣＡＩＡモデルは、Ｍｏｄｉｑｕｅｓｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓからの（７つの抗体複合体からなる）コラゲナーゼ抗体複合体を腹腔に注射することによって設けた（モデリングの０日目）。２．８ｍｇの抗体複合体を２００μｌのＰＢＳ中に溶解させ、腹腔内に直接注射した。モデリングの３日目に、２５μｇのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を腹腔内に再び注射し、炎症反応を促進させた。正常対照群では、等体積のＰＢＳをモデリングの０日目と３日目に与えた。前処置群では、モノクローナル抗体２Ｂ１１（２Ｂ１１前処置群）を、モデリングの７日目から１週間毎日５００μｇ／ｋｇで腹腔に注射した。処置群では、モノクローナル抗体２Ｂ１１を、モデリング成功後の１７日目から１週間５００μｇ／ｋｇで腹腔に注射した。

【0086】

３．観察指標
（１）動物の体重測定：動物の体重は、自己免疫関節炎のモデリング後（すなわち、多数の抗体複合体の腹腔注射後）に減少し得る。動物の体重測定は、薬剤の有効性を評価するための非常に重要な指標になっている。
（２）関節炎の重症度スコア：関節炎の程度は、関与する関節の数に基づいてスコアすることができ、これは、自己免疫関節炎に対する薬剤の治療効果を評価するための最も重要な指標である。
（３）関節腫脹の程度：ノギスによって足底の厚さを測定し、関節腫脹の程度を評価した。関節腫脹の程度もまた、関節炎のプロセス及び薬剤の有効性を評価するための重要な指標である。

【0087】

４．実験結果
（１）自己免疫関節炎をもつマウスの体重に対する２Ｂ１１の効果を図８に示す。正常群と比較して、ＣＡＩＡ群のマウスの体重は、コラゲナーゼ抗体複合体の腹腔注射後に継続的に減少した。（＊、ｐ＜０．０５、対正常群；＊、ｐ＜０．０１、対正常群）。ＣＡＩＡ＋２Ｂ１１前処置群またはＣＡＩＡ＋２Ｂ１１処置群のマウスの体重の減少の程度は、対照群のものよりも著しく低く、これは統計的に有意である（＃、ｐ＜０．０５、２Ｂ１１群対対照群）（一元配置分散分析を、反復測定を用いて行い、Ｔｕｋｅｙのポストホック検定は、ポストホック検定分析として使用した）。これは、２Ｂ１１による前処置、及び疾患発症後の２Ｂ１１の投与のいずれも、関節炎マウスの体重の減少の程度を著しく減少させ得ることを示唆している。
（２）自己免疫関節炎をもつマウスの関節炎の重症度に対する２Ｂ１１の効果：モデリング後、腫れ及び他の症状が、マウスの小関節で発生し得る。共通の関節炎の重症度スコア方法（表１を参照）を使用して、自己免疫関節炎に対する２Ｂ１１の予防（前処置群）及び治療（処置群）効果を評価した。

【0088】

【表1】

【0089】

図９に示すように、実験を通じて正常群のマウスの関節には腫れは起きなかったため、関節炎スコアは、０であった。ＣＡＩＡ群では、種々の小関節及び足首関節の腫れは、モデリングの７日目に起こり、関節炎スコアは、最大で４．８ポイントの最も高いピークに著しく増加した（モデリング後１０日目）。ＣＡＩＡ＋２Ｂ１１前処置群及びＣＡＩＡ＋２Ｂ１１処置群のいずれにおけるマウスの関節炎スコアは、対照群のものよりも著しく低いが、正常群よりはまだ高い（一元配置分散分析を、反復測定を用いて行い、テューキーのポストホック検定をポストホック検定分析として使用した）。これは、２Ｂ１１が、前処置群または処置群であっても、自己免疫関節炎をもつマウスの症状を効果的に緩和し得ることを示唆している。

【0090】

（３）自己免疫関節炎をもつマウスの関節腫脹の程度に対する２Ｂ１１の効果：異なる群の足底は、ノギスを使用して測定し、マウスの関節腫脹の程度を評価した。図１０に示すように、対照群のマウスの足底の厚さは、正常群と比較して著しく増加し、ＣＡＩＡ＋２Ｂ１１前処置群及びＣＡＩＡ＋２Ｂ１１処置群の足底の厚さは、対照群と比較して著しく減少した（＊ｐ＜０．０５、対正常群；＊ｐ＜０．０１、対正常群；＃ｐ＜０．０５、対実験群）。

【0091】

実施例９．モノクローナル抗体２Ｂ１１は、実験的アレルギー性脳脊髄炎をもつマウスの臨床症状を緩和する。
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、臨床多発性硬化症のマウスモデルであり、これは、特異的に感作されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって主に媒介される自己免疫疾患であると見なされ、中枢神経系中の微小血管周りの単核細胞浸潤及び脱髄によって特徴付けられる。

【0092】

１．実験動物
１８〜２０ｇの重さの６〜８週齢の雌のＳＰＦグレードのＣ５７ＢＬ／６マウス（ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供）を本実験で使用した。給餌条件は、以下の通りであった：クリーングレード、５〜６匹のマウス／ケージ、水と飼料は自由摂取；３以上の麻痺レベルのマウスと瀕死のマウスは、実験中に単一のケージに収容した；マウスの食事は、給水に浸して柔らかくした後に与えた。実験動物は完全に無作為化した。

【0093】

２．ＥＡＥモデルの調製
マウスをセボフルランで麻酔した。完全に乳化したＭＯＧ３５−５５（３ｍｇ／ｍｌ）／ＩＦＡ（Ｈ３７ＲＡ、４ｍｇ／ｍｌ）を、マウスの上背部の左及び右側部、並びに尾の左の根元に１５０μｌ／マウスの用量で皮下に注射した。さらに、マウスに百日咳毒素ＰＴＸ（０．５μｇ／１００μｌ）を５０μｌ／マウスの用量で腹腔内に注射し、４８時間後に同じ用量のＰＴＸを再び注射した。７日目に、ＭＯＧ３５−５５（３ｍｇ／ｍｌ）／ＩＦＡ（Ｈ３７ＲＡ、２ｍｇ／ｍｌ）を、マウスの下背部の左及び右側部、並びに尾の左の根元に１５０μｌ／マウスの用量で皮下に注射した。

【0094】

３．動物及び投与の群分け
マウスを１群当たり１０匹のマウスで３つの群に無作為化した：
（１）正常群（正常）；
（２）モデル群（ＥＡＥ＋ＮＳＳ）：モデリング後８日目に、等体積の正常ヒツジ血清を０．２ｍｌ／マウスの用量で毎日７日間連続して腹腔内に注射した；
（３）モデル＋抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体処置群（ＥＡＥ＋抗ｐｒｏＢＤＮＦ）：モデリング後９日目に、ＥＡＥモデルマウスが疾患の初期ステージである場合、マウスは、抗ｐｒｏＢＤＮＦポリクローナル抗体を１日１回、７日間連続して腹腔注射の治療を受け始めた（２．５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｌ／マウス／日）。

【0095】

４．観察指標
（１）ＥＡＥモデルの臨床スコアリング：モデリング後、臨床スコアリングを毎日行った。スコアリング基準は、以下の通りであった：０、臨床症状無し；０．５、尾の衰弱；１、尾の麻痺；２、協調運動の喪失；２．５、片側後肢の麻痺；３、両側後肢の麻痺；３．５、前肢の衰弱と共に両側後肢の麻痺；４、前肢の麻痺；５、瀕死または死亡。スコアは、マウスが死亡したことが判明した日に５と記録し、スコアは次の日からは記録しなかった。

【0096】

５．実験結果
図１１に示すように、ＥＡＥ群のマウスの臨床スコアリングは、モデリング後７日目からモデリング後３２日目まで著しく増加し始めた。ＥＡＥ＋２Ｂ１１前処置群のスコアは、モデリング後７日目から２５日目の間の同じ時点でＥＡＥ群のものよりも著しく低かった。これは、疾患の発症前の２Ｂ１１の投与が、ＥＡＥに起因する脊柱機能の損傷を予防し、減少させ得ることを示している。ＥＡＥ＋２Ｂ１１処置群のスコアは、モデリング後１７日目から２９日目の期間中にＥＡＥ群のものよりも著しく低かった。これは、２Ｂ１１の投与が疾患発症後であっても良好な治療効果を有することをさらに示している。

【0097】

実施例１０．抗ｐｒｏＢＤＮＦポリクローナル抗体の調製
ポリクローナル抗体は、以下のアミノ酸配列を有するヒトｐｒｏＢＤＮＦ抗原を用いて調製した：
ＡＰＭＫＥＡＮＩＲＧＱＧＧＬＡＹＰＧＶＲＴＨＧＴＬＥＳＶＮＧＰＫＡＧＳＲＧＬＴＳＬＡＤＴＦＥＨＶＩＥＥＬＬＤＥＤＱＫＶＲＰＮＥＥＮＮＫＤＡＤＬＹＴＳＲＶＭＬＳＳＱＶＰＬＥＰＰＬＬＦＬＬＥＥＹＫＮＹＬＤＡＡＮＭＳＭＲＶＲＲ（配列番号３７）。
調製は、具体的には以下の通りであった。
（１）ヒトｐｒｏＢＤＮＦ断片をＰＣＲで増幅し（リバースプライマー：５’ＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＧＡ−３’（配列番号３５）；フォワードプライマー：５’−ＴＴＡＧＣＧＣＣＧＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＧＡ−３’（配列番号３６））、ベクターｐＥＴ１００／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の多数のクローニング部位にクローンした。プラスミドを大腸菌ＢＬ２１に形質転換し、培養した。細菌コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１，０００ｍｌのＬＢ中で、３７℃、３００ｒｐｍで振動しながら増殖させた。５８０ｎｍで測定した培養のＯＤ値が０．８に到達すると、ＩＰＴＧを添加して、０．５ｍＭの最終濃度にした。培養を３０℃で一晩インキュベートした後、４℃にて１１，０００ｇで遠心分離した。細菌を２０分後に収集した。０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０％グリセロール、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、１０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ、及び１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液４０ｍｌに細菌プラークを懸濁させた。リゾチームを溶液に添加して、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にし、溶液を２５分間氷上に載置し、細胞を溶解した。その後、溶液を５０Ｗのパワーで１０回（各３０秒）超音波処理し、全反応プロセスを氷上で行った。溶液を４℃にて２０分間１１，０００ｇで再び遠心分離した。得られた沈殿物を５０ｍｌの緩衝液Ｉ（０．２Ｍ塩化ナトリウム及び１％デオキシコール酸ナトリウムを補充した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）からなる）に入れ、氷上で３０分間よく混合した。得られた懸濁液を３，０００ｇで１０分間遠心分離し、遠心分離によって得られた沈殿物を５０ｍｌの氷冷緩衝液ＩＩ（１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２５％デオキシコール酸ナトリウムを補充した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）からなる）に入れた。得られた溶解物を３，０００ｇで１０分間再び遠心分離した。遠心分離によって得られた沈殿物を４０ｍｌの緩衝液ＩＩで３回洗浄した後、４０ｍｌの８Ｍ尿素溶液中に溶解させた。タンパク質溶液を１１，０００ｇで４℃にて２５分間遠心分離し、得られた上清をニッケルカラムに添加した。上清の全てを通過させると、８Ｍ尿素、５ｍＭイミダゾール、及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する洗浄液でニッケルカラムを洗浄した。溶出液のＯＤ値を測定し、ＯＤ値が洗浄液のもの近くに低下するまで洗浄を停止した。８Ｍ尿素、１ｍＭイミダゾール、及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する溶出緩衝液をニッケルカラムに添加し、標的タンパク質を溶出した。収集したタンパク質をゲル電気泳動で分離した後、クーマシーブリリアントブルー染色を施した。０．７５Ｍ Ｌ−アルギニン、５ｍＭ ＧＳＨ（Ｒ）、０．５ｍＭ ＧＳＳＨ（Ｏ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝９．５）からなる溶液を使用して、標的タンパク質を含有する溶出液のタンパク質を安定化し、溶出液のｐＨ値を中和した。タンパク質溶液を２ＬのＰＢＳで４℃にて４時間透析し、５ＬのＰＢＳで４時間再び透析した後、１０ＬのＰＢＳで一晩再び透析した。
（２）０．４％グルタルアルデヒドを含有する２ｍｌのＰＢＳと、２ｍｌの完全フロイントアジュバントとを、ステップ（１）で得られた０．５ｍｇの脳由来神経栄養因子前駆体に連続して添加し、エマルションを形成した。エマルションを成体ヒツジの背面及び鼠径部の多数の注射部位に皮下注射した。次に、抗体力価が１／１０，０００に到達するまで、不完全フロイントアジュバント中の抗原の半分の用量を用いて、エマルションを２週間に１回注射した。

【0098】

実施例１１．実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の初期ステージにおける抗ｐｒｏＢＤＮＦポリクローナル抗体の使用
１．実験動物
１８〜２０ｇの重さの６〜８週齢の雌のＳＰＦグレードのＣ５７ＢＬ／６マウス（ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供）を本実験で使用した。給餌条件は、以下の通りであった：クリーングレード、５〜６匹のマウス／ケージ、水と飼料は自由摂取；３以上の麻痺レベルのマウスと瀕死のマウスは、実験中に単一のケージに収容した、マウスの食事は、給水に浸して柔らかくした後に与えた。実験動物は完全に無作為化した。

【0099】

２．ＥＡＥモデルの調製
マウスをセボフルランで麻酔した。完全に乳化したＭＯＧ３５−５５（３ｍｇ／ｍｌ）／ＩＦＡ（Ｈ３７ＲＡ、４ｍｇ／ｍｌ）を、マウスの上背部の左及び右側部、並びに尾の左の根元に１５０μｌ／マウスの用量で皮下に注射した。さらに、マウスに百日咳毒素ＰＴＸ（０．５μｇ／１００μｌ）を５０μｌ／マウスの用量で腹腔内に注射し、４８時間後に同じ用量のＰＴＸを再び注射した。７日目に、ＭＯＧ３５−５５（３ｍｇ／ｍｌ）／ＩＦＡ（Ｈ３７ＲＡ、２ｍｇ／ｍｌ）を、マウスの下背部の左及び右側部、並びに尾の左の根元に１５０μｌ／マウスの用量で皮下に注射した。

【0100】

３．動物及び投与の群分け
３０マウスを１群当たり１０匹のマウスで３つの群に無作為化した：
（１）正常群（正常）；
（２）モデル群（ＥＡＥ＋ＮＳＳ）：モデリング後８日目に、等体積の正常ヒツジ血清を０．２ｍｌ／マウスの用量で毎日７日間連続して腹腔内に注射した；
（３）モデル＋抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体処置群（ＥＡＥ＋抗ｐｒｏＢＤＮＦ）：モデリング後９日目に、ＥＡＥモデルマウスが疾患の初期ステージである場合、マウスは、抗ｐｒｏＢＤＮＦポリクローナル抗体を１日１回、７日間連続して腹腔注射の治療を受け始めた（２．５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｌ／マウス／日）。

【0101】

４．実験後処理
（１）ＥＡＥモデルの臨床スコアリング：モデリング後、臨床スコアリングを毎日行った。スコアリング基準は、以下の通りである：０、臨床症状無し；０．５、尾の衰弱；１、尾の麻痺；２、協調運動の喪失；２．５、片側後肢の麻痺；３、両側後肢の麻痺；３．５、前肢の衰弱と共に両側後肢の麻痺；４、前肢の麻痺；５、瀕死または死亡。スコアは、マウスが死亡したことが判明した日に５と記録し、スコアは次の日からは記録しなかった。
（２）ＨＥ染色及び区分、並びに病理学スコアリング
モデリング後３５日目のマウス（５匹マウス／群）を、灌流を通じて犠牲死させた。脊髄を除去し、脱水し、ヒアリン化し、ワックスに浸し、ワックスブロックにし、区分し、（４μｍ）、従来の方法に従ってＨＥ染色した。炎症細胞の浸潤が観察された。
（３）ＬＦＢ染色：区分を従来のＬＦＢ染色法に従って染色し、脱髄を観察した。
（４）脊髄疾患関連の遺伝子発現の検出：
モデリング後３５日目のマウス（５匹マウス／群）の脊髄を、リアルタイムＰＣＲによって、前炎症性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの発現レベルを検出した。

【0102】

５．データの分析
グラフパッドプリズムソフトウェア５．０を使用して、分析した。ｐ＜０．０５である場合、有意差と見なされる。

【0103】

６．結果
（１）モデルマウスの疾患の発症：抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体で処置したＥＡＥモデルマウスの神経学的障害は著しく減少し、治療後の臨床スコアリングは、約１で基本的に安定していた（図１２）。
（２）病理切片及び病理学的損傷スコア：モデル群のマウスの炎症細胞が脊髄の実質に密に分散し、炎症細胞の浸潤が抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体処置群で減少し、ごく少量の炎症細胞が浸潤したことが、光学顕微鏡法の結果により示された（図１３）。脊髄白質の髄鞘がモデル群のマウスにおいて著しく欠乏し、脊髄白質のミエリン欠損領域が抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体処置群のマウスで減少したことが、ＬＦＢ染色により示された（図１４）。
（３）脊髄における炎症性サイトカインの発現：リアルタイムＰＣＲの結果を図１５に示す。炎症性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの発現は大きく増加したが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの発現は、抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体処置群で著しく減少したことが示されている。

【0104】

疾患の初期ステージでの抗ｐｒｏＢＤＮＦポリクローナル抗体の投与がモデルマウスの神経学的機能スコアを著しく改善し、モデルマウスにおける脊髄及び脱髄の炎症細胞浸潤、並びに炎症性メディエーターの放出を阻害し得ることが、結果により示された。

【0105】

実施例１２．ＥＡＥのピークにおける抗ｐｒｏＢＤＮＦポリクローナル抗体の使用
１．実験動物
１８〜２０ｇの重さの６〜８週齢の雌のＳＰＦグレードのＣ５７ＢＬ／６マウス（ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供）を本実験で使用した。給餌条件は、以下の通りであった：クリーングレード、５〜６匹のマウス／ケージ、水と飼料は自由摂取；３以上の麻痺レベルのマウスと瀕死のマウスは、実験中に単一のケージに収容した、及びマウスの食事は、給水に浸して柔らかくした後に与えた。実験動物は完全に無作為化した。

【0106】

２．ＥＡＥモデルの調製
マウスをセボフルランで麻酔した。完全に乳化したＭＯＧ３５−５５（３ｍｇ／ｍｌ）／ＩＦＡ（Ｈ３７ＲＡ、４ｍｇ／ｍｌ）を、マウスの上背部の左及び右側部、並びに尾の左の根元に１５０μｌ／マウスの用量で皮下に注射した。さらに、マウスに百日咳毒素ＰＴＸ（０．５μｇ／１００μｌ）を５０μｌ／マウスの用量で腹腔内に注射し、４８時間後に同じ用量のＰＴＸを再び注射した。７日目に、ＭＯＧ３５−５５（３ｍｇ／ｍｌ）／ＩＦＡ（Ｈ３７ＲＡ、２ｍｇ／ｍｌ）を、マウスの下背部の左及び右側部、並びに尾の左の根元に１５０μｌ／マウスの用量で皮下に注射した。

【0107】

３．動物及び投与の群分け
３０匹のマウスを１群当たり１０匹のマウスで３つの群に無作為化した：
（１）正常群（正常）；
（２）モデル群（ＥＡＥ＋ＮＳＳ）：モデリング後１７日目、等体積の正常ヒツジ血清を０．２ｍｌ／マウスの用量で毎日７日間連続して腹腔内に注射した；
（３）モデル＋抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体処置群（ＥＡＥ＋抗ｐｒｏＢＤＮＦ）：モデリング後１７日目、ＥＡＥモデルマウスが疾患のピークであった場合、マウスは、抗ｐｒｏＢＤＮＦポリクローナル抗体を１日１回、７日間連続して腹腔注射の治療を受け始めた（２．５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｌ／マウス／日）。

【0108】

４．実験後処理
（１）ＥＡＥモデルの臨床スコアリング：モデリング後、臨床スコアリングを毎日行った。スコアリング基準は、以下の通りである：０、臨床症状無し；０．５、尾の衰弱；１、尾の麻痺；２、協調運動の喪失；２．５、片側後肢の麻痺；３、両側後肢の麻痺；３．５、前肢の衰弱と共に両側後肢の麻痺；４、前肢の麻痺；５、瀕死または死亡。スコアは、マウスが死亡したことが判明した日に５と記録し、スコアは次の日からは記録しなかった。
（２）ＨＥ染色及び区分、並びに病理学スコアリング
モデリング後３５日目のマウス（５匹マウス／群）を、灌流を通じて犠牲死させた。脊髄を除去し、脱水し、ヒアリン化し、ワックスに浸し、ワックスブロックにし、区分し、（４μｍ）、従来の方法に従ってＨＥ染色した。炎症細胞の浸潤が観察された。
（３）ＬＦＢ染色：区分を従来のＬＦＢ染色法に従って染色し、脱髄を観察した。
（４）脊髄疾患関連の遺伝子発現の検出：
モデリング後３５日目のマウス（５匹マウス／群）の脊髄を、リアルタイムＰＣＲによって、前炎症性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの発現レベルを検出した。

【0109】

５．データの分析
グラフパッドプリズムソフトウェア５．０を使用して、分析した。ｐ＜０．０５である場合、有意差と見なされる。

【0110】

６．結果
（１）モデルマウスの疾患の発症：抗ｐｒｏＢＤＮＦポリクローナル抗体で処置したＥＡＥモデルマウスの神経学的障害は著しく減少し、治療後の臨床スコアリングは、約１で基本的に安定していた（図１６）。
（２）病理切片及び病理学的損傷スコア：モデル群のマウスの炎症細胞が脊髄の実質に密に分散し、炎症細胞の浸潤が抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体処置群で減少し、ごく少量の炎症細胞が浸潤したことが、光学顕微鏡法の結果により示された（図１７）。脊髄白質の髄鞘がモデル群のマウスにおいて著しく欠乏し、脊髄白質のミエリン欠損領域が抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体処置群のマウスで減少したことが、ＬＦＢ染色により示された（図１８）。
（３）脊髄における炎症性サイトカインの発現：リアルタイムＰＣＲの結果を図１９に示す。炎症性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの発現は大きく増加したが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの発現は、抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体処置群で著しく減少したことが示されている。

【0111】

疾患のピークでの抗ｐｒｏＢＤＮＦ抗体の投与がモデルマウスの神経学的機能スコアを著しく改善し、モデルマウスにおける脊髄及び脱髄の炎症細胞浸潤、並びに炎症性メディエーターの放出を阻害し得ることが、結果により示された。

【0112】

本発明に示した全ての文献は、各文献が個々に参照により組み込まれたように、その全体を同程度まで参照により組み込む。さらに、本発明の上記説明を読んだ後、当業者は本発明に対して種々の変更や修正をすることができ、これらの等価な形態も本出願の添付の特許請求の範囲に含まれることを理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]