特許 6759303 ＶＬドメインを含む結合タンパク質を作製するマウス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6759303

(24)【登録日】2020年9月4日

(45)【発行日】2020年9月23日

(54)【発明の名称】ＶＬドメインを含む結合タンパク質を作製するマウス

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20200910BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20200910BHJP

   A01K 67/027 20060101ALN20200910BHJP

   C12N 15/06 20060101ALN20200910BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20200910BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20200910BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20200910BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20200910BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10ZNA

   C12N5/0735

   !A01K67/027

   !C12N15/06 100

   !C12P21/08

   !C12N15/13

   !C12N15/62 Z

   !C07K16/00

【請求項の数】11

【外国語出願】

【全頁数】58

(21)【出願番号】特願2018-212094(P2018-212094)

(22)【出願日】2018年11月12日

(62)【分割の表示】特願2018-123(P2018-123)の分割

【原出願日】2011年8月2日

(65)【公開番号】特開2019-47805(P2019-47805A)

(43)【公開日】2019年3月28日

【審査請求日】2018年11月12日

(31)【優先権主張番号】61/369,909

(32)【優先日】2010年8月2日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】リン マクドナルド

(72)【発明者】

【氏名】ショーン スティーブンズ

(72)【発明者】

【氏名】ケイガン ギュラー

(72)【発明者】

【氏名】カロライナ エー． ホシアワ

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー ジェイ． マーフィー

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１４３４７２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２００４−５２４８４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／００４１９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１５８００９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／００１５９５７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０５−３０４９８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０２１７３７３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ０１Ｋ ６７／０２７

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ｃ０７Ｋ １６／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントと、少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントとを含むハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を含む、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞であって、
該ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座は、該少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントと該少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントとの間の全ての機能的な重鎖Ｄ_Ｈセグメントを欠き、
該少なくとも１つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、該再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントと該再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントとがＢ細胞において組み換わり、該ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座において、該免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に連結された、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ／Ｊ_Ｌ）ヌクレオチド配列を形成することを可能にする組換えシグナル配列を含む、
マウスＥＳ細胞。

【請求項2】

前記少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトκセグメント、ヒトλセグメント、およびこれらの組合せから選択される、請求項１に記載のマウスＥＳ細胞。

【請求項3】

前記重鎖定常領域核酸配列が、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載のマウスＥＳ細胞。

【請求項4】

前記少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよび前記少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子がそれぞれ、内因性マウス重鎖遺伝子座において、１または複数の内因性マウス重鎖可変領域Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントおよび１または複数の内因性マウス重鎖接合Ｊ_Ｈ遺伝子セグメントを置き換える、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマウスＥＳ細胞。

【請求項5】

前記少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよび前記少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントが、前記内在性マウス重鎖遺伝子座の全てのマウス重鎖Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを置き換える、請求項４に記載のマウスＥＳ細胞。

【請求項6】

前記少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントがヒトＶκ遺伝子セグメントであり、前記少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントがヒトＪκ遺伝子セグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマウスＥＳ細胞。

【請求項7】

軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒト軽鎖可変領域Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖接合領域Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のマウスＥＳ細胞。

【請求項8】

前記軽鎖定常領域遺伝子配列が、マウス軽鎖定常領域遺伝子配列である、請求項７に記載のマウスＥＳ細胞。

【請求項9】

前記ヒト軽鎖可変領域Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントがヒトＶκ遺伝子セグメントである、請求項７または請求項８に記載のマウスＥＳ細胞。

【請求項10】

前記軽鎖定常領域遺伝子配列がマウスκ軽鎖定常領域遺伝子配列である、請求項９に記載のマウスＥＳ細胞。

【請求項11】

前記少なくとも１つの再構成されていないヒト軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントが、少なくとも６つまたはそれより多い再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変Ｖκ遺伝子セグメントを含み、前記少なくとも１つの再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖接合Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントが、５つ全ての再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖接合Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５遺伝子セグメントを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のマウスＥＳ細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと融合している免疫グロブリン重鎖定常領域を含む免疫グロブリン様結合タンパク質の他、軽鎖定常ドメインに融合している免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインに融合している免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを有する結合タンパク質が提供される。このような結合タンパク質を発現する細胞、これらを作製するマウス、ならびに関連する方法および組成物もまた提供される。

【背景技術】

【0002】

抗体は、典型的には、軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）と融合している軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）と会合している、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と融合している重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）を各々が含む２つの同一な重鎖を有する四量体構造を含む。典型的なヒトＩｇＧの場合、抗体分子は、ＩｇＧのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）および可変領域の（多様な）長さに応じて、およそ、約１５０ｋＤａ〜約１７０ｋＤａ（例えば、より長いヒンジ領域を含むＩｇＧ３の場合）のサイズである。

【0003】

典型的な抗体では、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインが会合して、標的抗原に結合する結合部位を形成する。したがって、アフィニティーおよび特異性に関する抗体の特徴は、大部分Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインの特徴に依存し得る。ヒトおよびマウスの典型的な抗体では、Ｖ_Ｈドメインが、λＶ_ＬドメインまたはκＶ_Ｌドメインと連結される。しかし、コグネイトＶ_Ｈドメイン（例えば、天然では抗体のコンテクストで発現し、特定のＶ_Ｌドメインと会合している、Ｖ_Ｈドメイン）の非存在下において標的抗原に特異的に結合するＶ_Ｌドメインを作製することができ、コグネイトＶ_Ｌドメインの非存在下において標的抗原に特異的に結合するＶ_Ｈドメインを単離し得ることもまた公知である。したがって、免疫グロブリンベースの結合タンパク質において有用な多様性は一般に、特定のＶ_ＨまたはＶ_Ｌをもたらす組換え（および組換えが生じる程度の体細胞超変異）により付与される他、コグネイトＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対の組合せによっても付与される。多様性の他の供給源を利用する組成物および方法を開発すれば、有用であろう。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

当技術分野では、軽鎖可変領域などの免疫グロブリン可変領域を含めた免疫グロブリン構造に基づく結合タンパク質が必要とされており、これには従来の抗体を上回る多様性の増強を呈示する結合タンパク質が含まれる。また、多様な軽鎖免疫グロブリン可変領域配列を含む結合タンパク質を含めた有用な結合タンパク質を作製するためのさらなる方法および動物も必要とされている。また、例えば、ヒト用治療剤を作製するのに用いられる、体細胞変異し、クローン選択された免疫グロブリン可変ドメインを生成させるための組成物および方法を含め、そこから選択するための結合タンパク質の多様性の増強、および免疫グロブリン可変ドメインの多様性の増強をもたらす、免疫グロブリンベースの結合タンパク質に有用なフォーマットも必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

一態様では、軽鎖（すなわち、カッパ（κ）鎖および／またはラムダ（λ）鎖）免疫グロブリン可変ドメインには由来するが、全長重鎖免疫グロブリン可変ドメインには由来しない免疫グロブリン可変ドメインを含む結合タンパク質が記載される。遺伝子改変マウスを含めた、結合タンパク質を作製するための方法および組成物もまた提供される。

【0006】

一態様では、ヒトλまたはκ軽鎖可変ドメインおよびヒトまたはマウス重鎖定常領域配列を含むタンパク質を含めた、１または複数のκ軽鎖および／またはλ軽鎖可変領域免疫グロブリン配列ならびに免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含むタンパク質を作製するための核酸構築物、細胞、胚、マウス、および方法が提供される。

【0007】

一態様では、マウス内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における１または複数の免疫グロブリン重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）遺伝子セグメント、重鎖多様性（Ｄ_Ｈ）遺伝子セグメント、および重鎖接合（Ｊ_Ｈ）遺伝子セグメントの、１または複数の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）遺伝子セグメントおよび１または複数の軽鎖接合領域（Ｊ_Ｌ）遺伝子セグメントによる置き換えを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。

【0008】

一態様では、内因性重鎖遺伝子座（ＶＬ_Ｈ遺伝子座）においてＶ_Ｌ遺伝子セグメント配列を形成するための、全てのまたは実質的に全てのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの、１または複数のＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび１または複数のＪ_Ｌ遺伝子セグメントによる置き換えであって、上記ＶＬ_Ｈ遺伝子座が、マウス内因性Ｃ_Ｈ遺伝子と組み換えられて、Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｊ_Ｌ遺伝子セグメント、およびマウス内因性Ｃ_Ｈ遺伝子に由来する再構成された遺伝子を形成することが可能である置き換えを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。

【0009】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、ヒトＶ_Ｌセグメントである。一実施形態では、上記Ｊ_Ｌセグメントが、ヒトＪ_Ｌセグメントである。特定の実施形態では、上記Ｖ_ＬセグメントおよびＪ_Ｌセグメントが、ヒトＶ_ＬセグメントおよびヒトＪ_Ｌセグメントである。

【0010】

一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、少なくとも６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、少なくとも１６のヒトＶκ遺伝子セグメント（ヒトＶκ）および少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、少なくとも３０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、少なくとも４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントが、２つ、３つ、４つ、または５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。

【0011】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、ヒトＶκセグメントである。一実施形態では、上記ヒトＶκセグメントが、４−１、５−２、７−３、２−４、１−５、および１−６を含む。一実施形態では、上記κＶ_Ｌが、３−７、１−８、１−９、２−１０、３−１１、１−１２、１−１３、２−１４、３−１５、１−１６を含む。一実施形態では、上記ヒトＶκセグメントが、１−１７、２−１８、２−１９、３−２０、６−２１、１−２２、１−２３、２−２４、３−２５、２−２６、１−２７、２−２８、２−２９、および２−３０を含む。一実施形態では、上記ヒトＶκセグメントが、３−３１、１−３２、１−３３、３−３４、１−３５、２−３６、１−３７、２−３８、１−３９、および２−４０を含む。

【0012】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、ヒトＶκセグメントであり、４−１、５−２、７−３、２−４、１−５、１−６、３−７、１−８、１−９、２−１０、３−１１、１−１２、１−１３、２−１４、３−１５、および１−１６を含む。一実施形態では、上記Ｖκセグメントが、１−１７、２−１８、２−１９、３−２０、６−２１、１−２２、１−２３、２−２４、３−２５、２−２６、１−２７、２−２８、２−２９、および２−３０をさらに含む。一実施形態では、上記Ｖκセグメントが、３−３１、１−３２、１−３３、３−３４、１−３５、２−３６、１−３７、２−３８、１−３９、および２−４０をさらに含む。

【0013】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、ヒトＶλセグメントであり、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片が、ｈＶλ３−２７〜ｈＶλ３−１に及ぶ。

【0014】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片が、ｈＶλ５−５２〜ｈＶλ１−４０に及ぶ。

【0015】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、クラスターＡのゲノム断片およびクラスターＢのゲノム断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターＡの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。

【0016】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、クラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＣの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。

【0017】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、ｈＶλ３−１、ｈＶλ４−３、ｈＶλ２−８、ｈＶλ３−９、ｈＶλ３−１０、ｈＶλ２−１１、およびｈＶλ３−１２を含む。特定の実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、Ｖλ３−１２〜Ｖλ３−１にわたる上記ヒトλ軽鎖遺伝子座の隣接配列を含む。一実施形態では、上記隣接配列が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のｈＶλを含む。特定の実施形態では、上記ｈＶλが、３−１、４−３、２−８、３−９、３−１０、２−１１、および３−１２を包含する。特定の実施形態では、上記ｈＶλが、Ｖλ３−１２〜Ｖλ３−１にわたるヒトλ遺伝子座の隣接配列を含む。

【0018】

一実施形態では、上記ｈＶλが、１３〜２８以上のｈＶλを含む。特定の実施形態では、上記ｈＶλが、２−１４、３−１６、２−１８、３−１９、３−２１、３−２２、２−２３、３−２５、および３−２７を包含する。特定の実施形態では、上記ｈＶλが、Ｖλ３−２７〜Ｖλ３−１にわたる上記ヒトλ遺伝子座の隣接配列を含む。

【0019】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、２９〜４０のｈＶλを含む。特定の実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、Ｖλ３−２９〜Ｖλ３−１にわたる上記ヒトλ遺伝子座の隣接配列、およびＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０にわたる上記ヒトλ遺伝子座の隣接配列を含む。特定の実施形態では、上記遺伝子改変マウスにおけるｈＶλ１−４０〜ｈＶλ３−２９における全てのまたは実質的に全ての配列が、天然では（例えば、ヒト集団では）上記ｈＶλ１−４０遺伝子セグメントの下流（３’側非翻訳部分の下流）に見出される約９５９ｂｐのヒトλ配列、制限酵素認識部位（例えば、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位）、これに後続する、天然では上記ｈＶλ３−２９遺伝子セグメントの上流に見出される約３，４３１ｂｐのヒトλ配列から本質的になる。

【0020】

一実施形態では、上記Ｊκが、ヒトＪκであり、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態では、上記Ｊκが、Ｊκ１〜Ｊκ５を含む。

【0021】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、ヒトＶλセグメントであり、上記Ｊκ遺伝子セグメントが、１２マーのスペーサーを有するＲＳＳであって、上記Ｊκ遺伝子セグメントの上流端で近接する（ｉｓ ｊｕｘｔａｐｏｓｅｄ）ＲＳＳを含む。一実施形態では、上記Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶλであり、上記ＶＬ_Ｈ遺伝子座が、２つ以上のＪκ遺伝子セグメントを含み、各Ｊκ遺伝子セグメントが、１２マーのスペーサーを有するＲＳＳであって、各Ｊκ遺伝子セグメントの上流端で近接するＲＳＳを含む。

【0022】

特定の実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、上記ヒトκ遺伝子座Ｖκ４−１〜Ｖκ２−４０にわたる隣接するヒトκ遺伝子セグメントを含み、上記Ｊ_Ｌセグメントが、上記ヒトκ遺伝子座Ｊκ１〜Ｊκ５にわたる隣接するヒトκ遺伝子セグメントを含む。

【0023】

上記Ｖ_ＬセグメントがＶλセグメントであり、上記Ｖ_ＬセグメントとＪセグメントとの間にＤ_Ｈセグメントが存在しない一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントが、下流で２３マーのＲＳＳと隣接し（すなわち、その下流側で近接し）、存在する場合のＪκセグメントまたは存在する場合のＪλセグメントが、上流で１２マーのＲＳＳと隣接する（すなわち、その上流側で近接する）。

【0024】

Ｖ遺伝子セグメントがＶκ遺伝子セグメントであり、上記Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間にＤ_Ｈ遺伝子セグメントが存在しない一実施形態では、上記Ｖκ遺伝子セグメントの各々が、下流側で、１２マーのＲＳＳで近接し、存在する場合のＪκセグメントまたは存在する場合のＪλセグメントの各々が、上流側で、２３マーのＲＳＳと近接する。

【0025】

一実施形態では、上記マウスが、Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｊ_Ｌ遺伝子セグメント、およびマウス内因性Ｃ_Ｈ遺伝子に由来する再構成された遺伝子を含む。一実施形態では、上記再構成された遺伝子が、体細胞変異している。一実施形態では、上記再構成された遺伝子が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮ付加（Ｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ）を含む。一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントおよび上記Ｊ_Ｌセグメントに由来する再構成された遺伝子において観察される上記Ｎ付加および／または上記体細胞変異が、内因性軽鎖遺伝子座において再構成される、再構成された軽鎖可変ドメイン（同じＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび同じＪ_Ｌ遺伝子セグメントに由来する）において観察されるＮ付加および／または体細胞変異の数の１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または少なくとも５倍である。一実施形態では、上記再構成された遺伝子が、対象の抗原に特異的に結合するＢ細胞であって、対象の抗原に低ナノモル濃度範囲以下のＫ_Ｄ（例えば、１０ナノモル濃度以下のＫ_Ｄ）で結合するＢ細胞内に存在する。特定の実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメント、上記Ｊ_Ｌセグメント、またはこれらの両方、が、ヒト遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記Ｖ_ＬセグメントおよびＪ_Ｌセグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記マウスのＣ_Ｈ遺伝子が、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥから選択される。特定の実施形態では、上記マウスのＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃ、およびＩｇＧ３から選択される。別の特定の実施形態では、上記マウスのＩｇＧが、ＩｇＧ１である。

【0026】

一実施形態では、上記マウスが、Ｂ細胞を含み、ここで、上記Ｂ細胞が、上記Ｂ細胞の染色体における遺伝子座から、４つのポリペプチド鎖から本質的になる結合タンパク質を作製し、ここで、上記４つのポリペプチド鎖が、（ａ）Ｖ_Ｌ領域と融合しているマウス内因性Ｃ_Ｈ領域を含む、２つの同一のポリペプチドと、（ｂ）上記マウスＣ_Ｈ領域と融合しており、かつ一実施形態ではヒト（例えば、ヒトκ）Ｖ_Ｌ領域であるＶ_Ｌ領域に関してコグネイトであるＶ_Ｌ領域と融合しているマウス内因性Ｃ_Ｌ領域を含む、２つの同一のポリペプチドとから本質的になる。一実施形態では、上記マウス内因性Ｃ_Ｈ領域と融合しているＶ_Ｌ領域が、ヒトＶ_Ｌ領域である。特定の実施形態では、上記マウスＣ_Ｈ領域と融合しているヒトＶ_Ｌ領域が、Ｖκ領域である。特定の実施形態では、上記マウスＣ_Ｈ領域と融合しているヒトＶ_Ｌ領域が、再構成されたヒト生殖系列軽鎖ヌクレオチド配列によりコードされるＶ領域と同一である。特定の実施形態では、上記マウスＣ_Ｈ領域に融合しているヒトＶ_Ｌ領域が、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記マウスＣ_Ｈ領域に融合しているヒトＶ_Ｌ領域が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含む再構成された遺伝子によりコードされる。

【0027】

一実施形態では、上記マウスにより作製される全てのＩｇＧ分子のうちの少なくとも５０％が、ＩｇＧアイソタイプのＣ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域を含むポリペプチドを含み、ここで、上記ポリペプチドの長さが、５３５、５３０、５２５、５２０、または５１５アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、全てのＩｇＧ分子のうちの少なくとも７５％が、本段落で列挙されるポリペプチドを含む。一実施形態では、全てのＩｇＧ分子のうちの少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本段落で列挙されるポリペプチドを含む。特定の実施形態では、上記マウスにより作製される全てのＩｇＧ分子が、本段落で列挙されるポリペプチドの長さ以下であるポリペプチドを含む。

【0028】

一実施形態では、上記マウスにより、再構成されたヒトＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントによりコードされるが、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントによってはコードされない可変ドメインと融合しているマウス内因性Ｃ_Ｈ領域を含む第１のポリペプチド、ならびに再構成されたヒトＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントによりコードされるが、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントによってはコードされないＶドメインと融合しているマウス内因性Ｃ_Ｌ領域を含む第２のポリペプチドを含む結合タンパク質を作製するが、この結合タンパク質は、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲のアフィニティーで抗原に特異的に結合する。一実施形態では、上記Ｊセグメントが、ヒトＪセグメント（例えば、ヒトκ遺伝子セグメント）である。一実施形態では、ヒトＶセグメントが、ヒトＶκセグメントである。一実施形態では、上記マウス内因性Ｃ_Ｈ領域と融合している可変ドメインが、上記マウス内因性Ｃ_Ｌ領域と融合している可変領域より多数の体細胞超変異を含み、特定の実施形態では、上記マウス内因性Ｃ_Ｈ領域と融合している可変領域が、上記マウス内因性Ｃ_Ｌ領域に融合しているＶ領域の約１．５、２、３、４、または５倍以上の体細胞超変異を含み、特定の実施形態では、上記マウスＣ_Ｈ領域と融合しているＶ領域が、上記マウスＣ_Ｌ領域と融合しているＶ領域より少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５以上の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記マウスＣ_Ｈ領域と融合しているＶ領域が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含む再構成された遺伝子によりコードされる。

【0029】

一実施形態では、上記マウスが、免疫グロブリン重鎖定常領域配列と融合している第１の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）、および免疫グロブリン軽鎖定常領域と融合している第２の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）を含む結合タンパク質を発現し、ここで、Ｖ_Ｌ１が、Ｖ_Ｌ２に存在する体細胞超変異の数の約１．５〜約５倍以上の数の体細胞超変異を含む。一実施形態では、Ｖ_Ｌ１における体細胞超変異の数が、Ｖ_Ｌ２における数の約２〜約４倍である。一実施形態では、Ｖ_Ｌ１における体細胞超変異の数が、Ｖ_Ｌ２における数の約２〜約３倍である。一実施形態では、Ｖ_Ｌ１が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含む配列によりコードされる。

【0030】

一態様では、以下のポリペプチド：各々がＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントから本質的になる遺伝子セグメントに由来する可変ドメインと融合しているＣ_Ｈ領域から本質的になる第１の２つの同一のポリペプチド、ならびに各々がＶ_ＬセグメントおよびＪ_Ｌセグメントから本質的になる遺伝子セグメントに由来する可変ドメインと融合しているＣ_Ｌ領域から本質的になる第２の２つの同一のポリペプチドから本質的になる免疫グロブリンを発現する遺伝子改変マウスが提供される。

【0031】

特定の実施形態では、上記Ｃ_Ｈ領域を有する２つの同一のポリペプチドが、マウスＣ_Ｈ領域を有する。

【0032】

特定の実施形態では、上記Ｃ_Ｌ領域を有する２つの同一のポリペプチドが、マウスＣ_Ｌ領域を有する。

【0033】

一実施形態では、上記Ｃ_Ｌ領域と融合している可変ドメインが、上記Ｃ_Ｈ領域に融合している可変ドメインとコグネイトの可変ドメインである。

【0034】

一実施形態では、上記マウス内因性Ｃ_Ｈ領域と融合している可変ドメインが、上記マウス内因性Ｃ_Ｌ領域と融合している可変ドメインより多数の体細胞超変異を含み、特定の実施形態では、上記マウス内因性Ｃ_Ｈ領域と融合している可変ドメインが、上記マウス内因性Ｃ_Ｌ領域と融合している可変ドメインの約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍以上の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記マウス内因性Ｃ_Ｌ領域と融合している可変ドメインが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮ付加を含む遺伝子によりコードされる。

【0035】

一実施形態では、上記Ｖセグメントおよび上記Ｊセグメントのうちの１または複数が、ヒト遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントおよび上記Ｊセグメントの両方が、ヒトκ遺伝子セグメントである。別の特定の実施形態では、上記Ｖセグメントおよび上記Ｊセグメントの両方が、ヒトλ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記Ｖセグメントおよび上記Ｊセグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントおよびヒトλ遺伝子セグメントから個別に選択される。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、Ｖκセグメントであり、上記Ｊセグメントが、Ｊλセグメントである。別の特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、Ｖλセグメントであり、上記Ｊセグメントが、Ｊκセグメントである。

【0036】

一実施形態では、上記Ｃ_Ｌ領域と融合している可変ドメインおよび上記Ｃ_Ｈ領域と融合している可変ドメインのうちの１または複数が、ヒト可変ドメインである。特定の実施形態では、上記ヒト可変ドメインが、ヒトＶκドメインである。別の特定の実施形態では、上記ヒト可変ドメインが、Ｖλドメインである。一実施形態では、上記ヒトドメインが、ヒトＶκドメインおよびヒトＶλドメインから個別に選択される。特定の実施形態では、上記Ｃ_Ｌ領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトＶλドメインであり、上記Ｃ_Ｈ領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトＶκドメインである。別の実施形態では、上記Ｃ_Ｌ領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトＶκドメインであり、上記Ｃ_Ｈ領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトＶλドメインである。

【0037】

一実施形態では、上記第１の２つの同一のポリペプチドのうちのＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶλセグメントおよびヒトＶκセグメントから選択される。一実施形態では、上記第２の２つの同一のポリペプチドのうちのＶ_Ｌセグメントが、ヒトＶλセグメントおよびヒトＶκセグメントから選択される。特定の実施形態では、上記第１の２つの同一のポリペプチドのうちのＶ_Ｌセグメントが、ヒトＶκセグメントであり、上記第２の２つの同一のポリペプチドのうちのＶ_Ｌセグメントが、ヒトＶκセグメントおよびヒトＶλセグメントから選択される。特定の実施形態では、上記第１の２つの同一のポリペプチドのうちのＶ_Ｌセグメントが、ヒトＶλセグメントであり、上記第２の２つの同一のポリペプチドのうちのＶ_Ｌセグメントが、ヒトＶλセグメントおよびヒトＶκセグメントから選択される。特定の実施形態では、上記第１の２つの同一のポリペプチドのうちのヒトＶ_Ｌセグメントが、ヒトＶκセグメントであり、上記第２の２つの同一のポリペプチドのうちのヒトＶ_Ｌセグメントが、ヒトＶκセグメントである。

【0038】

一実施形態では、上記マウスのＩｇＧが、抗原に対する反応により作製された結合タンパク質を含み、ここで、上記結合タンパク質が、可変ドメインおよびＣ_Ｈ領域から本質的になるポリペプチドを含み、ここで、上記可変ドメインが、再構成されたＶ_Ｌセグメントおよび再構成されたＪセグメントから本質的になるヌクレオチド配列によりコードされ、ここで、上記結合タンパク質が、上記抗原のエピトープに、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲のＫ_Ｄで特異的に結合する。

【0039】

一態様では、抗原に対する反応によりマウスにより作製されるＩｇＧのうちの全てのまたは実質的に全てが、可変ドメインを含む重鎖を含み、ここで、上記可変ドメインが、本質的にＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントからなる遺伝子セグメントに由来する、再構成された遺伝子によりコードされるマウスが提供される。一実施形態では、上記再構成された遺伝子が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含む。

【0040】

一実施形態では、上記Ｖセグメントが、軽鎖のＶセグメントである。一実施形態では、上記軽鎖が、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される。特定の実施形態では、上記軽鎖がκ軽鎖である。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、ヒトＶセグメントである。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、ヒトＶκセグメントであり、Ｊセグメントが、ヒトＪκセグメントである。

【0041】

一実施形態では、上記Ｊセグメントが軽鎖のＪセグメントである。一実施形態では、上記軽鎖が、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される。特定の実施形態では、上記軽鎖がκ軽鎖である。特定の実施形態では、上記ＪセグメントがヒトＪセグメントである。別の実施形態では、上記Ｊセグメントが重鎖のＪセグメント（すなわち、Ｊ_Ｈセグメント）である。特定の実施形態では、上記重鎖がマウス起源のものである。別の特定の実施形態では、上記重鎖がヒト起源のものである。

【0042】

一実施形態では、ＶセグメントおよびＪセグメントだけから作製される重鎖の可変ドメインが、体細胞変異している可変ドメインである。

【0043】

一実施形態では、ＶセグメントおよびＪセグメントだけから作製される重鎖の可変ドメインがマウスＣ_Ｈ領域に融合している。

【0044】

特定の実施形態では、抗原に対する反応により上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの全てまたは実質的に全てが、１つ以下のヒトＶセグメントおよび１つ以下のヒトＪセグメントに由来する可変ドメインを含み、上記可変ドメインが、マウスＩｇＧ定常領域に融合しており、上記ＩｇＧが、マウスＣ_Ｌ領域と融合しているヒトＶ_Ｌドメインを含む軽鎖をさらに含む。特定の実施形態では、上記マウスＣ_Ｌ領域と融合しているＶ_Ｌドメインが、ヒトＶκセグメントおよびヒトＪκセグメントに由来する。特定の実施形態では、上記マウスＣ_Ｌ領域と融合しているＶ_Ｌドメインが、ヒトＶλセグメントおよびヒトＪλセグメントに由来する。

【0045】

一態様では、Ｃ_Ｈ領域を含むポリペプチドにおける第１のＣＤＲ３およびＣ_Ｌ領域を含むポリペプチドにおける第２のＣＤＲ３を含むＩｇＧを作製するマウスであって、ここで、上記第１のＣＤＲ３および上記第２のＣＤＲ３の両方が、各々個別に２つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、上記２つの遺伝子セグメントが、本質的にＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントからなるマウスが提供される。一実施形態では、上記Ｃ_Ｈ領域を含むポリペプチドにおけるＣＤＲ３が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含むＣＤＲ３のヌクレオチド配列に由来する配列を含む。

【0046】

一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントおよび上記Ｊ_Ｌセグメントが、ヒト遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントおよび上記Ｊ_Ｌセグメントが、κ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記Ｖ_Ｌセグメントおよび上記Ｊ_Ｌセグメントが、λ遺伝子セグメントである。

【0047】

一態様では、Ｃ_Ｈ領域を含む第１のポリペプチドにおける第１のＣＤＲ３およびＣ_Ｌ領域を含む第２のポリペプチドにおける第２のＣＤＲ３を含むＩｇＧを作製するマウスであって、ここで、上記第１のＣＤＲ３および上記第２のＣＤＲ３の両方が、各々アミノ酸の配列を含み、ここで、上記アミノ酸のうちの７５％超がＶ遺伝子セグメントに由来するマウスが提供される。一実施形態では、上記Ｃ_Ｈ領域を含むポリペプチドにおけるＣＤＲ３が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含むＣＤＲ３のヌクレオチド配列に由来する配列を含む。

【0048】

一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３のアミノ酸のうちの８０％超、９０％超、または９５％超、ならびに上記第２のＣＤＲ３のアミノ酸のうちの８０％超、９０％超、または９５％超が、軽鎖Ｖセグメントに由来する。

【0049】

一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３のうちの２つ以下のアミノ酸が、軽鎖Ｖセグメント以外の遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、上記第２のＣＤＲ３のうちの２つ以下のアミノ酸が、軽鎖Ｖセグメント以外の遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、上記第１のＣＤＲ３のうちの２つ以下のアミノ酸および上記第２のＣＤＲ３のうちの２つ以下のアミノ酸が、軽鎖Ｖセグメント以外の遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、上記ＩｇＧのＣＤＲ３が、Ｄ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含まない。一実施形態では、第１のポリペプチドのＣＤＲ３が、Ｄセグメントに由来する配列を含まない。

【0050】

一実施形態では、上記Ｖセグメントが、ヒトＶ遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントである。

【0051】

一実施形態では、上記第１および／または上記第２のＣＤＲ３が、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの体細胞超変異を有する。一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３ が１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含む核酸配列によりコードされる。

【0052】

一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３が、ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸から本質的になり、上記第２のＣＤＲ３が、ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸から本質的になる。一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含む核酸配列に由来する。一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３が、２つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、上記２つ以下の遺伝子セグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントであり、かつ、上記第２のＣＤＲ３が、２つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、上記２つ以下の遺伝子セグメントが、ヒトＪκセグメント、ヒトＪλセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントから選択されるヒトＶκ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３が、２つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、上記２つ以下の遺伝子セグメントが、ヒトＪκセグメント、ヒトＪλセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントから選択されるヒトＶλセグメントおよびＪセグメントである。

【0053】

一態様では、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含有しないＩｇＧであって、ここで、マウスＣ_Ｌ領域と融合している第１のＶ_Ｌドメインを有する第１のポリペプチド、およびマウスＣ_Ｈ領域と融合している第２のＶ_Ｌドメインを有する第２のポリペプチドを含み、ここで、上記第１のＶ_Ｌドメインおよび上記第２のＶ_Ｌドメインが同一ではないＩｇＧを作製するマウスが提供される。一実施形態では、上記第１および第２のＶ_Ｌドメインが、異なるＶセグメントに由来する。別の実施形態では、上記第１および第２のＶ_Ｌドメインが、異なるＪセグメントに由来する。一実施形態では、上記第１および第２のＶ_Ｌドメインが、同一のＶセグメントおよびＪセグメントに由来し、ここで、上記第２のＶ_Ｌドメインが、上記第１のＶ_Ｌドメインと比較してより多数の体細胞超変異を含む。

【0054】

一実施形態では、上記第１および上記第２のＶ_Ｌドメインが、ヒトＶ_ＬドメインおよびマウスＶ_Ｌドメインから個別に選択される。一実施形態では、上記第１および第２のＶ_Ｌドメインが、ＶκドメインおよびＶλドメインから個別に選択される。特定の実施形態では、上記第１のＶ_Ｌドメインが、ＶκドメインおよびＶλドメインから選択され、上記第２のＶ_Ｌドメインが、Ｖκドメインである。別の特定の実施形態では、上記Ｖκドメインが、ヒトＶκドメインである。

【0055】

一態様では、上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの全てまたは実質的に全てが、マウスＣ_Ｌドメインと融合している第１のヒトＶ_Ｌドメインを有する軽鎖、およびマウスＣ_Ｈドメインと融合している第２のヒトＶ_Ｌドメインを有する重鎖から本質的になるマウスが提供される。

【0056】

一実施形態では、上記マウスＣ_Ｈドメインと融合させるヒトＶ_Ｌドメインが、ヒトＶκドメインである。

【0057】

一実施形態では、上記第１および上記第２のヒトＶ_Ｌドメインが同一ではない。

【0058】

一態様では、マウスであって、ここで、上記マウスにより作製される免疫グロブリンＧのうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または約１００％が、（ａ）免疫グロブリンＶ_Ｌドメインおよび免疫グロブリンＣ_Ｌ領域から本質的になる第１のポリペプチドと、（ｂ）５３５アミノ酸以下の長さの第２のポリペプチドであって、ここで、Ｃ_Ｈ領域およびＤ_Ｈ遺伝子セグメントに由来する配列を欠くＶドメインから本質的になる上記第２のポリペプチドとの二量体から本質的になる、マウスが提供される。

【0059】

一実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５３５アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５３０アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５２５アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５２０ アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５１５アミノ酸の長さである。

【0060】

一実施形態では、上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの約９０％以上において、上記第２のポリペプチドが、約５３５アミノ酸以下の長さである。

【0061】

一実施形態では、上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの約５０％以上において、上記第２のポリペプチドが、約５３５アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、マウスにより作製される免疫グロブリンＧのうちの約５０％以上において、第２のポリペプチドが、約５３０、５２５、５２０、５１５、５１０、５０５、５００、４９５、４９０、４８５、４８０、４７５、４７０、４６５、４６０、４５５、または４５０アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上が、上記列挙される長さのＩｇＧである。特定の実施形態では、上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの全てまたは実質的に全てが、上記列挙される長さのＩｇＧである。

【0062】

一実施形態では、上記第２のポリペプチドのＶドメインが、Ｖ_Ｌドメインである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドのＶドメインが、ＶκドメインおよびＶλドメインから選択される。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドのＶドメインが、ヒトＶκドメインまたはヒトＶλドメインである。

【0063】

一態様では、マウスの生殖系列におけるヌクレオチド配列から、軽鎖可変配列（例えば、Ｖ配列および／またはＪ配列）、Ｄ_Ｈ配列、および重鎖定常領域を含むポリペプチドを発現するマウスが提供される。

【0064】

一実施形態では、上記マウスが、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス内因性重鎖遺伝子座可変遺伝子セグメントの、マウス内因性重鎖遺伝子座における、複数のヒト遺伝子セグメントによる置き換えを含む、上記マウス内因性重鎖遺伝子座に由来するポリペプチドを発現する。

【0065】

一実施形態では、上記ポリペプチドが、Ｖλ遺伝子セグメントまたはＶκ遺伝子セグメントに由来するＶ_Ｌ配列を含み、上記ポリペプチドが、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントに由来するＣＤＲ３を含み、上記ポリペプチドが、Ｊ_Ｈ遺伝子セグメントまたはＪλ遺伝子セグメントもしくはＪκ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。

【0066】

一実施形態では、上記マウスは、マウス内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含み、その遺伝子座は、全ての機能的なＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１または複数のヒト軽鎖Ｖλ遺伝子セグメントによる置き換えを含み、ここで、１または複数のヒトＶλセグメントの各々が、下流側で、２３マーのスペースを置いた（２３−ｍｅｒ ｓｐａｃｅｄ）組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を近接させており、ここで、上記Ｖλセグメントが、１２マーのスペースを置いたＲＳＳを上流および下流で近接させているヒトＤ_ＨセグメントまたはマウスＤ_Ｈセグメントに作動可能に連結されており、上記Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントが、そのＤ_Ｈ遺伝子セグメントを近接させている上記１２マーのスペースを置いたＲＳＳで組み換える（ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）のに適する、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するＪセグメントと作動可能に連結され、ここで、上記Ｖセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪセグメントが、重鎖定常領域をコードする核酸配列に作動可能に連結される。

【0067】

一実施形態では、上記マウスは、マウス内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含み、その遺伝子座は、全ての機能的なＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１２マーのスペースを置いた組換えシグナル配列（ＲＳＳ）と各々が下流側で近接する１または複数のヒトＶκ遺伝子セグメントによる置き換えを含み、ここで、上記Ｖセグメントが、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流の両方で近接するヒトＤ_ＨセグメントまたはマウスＤ_Ｈセグメントに作動可能に連結され、上記Ｄ_Ｈセグメントが、上記Ｄ_Ｈセグメントを近接させる上記２３マーのスペースを置いたＲＳＳで組み換えるのに適する、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと上流側で近接するＪセグメントと作動可能に連結され、ここで、上記Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント、および遺伝子セグメントが、重鎖定常領域をコードする核酸配列に作動可能に連結される。

【0068】

一実施形態では、上記重鎖定常領域が、マウス内因性重鎖定常領域である。一実施形態では、その核酸配列が、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択される配列をコードする。一実施形態では、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、およびＣ_Ｈ３配列のうちの１または複数が、ヒト配列である。

【0069】

一実施形態では、上記マウスは、マウス内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含み、その遺伝子座は、全ての機能的なＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと各々が下流で近接する複数のヒトＶλ遺伝子セグメントまたはヒトＶκ遺伝子セグメント、１２マーのスペースを置いたＲＳＳによって上流および下流の両方で近接させられた複数のヒトＤ_Ｈセグメント、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流の両方で近接する複数のヒトＪセグメント（Ｊ_ＨセグメントまたはＪλセグメントもしくはＪκセグメント）による置き換えを含み、ここで、上記遺伝子座が、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択されるマウス内因性定常領域配列を含む。特定の実施形態では、上記マウスが、全てのまたは実質的に全ての機能的なヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメント、全てのまたは実質的に全ての機能的なヒトＤ_Ｈセグメント、および全てのまたは実質的に全てのＪ_ＨセグメントまたはＪλセグメントもしくはＪκセグメントを含む。

【0070】

一実施形態では、上記マウスが、（ａ）マウス配列を含む重鎖定常配列に連結されたヒト軽鎖配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ヒト軽鎖定常配列またはマウス軽鎖定常配列に連結されたヒト軽鎖可変領域を含むポリペプチドとを含む抗原結合タンパク質を発現する。特定の実施形態では、上記軽鎖配列が、ヒト軽鎖配列であり、抗体をＦｃおよびＦａｂへと切断することが可能であるプロテアーゼに曝露されると、少なくとも４つの軽鎖ＣＤＲを含む完全ヒトＦａｂが形成され、ここで、少なくとも４つの上記軽鎖ＣＤＲが、λ配列、κ配列、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、上記Ｆａｂが、少なくとも５つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、上記Ｆａｂが、６つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、上記Ｆａｂの少なくとも１つのＣＤＲが、ＶλセグメントまたはＶκセグメントに由来する配列を含み、少なくとも１つのＣＤＲが、Ｄセグメントに由来する配列をさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの上記ＣＤＲがＣＤＲ３であり、上記ＣＤＲがヒトＶκセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪκセグメントに由来する。

【0071】

一実施形態では、上記ポリペプチドが、ヒトＶλ遺伝子セグメントまたはヒトＶκ遺伝子セグメント、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントまたはヒトＪλ遺伝子セグメントもしくはヒトＪκ遺伝子セグメントに由来する可変領域を含む。特定の実施形態では、上記重鎖定常配列が、ヒトＣ_Ｈ１配列およびマウスＣ_Ｈ２配列およびマウスＣ_Ｈ３配列に由来する。

【0072】

一態様では、ヒトＪ遺伝子セグメントおよび重鎖定常領域配列に作動可能に連結した、再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントまたはヒトＶλ遺伝子セグメントをマウスの生殖系列に含むマウスであって、ここで、重鎖定常領域と融合しているヒトＶκドメインを含むＶ_Ｌ結合タンパク質を発現し、移行Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｈｉＩｇＤ^ｉｎｔ）、および成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｉｎｔＩｇＤ^ｈｉ）を含めたＣＤ１９^＋Ｂ細胞においてＶ_Ｌ結合タンパク質を発現する脾性Ｂ細胞集団を呈示する、マウスが提供される。

【0073】

一態様では、ヒトＪ遺伝子セグメントおよび重鎖定常領域配列に作動可能に連結した、再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントまたはヒトＶλ遺伝子セグメントをマウスの生殖系列に含むマウスであって、ここで、Ｂ細胞において重鎖定常領域と融合している軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、マウスの骨髄中のリンパ球集団が、野生型マウスのプロ／プレＢ細胞集団（骨髄中のリンパ球）とほぼ同じ数であるプロ／プレＢ細胞集団を呈示する、マウスが提供される。

【0074】

一実施形態では、上記マウスが、少なくとも６つの再構成されていないｈＶκ遺伝子セグメントおよび１または複数の再構成されていないｈＪκ遺伝子セグメントを含み、上記マウスが、Ｖ_Ｌ結合タンパク質を発現する、リンパ球ゲーティングされ、かつＩｇＭ^＋の脾細胞集団を含み、これらの集団が、野生型マウスの、リンパ球ゲーティングされ、かつＩｇＭ^＋の脾細胞集団の少なくとも７５％の大きさである。

【0075】

一実施形態では、上記マウスが、全体の約９０％を占めるＩｇＤ^＋細胞およびＩｇＭ^＋細胞による、成熟Ｂ細胞ゲーティングされる（ＣＤ１９^＋）脾細胞集団を呈示し、一実施形態では、改変マウスのＩｇＤ^＋細胞およびＩｇＭ^＋細胞による、成熟Ｂ細胞ゲーティングされる（ＣＤ１９^＋）脾細胞集団が、成熟Ｂ細胞ゲーティングされる（ＣＤ１９^＋）脾細胞集団である、野生型マウスのＩｇＤ^＋細胞およびＩｇＭ^＋細胞の全体とほぼ同じ（例えば、１０％以内、または５％以内）である。

【0076】

一態様では、マウスの生殖系列における改変された内因性重鎖遺伝子座に由来する免疫グロブリンタンパク質を発現するマウスであって、ここで、上記改変された内因性重鎖遺伝子座が、機能的なマウス重鎖Ｖ遺伝子セグメントを欠き、かつ上記遺伝子座が、再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび再構成されていないＪ遺伝子セグメントを含み、ここで、上記再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび再構成されていないＪ遺伝子セグメントが、重鎖定常領域配列と作動可能に連結され、ここで、上記免疫グロブリンタンパク質が、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドから本質的になり、ここで、上記第１のポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖配列および免疫グロブリン重鎖定常配列を含み、かつ、上記第２のポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域を含む、マウスが提供される。

【0077】

一態様では、免疫グロブリンタンパク質を発現するマウスであって、ここで、上記免疫グロブリンタンパク質が、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを欠き、上記免疫グロブリンタンパク質が、軽鎖遺伝子に由来する第１の可変ドメイン、および軽鎖遺伝子に由来する第２の可変ドメインを含み、ここで、上記第１の可変ドメインおよび上記第２の可変ドメインが、互いに関してコグネイトであり、ここで、上記第１および上記第２の軽鎖可変ドメインが、同一ではなく、かつ、ここで、上記第１および上記第２の軽鎖可変ドメインが会合し、会合すると対象の抗原に特異的に結合する、マウスが提供される。

【0078】

一態様では、マウスの生殖系列における再構成されていない遺伝子セグメントから、再構成されていないヒト遺伝子セグメントから本質的になる遺伝子セグメントに完全に由来する可変領域を含む免疫グロブリンタンパク質を作製するマウスであって、ここで、上記免疫グロブリンタンパク質が、免疫グロブリン軽鎖定常配列およびＣ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せからなる群から選択される免疫グロブリン重鎖定常配列を含む、マウスが提供される。

【0079】

一態様では、マウスの生殖系列における再構成されていない遺伝子セグメントから、可変領域を含む、免疫グロブリンタンパク質を作製するマウスであって、ここで、全ての可変領域の全てのＣＤＲ３が、もっぱら軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（必要に応じて、１または複数の体細胞超変異（例えば、１または複数のＮ付加）のある）から生成する、マウスが提供される。

【0080】

一態様では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントに由来する、体細胞変異している免疫グロブリンタンパク質をマウスの生殖系列に作製するマウスであって、ここで上記免疫グロブリンタンパク質が、Ｄ遺伝子セグメントに由来する配列を含むＣＤＲを欠き、ここで上記免疫グロブリンタンパク質が、軽鎖定常領域と融合している軽鎖可変ドメインにおける第１のＣＤＲ３を含み、重鎖定常領域と融合している軽鎖可変ドメインにおける第２のＣＤＲ３を含み、かつ、ここで上記第２のＣＤＲ３が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含む、再構成された軽鎖可変領域配列に由来する、マウスが提供される。

【0081】

一態様では、本明細書で記載されるマウスであって、λ遺伝子座、κ遺伝子座、およびこれらの組合せから選択される、機能的にサイレンシングされた軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一実施形態では、λ遺伝子座および／またはκ遺伝子座が非機能性となるように、上記マウスが、全体的または部分的に、λ遺伝子座および／またはκ遺伝子座の欠失を含む。

【0082】

一態様では、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞を含むマウス胚が提供される。一実施形態では、上記マウスが、キメラであり、その胚の細胞のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、本明細書で記載される、改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む。一実施形態では、上記胚の細胞のうちの少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．８％が、本明細書で記載される、改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む。一実施形態では、上記胚が、宿主細胞およびドナーＥＳ細胞に由来する細胞を含み、ここで、上記ドナーＥＳ細胞に由来する細胞が、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む。一実施形態では、上記胚が、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、または６４細胞期の宿主胚、または胚盤胞であり、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含むドナーＥＳ細胞をさらに含む。

【0083】

一態様では、本明細書で記載される核酸構築物を用いて作製されたマウスまたは細胞が提供される。

【0084】

一態様では、本明細書で記載される細胞を用いて作製されたマウスが提供される。一実施形態では、上記細胞が、マウスＥＳ細胞である。

【0085】

一態様では、第２のヒト軽鎖免疫グロブリン可変配列（Ｖ_Ｌ２）とコグネイトである、第１のヒト軽鎖免疫グロブリン可変配列（Ｖ_Ｌ１）をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、ここで、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域（ポリペプチド１）と融合している上記Ｖ_Ｌ１が、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域（ポリペプチド２）と融合しているＶ_Ｌ２とともに、ポリペプチド１／ポリペプチド２の二量体として発現してＶ_Ｌ１−Ｖ_Ｌ２抗体を形成する。

【0086】

一態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖配列と融合しているヒト免疫グロブリン軽鎖可変配列をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、ここで上記核酸配列がヒトＶ_Ｌ−Ｃ_Ｈポリペプチドをコードし、ここで上記ヒトＶ_Ｌ−Ｃ_Ｈポリペプチドが二量体として発現し、かつ、ここで上記二量体が免疫グロブリン軽鎖の非存在下において（例えば、ヒトλ軽鎖またはヒトκ軽鎖の非存在下において）発現する。一実施形態では、そのＶ_Ｌ−Ｃ_Ｈ二量体が、λ軽鎖の非存在下において、かつ、κ軽鎖の非存在下において、対象の抗原に特異的に結合する。

【0087】

一態様では、免疫グロブリン可変ドメインの全部または一部をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用。一実施形態では、上記免疫グロブリン可変ドメインが、ヒトＶλドメインまたはヒトＶκドメインである。

【0088】

一態様では、完全ヒトＦａｂ（ヒト軽鎖定常領域と融合している第１のヒトＶ_Ｌ、およびヒト重鎖定常領域配列と融合している第２のヒトＶ_Ｌを含む）または完全ヒトＦ（ａｂ）_２を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。

【0089】

一態様では、不死化細胞系を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一実施形態では、上記不死化細胞系が、マウス定常領域核酸配列を含む核酸配列に作動可能に連結したヒトＶλドメインまたはヒトＶκドメインをコードする核酸配列を含む。

【0090】

一態様では、ハイブリドーマまたはクァドローマを作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。

【0091】

一態様では、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞が提供される。一実施形態では、上記細胞が、全能性細胞、多能性細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、およびＥＳ細胞から選択される。特定の実施形態では、上記細胞が、マウス細胞、例えば、マウスＥＳ細胞である。一実施形態では、上記細胞が、上記改変された免疫グロブリン遺伝子座についてホモ接合性である。

【0092】

一態様では、ヒト重鎖定常領域配列に融合した、体細胞変異させた、第１のヒトＶκ配列または第１のヒトＶλ配列を含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞が提供される。

【0093】

一実施形態では、上記細胞は、ヒト軽鎖定常領域配列と融合させた、体細胞変異させた、第２のヒトＶκ配列または第２のヒトＶλ配列を含む第２のポリペプチド鎖をさらに含む。

【0094】

一実施形態では、上記第１のポリペプチドの上記ヒトＶκ配列または上記ヒトＶλ配列が、上記第２のポリペプチドの上記ヒトＶκ配列または上記ヒトＶλ配列とコグネイトである。

【0095】

一実施形態では、上記第１のポリペプチドの上記Ｖκまたは上記Ｖλおよび上記第２のポリペプチドの上記ヒトＶκまたは上記ヒトＶλが、会合すると、対象の抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、上記第１のポリペプチドが、ヒトＶκから本質的になる可変ドメインを含み、上記第２のポリペプチドが、上記第１のポリペプチドのヒトＶκとコグネイトであるヒトＶκからなる可変ドメインを含み、上記ヒト定常領域配列が、ＩｇＧ配列である。

【0096】

一実施形態では、上記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現するヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。

【0097】

一態様では、本明細書で記載される遺伝子改変を含む染色体を含むマウス体細胞が提供される。

【0098】

一態様では、本明細書で記載される遺伝子改変を含む核酸配列を含むマウス胚細胞が提供される。

【0099】

一態様では、本明細書で記載されるマウスに由来する多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞が提供される。特定の実施形態では、上記細胞が、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。

【0100】

一態様では、マウス、細胞、または治療用タンパク質（例えば、抗体または他の抗原結合タンパク質）を製造するための、本明細書で記載される細胞の使用が提供される。

【0101】

一態様では、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントを含む核酸構築物が提供される。特定の実施形態では、上記核酸構築物が、ヒトＶκ遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列に相同な相同性アームを含む。一実施形態では、ターゲティング構築物は、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で各々が近接する、全てのまたは実質的に全てのヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

【0102】

一態様では、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するヒトＪκ遺伝子セグメントを含む核酸構築物が提供される。特定の実施形態では、上記核酸構築物が、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトゲノムＤ_Ｈ遺伝子配列に対する相同性を含有する第１の相同性アームを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、ヒトゲノムＪ遺伝子配列に対する相同性を含有するか、またはマウス重鎖定常領域配列に対する相同性を含有するか、またはマウス定常領域重鎖配列の上流におけるＪ−Ｃ遺伝子間配列に対する相同性を含有する第２の相同性アームを含む。

【0103】

一態様では、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと下流で近接するヒトＶλセグメント、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤ_Ｈセグメント、ならびに２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するＪκセグメント、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するヒトＪλセグメント、および、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するヒトＪ_Ｈセグメントから選択されるヒトＪセグメントを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、上記構築物が、マウス定常領域配列、マウスＪ−Ｃ遺伝子間配列、および／またはヒトＶλ配列に対する相同性を含有する相同性アームを含む。

【0104】

一実施形態では、上記核酸構築物が、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片が、ｈＶλ３−２７〜ｈＶλ３−１に及ぶ。

【0105】

一実施形態では、上記核酸構築物が、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片が、ｈＶλ５−５２〜ｈＶλ１−４０に及ぶ。

【0106】

一実施形態では、核酸構築物が、クラスターＡのゲノム断片およびクラスターＢのゲノム断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターＡの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。

【0107】

一実施形態では、上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＣの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。

【0108】

一態様では、通常天然ではＪκセグメント、Ｊ_Ｈセグメント、Ｖλセグメント、またはＶ_Ｈセグメントのいずれかと隣接して見出される、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤ_Ｈセグメントを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、上記核酸構築物が、ヒトＶ−Ｊ遺伝子間領域に相同であるか、またはヒトＶ遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列に相同な、第１の相同性アームを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、ヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列に相同な、第２の相同性アームを含む。特定の実施形態では、上記ヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列が、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、上記核酸構築物が、上流で１２マーのＲＳＳと隣接するヒトＪ遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、１２マーのＲＳＳと上流で隣接するＪ遺伝子セグメントに対する相同性を含有する第２の相同性アームを含む。一実施形態では、上記Ｊ遺伝子セグメントが、ヒトＪκセグメント、ヒトＪλセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントから選択される。

【0109】

一態様では、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤ_Ｈセグメント、ならびに部位特異的リコンビナーゼの認識配列、例えば、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、またはＤｒｅタンパク質などの部位特異的リコンビナーゼにより認識される配列を含む核酸構築物が提供される。

【0110】

一態様では、ヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメント、１２マーまたは２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するＤ_Ｈセグメント、ならびに１２マーまたは２３マーのスペースを置いたＲＳＳを伴うヒトＪセグメントを含み、ここで上記１２マーまたは２３マーのスペースを置いたＲＳＳが、上記ヒトＪセグメントに対して（すなわち、転写方向に対して ）すぐの５’側に位置する核酸構築物が提供される。一実施形態では、上記構築物が、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと３’側で近接するヒトＶλセグメント、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤ_Ｈセグメント、ならびに、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと５’側で近接するヒトＪκセグメントを含む。一実施形態では、上記構築物が、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと３’側で近接するヒトＶκ、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤ_Ｈセグメント、ならびに、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと５’側で近接するヒトＪλセグメントを含む。

【0111】

一態様では、ターゲティングベクターであって、（ａ）ヒトターゲティングアームおよびマウスターゲティングアームから個別に選択され、そのベクターを、内因性免疫グロブリンＶ領域遺伝子の遺伝子座または改変された免疫グロブリンＶ領域遺伝子の遺伝子座へと方向付ける、第１のターゲティングアームおよび第２のターゲティングアームと、（ｂ）（ｉ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１、（ｉｉ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１〜Ｊκ２、（ｉｉｉ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１〜Ｊκ３、（ｉｖ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１〜Ｊκ４、（ｖ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１〜Ｊκ５、（ｖｉ）ｈＶκ３−７〜ｈＶκ１−１６、（ｖｉｉ）ｈＶκ１−１７〜ｈＶκ２−３０、（ｖｉｉｉ）ｈＶκ３−３１〜ｈＶκ２−４０、および（ｉｘ）これらの組合せからなる群から選択される、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの隣接配列、またはヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪκ遺伝子セグメントの隣接配列を含むターゲティングベクターが提供される。

【0112】

一実施形態では、上記ベクターを、内因性免疫グロブリン遺伝子座または改変された免疫グロブリン遺伝子座へと方向付けるターゲティングアームが、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座または改変された免疫グロブリン遺伝子座における配列と同一であるか、または実質的に同一である。

【0113】

一態様では、マウス、細胞、または治療用タンパク質（例えば、抗体または他の抗原結合タンパク質）を製造するための、本明細書で記載される核酸構築物の使用が提供される。

【0114】

一態様では、ヒト用治療剤を製造するための細胞系を作製するための、本明細書で記載されるマウス由来の核酸配列の使用が提供される。一実施形態では、上記ヒト用治療剤が、ヒト重鎖定常配列と融合しているヒト軽鎖可変配列（例えば、ヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメントに由来するヒト軽鎖可変配列）を含む結合タンパク質である。一実施形態では、上記ヒト用治療剤が、ヒトλ免疫グロブリン軽鎖またはヒトκ免疫グロブリン軽鎖である第１のポリペプチド、およびヒト重鎖定常配列と融合しているヒトＶλ可変配列またはヒトＶκ可変配列を含む第２のポリペプチドを含む。

【0115】

一態様では、ヒトＣ_Ｈドメインと融合させた、体細胞変異させた、ヒトＶ_Ｌドメインを含むポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物でトランスフェクトした、哺乳動物細胞を含む発現系が提供される。

【0116】

一実施形態では、上記発現系が、ヒトＣ_Ｌドメインと融合している免疫グロブリンＶ_Ｌドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ここで上記ヒトＣ_Ｌドメインと融合している上記Ｖ_Ｌドメインが、上記ヒトＣ_Ｈドメインと融合している上記Ｖ_Ｌドメインとコグネイト軽鎖である。

【0117】

一実施形態では、上記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、２９３細胞、およびウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）から選択される。

【0118】

一態様では、結合タンパク質を作製する方法であって、Ｖ_Ｌドメインをコードするヌクレオチド配列を、本明細書で記載されるマウスの細胞に由来するＣ_Ｈ領域に融合しているＶ_Ｌ領域をコードする遺伝子から得るステップと、ヒトＣ_Ｈ領域をコードする遺伝子とともにインフレームで上記Ｖ_Ｌ領域配列をコードするヌクレオチド配列をクローニングしてヒト結合タンパク質配列を形成し、適切な細胞において上記ヒト結合タンパク質配列を発現させるステップとを含む方法が提供される。

【0119】

一実施形態では、上記マウスを対象の抗原で免疫し、上記Ｃ_Ｈ領域に融合しているＶ_Ｌ領域が、対象の抗原エピトープに特異的に結合する（例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲にあるＫ_Ｄで特異的に結合する）。一実施形態では、上記Ｃ_Ｈ領域に融合しているＶ_Ｌ領域をコードするヌクレオチド配列を、上記マウスにおいて体細胞変異させる。

【0120】

一実施形態では、上記適切な細胞が、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、クァドローマ、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現するヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。

【0121】

一実施形態では、上記Ｃ_Ｈ領域が、ヒトＩｇＧアイソタイプを含む。特定の実施形態では、上記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択される。別の特定の実施形態では、上記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１である。別の特定の実施形態では、上記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ４である。別の特定の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ４が、改変されたＩｇＧ４である。一実施形態では、上記改変されたＩｇＧ４が、ヒンジ領域における置換を含む。特定の実施形態では、改変されたＩｇＧ４が、野生型ヒトＩｇＧ４と比べて、ＫａｂａｔのＥＵ番号付け指標により番号付けされたアミノ酸残基２２８における置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸残基２２８における置換が、ＫａｂａｔのＥＵ番号付け指標により番号付けされたＳ２２８Ｐ置換である。

【0122】

一実施形態では、上記細胞が、上記Ｃ_Ｈ領域に融合しているＶ_Ｌドメインとコグネイトである軽鎖に由来するＶ_Ｌドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その方法が、ヒトＣκドメインまたはヒトＣλドメインに融合している上記コグネイトＶ_Ｌドメインをコードするヌクレオチド配列を発現するステップをさらに含む。

【0123】

一態様では、遺伝子改変マウスを作製するための方法であって、マウス内因性重鎖遺伝子座において、１または複数のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを、１または複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントで置き換えるステップを含む方法が提供される。一実施形態では、上記置き換えが、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス免疫グロブリン重鎖セグメント（すなわち、Ｖ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメント）の、１または複数の機能的なヒト軽鎖セグメント（すなわち、Ｖ_ＬセグメントおよびＪ_Ｌセグメント）による置き換えである。一実施形態では、上記置き換えが、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス重鎖Ｖ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントの、全てのまたは実質的に全てのヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメントおよび少なくとも１つのＪλセグメントまたはＪκセグメントによる置き換えである。特定の実施形態では、上記置き換えが、全てのまたは実質的に全ての機能的なヒトＪλセグメントまたはヒトＪκセグメントを包含する。

【0124】

一態様では、マウス重鎖定常領域と融合しているヒト免疫グロブリンＶλセグメントもしくはＶκセグメントおよび／またはヒト免疫グロブリンＪλセグメントもしくはＪκセグメントに由来する配列を含むポリペプチドを発現するマウスを作製するための方法であって、マウス内因性重鎖免疫グロブリン可変セグメント（Ｖ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメント）を、少なくとも１つのヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλセグメントまたはヒトＪκセグメントで置き換えるステップを含み、ここで、上記置き換えを、遺伝子改変されたマウス前駆細胞を形成するための多能性マウス細胞、人工多能性マウス細胞、または全能性マウス細胞における置き換えとし、上記遺伝子改変されたマウス前駆細胞を、マウス宿主に導入し、上記遺伝子改変された前駆細胞を含む上記マウス宿主を懐胎させて、上記遺伝子改変されたマウス前駆細胞に由来するゲノムを含むマウスを形成する方法が提供される。一実施形態では、上記宿主が胚である。特定の実施形態では、上記宿主が、マウスの前桑実胚（ｐｒｅ−ｍｏｒｕｌａ）（例えば、８細胞期または４細胞期）、四倍体胚、胚性細胞塊、または胚盤胞から選択される。

【0125】

一態様では、本明細書で記載される遺伝子改変マウスを作製するための方法であって、核移植によって本明細書で記載される改変を含有する核酸を細胞へと導入するステップと、適切な条件下で上記細胞を維持して、本明細書で記載されるマウスへと発生させるステップ（例えば、上記細胞を培養するステップ、および代理母体において上記細胞を含む胚を懐胎させるステップを含めた）とを含む方法が提供される。

【0126】

一態様では、改変マウスを作製するための方法であって、マウスＥＳ細胞またはマウス多能性細胞もしくはマウス全能性細胞もしくはマウス人工多能性細胞を、本明細書で記載される通り、免疫グロブリン重鎖定常配列に作動可能に連結した、１または複数の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントを包含するように改変するステップと、上記ＥＳ細胞を培養するステップと、その培養ＥＳ細胞を宿主胚へと導入してキメラ胚を形成するステップと、上記キメラ胚を適切な宿主マウスへと導入して改変マウスへと発生させるステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、１または複数の、上記再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、ヒトλ遺伝子セグメントまたはヒトκ遺伝子セグメントである。一実施形態では、１または複数の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、ヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメントおよび１または複数のＪλセグメント、Ｊκセグメント、またはＪ_Ｈセグメントを含む。一実施形態では、上記重鎖定常遺伝子配列が、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択されるヒト配列である。一実施形態では、１または複数の、上記再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントにより、上記マウス内因性重鎖遺伝子座において、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス内因性重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換え、上記重鎖定常配列が、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、およびＣ_Ｈ３配列を含むマウス配列である。

【0127】

一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製された免疫グロブリン可変領域（ＶＲ）（例えば、ヒトＪ_Ｌ配列、またはヒトＪ_Ｈ配列、またはヒトＤ_Ｈ配列およびヒトＪ_Ｈ配列、またはヒトＤ_Ｈ配列およびヒトＪ_Ｌ配列と融合しているヒトＶ_Ｌ配列を含む）が提供される。特定の実施形態では、上記免疫グロブリンＶＲが、ＶκセグメントおよびＶλセグメントから選択される生殖系列のヒト遺伝子セグメントに由来し、ここで上記ＶＲが上記マウスに由来する再構成された配列によりコードされ、ここで上記再構成された配列が体細胞超変異している。一実施形態では、上記再構成された配列が、１〜５カ所の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記再構成された配列が、少なくとも ６、７、８、９、または１０カ所の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記再構成された配列が、１０カ所を超える体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記再構成された配列を、１または複数のヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列（例えば、ヒトまたはマウスのＣ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択される）と融合させる。

【0128】

一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製された結合タンパク質の免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列が提供される。一実施形態では、上記ＶＲを、１または複数のヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列（例えば、ヒトまたはマウスのＣ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択される）と融合させる。

【0129】

一態様では、本明細書で記載されるマウスに由来する核酸配列によりコードされる軽鎖可変ドメインが提供される。

【0130】

一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製されるか、または本明細書で記載されるマウスにおいて作製された配列に由来する、抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、ｓｃＦｖ）が提供される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
マウスであって、重鎖定常領域の核酸配列と作動可能に連結した、再構成されていない軽鎖Ｖセグメントおよび再構成されていないＪセグメントを該マウスの生殖系列に含む、マウス。
（項目２）
上記再構成されていない軽鎖Ｖセグメントが、ヒトκセグメント、ヒトλセグメント、およびこれらの組合せから選択される、項目１に記載のマウス。
（項目３）
上記重鎖定常領域の核酸配列が、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載のマウス。
（項目４）
上記再構成されていない軽鎖Ｖセグメントおよび上記再構成されていないＪセグメントにより、マウス内因性重鎖遺伝子座におけるマウス内因性重鎖Ｖセグメントおよびマウス内因性重鎖Ｊセグメントが置き換えられる、項目１に記載のマウス。
（項目５）
上記再構成されていない軽鎖Ｖセグメントにより、上記マウス内因性重鎖遺伝子座の、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス重鎖Ｖセグメントが置き換えられる、項目４に記載のマウス。
（項目６）
上記再構成されていないＪセグメントが軽鎖Ｊセグメントを含み、該軽鎖Ｊセグメントにより、上記マウス内因性重鎖遺伝子座の、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス重鎖Ｊセグメントが置き換えられる、項目４に記載のマウス。
（項目７）
上記再構成されていない軽鎖Ｖセグメントと上記再構成されていない軽鎖Ｊセグメントとが作動可能に連結され、上記マウスが、上記再構成されていない軽鎖Ｖセグメントと上記再構成されていない軽鎖Ｊセグメントとの間で機能的なＤセグメントを欠いている、項目６に記載のマウス。
（項目８）
上記再構成されていない軽鎖Ｖセグメントがヒトκセグメントであり、上記再構成されていない軽鎖Ｊセグメントがヒトκセグメントである、項目７に記載のマウス。
（項目９）
マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結したヒトκ可変領域を含む再構成された免疫グロブリン遺伝子を上記マウスのゲノムに含むＢ細胞を含む、項目１に記載のマウス。
（項目１０）
上記再構成された免疫グロブリン遺伝子が、マウス内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に位置する、項目１に記載のマウス。
（項目１１）
軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結したヒト軽鎖Ｖセグメントおよびヒト軽鎖Ｊセグメントを上記マウスの生殖系列にさらに含む、項目１に記載のマウス。
（項目１２）
上記軽鎖定常遺伝子が、マウス軽鎖定常遺伝子である、項目１１に記載のマウス。
（項目１３）
上記ヒト軽鎖Ｖセグメントが、ヒトκＶセグメントである、項目１２に記載のマウス。
（項目１４）
上記マウス軽鎖定常遺伝子が、マウスκ軽鎖定常遺伝子である、項目１３に記載のマウス。
（項目１５）
マウスであって、免疫グロブリン重鎖定常領域と融合している第１のヒト軽鎖可変領域配列を含む第１のポリペプチドと、免疫グロブリン軽鎖定常領域と融合している第２のヒト軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチドとを含む免疫グロブリンを該マウスの生殖系列から発現する、マウス。
（項目１６）
上記第１のヒト軽鎖可変領域配列がヒトκ可変領域配列を含み、上記第２のヒト軽鎖可変領域がヒトκ可変領域およびヒトλ可変領域から選択される、項目１５に記載のマウス。
（項目１７）
上記免疫グロブリン重鎖定常領域が、ヒト重鎖定常領域およびマウス重鎖定常領域から選択される、項目１６に記載のマウス。
（項目１８）
上記免疫グロブリン軽鎖定常領域が、ヒト軽鎖定常領域およびマウス軽鎖定常領域から選択される、項目１６に記載のマウス。
（項目１９）
上記第１のポリペプチドを、機能的な内因性重鎖Ｖ遺伝子セグメントを欠く、改変されたマウス内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現する、項目１６に記載のマウス。
（項目２０）
上記第２のポリペプチドを、機能的な内因性軽鎖Ｖ遺伝子セグメントを欠く、改変されたマウス内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現する、項目１９に記載のマウス。
（項目２１）
マウスであって、該マウスの生殖系列におけるマウス内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座で、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス内因性重鎖可変遺伝子セグメントの、少なくとも６つ以上の再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび１または複数の再構成されていないＪ遺伝子セグメントによる置き換えを含み、ここで該再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメントと該Ｊ遺伝子セグメントとが作動可能に連結されており、ここで該マウスは重鎖Ｖ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖を発現することが不可能であり、ここで該マウスは野生型マウスの脾性Ｂ細胞集団（Ｂ２２０^＋／ＩｇＭ^＋）の少なくとも約７５％のサイズである脾性Ｂ細胞集団（Ｂ２２０^＋／ＩｇＭ^＋）を含む、マウス。
（項目２２）
ヒト軽鎖可変ドメインを含む結合タンパク質を生成させるための、上記項目のいずれかに記載のマウスの使用。
（項目２３）
抗体を生成させるための、項目１から２１のいずれかに記載のマウスの使用。
（項目２４）
上記抗体がヒト抗体である、項目２３に記載の使用。
（項目２５）
二重特異性抗体を生成させるための、項目１から２１のいずれか一項に記載のマウスの使用。
（項目２６）
項目１から２１のいずれか一項に記載のマウスに由来する細胞または組織。
（項目２７）
ＥＳ細胞、Ｂ細胞、およびハイブリドーマから選択される、項目２６に記載の細胞。

【図面の簡単な説明】

【0131】

【図1A】図１Ａは、マウス重鎖遺伝子座の概要（一定の拡大比ではない）を例示する図である。マウス重鎖遺伝子座は、約３Ｍｂの長さであり、約２００の重鎖可変（Ｖ_Ｈ）遺伝子セグメント、１３の重鎖多様性（Ｄ_Ｈ）遺伝子セグメント、および４つの重鎖接合（Ｊ_Ｈ）遺伝子セグメントの他、エンハンサー（Ｅｎｈ）および重鎖定常（Ｃ_Ｈ）領域を含有する。

【図1B】図１Ｂは、ヒトκ軽鎖遺伝子座の概要（一定の拡大比ではない）を例示する図である。ヒトκ軽鎖遺伝子座は、それぞれ約４４０ｋｂ〜６００ｋｂにわたる、極性が反対である遠位コンティグおよび近位コンティグへと重複する。その２つのコンティグ間には、Ｖκ遺伝子セグメントを含まないと考えられる、約８００ｋｂのＤＮＡが存在する。ヒトκ軽鎖遺伝子座は、約７６のＶκ遺伝子セグメント、５つのＪκ遺伝子セグメント、イントロンエンハンサー（Ｅｎｈ）、および単一の定常領域（Ｃκ）を含有する。

【図2】図２は、４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するためのターゲティング戦略を示す図である。ハイグロマイシン（ＨＹＧ）選択カセットおよびネオマイシン（ＮＥＯ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。

【図3】図３は、マウスＣ_Ｈ領域に作動可能に連結したヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントを含む、改変されたマウス重鎖遺伝子座を示す図である。

【図4A】図４Ａは、ヒトＶλ遺伝子セグメントおよび単一のヒトＪλ遺伝子セグメントの、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するための例示的なターゲティング戦略を示す図である。ハイグロマイシン（ＨＹＧ）選択カセットおよびネオマイシン（ＮＥＯ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。

【図4B】図４Ｂは、ヒトＶλ遺伝子セグメントおよび４つのヒトＪλ遺伝子セグメントの、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するための例示的なターゲティング戦略を示す図である。ハイグロマイシン（ＨＹＧ）選択カセットおよびネオマイシン（ＮＥＯ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。

【図5A】図５Ａは、ヒトＶλ遺伝子セグメント、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するための例示的なターゲティング戦略を示す図である。ハイグロマイシン（ＨＹＧ）選択カセットおよびネオマイシン（ＮＥＯ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。

【図5B】図５Ｂは、ヒトＶλ遺伝子セグメント、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントの、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するための例示的なターゲティング戦略を示す図である。ハイグロマイシン（ＨＹＧ）選択カセットおよびネオマイシン（ＮＥＯ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。

【図6A】図６Ａは、Ｂ２２０およびＩｇＭの表面発現について染色した、代表的な野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性である代表的なマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）に由来する、脾細胞のコンタープロットを示す図である。

【図6B】図６Ｂは、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞にゲートをかけ、かつ、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）について染色した、代表的な野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性である代表的なマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）に由来する、脾細胞のコンタープロットを示す図である。

【図6C】図６Ｃは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）から採取された脾臓におけるＣＤ１９^＋Ｂ細胞、移行Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｈｉＩｇＤ^ｉｎｔ）、および成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｉｎｔＩｇＤ^ｈｉ）の全個数を示す図である。

【図7A】図７Ａは、単一体（ｓｉｎｇｌｅｔ）にゲートをかけ、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）およびＢ２２０について染色した、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）に由来する、骨髄のコンタープロットを示す図である。ドットプロットの各々では、未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞およびプロ／プレＢ細胞が示される。

【図7B】図７Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）の大腿骨から単離した骨髄におけるプレ／プロＢ細胞（Ｂ２２０^＋ＩｇＭ⁻）、未成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋）、および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｈｉＩｇＭ^＋）の全個数を示す図である。

【図7C】図７Ｃは、ＣＤ１９^＋にゲートをかけ、かつ、ｃｋｉｔ^＋およびＣＤ４３^＋について染色した、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）に由来する、骨髄のコンタープロットを示す図である。ドットプロットの各々では、プロＢ細胞およびプレＢ細胞が示される。

【図7D】図７Ｄは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）の大腿骨から採取した骨髄におけるプロＢ細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３^＋ｃｋｉｔ^＋）およびプレＢ細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３⁻ｃｋｉｔ⁻）の個数を示す図である。

【図7E】図７Ｅは、単一体にゲートをかけ、ＣＤ１９およびＣＤ４３について染色した、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）に由来する、骨髄のコンタープロットを示す図である。ドットプロットの各々では、未成熟Ｂ細胞、プレＢ細胞、およびプロＢ細胞が示される。

【図7F】図７Ｆは、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）を発現するプレＢ細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３^ｉｎｔ）にゲートをかけた、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）に由来する、骨髄のヒストグラムを示す図ある。

【図7G】図７Ｇは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに内因性重鎖遺伝子座に位置する６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）の大腿骨からの骨髄採取物におけるＩｇＭ^＋プレＢ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^＋ＣＤ４３^ｉｎｔ）および未成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^＋ＣＤ４３⁻）の個数を示す図である。

【図8A】図８Ａは、ＣＤ１９^＋にゲートをかけ、かつ、Ｉｇλ^＋およびＩｇκ^＋の発現について染色した、脾細胞のコンタープロットを示す図である。該脾細胞は、野生型重鎖遺伝子座を含み、内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントにより置き換えられているマウス（ＷＴ）、ならびに内因性重鎖遺伝子座における３０のｈＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であり、上記内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントにより置き換えられているマウス（３０ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）に由来する。

【図8B】図８Ｂは、未成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋）および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｈｉＩｇＭ^＋）にゲートをかけ、ＩｇλおよびＩｇκの発現について染色した、マウスの大腿骨から単離された骨髄のコンタープロットを示す図である。該骨髄は、野生型重鎖遺伝子座を含み、内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントにより置き換えられたマウス（ＷＴ）、ならびに内因性重鎖遺伝子座における３０のｈＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であり、上記内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントにより置き換えられたマウス（３０ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）に由来する。

【図9】図９は、マウス重鎖遺伝子座における３０のｈＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であり、内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントにより置き換えられたナイーブマウスの脾細胞ＲＮＡから増幅された１２の個別のＲＴ−ＰＣＲクローンのＶκ−Ｊκ−ｍＩｇＧ接合部のヌクレオチド配列アライメントを示す図である。小文字の塩基は、組換えにおける変異および／またはＮ付加から結果として得られる非生殖系列塩基を示す。人為的スペース（ピリオド）は、フレームワーク４領域を適正に配列させるため、および、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／ｃ、およびＩｇＧ３でプライミングしたクローンについて、マウス重鎖ＩｇＧヌクレオチド配列のアライメントを示すために組み入れられている。

【発明を実施するための形態】

【0132】

「二重特異性結合タンパク質」という語句は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能である結合タンパク質を包含する。二重特異性結合タンパク質は、第１のＣ_Ｈ領域と融合している第１の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）および第２のＣ_Ｈ領域と融合している第２の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）を含む２つの異なるポリペプチドを含む。一般に、上記第１および上記第２のＣ_Ｈ領域は、同一の場合もあり、１または複数のアミノ酸置換（例えば、本明細書で記載されるアミノ酸置換）だけ異なる場合もある。Ｖ_Ｌ１およびＶ_Ｌ２は、異なるエピトープ（２つの異なる分子（例えば、抗原）または同じ分子（例えば、同じ抗原に）に）に特異的に結合する。二重特異性結合タンパク質が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に選択的に結合する場合、上記第１のエピトープに対するＶ_Ｌ１のアフィニティーは一般に、上記第２のエピトープに対するＶ_Ｌ１のアフィニティーより、少なくとも１〜２または３または４桁小さく、Ｖ_Ｌ２についてはその逆である。上記二重特異性結合タンパク質により認識されるエピトープは、同じ標的に存在する場合もあり、異なる標的に存在する場合もある（例えば、同じ抗原に存在する場合もあり、異なる抗原に存在する場合もある）。二重特異性結合タンパク質は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識するＶ_Ｌ１とＶ_Ｌ２とを組み合わせることにより作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識するＶ_Ｌ配列をコードする核酸配列は、異なるＣ_Ｈ領域をコードする核酸配列に融合させることができ、このような配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現させることもでき、免疫グロブリン軽鎖を発現しない細胞内で発現させることもできる。典型的な二重特異性結合タンパク質は、各々が３つの軽鎖ＣＤＲに（Ｎ末端からＣ末端へ）後続するＣ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメイン、およびＣ_Ｈ３ドメインを有する２つの重鎖と、抗原結合特異性は付与しないが、各重鎖と会合し得る免疫グロブリン軽鎖、または各重鎖と会合していることが可能であり、Ｖ_Ｌ１および／もしくはＶ_Ｌ２が結合するエピトープのうちの１または複数に結合し得る免疫グロブリン軽鎖、または各重鎖と会合していることが可能であり、重鎖のうちの一方もしくは両方がエピトープのうちの一方もしくは両方に結合することを可能とするかもしくはそれ支援する免疫グロブリン軽鎖とを有する。

【0133】

したがって、二重特異性結合タンパク質の２つの一般的な種類は、（１）Ｖ_Ｌ１−Ｃ_Ｈ（二量体）、および（２）Ｖ_Ｌ１−Ｃ_Ｈ：軽鎖＋Ｖ_Ｌ２−Ｃ_Ｈ：軽鎖（その軽鎖が同じであるかまたは異なる）である。いずれの場合においても、上記Ｃ_Ｈ（すなわち、上記重鎖定常領域）を、本明細書で記載される通りに示差的に改変することもでき（例えば、プロテインＡに示差的に結合するように改変される、血清半減期を延長するように改変されるなど）、同じとすることもできる。

【0134】

配列を発現させることとの関連で用いられる場合の「細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞を包含する。細胞には、原核生物および真核生物の細胞（単細胞または複数細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種などの株）、ミコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９細胞、ＳＦ−２１細胞、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、Ｂ細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクァドローマなどの細胞融合体が含まれる。一部の実施形態では、上記細胞が、ヒト細胞、サル細胞、類人猿細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、上記細胞が、真核細胞であり、以下の細胞：ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ細胞、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ細胞）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、２９３ ＥＢＮＡ細胞、ＭＳＲ ２９３細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨａＫ細胞、ＢＨＫ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ ５細胞、Ｃｏｌｏ２０５細胞、ＨＢ ８０６５細胞、ＨＬ−６０細胞（例えば、ＢＨＫ２１細胞）、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ａ４３１細胞（上皮細胞）、ＣＶ−１細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、Ｐ２／０細胞、ＮＳ−０細胞、ＭＭＴ ０６０５６２細胞、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞に由来する細胞系から選択される。一部の実施形態では、上記細胞が１または複数のウイルス遺伝子を含み、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）である。

【0135】

「〜とコグネイト」の意味、例えば、第２のＶ_Ｌドメイン「〜とコグネイト」である第１のＶ_Ｌドメインの意味で用いられる場合の「コグネイト」という用語は、本発明に従うマウスにより作製される同じ結合タンパク質に由来する２つのＶ_Ｌドメイン間の関係に対する言及を包含することを意図する。例えば、本発明の実施形態に従い遺伝子改変されているマウス、例えば、Ｖ_Ｈ領域、Ｄ_Ｈ領域、およびＪ_Ｈ領域が、Ｖ_Ｌ領域およびＪ_Ｌ領域で置き換えられた重鎖遺伝子座を有するマウスにより、第１のヒトＶ_Ｌドメインと融合している同じマウスＣ_Ｈ領域（例えば、ＩｇＧアイソタイプ）から作製された２つの同一のポリペプチド鎖、ならびに第２のヒトＶ_Ｌドメインと融合している同じマウスＣ_Ｌ領域から作製された２つの同一のポリペプチド鎖を有する抗体様結合タンパク質が作製される。上記マウスにおけるクローン選択では、単一の抗体様結合タンパク質のコンテクストにおいて共に現れるように、上記第１および上記第２のヒトＶ_Ｌドメインを、クローン選択工程により選択した。したがって、クローン選択工程の結果として、単一の抗体様分子において共に現れる第１および第２のＶ_Ｌドメインを、「コグネイト」と称する。これに対し、第１および第２の抗体様分子が同一の重鎖を有するのでない限り（すなわち、上記第１のヒト重鎖領域に融合しているＶ_Ｌドメインと上記第２のヒト重鎖領域に融合しているＶ_Ｌドメインとが同一でない限り）、上記第１の抗体様分子において現れるＶ_Ｌドメインと上記第２の抗体様分子において現れるＶ_Ｌドメインとはコグネイトとならない。

【0136】

「相補性決定領域」という語句または「ＣＤＲ」という用語は、通常（すなわち、野生型動物では）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域における２つのフレームワーク領域間に現れる、生物の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を包含する。ＣＤＲは、例えば、生殖系列配列、または再構成されているかもしくは再構成されていない配列によりコードされ得、例えば、ナイーブＢ細胞もしくはナイーブＴ細胞または成熟Ｂ細胞もしくは成熟Ｔ細胞によりコードされ得る。一部の状況では（例えば、ＣＤＲ３の場合は）、ＣＤＲが、隣接していない（例えば、再構成されていない核酸配列では）が、Ｂ細胞の核酸配列では、例えば、その配列をスプライシングまたは連結する結果として（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ−Ｄ−Ｊ組換えの結果として）隣接する、２つ以上の配列（例えば、生殖系列配列）によりコードされ得る。

【0137】

「遺伝子セグメント」または「セグメント」という語句は、再構成されたＶ／Ｊ配列またはＶ／Ｄ／Ｊ配列を形成する再構成（例えば、内因性リコンビナーゼにより媒介される）に関与し得る、免疫グロブリン遺伝子座では再構成されていない配列（例えば、ヒトおよびマウスでは）を包含する、Ｖ（重鎖または軽鎖）免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはＤ免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはＪ（重鎖または軽鎖）免疫グロブリン遺伝子セグメントに対する言及を包含する。別段に示されない限り、上記Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメントは、１２／２３ルールによるＶ／Ｊ組換えまたはＶ／Ｄ／Ｊ組換えを可能とする組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含む。別段に示されない限り、上記セグメントは、天然ではそれらが会合する配列またはその機能的な同等物（例えば、Ｖセグメントの場合はプロモーター（複数可）およびリーダー（複数可））をさらに含む。

【0138】

「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という語句は、任意の生物に由来する免疫グロブリン重鎖定常領域配列を包含し、別段に指定されない限り、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を包含する。別段に指定されない限り、Ｖ_Ｈドメインは、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を包含する。重鎖の断片は、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにこれらの組合せを包含する。典型的な重鎖は、以下の可変ドメイン（Ｎ末端からＣ末端へ）：Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ３ドメイン、および、必要に応じて、Ｃ_Ｈ４ドメイン（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＥの場合）、ならびに膜貫通（Ｍ）ドメイン（例えば、リンパ球における膜結合免疫グロブリンの場合）から本質的になる。重鎖定常領域とは、ＦＲ４の外側から上記重鎖のＣ末端へと（Ｎ末端側からＣ末端側へと）広がる重鎖の領域である。わずかな逸脱、例えば、Ｃ末端からの１つ、２つ、３つまたは数個のアミノ酸の切断を伴う重鎖定常領域の他、配列の修飾、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸置換を伴う重鎖定常領域も、「重鎖定常領域」という語句により包含される。アミノ酸置換は、例えば（免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域についてのＥＵ付番を参照すると）、２２８位、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４１位、２４８位、２４９位、２５０位、２５２位、２５４位、２５５位、２５６位、２５８位、２６５位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７６位、２７８位、２８０位、２８３位、２８５位、２８６位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３０８位、３０９位、３１１位、３１２位、３１５位、３１８位、３２０位、３２２位、３２４位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３４２位、３４４位、３５６位、３５８位、３５９位、３６０位、３６１位、３６２位、３７３位、３７５位、３７６位、３７８位、３８０位、３８２位、３８３位、３８４位、３８６位、３８８位、３８９位、３９８位、４１４位、４１６位、４１９位、４２８位、４３０位、４３３位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、および４３９位から選択される１または複数の位置において作製することができる。

【0139】

限定を目的とせずに述べると、例えば、血清半減期の延長（列挙される修飾（複数可）を伴わない、同じ重鎖定常領域と比較した）を呈示させるために、重鎖定常領域を修飾し、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、ならびに２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）における修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）における修飾、または２５０位および／もしくは４２８位における修飾、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位における修飾をもたらすことができる。別の例では、上記修飾が、４２８Ｌの修飾（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓの修飾（例えば、Ｎ４３４Ｓ）、４２８Ｌの修飾、２５９Ｉの修飾（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆの修飾（例えば、Ｖ３０８Ｆ）、４３３Ｋの修飾（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の修飾、２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、３０７位および／もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）の修飾を含み得る。

【0140】

「軽鎖」という語句は、任意の生物に由来する免疫グロブリン軽鎖定常（Ｃ_Ｌ）領域配列を包含し、別段に指定されない限り、ヒトκ軽鎖およびヒトλ軽鎖を包含する。別段に指定されない限り、軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）ドメインは、典型的に、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を包含する。一般に、全長軽鎖（Ｖ_Ｌ＋Ｃ_Ｌ）は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を包含するＶ_Ｌドメイン、およびＣ_Ｌ領域を包含する。本発明と共に用い得る軽鎖（Ｖ_Ｌ＋Ｃ_Ｌ）は、例えば、上記結合タンパク質が選択的に結合する第１のまたは第２の（二重特異性結合タンパク質の場合）エピトープ（例えば、Ｃ_Ｈドメインと融合しているＶ_Ｌドメインが選択的に結合するエピトープ（複数可））に選択的には結合しない軽鎖を包含する。上記Ｃ_Ｈドメインと融合しているＶ_Ｌドメインが結合するエピトープ（複数可）に選択的には結合しないＶ_Ｌドメインは、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリーまたはインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ））において最も一般的に用いられる軽鎖であって、上記結合タンパク質のエピトープ結合ドメインのアフィニティーおよび／または選択性には実質的に干渉しない軽鎖についてのスクリーニングにより同定され得るＶ_Ｌドメインを包含する。適切な軽鎖は、上記Ｃ_Ｈ領域に融合しているＶ_Ｌ領域が特異的に結合するエピトープに結合し得る（単独でまたは上記Ｃ_Ｈ領域と融合しているそのコグネイトＶ_Ｌ領域と組み合わせて）軽鎖を包含する。

【0141】

「マイクロモル濃度の範囲」という語句は、１〜９９９マイクロモル濃度を意味することを意図し、「ナノモル濃度の範囲」という語句は、１〜９９９ナノモル濃度を意味することを意図し、「ピコモル濃度の範囲」という語句は、１〜９９９ピコモル濃度を意味することを意図する。

【0142】

「非ヒト動物」という用語は、円口類、硬骨魚類、サメおよびエイなどの軟骨魚類、両生類、爬虫類、哺乳動物、および鳥類など、任意の脊椎動物を包含することを意図する。適切な非ヒト動物は、哺乳動物を包含する。適切な哺乳動物は、非ヒト霊長動物、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、および齧歯動物を包含する。適切な非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含めた齧歯動物科から選択される。一実施形態では、非ヒト動物が、マウスである。

【0143】

マウス、ヌクレオチド配列、および結合タンパク質
免疫グロブリン遺伝子座のエレメントによりコードされる結合タンパク質であって、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと融合している免疫グロブリン重鎖定常領域を含む結合タンパク質が提供される。さらに、マウスにおける免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座によりコードされるエレメントを含有する結合タンパク質をコードするように遺伝子改変する複数の戦略が提供される。このような遺伝子改変マウスは、免疫グロブリン構造を有するが、従来の抗体を上回る多様性の増強を呈示する結合タンパク質の固有の集団を生成させるための供給源を表す。

【0144】

本明細書で記載される結合タンパク質の態様は、改変された免疫グロブリン遺伝子座によりコードされる結合タンパク質であって、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（またはその一部）を通常（すなわち、野生型動物では）コードする遺伝子セグメントが、重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されるように改変される結合タンパク質を包含する。上記軽鎖遺伝子セグメントが再構成されると、重鎖定常領域をコードする配列と融合している、軽鎖可変ドメインをコードする配列を含む、再構成されたヌクレオチド配列が得られる。この配列は、重鎖定常領域と融合している免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、上記ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖ_Ｌドメイン、Ｃ_Ｈ１領域、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２領域、Ｃ_Ｈ３領域、および、必要に応じて、Ｃ_Ｈ４領域から本質的になる。

【0145】

本明細書で記載される改変されたマウスでは、コグネイト軽鎖であって、一実施形態では、抗体様である結合タンパク質を作製するための、上に記載したポリペプチドを伴うコグネイト軽鎖対もまた含む結合タンパク質が作製されるが、この結合タンパク質は、Ｃ_Ｈ領域に融合しているＶ_Ｌ領域（Ｖ_Ｈ領域ではなく）を含む。

【0146】

多様な実施形態では、上記改変マウスにより、Ｃ_Ｈ領域と融合しているＶ_Ｌ領域（ハイブリッド重鎖）を含む結合タンパク質であって、そのハイブリッド重鎖のＶ_Ｌ領域が体細胞超変異度の増強を呈示する、結合タンパク質が作製される。これらの実施形態では、上記増強がＣ_Ｌ領域と融合しているＶ_Ｌ領域（軽鎖）を上回る。一部の実施形態では、ハイブリッド重鎖のＶ_Ｌ領域が、Ｃ_Ｌ領域と融合しているＶ_Ｌ領域の約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍以上の体細胞超変異を呈示する。一部の実施形態では、抗原に対する反応において改変されたマウスが、ハイブリッド重鎖のＶ_Ｌ領域を含む結合タンパク質の集団であって、上記ハイブリッド重鎖のＶ_Ｌ領域において、平均で、同じ抗原に対する反応において野生型マウスで観察されるハイブリッド重鎖のＶ_Ｌ領域における場合の約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍以上の体細胞超変異を呈示する、結合タンパク質の集団を呈示する。一実施形態では、上記ハイブリッド重鎖のＶ_Ｌ領域における体細胞超変異が、ＣＤＲ３において、１もしくは複数のＮ付加、または２つ以上のＮ付加を含む。

【0147】

多様な実施形態では、上記結合タンパク質が、天然において内因性軽鎖遺伝子座から再構成された軽鎖について観察されるＮ付加より多数のＮ付加を含む免疫グロブリン軽鎖配列によりコードされる可変ドメインを含み、例えば、ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインと融合しているマウス重鎖定常領域、およびヒト（軽鎖または重鎖）Ｊ遺伝子セグメントを含む結合タンパク質であって、上記ヒトＶセグメントおよびヒトＪセグメントが再構成されて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を含む、再構成された遺伝子を形成する、結合タンパク質である。

【0148】

多様な実施形態では、本発明のマウスにより、平均で野生型抗体（すなわち、Ｖ_Ｈドメインを有する抗体）より小型で、より小型のサイズであることと関連した利点を保有する、結合タンパク質が作製される。より小型のサイズは、少なくとも部分的には、通常Ｖ_Ｈドメインに存在する、Ｄ_Ｈ領域によりコードされるアミノ酸配列の非存在により実現される。より小型のサイズはまた、例えば、Ｖκ領域およびＪκ領域に由来するＣＤＲ３の形成によっても実現することができる。

【0149】

別の態様では、体細胞超変異しているＶ_Ｌドメイン、例えば、体細胞変異しているヒトＶκドメイン、および、例えば、１〜１０以上のＮ付加を含む再構成されたκ可変領域遺伝子によりコードされるヒトＶκドメインを有する結合タンパク質の集団を提供するためのマウスおよび方法が提供される。一実施形態では、抗体の多様性を生成させるためのＶ_Ｈ領域の非存在下において、本発明のマウスは、例えば、そのＶドメインがＶ_Ｌドメインに限られるかまたは実質的にＶ_Ｌドメインである抗原による感作に対する反応による結合タンパク質を生成させる。したがって、上記マウスによるクローン選択工程は、Ｖ_ＨドメインではなくＶ_Ｌドメインを有する結合タンパク質だけからの選択、または実質的にＶ_ＨドメインではなくＶ_Ｌドメインを有する結合タンパク質からの選択に限定される。上記Ｖ_Ｌドメインの体細胞超変異は、高頻度であるか、または野生型マウス（これもまた、ある程度の頻度でＶ_Ｌドメインを変異させる）における体細胞超変異より実質的に高頻度である（例えば、２〜５倍以上高頻度である）。本発明のマウスにおけるクローン選択工程は、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲のアフィニティーでエピトープに特異的に結合する結合タンパク質を含め、改変された免疫グロブリン遺伝子座に由来する高アフィニティーの結合タンパク質を生成させる。このような結合タンパク質をコードする配列は、適切な発現系を用いて、ヒト可変領域およびヒト定常領域を含有する治療用結合タンパク質を作製するのに用いることができる。

【0150】

他の実施形態では、本発明によるマウスであって、上記マウス重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座が、無効化されるか、非機能性とされるか、またはノックアウトされ、完全ヒトトランス遺伝子またはヒト−マウスキメラトランス遺伝子がマウスに移入され、ここで上記トランス遺伝子のうちの少なくとも１つが、改変された重鎖遺伝子座（例えば、軽鎖遺伝子セグメントを１または複数の重鎖遺伝子配列に作動可能に連結した）を含有する、マウスを作製することができる。このようなマウスによって、本明細書で記載される結合タンパク質もまた作製することができる。

【0151】

一態様では、体細胞超変異により多様性を増大させるための方法、またはＶ_ＬドメインにおけるＮ付加により多様性を増大させるための方法を含めた、多様性を増大させるための方法であって、再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび再構成されていないＪ遺伝子セグメントを、マウスＣ_Ｈ遺伝子配列と作動可能に連結するステップと、上記動物を対象の抗原に曝露するステップと、上記動物の、再構成され、体細胞超変異しているＶ（軽鎖）／Ｊ遺伝子配列であって、免疫グロブリンＣ_Ｈ領域をコードするヌクレオチド配列と融合している、上記再構成されたＶ（軽鎖）／Ｊ遺伝子配列を上記動物から単離するステップとを含む方法が提供される。

【0152】

一実施形態では、超変異しているＶ_Ｌと融合している免疫グロブリン重鎖がＩｇＭであり、別の実施形態ではＩｇＧであり、別の実施形態ではＩｇＥであり、別の実施形態ではＩｇＡである。

【0153】

一実施形態では、体細胞超変異し、クラススイッチしているＶ_Ｌドメインが、Ｃ_Ｌ配列に作動可能に連結したＶ_Ｌ配列を有する、再構成され、クラススイッチしている抗体について観察される体細胞超変異の約２〜５倍以上を含有する。一実施形態では、体細胞超変異しているＶ_Ｌドメインにおいて観察される体細胞超変異が、Ｃ_Ｈ領域に融合しているＶ_Ｈ遺伝子から発現させたＶ_Ｈドメインにおいて観察される体細胞超変異とほぼ同じ数である。

【0154】

一態様では、高アフィニティーのヒトＶ_Ｌドメインを作製するための方法であって、本発明のマウスを対象の抗原に曝露するステップと、上記マウスに対象の抗原に対する免疫反応を発生させるステップと、対象の抗原に高アフィニティーで特異的に結合する、体細胞変異し、クラススイッチしているヒトＶ_Ｌドメインを、上記マウスから単離するステップとを含む方法が提供される。

【0155】

一実施形態では、体細胞変異し、クラススイッチしているヒトＶ_Ｌドメインを含む結合タンパク質のＫ_Ｄが、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲にある。

【0156】

一実施形態では、上記結合タンパク質が、ポリペプチド二量体から本質的になり、ここで上記ポリペプチドが、ヒトＣ_Ｈ領域と融合しているヒトＶ_Ｌドメインを含む、体細胞変異し、クラススイッチしている結合タンパク質から本質的になる。

【0157】

一実施形態では、上記結合タンパク質が、ポリペプチド二量体および２つの軽鎖から本質的になり、ここで上記ポリペプチドが、ヒトＣ_Ｈ領域と融合しているヒトＶ_Ｌドメインを有する、体細胞変異し、クラススイッチしている結合タンパク質から本質的になり、ここで上記二量体の各ポリペプチドが、コグネイト軽鎖Ｖ_ＬドメインおよびヒトＣ_Ｌ領域を含むコグネイト軽鎖と会合している。

【0158】

一態様では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子配列を体細胞超変異させるための方法であって、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを、マウス内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座においてマウス内因性Ｃ_Ｈ遺伝子と作動可能に連結するステップと、上記マウスを対象の抗原に曝露するステップと、対象の抗原に結合する、体細胞超変異しているヒトＶ_Ｌ遺伝子配列をマウスから得るステップとを含む方法が提供される。

【0159】

一実施形態では、上記方法が、対象の抗原に結合する、体細胞超変異しているヒトＶ_Ｌ遺伝子配列とコグネイトである軽鎖に由来するＶ_Ｌ遺伝子配列をマウスから得るステップをさらに含む。

【0160】

Ｄ_Ｈ配列を伴うＶ_Ｌ結合タンパク質
多様な態様では、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび再構成されていない（例えば、軽鎖または重鎖）Ｊ遺伝子セグメントを含むマウスがまた、Ｊセグメントと組み換えて、再構成されたＤ／Ｊ配列を形成することが可能である、再構成されていないＤ_Ｈ遺伝子セグメントであって、この再構成されたＤ／Ｊ配列を、次に、上記軽鎖Ｖセグメントと共に再構成して、（ａ）軽鎖Ｖセグメント、（ｂ）Ｄ_Ｈセグメント、および（ｃ）（例えば、軽鎖または重鎖）Ｊセグメントに由来する再構成された可変配列を形成することが可能であり、この場合、上記再構成された可変配列が、重鎖定常配列に作動可能に連結される（例えば、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびこれらの組合せから選択される重鎖定常配列に作動可能に連結される、例えば、マウスまたはヒトのＣ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３に作動可能に連結される）、再構成されていないＤ_Ｈ遺伝子セグメントも含む。

【0161】

多様な態様では、再構成されていないヒト軽鎖ＶセグメントおよびＪセグメントを含むマウスであって、ヒトＤセグメントもまた含むマウスが、例えば、ＣＤＲ３配列の多様性を増大させた供給源として有用である。通常、ＣＤＲ３配列は、Ｖ／Ｊ組換えに由来する軽鎖、およびＶ／Ｄ／Ｊ組換えに由来する重鎖において生じる。組換えにおいて生じるヌクレオチド付加（例えば、Ｎ付加）によりさらなる多様性が提供されるが、また、体細胞超変異の結果として生じるヌクレオチド付加によってもさらなる多様性が提供される。ＣＤＲ３配列により付与される結合特徴は一般に、場合によって、軽鎖ＣＤＲ３配列、重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに軽鎖ＣＤＲ３配列および重鎖ＣＤＲ３配列の組合せにより付与される結合特徴に限定される。しかし、本明細書で記載されるマウスでは、第１の軽鎖ＣＤＲ３（その重鎖ポリペプチドにおける）および第２の軽鎖ＣＤＲ３（その軽鎖ポリペプチドにおける）の組合せの結果として付与される結合特徴のために、多様性の供給源の追加が可能である。本明細書で教示されるＲＳＳ操作を用いてＤセグメントに作動可能に連結し、かつ、Ｊセグメント（軽鎖または重鎖）にも作動可能に連結した、軽鎖Ｖ領域に由来する再構成されていないＶセグメントを含む、本明細書で記載されるとおり、マウスに由来するような、上記第１の軽鎖ＣＤＲ３が、Ｄ遺伝子セグメントに由来する配列を含有する場合は、さらなる多様性が可能である。

【0162】

多様性の別の供給源は、記載されるマウスにおいて可能なＶ（軽鎖）／Ｊ組換えまたはＶ（軽鎖）／Ｄ／Ｊ組換えにおいて生じ得るＮおよび／またはＰ付加である。したがって、本明細書で記載されるマウスは、異なる多様性の供給源（軽鎖間）をもたらすだけでなく、本明細書で記載されるマウスにおける、再構成されたＶ（軽鎖）／Ｊ遺伝子または再構成されたＶ（軽鎖）／Ｄ／Ｊ遺伝子における、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮ付加を追加するために、さらなる多様性の供給源ももたらす。

【0163】

多様な態様では、Ｊ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｖ遺伝子セグメントに作動可能に連結したＤ遺伝子セグメントの使用により、多様性の増強がもたらされる。この場合におけるＤ_Ｈセグメントの作動可能な連結は、このＤセグメントが、それと共に列挙されるＪセグメントと組み換え得ることを必要とする。したがって、上記Ｄセグメントは、上記Ｄセグメントおよび上記Ｊセグメントが再構成されるように、上記Ｊセグメントの上流で近接するＲＳＳと一致する（ｍａｔｃｈｅｄ）、下流のＲＳＳを近接させることを必要とする。さらに、上記Ｄセグメントは、上記再構成されたＤ／Ｊセグメントおよび上記Ｖセグメントが再構成されて可変ドメインをコードする遺伝子を形成するように、上記Ｖセグメントの下流で近接したＲＳＳと一致する、上流で近接した適切なＲＳＳも必要とする。

【0164】

ＲＳＳまたは組換えシグナル配列は、１２塩基対（ｂｐ）または２３塩基対（ｂｐ）の非保存配列により、保存された核酸ノナマー配列から隔てられた、保存された核酸ヘプタマー配列を含む。ＲＳＳは、リコンビナーゼにより、上記１２／２３ルールに従う再構成過程において免疫グロブリン遺伝子セグメントの接合を達成するのに用いられる。上記１２／２３ルールによれば、１２ｂｐの（非保存の）スペーサーを有するＲＳＳと近接する遺伝子セグメントは、２３ｂｐの（非保存の）スペーサーを有するＲＳＳと近接する遺伝子セグメントと共に再構成される、すなわち、各々が１２ｂｐのスペーサーを伴うＲＳＳを有する遺伝子セグメント間の再構成、または各々が２３ｂｐのスペーサーを伴うＲＳＳを有する遺伝子セグメント間の再構成は一般に観察されない。

【0165】

上記λ軽鎖遺伝子座の場合は、可変遺伝子セグメント（Ｖλ遺伝子セグメント）が、２３マーのスペーサーを有するＲＳＳと下流で（Ｖ配列の転写方向に対して）隣接し、接合遺伝子セグメント（Ｊλ遺伝子セグメント）が、１２マーのスペーサーを有するＲＳＳと上流で（上記Ｊ配列の転写方向に対して）隣接する。したがって、ＶλセグメントおよびＪλセグメントは、上記１２／２３ルール下で適合性であるＲＳＳと隣接し、したがって、再構成において組み換えることが可能である。

【0166】

しかし、野生型生物のκ遺伝子座では、各機能的なＶκセグメントが、１２マーのスペーサーを有するＲＳＳと下流で隣接する。したがって、Ｊκセグメントは、Ｊκセグメントの上流側で、２３マーのスペースを近接させる。上記重鎖遺伝子座では、Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントが、２３マーのスペーサーを有するＲＳＳと下流で近接するのに続き、Ｄ_Ｈセグメントが、１２マーのスペーサーと上流および下流で近接し、Ｊ_Ｈセグメントの各々が、そのＪ_Ｈセグメントの上流側で近接する２３マーのセグメントを伴う。上記重鎖遺伝子座では、まず、１２マーのスペーサーを伴う下流のＤ_ＨＲＳＳおよび２３マーのスペーサーを伴う上流のＪ_ＨＲＳＳを介してＤ／Ｊ組換えが生じ、１２マーのスペーサーを伴うＲＳＳを上流側で近接させる、ＲＳＳを有する中間体の再構成Ｄ／Ｊ配列がもたらされる。次いで、１２マーを伴うＲＳＳを上流側で近接させる再構成されたＤ／Ｊセグメントが、２３マーを伴うＲＳＳをその下流側で近接させるＶ_Ｈセグメントと共に再構成されて、再構成されたＶ／Ｄ／Ｊ配列を形成する。

【0167】

一実施形態では、Ｖλセグメントを、ＪλセグメントであるＪ遺伝子セグメントとともに上記重鎖遺伝子座で用い、この場合、上記Ｖλセグメントは、そのＶλ配列の下流側で近接するＲＳＳを含み、そのＲＳＳは、２３マーのスペーサーを含み、上記Ｊセグメントは、その上流側で、１２マーのスペーサーを有するＲＳＳが近接しているＪλセグメント（例えば、天然で見出される）である。

【0168】

一実施形態では、Ｖλセグメントを、Ｊκ遺伝子セグメントまたはＪ_Ｈ遺伝子セグメントであるＪ遺伝子セグメントとともに上記重鎖遺伝子座で用い、この場合、そのＶλ配列は、その下流側で、２３マーのスペーサーを含むＲＳＳを近接させ、上記ＪκセグメントまたはＪ_Ｈセグメントは、その上流側で、１２マーのスペーサーを含むＲＳＳに近接させる。

【0169】

一実施形態では、Ｖλセグメントを、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントとともに上記重鎖遺伝子座で用いる。一実施形態では、上記Ｖλセグメントが、２３マーのスペーサーを有するＲＳＳを伴うそのＶλ配列の下流側で近接するＲＳＳを含み、上記Ｄ_Ｈセグメントが、１２マーのスペーサーを有するＲＳＳを伴うそのＤ_Ｈ配列の上流側および下流側で近接するＲＳＳを含み、Ｊセグメントが、その上流側で、２３マーのスペーサーを有するＲＳＳを近接させ、この場合、Ｊセグメントは、Ｊλ、Ｊκ、およびＪ_Ｈから選択される。

【0170】

一実施形態では、Ｖκセグメントを、Ｊ遺伝子セグメント（Ｄセグメントを介在させない）とともに上記重鎖遺伝子座で用い、この場合、上記Ｖκセグメントは、１２マーのスペースを置いたＲＳＳを含む上記Ｖκセグメントの下流側でＲＳＳを近接させ、上記Ｊセグメントは、その上流側で、２３マーのスペースを置いたＲＳＳを近接させ、上記Ｊκセグメントが、Ｊκセグメント、Ｊλセグメント、およびＪ_Ｈセグメントから選択される。一実施形態では、上記Ｖセグメントおよび／または上記Ｊセグメントが、ヒトＶセグメントおよび／またはヒトＪセグメントである。

【0171】

一実施形態では、上記Ｖκセグメントを、ＤセグメントおよびＪセグメントとともに上記重鎖遺伝子座で用い、この場合、上記Ｖκセグメントは、１２マーのスペースを置いたＲＳＳを含む上記Ｖκセグメントの下流側でＲＳＳを近接させ、上記Ｄセグメントは、その上流側および下流側で、２３マーのスペースを置いたＲＳＳを近接させ、上記Ｊセグメントは、その上流側で、１２マーのスペースを置いたＲＳＳを近接させる。一実施形態では、上記Ｊセグメントが、Ｊκセグメント、Ｊλセグメント、およびＪ_Ｈセグメントから選択される。一実施形態では、上記Ｖセグメントおよび／または上記Ｊセグメントが、ヒトＶセグメントおよび／またはヒトＪセグメントである。

【0172】

その上流端に近接する、２３マーのスペーサーを有するＲＳＳを伴うＪλセグメント、またはその上流端で近接させた、１２マーのスペーサーを有するＲＳＳを伴うＪκセグメントもしくはＪ_Ｈセグメントは、当技術分野において公知である、核酸配列を作製するのに適する任意の方法を用いて作製する。上流で、ＲＳＳを近接させるＪセグメントであって、上記ＲＳＳが選択されたスペーサー（例えば、１２マーまたは２３マーのスペーサー）を有するＪセグメントを作製するのに適する方法は、ヘプタマー、ノナマー、および選択されたスペーサーを含む核酸を化学合成し、これを、化学合成したかまたは適切な供給源（例えば、ヒト配列供給源）からクローニングされるＪセグメント配列に融合させ、その融合させたＪセグメント配列およびＲＳＳをターゲティングベクター内で用いて、上記ＲＳＳ−Ｊを適切な部位に向かわせる。

【0173】

上流および下流で近接する、２３マーのスペースを置いたＲＳＳを伴うＤセグメントは、当技術分野において公知である任意の方法により作製することができる。１つの方法は、上流における２３マーのＲＳＳおよびＤセグメント配列および下流における２３マーのＲＳＳを化学合成するステップと、ＲＳＳに隣接するＤセグメントを適切なベクター内に入れるステップとを含む。上記ベクターは、１または複数のマウスＤセグメントを、上流側および下流側で近接する、１２マーのＲＳＳ配列を伴うヒトＤセグメントで置き換えることを指向する場合もあり、例えば、ヒトＶセグメントとヒトまたはマウスのＪセグメントとの間の位置にあるヒト化遺伝子座に挿入することを指向する場合もある。

【0174】

当技術分野では、ＲＳＳを構築するのに適切なノナマーおよびヘプタマーが公知である（例えば、参照により組み込まれる「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」、７版、Ｍｕｒｐｈｙら（２００８年、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ， ＬＬＣ）、１４８頁、図４．５を参照されたい）。適切な非保存のスペーサー配列には、例えば、ヒト免疫グロブリンまたはマウス免疫グロブリンの遺伝子座のＲＳＳ配列において観察されるスペーサー配列が包含される。

【0175】

二重特異性結合タンパク質
本明細書で記載される結合タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、多重特異性結合タンパク質、例えば、二重特異性結合タンパク質を作製するのに用いることができる。この態様では、本質的にＣ_Ｈ領域と融合している第１のＶ_Ｌドメインから本質的になる第１のポリペプチドが、Ｃ_Ｈ領域と融合している第２のＶ_Ｌドメインから本質的になる第２のポリペプチドと会合することができる。上記第１のＶ_Ｌドメインと上記第２のＶ_Ｌドメインとが異なるエピトープに特異的に結合する場合は、その２つのＶ_Ｌドメインを用いて二重特異性結合分子を作製することができる。上記Ｃ_Ｈ領域は、同じ場合もあり、異なる場合もある。一実施形態では、例えば、上記Ｃ_Ｈ領域のうちの１つが、プロテインＡに対する結合決定基を消失させるように改変され得る一方、他の重鎖定常領域は、そのように改変されない。この特定の配列は、例えば、ホモ二量体（例えば、上記第１のポリペプチドのホモ二量体または第２のポリペプチドのホモ二量体）の混合物からの二重特異性結合タンパク質の単離を単純化する。

【0176】

一態様では、本明細書で記載される方法および組成物を用いて二重特異性結合タンパク質を作製する。この態様では、Ｃ_Ｈ領域に融合している第１のＶ_ＬおよびＣ_Ｈ領域に融合している第２のＶ_Ｌの各々を、同じアイソタイプのヒトＩｇＧ配列（例えば、ヒトＩｇＧ１配列、ヒトＩｇＧ２配列、ヒトＩｇＧ３配列、またはヒトＩｇＧ４配列）とインフレームで個別にクローニングする。上記第１のＶ_Ｌは、第１のエピトープに特異的に結合し、上記第２のＶ_Ｌは、第２のエピトープに特異的に結合する。上記第１および第２のエピトープは、異なる抗原に存在する場合もあり、同じ抗原に存在する場合もある。

【0177】

一実施形態では、上記第１のＶ_Ｌに融合しているＣ_Ｈ領域のＩｇＧアイソタイプと上記第２のＶ_Ｌに融合しているＣ_Ｈ領域のＩｇＧアイソタイプとが同じアイソタイプであるが、１つのＩｇＧアイソタイプが少なくとも１つのアミノ酸置換を含む点で異なる。一実施形態では、少なくとも１つの上記アミノ酸置換により、上記置換を保有する重鎖が、その置換を欠く重鎖と比較して、プロテインＡに結合することが不可能となるかまたは実質的に不可能となる。

【0178】

一実施形態では、上記第１のＣ_Ｈ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第１のＣ_Ｈ３ドメインを含み、上記第２のＣ_Ｈ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第２のＣ_Ｈ３ドメインを含み、ここで上記第２のＣ_Ｈ３ドメインが、上記第２のＣ_Ｈ３ドメインのプロテインＡに対する結合性を低減するかまたは消失させる修飾を含む。

【0179】

一実施形態では、上記第２のＣ_Ｈ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ付番により番号付けられた４３５Ｒ修飾を含む。別の実施形態では、上記第２のＣ_Ｈ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ付番により番号付けられた４３６Ｆ修飾をさらに含む。

【0180】

一実施形態では、上記第２のＣ_Ｈ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ付番により番号付けられたＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉからなる群から選択される修飾を含むヒトＩｇＧ１のＣ_Ｈ３ドメインである。

【0181】

一実施形態では、上記第２のＣ_Ｈ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ付番により番号付けられたＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉからなる群から選択される修飾を含むヒトＩｇＧ２のＣ_Ｈ３ドメインである。

【0182】

一実施形態では、上記第２のＣ_Ｈ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ付番により番号付けられたＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉからなる群から選択される修飾を含むヒトＩｇＧ４のＣ_Ｈ３ドメインである。

【0183】

一実施形態では、上記結合タンパク質が、１または複数の本明細書で列挙される修飾を有するＣ_Ｈ領域を含み、ここで上記結合タンパク質の定常領域が、ヒトにおいて非免疫原性であるかまたは実質的に非免疫原性である。特定の実施形態では、上記Ｃ_Ｈ領域が、ヒトにおいて免疫原性エピトープを提示しないアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、上記結合タンパク質が野生型ヒト重鎖では見出されないＣ_Ｈ領域を含み、そのＣ_Ｈ領域がＴ細胞エピトープを生成させる配列を含まない。

【実施例】

【0184】

以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのようにして作製し用いるかについて記載するように提示されるものであり、本発明者らが自らの発明と考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。別段に示されない限り、温度は摂氏で示し、圧力は大気圧または大気圧近傍とする。

【0185】

（実施例Ｉ）
軽鎖遺伝子セグメントの重鎖遺伝子座への導入
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作法（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ， Ｄ．Ｍ．、Ｍｕｒｐｈｙ， Ａ．Ｊ．、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ， Ｄ．、Ｇａｌｅ， Ｎ．Ｗ．、Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ， Ａ．Ｎ．、Ａｕｅｒｂａｃｈ， Ｗ．、Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ， Ｗ．Ｔ．、Ａｄａｍｓ， Ｎ．Ｃ．、Ｒｏｊａｓ， Ｊ．、Ｙａｓｅｎｃｈａｋ， Ｊ．、Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｓｋｙ， Ｒ．、Ｂｏｕｃｈｅｒ， Ｍ．、Ｅｌｓａｓｓｅｒ， Ａ．Ｌ．、Ｅｓａｕ， Ｌ．、Ｚｈｅｎｇ， Ｊ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｊ．Ａ．、Ｗａｎｇ， Ｘ．、Ｓｕ， Ｈ．、Ｘｕｅ， Ｙ．、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， Ｍ．Ｇ．、Ｎｏｇｕｅｒａ， Ｉ．、Ｔｏｒｒｅｓ， Ｒ．、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ， Ｌ．Ｅ．、Ｓｔｅｗａｒｔ， Ａ．Ｆ．、ＤｅＣｈｉａｒａ， Ｔ．Ｍ．、Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ， Ｇ．Ｄ．（２００３年）、「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２１巻、６５２〜６５９頁を参照されたい）を用いて、マウスゲノムの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを改変するための多様なターゲティング構築物を作製した。再構成されていないヒト生殖系列のκ軽鎖遺伝子配列の挿入（図２の上方）を確保するために、マウスＢＡＣ ＤＮＡを相同組換えにより改変して、Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントのターゲティングされた欠失を介してマウス内因性重鎖遺伝子座を不活化した。

【0186】

略述すると、リコンビナーゼを介する組換えを用いて、２回にわたる継起的なターゲティングイベントにおいて、マウス重鎖遺伝子座を欠失させた。第１のターゲティングイベントは、上記マウス重鎖遺伝子座の５’端において、５’側から３’側への、マウス５’側相同性アーム、リコンビナーゼ認識部位、ネオマイシンカセット、および３’側相同性アームを含むターゲティングベクターを用いる第１のターゲティングを包含した。上記５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、上記マウス重鎖遺伝子座の５’側配列を含有した。第２のターゲティングイベントは、上記Ｊ_Ｈ遺伝子セグメントの領域内のマウス重鎖遺伝子座の３’端において、５’側から３’側への、マウス５’側相同性アーム、５’側リコンビナーゼ認識部位、第２のリコンビナーゼ認識部位、ハイグロマイシンカセット、第３のリコンビナーゼ認識部位、およびマウス３’側相同性アームを含有する第２のターゲティングベクターを用いる、ターゲティングを包含した。上記５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、上記マウスＪ_Ｈ遺伝子セグメントおよびイントロンエンハンサーの５’側および定常領域に隣接する配列を含有した。両方のターゲティングベクター（上に記載した）でターゲティングされた、改変された重鎖遺伝子座を含有する陽性ＥＳ細胞は、核型分析（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）により確認した。次いで、ＤＮＡを、二重ターゲティングされたＥＳ細胞から単離し、リコンビナーゼによる処理にかけると、これにより、第１のターゲティングベクターにおける５’側リコンビナーゼ認識部位と第２のターゲティングベクターにおける５’側リコンビナーゼ認識部位との間におけるマウス重鎖遺伝子座のゲノムＤＮＡの欠失が媒介され、単一のリコンビナーゼ認識部位および２つのリコンビナーゼ認識部位に隣接するハイグロマイシンカセットが残される（図２の上方を参照されたい）。したがって、下記で記載されるターゲティングベクターを用いて、正確な様式で順次ヒトκ生殖系列遺伝子セグメントを挿入するために、完全なＣ_Ｈ遺伝子を含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した。

【0187】

当技術分野において認知される標準的な分子的技法を用いて、４つの個別のターゲティングベクターを操作して、４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを、不活化させたマウス重鎖遺伝子座（上に記載した）へと順次挿入した（図２）。上記４つのターゲティング構築物を操作するのに用いたヒトκ遺伝子セグメントは、天然では、ヒト生殖系列κ軽鎖遺伝子座の近位コンティグにおいて見出される（図１Ｂおよび表１）。

【0188】

第１の６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、約１１０，４９９ｂｐのヒトゲノム断片を、ヒトＪκ５遺伝子セグメントの４３１ｂｐ下流（３’側）におけるＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含有するように工学的に作製した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。別のＰＩ−ＳｃｅＩ部位を、上記マウス重鎖のイントロンエンハンサー、ＩｇＭのスイッチ領域（Ｓμ）、およびマウス重鎖遺伝子座のＩｇＭ遺伝子を含有する、約７，８５２ｂｐのゲノム断片の５’端において工学的に作製した。約１１０．５ｋｂのヒト断片とのライゲーションにより、このマウス断片を３’側相同性アームとして用い、これにより、５’側から３’側への、上記第１の６つの連続するＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントを含有する、約１１０．５ｋｂにわたるヒトκ軽鎖遺伝子座のゲノム配列、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位、マウスイントロンエンハンサー、ＳμおよびマウスＩｇＭ定常遺伝子を含有する、約７，８５２ｂｐのマウス重鎖配列を含有する３’側接合部を作製した。ヒトＶκ１−６遺伝子セグメントの上流（５’側）には、マウス重鎖遺伝子座の５’側の配列に対応する１９，７５２ｂｐのマウスゲノムＤＮＡを含有する、マウス５’側相同性アームの始点の前に、さらなる３，７１０ｂｐのヒトκ配列を配置した。上記５’側相同性アームと上記ヒトκ配列の開始部との間には、３つのリコンビナーゼ認識部位に隣接するネオマイシンカセットを配置した（図２のターゲティングベクター１を参照されたい）。ヒトκ配列を最初に挿入するための最終のターゲティングベクターは、５’側から３’側への、上記重鎖遺伝子座の５’側に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’側相同性アーム、第１のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）、ネオマイシンカセット、第２のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ２）、第３のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ３）、上記第１の６つの連続するヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、約１１０．５ｋｂのヒトゲノムκ配列、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位、ならびにイントロンエンハンサー、Ｓμ、およびマウスＩｇＭ定常遺伝子を含めた約８ｋｂのマウスゲノム配列を含有する３’側相同性アームを包含した（図２のターゲティングベクター１を参照されたい）。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとハイブリッド重鎖（すなわち、ヒトＶκドメインおよびマウスＣ_Ｈ領域）の形成をもたらす、マウス内因性重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した。

【0189】

【表1】

１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントのハイブリッド重鎖遺伝子座への導入：１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを、上記で記載した改変されたマウス重鎖遺伝子座へと導入するために、第２のターゲティングベクターを工学的に作製した（図２のターゲティングベクター２を参照されたい）。ヒトκ軽鎖遺伝子座に由来する１２の連続するヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、１４０，０５８ｂｐのヒトゲノム断片を、上記マウス重鎖遺伝子座の５’側のマウスゲノム配列を含有する５’側相同性アームおよびヒトゲノムのκ配列を含有する３’側相同性アームで工学的に作製した。上記ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントの上流（５’側）には、ターゲティングベクター１を構築するために用いた同じ５’側相同性アームである、マウス５’側相同性アームの始点の前に、さらなる１０，１７０ｂｐのヒトκ配列を配置した（図２を参照されたい）。上記５’側相同性アームとヒトκ配列の開始部との間には、リコンビナーゼ認識部位に隣接するハイグロマイシンカセットを配置した。３’側相同性アームは、ターゲティングベクター１のヒトゲノムκ配列の約１１０．５ｋｂの断片と同等の５’端に対応する、ヒトゲノムκ配列の３１，１６５ｂｐの重複が存在した（図２）。１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを挿入するための最終のターゲティングベクターは、５’側から３’側への、上記重鎖遺伝子座の５’側に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’側相同性アーム、第１のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）、ハイグロマイシンカセット、第２のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ２）、およびそのうちの約３１ｋｂが、ターゲティングベクター１のヒトκ配列の５’端と重複し、このターゲティング構築物についての３’側相同性アームとして働く、１２の連続するヒトＶλ遺伝子セグメントを含有する、約１４０ｋｂのヒトゲノムκ配列を包含した。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとハイブリッド重鎖の形成をもたらす、マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した１６のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した。

【0190】

１４のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントのハイブリッド重鎖遺伝子座への導入：１４のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを、上記で記載した改変されたマウス重鎖遺伝子座へと導入するために、第３のターゲティングベクターを工学的に作製した（図２のターゲティングベクター３を参照されたい）。１５の連続するヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、１６０，５７９ｂｐのヒトゲノム断片を、マウス重鎖遺伝子座の５’側のマウスゲノム配列を含有する５’側相同性アームおよびヒトゲノムのκ配列を含有する３’側相同性アームで工学的に作製した。上記ヒトＶκ２−３０遺伝子セグメントの上流（５’側）には、前出の２つのターゲティングベクターに用いたのと同じ５’側の相同性である、マウス５’側相同性アームの始点の前に、さらなる１４，６８７ｂｐのヒトκ配列を配置した（上に記載した、図２もまた参照されたい）。上記５’側相同性アームと上記ヒトκ配列の開始部との間には、リコンビナーゼ認識部位に隣接するネオマイシンカセットを配置した。３’側相同性アームは、ターゲティングベクター２のヒトゲノムκ配列の約１４０ｋｂの断片と同等の５’端に対応する、ヒトゲノムκ配列の２１，２７５ｂｐの重複を包含した（図２）。１４のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを挿入するための最終のターゲティングベクターは、５’側から３’側のへ、マウス重鎖遺伝子座の５’側に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’側相同性アーム、第１のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）、ネオマイシンカセット、第２のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ２）、およびそのうちの約２１ｋｂが、ターゲティングベクター２のヒトκ配列の５’端と重複し、このターゲティング構築物についての３’側相同性アームとして働く、１５のヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、約１６１ｋｂのヒトゲノムκ配列を包含した。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとキメラκ重鎖の形成をもたらす、マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した３０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した。

【0191】

１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントのハイブリッド重鎖遺伝子座への導入：１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを、上記で記載した改変されたマウス重鎖遺伝子座へと導入するために、第４のターゲティングベクターを工学的に作製した（図２のターゲティングベクター４を参照されたい）。１６の連続するヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、９０，３９８ｂｐのヒトゲノム断片を、マウス重鎖遺伝子座の５’側のマウスゲノム配列を含有する５’側相同性アームおよびヒトゲノムのκ配列を含有する３’側相同性アームで工学的に作製した。上記ヒトＶκ２−４０遺伝子セグメントの上流（５’側）には、前出のターゲティングベクターと同じ５’側の相同性である、マウス５’側相同性アームの始点の前に、さらなる８，４８４ｂｐのヒトκ配列を配置した（上に記載した、図２もまた参照されたい）。上記５’側相同性アームとヒトκ配列の開始部との間には、リコンビナーゼ認識部位に隣接するハイグロマイシンカセットを配置した。３’側相同性アームは、ターゲティングベクター３のヒトゲノムκ配列の約１６０ｋｂの断片と同等の５’端に対応する、ヒトゲノムκ配列の６１，６１５ｂｐの重複を包含した（図２）。１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを挿入するための最終のターゲティングベクターは、５’側から３’側への、マウス重鎖遺伝子座の５’側に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’側相同性アーム、第１のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）、ハイグロマイシンカセット、第２のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ２）、およびそのうちの約６２ｋｂが、ターゲティングベクター３のヒトκ配列の５’端と重複し、このターゲティング構築物についての３’側相同性アームとして働く、１６のヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、約９０ｋｂのヒトゲノムκ配列を包含した。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとキメラκ重鎖の形成をもたらす、マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した（図３）。

【0192】

上記で記載したのと同様の手法を用いて、マウス重鎖定常領域のコンテクストにおけるヒト軽鎖可変ドメイン他の組合せを構築する。さらなる軽鎖可変ドメインは、ヒトＶλ遺伝子セグメントおよびヒトＪλ遺伝子セグメントに由来し得る（図４Ａおよび４Ｂ）。

【0193】

ヒトλ軽鎖遺伝子座は、１，０００ｋｂを超えて広がり、可変（Ｖ）セグメントまたは接合（Ｊ）セグメントをコードする、８０を超える遺伝子を含有する。公表された報告によれば、ヒトλ軽鎖遺伝子座のうちの７０のＶλ遺伝子セグメントでは、３０〜３８のいずれかの数のものが機能的な遺伝子セグメントであると考えられている。７０のＶλ配列は、その全てが異なるＶ遺伝子ファミリー群の異なるメンバーを含有する３つのクラスター（クラスターＡ、Ｂ、およびＣ）に配置されている。ヒトλ軽鎖遺伝子座内では、全ての観察されるＶλドメインの過半が、遺伝子セグメント１−４０、１−４４、２−８、２−１４、および３−２１によりコードされている。存在する７つのＪλ遺伝子セグメントのうち、４つだけが、一般に機能的なＪλ遺伝子セグメント（Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、およびＪλ７）と考えられている。一部の対立遺伝子では、第５のＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対が、偽遺伝子（Ｃλ６）であると報告されている。複数のヒトＪλ遺伝子セグメントの、本明細書で記載されるハイブリッド重鎖遺伝子座への組込みは、新規の合成により構築される。このように、生殖系列の構成において複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含有するゲノム断片を、複数のヒトＶλ遺伝子セグメントで工学的に作製すると、重鎖定常領域のコンテクストにおいて正常なＶ−Ｊ組換えが可能となる。

【0194】

軽鎖可変ドメインの重鎖定常領域との結合は、非ヒト動物においてヒトＶ_Ｌ領域を伴う固有のＶ_Ｌ結合タンパク質を生成させるための潜在的に豊富な多様性の供給源を表す。マウスにおいてヒトλ軽鎖遺伝子座（または上記で記載したヒトκ遺伝子座）のこの多様性を利用することにより、固有のハイブリッド重鎖の工学的に作製が結果としてもたらされ、遺伝子改変動物の免疫レパートリーおよび治療剤をもたらすための次の生成のプラットフォームとしてのそれらのその後の使用に、別次元の結合タンパク質がもたらされる。

【0195】

加えて、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｈ（またはＪκ）遺伝子セグメントを、ヒトＶκ遺伝子セグメントまたはヒトＶλ遺伝子セグメントとともに取り込ませて、組み換えられると工学的に作製された新規の可変ドメインをもたらす新規のハイブリッド遺伝子座を構築することもできる（図５Ａおよび５Ｂ）。この後者の場合、通常は単一の遺伝子座に含有されない遺伝子セグメントの組合せを工学的に作製すれば、それらを単一の遺伝子座へと組み合わせるときに正常な組換えを達成し得るように、それぞれの遺伝子セグメントに付随する組換えシグナル配列（ＲＳＳ）に対する特別の注意が必要となる。例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えは、組換えが生じる正確な位置において各遺伝子セグメントに隣接して見出されるヘプタマー配列およびノナマー配列として公知である保存された非コードＤＮＡ配列により誘導されることが公知である。これらの非コードＤＮＡ配列の間には、１２または２３塩基対（ｂｐ）の長さである非保存のスペーサー領域が存在する。一般に、組換えは、同じ染色体に位置する遺伝子セグメントだけで生じ、１２ｂｐのスペーサーが隣接するこれらの遺伝子セグメントは、２３ｂｐのスペーサーが隣接する遺伝子セグメントに接合され得る（すなわち１２／２３ルール）が、抗体のうちのごく一部では、２つのＤ_Ｈ遺伝子セグメント（各々に１２ｂｐのスペーサーが隣接する）の接合も観察されている。通常では適合性のスペーサーを有さない遺伝子セグメント間における組換え（例えば、ＶκとＤ_Ｈとの間における組換え、またはＤ_ＨとＪλとの間における組換え）を可能とするには、軽鎖可変領域を含有する固有の重鎖を形成するための組換えの成功を可能とする固有のハイブリッド重鎖を構築するために所望される遺伝子セグメントと隣接する位置において、固有の適合性のスペーサーを合成する。

【0196】

したがって、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを、内因性重鎖遺伝子座へと組み込むために、上記で概括された戦略を用いることにより、他のヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの組合せ、ならびに特定のヒト重鎖遺伝子セグメント（例えば、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメント）およびこれらの組合せの使用が可能となる。

【0197】

（実施例ＩＩ）
内因性重鎖遺伝子座においてヒト軽鎖遺伝子セグメントを保有する、ターゲティングされたＥＳ細胞の同定
マウスＥＳ細胞を電気穿孔して、Ｖ_Ｌ結合タンパク質（すなわち、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結したヒトκ軽鎖遺伝子セグメント）を発現するキメラマウスを発生させるための、改変されたＥＳ細胞を作製するのに、前出の実施例において作製された、ターゲティングされたＢＡＣ ＤＮＡを用いた。再構成されていないヒトκ軽鎖遺伝子セグメントの挿入を含有するＥＳ細胞は、定量的ＰＣＲアッセイであるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）により同定した（ＬｉｅおよびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、１９９８年、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：４３〜４８頁）。ヒトκ配列および関連する選択カセットを挿入し、マウス重鎖配列を消失させ、かつ、内因性重鎖遺伝子座に隣接するマウス配列を保持するために、特異的なプライマーセットおよびプローブをデザインした。

【0198】

ヒトκ遺伝子セグメントを含有するターゲティング構築物の挿入により導入される任意の所望されない選択カセットを除去するために、上記ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを保有するＥＳ細胞を、リコンビナーゼを発現する構築物でトランスフェクトすることができる。必要に応じて、上記選択カセットは、上記リコンビナーゼを発現するマウスに交配させることにより除去することができる（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。必要に応じて、上記選択カセットは、マウスにおいて保持される。

【0199】

（実施例ＩＩＩ）
Ｖ_Ｌ結合タンパク質を発現するマウスの発生および解析
上記で記載したターゲティングされたＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、８細胞期のマウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ， Ｗ．Ｔ．、Ａｕｅｒｂａｃｈ， Ｗ．、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ， Ｄ．、Ｈｉｃｋｅｙ， Ｊ．Ｆ．、Ｅｓｃａｒａｖａｇｅ， Ｊ．Ｍ．、Ｅｓａｕ， Ｌ．、Ｄｏｒｅ， Ａ．Ｔ．、Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｓ．、Ａｄａｍｓ， Ｎ．Ｃ．、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， Ｍ．Ｇ．、Ｇａｌｅ， Ｎ．Ｗ．、Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ， Ｇ．Ｄ．、ＤｅＣｈｉａｒａ， Ｔ．Ｍ．、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ， Ｄ．Ｍ．（２００７年）、「Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２５巻、９１〜９９頁を参照されたい）。上記マウス重鎖遺伝子座においてヒトκ遺伝子セグメントを個別に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（上記ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０世代のマウス）は、内因性重鎖遺伝子座における固有のヒトκ遺伝子セグメントの存在を検出した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、前出）対立遺伝子アッセイの変法（前出）を用いて遺伝子型決定することにより同定した。マウス仔を遺伝子型決定し、ハイブリッド重鎖遺伝子の遺伝子座についてヘテロ接合性であるマウス仔を、Ｖ_Ｌ結合タンパク質の発現を特徴付けるために選択する。

【0200】

フローサイトメトリー：ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントの上記マウス重鎖遺伝子座への導入は、上記マウスκ軽鎖遺伝子セグメントの、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントによるｉｎ ｓｉｔｕの置き換え（ＵＳ６，５９６，５４１）をさらに含有する、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃヘテロ接合性の胚およびＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃヘテロ接合性の胚に由来するＦ１期のＥＳ細胞系（Ｆ１Ｈ４、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００７年、前出）において実施した。ヒト生殖系列κ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ＩｇＭ^ａハプロタイプを保有する１２９Ｓ６対立遺伝子に向かわせる（ｔａｒｇｅｔｅｄ）一方で、改変されていないＣ５７６ＢＬ／６Ｎマウスの対立遺伝子は、ＩｇＭ^ｂハプロタイプを保有する。これらのＩｇＭの対立遺伝子形態は、上記ＩｇＭ^ａまたはＩｇＭ^ｂの対立遺伝子において見出される多型に特異的な抗体を用いるフローサイトメトリーにより識別することができる。フローサイトメトリーを用いて、実施例Ｉで記載した上記内因性重鎖遺伝子座においてヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを保有する、ヘテロ接合性のマウスを、ヒトＶ_Ｌ結合タンパク質の発現について評価した。

【0201】

略述すると、血液をマウス群（１群当たりｎ＝６匹）から採取し、スライドガラスを用いて破砕した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウスを対照群として用いた。ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）により赤血球（ＲＢＣ）を溶解した後、細胞をＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのＦＡＣＳ用染色緩衝液中で再懸濁させ、抗マウスＣＤ１６／３２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でブロッキングした。リンパ球を抗マウスＩｇＭ^ｂ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗マウスＩｇＭ^ａ−ＰＥ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗マウスＣＤ１９抗体（クローン１Ｄ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および抗マウスＣＤ３抗体（１７Ａ２、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））で染色した後、全て製造業者の指示に従い、ＢＤ ＣＹＴＯＦＩＸ（商標）で固定した。最終の細胞ペレットを、染色緩衝液中で再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）およびＢＤ ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ ＰＲＯ（商標）ソフトウェアを用いて解析した。表２は、各遺伝子改変を保有する動物群において観察されるＢ細胞（ＣＤ１９^＋）、Ｔ細胞（ＣＤ３^＋）、ハイブリッド重鎖（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ａ＋）、および野生型重鎖（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｂ＋）の発現についての平均百分率値を示す。

【0202】

同様の実験では、多様な細胞表面マーカーについてのフローサイトメトリーを用いて、上記マウス重鎖定常領域に作動可能に連結した６つのヒトＶκおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（実施例Ｉ、図２に記載した）についてホモ接合性であるマウスに由来する脾コンパートメント、血液コンパートメント、および骨髄コンパートメントのＢ細胞含量を、Ｂ細胞発生の進行について解析した。

【0203】

略述すると、野生型マウス、ならびに上記マウス重鎖定常領域に作動可能に連結した、６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウスの２つの群のマウス（各群８週齢の雌ｎ＝３匹ずつ）を屠殺し、血液、脾臓、および骨髄を採取した。血液は、ＥＤＴＡを伴うｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ試験管（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）へと回収した。骨髄は、完全ＲＰＭＩ培地（ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、およびゲンタイマイシンを補充したＲＰＭＩ培地）でフラッシュすることにより、大腿骨から回収した。脾臓調製物および骨髄調製物に由来するＲＢＣは、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）で溶解させた後、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。

【0204】

細胞（１×１０^６個）を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２、ＢＤ）と共に、氷上で１０分間にわたりインキュベートした後、以下の抗体カクテル：抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ４３抗体（１Ｂ１１、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＰＥ−ｃｋｉｔ抗体（２Ｂ８、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ抗体（ＩＩ／４１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ抗体（１１−２６ｃ．２ａ、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ ７８０−Ｂ２２０抗体（ＲＡ３−６Ｂ２、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＡＰＣ−ＣＤ１９抗体（ＭＢ１９−１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））により、氷上で３０分間にわたり標識した。骨髄：未成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋）、成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｈｉＩｇＭ^＋）、プロＢ細胞（ＣＤ１９^＋ｃｋｉｔ^＋ＣＤ４３^＋）、プレＢ細胞（ＣＤ１９^＋ｃｋｉｔ⁻ＣＤ４３⁻）、プレＢ細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３^ｉｎｔＩｇＭ^＋／−）、未成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３⁻ＩｇＭ^＋／−）。血液および脾臓：Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋）、成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｉｎｔＩｇＤ^ｈｉ）、移行／未成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｈｉＩｇＤ^ｉｎｔ）。

【0205】

染色の後、細胞を洗浄し、２％のホルムアルデヒドで固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターによりデータ収集を実施し、ＦＬＯＷＪＯ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）で解析した。図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、脾コンパートメントの結果を示す。図７Ａ〜７Ｇは、骨髄コンパートメントの結果を示す。各群のマウスに由来する血液コンパートメントについて得られる結果により、各群に由来する脾コンパートメントによる結果と比較して同様の結果が裏付けられた（データは示さない）。

【0206】

同様の実験では、多様な細胞表面マーカーについてのフローサイトメトリーを用いて、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結した３０のヒトＶκおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（実施例Ｉ、図２に記載した）についてホモ接合性であるマウスに由来する脾コンパートメント、血液コンパートメント、および骨髄コンパートメントＢ細胞含量を、Ｂ細胞発生の進行について解析した。

【0207】

略述すると、野生型重鎖遺伝子座と、内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよび内因性Ｊκ遺伝子セグメントの、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントによる置き換えとを含有するマウス（ＷＴ）、ならびに３０のｈＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントと、内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよび内因性Ｊκ遺伝子セグメントの、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントによる置き換えとについてホモ接合性であるマウス（３０ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）の２つの群のマウス（各群６週齢の雌Ｎ＝３匹ずつ）を屠殺し、脾臓、および骨髄を採取した。骨髄および脾細胞を、多様な細胞表面マーカー（上に記載した）による染色のために調製した。

【0208】

細胞（１×１０^６個）を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に、氷上で１０分間にわたりインキュベートした後、骨髄パネルまたは脾細胞パネルにより、氷上で３０分間にわたり標識した。骨髄パネル：抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ４３抗体（１Ｂ１１、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＰＥ−ｃｋｉｔ抗体（２Ｂ８、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ抗体（ＩＩ／４１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＡＰＣ−ＣＤ１９抗体（ＭＢ１９−１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））。骨髄および脾臓パネル：抗マウスＦＩＴＣ−Ｉｇκ抗体（１８７．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−Ｉｇλ抗体（ＲＭＬ−４２、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ抗体（ＩＩ／４１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ抗体（１１−２６ｃ．２ａ、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ−ＣＤ３抗体（１７Ａ２、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＡＰＣ−Ｂ２２０抗体（ＲＡ３−６Ｂ２、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＡＰＣ−Ｈ７−ＣＤ１９抗体（ＩＤ３、ＢＤ）。骨髄：未成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋）、成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｈｉＩｇＭ^＋）、プロＢ細胞（ＣＤ１９^＋ｃｋｉｔ^＋ＣＤ４３^＋）、プレＢ細胞（ＣＤ１９＋ｃｋｉｔ−ＣＤ４３−）、未成熟Ｂ細胞Ｉｇκ^＋（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋Ｉｇκ^＋Ｉｇλ⁻）、未成熟Ｉｇλ^＋Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋Ｉｇκ⁻Ｉｇλ^＋）、成熟Ｉｇκ^＋Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｈｉＩｇＭ^＋Ｉｇκ^＋Ｉｇλ⁻）、成熟Ｉｇλ^＋Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｈｉＩｇＭ^＋Ｉｇκ⁻Ｉｇλ^＋）。脾臓：Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋）、成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＤ^ｈｉＩｇＭ^ｉｎｔ）、移行／未成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＤ^ｉｎｔＩｇＭ^ｈｉ）。骨髄および脾臓：Ｉｇκ^＋Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋Ｉｇκ^＋Ｉｇλ⁻）、Ｉｇλ^＋Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋Ｉｇκ⁻Ｉｇλ^＋）。

【0209】

染色の後、細胞を洗浄し、２％のホルムアルデヒドで固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターによりデータ収集を実施し、ＦＬＯＷＪＯ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）で解析した。その結果により、３つのコンパートメント全てについて、６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（上に記載した）と比較して同様の染色パターンおよび細胞集団が裏付けられた。しかし、これらのマウスでは、内因性λ軽鎖の遺伝子座が完全であるにもかかわらず、これらのマウスでは、脾コンパートメントおよび骨髄コンパートメントの両方において、上記内因性λ軽鎖発現の消失が裏付けられた（それぞれ、図８Ａおよび８Ｂ）。これは、重鎖定常領域のコンテクストで、再構成されたヒトκ軽鎖ドメインが、Ｉｇλ^＋細胞の欠失をもたらすマウスλ軽鎖ドメインと対合または会合できないことを反映し得る。

【0210】

アイソタイプの発現：ヒト重鎖可変遺伝子およびκ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座についてホモ接合性であるマウス（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｉｃｅ、ＵＳ７，１０５，３４８を参照されたい）ならびに内因性重鎖遺伝子座に工学的に作製された６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス（６ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）について、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを用いる定量的ＰＣＲアッセイ（上記の実施例ＩＩに記載される）により、全免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）および全免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）ならびに表面（すなわち、膜結合）ＩｇＭおよび表面ＩｇＧ１を決定した。

【0211】

略述すると、製造業者の指示に従い、マウスＣＤ１９ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞を、マウス（１群当たりｎ＝３〜４匹のマウス）群の脾臓から精製した。全ＲＮＡは、ＲＮＥＡＳＹ（商標）Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ゲノムＲＮＡは、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて取り出した。Ｆｉｒｓｔ Ｓｔａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、約２００ｎｇのｍＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写させ、次いで、これを、ＡＢＩ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により増幅した。固有のプライマー／プローブの組合せを用いて、ＩｇＭおよびＩｇＧ１アイソタイプの全形態、表面形態（すなわち、膜貫通形態）、および分泌形態の発現を特異的に決定した（表３）。マウスκ定常領域（ｍＣκ）に対して、相対発現を標準化した。

【0212】

【表2】

【0213】

【表3】

定量的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲアッセイによる結果により、全ＩｇＭおよび全ＩｇＧ１の減少が裏付けられた。しかし、ＩｇＭおよびＩｇＧ１の表面形態と対比した分泌形態の比は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ）と比較して正常であると考えられた（データは示さない）。

【0214】

ヒトκ遺伝子セグメントの使用状況（ｕｓａｇｅ）およびＶκ−Ｊκ接合部の解析：脾細胞から単離されるＲＮＡを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、３０のｈＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントと、内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよび内因性Ｊκ遺伝子セグメントの、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントによる置き換えとについてホモ接合性であるナイーブマウス（３０ｈＶκ−５ｈＪκ ＨＯ）を、マウス重鎖（ＩｇＧ）における固有のヒトＶκ−Ｊκ再構成について解析した。

【0215】

略述すると、脾臓を採取し、滅菌ディスポーザブルバッグ中に５％のＨＩ−ＦＢＳを伴う１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）で還流した。次いで、単一の脾臓を含有する各バッグをＳＴＯＭＡＣＨＥＲ（商標）（Ｓｅｗａｒｄ）に入れ、中程度の設定で３０秒間にわたりホモジナイズした。次いで、ホモジナイズした脾臓を、０．７μｍの細胞ろ過器（ ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）を用いて濾過し、次に、遠心分離（１０００ｒｐｍで１０分間にわたる）によりペレット化し、ＲＢＣを、ＢＤ ＰＨＡＲＭ ＬＹＳＥ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３分間にわたり溶解させた。脾細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０で希釈し、再度遠心分離した後、１ｍＬのＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で再懸濁させた。当技術分野において公知である標準的な技法を用いて、ペレット化された脾細胞からＲＮＡを単離した。

【0216】

ヒトｈＶκ遺伝子セグメントおよびマウスＩｇＧに特異的なプライマーを用いて、脾細胞ＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲを実施した。マウスＩｇＧ用のプライマーは、それが全てのマウスＩｇＧアイソタイプに由来するＲＮＡを増幅することが可能であるようにデザインした。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローニングし、上記ベクター内のそのクローニング部位に隣接する位置に配置して、順方向プライマーＭ１３（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ ＧＧＣＣＡＧ：配列番号１６）および逆方向プライマーＭ１３（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ ＣＴＡＴＧＡＣ：配列番号１７）により配列決定した。１２の選択されたクローンにおけるヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントの使用状況を、表４に示す。図９は、１２の選択されたＲＴ−ＰＣＲクローンについて、ｈＶκ−ｈＪκ−ｍＩｇＧ接合部のヌクレオチド配列を示す。

【0217】

この実施例で示される通り、６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるか、または上記マウス重鎖定常領域に作動可能に連結した３０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウスにより、それらの生殖系列の構成において軽鎖可変遺伝子セグメントを含有する、改変された重鎖遺伝子座からのヒト軽鎖可変領域の発現が裏付けられた。種々の段階にわたるＢ細胞発生の進行がこれらのマウスにおいて観察されたことから、内因性重鎖遺伝子座に由来する軽鎖可変遺伝子セグメント、およびこのようなハイブリッド重鎖（すなわち、重鎖定常領域に連結されたヒト軽鎖可変領域）の、抗体レパートリーの一部としての発現を伴う、複数の生産的な組換えイベントが示される。

【0218】

【表4】

（実施例ＩＶ）
Ｖ_Ｌ結合タンパク質を発現するマウスの増殖
Ｖ_Ｌ結合タンパク質の新規の生成を創出するために、再構成されていないヒトκ遺伝子セグメントを保有するマウスを、他の内因性重鎖対立遺伝子の欠失を含有する別のマウスに交配させることができる。このようにすれば、得られる後代は、実施例Ｉで記載したハイブリッド重鎖だけを発現する。交配は、当技術分野において認知される標準的な技法により実施するが、代替的には、企業、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに実施させる。ハイブリッド重鎖遺伝子座を保有するマウス株を、固有のハイブリッド重鎖の存在および従来のマウス重鎖の非存在についてスクリーニングする。

【0219】

代替的に、マウス重鎖遺伝子座において、上記再構成されていないヒトκ遺伝子セグメントを保有するマウスは、上記マウス軽鎖遺伝子座（κおよびλ）に１または複数の欠失を含有する他のマウスに交配させることにより、最適化することができる。このようにすれば、得られる後代は、実施例Ｉで記載した固有のヒトκ重鎖抗体だけを発現する。交配は、当技術分野において認知される標準的な技法により同様に実施するが、代替的には、企業、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに実施させる。ハイブリッド重鎖遺伝子座および１または複数のマウス軽鎖遺伝子座の欠失を保有するマウス株を、ヒトκ軽鎖ドメインおよびマウス重鎖定常ドメインを含有する固有のハイブリッド重鎖の存在ならびにマウス内因性軽鎖の非存在についてスクリーニングする。

【0220】

また、再構成されていないハイブリッド重鎖遺伝子座を保有するマウスを、マウス内因性κ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座の、ヒトκ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座による置き換え（ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス技術（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を参照されたい）を含有するマウスとも交配させる。抗原刺激に対する反応により、上記マウスが、ヒトκ軽鎖可変ドメインおよびマウス重鎖定常ドメインを含む抗体を生成するように、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｕｓｅ）は、部分的に、マウス内因性κ軽鎖可変定常領域遺伝子座に作動可能に連結する、ヒトκ軽鎖可変領域を含むゲノムを有することを包含する。上記抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、単離して、ヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結することができる。次いで、上記ＤＮＡを、上記抗体の完全ヒト軽鎖を発現することが可能である細胞において発現させることができる。適切な交配スケジュールでは、上記マウス内因性κ軽鎖の、上記ヒトκ軽鎖遺伝子座による置き換え、および再構成されていないハイブリッド重鎖遺伝子座を保有するマウスが得られる。対象の抗原で免疫すると、体細胞変異したヒトＶκドメインを含有する固有のＶ_Ｌ結合タンパク質を単離することができる。

【0221】

（実施例Ｖ）
Ｖ_Ｌ結合タンパク質の生成
上記再構成されていないハイブリッド重鎖遺伝子座を含有するマウスを、他の内因性Ｉｇ遺伝子座の改変および欠失を含有する、所望される多様なマウス株に交配させた（実施例ＩＶで記載した）後で、選択されたマウスを対象の抗原で免疫することができる。

【0222】

一般に、少なくとも１つのハイブリッド重鎖遺伝子座を含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスを抗原で感作し、細胞（Ｂ細胞など）を上記動物から（例えば、脾臓またはリンパ節から）回収する。上記細胞を骨髄腫細胞系と融合させて、不死化ハイブリドーマ細胞系を調製し、このようなハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択して、免疫に用いた抗原に特異的なハイブリッド重鎖を含有する抗体を生成するハイブリドーマ細胞系を同定する。上記ハイブリッド重鎖のヒトＶκ領域をコードするＤＮＡを単離し、所望の定常領域、例えば、重鎖および／または軽鎖定常領域に結合することができる。上記マウス重鎖定常領域に融合しているヒトＶκ遺伝子セグメントが存在するために、固有の抗体様レパートリーが生成され、固有の抗体フォーマットが作製される結果として、上記免疫グロブリンレパートリーの多様性が劇的に増大する。このため、免疫されると、抗原特異的レパートリーに対する多様性のレベルが付加される。結果として得られる、クローニングされた抗体配列は、その後、ＣＨＯ細胞などの細胞において生成させることができる。代替的に、抗原特異的Ｖ_Ｌ結合タンパク質またはその可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球（例えば、Ｂ細胞）から直接単離することもできる。

【0223】

まず、ヒトＶκ領域およびマウス定常領域を有する、高アフィニティーのＶ_Ｌ結合タンパク質を単離する。上に記載したとおり、上記Ｖ_Ｌ結合タンパク質を、アフィニティー、選択性、エピトープなどを含めた所望の特徴について特徴付け、および選択する。上記マウス定常領域を、所望されるヒト定常領域で置き換えて、本発明の再構成されていないハイブリッド重鎖遺伝子座から、体細胞変異したヒトＶκドメインを含有する固有の完全ヒトＶ_Ｌ結合タンパク質を生成させる。適切なヒト定常領域は、例えば、野生型ＩｇＧ１定常領域もしくは野生型ＩｇＧ４定常領域、または改変されたＩｇＧ１定常領域もしくは改変されたＩｇＧ４定常領域、あるいは、Ｃκ定常領域またはＣλ定常領域を包含する。

【0224】

マウス内因性重鎖遺伝子座の、６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントによる置き換え（実施例Ｉで記載したとおり）、ならびに上記内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよび内因性Ｊκ遺伝子セグメントの、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントによる置き換えを含有するマウスの個別のコホートを、ヒト細胞表面受容体タンパク質（抗原Ｘ）で免疫した。抗原Ｘは、３〜４日毎に６回にわたる連続の注射により、マウスの後足蹠へと直接投与する。注射の前に、２〜３マイクログラムの抗原Ｘを、１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（型番：ｔｌｒｌ−ｍｏｄｎ−ＯＤＮ１８２６オリゴヌクレオチド、ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（リン酸アルミニウムゲルアジュバント、型番：Ｈ−７１６３９−２５０、Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と混合する。最終の抗原リコールの前に、６回全ての注射を施すが、これは屠殺の３〜５日間前に施す。４回目および６回目の注射後における採血血液を回収し、標準的な抗原特異的イムノアッセイにより、抗体免疫反応をモニタリングする。

【0225】

所望される免疫反応を達成したら、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存能力を保ち、ハイブリドーマ細胞系を形成する。上記ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択して、抗原Ｘ特異的Ｖ_Ｌ結合タンパク質を生成する細胞系を同定する。この技法を用いて、複数の抗抗原Ｘ特異的Ｖ_Ｌ結合タンパク質（すなわち、マウス重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコンテクストでヒトＶκドメインを保有する結合タンパク質）を得る。

【0226】

代替的には、抗抗原Ｘ Ｖ_Ｌ結合タンパク質を、参照によりその全体において本明細書に具体的に組み込まれるＵ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１において記載される通り、骨髄腫細胞へと融合させることなしに、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離する。この方法を用いて、複数の完全ヒト抗抗原Ｘ Ｖ_Ｌ結合タンパク質（すなわち、ヒトＶκドメインおよびヒト定常ドメインを保有する抗体）を得た。

【0227】

ヒトκ遺伝子セグメントの使用状況：作製した抗抗原Ｘ Ｖ_Ｌ結合タンパク質の構造を解析するため、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１（前出）において記載されている方法から適合させた方法を用いて、上記ヒトＶκドメインをコードする核酸（上記Ｖ_Ｌ結合タンパク質の重鎖および軽鎖の両方に由来する）をクローニングおよび配列決定した。上記抗体の核酸配列および予測されるアミノ酸配列から、免疫したマウスから得られる、選択されたＶ_Ｌ結合タンパク質のハイブリッド重鎖可変領域（上に記載した）について、遺伝子使用状況を同定した。表５は、選択された抗抗原Ｘ Ｖ_Ｌ結合タンパク質に由来するヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントの遺伝子使用状況について示すが、これにより、本発明によるマウスは、いずれもが再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する内因性重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座における多様な再構成のために、多様なヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントから、抗原特異的Ｖ_Ｌ結合タンパク質を生成することが裏付けられる。多様なヒトＪκセグメントと共に再構成されたヒトＶκ遺伝子セグメントは、固有の抗原特異的Ｖ_Ｌ結合タンパク質をもたらす。

【0228】

【表5】

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：ＥＬＩＳＡアッセイにより、抗原Ｘに対して得られたヒトＶ_Ｌ結合タンパク質を、それらが抗原Ｘの天然のリガンド（リガンドＹ）の結合を遮断する能力について調べた。

【0229】

略述すると、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの濃度に希釈したリガンドＹで９６ウェルプレートをコーティングし、一晩にわたりインキュベートした後で、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで４回にわたり洗浄した。次いで、室温で１時間にわたり、そのプレートを、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）でブロッキングした。個別のプレートにおいて、抗抗原Ｘ Ｖ_Ｌ結合タンパク質を含有する上清を、緩衝液中で１：１０に希釈した。上記Ｖ_Ｌ結合タンパク質のものと同じ成分を含む偽上清を、陰性対照として用いた。抗原Ｘの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分とコンジュゲートした（抗原Ｘ−ｍＦｃ）。抗原Ｘ−ｍＦｃを、０．１５０ｎＭの最終濃度まで添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、Ｖ_Ｌ結合タンパク質／抗原Ｘ−ｍＦｃ混合物を、リガンドＹを含有するプレートに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。リガンドＹに結合した抗原Ｘ−ｍＦｃの検出は、抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）にコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により決定し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用い、硫酸により中和した標準的な比色反応により発色させた。吸光度は、ＯＤ４５０で０．１秒間にわたり読み取った。抗原Ｘを含まない試料のバックグラウンドの吸光度を、全ての試料から差し引いた。＞２５０（３つの９６ウェルプレート）の抗原Ｘ特異的Ｖ_Ｌ結合タンパク質について、バックグラウンドを差し引いた各試料のＭＦＩを、調整された陰性対照値で除し、１００を乗じ、結果として得られる値を１００から差し引くことにより、遮断の百分率を計算した。

【0230】

その結果により、マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に融合している抗原Ｘの細胞外ドメインに特異的に結合した抗原Ｘで免疫したマウスから単離された複数のＶ_Ｌ結合タンパク質が示された（データは示さない）。

【0231】

アフィニティーの決定：選択された抗原Ｘ特異的Ｖ_Ｌ結合タンパク質上清の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ１００測定器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）により決定した。全てのデータは、ランニングバッファーおよび試料緩衝液の両方としてのＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）を２５℃で用いて得た。

【0232】

略述すると、Ｖ_Ｌ結合タンパク質は、粗上清試料から、標準的なアミン結合化学反応を用いて高濃度の抗ヒトＦｃ抗体により予め誘導体化した（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）ＣＭ５センサーチップ表面に捕捉した。その捕捉工程では、上清を、抗ヒトＦｃ表面全体に、３μＬ／分の流速で合計３分間にわたり注入した。上記捕捉工程の後、１００ｎＭの濃度のランニングバッファーまたは分析物を、３５μＬ／分の流速で２分間にわたり注入した。捕捉された上記Ｖ_Ｌ結合タンパク質からの抗原の解離を、６分間にわたりモニタリングした。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５を短時間にわたり注入することにより、捕捉された上記Ｖ_Ｌ結合タンパク質を取り出した（ｒｅｍｏｖｅｄ）。全てのセンサーグラムは、緩衝液の注入に由来するセンサーグラムを、分析物に由来するセンサーグラムから減じ、これにより、その捕捉表面からの上記Ｖ_Ｌ結合タンパク質の解離により引き起こされるアーチファクトを除去することにより、二重に基準化した。各Ｖ_Ｌ結合タンパク質の結合データは、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ２．１を用いて、物質移動を伴う１：１の結合モデルに当てはめた。

【0233】

３４の選択されたＶ_Ｌ結合タンパク質の結合アフィニティーは様々であったが、全てがナノモル濃度範囲のＫ_Ｄ（１．５〜１３０ｎＭ）を呈示した。さらに、選択された上記Ｖ_Ｌ結合タンパク質のうちの約７０％（３４例のうちの２３例）により、一桁のナノモル濃度単位のアフィニティーが裏付けられた。これらの選択されたＶ_Ｌ結合タンパク質についてのＴ^１／２の測定により、約０．２〜６６分間の範囲が示された。３４のＶ_Ｌ結合タンパク質のうち、６つが、抗原Ｘに対して３ｎＭを超えるアフィニティー（１．５３、２．２３、２．５８、２．５９、２．７９、および２．８４）を示した。そのアフィニティーのデータは、重鎖定常領域および軽鎖定常領域に連結された、再構成されたヒト軽鎖可変ドメインの組合せによる会合（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）から結果として得られるＶ_Ｌ結合タンパク質（表４に記載されている）が、高アフィニティーの、クローン選択され、体細胞変異したＶ_Ｌ結合タンパク質であることと符合する。本明細書で記載されるマウスが生成する上記Ｖ_Ｌ結合タンパク質は、抗原Ｘにおける１または複数のエピトープに対する特異性を呈示する、多様な、高アフィニティーで固有の結合タンパク質のコレクションを含む。

【0234】

別の実験では、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズベースのアッセイにより、抗原Ｘに対して得られた、選択されたヒトＶ_Ｌ結合タンパク質を、それらが抗原Ｘの天然のリガンド（リガンドＹ）の結合を遮断する能力について調べた（データは示さない）。その結果により、ナノモル濃度範囲のアフィニティーで抗原Ｘの細胞外ドメインに特異的に結合すること（上に記載した）に加え、選択されたＶ_Ｌ結合タンパク質はまた、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に由来する抗原Ｘに結合することも可能であることが裏付けられた。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]