特許 6759402 ＦＬＴ３変異を有する急性骨髄性白血病の治療用の医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6759402

(24)【登録日】2020年9月4日

(45)【発行日】2020年9月23日

(54)【発明の名称】ＦＬＴ３変異を有する急性骨髄性白血病の治療用の医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/10 20060101AFI20200910BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20200910BHJP

   A61K 31/7068 20060101ALI20200910BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200910BHJP

   A61K 38/12 20060101ALN20200910BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/10ZNA

   A61P35/02

   A61K31/7068

   A61P43/00 121

   A61P43/00 111

   !A61K38/12

【請求項の数】20

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2019-59920(P2019-59920)

(22)【出願日】2019年3月27日

(62)【分割の表示】特願2016-524577(P2016-524577)の分割

【原出願日】2014年10月30日

(65)【公開番号】特開2019-116497(P2019-116497A)

(43)【公開日】2019年7月18日

【審査請求日】2019年3月27日

(31)【優先権主張番号】61/897,921

(32)【優先日】2013年10月31日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/945,302

(32)【優先日】2014年2月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511304383

【氏名又は名称】バイオカイン セラピューティックス リミテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】515264805

【氏名又は名称】バイオラインアールエックス・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢｉｏＬｉｎｅＲｘ Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】特許業務法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ペレド アムノン

(72)【発明者】

【氏名】アブラハム マイケル

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２６４３７８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特許第６２９４４５９（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 ZENG ZHIHONG; SAMUDIO ISMAEL J; MUNSELL MARK; AN JING; HUANG ZIWEI; ESTEY ELIHU; ET AL，INHIBITION OF CXCR4 WITH THE NOVEL RCP168 PEPTIDE OVERCOMES STROMA-MEDIATED CHEMORESISTANCE 以下備考，MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS，米国，AMERICAN ASSOCIATION OF CANCER RESEARCH，２００６年１２月 １日，VOL:5, NR:12，PAGE(S):3113 - 3121，IN CHRONIC AND ACUTE LEUKEMIAS，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1158/1535-7163

【文献】 KATIA BEIDER; MICHAL BEGIN; MICHAL ABRAHAM; HANNA WALD; IDO D WEISS; ORI WALD; ET AL，CXCR4 ANTAGONIST 4F-BENZOYL-TN14003 INHIBITS LEUKEMIA AND MULTIPLE MYELOMA TUMOR GROWTH，EXPERIMENTAL HEMATOLOGY，米国，ELSEVIER INC，２０１０年１１月３０日，VOL:39, NR:3，PAGE(S):282 - 292，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1016/j.exphem.2010.11.010

【文献】 Experimental Hematology, 2010, Vol.38, pp.180-190

【文献】 Blood, 2013.10.21, Vol.122, No.21, Abstract Number.3939，Meeting info:55th Annual Meeting of the American Society of Hematology

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）変異を有する急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の対象に投与するための薬剤であって、配列番号１のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを有効成分として含み、前記対象はシタラビンを投与されている、薬剤。

【請求項2】

ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）変異を有するＡＭＬの治療を必要とし、且つシタラビンを投与されている対象の治療のための医薬の製造における、配列番号１のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドの有効成分としての使用。

【請求項3】

ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）変異を有するＡＭＬの治療のための、配列番号１のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチド剤及びシタラビンを含む製品。

【請求項4】

前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチド及び前記シタラビンが別個の容器に入っている、請求項３に記載の製品。

【請求項5】

前記ＦＬＴ３変異がＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）変異である、請求項１に記載の薬剤。

【請求項6】

１日当たりの前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドの投与量が、前記対象のｋｇ体重当たり０．１〜１０ｍｇとなるように、前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを含む、請求項１の薬剤。

【請求項7】

前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドが皮下投与用に処方されている、請求項１の薬剤。

【請求項8】

前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドが静脈内投与用に処方されている、請求項１の薬剤。

【請求項9】

前記対象に対して、シタラビンの投与と同時に前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを投与するための、請求項１の薬剤。

【請求項10】

前記対象に対して、シタラビンの投与と連続して前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを投与するための、請求項１の薬剤。

【請求項11】

ＡＭＬ細胞のアポトーシス誘導において、前記シタラビンが前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドとの相乗効果を示す、請求項１および５〜１０のいずれか一項に記載の薬剤。

【請求項12】

前記ＦＬＴ３変異がＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）変異である、請求項２の使用。

【請求項13】

１日当たりの前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドの投与量が、前記対象のｋｇ体重当たり０．１〜１０ｍｇとなるように、前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを含む、請求項２の使用。

【請求項14】

前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドが皮下投与用に処方されている、請求項２の使用。

【請求項15】

前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドが静脈内投与用に処方されている、請求項２の使用。

【請求項16】

前記対象に対して、シタラビンの投与と同時に前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを投与する、請求項２の使用。

【請求項17】

前記対象に対して、シタラビンの投与と連続して前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを投与する、請求項２の使用。

【請求項18】

ＡＭＬ細胞のアポトーシス誘導において、前記シタラビンが前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドとの相乗効果を示す、請求項２および１２〜１７のいずれか一項に記載の使用。

【請求項19】

前記ＦＬＴ３変異がＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）変異である、請求項３又は４に記載の製品。

【請求項20】

ＡＭＬ細胞のアポトーシス誘導において、前記シタラビンが前記ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドとの相乗効果を示す、請求項３、４および１９のいずれか一項に記載の製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療用の医薬組成物、当該医薬組成物の製造におけるＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドの使用、およびＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを含む製品に関する。

【背景技術】

【0002】

ＡＭＬは、成熟細胞に分化する能力が低下した造血幹細胞及び前駆細胞（芽細胞）の制御のきかない増殖という特徴を有する、異質な一群の疾病である（Ｅｓｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３６８：１８９４−１９０７，２００６）。多くのＡＭＬ患者が伝統的な化学療法により完全な寛解（ＣＲ）を達成することができるが、ＡＭＬ患者の大多数はいずれ再発する。再発率は、ＦＬＴ３（ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３）遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）変異を有する患者で特に高い。ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異は、ＡＭＬ患者の約１／４に見出される（Ｌｅｖｉｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７：１７３８−１７５２，２００３）。現在いくつかのＦＬＴ３阻害剤が臨床試験下にあるが、いずれも未だＦＬＴ３変異を有するＡＭＬの治療に認可されていない（Ｆａｔｈｉ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓ．１：１７５−１８９，２０１１）。

【0003】

元々、抗ＨＩＶ化合物として発見された、ＡＭＤ３１００と称されるビシクラム系薬剤は、ＣＸＣＲ４に特異的な拮抗的相互作用を示す。ＣＸＣＲ４受容体をＡＭＤ３１００で遮断すると、造血前駆細胞の動態化が生じる。国際公開第２００７／０２２５２３号は、骨髄性又は造血性の悪性腫瘍に罹患した患者における化学療法の有効性を向上させるためのＡＭＤ３１００等のＣＸＣＲ４作動薬の使用を開示している。

【0004】

Ｔ−１４０は、ＣＸＣＲ４に対する特異的な結合を介して、Ｔ細胞へのＨＩＶ−１（Ｘ４−ＨＩＶ−１）の侵入を抑制する特異的なＣＸＣＲ４拮抗薬として開発された、１４残基合成ペプチドである（Ｔａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５３（３）：８７７−８８２，１９９８）。その後、ナノモルレベルでの阻害活性を有する特異的なＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドとして、Ｔ−１４０のペプチド類似体が開発された（Ｔａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１：３６６３−３６６９，２００３）、国際公開第２００２／０２０５６１号、国際公開第２００４／０２０４６２号、国際公開第２００４／０８７０６８号、国際公開第００／０９１５２号、米国特許第２００２／０１５６０３４号及び国際公開第２００４／０２４１７８号）。

【0005】

国際公開第２００４／０８７０６８号は、ケモカイン受容体、特にＣＸＣＲ４受容体の拮抗薬と、癌の治療、予防又は診断等におけるその使用とを開示している。当該公開公報では、ＣＸＣＲ４ペプチド拮抗薬の例としてＴ１４０、及びＴ１４０の誘導体が挙げられ、病態として乳房、脳、膵臓、卵巣、前立腺、腎臓などの癌及び非小細胞肺癌が挙げられている。

【0006】

国際公開第００／０９１５２号は、例えば癌の治療における、ＣＸＣＲ４拮抗薬のさまざまな治療的使用を開示している。

【0007】

国際公開第２００４／０２４１７８号は、アポトーシス誘導治療、及び／又は、患者における癌細胞の転移性拡散を予防するための、ＣＸＣＲ４受容体に対するリガンドとしてのケモカイン受容体拮抗薬の使用を開示している。

【0008】

米国特許出願公開第２００２／０１５６０３４号は、例えば癌などにおける造血細胞の治療のためのＣＸＣＲ４拮抗薬の使用を開示している。

【0009】

国際公開第２００２／０２０５６１号は、Ｔ−１４０のペプチド類似体及び誘導体を開示している。当該公開公報にて特許請求されたペプチドは、高い抗ＨＩＶウイルス活性と、低い細胞毒性とを明らかに示す強力なＣＸＣＲ４阻害剤であることが示されている。

【0010】

近年、ＣＸＣＲ４拮抗薬であるＴＮ１４０とＡＭＤ３１００との間の比較研究により、ＡＭＬに対する単剤療法として、ＴＮ１４０がＡＭＤ３１００よりも有効であることが示唆された。ＴＮ１４０と、ＴＮ１４０よりも程度は低いがＡＭＤ３１００は、ヒトＣＸＣＲ４発現ＡＭＬ細胞の退縮を誘導し、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）白血病開始細胞（ＬＩＣ）を標的とすることが開示されている（Ｙ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１２）。

【0011】

国際公開第２００４／０２０４６２号は、４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３を含む、Ｔ−１４０の更なる新規なペプチド類似体及び誘導体を開示している。本公開公報では、更に、Ｔ−細胞白血病等の癌の治療にＴ−１４０類似体を使用した予防のため及び治療のための組成物、並びに当該組成物を使用した方法が開示されている。

【0012】

Ｂｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９：２８２−９２，２０１１）では、４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３が、ＡＭＬなどの造血細胞起源の悪性細胞に対するＣＸＣＲ４依存性選択的細胞毒性を示すことが報告されている。インビボでは、４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３の皮下注射によってヒトＡＭＬ異種移植片の増殖が有意に低下した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、ＦＬＴ３変異を有する急性骨髄性白血病の治療のための新規な、安全かつ有効な医薬組成物を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明の態様によれば、ＦＬＴ３変異を有する急性骨髄性白血病の対象に投与するための治療用の医薬組成物が提供される。本医薬組成物は、配列番号１のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを有効成分として含み、対象はシタラビンを投与されているものである。

【0015】

本発明の態様によれば、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）変異を有するＡＭＬの治療を必要とする対象の治療のために識別された医薬の製造における、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドの使用が提供される。

【0016】

本発明の態様によれば、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）を有するＡＭＬの治療のための、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチド及び化学療法薬を含むＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドが提供される。

【0017】

本発明の態様によれば、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）変異を有するＡＭＬの治療のために識別された、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチド及び化学療法薬を含む製品が提供される。

【0018】

下記に記載される本発明の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチド及び化学療法薬は、別個の容器に入っている。

【0019】

下記に記載される本発明の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、ＦＬＴ３変異は、ＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）変異である。

【0020】

記載される本発明の好ましい実施形態における尚更なる特徴によれば、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、配列番号１に示す通りである。

【0021】

記載される本発明の好ましい実施形態における尚更なる特徴によれば、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、１日当たり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で対象に投与される。

【0022】

記載される本発明の好ましい実施形態における尚更なる特徴によれば、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、皮下に投与される。

【0023】

記載される本発明の好ましい実施形態における尚更なる特徴によれば、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、静脈内に投与される。

【0024】

記載される本発明の好ましい実施形態における尚更なる特徴によれば、急性骨髄性白血病の治療方法は、対象に治療的有効量の化学療法薬を投与するステップを更に含む。

【0025】

記載される本発明の好ましい実施形態における尚更なる特徴によれば、化学療法薬は、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃ）である。

【0026】

記載される本発明の好ましい実施形態における尚更なる特徴によれば、化学療法薬は、キザルチニブ（ＡＣ２２０）である。

【0027】

尚更なる特徴によれば、ＡＭＬ細胞のアポトーシス誘導において、化学療法薬はＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドと相乗効果を示す。

【0028】

本発明は、急性骨髄性白血病の安全かつ有効な新規な治療方法によって、現在既知の構成の問題点に対する対処法を提供する。

【0029】

特に定義しない限り、本明細書で使用される技術及び／又は科学用語の全ては、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の又は等価な方法及び材料を本発明の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を下記に記載する。矛盾する場合、そこに記載された定義も含めて、特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。

【0030】

本発明のいくつかの実施形態について、例示のために、添付の図面を参照して次に説明する。以下、特に図面を詳細に参照するにあたり、特定の項目は、例示のため、または本発明の実施形態の詳細な説明を目的とすることを強調する。この観点において、説明を図面と共に考慮することで、本発明の実施形態がどのように実践され得るかを当業者に明らかにする。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存に対する、ＢＬ−８０４０（８μＭ）、ＡＲＡ−Ｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）、又はそれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。図１Ａは、死細胞の出現率を示す。図１Ｂは、生存細胞の数を示す。一つの星印（^＊）は、未処理対照に対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。一対の星印（^＊＊）は、ＢＬ−８０４０のみの場合に対する統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。

【図2】ＦＬＴ３−ＷＴを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存に対するＢＬ−８０４０（８μＭ）、ＡＲＡ−Ｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）、又はそれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。図２Ａは、死細胞の出現率を示す。図２Ｂは、生存細胞数を示す。一つの星印（^＊）は、未処理対照に対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

【図3】ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するＭＶ４−１１ヒトＡＭＬ細胞の生存に対するＢＬ−８０４０（２０μＭ）、ＡＲＡ−Ｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）、又はそれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。図３Ａは、死細胞の出現率を示す。図３Ｂは、生存細胞の数を示す。一つの星印（^＊）は、未処理対照に対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。一対の星印（^＊＊）は、ＡＲＡ−Ｃのみの場合に対する統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。

【図4】ＦＬＴ３−ＷＴを有するＨＬ６０ヒトＡＭＬ細胞の生存に対するＢＬ−８０４０（２０μＭ）、ＡＲＡ−Ｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）、又はそれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。図４Ａは、死細胞の出現率を示す。図４Ｂは、生存細胞数を示す。一つの星印（^＊）は、未処理対照に対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。一対の星印（^＊＊）は、ＡＲＡ−Ｃのみの場合に対する統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。

【図5】ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するＭ４Ｖ−１１ヒトＡＭＬ細胞の生存に対するＢＬ−８０４０（８μＭ）、ＡＣ２２０（０．５ｎＭ）、又はそれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。図５Ａは、死細胞の出現率を示す。図５Ｂは、生存細胞数を示す。一つの星印（^＊）は、未処理対照に対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。一対の星印（^＊＊）は、ＡＣ２２０のみの場合に対する統計的有意差（ｐ＜０．０１）示す。

【図6】ＦＬＴ３−ＷＴを有するＨＬ６０ヒトＡＭＬ細胞の生存に対するＢＬ−８０４０（８μＭ）、ＡＣ２２０（０．５ｎＭ）、又はそれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。図６Ａは、死細胞の出現率を示す。図６Ｂは、生存細胞数を示す。一つの星印（^＊）は、未処理対照に対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

【図7】ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存に対するＢＬ−８０４０（２０μＭ）、ＡＣ２２０（５０ｎＭ）、又はそれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。図７Ａは、死細胞の出現率を示す。図７Ｂは、生存細胞数を示す。一つの星印（^＊）は、未処理対照に対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。一対の星印（^＊＊）は、ＡＣ２２０のみの場合に対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

【図8】ＦＬＴ３−ＷＴを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存に対するＢＬ−８０４０（２０μＭ）、ＡＣ２２０（５０ｎＭ）、又はそれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。図８Ａは、死細胞の出現率を示す。図８Ｂは、生存細胞数を示す。一つの星印（^＊）は、未処理対照に対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

【図9】ＢＬ−８０４０、ＡＣ２２０又は両方で処理したＮＳＧマウスの血液中のＡＭＬ生細胞の百分率を示す棒グラフである。

【図10】処理から７日後の、ＢＬ−８０４０、ＡＣ２２０又は両方で処理したＮＳＧマウスの血液中の総白血球数を示す棒グラフである。

【図11A】ＢＬ−８０４０、ＡＣ２２０又は両方で処理したＮＳＧマウスの骨髄（ＢＭ）中のＡＭＬ生細胞の百分率を示す棒グラフである。

【図11B】ＢＬ−８０４０、ＡＣ２２０又は両方で処理したＮＳＧマウスの骨髄（ＢＭ）中のＡＭＬ生細胞数を示す棒グラフである。

【図12A】ＢＬ−８０４０、ＡＣ２２０又は両方で処理したＮＳＧマウスの脾臓中のＡＭＬ生細胞数を示す棒グラフである。

【図12B】ＢＬ−８０４０、ＡＣ２２０又は両方で処理したＮＳＧマウスの脾臓中のＡＭＬ生細胞の百分率を示す棒グラフである。

【図13A】ＢＬ−８０４０、ＡＣ２２０又は両方で処理したＮＳＧマウスの骨髄（ＢＭ）中のアポトーシスＡＭＬ細胞数を示す棒グラフである。

【図13B】ＢＬ−８０４０、ＡＣ２２０又は両方で処理したＮＳＧマウスの骨髄（ＢＭ）中のアポトーシスＡＭＬ細胞の百分率を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0032】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＦＬＴ３変異を有する急性骨髄性白血病の治療におけるＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドの使用に関する。

【0033】

本発明の原理及び作用は、図面及び付随する説明を参照して、より深く理解することができる。

【0034】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の用途は、下記記載、又は実施例による例示によって示される詳細に必ずしも限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態、又は、様々な方法で実践若しくは実行することが可能である。また、本明細書で使用される表現及び専門用語は、説明を目的とし、限定として見なされるべきではないことを理解されたい。

【0035】

ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者の約１／４に見出され、特に予後が悪いと考えられている（Ｌｅｖｉｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７：１７３８−１７５２，２００３）。

【0036】

本発明の実施化に当たり、本発明者らは、驚くべきことに、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドＢＬ−８０４０（配列番号１）が、野生型ＡＭＬ細胞と比較して、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ細胞に対して実質的により有毒であることを発見した（下記の実施例１を参照されたい）。

【0037】

本発明の態様によれば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療方法が提供される。本方法は、（ｉ）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）変異を有するＡＭＬの対象を識別するステップと、（ｉｉ）対象に、治療的有効量のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドを投与するステップとを含む。

【0038】

野生型ＦＬＴ３配列は、配列番号７３及び７４に示した。

【0039】

ＦＬＴ３変異を有するＡＭＬの対象は、例えばＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．５： ９６-１０２，２００３に記載されている方法など当技術分野にて既知の方法を用いて識別することができる。ＦＬＴ３における変異は、Ｍａｒｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００５ ３７（６）：１１６８−７２；及びＮａｋａｏ ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０（１２）：１９１１−８にも記載されている。

【0040】

ＦＬＴ３遺伝子における遺伝子内縦列重複は、典型的には、異常な（abbarent）ＲＮＡ転写産物により特徴付けられる。このような異常なＲＮＡ転写産物は、エクソン１１内の単純な内部重複、４ｂｐの挿入を伴う内部重複（２６ｂｐ）、又はエクソン１１の３’部分からイントロン１１にわたる１３６ｂｐ配列及びエクソン１２の最初の１６ｂｐ配列における、１ｂｐの挿入を伴う重複に由来するものである（Ｎａｋａｏ、前出参照）。他の異常も存在し得る。

【0041】

特定の実施形態によれば、ＦＬＴ３変異は、タンパク質の活性化をもたらす。

【0042】

一実施形態において、ＦＬＴ３変異は、ＦＬＴ３遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）変異である（Ｌｅｖｉｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７：１７３８−１７５２，２００３；Ｎａｋａｏ前出）。

【0043】

別の実施形態によれば、ＦＬＴ３変異は、８３５位のアスパラギン酸残基におけるミスセンス変異である。

【0044】

本明細書において「ペプチド」は、ネイティブなペプチド（分解生成物、合成的に合成されたペプチド、又は組み換えペプチドのいずれか）及びペプチド模倣薬（典型的には、合成的に合成されたペプチド）、並びにペプチド類似体であるペプトイド及びセミペプトイド、例えば、ペプチドの体内での安定性あるいは細胞浸透性を高めるような修飾を有するものを包含する。

【0045】

本発明のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３（配列番号１）類似体及び誘導体と称されることもある。また、下記に詳細する「Ｔ−１４０類似体」としても既知の、国際公開第２００２／０２０５６１号及び国際公開第２００４／０２０４６２号の特許出願に開示されているペプチドと構造的及び機能的に関連している。理論にとらわれるものではないが、本発明のペプチドは、骨髄性白血病細胞の増殖停止及び／又は死を誘導することが示唆される。

【0046】

本明細書において「ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチド」は、そのペプチド拮抗薬が存在しない場合に比べてＣＸＣＲ−４の活性化を少なくとも１０％低下させるペプチドである。特定の実施形態によれば、ペプチド拮抗薬は、競合阻害剤である。特定の実施形態によれば、ペプチド拮抗薬は、非競合阻害剤である。

【0047】

本明細書において「ペプチド」は、ネイティブなペプチド（分解生成物、合成的に合成されたペプチド、又は組み換えペプチドのいずれか）及びペプチド模倣薬（典型的には、合成的に合成されたペプチド）、並びにペプチド類似体であるペプトイド及びセミペプトイド、例えば、ペプチドの体内での安定性あるいは細胞浸透性を高めるような修飾を有するものを包含する。

【0048】

特定の実施形態によれば、ペプチドは、１００アミノ酸以下の長さを有する。特定の実施形態によれば、ペプチドは、５〜１００アミノ酸の長さを有する。特定の実施形態によれば、ペプチドは、５〜５０アミノ酸の長さを有する。特定の実施形態によれば、ペプチドは、５〜２０アミノ酸の長さを有する。特定の実施形態によれば、ペプチドは、５〜１５アミノ酸の長さを有する。特定の実施形態によれば、ペプチドは、１０〜２０アミノ酸の長さを有する。特定の実施形態によれば、ペプチドは、１０〜１５アミノ酸の長さを有する。

【0049】

特定の実施形態によれば、本発明のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、例えば４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３（配列番号１）類似体及び誘導体であり、下記に詳細する「Ｔ−１４０類似体」としても既知の、国際公開第２００２／０２０５６１号及び国際公開第２００４／０２０４６２号の特許出願に開示されているペプチドと構造的及び機能的に関連している。

【0050】

様々な特定の実施形態において、Ｔ−１４０類似体又は誘導体は、以下の式（Ｉ）に示すアミノ酸配列、又はその塩を有する。

【化1】

【0051】

式中：
Ａ_１は、アルギニン、リシン、オルニチン、シトルリン、アラニン若しくはグルタミン酸残基、若しくはこれらのアミノ酸のＮ−α−置換誘導体である、又はＡ_１は不在であり；
Ａ_２は、Ａ_１が存在する場合、アルギニン若しくはグルタミン酸残基を表し、又、Ａ_１が不在の場合、Ａ_２は、アルギニン若しくはグルタミン酸残基、若しくはこれらのアミノ酸のＮ−α−置換誘導体を表し；
Ａ_３は、芳香族アミノ酸残基を表し；
Ａ_４、Ａ_５及びＡ_９は、各々独立して、アルギニン、リシン、オルニチン、シトルリン、アラニン又はグルタミン酸残基を表し；
Ａ_６は、プロリン、グリシン、オルニチン、リシン、アラニン、シトルリン、アルギニン又はグルタミン酸残基を表し；
Ａ_７は、プロリン、グリシン、オルニチン、リシン、アラニン、シトルリン又はアルギニン残基を表し；
Ａ_８は、チロシン、フェニルアラニン、アラニン、ナフチルアラニン、シトルリン又はグルタミン酸残基を表し；
Ａ_１０は、シトルリン、グルタミン酸、アルギニン又はリシン残基を表し；
Ａ_１１は、アルギニン、グルタミン酸、リシン又はシトルリン残基を表し、Ｃ−末端カルボキシル基は、誘導体化されていてもよく；
４位又は１３位のシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成してもよく、アミノ酸は、Ｌ型又はＤ型のいずれであってもよい。

【0052】

式（Ｉ）による例示的なペプチドは、下記の表１に提示する配列番号１〜７２の任意の１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチドである。

【0053】

【表1-1】

【0054】

【表1-2】

【0055】

特定の実施形態によれば、配列番号１〜７２の各々において、２つのシステイン残基は、ジスルフィド結合にて結合されている。

【0056】

別の実施形態において、類似体又は誘導体は、配列番号６５（Ｈ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｉｔ−Ｌｙｓ−ＤＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｃｉｔ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ＯＨ；ＴＣ１４００３）に示すアミノ酸配列を有する。

【0057】

別の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用されるペプチドは、本質的に配列番号１に示すアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、本発明の組成物及び方法に使用されるペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％相同である。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％相同である。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１に対して少なくとも約９５％相同である。上記可能な形態はそれぞれ本発明の別々の実施形態を表す。

【0058】

様々な別の実施形態において、ペプチドは、配列番号１〜７２から選択され、上記可能な形態はそれぞれ本発明の別々の実施形態を表す。

【0059】

別の実施形態において、ペプチドは、配列番号１〜４、１０、４６、４７、５１〜５６、６５、６６、６８、７０及び７１の任意の１つに示すアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号４、１０、４６、４７、６８及び７０の任意の１つに示すアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、２、５１、６５及び６６の任意の１つに示すアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３〜５６の任意の１つに示すアミノ酸配列を有する。

【0060】

一実施形態において、ペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号５１に示すアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号６６に示すアミノ酸配列を有する。

【0061】

他のＣＸＣＲ４ペプチド阻害剤（拮抗薬）としては、ＬＹ２５１０９２４（Ｌｉｌｌｙ Ｏｎｃｏｌｏｇｙによる）、ＣＴＣＥ−９９０８（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５５：２３１−２３６）、Ｆｃ１３１類似体、及び下記の引用文献（その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に特定されているナノボディが挙げられるが、これらに限定されない：

【0062】

Ｔａｎ ＮＣ，Ｙｕ Ｐ，Ｋｗｏｎ Ｙ−Ｕ，Ｋｏｄａｄｅｋ Ｔ．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｅｐｔｏｉｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００８；１６：５８５３−６１
Ｋｗｏｎ Ｙ−Ｕ，Ｋｏｄａｄｅｋ Ｔ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｅｐｔｏｉｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００７；１２９：１５０８
Ｍｉｌｌｅｒ Ｓ，Ｓｉｍｏｎ Ｒ，Ｎｇ Ｓ，Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ Ｒ，Ｋｅｒｒ Ｊ，Ｍｏｏｓ Ｗ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｌ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，Ｄ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，ａｎｄ Ｎ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｅｐｔｏｉｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｒｅｓ．１９９５；３５：２０−３２
Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｙ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ，Ｏｉｓｈｉ Ｓ，Ｆｕｊｉｉ Ｎ，Ｆｕｒｕｙａ Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ ＣＸＣＲ４ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ＣＸＣＲ４−ＦＣ１３１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２０１２；２２：２１４６−５０
Ｊａａｈｎｉｃｈｅｎ Ｓ，Ｂｌａｎｃｈｅｔｏｔ Ｃ，Ｍａｕｓｓａｎｇ Ｄ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐａｊｕｅｌｏ Ｍ，Ｃｈｏｗ ＫＹ，Ｂｏｓｃｈ Ｌ，Ｄｅ Ｖｒｉｅｚｅ Ｓ，Ｓｅｒｒｕｙｓ Ｂ，Ｕｌｒｉｃｈｔｓ Ｈ，Ｖａｎｄｅｖｅｌｄｅ Ｗ．ＣＸＣＲ４ ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（ＶＨＨ−ｂａｓｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ）ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｎｄ ＨＩＶ−１ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｉｚｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０；１０７：２０５６５−７０。

【0063】

本発明のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、ＦＬＴ３変異を有するＡＭＬの対象の治療に使用される。

【0064】

本明細書において「治療する」は、病態（疾病、疾患又は状態、即ち、ＦＬＴ３変異を有する急性骨髄性白血病）の発達を阻害、予防若しくは停止させ、及び／又は、病態の減少、寛解若しくは軽減を引き起こすことを指す。当業者は、様々な方法論及びアッセイを用いて病態の発達を評価できる。また同様に、様々な方法論及びアッセイを用いて病態の減少、寛解又は軽減を評価できることを理解するであろう。

【0065】

本明細書において「予防する」は、疾病の危険性を有し得るが、まだ疾病にかかったと診断されていない患者において、疾病、疾患又は状態の発生を防ぐことを指す。

【0066】

本明細書において「対象」は、病態を持つすべての年齢の哺乳動物、好ましくはヒトを含む。

【0067】

本発明のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、単独で、又は１つ以上の化学療法薬と組み合わせて投与されてもよい。

【0068】

本明細書において「化学療法薬」は、癌の治療において、治療的有用性を有する任意の化学的薬剤を指す。本明細書で使用される化学療法薬は、化学的及び生物的薬剤の両方を包含する。これらの薬剤は、癌細胞が継続的な生存のために依存する細胞活動を阻害するよう機能する。化学療法薬のカテゴリーには、アルキル化剤／アルカロイド剤、代謝拮抗薬、ホルモン又はホルモン類似体、そのほか多くの抗悪性腫瘍薬が含まれる。これらの薬物の全部ではないが殆どは、癌細胞に対して直接有毒であり、免疫刺激を必要としない。好適な化学療法薬は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎのＳｌａｐａｋ ａｎｄ Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８６；Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２^ｎｄ ｅｄ．，２０００ ＣｈｒｃｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｉｎｃ．のＰｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，Ｃｈ １７；Ｂａｌｔｚｅｒ Ｌ．ａｎｄ Ｂｅｒｋｅｒｙ Ｒ．（ｅｄｓ）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，２^ｎｄ ｅｄ．Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｄ．Ｓ．，Ｋｎｏｂｆ Ｍ．Ｆ．，Ｄｕｒｉｖａｇｅ Ｈ．Ｊ．（ｅｄｓ）：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４^ｔｈ ｅｄ．Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。

【0069】

いくつかの実施形態において、本発明の化学療法薬は、シタラビン（シトシンアラビノシド、Ａｒａ−Ｃ、サイトサール−Ｕ）、キザルチニブ（ＡＣ２２０）、ソラフェニブ（ＢＡＹ ４３−９００６）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、プロカルバジン、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、エトポシド、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、デキサメサゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、全トランスレチノイン酸、三酸化ヒ素、インターフェロン−α、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イマチニブメシル酸塩、サイトサール−Ｕ、メルファラン、ブスルファン（ミレラン（登録商標））、チオテパ、ブレオマイシン、白金（シスプラチン）、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標））、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、５−アザシチジン、クラドリビン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、６−チオグアニン、又はそれらの任意の組み合わせである。

【0070】

一実施形態において、化学療法薬は、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃ）である。

【0071】

別の実施形態において、化学療法薬は、キザルチニブ（ＡＣ２２０）である。

【0072】

興味深いことに、ＣＸＣＲ４ペプチド拮抗薬（例えば、配列番号１）と化学療法薬（例えば、ＡＣ２２０）との組み合わせは、ＡＭＬ細胞のアポトーシスの誘発において相乗作用を生じる。

【0073】

本発明のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチド及び化学療法薬は、対象に同時に又は連続して投与されてもよい。

【0074】

本発明のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、活性成分としてそのまま、又は、好適な担体若しくは賦形剤と混合した医薬組成物として対象に投与されてもよい。

【0075】

本明細書において、「医薬組成物」は、生理学的に好適な担体及び賦形剤等の他の化学構成成分を有する、本明細書に記載される活性成分のうちの１つ以上の製剤を指す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。

【0076】

本明細書において、「活性成分」は、生物学的効果を担うペプチドを指す。場合により、本明細書で下記に更に記載するように、化学療法薬、放射線剤等の複数の活性成分が処方中に含まれてもよい。

【0077】

以後「生理学的に許容され得る担体」及び「薬学的に許容され得る担体」は交換可能に使用され得るが、生物に対して有意な刺激作用を生じず、また投与される化合物の生物学的活性及び特性を抑制しない担体又は希釈剤を指す。

【0078】

本明細書において、「賦形剤」は、医薬組成物に添加されて、活性成分の投与を更に容易にする不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々なタイプの糖及び澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。

【0079】

薬物の調製及び投与のための技術は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見出すことができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，２０^ｔｈ ｅｄ，２０００）。

【0080】

本発明の医薬組成物は、例えば、従来からの混合、溶解、顆粒化、糖衣錠形成、微粒子化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥など、当技術分野にて周知のプロセスにより製造することができる。

【0081】

本発明による使用のための医薬組成物は、活性成分の薬学的に使用され得る製剤への加工を容易にする、賦形剤及び補助剤を含む生理学的に許容され得る担体を１種以上使用して、従来からの方法で処方してもよい。適切な処方は、選ばれる投与経路に依存する。

【0082】

一実施形態において、本発明のペプチド、又は該ペプチドを含む医薬組成物は、皮下に投与される。

【0083】

別の実施形態では、本発明のペプチド、又は該ペプチドを含む医薬組成物は、静脈内に投与される。

【0084】

注射の場合、医薬組成物の活性成分は、水溶液（例えば、ＷＦＩ）、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液等の生理学的適合性を有する緩衝液として処方されてもよい。

【0085】

投与用として使われうる医薬組成物としては、水溶性の形態として活性製剤の水溶液が挙げられる。加えて、活性成分の懸濁液を、適切な油性の又は水性の注射懸濁液として調製してもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、又は、オレイン酸エチル、トリグリセリド、若しくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性の注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストラン等の、懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよい。場合により、懸濁液はまた、高濃度溶液を調製するために、好適な安定剤、又は活性成分の溶解度を増大させる成分を含んでもよい。

【0086】

あるいは活性成分は粉末形態にあってもよく、使用前に好適なビヒクル、例えば、無菌かつパイロジェンフリーの水性溶液を用いて再構成する。

【0087】

上記の代替となる実施形態は、当技術分野にて周知の、対象内での活性成分の徐放または活性持続時間の延長をもたらすデポー剤を含む。

【0088】

本発明における使用に好適な医薬組成物には、意図される目的を達成するのに有効な量の活性成分を含む組成物が含まれる。治療的有効量の決定は、通常の技術範囲で、特に本明細書によって提供される詳細な開示をもとに、当業者が十分に行うことができる。

【0089】

本発明の方法に使用される任意の製剤について、治療的有効量又は用量は、まずインビトロのアッセイおよび細胞培養アッセイから概算することができる。例えば、動物モデルにおいて所望の濃度又は力価を達成する、用量を処方してもよい。得られた情報からヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。

【0090】

本明細書に記載される活性成分の毒性及び治療有効性は、標準的な薬学的手順により、インビトロ、細胞培養物又は実験動物で決定してもよい（後の実施例、及びＳｅｋｉｄｏ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ １３７（１）：３３−４２を参照）。これらのインビトロ、細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトで使用される投与量の範囲を決定するのに使用することができる。投与量は、使用する剤形と、利用する経路とに応じて変化し得る。正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して、個々の医師により選択されうる。（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ．，１９７５，“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１ ｐ．１参照）。

【0091】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチド、又は該ペプチドを含む医薬組成物の１日当たりの用量は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、０．３〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．３〜２ｍｇ／ｋｇ体重、０．３〜１ｍｇ／ｋｇ体重、又は０．３〜０．９ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。

【0092】

いくつかの実施形態において、本発明の化学療法薬、又は当該化学療法薬を含む医薬組成物の１日当たりの用量は、１〜１０ｇ／平方メートル体表面積、１．５〜５ｇ／平方メートル体表面積、又は２〜４ｇ／平方メートル体表面積の範囲内である。

【0093】

治療の継続時間及び頻度について、熟練した臨床医は、治療がいつ治療的利益を提供するかの決定や、投与量や投与頻度の増減、治療の中断、治療の再開、又はその他の治療計画の変更について決定するために、対象のモニタリングを行うことは、通常の手順である。投与スケジュールは、血球数（例えば、赤血球又は白血球レベル、ヘモグロビンレベル等）やペプチドに対する対象の感受性などの多数の臨床的因子に応じて変動し得る。所望の用量は、１回で投与されてもよく、又は、サブ用量、例えば、２〜４のサブ用量に分割され、例えば１日を通して適切な間隔で、若しくは他の適切なスケジュールで、ある期間にわたって投与されてもよい。そのようなサブ用量は、単位剤形で投与されてもよい。

【0094】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドは、化学療法薬の投与に先立って、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、又は少なくとも２ヶ月間、投与される。

【0095】

本明細書に記載される活性成分、即ちＣＸＣＲ４拮抗性ペプチド及び化学療法薬は、包装されて製品とされてもよい。本発明の実施形態によれば、そのような製品は、少なくとも２つの別個の容器（例えば、３つ以下の容器）を含んでもよい。１つの容器がＣＸＣＲ−４ペプチド拮抗薬（例えば、配列番号１に示すペプチド）を梱包したものであり、他の容器が化学療法薬（例えば、ａｒａ−Ｃ）を梱包したものである。製品は、ラベル、及び／又は、骨髄性白血病（例えば、ＡＭＬ）の治療のための説明書を含んでもよい。

【0096】

上記に代えて、または上記に加えて、ＣＸＣＲ４阻害剤（例えば、配列番号１）及び化学療法薬（シタラビン）を共処方して、上述したような医薬組成物に処方してもよい。

【0097】

それ故、本発明のいくつかの実施形態の組成物（ＣＸＣＲ４拮抗薬、化学療法、又はこれらの組み合わせ）及び／又は物品は、所望により、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を収容し得る、ＦＤＡ認可キットのようなパックやディスペンサー装置内に入っていてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックのような金属又はプラスチック箔を含んでもよい。パックやディスペンサー装置は、投与のための説明書が添えられてもよい。パックやディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用又は販売を規制している行政機関により規定された形態の通知書を、容器に収容していてもよく、このような通知書は、組成物、又はヒトへの投与若しくは獣医学的投与の形態が、当機関により認可されていることの証明となる。そのような通知書は、例えば、処方薬に関して米国食品医薬品局（U.S. Food and Drug Administration）により認可されたラベル、又は、認可された製品説明書（insert）であり得る。適合する医薬担体中に処方された本発明の製剤を含む組成物を調製し、適切な容器（例えば、凍結乾燥バイアル）に収容し、上記で詳述した病状の治療用である旨のラベルを付すこともできる。

【0098】

本明細書において「約」は、±１０％を指す。

【0099】

本明細書において「方法」は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を指し、これらに限定されるものではないが、化学分野、薬理学分野、生物学分野、生化学分野及び医療分野の事業従事者に既知の様式、手段、技術及び手順、あるいは当該既知の様式、手段、技術及び手順から容易に開発可能な様式、手段、技術及び手順を含むが、これらに限定されない、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順が挙げられる。

【0100】

明確さのために別個の実施形態の文脈にて記載される本発明の所定の特徴は、また、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈にて記載される本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の好適なサブコンビネーションで、又は適宜記載された本発明の任意の他の実施形態にも提供され得る。様々な実施形態の文脈にて記載される所定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは動作不能でない限り、それらの実施形態の必須の特徴と考えられるべきではない。

【0101】

上述したように本明細書に記載され、特許請求の範囲に請求される本発明のさまざまな実施形態及び態様は、以下の実施例によって実験的に支持されるものである。

【0102】

実施例
ここで、上記の記載と共に本発明を限定することなく説明する以下の実施例に参照する。

【0103】

一般に、本明細書で使用する用語体系、及び本発明に利用される検査法は、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術、及び組み換えＤＮＡ技術などを含む。それらの技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，８０１，５３１号；米国特許第５，１９２，６５９号及び米国特許第５，２７２，０５７号に示される方法論；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ − Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，Ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（Ｅｄｓ．），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照されたい；また利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学文献に広範囲に記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号；米国特許第３，８３９，１５３号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，８５０，５７８号；米国特許第３，８５３，９８７号；米国特許第３，８６７，５１７号；米国特許第３，８７９，２６２号；米国特許第３，９０１，６５４号；米国特許第３，９３５，０７４号；米国特許第３，９８４，５３３号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，０３４，０７４号；米国特許第４，０９８，８７６号；米国特許第４，８７９，２１９号；米国特許第５，０１１，７７１号及び米国特許第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。これらの全ては、本明細書に完全に示されるが如く参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献も本文書全体に提供されている。これらに記載されている手順は、当技術分野にて周知であると考えられ、読者の利便性のために提供される。これらに含まれる情報の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例1】

【0104】

単独、又は、化学療法薬と組み合わせたＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドＢＬ−８０４０のインビトロでのＡＭＬ細胞の生存に対する効果

【0105】

材料及び方法
薬剤
ＢＬ−８０４０（４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３；配列番号１）を合成し、ＭＳＤ Ｎ．Ｖ．により凍結乾燥した。
ＡＲＡ−Ｃ（シタラビン）をＨａｄａｓｓａｈ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃａ ｐｈａｒｍａｃｙ（イスラエル国）から購入した。
ＡＣ２２０（キザルチニブ）をＳｅｌｌｅｃｋ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国）から購入した。

【0106】

ＡＭＬ細胞
以下の細胞株を、ＡＴＣＣから入手した：ＭＶ４−１１（ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するヒトＡＭＬ細胞）及びＨＬ６０（野生型ＦＬＴ３（ＦＬＴ３−ＷＴ）を有するヒトＡＭＬ細胞）。

【0107】

ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するヒト初代ＡＭＬ細胞、及びＦＬＴ３−ＷＴを有するヒト初代ＡＭＬ細胞は、Ｃｈａｉｍ Ｓｈｅｂａ医療センター（Ｃｈａｉｍ Ｓｈｅｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）（イスラエル国、テルアビブ）の規則に従って同意を得た後にＡＭＬ患者から入手した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、スウェーデン国、ウプサラ）を使用した密度勾配遠心分離により、血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。１０％ ＤＭＳＯを添加した１％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，イスラエル国、キブツ ベイト ハメニク）中に細胞を懸濁した後、液体窒素中に保管した。毒性アッセイの開始に先だって、単離された細胞を解凍し、２０％ ＦＣＳを添加したロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ １６４０；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁し、３７℃で４時間インキュベートした。ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異又は野生型ＦＬＴ３（ＦＬＴ３−ＷＴ）を有する単離細胞を、Ｌｅｖｉｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７：１７３８−１７５２，２００３）に記載された手順と実質的に同じ方法を使用することによって識別した。

【0108】

生存アッセイの手順
ＢＬ−８０４０（８μＭ又は２０μＭ）、ＡＲＡ−Ｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＡＣ２２０（０．５又は５０ｎＭ）又はそれらの組み合わせを含むか含まない、１％ ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地中に、９６穴プレート内のウェル当たり２×１０^５細胞／２５０μｌの細胞を播種した。５％ ＣＯ_２を含む湿気のある雰囲気内にて３７℃で、培養物を４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ，米国、セントルイス；１：１０００）で染色し、死細胞（％ＰＩ陽性）の出現率と、生存細胞（ＰＩ陰性）の密度とを、Ｂｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｂｅｇｉｎ（Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３９：２８２−９２，２０１１）に記載された手順を用いＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用して決定した。

【0109】

結果
野生型ＦＬＴ３遺伝子を有するヒトＡＭＬ細胞をＢＬ−８０４０に暴露したことにより、死細胞の出現率（％死細胞）が増加し、生存細胞密度（生存細胞の数）が低下した。しかしながら、最も驚くべきことに、（野生型ＦＬＴ３とは違って）ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有する類似したＡＭＬ細胞に対するＢＬ−８０４０単独の効果は、実質的により強く、死細胞の百分率のレベルはより高く、生存細胞数のレベルはより低かった。ＢＬ−８０４０（即ち、配列番号１、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ細胞に対してより効果的）の示すこの差別的な効果は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＡＭＬが標準的な化学療法に抵抗性であるという知見故に、予想に反するものであった。

【0110】

図１Ａは、ＢＬ−８０４０（８μＭ）への暴露が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を７９．３％も増大させたことを示す。比較して、ＢＬ−８０４０は、野生型ＦＬＴ３を有するヒト初代ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を１３．７％しか増大させなかった（図２Ａ）。

【0111】

図１Ｂは、ＢＬ−８０４０（８μＭ）への暴露が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存細胞数を２８．８％低下させたことを示す。比較して、ＢＬ−８０４０は、野生型ＦＬＴ３を有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存細胞数を１６．１％しか低下させなかった（図２Ｂ）。

【0112】

図７Ａは、ＢＬ−８０４０（２０μＭ）への暴露が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を１１６．６％も増大させたことを示す。比較して、ＢＬ−８０４０は、野生型ＦＬＴ３を有するヒト初代ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を５６．３％しか増大させなかった（図８Ａ）。

【0113】

図７Ｂは、ＢＬ−８０４０（２０μＭ）がＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存細胞数を５０．０％低下させたことを示す。比較して、ＢＬ−８０４０は、野生型ＦＬＴ３を有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存細胞数を３４．４％しか低下させなかった（図８Ｂ）。

【0114】

ＢＬ−８０４０を化学療法薬（ＡＲＡ−Ｃ又はＡＣ２２０）と組み合わせた場合、ＡＭＬ細胞の生存に対する混合物の（死細胞の出現率と、残存する生存細胞の密度とにより決定される）組み合わせ効果は、野生型ＦＬＴ３を有するＡＭＬ細胞に対するよりも、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ細胞に対するほうがかなり強かった。

【0115】

図１Ａは、ＡＲＡ−Ｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせたＢＬ−８０４０（８μＭ）が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を１１０．３％も増大させたことを示す。比較して、同一の組み合わせ処理は、野生型ＦＬＴ３を有するヒト初代ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を１３．７％しか増大させなかった（図２Ａ）。

【0116】

図１Ｂは、ＡＲＡ−Ｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせたＢＬ−８０４０（８μＭ）が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存細胞数を４４．４％低下させたことを示す。比較して、同一の組み合わせ処理は、野生型ＦＬＴ３を有するヒト初代ＡＭＬ細胞の生存細胞数を３．３％しか低下させなかった（図２Ｂ）。

【0117】

図３Ａは、ＡＲＡ−Ｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせたＢＬ−８０４０（２０μＭ）が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒトＭＶ４−１１ ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を１４３．７％も増大させたことを示す。比較して、同一の組み合わせ処理は、野生型ＦＬＴ３を有するヒトＨＬ−６０ ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を３２．４％しか増大させなかった（図４Ａ）。

【0118】

図３Ｂは、ＡＲＡ−Ｃ（５０ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせたＢＬ−８０４０（２０μＭ）が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒトＭＶ４−１１ ＡＭＬ細胞の生存細胞数を７３．８％低下させたことを示す。比較して、同一の組み合わせ処理は、野生型ＦＬＴ３を有するヒトＨＬ−６０ ＡＭＬ細胞の生存細胞数を５０．０％しか低下させなかった（図４Ｂ）。

【0119】

図５Ａは、ＡＣ２２０（０．５μＭ）と組み合わせたＢＬ−８０４０（２０μＭ）が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒトＭＶ４−１１ ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を２１８．２％も増大させたことを示す。比較して、同一の組み合わせ処理は、野生型ＦＬＴ３を有するヒトＨＬ−６０ ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を８．８％しか増大させなかった（図６Ａ）。

【0120】

図５Ｂは、ＡＣ２２０（０．５μＭ）と組み合わせたＢＬ−８０４０（２０μＭ）が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒトＭＶ４−１１ ＡＭＬ細胞の生存細胞数を７８．８％低下させたことを示す。比較して、同一の組み合わせ処理は、野生型ＦＬＴ３を有するヒトＨＬ−６０ ＡＭＬ細胞の生存細胞数を５１．４％しか低下させなかった（図６Ｂ）。

【0121】

図７Ａは、ＡＣ２２０（５０μＭ）と組み合わせたＢＬ−８０４０（２０μＭ）が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒトＭＶ４−１１ ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を１５０．０％増大させたことを示す。比較して、同一の組み合わせ処理は、野生型ＦＬＴ３を有するヒトＨＬ−６０ ＡＭＬ細胞の死細胞百分率を６４．６％しか増大させなかった（図８Ａ）。

【0122】

図７Ｂは、ＡＣ２２０（５０μＭ）と組み合わせたＢＬ−８０４０（２０μＭ）が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するヒトＭＶ４−１１ ＡＭＬ細胞の生存細胞数を８５．７％低下させたことを示す。比較して、同一の組み合わせ処理は、野生型ＦＬＴ３を有するヒトＨＬ−６０ ＡＭＬ細胞の生存細胞数を３４．８％しか低下させなかった（図８Ｂ）。

【0123】

これらの結果から、ＣＸＣＲ４拮抗性ペプチドＢＬ−８０４０が、単独でも化学療法薬と組み合わせても、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＡＭＬの治療に対して、非常に有利であることがわかる。

【実施例2】

【0124】

ＡＭＬ ＦＬＴ３−ＩＴＤモデルにおいて、ＢＬ−８０４０はＡＭＬ細胞のアポトーシスを誘発し、この効果はＡＣ２２０の存在下で更に増大する。

【0125】

本発明者らは、ＦＬＴ３変異を有するＡＭＬ細胞の生存及びアポトーシスに対するＢＬ−８０４０単独の場合、あるいはＦＬＴ３阻害剤ＡＣ２２０と組み合わせた場合の効果を試験した。

【0126】

方法：ヒトＡＭＬ ＭＶ４−１１細胞（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）を使用した。細胞をＢＬ−８０４０（２０μＭ）、ＡＣ２２０（５０ｎＭ）、又はそれらの組み合わせの存在下で、インビトロで４８時間インキュベートした。生存細胞のレベル、及びアポトーシスの百分率をＦＡＣＳにより評価した。

【0127】

インビボでの試験では、ＭＶ４−１１細胞を移植したＮＯＤ ＳＣＩＤ γ（ＮＳＧ）マウスのＡＭＬモデルを使用した。移植から３週間後には、マウスを７日間連続して毎日、ＢＬ−８０４０の皮下（ＳＣ）注射（４００ｕｇ／マウス）、又はＡＣ２２０（１０ｍｇ／Ｋｇ）の経口投与、又はそれらの組み合わせで処理した。ＡＭＬ細胞の生存及びアポトーシスを、移植マウスの血液、ＢＭ及び脾臓について調べた。

【0128】

試験の概要を下記に記す。
マウス
対照 ４匹
ＢＬ８０４０ ５匹
ＡＣ２２０ ５匹
ＢＬ８０４０＋ＡＣ２２０ ５匹
７〜９週齢の雌マウス
（−１）日目 ２０１４／１／２６：細胞注射の２４時間前に、マウスに２００ｒａｄ照射した。
０日目 ２０１４／１／２７：マウスに総容積２００μｌ ＰＢＳ中の１０×１０^６のＭＶ４−１１細胞をＩＶ注射した。
１６日目 ２０１４／２／１２
血液中のｈＣＤ４５^＋細胞のレベルをＦＡＣＳにより評価した：
５０μｌの血液を１ｍｌのＡＣＫで溶解し、ＡＰＣ−抗ヒトＣＤ４５（１：４０）と共にインキュベートした。
細胞を３００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ＰＩ染色の後、ＦＡＣＳにより高速で３０分間読み取った。
１７日目 ２０１４／２／１３：マウスに対して、４００μｇ／マウスのＢＫＴ１４０（４００−５００−１１０）のＳＣ注射、又はＡＣ２２０の経口投与、又はそれらの組み合わせを行った。
２０１４／２／１３〜２０１４／２／１９ ７日間連続してＢＫＴ１４０やＡＣ２２０で毎日処理を行った。
２４日目 ２０１４／２／２０：マウスを屠殺し、各マウスから脾臓、血液及び４本の骨を採取した。

【0129】

結果：
インビトロにおいて、ＢＬ−８０４０によるＡＭＬ細胞の処理は、直接的に細胞増殖を３５％阻害し、細胞死を４０％増大させた。ＡＣ２２０は６０％の細胞に細胞死を誘発し、ＢＬ−８０４０とＡＣ２２０との組み合わせは更に、これらの薬剤のアポトーシス効果を増大させ、細胞生存率を９７％も低下させ、ＡＭＬ細胞の細胞死を９３％も誘発することが見出された。

【0130】

インビボにおいて、ＢＬ−８０４０は、血液中のＡＭＬ生芽細胞の百分率を、対照の１３．５％から１．７％へと低下させることが見出された（図９）。ＢＬ−８０４０を含む又は含まないＡＣ２２０による処理は、このレベルを０．１％に低下させる（図９）。興味深いことに、ＡＣ２２０処理後の総マウスＷＢＣのレベルは、対照と比較して６５％とかなり低下した（図１０）。この正常なＷＢＣの大幅な低下は、ＡＣ２２０をＢＬ−８０４０と組み合わせた場合には起こらなかった。ＢＭ中のＡＭＬ細胞の数を、対照マウスの１２．６％と比較してＢＬ−８０４０は２．６％まで低下させた一方、ＡＣ２２０は０．０５％まで低下させた。ＡＣ２２０とＢＬ−８０４０を組み合わせると、ＢＭ中のＡＭＬ細胞は０．００６％にまで低下し、３／５のマウスではＢＭ中にＡＭＬ細胞が全く存在しないことが見出された（図１１Ａ、Ｂ）。ＢＬ−８０４０がＡＭＬ細胞のレベルを対照の２１％から０．４％に低下させ、ＡＣ２２０がレベルを０．０９％に低下させるなど、同様の効果が脾臓中でも観察された。ＡＣ２２０とＢＬ−８０４０との組み合わせは、細胞レベルを０．０２％にまで更に低下させた（図１２Ａ、Ｂ）。血液、ＢＭ及び脾臓中のＡＭＬ細胞数の低下は、ＡＭＬ細胞アポトーシスの誘発を伴っていた（図１３Ａ、Ｂ）。

【0131】

結論：ＣＸＣＲ４拮抗薬ＢＬ−８０４０は、インビトロ及びインビボ両方においてＡＭＬ細胞の細胞死を急速かつ効率的に誘発し、ＡＣ２２０との相乗作用を示すことが見出された。ＢＬ−８０４０とＡＣ２２０の組み合わせは、ＡＭＬ細胞の微小残存病変を低減することが見出された。これらの結果から、ＢＬ−８０４０はＢＭ中のＡＭＬの固定（anchorage）だけでなくＡＭＬの生存も標的とするため、ＦＬＴ３陽性ＡＭＬ患者において潜在的な治療的利点を持ちうることがわかる。更に、これらの結果から、ＦＬＴ３阻害剤ＡＣ２２０と組み合わせたＢＬ−８０４０療法の合理性が提供されうる。

【0132】

本発明をその特定の実施形態と共に記載してきたが、多数の代替、改変及び変種が当業者に明らかとなることは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に含まれるそれらの代替、改変及び変種の全てを包含することが意図される。

【0133】

本明細書に言及した刊行物、特許及び特許出願の全ては、個々の刊行物、特許又は特許出願の各々が、具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれる場合と同程度に、それらの全体が本明細書に組み込まれる。加えて、本明細書における任意の参考文献の引用又は特定は、それらの参考文献が本発明の先行技術として利用可能であると認めるものと解釈されるべきではない。各表題が使用される範囲において、それらは必ずしも限定するものと解釈してはならない。

【配列表フリーテキスト】

【0134】

配列番号１：合成ペプチド
配列番号２：合成ペプチド
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成ペプチド
配列番号５：合成ペプチド
配列番号６：合成ペプチド
配列番号７：合成ペプチド
配列番号８：合成ペプチド
配列番号９：合成ペプチド
配列番号１０：合成ペプチド
配列番号１１：合成ペプチド
配列番号１２：合成ペプチド
配列番号１３：合成ペプチド
配列番号１４：合成ペプチド
配列番号１５：合成ペプチド
配列番号１６：合成ペプチド
配列番号１７：合成ペプチド
配列番号１８：合成ペプチド
配列番号１９：合成ペプチド
配列番号２０：合成ペプチド
配列番号２１：合成ペプチド
配列番号２２：合成ペプチド
配列番号２３：合成ペプチド
配列番号２４：合成ペプチド
配列番号２５：合成ペプチド
配列番号２６：合成ペプチド
配列番号２７：合成ペプチド
配列番号２８：合成ペプチド
配列番号２９：合成ペプチド
配列番号３０：合成ペプチド
配列番号３１：合成ペプチド
配列番号３２：合成ペプチド
配列番号３３：合成ペプチド
配列番号３４：合成ペプチド
配列番号３５：合成ペプチド
配列番号３６：合成ペプチド
配列番号３７：合成ペプチド
配列番号３８：合成ペプチド
配列番号３９：合成ペプチド
配列番号４０：合成ペプチド
配列番号４１：合成ペプチド
配列番号４２：合成ペプチド
配列番号４３：合成ペプチド
配列番号４４：合成ペプチド
配列番号４５：合成ペプチド
配列番号４６：合成ペプチド
配列番号４７：合成ペプチド
配列番号４８：合成ペプチド
配列番号４９：合成ペプチド
配列番号５０：合成ペプチド
配列番号５１：合成ペプチド
配列番号５２：合成ペプチド
配列番号５３：合成ペプチド
配列番号５４：合成ペプチド
配列番号５５：合成ペプチド
配列番号５６：合成ペプチド
配列番号５７：合成ペプチド
配列番号５８：合成ペプチド
配列番号５９：合成ペプチド
配列番号６０：合成ペプチド
配列番号６１：合成ペプチド
配列番号６２：合成ペプチド
配列番号６３：合成ペプチド
配列番号６４：合成ペプチド
配列番号６５：合成ペプチド
配列番号６６：合成ペプチド
配列番号６７：合成ペプチド
配列番号６８：合成ペプチド
配列番号６９：合成ペプチド
配列番号７０：合成ペプチド
配列番号７１：合成ペプチド
配列番号７２：合成ペプチド

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【配列表】

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